ES2472423T3 - Agentes de formación de imágenes dirigidos al receptor de folato - Google Patents

Agentes de formación de imágenes dirigidos al receptor de folato Download PDF

Info

Publication number
ES2472423T3
ES2472423T3 ES10179508.6T ES10179508T ES2472423T3 ES 2472423 T3 ES2472423 T3 ES 2472423T3 ES 10179508 T ES10179508 T ES 10179508T ES 2472423 T3 ES2472423 T3 ES 2472423T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
99mtc
cancer cells
vitamin
folate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES10179508.6T
Other languages
English (en)
Inventor
Matthew A Parker
Christopher Paul Leamon
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Endocyte Inc
Original Assignee
Endocyte Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Endocyte Inc filed Critical Endocyte Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2472423T3 publication Critical patent/ES2472423T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/025—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus inorganic Tc complexes or compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/0402—Organic compounds carboxylic acid carriers, fatty acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/041—Heterocyclic compounds
    • A61K51/044—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine, rifamycins
    • A61K51/0459—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine, rifamycins having six-membered rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, e.g. piperazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/0497—Organic compounds conjugates with a carrier being an organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un procedimiento de formación de imágenes de una población de células tumorales en un animal que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula: **Fórmula** quelado a un catión de un radionúclido.

Description

Agentes de formacion de imagenes dirigidos al receptor de folato.
Campo de la invención
La invencion se refiere a compuestos y a procedimientos para dirigir a un agente de formacion de imagenes a celulas de un animal. Mas particularmente, los agentes de formacion de imagenes a base de radionuclidos se dirigen a celulas que tienen receptores para una vitamina usando dicha vitamina, o un derivado de union a los receptores de la vitamina o un analogo del mismo, como el ligando de direccionamiento para el agente de formacion de imagenes.
Antecedentes y resumen de la invención
El transporte transmembrana es una funcion celular fundamental. Puesto que los medicos han reconocido la importancia del transporte transmembrana para muchos campos de las ciencias biologicas y medicas, incluyendo la terapia farmacologica y la transferencia genica, se han realizado esfuerzos de investigacion significativos dirigidos a la comprension y la aplicacion de dichos procedimientos. Asi pues, por ejemplo, se ha intentado la administracion transmembrana de acidos nucleicos a traves del uso de vehiculos de proteinas, vehiculos de anticuerpos, sistemas de administracion liposomicos, electroporacion, inyeccion directa, fusion celular, vehiculos virales, choque osmotico y transformacion mediada por calcio-fosfato. Sin embargo, muchas de estas tecnicas estan limitadas tanto por los tipos de celulas en los que se produce el transporte transmembrana como por las condiciones necesarias para que se produzca un transporte transmembrana satisfactorio de moleculas exogenas. Ademas, muchas de estas tecnicas estan limitadas por el tipo y el tamafo de la molecula exogena que puede transportarse a traves de la membrana celular sin perdida de bioactividad.
Un mecanismo para el transporte transmembrana de las moleculas exogenas que tiene una amplia aplicabilidad es la endocitosis mediada por un receptor. Ventajosamente, la endocitosis mediada por un receptor se produce tanto in vivo como in vitro. La endocitosis mediada por un receptor implica el movimiento de ligandos unidos a receptores de la membrana hacia el interior de una zona limitada por la membrana a traves de la invaginacion de la membrana. El procedimiento se inicia o activa mediante la union de un ligando especifico del receptor con el receptor. Se han caracterizado muchos sistemas endocitoticos mediados por receptores, incluyendo aquellos que generan la internalizacion de galactosa, manosa, manosa-6-fosfato, transferrina, asialoglucoproteina, folato, transcobalamina (vitamina B12), a-2-macroglobulinas, insulina y otros factores de crecimiento peptidicos, tales como factor de crecimiento epidermico (EGF).
La endocitosis mediada por un receptor se ha usado para administrar moleculas exogenas, tales como proteinas y acidos nucleicos a celulas. Generalmente, un ligando especifico se conjuga quimicamente mediante union covalente, ionica o de hidrogeno a una molecula exogena de interes, formando una molecula conjugada que tiene un resto (la parte de ligando) que todavia es reconocido en el conjugado por un receptor diana. Usando esta tecnica, se ha conjugado la proteina fototoxica psoraleno con insulina, y se ha internalizado mediante la ruta endocitotica del receptor de insulina (Gasparro, Biochem. Biophys. Res. Comm. 141 (2) pag. 502-509, 15 de diciembre de 1986); se ha usado el receptor especifico de los hepatocitos para asialoglucoproteinas de galactosa terminales para la administracion transmembrana especifica de los hepatocitos de asialoorosomucoide-poli-lisina formando un complejo no covalentemente con un plasmido (Wu, G. Y., J. Biol. Chem., 262 (10), pag. 4429-4432, 1987); se ha usado el receptor celular para EGF para administrar polinucleotidos unidos covalentemente a EGF al interior de la celula (Myers, solicitud de patente europea 86810614.7, publicada el 6 de junio de 1988); se ha usado el receptor celular ubicado en el intestino para el complejo organometalico de vitamina B12-factor intrinseco para mediar en la administracion de un farmaco, una hormona, un peptido bioactivo y un inmunogeno que forme un complejo con vitamina B12 al sistema circulatorio tras la administracion oral (Russell-Jones et al., solicitud de patente europea 86307849.9, publicada el 29 de abril de 1987); se ha usado el receptor de manosa-6-fosfato para administrar lipoproteinas de baja densidad a celulas (Murray, G. J. y Neville, D. M., Jr., J. Biol. Chem, vol. 255 (24), pag. 119411948, 1980); se ha usado el receptor de la subunidad de union a la toxina del colera para administrar insulina a celulas carentes de receptores de insulina (Roth y Maddox, J. Coll. Phys. vol. 115, pag. 151, 1983); y se ha empleado el receptor de gonadotropina corionica humana para administrar una cadena a de ricina acoplada a GCH a celulas con el receptor de GCH apropiado (Oeltmann y Heath, J. Biol. Chem, vol. 254, pag. 1028 (1979)).
En una realizacion, la presente invencion implica el transporte transmembrana de un agente de formacion de imagenes a base de radionuclido a traves de una membrana que tiene receptores para el folato. Se pone en contacto una membrana celular que porta receptores para el folato con un conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes durante un tiempo suficiente para iniciar y permitir el transporte transmembrana del conjugado, y se monitoriza la biodistribucion del conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes en el animal. En otra realizacion, el resto de folato simplemente se une a un receptor de la vitamina de la superficie celular para concentrar el radionuclido quelado sobre la superficie celular.
La invencion aprovecha (1) la ubicacion de los receptores de la vitamina y (2) los procesos endociticos mediados por receptores asociados. Por ejemplo, la invencion aprovecha la expresion unica, sobreexpresion o expresion de
preferencia de receptores de vitamina, transportadores u otras proteinas presentes en la superficie que se unen especificamente a vitaminas, o derivados o analogos de las mismas, en celulas tumorales u otros tipos celulares que sobreexpresan dichos receptores. Por consiguiente, la invencion se puede usar para detectar celulas, tales como celulas tumorales u otros tipos de celulas, que sobreexpresan los receptores de vitamina, o los receptores de derivados o analogos de vitamina, aprovechando los procesos endociticos mediados por receptores que se producen cuando dichas celulas se ponen en contacto con el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes.
Los receptores de vitaminas, tales como el receptor de folato (RF) de alta afinidad, se expresan a niveles altos, por ejemplo, en celulas cancerosas. Se ha publicado que todos los canceres epiteliales de ovario, glandula mamaria, colon, pulmon, nariz, garganta y cerebro expresan niveles elevados del RF. De hecho, se sabe que mas del 90 % de todos los tumores de ovario humanos expresan grandes cantidades de este receptor. Por lo tanto, la presente invencion se puede usar para la formacion de imagenes de diagnostico de una variedad de tipos de tumores y de otros tipos de celulas implicados en estados patologicos.
Se han usado quelantes de radionuclidos que forman complejos con ligandos como sondas no invasivas con el fin de formar imagenes de diagnostico. Por ejemplo, se han usado peptido intestinal vasoactivo, analogos de somatostatina y anticuerpos monoclonales como ligandos para localizar radionuclidos para celulas, tales como celulas tumorales. Los anticuerpos monoclonales, y diversos fragmentos de los mismos, recibieron inicialmente la mayor atencion, porque se creia que era posible conseguir la direccion especifica a un tumor precisa usando anticuerpos monoclonales como ligandos de direccionamiento. Desafortunadamente, este enfoque fue problematico porque i) los anticuerpos tienen tiempos de circulacion prolongados debido a su gran tamafo, lo que es desfavorable a efectos de la formacion de imagenes; ii) los anticuerpos son costosos de producir; iii) los anticuerpos pueden ser inmunogenos, y por consiguiente, se deben humanizar cuando se usan multiples dosis; y iv) las proporciones del tumor con respecto al tejido no diana (TINT) de los radionuclidos ligados a anticuerpos son suboptimas. Por lo tanto, el centro de atencion se ha dirigido recientemente hacia el uso de ligandos con especificidad tumoral mas pequefos, que no tienen dichas limitaciones.
Se han usado vitaminas, tales como el acido folico, para dirigir agentes de formacion de imagenes a celulas tumorales, y son ventajosas debido a su pequefo tamafo. El primer complejo dirigido a base de acido folico descrito para la formacion de imagenes de tumores in vivo fue un derivado de histamina que contenia 125yodo. Este complejo no se considero un candidato clinico relevante debido al componente de radionuclido 125I de larga vida. Posteriormente, se desarrollo un conjugado de deferoxamina-folato para la formacion de imagenes de tumores (la deferoxamina quela 67Ga, un radionuclido que emite radiacion gamma que tiene una semivida de 78 horas). Se observo aclaramiento hepatobiliar con este conjugado y, por lo tanto, se detuvo el desarrollo preclinico debido a problemas anticipados en la formacion de imagenes de manera precisa de ubicaciones de la region abdominal. Sin embargo, este obstaculo se supero sustituyendo el quelante de deferoxamina con el acido dietilentriaminapentaacetico (DTPA), un quelante eficaz de 111In (semivida de 68 horas). Se confirmo que la via principal de eliminacion de 111In-DPTA-folato era a traves de los rifones.
Mas recientemente, se ha adoptado 99mTc como el radionuclido preferido para la formacion de imagenes, porque i) el radionuclido se obtiene facilmente de generadores de 99Mo-99mTc disponibles en el mercado; ii) el coste de produccion de grandes cantidades de 99mTc es insignificante en comparacion con el coste de produccion de 111In; y iii) 99mTc tiene una semivida mucho mas corta (6 horas), lo que permite que se administren mayores dosis de radionuclido, produciendo imagenes con mayor resolucion sin el riesgo de exponer organos vitales a radiacion peligrosa.
Se han desarrollado varios conjugados de 99mTc a base de folato. Por ejemplo, los conjugados de folato de 99mTc-6hidrazinonicotinamido-hidrazido (HYNIC; Guo, et al., J. Nucl. Med., 40 (9): 1563-1569 (1999)), 99mTc-12-amino3,3,9,9-tetrametil-5-oxa-4,8-diaza-2,10-dodecanodiona-dioxima (OXA) (Linder, et al., Soc. Nucl. Med., Proc. XLVII Encuentro Anual, 2000, 41 (5): 119P), 99mTc-etilendicisteina (Ilgan, et al., Cancer Biother. & Radiopharm., 13 (6): 427-435 (1998)) y 99mTc-DTPA-folato (Mathias, et al., Bioconjug. Chem., 11 (2): 253-257 (2000)) han mostrado cualidades prometedoras de captacion en tumores in vivo. Sin embargo, se necesitan conjugados de 99mTc a base de vitaminas alternativos, o conjugados a base de vitaminas que empleen otros radionuclidos, que presenten proporciones de tumor con respecto al tejido no diana (TINT) optimas y se eliminen a traves de los rifones. Dichos conjugados a base de vitaminas deben ser adecuados para un desarrollo clinico como agentes de formacion de imagenes de tumores y para el diagnostico de otros estados patologicos.
La invencion se refiere a un procedimiento para la formacion de imagenes de una poblacion de celulas tumorales en un animal que comprende la administracion de una cantidad eficaz de un compuesto de formula:
quelado a un cation de un radionuclido. En una divulgacion, se proporciona un compuesto de formula:
5 en la que V es una vitamina, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH, M es un cation de un radionuclido, n es 1 o 0; y k es 1 o 0. La vitamina es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo.
En otra divulgacion, se proporciona una composicion para la formacion de imagenes de diagnostico que comprende 10 un compuesto de formula:
en la que V es una vitamina, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH, M es un cation de un radionuclido, n es 1 o 0, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable del mismo. La vitamina es un sustrato para el
15 transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo.
En otra divulgacion mas, se proporciona un procedimiento para la formacion de imagenes de una poblacion de celulas en un animal, en el que las celulas se caracterizan por un receptor de vitamina en la superficie de las mismas. El procedimiento comprende las etapas de administrar al animal una cantidad eficaz de una composicion que comprende un compuesto de formula:
en la que V es una vitamina, o un derivado de union al receptor o un analogo del mismo, especifica del receptor de vitamina de la superficie celular, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH, M es un cation de un radionuclido, n es 1 o 0, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable del mismo, y monitorizar la biodistribucion del compuesto en el animal.
En otra divulgacion, se proporciona un compuesto de formula:
en la que V es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo, L es un engarce divalente, R es una cadena 10 lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH, M es un cation de un radionuclido, n es 1 o 0 y k es 1 o 0.
En otra divulgacion mas, se proporciona una composicion para la formacion de imagenes de diagnostico que comprende un compuesto de formula:
en la que V es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo, o
15 un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH, M es un cation de un radionuclido, n es 1 o 0, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable del mismo.
En otra divulgacion mas, se proporciona un procedimiento para la formacion de imagenes de una poblacion de celulas en un animal, en el que las celulas se caracterizan por un receptor de vitamina en la superficie de las
20 mismas. El procedimiento comprende las etapas de administrar al animal una cantidad eficaz de una composicion que comprende un compuesto de formula:
en la que V es la vitamina, o un derivado de union al receptor o un analogo del mismo, especifica para el receptor de vitamina de la superficie celular, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH, M es un cation de un radionuclido, n es 1 o 0, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable del mismo, y monitorizar la biodistribucion del compuesto en el animal.
En cualquiera de estas divulgaciones, V del compuesto puede ser, por ejemplo, una vitamina seleccionada del grupo que consiste en folato, riboflavina, tiamina, vitamina B12 y biotina, o un derivado o analogo de las mismas. En cualquiera de estos aspectos o divulgaciones, el radionuclido del compuesto se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en radioisotopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Estructura de EC20, un compuesto a modo de ejemplo usado como agente de formacion de imagenes de acuerdo con la invencion. Figura 2. Radiocromatograma de HPLC de 99mTc-EC20. Las muestras de 99mTc-EC20 se eluyeron isocraticamente en una columna C18 (3,9 x 150 mm) Nova-Pak de Waters usando una fase movil acuosa que contenia metanol al 20 % y acido trifluoroacetico al 0,2 % a un caudal de 1 mlImin. Se monitorizo el analisis de HPLC tanto con el detector UV (280 nm) como con un radiodetector FC-3200 de Bioscan. Pico A, 99mTc libre; pico B, un quelato que contiene folato de estructura desconocida; picos C y D, diastereomeros que poseen una configuracion bien syn o anti del enlace tecnecio-oxigeno en el anillo quelante Dap-Asp-Cys de EC20. Figura 3. Estructuras de los isomeros de Re-EC20 y 99mTc-EC20 (posicion syn o anti del enlace metal-oxo). Figura 4. Bloqueo de la union de 3H-acido folico a celulas KB con diversos competidores que contienen folato. Se incubaron celulas KB durante 15 min en hielo con 3H-acido folico 100 nM en presencia y ausencia de concentraciones crecientes de los competidores. (e) Acido folico; (■) EC20; (▲) Isomero A de EC20:Re; (▼) Isomero B de EC20:Re; ( ) DTPA-folato. Las barras de error representan 1 desviacion estandar (n = 3). Figura 5. Asociacion dependiente del tiempo de 99mTc-EC20. Se incubaron celulas KB con 99mTc-EC20 10 nM durante periodos crecientes de tiempo a 37 DC. Tras multiples lavados, se recogieron las celulas y se sometieron a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1 desviacion estandar (n = 3). Figura 6. Asociacion dependiente de la concentracion de 99mTc-EC20. Se incubaron celulas KB durante 2 h a 37 DC en presencia de concentraciones crecientes de 99mTc-EC20. Tras multiples lavados, se recogieron las celulas y se sometieron a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1 desviacion estandar (n = 3). Figura 7. Asociacion dependiente de la concentracion de 99mTc-EC20 "pico B". Se incubaron celulas KB durante 2 h a 37 DC en presencia de concentraciones crecientes de "pico B" que se aislo de manera cromatografica a partir de la formulacion de 99mTc-EC20. Tras multiples lavados, se recogieron las celulas y se sometieron a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1 desviacion estandar (n = 3). (e), Pico B; (D), Pico B mas acido folico 1 mM. Figura 8. Aclaramiento sanguineo de 99mTc-EC20 en ratones BalbIc. Todos los animales recibieron una dosis intravenosa de 50 !gIkg de EC20 (67 nmolIkg) en aproximadamente 0,1 ml durante una breve anestesia con eter dietilico. En los tiempos designados tras la inyeccion, se sacrifico cada animal mediante asfixia con CO2, se extrajo sangre y se sometio a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1 desviacion estandar (n = 3 animales). Figura 9. Imagenes de radiacion gamma de cuerpo entero (vista ventral). Las imagenes se obtuvieron 4 h despues de la administracion intravenosa de 99mTc-EC20 a un raton BalbIc que tenia un tumor M109 positivo en el receptor de folato subcutaneo. Solo los rifones (K) y el tumor (T) presentan una acumulacion significativa de este radiotrazador. Figura 10. Estructuras de EC11, EC13, EC14, EC15, EC19, EC20, EC31 y EC53. Figura 11. Distribucion tisular de 99mTc-EC20 en ratones BalbIc con tumores M109 positivos en RF y tumores 4T1 negativos en RF. Figura 12. Analisis de HPLC de EC11. Figura 13. Analisis de espectroscopia de masas de EC11. Figura 14. Analisis de RMN de EC 11. Figura 15. Analisis de HPLC de EC 13. Figura 16. Analisis de RMN de EC14.
Figura 17. Analisis de espectroscopia de masas de EC 15. Figura 18. Analisis de HPLC de EC19. Figura 19. Analisis de espectroscopia de masas de EC 19. Figura 20. Analisis de HPLC de EC31.
5 Figura 21. Analisis de HPLC de EC53. Figura 22. Analisis de espectroscopia de masas de EC53. Figura 23. Analisis de espectroscopia de masas de EC53.
Descripci�n detallada de la invención
De acuerdo con la divulgacion, se proporcionan procedimientos para dirigir agentes de formacion de imagenes a
10 base de radionuclidos a poblaciones de celulas que expresan de forma unica, sobreexpresan o expresan preferentemente receptores de vitaminas. Por consiguiente, una vitamina, o un derivado de union a un receptor o analogo del mismo, se usa como el ligando de direccionamiento para el agente de formacion de imagenes. El conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes se puede usar para dirigir radionuclidos a celulas y para concentrar los radionuclidos en una poblacion de celulas, tal como una poblacion de celulas tumorales, para su uso
15 en la formacion de imagenes de diagnostico.
La invencion se refiere a un procedimiento de formacion de imagenes de una poblacion de celulas tumorales en un animal que comprende la administracion de una cantidad eficaz de un compuesto de formula:
quelado a un cation de un radionuclido.
20 La solicitud desvela una composicion de formacion de imagenes de diagnostico que comprende un compuesto de formula:
para su uso en dichos procedimientos. En el compuesto, V es una vitamina, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo, L es un engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH, M es un cation de un radionuclido y n es 1 o 0. La vitamina, o derivado de union al receptor de la vitamina o analogo del mismo, es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo.
La solicitud tambien desvela los compuestos de las formulas:
en las que V es una vitamina, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo, L es un
10 engarce divalente, R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH, M es un cation de un radionuclido, n es 1 o 0 y k es 1 o 0. La vitamina es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo.
Un ejemplo de estos compuestos es un compuesto denominado EC20 representado en la Fig. 1. Los ejemplos de otros compuestos para su uso de acuerdo con la presente divulgacion son compuestos denominados EC11, EC13,
15 EC14, EC15, EC19, EC31 y EC53 (vease la Fig. 10). El resto de vitamina (por ejemplo, el resto de acido folico de EC20) proporciona una union de alta afinidad a los RF celulares. Los compuestos tambien contienen un quelante a base de peptido bifuncional que proporciona el sitio para la quelacion del radionuclido, por ejemplo, 99mTc (vease la Fig. 1), y los compuestos pueden, opcionalmente, contener un engarce a traves del cual el resto de vitamina se une covalentemente al resto quelante.
20 De acuerdo con la invencion, el resto de vitamina del compuesto es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptores in vivo, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo. La vitamina de las divulgaciones anteriores se une, opcionalmente, a traves de un engarce (L) con la parte de quelante de los compuestos. En la invencion, y como se muestra en la Fig. 1, EC20 comprende un analogo de acido folico unido al resto quelante, porque EC20 tiene el acido glutamico en la configuracion D. La parte
25 de quelante comprende un resto de acido a,1-diaminopropionico unido a un grupo cisteina a traves de un tercer residuo de aminoacido. La parte de quelante del compuesto esta adaptada a unirse a un cation radionuclido (M) (en el que k = 1).
De acuerdo con la invencion, el compuesto con radionuclido unido se denomina "conjugados de vitamina-agente de formacion de imagenes".
30 La estructura del engarce, si esta presente, no es de importancia fundamental para las divulgaciones anteriores. Por lo tanto, por ejemplo, puede ser cualquier engarce divalente biocompatible. Por lo general, el engarce comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 atomos de carbono, mas comunmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 atomos de carbono. Normalmente, se emplean engarces de menor peso molecular (es decir, aquellos que tienen un peso molecular aproximado de aproximadamente 30 a aproximadamente 300). Ademas, el
35 resto de vitamina puede ser una vitamina, o un derivado o analogo de la misma. Por ejemplo, el folato contiene un acido glutamico en la configuracion L unido a acido pteroico. EC11 y EC14 contienen dos residuos de acido glutamico y, por tanto, estos compuestos, por ejemplo, tambien se pueden considerar derivados de acido folico (Fig. 10).
Entre las vitaminas que se cree que desencadenan la endocitosis mediada por un receptor y que tienen aplicacion de acuerdo con el procedimiento desvelado en el presente documento estan la niacina, el acido pantotenico, el acido folico, la riboflavina, la tiamina, la biotina, la vitamina B12 y las vitaminas liposolubles A, D, E y K. Estas vitaminas, y sus analogos y derivados, constituyen vitaminas que se pueden acoplar con agentes de formacion de imagenes para formar los conjugados de vitamina-quelante para su uso de acuerdo con la invencion. Los restos de vitamina preferidos incluyen acido folico, biotina, riboflavina, tiamina, vitamina B12, y los analogos y derivados de estas moleculas de vitamina, y otras moleculas de union a receptores de vitaminas relacionados.
De acuerdo con las divulgaciones anteriores, se pueden usar acido folico, acido folinico, acido pteroico, acido pteropoliglutamico y pteridinas de union a los receptores de folato, tales como tetrahidropterinas, dihidrofolatos, tetrahidrofolatos y sus analogos desaza y didesaza. Las expresiones analogos "desaza" y "didesaza" se refieren a los analogos de folato reconocidos en la tecnica que tienen un atomo de carbono sustituido con uno o dos atomos de nitrogeno en la estructura del acido folico natural. Por ejemplo, los analogos desaza incluyen los analogos 1desaza, 3-desaza, 5-desaza, 8-desaza y 1.0-desaza. Los analogos didesaza incluyen, por ejemplo, los analogos 1,5didesaza, 5,10-didesaza, 8,10-didesaza y 5,8-didesaza. Los anteriores son derivados o analogos de folato y se pueden unir a los receptores de folato. Otros derivados o analogos de folato utiles de acuerdo con las anteriores divulgaciones son los analogos de union a los receptores de folato aminopterina, ametopterina (metotrexato), N10metilfolato, 2-desamino-hidroxifolato, analogos desaza, tales como 1-desazametopterina o 3-desazametopterina y acido 3',5'-dicloro-4-amino-4-desoxi-N10-metilpteroilglutamico (diclorometotrexato).
La vitamina o derivado o analogo de la misma, puede ser capaz de unirse selectivamente a la poblacion de celulas que se va a visualizar debido a la expresion de preferencia en las celulas diana de un receptor para la vitamina, o derivado o analogo, en el que el receptor es accesible para la union. El sitio de union para la vitamina puede incluir receptores para cualquier molecula de vitamina capaz de unirse especificamente a un receptor, siendo el receptor u otra proteina expresado de manera unica, sobreexpresado o preferentemente expresado por la poblacion de celulas que se va a visualizar. Una proteina presente en la superficie expresada de manera unica, sobreexpresada o expresada preferentemente por las celulas que se van a visualizar es un receptor no presente o presente en cantidades menores en otras celulas, proporcionando un medio para la visualizacion sensible, rapida y selectiva de las celulas diana para la formacion de imagenes de diagnostico usando los conjugados de vitamina-agente de formacion de imagenes de la presente invencion.
De acuerdo con la invencion, el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes es capaz de unirse con una alta afinidad a los receptores en las celulas cancerosas u otras celulas que se vayan a visualizar. La union de alta afinidad puede ser inherente al resto de vitamina o la afinidad de union se puede mejorar mediante el uso de una vitamina modificada quimicamente (es decir, un analogo o un derivado) o mediante el enlace quimico particular entre la vitamina y el resto quelante que esta presente en el conjugado.
De acuerdo con la divulgacion, el quelante se puede conjugar con multiples vitaminas diferentes, o derivados o analogos de union a receptores de vitaminas para aumentar la posibilidad de la union con los respectivos receptores de membrana celular. Como alternativa, las partes independientes de la dosis de un conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes pueden constituir diferentes conjugados de vitamina-agente de formacion de imagenes para aumentar la posibilidad de union a los respectivos receptores de membrana celular.
En general, se puede usar cualquier manera de formar un complejo entre el quelante y la vitamina, o el derivado o analogo de union al receptor de vitamina, de acuerdo con las presentes divulgaciones. El quelante puede formar un complejo con la vitamina, o el derivado o analogo de union al receptor de vitamina, mediante la conjugacion directa del quelante y la vitamina usando de un engarce divalente. Como alternativa, la vitamina y el quelante se pueden conjugar sin el empleo de un engarce. Si se usa un engarce, el engarce puede conjugar directamente la vitamina, o el derivado o analogo de union al receptor de vitamina, y el quelante a traves de un enlace de hidrogeno, ionico o covalente. Ademas, de acuerdo con las presentes divulgaciones, el engarce divalente puede comprender un medio indirecto para asociar el quelante con la vitamina, o el derivado o analogo de union al receptor de vitamina, tal como mediante la conexion a traves de engarces intermedios, brazos espaciadores o moleculas puente. Los medios tanto directos como indirectos para la asociacion no deben impedir la union de la vitamina, o del derivado o analogo de union al receptor de vitamina, con el receptor de vitamina sobre la membrana celular para el funcionamiento del procedimiento de la presente invencion.
El enlace covalente de la vitamina, o derivado o analogo de union al receptor de vitamina, y el quelante se puede producir, independientemente de si se emplea un engarce o no, a traves de la formacion de enlaces de tipo amida, ester o imino entre grupos de acido, de aldehido, hidroxi, amino o hidrazo. Por ejemplo, un acido carboxilico del resto de vitamina o del quelante se puede activar usando carbonildiimidazol o reactivos de acoplamiento de carbodiimida convencionales, tales como 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y, tras ello, hacer reaccionar con el otro componente del conjugado, o con un engarce, que tenga al acoplado, con o sin un engarce, a traves de enlaces de tipo ester, amida o tioester.
Los radionuclidos adecuados para la formacion de imagenes de diagnostico incluyen radioisotopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio, incluyendo los isotopos 111In, 99mTc, 64Cu, 67Cu, 67Ga o 68Ga. Estos radionuclidos son cationicos y forman complejos con el quelante a traves del grupo quelante del conjugado para formar el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes.
El conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes de acuerdo con la invencion se usa para visualizar de manera selectiva, usando tecnicas de formacion de imagenes escintigraficas, una poblacion de celulas en un animal en el que la poblacion de celulas expresa de manera unica, sobreexpresa o expresa preferentemente receptores para una vitamina, o un derivado de union al receptor de vitamina o analogo del mismo. Se pueden usar el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes para visualizar poblaciones de celulas patogenas, siempre que las celulas expresen de manera unica o preferentemente, o sobreexpresen receptores de vitamina o receptores que se unen a derivados o analogos de vitamina.
La invencion es aplicable a poblaciones de celulas patogenas que provocan una variedad de patologias que incluyen cancer y enfermedades mediadas por cualquier otro tipo de celulas patogenas que sobreexpresan receptores de vitamina, o receptores capaces de unirse a derivados o analogos de vitamina. Por lo tanto, la poblacion de celulas patogenas puede ser tumorigena, incluyendo tumores benignos y tumores malignos. Si la poblacion de celulas es una poblacion de celulas cancerosas, las celulas cancerosas pueden surgir espontaneamente o mediante procedimientos, tales como mutaciones presentes en la linea germinal del animal huesped o mutaciones somaticas,
o el cancer puede inducirse de manera quimica, viral o mediante radiacion. La invencion se puede usar para la formacion de imagenes de diagnostico de canceres, tales como carcinomas, sarcomas, linfomas, enfermedad de Hodgkin, melanomas, mesoteliomas, linfoma de Burkitt, carcinomas nasofaringeos y mielomas. La poblacion de celulas cancerosas puede incluir, pero sin limitacion, cancer oral, nasofaringeo, de tiroides, endocrino, de piel, gastrico, esofagico, laringeo, de garganta, pancreatico, de colon, de vejiga, de huesos, de ovario, de cuello uterino, uterino, de mama, de testiculos, de prostata, rectal, renal, hepatico, pulmonar y de cerebro. En realizaciones en las que la poblacion de celulas es una poblacion de celulas cancerosas, usando el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes, es posible visualizar celulas tumorales, incluyendo celulas de tumor primario o celulas que han experimentado metastasis o estan en el procedimiento de disociarse del tumor primario.
Los conjugados de vitamina-agente de formacion de imagenes de la presente divulgacion se pueden usar para diagnosticar un estado patologico o para monitorizar la progresion de una enfermedad. Por ejemplo, el procedimiento de formacion de imagenes de diagnostico de acuerdo con la vitamina se puede usar para monitorizar la progresion del cancer en combinacion con tratamientos profilacticos para prevenir la reaparicion de un tumor tras su eliminacion mediante cualquier enfoque terapeutico, incluyendo la extirpacion quirurgica del tumor, radioterapia, quimioterapia o terapia biologica.
El procedimiento de la presente invencion se puede usar para aplicaciones tanto de medicina clinica en seres humanos como veterinarias. Asi pues, el animal que alberga la poblacion de celulas que se visualizan puede ser un ser humano o, en el caso de aplicaciones veterinarias, puede ser un animal de laboratorio, agricola, domestico o salvaje. La presente invencion se puede aplicar a animales incluyendo, pero sin limitacion, seres humanos, animales de laboratorio, tales como roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hamsteres, etc.), conejos, monos, chimpances, animales domesticos, tales como perros, gatos y conejos, animales de la agricultura, tales como vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, y animales salvajes en cautividad, tales como osos, osos panda, leones, tigres, leopardos, elefantes, cebras, jirafas, gorilas, delfines y ballenas.
Las composiciones para la formacion de imagenes de diagnostico comprenden una cantidad del conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes eficaz para visualizar las celulas diana para la formacion de imagenes de diagnostico en un animal cuando se administra en una o mas dosis. La composicion de formacion de imagenes de diagnostico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes se administra preferentemente al animal por via parenteral, por ejemplo, por via intradermica, subcutanea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o intratecal. Como alternativa, la composicion que contiene el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes se puede administrar al animal mediante otros procedimientos medicamente utiles, y se puede usar cualquier dosis eficaz y forma farmaceutica adecuada, incluyendo formas farmaceuticas para inhalacion y orales.
Los ejemplos de formas farmaceuticas parenterales incluyen disoluciones acuosas del conjugado de vitaminaagente de formacion de imagenes, en solucion salina isotonica, glucosa al 5 % u otros vehiculos liquidos farmaceuticamente aceptables bien conocidos, tales como alcoholes, glicoles, esteres y amidas liquidos. La forma farmaceutica parenteral de acuerdo con la presente invencion puede estar en forma de un liofilizado que se puede reconstituir que comprende la dosis del conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes.
La dosis del conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes en la composicion de formacion de imagenes de diagnostico puede variar de manera significativa dependiendo del tamafo del animal, la poblacion de celulas diana para la formacion de imagenes de diagnostico, el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes especifico que se esta usando y la via de administracion del conjugado. La cantidad eficaz que se administrara al animal se basa en la superficie corporal, peso y evaluacion realizada por el medico del estado del animal. Una dosis eficaz puede variar de aproximadamente 1 ngIkg a aproximadamente 1 mgIkg, mas preferentemente de aproximadamente 100 ngIkg a aproximadamente 500 !gIkg, y lo mas preferentemente de aproximadamente 100 ngIkg a aproximadamente 25 !gIkg.
Se puede usar cualquier pauta de dosificacion eficaz para administrar la composicion de formacion de imagenes de diagnostico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes. Por ejemplo, la composicion de formacion de imagenes de diagnostico se puede administrar como una sola dosis, o se puede administrar en dosis multiples, si es necesario, para conseguir la visualizacion de la poblacion de celulas diana. Se pueden administrar inyecciones adicionales de la composicion de formacion de imagenes de diagnostico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes al animal en un intervalo de dias o meses tras laIs inyeccionIinyecciones inicialIes, y las inyecciones adicionales pueden se utiles para monitorizar el progreso del estado patologico. La composicion de formacion de imagenes de diagnostico que contiene el conjugado de vitaminaagente de formacion de imagenes tambien se puede administrar en combinacion con vitamina sin marcar. "En combinacion con" significa que la vitamina sin marcar bien se puede administrar junto con el agente de formacion de imagenes o que la vitamina sin marcar se puede inyectar previamente antes de la administracion del agente de formacion de imagenes para mejor la calidad de la imagen. Por ejemplo, el agente de formacion de imagenes se puede administrar en combinacion con de aproximadamente 0,5 ngIkg a aproximadamente 100 mgIkg, o de aproximadamente 1 !gIkg a aproximadamente 100 mgIkg, o de aproximadamente 100 !gIkg a aproximadamente 100 mgIkg de la vitamina sin marcar.
La composicion de formacion de imagenes de diagnostico normalmente se formula para la administracion parenteral y se administra al animal en una cantidad eficaz para permitir la formacion de imagenes de la poblacion de celulas diana. Por lo general, la composicion de formacion de imagenes de diagnostico que contiene la vitamina-agente de formacion de imagenes dirigido se administra al animal, y tras un periodo de tiempo que permita la administracion y la concentracion del conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes en la poblacion de celulas diana, al animal se somete al procedimiento de formacion de imagenes, siendo la formacion de imagenes posibilitada por el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes. Cuando se usan para monitorizar la progresion de una enfermedad o un diagnostico, los procedimientos de formacion de imagenes normalmente se llevan a cabo de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 horas despues de la administracion de la composicion de formacion de imagenes de diagnostico que contiene el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes.
Como se ha mencionado anteriormente, la invencion proporciona un procedimiento de formacion de imagenes de una poblacion de celulas tumorales en un animal, en el que las celulas se caracterizan por un receptor de vitamina en la superficie de las celulas. El procedimiento comprende las etapas de administrar al animal una cantidad eficaz de una composicion que comprende un compuesto de formula:
El procedimiento se puede usar para la formacion de imagenes de una poblacion de celulas in vitro, por ejemplo, en cultivo celular, o in vivo, cuando las celulas forman parte de o existen de otra manera en tejido animal. Asi pues, las celulas diana pueden incluir, por ejemplo, las celulas que revisten el tubo digestivo, tal como la mucosa oral o faringea, las celulas que forman las vellosidades del intestino delgado o las celulas que revisten el intestino grueso. Dichas celulas del tubo digestivo pueden servir de diana de acuerdo con la presente invencion mediante la administracion oral de una composicion de formacion de imagenes de diagnostico que comprenda el conjugado de vitamina-agente de formacion de imagenes. De igual manera, las celulas que revisten el sistema respiratorio (fosas nasales, pulmones) de un animal pueden servir de diana mediante la inhalacion de los presente complejos, y las celulas de organos internos, incluyendo las celulas de los ovarios y del cerebro, pueden servir de diana, particularmente, mediante la administracion parenteral de la composicion de formacion de imagenes de diagnostico.
La solicitud tambien desvela:
1. Un compuesto de formula:
en la que V es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in
5 vivo, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo; L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH; M es un cation de un radionuclido; n o 1 o 0; y
10 kes 1 o 0.
2.
El compuesto de 1, en el que V es una vitamina seleccionada del grupo que consiste en folato, riboflavina, tiamina, vitamina B12 y biotina, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo.
3.
El compuesto de 1, en el que el radionuclido se selecciona del grupo que consiste en isotopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.
15 4. El compuesto de 3, en el que el radionuclido es un isotopo de tecnecio.
5. El compuesto de 1, en el que V es folato, o un derivado de union al receptor de folato o analogo del mismo.
en la que V es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in
20 vivo, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo; L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH; M es un cation de un radionuclido; n o 1 o 0; y
25 un vehiculo farmaceuticamente aceptable para el mismo.
7. La composicion de 6, en la que V del compuesto es una vitamina seleccionada del grupo que consiste en folato, riboflavina, tiamina, vitamina B12 y biotina, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo.
8. La composicion de 6, la que el radionuclido del compuesto se selecciona del grupo que consiste en isotopos 30 de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.
9.
La composicion de 8, en la que el radionuclido del compuesto es un isotopo de tecnecio.
10.
La composicion de 6 adaptada a la administracion parenteral.
11.
El compuesto de 6, en el que V es folato, o un derivado de union al receptor de folato o analogo del mismo.
12.
Un procedimiento de formacion de imagenes de una poblacion de celulas en un animal, en el que dichas
35 celulas se caracterizan por un receptor de vitaminas en la superficie de dichas celulas, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
en la que V es la vitamina, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo, especifica de dicho receptor de vitaminas de la superficie celular; L es un engarce divalente;
R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCBRCOOH; M es un cation de un radionuclido; n o 1 o 0; y un vehiculo farmaceuticamente aceptable para el mismo; y monitorizar la biodistribucion de dicho compuesto en
5 el animal;
13. El procedimiento de 12, en el que V del compuesto es una vitamina seleccionada del grupo que consiste en folato, riboflavina, tiamina, vitamina B12 y biotina, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo.
14. El procedimiento de 12, en el que el radionuclido del compuesto se selecciona del grupo que consiste en 10 isotopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.
15.
El procedimiento de 14, en el que el radionuclido del compuesto es un isotopo de tecnecio.
16.
El procedimiento de 12, en el que la composicion se administra por via parenteral al paciente.
17.
El compuesto de 12, en el que V es folato, o un derivado de union al receptor de folato o analogo del mismo.
18. Un compuesto de formula:
en la que V es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo; L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH;
20 M es un cation de un radionuclido; n o 1 o 0; y k es 1 o 0.
25 en la que V es una vitamina que es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo; L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH; M es un cation de un radionuclido;
30 n o 1 o 0; y un vehiculo farmaceuticamente aceptable para el mismo.
20. Un procedimiento de formacion de imagenes de una poblacion de celulas de un animal, en el que dichas celulas se caracterizan por un receptor de vitaminas en la superficie de dichas celulas, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
en la que V es la vitamina, o un derivado de union al receptor de la vitamina o un analogo del mismo, especifica de dicho receptor de vitaminas de la superficie celular; L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoacido de formula H2NCHRCOOH; M es un cation de un radionuclido; n o 1 o 0; y
un vehiculo farmaceuticamente aceptable para el mismo; y monitorizar la biodistribucion de dicho compuesto en el animal.
Ademas, se desvelan:
en la que V es un folato, siendo el folato un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo, o un derivado de union al receptor de folato o un analogo del mismo; L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoacido;
10 M es un cation de un radionuclido; n es 1 o 0; y k es 1 o 0; para la formacion de imagenes de una poblacion de celulas en un animal en el que se ha inyectado previamente folato sin marcar.
15 2A. El uso de 1A, en el que el radionuclido del compuesto se selecciona del grupo que consiste en isotopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio. 3A. El uso de 1A o 2A, en el que el radionuclido del compuesto es un isotopo de tecnecio.
20 5A. El uso de uno cualquiera de 1A a 4A, en el que la poblacion de celulas del animal es una poblacion de celulas tumorales. 6A. El uso de 5A, en el que las celulas tumorales son celulas tumorales del ovario. 7A. El uso de uno cualquiera de 1A a 6A, en el que el compuesto es una forma de dosificacion parenteral seleccionada del grupo que consiste en una forma de dosificacion intradermica, subcutanea, intramuscular,
25 intraperitoneal, intravenosa e intratecal. 8A. El uso de 7A, en el que la forma de dosificacion es una forma de dosificacion intravenosa. 9A. Un conjugado de formula:
y un vehiculo farmaceuticamente aceptable del mismo; en la que V es un folato, siendo el folato un sustrato para el transporte transmembrana mediado por el receptor in vivo, o un derivado de union al receptor de folato o un analogo del mismo; L es un engarce divalente; R es una cadena lateral de un aminoacido; M es un cation de un radionuclido; n es 1 o 0; y k es 1 o 0; en combinacion con un folato sin marcar.
11A. La combinacion de 9A o 10A, en la que un cation de un radionuclido esta unido al conjugado, donde el radionuclido se selecciona del grupo que consiste en isotopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio. 12A. La combinacion de uno cualquiera de 9A a 11A, en la que el radionuclido es un isotopo de tecnecio.
15 13A. La combinacion de uno cualquiera de 9A a 12A, en la que el conjugado es una forma de dosificacion adaptada a la administracion parenteral. 14A. La combinacion de 13A, en la que la forma de dosificacion se selecciona del grupo que consiste en una forma de dosificacion intradermica, subcutanea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e intratecal. 15A. La combinacion de uno cualquiera de 9A a 14A, en la que el vehiculo farmaceuticamente aceptable es un
20 liquido. 16A. La combinacion de 15A, en la que el vehiculo liquido se selecciona del grupo que consiste en solucion salina, glucosa al 5 %, alcoholes, glicoles, esteres, amidas y una combinacion de los mismos.
Ejemplo 1
Materiales
25 Se adquirio acido N10-trifluoroacetilpteroico de Eprova AG, Schaffhausen, Suiza. Se adquirieron los reactivos para la sintesis de peptidos de NovaBiochem y Bachem. Syncor suministro el 99mTc-pertecnetato de sodio. Se preparo [ReO2(en)2]Cl de acuerdo con Rouschias (Rouschias, G., Chem. Rev., 74:531 (1974)). Se adquirieron placas de celulosa y placas de intercambio ionico de DEAE de J. T. Baker.
Ejemplo 2
30 Sintesis, purificacion y caracterizacion analitica de EC20
Se preparo EC20 mediante un enfoque secuencial de soporte polimerico usando la estrategia de Fmoc (vease el Esquema 1 que se presenta a continuacion; Fmoc = 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; Boc = terc-butiloxicarbonilo; Dap = acido diaminopropionico; DMF = dimetilformamida; DIPEA = diisopropiletilamina). Se sintetizo EC20 en una resina de Wang sensible a acido cargada con Fmoc-L-Cys(Trt)-OH. Se aplico hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris35 pirrolidin-fosfonio (PyBOP) como reactivo activador para garantizar un acoplamiento eficaz usando equivalentes bajos de aminoacidos. Se eliminaron los grupos protectores de Fmoc tras cada etapa de acoplamiento en condiciones convencionales (piperidina al 20 % en DMF). Tras la ultima etapa de ensamblaje, se escindio el peptido del soporte polimerico mediante el tratamiento con acido trifluoroacetico al 92,5 % que contenia etanoditiol al 2,5 %, triisopropilsilano al 2,5 % y agua desionizada al 2,5 %. Esta reaccion tambien dio como resultado la eliminacion
40 simultanea de los grupos protectores de tritilo, Boc y t-Bu. Por ultimo, se elimino el resto de trifluoroacetilo en hidroxido de amonio acuoso, dando EC20.
Se purifico el producto EC20 bruto mediante HPLC usando una columna de 7 !m, 30 x 300 mm, Xterra RP 18 (Waters); fase movil de HCl 32 mM (A), MeOH (B); condiciones de gradiente que parten con A al 99 % y B al 1 %, llegando a A al 89 % y B al 11 % en 37 min mediante un caudal de 20 mlImin. En estas condiciones, el monomero 45 de EC20 normalmente eluyo a 14,38 min, mientras que el dimero de disulfuro de EC20 (contaminante minoritario) eluyo a 16,83 min. Todos los demas componentes mostrados en la Fig. 10 se pueden preparar usando un esquema
de sintesis similar, a excepcion de EC15, que se sintetiza como se muestra en el Esquema 2 que se presenta a continuacion.
Se disolvieron dos miligramos de EC20 purificado mediante HPLC en 0,62 ml de D2O2, y se recogio un espectro de RMN de 1H a 500 MHz. La Tabla 1 (vease a continuacion) enumera los desplazamientos quimicos, las formas de sefal y los valores J para todos los protones no intercambiables en la molecula de EC20.
Tambien se analizo EC20 mediante espectrometria de masas por electronebulizacion. Picos del ion positivo principal (m/z, intensidad relativa): 746,1, 100; 747,1, 44; 556,8, 32; 570,8, 16.
Esquema 1�
10 Tabla 1 Datos de RMN de 1H para EC20. Se disolvio EC20 en D2O y se recogio un espectro a 500 MHz. Los desplazamientos quimicos (8) estan en ppm. La sefal para HOD a 8 = 4,80 ppm se uso como referencia, pD = 4,78; s = singlete; d = doblete; m = multiplete.
Residuo
Protones observados Desplazamiento quimico (8) Sefales Valores J
Ple
H-7 2 x H-9 H-12 a. H-16 H-13 a. H-15 8,76 4,64 7,68 6,8 s s d d 3J12,13 = 3J15,16 = 8,8 Hz
D-Glu
H-2 H-3a H-3B 2 x H-4 4,41 2,08 2,27 2,44 dd m m dd 3J2,3 = 39,1 Hz; 3J2,3b = 4,5 Hz 2J3a,3b = 14,2 Hz; 3J3a, 4 = 3J4b,4 = 5,6 Hz
(Continuacion)
Residuo
Protones observados Desplazamiento quimico (8) Sefales Valores J
Dpr
H-2 H-3A H-3B 4,1 3,52 3,72 dd; X del sistema ABX dd; A del sistema ABX dd; B del sistema ABX 3J2,3A-6,6 Hz; 3J2,3B = 4,7 Hz 2JA,B = 14,7 Hz
Asp
H-2 2,81 H-3B 4,71 2,62 2,81 dd; X del sistema ABX dd; A del sistema ABX dd; B del sistema ABX 3J2,3A = 9,5 Hz; 3J2,3B = 4,3 Hz 2JA,B = 16,1 Hz
Cys
H-2 H-3A H-3B 4,3 2,85 2,89 dd; X del sistema ABX dd; A del sistema ABX dd; B del sistema ABX 3J2,3A = 55bz; 3J2,3B = 4,4 Hz 2JA,B = 14,1 Hz
Esquema 2�
Ejemplo 3
Preparacion del vial de reactivo no radiactivo y de 99mTc-EC20
Se usaron kits de EC20 para la preparacion de la sustancia farmacologica radiactiva de 99mTc-EC20. Cada kit contenia una mezcla liofilizada no pirogena, esteril, de 0,1 mg de EC20, 80 mg de a-D-glucoheptonato de sodio, 80 mg de cloruro de estafo (II) dihidratado, y suficiente hidroxido de sodio o acido clorhidrico para ajustar el pH a 6,8 � 0,2 antes de la liofilizacion. Se sello el polvo liofilizado en un vial de 5 ml bajo una atmosfera de argon. A continuacion, se almacenaron los kits en congelacion a -20 DC hasta su uso o caducidad (la vida util de almacenamiento actual es > 2 afos). Es importante destacar que el componente cloruro de estafo (II) se requiere para reducir el 99mTc-pertecnetato afadido, mientras que el componente a-D-glucoheptonato de sodio es necesario para estabilizar el 99mTc reducido recientemente antes de su quelacion final para dar el compuesto EC20,
Se preparo 99mmTc-EC20 de la siguiente manera (es decir, quelacion de 99mTc, dando EC20). En primer lugar, se preparo un bafo de agua en ebullicion que contenia un protector de vial de plomo parcialmente sumergido. Se limpio con hisopo la parte superior del vial de EC20 con etanol al 70 % para desinfectar la superficie y se coloco el vial en un recipiente de proteccion adecuado. Usando una jeringa protegida con aguja de calibre 27, se inyecto 1 ml de la inyeccion de 99mTc-pertecnetato de sodio esteril (de 15 a 20 mCi) en cloruro de sodio al 0,9 %, en el vial protegido. Antes de retirar la jeringa del vial, se extrajo un volumen de gas del vial igual al volumen de pertecnetato afadido con el fin de normalizar la presion en el interior del vial. Se agito suavemente el vial durante 30 segundos para garantizar la completa disolucion del polvo liofilizado. Luego, se coloco el vial en protector de plomo que estaba situado en el bafo de agua en ebullicion. Se calento la disolucion durante -18 minutos y, a continuacion, se enfrio hasta la temperatura ambiente durante un minimo de 15 min. Esta disolucion se puede almacenar a temperatura ambiente (15-25 DC) protegida de la luz, pero se debe usar en un plazo de 6 horas de su preparacion.
Se determino la estabilidad radioquimica de la sustancia farmacologica radiactiva mediante HPLC tras su almacenamiento a temperatura ambiente protegida de la luz durante hasta 24 horas. Se analizaron muestras de la solucion de 99mTc-EC20 (20 !l) usando un sistema de HPLC que consistia en un sistema de administracion de multiples disolventes 600E de Waters y un detector UV 490, un radiodetector EC-3200 de Bioscan, un programa informatico de radiocromatograma Laura v1.5 y una columna C18 (3,9 x 150 mm) Nova-Pak de Waters. Se eluyeron isocraticamente las muestras inyectadas usando una fase movil acuosa que contenia metanol al 20% y acido trifluoroacetico al 0,1 % a un caudal de 1 mlImin. Se monitorizo el analisis por HPLC tanto con el detector UV (280 mm) como con el radiodetector de rayos gamma. En particular, la pureza radioquimica de 99mTc-EC20 se mantuvo superior al 90 % durante al menos 24 horas en todos los casos.
Ejemplo 4
Determinacion de la pureza radioquimica de 99mTc-EC20 mediante CCF
Las impurezas radioquimicas principales en la preparacion de 99mTc-EC20 seran 1) 99mTc-pertecnetato, 2) 99mTcglucoheptonato (precursor de intercambio de ligando), 3) 99mTc de union inespecifica (99mTc unido a un sitio diferente del resto quelante Dap-Asp-Cys esperado de la molecula EC20) y 4) 99mTc hidrolizado. Dado que se estaba analizando el 99mTc-EC20 para determinar su posible uso clinico, se desarrollo un procedimiento a base de tres CCF para determinar las cantidades de cada impureza y estimar la pureza radioquimica global de 99mTc-EC20.
En el primer sistema, se revelo una placa de celulosa con agua desionizada. 99mTc-EC20, 99mTc-glucoheptonato, 99mTc de union inespecifica y 99mTc-pertecnetato se mueven hacia el frente de disolvente (Rf = 1,0), mientras que 99mTc hidrolizado permanece en el origen (Rf = 0,0). Se corto la placa de celulosa en dos fragmentos a Rf = 0,3 (1,5 cm del origen) y se realizo el recuento en cada fragmento usando un calibrador de dosis. Se calculo el porcentaje de 99mTc hidrolizado de la siguiente manera: A = % de hidrolizado; 99mTc = (!Ci en el fragmento inferiorI!Ci en ambos fragmentos) x 100.
En el segundo sistema, se revelo una placa de celulosa con acetona y NaCl al 0,9 % (7:3, vIv). El 99mTc-pertecnetato se mueve con Rf = 0,9, mientras que 99mTc-EC20, 99mTc-glucoheptonato, 99mTc de union inespecifica y 99mTc hidrolizado permanecen en el origen (Rf = 0,0). Se corto la placa de celulosaIacetona-solucion salina en dos fragmentos a Rf = 0,6 (3,0 cm del origen) y se realizo el recuento en cada fragmento usando un calibrador de dosis. Se calculo el porcentaje de 99mTc-pertecnetato de la siguiente manera: B = % de 99mTc-pertecnetato = (!Ci en el fragmento superiorI!Ci en ambos fragmentos) x 100.
Por ultimo, en el tercer sistema, se revelo una placa de intercambio ionico de DEAE con Na2SO4 0,3 M. El 99mTcglucoheptonato se mueve hacia el frente de disolvente (Rf = 1,0), 99mTc de union inespecifica se mueve con Rf = 0,6 y 99mTc-EC20, 99mTc hidrolizado y 99mTc-pertecnetato permanecen cerca del origen (99mTc-EC20, Rf = 0,1; 99mTc hidrolizado: Rf = 0,0; 99mTc-pertecnetato: Rf = 0,3). Se corto la placa de celulosaINa2SO4 en dos fragmentos a 2,5 cm del origen y se realizo el recuento en cada fragmento usando un calibrador de dosis. Se calculo el porcentaje de99mTc-glucoheptonato y 99mTc de union inespecifica de la siguiente manera: C = % de (99mTc-glucoheptonato + 99mTc de union inespecifica) = (!Ci en el fragmento superiorI !Ci en ambos fragmentos) x 100. Se calculo entonces la pureza radioquimica global de 99mTc-EC20 de la siguiente manera: pureza radioquimica = 100 - (A+B+C).
Como se muestra en la Fig. 2, el analisis por HPLC de la formulacion 99mTc-EC20 muestra cuatro componentes radioquimicos, denominados picos A a D. Se confirmo que el pico A era 99mTc libre y este subproducto esta presente de manera reproducible a < 2 %. El pico B, que era diferente del de 99mTc-glucoheptonato (no se muestran los datos), eluyo con un tiempo de retencion de 2,8 min. Este componente represento aproximadamente el 3 % de la mezcla y se creia que resultaba de la quelacion de 99mTc en algun otro sitio de la molecula de EC20, ademas del resto Dap-Asp-Cys esperado. Los picos C y D (tiempos de retencion de 4,8 minutos y 13,2 minutos, respectivamente), representan la mayoria de la actividad radioquimica formulada.
Ejemplo 5
Sintesis de Re-EC20
Se disolvieron cincuenta y dos mg (0,010 mmol) de EC20 y [ReO2(en)2]Cl (52 mg, 0,14 mmol) en 6 ml y 1 ml de tampon fosfato purgado con argon (0,05 M, pH 5,8), respectivamente. Se combinaron las dos soluciones y se calentaron bajo una atmosfera de argon en un bafo de agua en ebullicion durante 2 horas. Se congelo y se liofilizo durante una noche la mezcla de reaccion. Se purifico el producto bruto mediante HPLC (columna Xterra RP18, 19 x 150 mm, NH4OAc 10 mMICH3CN, caudal de 10 mlImm; gradiente del 1 % al 8 %). Se recogieron las fracciones, se liofilizaron y se almacenaron a -20 DC hasta su uso.
Debido a la falta de instalaciones para espectros de masas para el analisis de materiales radiactivos, se analizo el analogo de renio no radiactivo, Re-EC20. Tanto el renio como el tecnecio son metales del grupo VIIA que tienen una similitud significativa en cuanto a las propiedades quimicas y fisicas. Tambien forman complejos similares con ligandos organicos. Este comportamiento quimico analogo, con frecuencia, se ha usado en el esclarecimiento de las estructuras de nuevas clases de productos radiofarmaceuticos de tecnecio basados en analogos de renio no radiactivos. De manera interesante, el analisis por HPLC de Re-EC20 tambien mostro dos picos principales que eluyeron a 5 y 14,2 minutos, respectivamente, similares a los picos C y D para 99mTc-EC20 (cromatograma no mostrado). El analisis de espectros de masas confirmo que estos dos componentes eran isomeros correspondientes al complejo Re-EC20 (mIz = 945). De hecho, es probable que estas especies fueran diastereomeros que poseian una configuracion bien syn o anti del enlace de oxigeno del tecnecio en el anillo quelante Dap-Asp-Cys, como se representa en la Fig. 3. Debido a que i) los dos picos del cromatograma de Re-EC20 representan complejos isomericos, y ii) existen informes sobre el isomerismo similar en complejos de tecnecio, es probable que los componentes C y D del radiocromatograma de 99mTc-EC20 tambien sean isomeros.
Ejemplo 6
Cultivo celular
Se cultivaron celulas de manera continua en forma de una monocapa usando medio RPMI libre de folato (FFRPMI) que contenia suero de ternero fetal inactivado por calor (HIFCS) al 10 % a 37 DC en una atmosfera de CO2 al 5 %Ihumidificada con aire al 95 % sin antibioticos. El HIFCS contenia su complemento normal de folatos endogenos que permitio que las celulas crecieran de manera sostenida en este medio mas fisiologicamente apropiado. Todos los experimentos celulares se realizaron usando FFRPMI que contenia HIFCS al 10 % (FFRPMIIHIFCS) como medio de crecimiento, excepto cuando se indica lo contrario.
Ejemplo 7
Ensayo de afinidad relativa
Se determino la afinidad relativa de diversos derivados de folato de acuerdo con el procedimiento descrito por Westerhoff et al. (Mol. Pharm., 48:459-471 (1995)) con una ligera modificacion. En resumen, se tripsinizaron ligeramente celulas KB positivas en RF en tripsina al 0,25 %IPBS a temperatura ambiente durante 3 minutos, y se diluyeron despues en FFRPMIIHIFCS. Tras una centrifugacion de 800 x g durante 5 minutos y un lavado con PBS, se suspendio el sedimento de celulas final en FFRPMI 1640 (sin suero). Se incubaron las celulas durante 15 min en hielo con 100 nM de 3H-acido folico en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de articulos de ensayo que contenian folato. Se centrifugaron las celulas a 10.000 x g durante 5 min, se suspendieron los sedimentos de celulas en tampon, se transfirieron a viales individuales que contenian 5 ml del coctel de centelleo y, a continuacion, se realizo el recuento para determinar la radiactividad. Los tubos de control negativo solo contenian el 3H-acido folico en FFRPMI (sin competidor). Los tubos de control positivo contenian una concentracion final de acido folico 1 mM, y las CPM medidas en estas muestras (que representan la union inespecifica del marcador) se restaron de todas las muestras. En particular, las afinidades relativas se definieron como la proporcion molar inversa del compuesto requerido para desplazar el 50 % de 3H-acido folico unido a RF de KB, y la afinidad relativa del acido folico por el RF se establecio en 1.
La capacidad de EC20 para competir de manera directa con el acido folico para unirse a los RF de superficie celular se midio usando este ensayo. Es importante destacar que un valor de afinidad relativa de 1,0 implica que el ligando del articulo de ensayo tiene una afinidad por el RF igual al acido folico. Asi mismo, los valores inferiores a la unidad reflejan una afinidad mas debil y los valores superiores a la unidad reflejan una afinidad mas fuerte.
Se incubaron celulas KB cultivadas con 3H-acido folico 100 nM en presencia de concentraciones crecientes de acido folico no radiactivo, EC20, renio-EC20 (isomero A; pico C), renio-EC20 (isomero B; pico 0) o un producto radiofarmaceutico a base de folato relacionado, DTPA-folato. Tras una incubacion durante 15 minutos a 4 DC, se enjuagaron las celulas libres de material sin unir y se realizo el recuento para determinar la radiactividad asociada a las celulas residuales. La cantidad de radiactividad unida se represento frente a la concentracion del ligando sin marcar, y se estimaron los valores de CI50 (concentracion de ligando necesaria para bloquear el 50 % de union del 3H-acido folico). Como se muestra en la Fig. 4 y la Tabla 2 (que se presenta a continuacion), se determino que EC20 tenia una afinidad de 0,92 con respecto a la del acido folico por los RF humanos. Ambos isomeros de renio-EC20 mostraron valores de afinidad relativa que eran muy similares a, si no mejores que, la molecula de EC20 precursora (1,42 y 1,37 para el isomero A e isomero B de Re-EC20, respectivamente). El DTPA-folato, un agente
5 radiofarmaceutico de folato que quela a 111In, mostro una afinidad relativa de 0,87 por el receptor de folato. Por lo tanto, la modificacion quimica de folato con diversos motivos quelantes de metal no altero la afinidad intrinseca de la vitamina por el RF.
Tabla 2. Estimaciones de la afinidad relativa. Las afinidades relativas (AR) se definieron como la proporcion molar inversa de compuesto requerido para desplazar el 50 % del 3H-acido folico unido a celulas KB positivas en RF. La 10 afinidad relativa del acido folico se establecio en 1. Se evaluo cada articulo de ensayo por triplicado.
Articulo de ensayo
CI50 (nM) D.E. AR D.E.
�cido fálico
118 19 1,00
EC20
128 25 0,92 0,23
Is�mero 1 de EC20:Re
83 16 1,42 0,36
Is�mero 2 de EC20:Re
86 3 1,37 0,23
DTPA-folato
136 12 0,87 0,16
Ejemplo 8
Captacion celular dependiente del tiempo
Se sembraron celulas KB en placas Falcon de 12 pocillos y se permitio la formacion de monocapas subconfluentes
15 durante una noche. Tras un enjuague con 1 ml de FFRPMIIHIFCS recien preparado, cada pocillo recibio 1 ml de FFRPMIIHIFCS que contenia 99mTc-EC20 10 nM. Se incubaron las celulas durante tiempos predeterminados a 37 DC y, a continuacion, se enjuagaron cuatro veces con 1 ml de PBS enfriado con hielo, pH 7,4. Se disolvieron las monocapas de celulas en 0,5 ml de PBS, pH 7,4 que contenian dodecilsulfato de sodio al 1 % durante 15 min a temperatura ambiente y luego se realizo el recuento para determinar la radiactividad usando un contador de rayos
20 gamma de Packard. Se cuantifico la proteina en cada muestra usando un kit de ensayo de proteinas DC de BioRad, y los valores de proteina celular se convirtieron en numero de celulas usando el factor de conversion de 2,23 x 107 mg de proteina por celula. Se expresaron los valores tabulados finales en terminos de moleculas de EC20 por celula.
Usando este protocolo, se midio la cinetica de captacion de 99mTc-EC20 en celulas KB positivas en RF. Como se
25 muestra en la Fig. 5, se alcanzo la captacion en estado estacionario en el plazo de dos horas a 37 DC, en el que aproximadamente 3,2 millones de moleculas de EC20 estaban asociadas a celulas, mientras que la mitad de la asociacion celular maxima se produjo 9 minutos despues de mezclar 10 nM de este producto radiofarmaceutico con las celulas. Lo interesante es que la mitad del punto de saturacion maximo se alcanzo en solo 37 segundos cuando se incubaron las celulas con una concentracion 10 veces superior de 99mTc-EC20 (100 nM; datos no mostrados).
30 Ejemplo 9
Captacion celular dependiente de la concentracion
Se sembraron celulas KB en placas Falcon de 12 pocillos y se permitio la formacion de monocapas subconfluentes durante una noche. Tras un enjuague con 1 ml de FFRPMIIHIFCS fresco, cada pocillo recibio 1 ml de FFRPMIIHIFCS que contenia concentraciones crecientes de 99mTc-EC20. Se incubaron las celulas durante 2 horas a
35 37 DC y luego se enjuagaron cuatro veces con 1 ml de PBS enfriado con hielo, pH 7,4. Se disolvieron las monocapas en 0,5 ml de PBS, pH 7,4 que contenian dodecilsulfato de sodio al 1 % durante 15 min a temperatura ambiente y, a continuacion, se realizo el recuento para determinar la radiactividad usando un contador de rayos gamma de Packard. Se determino el contenido de proteina como se ha descrito anteriormente, y se expresaron los valores tabulados finales en terminos de moleculas de EC20 por celula.
Como se muestra en la Fig. 6, se descubrio que la captacion celular de 99mTc-EC20 dependia de la concentracion extracelular. Se determino que las celulas KB usadas en particular se unian a un maximo de cuatro millones de moleculas del producto radiofarmaceutico de folato por celula. El analisis de Scatchard de los datos estimo que la KD de union era 3,2 nM, un valor comparable con la KD observada para la union de la vitamina folato con estas mismas celulas.
Aunque no se establecio la identidad completa del componente del pico B, el analisis de absorcion UV indico que contenia un resto de folato (es decir, el espectro de absorcion contenia el pico de absorcion secundario caracteristico del folato a 363 nm). Se recogio este material radiomarcado purificado mediante HPLC (material del pico B) y luego se afadio a celulas KB cultivadas. Como se muestra en la Fig. 7, tambien se descubrio que la captacion celular del componente del pico B marcado con 99mTc dependia de la concentracion extracelular. El analisis de Scatchard de los datos estimo que la KD de union era 1,1 nM. Lo interesante es que la asociacion celular del pico B se bloqueo completamente en presencia de acido folico en exceso, indicando que este subproducto de formulacion minoritario tambien se puede dirigir a celulas positivas en RF con fines radiodiagnosticos.
Ejemplo 10
Aclaramiento de la sangre
Se mantuvieron los animales usados para el presente estudio con una dieta libre de folato (Harlan ND TD-90261) durante aproximadamente tres semanas antes de la administracion de la dosis. La aclimatacion a esta dieta especial es esencial, porque las dietas para roedores habituales contienen grandes cantidades de acido folico (6 mgIkg de comida) y promueven altos niveles de folato serico en ratones. Ademas, estudios anteriores han demostrado que los ratones sometidos a una dieta libre de folato durante 3 semanas mantuvieron un nivel de folato serico seguro de 25
� 7 nM, que es ligeramente superior a la concentracion de 9-14 nM medible en el suero humano.
Se preparo la solucion de 99mTc-EC20 el dia de su uso que contenia inicialmente 100 !g de EC20 por mililitro. Se diluyo adicionalmente la solucion con solucion salina esteril para preparar las soluciones madre de trabajo. Se estimo mediante CCF que la pureza radioquimica del producto era del -94 %. Cada animal recibio una dosis de 50 !gIkg de EC20 (67 nmolIkg) en un volumen i.v. de aproximadamente 0,1 ml a traves de la vena de la cola durante una breve anestesia con eter dietilico. A los tiempos designados (vease la Fig. 8) posteriores a la inyeccion, se sacrifico cada animal mediante asfixia con CO2, y se extrajo inmediatamente sangre mediante puncion cardiaca.
Como se muestra en la Fig. 8, el 99mTc-EC20 se elimino rapidamente de la circulacion en el raton BalbIc. Se estimo que la semivida plasmatica de este producto radiofarmaceutico fue de -4 minutos, y menos del 0,2 % de la dosis de99mTc-EC20 inyectada permanecio en circulacion despues de cuatro horas (suponiendo que la sangre representa el 5,5 % de la masa corporal total). Estos datos indican que los conjugados de folato se eliminan rapidamente de la circulacion tras la administracion intravenosa, y que se pueden obtener datos de biodistribucion tisular valiosos transcurridas solo unas cuantas horas de la inyeccion sin la preocupacion de que se produzca una captacion tisular inespecifica debido a la radiactividad transmitida por la sangre.
Ejemplo 11
Estudios de distribucion tisular
Se evaluo la capacidad de 99mTc-EC20 para dirigirse a tumores in vivo usando un modelo M109 positivo en RF. Estas celulas tumorales son singenicas para el raton BalbIc y forman de manera reproducible tumores solidos subcutaneos en el plazo de dos semanas tras la inoculacion. Tambien se evaluaron en este bioensayo 99mTc-EC14, que es estructuralmente similar a 99mTc-EC20, a excepcion de que contiene un residuo de D-Glu adicional (es decir, Pte-D-Glu-D-Glu-1Dpr-Asp-Cys), 99mTc-EC28 (un control que no contiene pteroato que consiste en benzoil-D-Glu-n-Glu-1Dpr-Asp-Cys) y el producto radiofarmaceutico de 111In-DTPA-folato previamente publicado. Es importante destacar que el agente de control 99mTc-EC28 no se unira a los RF de la superficie celular, porque carece de un resto de anillo de pteridina esencial.
Se adquirieron ratones (raza BalbIc) de cuatro a cinco semanas de edad de Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, IN) y se mantuvieron con una dieta libre de folato durante un total de tres semanas antes del experimento. Se inocularon celulas tumorales M109 positivas en RF, singenicas (1 x 106 por animal) en el tejido subcutaneo de la axila derecha dos semanas antes del experimento. Todos los ratones eran hembras, y los pesos de los tumores eran de 54,2 � 29,8 mg el dia del experimento. Se preparo una solucion madre de 99mTc-EC20 que contenia 100 !g del agente por mililitro el dia de su uso, y tenia una pureza radioquimica era de > 96 %. Tambien se prepararon los dos agentes quelantes de 99mTc adicionales, 99mTc-EC14 y 99mTc-EC28, asi como 111In-DTPA-folato hasta una pureza radioquimica > 90 %. Se diluyeron todas las soluciones bien solo con solucion salina o con una solucion salina que contenia 100 equivalentes de acido folico (para competencia) de manera que la concentracion del producto radiofarmaceutico final resulto ser de 10 !molIml.
Los animales recibieron una dosis i.v. de aproximadamente 40 !molIkg del articulo de ensayo en un volumen de 100 !l a traves de una vena lateral de la cola durante una breve anestesia con eter dietilico. Cuatro horas despues
de la inyeccion, se sacrificaron los animales mediante asfixia con CO2 y se diseccionaron. Se extirparon los tejidos seleccionados, se pesaron y se realizo el recuento para determinar la distribucion de 99mTc. Se corrigieron los valores de CPM por la degradacion y se tabularon los resultados como el % de dosis inyectada por gramo de peso humedo de tejido.
5 Como se muestra en la Tabla 3 (que figura a continuacion), los tres productos radiofarmaceuticos que contenian "folato", 99mTc-EC14, 99mTc-EC20 y 111In-DTPA-folato, se acumularon predominantemente en los rifones y el tumor positivo en RF; sin embargo, los rifones concentraron un porcentaje superior de dosis inyectada por gramo de tejido (% de DIIg) que el tumor. Lo interesante es que la acumulacion neta del tumor de 111In-DTPA-folato y 99mTc-EC20 fue casi la misma (19 y 17 % de DIIg, respectivamente), mientras que la captacion del tumor de 99mTc-EC14 fue algo
10 inferior al -10 % de DIIg. No obstante, los tres agentes mostraron altas proporciones de tumor con respecto a la sangre (de > 30 a 1).
Tabla 3. Biodistribuci�n de productos radiofarmac�uticos de folato en ratones Balb/c que tienen tumores M109 subcut�neos
% de dosis inyectada por gramo de tejido (4 h despues de la inyeccion intravenosa)
99mTc-EC14
99mTc-EC14 +Acido folico 99mTc-EC20 99mTc-EC20 +Acido folico 111 In-DTPA-Folato 111 In-DTPA-Folato + Acido folico 99mTc-EC28
SangreCoraz�nPulm�nH�gadoBazoIntestinoRi��nM�sculo Est�magoTumorTumor/ Sangre
0,31 0,14 2,39 0,64 2,08 0,40 3,44 2,19 2,68 2,49 1,70 0,55 98,0 40,7 0,99 0,28 1,47 0,58 9,83 2,77 34,1 7,41 0,19 0,07 0,08 0,01 0,15 0,04 1,37 0,98 2,99 1,43 0,32 0,11 5,94 0,52 0,09 0,11 0,10 0,03 0,43 � 0,52 2,00 2,00 0,34 0,03 1,57 0,26 2,22 0,63 3,56 0,25 0,95 0,15 2,56 0,61 1,38 12,4 0,67 0,20 1,45 0,55 17,2 � 1,02 51,0 8,20 0,09 0,02 0,08 0,01 0,31 0,26 1,15 0,22 0,38 0,33 2,93 1,49 5,64 2,13 0,06 0,02 3,35 5,19 0,45 � 0,18 4,70 1,30 0,231 0,10 2,57 0,82 1,72 0,61 5,21 2,63 3,30 2,33 1,87 0,69 1,91 79,2 1,19 0,48 1,62 0,65 19,3 � 5,86 102 43,4 0,09 0,04 0,06 0,02 0,09 0,2 0,81 0,03 1,46 0,73 0,82 0,14 3,14 1,96 0,05 0,04 0,25 0,20 0,46 � 0,42 5,00 4,60 0,06 0,04 0,03 0,01 0,05 0,01 0,50 0,26 0,60 0,38 0,47 0,19 0,62 0,14 0,02 0,01 0,21 0,19 0,11 � 0,06 2,00 0,50
Los valores mostrados representan la media � la D.E. de los datos de 3 animales.
Se demostro ademas la direccion especifica hacia el folato mediante dos procedimientos distintos. En primer lugar, se bloqueo de manera eficaz (> 94 %) la acumulacion de 99mTc-EC14, 99mTc-EC20 y 111In-DTPA-folato en el tumor positivo en RF y en los rifones al administrar conjuntamente estos agentes con un exceso de 100 veces de acido folico. En segundo lugar, el agente de control 99mTc-EC28 no se acumulo de manera apreciable en los rifones ni en el tumor. Ambas observaciones muestran que se requiere un resto "de tipo folato" (o pteroato) intacto para proporcionar la captacion dirigida y la retencion de estos agentes radiofarmaceuticos en los tejidos positivos en RF.
Ejemplo 12
Gammagrafia
Se inocularon celulas tumorales M109 (1 x 106 por animal) en el tejido subcutaneo de la axila derecha de ratones BalbIc dos semanas antes del experimento. Los animales recibieron una dosis i.v. de aproximadamente 50 !molIkg del articulo de ensayo en un volumen de 100 !l a traves de una vena lateral de la cola durante una breve anestesia con eter dietilico. Cuatro horas despues de la inyeccion, se sacrificaron los animales mediante asfixia con CO2 y se colocaron despues en la parte superior de una superficie de adquisicion de imagenes. Se realizo la adquisicion de imagenes de todo el cuerpo durante 1 minuto y a una velocidad de recuento de 50-75.000 recuentos por minuto usando una camara para rayos gamma radioisotopos Sigma 410 Omega 500 de Technicare. Se analizaron todos los datos usando un ordenador basado en MS-DOS de Medasys dotado del programa informatico Pinnacle de Medasys.
Usando este protocolo de gammagrafia, se demostro la captacion de 99mTc-EC20 por los tumores M109 positivos en RF y los rifones. Como se muestra en la Fig. 9, una imagen ventral de un raton al que se inyecto 99mTc-EC20 como se ha descrito anteriormente localiza la radiacion gamma en los dos rifones (K) y la masa tumoral M109 (T; zona del hombro). No se observo ningun radiotrazador apreciable en otros tejidos corporales. Se ha informado de un perfil de imagen similar para el producto radiofarmaceutico 111In-DTPA-folato.
Ejemplo 13
Excrecion urinaria y metabolismo
Se obtuvo el perfil de especiacion por HPLC urinario de 99mTc-EC20 usando ratones BalbIc. Se inyecto a los ratones (cada uno de -20 g) 1 mCi (6,7 nmol) de 99mTc-EC20 a traves de una vena lateral de la cola. Tras un periodo de tiempo de 1, 4 o 6 horas, se sacrificaron grupos de dos ratones mediante asfixia con CO2 y se recogio la orina. Tras la filtracion a traves de un filtro Millex GV13, se evaluo la especiacion radioquimica usando un sistema de HPLC dotado de una columna C18, de 3,9 x 150 mm, Nova-Pak y un detector radioquimico. Se eluyo isocraticamente el sistema con metanol al 20 % que contenia TFA al 0,1 % a un caudal de 1 mlIminuto.
Se determino previamente que la via de eliminacion principal del 111In-DTPA-folato era a traves de la orina. De manera similar al perfil de HPLC mostrado en la Fig. 2, tanto el patron de 99mTc-EC20 como las muestras de orina presentaron cuatro picos radiactivos. Como se muestra en la Tabla 4 (que figura a continuacion), la pureza radioquimica del patron (suma de los picos C y D presumiblemente correspondientes a 99mTc-EC20 syn y anti) permanecio constante al -93 % durante las 6 horas que duro el presente experimento. La cantidad de 99mTc libre en el patron (pico A) fue del -2 %. Es importante destacar que se cree que el pico B de este perfil radioquimico es EC20 quelado con 99mTc en una posicion menos estable, no convencional; sin embargo, no se incluyo la radiactividad medida en esta fraccion en la estimacion de la pureza radioquimica global para 99mTc-EC20. Estos datos indican, en conjunto, que la formulacion permanecio estable en solucion salina a largo de estas 6 horas de investigacion.
Despues de 1 y 4 horas posteriores a la inyeccion en ratones BalcIC, el perfil de especiacion radioquimica de 99mTc-EC20 en la orina del raton permanecio invariable. Sin embargo, la radiactividad presente en la orina a las 6 horas de la inyeccion fue demasiado baja para someterse a ensayo de manera precisa mediante HPLC. La proporcion de farmaco original entre las especies radiactivas recuperadas en la orina permanecio relativamente constante al aproximadamente 90 % a lo largo de las cuatro horas durante las cuales se pudo cuantificar. Este valor es muy similar a la pureza del 93 % del patron que indica que el 99mTc-EC20 se excreta predominantemente en la orina en una forma no modificada.
Tabla 4. Excreci�n y metabolismo de 99mTc-Ec20 de los ratones Balb/c. Se inyecto a los ratones 1 mCi (6,7 nmol) de 99mTc-EC20 a traves de una vena lateral de la cola. En los puntos temporales indicados, se sacrificaron grupos de dos ratones y se extrajo la orina. A continuacion, se determino la especiacion radioquimica mediante HPLC. La suma de los picos C y D (isomeros syn y anti) en porcentaje de superficie se usa para calcular la pureza global de 99mTc-Ec20 intacto.
Pico
t.a. (min) Porcentaje de superficie
Patr�n de 99mTc-EC20
Muestras de orina (dos ratones/punto temporal)
0 h
1 h 6 h 1 h 4 h
A (pertecnetato)
1,4 2 2,1 1,8 8,3 6,3 9,4 10,2
B (desconocido)
3,4 4,5 4,5 4,8 2,5 2,6 5,4 0
C (isómero 1)
5,5 15,5 15,7 15,9 20,4 18,1 7,3 11,1
D (isómero 2)
18,5 78 77,7 77,5 68,8 73 77,9 78,7
Suma de C y D
93,5 93,4 93,4 89,2 91,1 85,2 89,8
Ejemplo 14
Union de proteina serica
Se usaron suero de rata recien preparado y suero comercial de ser humano varon (donantes de tipo AB, Sigma
10 Chemical Co.) para evaluar la union in vitro de 99mTc-EC20 con proteinas sericas. Un minuto despues de mezclar el 99mTc-EC20 con 1 ml de suero a temperatura ambiente, se transfirieron 0,3 ml de la solucion de suero a un dispositivo de ultrafiltracion limpio Centrifree� de Amicon (30.000 NMWL) por triplicado. Durante un minuto de carga de la centrifugadora con la solucion de suero, se centrifugo el dispositivo a 1.000 x g durante 20 minutos a 20 DC. Se transfirieron 50 !l de muestras de la solucion original, y del filtrado de cada dispositivo, a un tubo limpio y se realizo
15 el recuento en un contador gamma automatico. Se ultrafiltro una solucion de control de 99mTc-EC20 mezclada con 1 ml de solucion salina normal de una manera identica. Se calculo el porcentaje de 99mTc libre para cada una de las tres muestras.
Aunque el 99mTc-EC20 solo presento un nivel menor de union inespecifica con el dispositivo de ultrafiltracion ( �50), se descubrio que aproximadamente el 70 % del mismo se asocio predominantemente con la fraccion de proteina
20 serica de > 30 kDa en soluciones suero de rata o humano (69 % y 72 %, respectivamente). Es importante destacar que, como el 99mTc-EC20 se acumula eficaz y preferentemente dentro de los tejidos positivos en RF (vease la Tabla 2 y la Fig. 8), su evidente afinidad por las proteinas sericas no parece afectar a la capacidad de este radiotrazador para dirigirse a los RF in vivo.
Ejemplo 15
25 Estudios de distribucion tisular
Los protocolos usados en el presente ejemplo son similares a los descritos en el Ejemplo 11. Se evaluo ademas la capacidad de 99mTc-EC20 para dirigirse a tumores in vivo usando un modelo M109 positivo en RF y un modelo de tumor 4T1 negativo en RF. Se adquirieron ratones BalbIc hembra de seis semanas de edad (n = 3Igrupo de dosis) de Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, IN) y se mantuvieron con una dieta libre de folato (Harlan TEKLAD)
30 durante un total de siete dias antes de la inoculacion de las celulas tumorales.
Se inocularon celulas tumorales M109 positivas en RF, singenicas (2 x 106 P0 por animal) o celulas 4T1 negativas en RF (5 x 105 P0 por animal) subcutaneamente en 100 !l de RPMI-1640 libre de folato que contenia suero murino singenico. Se preparo una solucion madre de 99mTc-EC20 que contenia 100 !g de agente por mililitro el dia que se uso como se ha descrito anteriormente.
35 Dieciseis dias despues de la inoculacion de las celulas tumorales, se inyectaron a los animales por via intravenosa 500 o 1.800 nmolIkg de EC20 para los animales portadores de tumores M109 y 500 nmolIkg de EC20 para los animales portadores de tumores 4T1 (3 ratones por grupo de dosis). Todas las inyecciones fueron en volumenes de 100 !l. Cuatro horas despues de la inyeccion, se sacrificaron los animales por asfixia con CO2, se extrajo la sangre por puncion cardiaca y se diseccionaron los animales. Se extirparon los tejidos seleccionados (corazon, pulmones, higado, bazo, rifones, intestinos, estomago, musculares y tumorales), se pesaron y se realizo el recuento en un contador gamma automatico para determinar la distribucion de 99mTc. La captacion del producto radiofarmaceutico en terminos de porcentaje de dosis inyectada de peso humedo de tejido (% DIIg) se calculo por referencia a
5 patrones preparados a partir de diluciones de la preparacion inyectada.
Como se muestra en la Fig. 11, se demostro la direccion especifica al receptor de folato, porque el 99mTc-EC20 se acumulo predominantemente en los tumores M109 positivos en RF y en los rifones, y no en los tumores 4T1 negativos en RF. La captacion en los tumores 4T1 negativos en RF fue 7,6 veces inferior que en los tumores M109 positivos en RF. La captacion de 99mTc-EC20 en los tejidos normales, a excepcion, como era de esperar, del rifon,
10 fue baja. Estos resultados muestran que la direccion de 99mTc-EC20 es especifica de los RF.
Ejemplo 16
Estudios de distribucion tisular
Los protocolos usados en el presente ejemplo son similares a los descritos en el Ejemplo 11. Se evaluo la capacidad de 99mTc-EC11 (peptido A1), 99mTc-EC13 (peptido A3) y 99mTc-EC14 (peptido A2) para dirigirse a tumores in vivo 15 usando un modelo de tumor KB positivo en RF. Se mantuvieron ratones atimicos macho de cuatro semanas de edad (n = 4Igrupo) a una dieta libre de folato durante un total de diez dias antes de la inoculacion de las celulas tumorales.
Se inocularon celulas tumorales KB positivas en RF (0,25 x 106 por animal) subcutaneamente en la region intracapsular. Catorce dias despues de la inoculacion de las celulas tumorales, se inyectaron a los animales (n = 4Igrupo) por via intravenosa 99mTc-EC11, 99mTc-EC13 y 99mTc-EC14 a las dosis (aproximadamente 12 !gIkg) de los 20 conjugados mostrados en la Tabla 5 que figura a continuacion. Las soluciones madre de 99mTc-EC11, 99mTc-EC13 y 99mTc-EC14 se prepararon el dia de su uso como se ha descrito anteriormente. Se administro conjuntamente un exceso de aproximadamente 20 veces de folato libre (unos 200 !gIkg) a los animales de control (n = 4Igrupo). Cuatro horas despues de la inyeccion, se sacrificaron los animales por asfixia con CO2, se extrajo la sangre por puncion cardiaca y se diseccionaron los animales. Se extirparon los tejidos seleccionados, se pesaron y se realizo el
25 recuento en un contador gamma automatico para determinar la distribucion de 99mTc. La captacion del producto radiofarmaceutico en terminos de porcentaje de dosis inyectada de peso humedo de tejido (% DIIg) se calculo por referencia a patrones preparados a partir de diluciones de la preparacion inyectada.
Como se muestra en la Tabla 5, se demostro la direccion especifica al receptor de folato porque 99mTc-EC11, 99mTc-EC13 y 99mTc-EC14 se acumularon predominantemente en los tumores KB positivos en RF y en los rifones. La
30 acumulacion fue bloqueada por la administracion de acido folico libre. Estos resultados muestran que 99mTc-EC11, 99mTc-EC13 y 99mTc-EC14 se pueden dirigir a tumores in vivo de manera especifica de los RF.
Se obtuvieron resultados similares (vease la Tabla 6 que figura mas adelante) con 99mTc-EC53 (el enantiomero D completo de EC20) usando protocolos similares, a excepcion de que la dosis de 99mTc-EC53 fue de aproximadamente 50 !g, y que se uso un exceso 100 superior de folato libre o EC53 frio. Como se muestra en la
35 Tabla 6, se demostro la direccion especifica del receptor de folato, porque el 99mTc-EC53 se acumula predominantemente en los tumores KB positivos en RF y en los rifones. La acumulacion fue bloqueada por la administracion de acido folico libre. Estos resultados muestran que 99mTc-EC53 se puede dirigir a tumores in vivo de manera especifica del RF.
TABLA 5 (Continuacion)
Porcentaje de dosis de 99mTc inyectada por gramo (Masa húmeda de tejido)
P�ptido A1-Folato (EC 11)
P�ptido A2-Folato (EC14) P�ptido A3-Folato (EC13) HYNIC-Folato
Masa tumoral (g):
0,112 � 0,027 0,125 � 0,032 0,160 � 0,037 0,171 � 0,044 0,213 � 0,067 0,0773 � 0,041 0,179 � 0,060 0,150 � 0,068
Masa del animal (g):
28,9 � 1,3 27,1 � 1,6 27,6 � 0,6 27,3 � 2,7 30,0 � 1,3 27,5 � 1,4 27,5 � 1,4 29,0 � 2,0
Cantidad de animales y género:
4M 4M 4M 4M 4M 4M 4M 4M
Dosis de conjugado de folato (!g/kg):
11,9 � 0,5 13,04 � 1,12 12,6 � 0,4 12,87 � 1,53 11,7 � 0,9 13,03 � 1,05 1,58 � 0,03 1,46 � 0,08
Dosis de ácido fálico dihidratado t (!g/kg): (!mol/kg):
0 0 195,1 � 17,9 0,41 � 0,04 0 0 192,6 � 22,9 0,40 � 0,05 0 0 191,7 � 15,5 0,40 � 0,03 0 0 169,6 � 9,4 0,36 � 0,02
Porcentaje de dosis de 99mTc inyectada por gramo (Masa húmeda de tejido)
P�ptido A1-Folato (EC 11)
P�ptido A2-Folato (EC14) P�ptido A3-Folato (EC13) HYNIC-Folato
Sangre:
0,21 � 0,01 0,25 � 0,01 0,19 � 0,02 0,12 � 0,02 0,25 � 0,03 0,16 � 0,02 0,31 � 0,06 0,25 � 0,01
Coraz�n:
2,5 � 0,3 0,36 � 0,03 3,0 � 0,5 0,24 � 0,01 1,6 � 0,1 0,20 � 0,03 3,4 � 0,3 0,28 � 0,02
Pulmones:
1,2 � 0,2 0,35 � 0,03 1,6 � 0,3 0,24 � 0,02 1,1 � 0,1 0,23 � 0,02 1,2 � 0,2 0,29 � 0,03
H�gado y vesícula:
5,4 � 1,4 1,6 � 0,1 4,5 � 1,0 0,66 � 0,07 3,5 � 0,7 0,65 � 0,04 3,9 � 0,9 0,62 � 0,02
Bazo:
0,38 � 0,03 0,23 � 0,01 0,41 � 0,06 0,15 � 0,01 0,39 � 0,06 0,15 � 0,02 0,39 � 0,12 0,17 � 0,02
Ri��n (uno):
67,8 � 6,9 55,5 � 2,3 44,2 � 6,4 20,6 � 2,4 54,5 � 2,4 29,1 � 2,2 41,2 � 8,4 38,4 � 2,6
Est�mago, intestinos y contenido:
1,4 � 0,1 1,1 � 0,3 1,4 � 0,1 0,50 � 0,10 2,5 � 0,2 3,7 � 0,7 1,5 � 0,2 1,2 � 1,0
M�sculo:
1,8 � 0,1 0,38 � 0,06 2,4 � 0,4 0,26 � 0,02 1,7 � 0,2 0,21 � 0,03 2,2 � 0,3 0,36 � 0,06
Tumor:
2,95 � 0,57 1,47 � 0,24 5,57 � 0,76 2,0 � 0,5 5,46 � 0,45 1,67 � 0,24 4,64 � 0,67 2,31 � 0,27
Tumor/Sangre:
13,7 � 2,1 5,9 � 0,9 29,3 � 5,2 17,0 � 4,5 22,5 � 1,4 10,2 � 1,5 15,1 � 2,1 9,1 � 1,0
Tumor/Hígado:
0,57 � 0,14 0,94 � 0,09 1,3 � 0,3 3,0 � 0,6 1,6 � 0,2 2,6 � 0,3 1,3 � 0,3 3,7 � 0,5
Tumor/Ri��n:
0,043 � 0,005 0,027 � 0,005 0,13 � 0,03 0,10 � 0,01 0,10 � 0,01 0,058 � 0,010 0,11 � 0,01 0,069 � 0,003
Tumor/Músculo:
1,6 � 0,3 3,9 � 0,08 2,4 � 0,6 7,7 � 1,7 3,3 � 0,3 8,2 � 2,0 2,1 � 0,4 6,5 � 1,3
Los valores mostrados representan la media � la desviacion tipica. Se supuso que la sangre representaba el 5,5 % de la masa corporal total. Las proporciones de tumorItejido de fondo se basaron en los correspondientes datos de % de dosis inyectada por gramo. t Dosis de acido folico inyectada junto con la dosis de conjugado de 99mTc-Folato. n = 3
TABLA 6 (Continuacion)
99mTc-EC53
99mTc-EC53 más ácido fálico 99mTc-EC53 más EC53
Media
D.E. Media D.E. Media D.E.
Dosis del articulo de ensayo (ugIkg)
50,0 50,0 50,0
(nmolIkg)
67,0 67,0 67,0
Competidor coadministrado (nmolIkg)
6700,0 6700,0
Masa tumoral (g)
0,2 0,17 0,20 0,14 0,19 0,15
Animales
3H 3H 3H
Sangre
0,38 0,03 0,244 0,028 0,24 0,06
Corazon
1,09 0,28 0,15 0,03 0,19 0,03
Pulmon
0,89 0,30 0,23 0,04 0,26 0,07
Higado
3,86 0,96 4,49 1,15 3,77 0,48
Intestino
3,53 0,86 4,33 3,67 3,96 1,86
99mTc-EC53
99mTc-EC53 más ácido fálico 99mTc-EC53 más EC53
Rifon
77,99 6,19 10,12 6,91 7,97 1,52
Musculo
0,76 0,31 0,11 0,04 0,12 0,06
Bazo
0,67 0,22 0,27 0,06 0,41 0,11
Estomago
1,04 0,36 0,30 0,15 0,18 0,01
Tumor
11,77 4,26 0,53 0,11 1,88 1,56
TumorISangre
31,4 13,7 2,2 0,6 4,5 4,8
TumorIHigado
3,4 2,2 0,1 0,0 0,3 0,4
TumorIMusculo
17,1 7,0 5,2 1,4 8,5 8,0
TumorIRifon
0,2 0,07 0,07 0,05 0,14 0,16
DISCUSI�N
La invencion proporciona un procedimiento que incluye un conjugado de un folato y un quelante de radionuclido para el desarrollo clinico como agente de formacion de imagenes. Los ejemplos de dicho agente de formacion de 5 imagenes es el quelante de radionuclido a base de folato recientemente disefado, sintetizado y caracterizado radioquimicamente, 99mTc-EC20.
99mTc-EC20, un derivado peptidico de bajo peso molecular de folato que contiene un enlace peptidico D-�-Glu (vease la Fig. 1), se sintetizo usando un procedimiento sintetico eficaz en fase solida. En su forma natural, el folato (o pteroil-glutamato) tiene un solo residuo de glutamilo presente en una configuracion L. Sin embargo, se incorporo un
10 residuo de enantiomero D-Glu en la molecula de EC20. Es importante destacar que, al igual que en EC20, la sustitucion del residuo de L-Glu en el acido folico con un residuo de D-Glu no modifica la capacidad del acido folico para unirse al RF de alta afinidad.
Se descubrio que EC20 quela eficazmente 99mTc cuando esta en presencia de a-D-glucoheptonato y cloruro de estafo (II). Cuando se analizo mediante HPLC radioquimica, > 95 % de la formulacion de 99mTc-EC20 resultante
15 consistia en una mezcla de estereoisomeros syn y anti, cada uno igualmente capaz de unirse a RF con alta afinidad (vease la Fig. 3). Aproximadamente el 3 % del 99mTc de la formulacion estaba quelado a EC20 en algun otro sitio de la molecula de EC20 diferente del resto de Dap-Asp-Cys esperado. Aunque este componente no se aislo en cantidad suficiente para realizar una caracterizacion optima, se demostro que se une a RF con alta afinidad (vease la Fig. 6). Finalmente, el 2 % restante de la radiactividad de la formulacion de 99mTc-EC20 se atribuyo al 99mTc libre.
20 99mTc-EC20 demostro una asociacion dependiente tanto del tiempo como de la concentracion con celulas positivas en RF. 99mTc-EC20 se aclaro rapidamente de la sangre (T1I2 -4 min), lo cual es importante para los agentes de formacion de imagenes de diagnostico, y 99mTc-EC20 se acumulo preferentemente en grandes cantidades dentro de los tumores positivos en RF.
El rendimiento de 99mTc-EC20 se comparo directamente con el de un agente de direccion a RF similar, 111In-DTPA
25 folato, usando dos procedimientos diferentes. En primer lugar, se descubrio que ambos productos radiofarmaceuticos a base de folato compiten por igual con el acido folico para unirse a los RF de KB (vease la Fig. 3 y la Tabla 1). En segundo lugar, la biodistribucion de cada agente en ratones portadores del tumor fue casi identica (vease la Tabla 2). Se midieron la alta captacion de los tumores y las altas proporciones de tumor con respecto a la sangre para 99mTc-EC20. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que al igual que el 111In-DTPA-folato, el
30 99mTc-EC20 se localizara eficazmente en los tumores positivos en RF cuando se administra clinicamente a los pacientes.
Son varios los conjugados de 99mTc a base de folato ya descritos. Hay datos de biodistribucion limitada disponibles sobre un conjugado de 99mTc-12-amino-3,3,9,9-tetrametil-5-oxa-4,8,diaza-2,10-dodecanodiona-dioxima (OXA)-folato; sin embargo, se ha informado sobre niveles moderados (-7 % DIIg) de captacion de trazador en un tumor KB. 35 Tambien se han publicado estudios que incluyen la biodistribucion de un conjugado de 99mTc-etilendicisteina-folato en ratas portadoras de tumores de mama. Las ratas de aquel estudio se alimentaron con una dieta rica en folato. De este modo, se obtuvieron una baja captacion tumoral y bajas proporciones de tumor con respecto a la sangre. Por ultimo, se observo la acumulacion de un derivado de 99mTc-6-hidrazinonicotinamido-hidrazido (HYNIC)-folato (HYNIC-folato) en grandes cantidades dentro de tumores 24JK-FBP. Curiosamente, el 99mTc-EC20 se acumulo 40 dentro de tumores M109 a niveles casi identicos a los de HYNIC-folato en tumores 241K-FBP (-17 % de DIIg) (Tabla 2). Estos dos agentes tambien presentaron unas proporciones de tumor con respecto a la sangre de 50:1 a las 4
horas de la inyeccion intravenosa.
En resumen, se creo un nuevo derivado de peptido de folato para quelar eficazmente 99mTc. Este nuevo compuesto, el 99mTc-EC20, se une con avidez a las celulas tumorales positivas en RF in vitro e in vivo. Se descubrio que EC20 se une a celulas tumorales positivas en el receptor de folato (RF) cultivadas de una manera dependiente tanto del tiempo como de la concentracion con muy alta afinidad (KD -3 nM). Usando un ensayo de afinidad relativa in vitro, tambien se descubrio que EC20 compite eficazmente con 3H-acido folico por la union celular cuando se presenta bien solo o en forma de un quelato de metal formulado. Tras la inyeccion intravenosa en ratones BalbIc, el 99mTc-EC20 se retiro rapidamente de la circulacion (t1I2 en plasma -4 min) y se excreto en la orina en forma no metabolizada. Los datos de gammografia y los estudios cuantitativos de biodistribucion realizados en los ratones BalbIc portadores de tumores M109 confirmaron que 99mTc-EC20 se acumula predominantemente en los tejidos tumorales positivos en RF y renales. Estos resultados muestran que 99mTc-EC20 es un agente de formacion de imagenes de radiodiagnostico eficaz y no invasivo para la deteccion de tumores positivos en RF. Otros agentes de formacion de imagenes relacionados con EC20 tambien demostraron ser eficaces, incluyendo EC11, EC13, EC14 y EC53.
Cada afo, en Estados Unidos, a -26.000 mujeres se les diagnostica cancer de ovario, y menos del 50 % de las mujeres sobrevive mas de cinco afos. Una de las razones de la baja tasa de supervivencia es la dificultad de diagnosticar este tipo de cancer. Debido al temor de romper una masa abdominal no identificada y al potencial de propagacion del cancer a lo largo de la cavidad abdominal, no se suele realizar la biopsia con aguja fina. En su lugar, el diagnostico y la estadificacion de las masas ovaricas sospechosas normalmente se realizan a traves de una laparotomia quirurgica, que es un procedimiento invasivo y costoso. Como el 99mTc-EC20 se une estrechamente con el RF presente en grandes cantidades en los canceres de ovario (entre otros), este producto radiofarmaceutico proporciona un procedimiento barato y no invasivo, pero fiable para el diagnostico precoz del cancer de ovario maligno. Es importante destacar que el 99mTc-EC20 tambien puede ayudar a guiar el procedimiento de toma de decisiones clinicas, haciendo posible un diagnostico mas definitivo y mas precoz de la enfermedad recurrente o residual.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de formacion de imagenes de una poblacion de celulas tumorales en un animal que comprende la administracion de una cantidad eficaz de un compuesto de formula:
    5 quelado a un cation de un radionuclido.
  2. 2.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que las celulas tumorales son celulas tumorales positivas en el receptor de folato.
  3. 3.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que las celulas tumorales son seleccionadas del grupo que consiste en celulas de carcinoma, celulas de carcinoma nasofaringeo, celulas de sarcoma, celulas de
    10 linfoma, celulas de linfoma de Burkitt, celulas de la enfermedad de Hodgekin, celulas de melanoma, celulas de mesotelioma y celulas de mieloma.
  4. 4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que las celulas tumorales son seleccionadas del grupo que consiste en celulas de cancer oral, celulas de cancer nasofaringeo, celulas de cancer de tiroides, celulas de cancer endocrino, celulas de cancer de piel, celulas de cancer gastrico, celulas de cancer de esofago, celulas de
    15 cancer de laringe, celulas de cancer de garganta, celulas de cancer de pancreas, celulas de cancer de colon, celulas de cancer de vejiga, celulas de cancer de hueso, celulas de cancer de ovario, celulas de cancer de cuello uterino, celulas de cancer de utero, celulas de cancer de mama, celulas de cancer de testiculo, celulas de cancer de prostata, celulas de cancer rectal, celulas de cancer renal, celulas de cancer hepatico, celulas de cancer pulmonar y celulas de cancer cerebral.
    20 5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el radionuclido es un radioisotopo de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.
  5. 6.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que el radionuclido es seleccionado de entre 99mTc, 111ln, 64Cu, 67Cu, 67Ga y 68Ga.
  6. 7.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el radionuclido es 99mTc.
    FIG. 13
ES10179508.6T 2002-05-06 2003-05-06 Agentes de formación de imágenes dirigidos al receptor de folato Expired - Lifetime ES2472423T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37857102P 2002-05-06 2002-05-06
US378571P 2002-05-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2472423T3 true ES2472423T3 (es) 2014-07-01

Family

ID=29401611

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03733967T Expired - Lifetime ES2336780T3 (es) 2002-05-06 2003-05-06 Agentes de formacion de imagenes dirigidos al receptor de folato.
ES09171503.7T Expired - Lifetime ES2438008T3 (es) 2002-05-06 2003-05-06 Agentes de formación de imágenes dirigidos a vitaminas
ES10179448.5T Expired - Lifetime ES2500922T3 (es) 2002-05-06 2003-05-06 Agentes de formación de imágenes dirigidos al receptor de folato
ES10179508.6T Expired - Lifetime ES2472423T3 (es) 2002-05-06 2003-05-06 Agentes de formación de imágenes dirigidos al receptor de folato

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03733967T Expired - Lifetime ES2336780T3 (es) 2002-05-06 2003-05-06 Agentes de formacion de imagenes dirigidos al receptor de folato.
ES09171503.7T Expired - Lifetime ES2438008T3 (es) 2002-05-06 2003-05-06 Agentes de formación de imágenes dirigidos a vitaminas
ES10179448.5T Expired - Lifetime ES2500922T3 (es) 2002-05-06 2003-05-06 Agentes de formación de imágenes dirigidos al receptor de folato

Country Status (19)

Country Link
US (5) US7128893B2 (es)
EP (4) EP2260875B1 (es)
JP (1) JP4801348B2 (es)
KR (1) KR100978418B1 (es)
CN (2) CN101648028B (es)
AT (1) ATE448799T1 (es)
AU (1) AU2003239383C1 (es)
CA (1) CA2484345C (es)
CY (1) CY1114733T1 (es)
DE (1) DE60330135D1 (es)
DK (3) DK2260875T3 (es)
ES (4) ES2336780T3 (es)
HK (1) HK1141440A1 (es)
IL (1) IL164811A (es)
NZ (1) NZ536467A (es)
PT (2) PT2151250E (es)
SI (2) SI2151250T1 (es)
WO (1) WO2003092742A1 (es)
ZA (1) ZA200408664B (es)

Families Citing this family (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7875612B2 (en) 2001-04-24 2011-01-25 Purdue Research Foundation Folate mimetics and folate-receptor binding conjugates thereof
MXPA03010035A (es) 2001-05-02 2004-06-30 Purdue Research Foundation Tratamiento y diagnostico de enfermedades mediadas por macrofagos.
US8043603B2 (en) * 2002-02-07 2011-10-25 Endocyte, Inc. Folate targeted enhanced tumor and folate receptor positive tissue optical imaging technology
US8043602B2 (en) 2002-02-07 2011-10-25 Endocyte, Inc. Folate targeted enhanced tumor and folate receptor positive tissue optical imaging technology
CN101648028B (zh) * 2002-05-06 2012-11-21 恩多塞特公司 维生素-定向的显象剂
ATE426414T1 (de) * 2002-05-15 2009-04-15 Endocyte Inc Vitamin-mitomycin-konjugate
TWI367096B (en) 2003-01-27 2012-07-01 Endocyte Inc Vitamin-receptor binding drug delivery conjugates and pharmaceutical compositions
EP1622646B1 (en) * 2003-05-06 2012-08-08 Purdue Research Foundation Treatment of lupus targeting the macrophages or the folate receptor
CA2527196C (en) 2003-05-30 2012-10-16 Purdue Research Foundation Diagnostic method for atherosclerosis
WO2006012527A1 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
JP2008519859A (ja) * 2004-11-10 2008-06-12 ユニバーシティー オブ サウス フロリダ 標的化した薬物送達のための白金錯体
EP1827239B1 (en) * 2004-12-23 2019-04-17 Purdue Research Foundation Positron emission tomography imaging method
CN101175757B (zh) * 2005-03-16 2012-11-14 恩多塞特公司 蝶酸及其缀合物的合成和纯化
JP5175723B2 (ja) * 2005-07-05 2013-04-03 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション 単球介在性疾患を治療するための組成物の調製
KR20130113543A (ko) 2005-08-19 2013-10-15 엔도사이트, 인코포레이티드 복수-약제 리간드 공액체
US20080280937A1 (en) * 2005-08-19 2008-11-13 Christopher Paul Leamon Ligand Conjugates of Vinca Alkaloids, Analogs, and Derivatives
EP1940473A2 (en) 2005-09-23 2008-07-09 Purdue Research Foundation Multiphoton in vivo flow cytometry method and device
EP2087337A4 (en) * 2006-11-03 2010-09-08 Purdue Research Foundation METHOD AND DEVICE FOR EX-VIVO FLOW CYTOMETRY
CA2677792C (en) * 2007-02-07 2015-04-14 Purdue Research Foundation Positron emission tomography imaging method
EP2606911A1 (en) 2007-02-16 2013-06-26 KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH Receptor And Antigen Targeted Prodrug
WO2008101231A2 (en) * 2007-02-16 2008-08-21 Endocyte, Inc. Methods and compositions for treating and diagnosing kidney disease
EP2481427A1 (en) * 2007-03-14 2012-08-01 Endocyte, Inc. Folate-Tubulysin conjugates
PT2146944E (pt) 2007-04-11 2014-03-11 Merck & Cie Processo para a preparação de folatos marcados com 18f
EP2146995A1 (en) * 2007-04-11 2010-01-27 Merck Eprova AG Folate-conjugates and corresponding metal-chelate complexes for use in diagnostic imaging and radiotherapy
CA2688308A1 (en) * 2007-05-25 2008-12-04 Purdue Research Foundation Method of imaging localized infections
RU2523909C2 (ru) 2007-06-25 2014-07-27 Эндосайт, Инк. Конъюгаты, содержащие гидрофильные спейсеры линкеров
US9877965B2 (en) 2007-06-25 2018-01-30 Endocyte, Inc. Vitamin receptor drug delivery conjugates for treating inflammation
JP2010536790A (ja) 2007-08-17 2010-12-02 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション Ｐｓｍａ結合性リガンド−リンカー結合体及び使用方法
US9187521B2 (en) 2007-10-25 2015-11-17 Endocyte, Inc. Tubulysins and processes for preparing
CN101903037A (zh) * 2007-11-15 2010-12-01 恩多塞特公司 施用偶合物的方法
US9332973B2 (en) 2008-10-01 2016-05-10 Covidien Lp Needle biopsy device with exchangeable needle and integrated needle protection
US8968210B2 (en) 2008-10-01 2015-03-03 Covidien LLP Device for needle biopsy with integrated needle protection
US11298113B2 (en) 2008-10-01 2022-04-12 Covidien Lp Device for needle biopsy with integrated needle protection
US9186128B2 (en) 2008-10-01 2015-11-17 Covidien Lp Needle biopsy device
US9782565B2 (en) 2008-10-01 2017-10-10 Covidien Lp Endoscopic ultrasound-guided biliary access system
WO2010083104A2 (en) 2009-01-13 2010-07-22 Emory University Conjugates of noscapine and folic acid and their use in treating cancer
AU2010221419B2 (en) 2009-03-02 2015-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid chemical modifications
US20120003151A1 (en) * 2009-03-05 2012-01-05 Purdue Research Foundation Method for early imaging of atherosclerosis
US9951324B2 (en) 2010-02-25 2018-04-24 Purdue Research Foundation PSMA binding ligand-linker conjugates and methods for using
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
DK2556171T3 (en) 2010-04-05 2015-12-14 Prognosys Biosciences Inc Spatially CODED BIOLOGICAL ASSAYS
WO2011130716A2 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Access Pharmaceuticals, Inc. A nanostructures containing vitamin b12 for facilitated delivery of drugs across biological barriers
US20130260460A1 (en) 2010-04-22 2013-10-03 Isis Pharmaceuticals Inc Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides
WO2011133876A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
EP2683410A2 (en) 2011-03-08 2014-01-15 Access Pharmaceuticals, Inc. Targeted nanocarrier systems for delivery of actives across biological membranes
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
CA2839647C (en) 2011-08-17 2022-08-16 Merck & Cie Folate conjugates of albumin-binding entities
WO2013103707A1 (en) 2012-01-03 2013-07-11 Invictus Oncology Pvt. Ltd. Ligand-targeted molecules and methods thereof
US10080805B2 (en) 2012-02-24 2018-09-25 Purdue Research Foundation Cholecystokinin B receptor targeting for imaging and therapy
WO2013130776A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Purdue Research Foundation Folate receptor alpha binding ligands
US20140080175A1 (en) 2012-03-29 2014-03-20 Endocyte, Inc. Processes for preparing tubulysin derivatives and conjugates thereof
EP2877095A4 (en) * 2012-07-25 2016-04-20 Univ Emory IMAGING AND THERAPEUTIC METHODS FOR THE TREATMENT OF PARATHYROID TUMORS
EA201590622A1 (ru) 2012-10-16 2015-10-30 Эндосайт, Инк. Конъюгаты для доставки лекарственного средства, содержащие не встречающиеся в природе аминокислоты, и способы применения
KR101551232B1 (ko) 2012-10-26 2015-09-10 한국원자력연구원 Ｎ3ｓ1형의 새로운 킬레이터가 접합된 폴레이트 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 진단 또는 치료용 조성물
BR112015011118B1 (pt) 2012-11-15 2022-12-13 Endocyte, Inc Conjugado; composição farmacêutica; e uso de um conjugado
WO2014150943A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Purdue Research Foundation Asthma imaging and therapy
CN111662960B (zh) 2013-06-25 2024-04-12 普罗格诺西斯生物科学公司 采用微流控装置的空间编码生物分析
TN2016000137A1 (en) 2013-10-18 2017-10-06 Deutsches Krebsforsch Labeled inhibitors of prostate specific membrane antigen (psma), their use as imaging agents and pharmaceutical agents for the treatment of prostate cancer.
EA035171B1 (ru) * 2013-11-14 2020-05-08 Эндосайт, Инк. Конъюгаты на основе связывающихся с psma лигандов или ингибиторов psma для позитронно-эмиссионной томографии
EP3574924B1 (en) 2013-11-19 2021-01-06 Purdue Research Foundation Patient selection method for inflammation
AU2015241198A1 (en) 2014-04-03 2016-11-17 Invictus Oncology Pvt. Ltd. Supramolecular combinatorial therapeutics
US9850183B2 (en) 2014-06-27 2017-12-26 Reiley Pharmaceuticals, Inc. Conjugates derived from non-steroidal anti-inflammatory drugs and methods of use thereof in imaging
US20160166679A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 Purdue Research Foundation Method of treatment using folate conjugates and tyrosine kinase inhibitors
US20170369872A1 (en) 2014-12-18 2017-12-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir tm compounds
US10188759B2 (en) 2015-01-07 2019-01-29 Endocyte, Inc. Conjugates for imaging
EP3242688B1 (en) 2015-01-09 2020-01-29 Reiley Pharmaceuticals, Inc. Cox-2-targeting, platinum-containing conjugates and their use in the treatment of tumors and cancers
DK3901281T3 (da) 2015-04-10 2023-01-23 Spatial Transcriptomics Ab Rumligt adskilt, multipleks nukleinsyreanalyse af biologiske prøver
US11053495B2 (en) 2015-07-17 2021-07-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multi-targeted single entity conjugates
ES2811347T3 (es) * 2015-08-14 2021-03-11 Endocyte Inc Método de formación de imágenes con un compuesto quelante
SG10202108763UA (en) 2015-12-04 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
EP3429575A4 (en) 2016-03-16 2019-10-23 Purdue Research Foundation AGAINST CARBOANHYDRASE-IX DRUGS AND METHODS
WO2017161144A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Endocyte, Inc. Carbonic anhydrase ix inhibitor conjugates and uses thereof
US20170296679A1 (en) * 2016-04-18 2017-10-19 Intuitive Surgical Operations, Inc. Compositions of Near IR Closed Chain, Sulfo-Cyanine Dyes and Prostate Specific Membrane Antigen Ligands
EP3672615A4 (en) 2017-08-22 2021-04-21 Purdue Research Foundation FBSA-BASED THERAPEUTIC AND RADIO-IMAGING CONJUGATES TARGETING CARBONIC ANHYDRASE POSITIVE CANCERS
JP7353301B2 (ja) 2018-05-07 2023-09-29 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド 肝臓外送達
EP3856907A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases
US20220211743A1 (en) 2019-05-17 2022-07-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oral delivery of oligonucleotides
WO2021086982A2 (en) 2019-10-28 2021-05-06 Beckman Coulter, Inc. Compounds for the identification of microbial classes and uses thereof
MX2022005220A (es) 2019-11-06 2022-08-11 Alnylam Pharmaceuticals Inc Suministro extrahepático.
EP4055165A1 (en) 2019-11-06 2022-09-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
US20230257745A1 (en) 2020-07-10 2023-08-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Circular siRNAs
CA3196969A1 (en) 2020-10-30 2022-05-05 Tod SPEER Oligonucleotide-based therapeutics and uses thereof
EP4271695A2 (en) 2020-12-31 2023-11-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified nucleoside based oligonucleotide prodrugs
KR20230136130A (ko) 2020-12-31 2023-09-26 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 시클릭-디설파이드 개질된 인산염 기반 올리고뉴클레오티드전구약물
WO2022150721A1 (en) * 2021-01-08 2022-07-14 Lycia Therapeutics, Inc. Bifunctional folate receptor binding compounds
WO2023283403A2 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bis-rnai compounds for cns delivery
KR20240036041A (ko) 2021-07-21 2024-03-19 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 대사 장애-연관 표적 유전자 iRNA 조성물 및 이의 사용 방법
WO2023064530A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Extra-hepatic delivery irna compositions and methods of use thereof
WO2023220744A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded loop oligonucleotides
WO2024006999A2 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cyclic-disulfide modified phosphate based oligonucleotide prodrugs
WO2024073732A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified double-stranded rna agents

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2816110A (en) 1956-11-23 1957-12-10 Merck & Co Inc Methods for the production of substituted pteridines
US5140104A (en) 1982-03-09 1992-08-18 Cytogen Corporation Amine derivatives of folic acid analogs
US5242679A (en) * 1985-01-14 1993-09-07 Neorx Corporation Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy
US5175343A (en) * 1985-01-14 1992-12-29 Neorx Corporation Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy
NZ217821A (en) 1985-10-10 1989-07-27 Biotech Australia Pty Ltd Oral delivery system; complex of active agent and vitamin b12 or analogue thereof
GB8608335D0 (en) 1986-04-04 1986-05-08 Pfizer Ltd Pharmaceutically acceptable salts
EP0273085A1 (en) 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells
US5053493A (en) * 1987-04-02 1991-10-01 Centocor Cardiovascular Imaging Partners, L.P. Method for labeling antibodies with a metal ion
US5688488A (en) * 1989-04-03 1997-11-18 Purdue Research Foundation Composition and method for tumor imaging
US7238340B1 (en) * 1991-11-27 2007-07-03 Cis Bio International Monoamine, diamide, thiol-containing metal chelating agents
EP0570493B1 (en) * 1991-02-08 2000-01-05 Diatide, Inc. TECHNETIUM-99m LABELED POLYPEPTIDES FOR IMAGING
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5159079A (en) 1991-12-20 1992-10-27 Eli Lilly And Company 2-piperidones as intermediates for 5-deaza-10-oxo- and 5-deaza-10-thio-5,6,7,8-tetrahydrofolic acids
US6022966A (en) 1993-11-22 2000-02-08 Neorx Corporation Pretargeting methods and compounds
DE4310999C2 (de) * 1993-03-31 1996-07-18 Diagnostikforschung Inst Bifunktionelle chalkogenatom-unterbrochene Chelatbildner vom Typ XN¶1¶S¶1¶X' für radioaktive Isotope und deren Metallkomplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese enthaltende pharmazeutische Mittel
DE4311023C2 (de) * 1993-03-31 1996-05-02 Diagnostikforschung Inst Bifunktionelle chalkogenatom-unterbrochene Chelatbildner von Typ XN¶1¶S¶1¶O¶1¶ für radioaktive Isotope, deren Metallkomplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese enthaltende pharmazeutische Mittel
DE4311021A1 (de) * 1993-03-31 1994-10-27 Diagnostikforschung Inst Bifunktionelle Chelatbildner, deren Technetium- und Rhenium-Komplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende radiopharmazeutische Mittel
DE4311022C2 (de) * 1993-03-31 1996-07-11 Diagnostikforschung Inst Bifunktionelle chalkogenatom-unterbrochene Chelatbildner vom Typ S¶3¶N¶2¶ für radioaktive Isotope und deren Metallkomplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese enthaltende pharmazeutische Mittel
DE4425781A1 (de) * 1994-07-14 1996-01-18 Schering Ag Technetium-Sulfonamid-Komplexe, deren Verwendung, diese enthaltende pharmazeutische Mittel, sowie Verfahren zur Herstellung der Komplexe und Mittel
US6083480A (en) * 1997-05-01 2000-07-04 Diatide, Inc. Calcitonin receptor binding reagents
US6093382A (en) * 1998-05-16 2000-07-25 Bracco Research Usa Inc. Metal complexes derivatized with folate for use in diagnostic and therapeutic applications
US6323313B1 (en) * 1999-06-01 2001-11-27 The University Of Washington Annexin derivative with endogenous chelation sites
CA2410906C (en) * 2000-06-02 2012-10-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Ethylenedicysteine (ec)-drug conjugates
MXPA03010035A (es) 2001-05-02 2004-06-30 Purdue Research Foundation Tratamiento y diagnostico de enfermedades mediadas por macrofagos.
CN101648028B (zh) * 2002-05-06 2012-11-21 恩多塞特公司 维生素-定向的显象剂
TWI367096B (en) * 2003-01-27 2012-07-01 Endocyte Inc Vitamin-receptor binding drug delivery conjugates and pharmaceutical compositions
EP1622646B1 (en) * 2003-05-06 2012-08-08 Purdue Research Foundation Treatment of lupus targeting the macrophages or the folate receptor

Also Published As

Publication number Publication date
CN101648028B (zh) 2012-11-21
EP2260875A3 (en) 2011-08-24
AU2003239383C1 (en) 2009-03-19
US7128893B2 (en) 2006-10-31
SI2151250T1 (sl) 2014-02-28
US8834842B2 (en) 2014-09-16
ES2500922T3 (es) 2014-10-01
EP2151250B1 (en) 2013-10-02
DK2258401T3 (da) 2014-10-13
AU2003239383B2 (en) 2008-10-16
SI2260875T1 (sl) 2014-07-31
US20090324499A1 (en) 2009-12-31
US8313728B2 (en) 2012-11-20
IL164811A (en) 2012-06-28
ZA200408664B (en) 2007-04-25
EP1501551A4 (en) 2006-01-11
CN100528241C (zh) 2009-08-19
EP2258401A3 (en) 2011-08-24
EP2258401A2 (en) 2010-12-08
EP1501551A1 (en) 2005-02-02
EP2151250A1 (en) 2010-02-10
EP2258401B1 (en) 2014-07-09
PT2260875E (pt) 2014-06-25
EP1501551B1 (en) 2009-11-18
CN101648028A (zh) 2010-02-17
EP2260875B1 (en) 2014-04-23
PT2151250E (pt) 2013-12-09
DE60330135D1 (de) 2009-12-31
CA2484345A1 (en) 2003-11-13
CA2484345C (en) 2015-09-29
US20130237687A1 (en) 2013-09-12
CN1662263A (zh) 2005-08-31
US20070031334A1 (en) 2007-02-08
DK2151250T3 (da) 2013-12-16
US8865126B2 (en) 2014-10-21
US20040033195A1 (en) 2004-02-19
NZ536467A (en) 2006-11-30
KR100978418B1 (ko) 2010-08-26
ES2438008T3 (es) 2014-01-15
JP2006501149A (ja) 2006-01-12
HK1141440A1 (en) 2010-11-12
DK2260875T3 (da) 2014-06-30
JP2011012066A (ja) 2011-01-20
AU2003239383A1 (en) 2003-11-17
JP4801786B2 (ja) 2011-10-26
ES2336780T3 (es) 2010-04-16
CY1114733T1 (el) 2016-12-14
US7862798B2 (en) 2011-01-04
ATE448799T1 (de) 2009-12-15
KR20040104686A (ko) 2004-12-10
US20140065068A1 (en) 2014-03-06
WO2003092742A1 (en) 2003-11-13
JP4801348B2 (ja) 2011-10-26
EP2260875A2 (en) 2010-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2472423T3 (es) Agentes de formación de imágenes dirigidos al receptor de folato
US20220125958A1 (en) Compounds for positron emission tomography
US9365599B2 (en) N3S1 chelator-folate derivatives, preparation method thereof and composition for diagnosis or treatment of cancer containing the same as an active ingredient
JP4801786B6 (ja) ビタミンを標的とした造影剤
KR101551232B1 (ko) Ｎ3ｓ1형의 새로운 킬레이터가 접합된 폴레이트 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 진단 또는 치료용 조성물
NZ719939B2 (en) Compounds for positron emission tomography