ES2336780T3 - Agentes de formacion de imagenes dirigidos al receptor de folato. - Google Patents
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Abstract
Compuesto de fórmula **(Ver fórmula)** en la que V es un folato, en la que el folato se une a un receptor de folato, y en la que el folato es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptor in vivo, o un derivado o análogo del mismo, en la que el análogo se selecciona de análogos desaza y didesaza de ácido fólico, ácido folínico, ácido pteroico, ácido pteropoliglutámico y pteridinas que se unen al receptor de folato, o de aminopterina, ametopterina (metotrexato), N10-metilfolato, 2-desamino-hidroxifolato, análogos desaza y ácido 3''5''-dicloro-4-amino-4-desoxi-N10-metilpteroilglutámico (diclorometotrexato), en la que el derivado o análogo se une al receptor de folato y es un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptor in vivo; L es un conector divalente; R es una cadena lateral de un aminoácido de fórmula H2NCHRCOOH; M es un catión de un radionúclido; n es 1 ó 0; y k es 1 ó 0, con la condición de que (i) si k = 0, el compuesto no es el compuesto EC20: **(Ver fórmula)** y si dicho k = 1 y dicho compuesto es EC20, M no es 99mTc.
Description
Agentes de formación de imágenes dirigidos al
receptor de folato.
La invención se refiere a compuestos y a métodos
para dirigir un agente de formación de imágenes a células de un
animal. Más particularmente, los agentes de formación de imágenes a
base de radionúclido se dirigen a células que tienen receptores
para una vitamina usando una vitamina de este tipo, o un derivado o
un análogo de la misma que se une al receptor de vitamina, como el
ligando dirigido para el agente de formación de imágenes.
El transporte transmembrana es una función
celular crítica. Puesto que los médicos han reconocido la
importancia del transporte transmembrana para muchas áreas de la
ciencia biológica y médica, incluyendo el tratamiento farmacológico
y la transferencia génica, se han realizado esfuerzos de
investigación significativos dirigidos a la comprensión y la
aplicación de tales procesos. Así, por ejemplo, se ha intentado el
suministro transmembrana de ácidos nucleicos a través del uso de
soportes de proteínas, soportes de anticuerpos, sistemas de
suministro liposómicos, electroporación, inyección directa, fusión
celular, soportes virales, choque osmótico y transformación mediada
por calcio-fosfato. Sin embargo, muchas de estas
técnicas están limitadas tanto por los tipos de células en los que
se produce el transporte transmembrana como por las condiciones
requeridas para el transporte transmembrana satisfactorio de
moléculas exógenas. Además, muchas de estas técnicas están limitadas
por el tipo y el tamaño de la molécula exógena que puede
transportarse a través de la membrana celular sin pérdida de
bioactividad.
Un mecanismo para el transporte transmembrana de
las moléculas exógenas que tiene amplia aplicabilidad es la
endocitosis mediada por receptor. Ventajosamente, la endocitosis
mediada por receptor se produce tanto in vivo como in
vitro. La endocitosis mediada por receptor implica el movimiento
de ligandos unidos a receptores de membrana hacia el interior de
una zona limitada por la membrana a través de la invaginación de la
membrana. El proceso se inicia o activa mediante la unión de un
ligando específico de receptores al receptor. Se han caracterizado
muchos sistemas endocitóticos mediados por receptor, incluyendo
aquellos que dan como resultado la internalización de galactosa,
manosa, manosa-6-fosfato,
transferrina, asialoglicoproteína, folato, transcobalamina
(vitamina B12),
\alpha-2-macroglobulinas, insulina
y otros factores de crecimiento peptídicos tales como factor de
crecimiento epidérmico (EGF).
Se ha utilizado la endocitosis mediada por
receptor para suministrar moléculas exógenas tales como proteínas y
ácidos nucleicos a células. Generalmente, un ligando específico se
conjuga químicamente mediante unión de hidrógeno, iónica o
covalente a una molécula exógena de interés, formando una molécula
conjugada que tiene un resto (la parte de ligando) que todavía se
reconoce en el conjugado por un receptor diana. Usando esta
técnica, se ha conjugado la proteína fototóxica psoraleno con
insulina y se ha internalizado mediante la ruta endocitótica del
receptor de insulina (Gasparro, Biochem. Biophys. Res. Comm. 141 (2)
págs. 502-509, 15 de diciembre de 1986); se ha
utilizado el receptor específico de hepatocitos para
asialoglicoproteínas de galactosa-terminales para
el suministro transmembrana específico de hepatocitos de
asialoorosomucoide-poli-L-lisina
complejada no covalentemente con un plásmido (Wu, G. Y., J. Biol.
Chem., 262 (10), págs. 4429-4432, 1987); se ha
utilizado el receptor celular para EGF para suministrar
polinucleótidos unidos covalentemente a EGF al interior de la
célula (Myers, solicitud de patente europea 86810614.7, publicada el
6 de junio de 1988); se ha usado el receptor celular ubicado en el
intestino para el complejo organometálico vitamina
B12-factor intrínseco para mediar en el suministro
de un fármaco, una hormona, un péptido bioactivo y un inmunógeno
complejado con vitamina B12 al sistema circulatorio tras la
administración oral (Russell-Jones et al.,
solicitud de patente europea 86307849.9, publicada el 29 de abril
de 1987); se ha usado el receptor de
manosa-6-fosfato para suministrar
lipoproteínas de baja densidad a células (Murray, G. J. y Neville,
D. M., Jr., J. Biol. Chem, vol. 255 (24), págs.
1194-11948, 1980); se ha usado el receptor de la
subunidad de unión a la toxina del cólera para suministrar insulina
a células que carecían de receptores de insulina (Roth y Maddox, J.
Cell. Phys. vol. 115, pág. 151, 1983); y se ha empleado el receptor
de gonadotropina coriónica humana para suministrar una cadena
\alpha de ricina acoplada
a GCH a células con el receptor de GCH apropiado (Oeltmann y Heath, J. Biol. Chem, vol. 254, pág. 1028 (1979)).
a GCH a células con el receptor de GCH apropiado (Oeltmann y Heath, J. Biol. Chem, vol. 254, pág. 1028 (1979)).
En una realización, la presente invención
implica el transporte transmembrana de un agente de formación de
imágenes a base de radionúclidos a través de una membrana que tiene
receptores para una vitamina, o un derivado que se une al receptor
de vitamina o análogo de la misma. Una membrana celular que tiene
receptores de vitamina, o receptores para derivados o análogos de
la vitamina, se pone en contacto con un conjugado de
vitamina-agente de formación de imágenes durante un
tiempo suficiente para iniciar y permitir el transporte
transmembrana del conjugado, y se monitoriza la biodistribución del
conjugado de vitamina-agente de formación de
imágenes en el animal. En otra realización, el resto dirigido a la
vitamina/derivado o análogo de la vitamina se une simplemente a un
receptor de vitamina de la superficie celular para concentrar el
radionúclido quelado sobre la superficie celular.
La invención aprovecha (1) la ubicación de los
receptores de vitamina y (2) los procesos endocíticos mediados por
receptor asociados. Por ejemplo, la invención aprovecha la expresión
única, sobreexpresión o expresión preferencial de receptores de
vitamina, transportadores u otras proteínas presentes en la
superficie que se unen específicamente a vitaminas, o derivados o
análogos de las mismas, en células tumorales u otros tipos
celulares que sobreexpresan tales receptores. Por consiguiente, la
invención puede usarse para detectar células, tales como células
tumorales u otros tipos celulares, que sobreexpresan los receptores
de vitamina, o los receptores para los derivados o análogos de la
vitamina, aprovechando los procesos endocíticos mediados por
receptor que se producen cuando se ponen en contacto tales células
con el conjugado de vitamina-agente de formación de
imágenes.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los receptores de vitamina, tales como el
receptor de folato (RF) de alta afinidad, se expresan a niveles
altos, por ejemplo, en células cancerosas. Se ha notificado que
todos los cánceres epiteliales de ovario, glándula mamaria, colon,
pulmón, nariz, garganta y cerebro expresan niveles elevados del RF.
De hecho, se conoce que más del 90% de todos los tumores ováricos
humanos expresan grandes cantidades de este receptor. Por tanto, la
presente invención puede usarse para la formación de imágenes de
diagnóstico de una variedad de tipos de tumores y de otros tipos
celulares implicados en estados patológicos.
Se han usado quelantes de radionúclidos
complejados a ligandos como sondas no invasivas para fines de
formación de imágenes de diagnóstico. Por ejemplo, se han usado
péptido intestinal vasoactivo, análogos de somatostatina y
anticuerpos monoclonales como ligandos para localizar
radionucléotidos para células, tales como células tumorales. Los
anticuerpos monoclonales, y diversos fragmentos de los mismos,
inicialmente recibieron la mayor atención porque se creía que la
dirección específica a tumor precisa podría conseguirse usando
anticuerpos monoclonales como ligandos dirigidos.
Desafortunadamente, este enfoque fue problemático porque i) los
anticuerpos tienen tiempos de circulación prolongados debido a su
gran tamaño que es desfavorable para los fines de formación de
imágenes, ii) los anticuerpos son costosos de producir, iii) los
anticuerpos pueden ser inmunogénicos, y por consiguiente, deben
humanizarse cuando se usan dosis múltiples, y iv) las razones de
tumor con respecto a tejido no diana (T/NT) de los radionúclidos
unidos a anticuerpos son subóptimas. Por tanto, el centro de
atención se ha dirigido recientemente hacia el uso de ligandos
específicos de tumor más pequeños que no tienen tales
limitaciones.
Se han usado las vitaminas, tales como ácido
fólico, para dirigir agentes de formación de imágenes a células
tumorales, y son ventajosos debido a su pequeño tamaño. El primer
complejo dirigido a base de ácido fólico descrito para la formación
de imágenes de tumores in vivo fue un derivado de histamina
que contenía ^{125}yodo. Este complejo no se consideró un
candidato clínico relevante debido al componente de radionucléotido
^{125}I de larga vida. Posteriormente, se desarrolló un conjugado
de deferoxamina-folato para la formación de imágenes
de tumores (deferoxamina quela a ^{67}Ga, un radionucléotido que
emite radiación gamma que tiene una semivida de 78 horas). Se
observó aclaramiento hepatobiliar con este conjugado y, por tanto,
se detuvo el desarrollo preclínico debido a problemas anticipados
en la formación de imágenes de manera precisa de ubicaciones en la
región abdominal. Sin embargo, se superó este obstáculo sustituyendo
el quelante de deferoxamina por el ácido
dietilentriamina-pentaacético (DTPA), un quelante
eficaz de ^{111}In (semivida de 68 horas). Se confirmó que la vía
principal de eliminación de
^{111}In-DPTA-folato era a través
de los riñones.
Más recientemente, se ha adoptado ^{99m}Tc
como el radionúclido preferido para la formación de imágenes,
porque i) el radionúclido se obtiene fácilmente de generadores de
^{99}Mo-^{99m}Tc disponibles comercialmente,
ii) el coste de producir grandes cantidades de ^{99m}Tc es
insignificante en comparación con el coste de producir ^{111}In,
y iii) ^{99m}Tc tiene una semivida mucho más corta (6 horas), lo
que permite que se administren dosis de radionúclido mayores,
produciendo imágenes con mayor resolución sin el riesgo de
exposición a radiación peligrosa a órganos vitales.
Se han desarrollado varios conjugados de
^{99m}Tc a base de folato. Por ejemplo, los conjugados de folato
de
^{99m}Tc-6-hidrazinonicotinamido-hidrazido
(HYNIC; Guo, et al., J. Nucl. Med., 40 (9):
1563-1569 (1999)),
^{99m}Tc\sim12-amino-3,3,9,9-tetrametil-5-oxa-4,8-diaza-2,10-dodecanodiona-dioxima
(OXA) (Linder, et al., Soc. Nucl. Med., Proc. 47th Annual
Meeting, 2000, 41 (5): 119P), Tc-etilendicisteína
(Ilgan, et al., Cancer Biother. & Radiopharm., 13 (6):
427-435 (1998)), y
^{99m}Tc-DTPA~folato (Mathias, et al.,
Bioconjug. Chem., 11 (2): 253-257 (2000)) han
mostrado cualidades de captación en tumores in vivo
prometedoras. Sin embargo, existe una necesidad de conjugados de
^{99m}Tc a base de vitamina alternativos, o conjugados a base de
vitamina que empleen otros radionúclidos, que presenten razones de
tumor con respecto a tejido no diana (T/NT) óptimas y se eliminen a
través de los riñones. Tales conjugados a base de vitaminas deben
ser adecuados para su desarrollo clínico como agentes de formación
de imágenes de tumores y para el diagnóstico de otros estados
patológicos.
La invención proporciona compuestos y
composiciones según las reivindicaciones.
Figura 1. Estructura de EC20, un compuesto a
modo de ejemplo usado como agente de formación de imágenes según la
invención.
Figura 2. Radiocromatograma de HPLC de
^{99m}Tc-EC20. Las muestras de
^{99m}Tc-EC20 se eluyeron isocráticamente en una
columna C18 (3,9 x 150 mm) Nova-Pak de Waters usando
una fase móvil acuosa que contenía metanol al 20% y ácido
trifluoroacético al 0,2% a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se
monitorizó el análisis por HPLC con tanto el detector UV (280 nm)
como un radiodetector FC-3200 de Bioscan. Pico A,Tc
libre; pico B, un quelato que contiene folato de estructura
desconocida; picos C y D, diastereómeros que presentan una
configuración o bien syn o bien anti del enlace
tecnecio-oxígeno en el anillo quelante
Dap-Asp-Cys de EC20.
Figura 3. Estructuras de los isómeros de
Re-EC20 y ^{99m}Tc-EC20 (posición
syn o anti del enlace metal-oxo).
Figura 4. Bloqueo de la unión de ácido
^{3}H-fólico a células KB con diversos
competidores que contienen folato. Se incubaron células KB durante
15 min en hielo con ácido ^{3}H-fólico 100 nM en
presencia y ausencia de concentraciones crecientes de los
competidores. (\medbullet) Ácido fólico; (\blacksquare) EC20;
(\ding{115}) Isómero A de EC20:Re; (\ding{116}) Isómero B de
EC20:Re; (a) DTPA-folato. Las barras de error
representan 1 desviación estándar (n = 3).
Figura 5. Asociación dependiente del tiempo de
^{99m}Tc-EC20. Se incubaron células KB con
^{99m}Tc-EC20 10 nM durante periodos crecientes de
tiempo a 37ºC. Tras múltiples lavados, se recogieron las células y
se sometieron a recuento para determinar la radiactividad asociada.
Las barras de error representan 1 desviación estándar (n = 3).
Figura 6. Asociación dependiente de la
concentración de ^{99m}Tc-EC20. Se incubaron
células KB durante 2 h a 37ºC en presencia de concentraciones
crecientes de ^{99m}Tc-EC20. Tras múltiples
lavados, se recogieron las células y se sometieron a recuento para
determinar la radiactividad asociada. Las barras de error
representan 1 desviación estándar (n = 3).
Figura 7. Asociación dependiente de la
concentración de ^{99m}Tc-EC20 "pico B". Se
incubaron células KB durante 2 h a 37ºC en presencia de
concentraciones crecientes de "pico B" que se aisló de manera
cromatográfica a partir de la formulación de
^{99m}Tc-EC20. Tras múltiples lavados, se
recogieron las células y se sometieron a recuento para determinar
la radiactividad asociada. Las barras de error representan 1
desviación estándar (n = 3). (\medbullet), Pico B; (º), Pico B más
ácido fólico 1 mM.
Figura 8. Aclaramiento sanguíneo de
^{99m,}Tc-EC20 en ratones Balb/c. Cada animal
recibió una dosis intravenosa de 50 \mug/kg de EC20 (67 nmol/kg)
en aproximadamente 0,1 ml durante una breve anestesia con dietil
éter. En los tiempos designados tras la inyección, se sacrificó
cada animal mediante asfixia con CO_{2}, se extrajo sangre y se
sometió a recuento para determinar la radiactividad asociada. Las
barras de error representan 1 desviación estándar (n = 3
animales).
Figura 9. Imágenes de rayos gamma corporales
totales (vista ventral). Se obtuvieron las imágenes 4 h tras la
administración intravenosa de ^{99m}Tc-EC20 a un
ratón Balb/c que tenía un tumor M109 positivo para receptor de
folato subcutáneo. Solamente los riñones (K) y el tumor (T)
presentan acumulación significativa de este radiotrazador.
Figura 10. Estructuras de EC11, EC13, EC14,
EC15, EC19, EC20, EC31 y EC53.
Figura 11. Distribución en los tejidos de
^{99m}Tc-EC20 en ratones Balb/c que tenían tumores
M109 positivos para RF y tumores 4T1 negativos para RF.
Figura 12. Análisis por HPLC de EC11.
Figura 13. Análisis por espectroscopía de masas
de EC11.
Figura 14. Análisis por RMN de EC11.
Figura 15. Análisis por HPLC de EC13.
Figura 16. Análisis por RMN de EC14.
Figura 17. Análisis por espectroscopía de masas
de EC15.
Figura 18. Análisis por HPLC de EC19.
Figura 19. Análisis por espectroscopía de masas
de EC19.
Figura 20. Análisis por HPLC de EC31.
Figura 21. Análisis por HPLC de EC53.
Figura 22. Análisis por espectroscopía de masas
de EC53.
Figura 23. Análisis por espectroscopía de masas
de EC53.
La invención proporciona compuestos y
composiciones según las reivindicaciones.
Por consiguiente, se usa una vitamina, o un
derivado o análogo de la misma que se une al receptor, como ligando
dirigido para el agente de formación de imágenes. Puede usarse el
conjugado de vitamina-agente de formación de
imágenes para dirigir radionúclidos a células y para concentrar los
radionúclidos en una población de células, tal como una población
de células tumorales, para su uso en la formación de imágenes de
diagnóstico.
Un ejemplo de estos compuestos es un compuesto
denominado EC20 representado en la figura 1. Ejemplos de otros
compuestos para su uso según esta invención son compuestos
denominados EC11, EC13, EC14, EC15, EC19, EC31 y EC53 (véase la
figura 10). El resto de vitamina (por ejemplo, el resto de ácido
fólico en EC20) proporciona una unión de alta afinidad a los RF
celulares. Los compuestos contienen también un quelante a base de
péptido bifuncional, que proporciona el sitio para la quelación del
radionúclido, por ejemplo, ^{99m}Tc (véase la figura 1), y los
compuestos pueden, opcionalmente, contener un conector a través del
cual el resto de vitamina se une covalentemente al resto
quelante.
Según la invención, el resto de vitamina (V) de
los compuestos es un folato que es un sustrato para el transporte
transmembrana mediado por receptor in vivo, o un derivado o
análogo del mismo que se une al receptor de folato, según las
reivindicaciones. La vitamina se une, opcionalmente, a través de un
conector (L) a la parte de quelante de los compuestos. La parte de
quelante comprende un resto de ácido
\alpha,\beta-diaminopropiónico unido a un grupo
cisteína a través de un tercer residuo de aminoácido. La parte de
quelante del compuesto está adaptada para unirse a un catión
radionúclido (M) (si k=1).
Según la invención, los compuestos con
radionúclido unido se denominan "conjugados de
vitamina-agente de formación de imágenes".
La estructura del conector, si está presente, no
es crítica para la invención. Por tanto, por ejemplo, puede ser
cualquier conector divalente biocompatible. Normalmente, el conector
comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 átomos de
carbono, más normalmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 20
átomos de carbono. Normalmente se emplean conectores de menor peso
molecular (es decir, aquéllos que tienen un peso molecular
aproximado de aproximadamente 30 a aproximadamente 300).
El folato contiene un ácido glutámico en la
configuración L unido a ácido pteroico. Tal como se muestra en la
figura 1, EC20 comprende un análogo de ácido fólico unido al resto
de quelante porque EC20 tiene el ácido glutámico en la
configuración D. EC11 y EC14 contienen dos residuos de ácido
glutámico y, por tanto, estos compuestos, por ejemplo, pueden
considerarse también derivados de ácido fólico (figura 10).
Entre las vitaminas que se cree que desencadenan
la endocitosis mediada por receptor están niacina, ácido
pantoténico, ácido fólico, riboflavina, tiamina, biotina, vitamina
B12 y las vitaminas liposolubles A, D, E y K.
Según la invención pueden usarse ácido fólico,
ácido folínico, ácido pteroico, ácido pteropoliglutámico y
pteridinas que se unen al receptor de folato tales como
tetrahidropterinas, dihidrofolatos, tetrahidrofolatos y sus
análogos desaza y didesaza. Los términos análogos "desaza" y
"didesaza" se refieren a los análogos de folato reconocidos en
la técnica que tienen un átomo de carbono sustituido por uno o más
átomos de nitrógeno en la estructura del acido fólico que se
produce de manera natural. Por ejemplo, los análogos desaza incluyen
los análogos 1-desaza, 3-desaza,
5-desaza, 8-desaza y
10-desaza. Los análogos didesaza incluyen, por
ejemplo, los análogos 1,5-didesaza,
5,10-didesaza, 8,10-didesaza y
5,8-didesaza. Los anteriores son derivados o
análogos de folato y pueden unirse a los receptores de folato.
Otros derivados o análogos de folato útiles según la invención son
los análogos que se unen al receptor de folato aminopterina,
ametopterina (metotrexato), N^{10}-metilfolato,
2-desamino-hidroxifolato, análogos
desaza tales como 1-desazametopterina o
3-desazametopterina, y ácido
3'5'-dicloro-4-amino-4-desoxi-N^{10}-metilpteroilglutámico
(diclorometotrexato).
La vitamina, o derivado o análogo de la misma,
puede unirse selectivamente a la población de células que van a
visualizarse debido a la expresión preferencial en las células
seleccionadas como diana de un receptor de folato para el folato, o
derivado o análogo, en el que el receptor es accesible para la
unión. El sitio de unión para el folato puede incluir receptores
para cualquier molécula de folato que puede unirse específicamente
a un receptor en el que se expresa de manera única, sobreexpresa o
expresa preferencialmente el receptor u otra proteína por la
población de células que van a visualizarse. Una proteína presente
en la superficie expresada de manera única, sobreexpresada o
expresada preferencialmente por las células que van a visualizarse
es un receptor no presente o presente en cantidades menores en
otras células proporcionando un medio para la visualización
sensible, rápida y selectiva de las células seleccionadas como diana
para la formación de imágenes de diagnóstico usando los conjugados
de vitamina-agente de formación de imágenes de la
presente invención.
Los radionúclidos adecuados para la formación de
imágenes de diagnóstico incluyen radioisótopos de galio, indio,
cobre, tecnecio y renio, incluyendo los isótopos ^{111}In,Tc,
^{64}Cu, Cu, ^{67}Ga o ^{68}Ga. Estos radionúclidos son
catiónicos y se complejan con el quelante a través del grupo
quelante del conjugado para formar el conjugado de
vitamina-agente de formación de imágenes.
Los conjugados de
vitamina-agente de formación de imágenes según la
invención se utilizan para visualizar de manera selectiva, usando
técnicas de formación de imágenes gammagráficas, una población de
células en un animal en el que la población de células expresa de
manera única, sobreexpresa o expresa preferencialmente receptores
para una vitamina, o derivado o análogo de la misma que se une al
receptor de la vitamina. Pueden usarse los conjugados de
vitamina-agente de formación de imágenes para
visualizar poblaciones de células patógenas, siempre que las
células expresen o sobreexpresen de manera única o preferencial
receptores de vitamina o receptores que se unen a derivados o
análogos de vitamina.
La invención es aplicable a poblaciones de
células patógenas que provocan una variedad de patologías que
incluyen cáncer y enfermedades mediadas por cualquier otro tipo de
células patógenas que sobreexpresan receptores de vitamina, o
receptores que pueden unirse a derivados o análogos de vitamina. Por
tanto, la población de células patógenas puede ser tumorígena,
incluyendo tumores benignos y tumores malignos, o puede ser no
tumorígena. Si la población de células es una población de células
cancerosas, las células cancerosas pueden surgir espontáneamente o
mediante tales procesos como mutaciones presentes en la línea
germinal del animal huésped o mutaciones somáticas, o el cáncer
puede inducirse de manera química, viral o mediante radiación. La
invención puede utilizarse para la formación de imágenes de
diagnóstico de cánceres tales como carcinomas, sarcomas, linfomas,
enfermedad de Hodgkin, melanomas, mesoteliomas, linfoma de Burkitt,
carcinomas nasofaríngeos y mielomas. La población de células
cancerosas puede incluir, pero no se limita a, cánceres oral,
nasofaríngeo, de tiroides, endocrino, de piel, gástrico, esofágico,
laríngeo, de garganta, pancreático, de colon, de vejiga, de huesos,
ovárico, de cuello uterino, uterino, de mama, de testículos, de
próstata, rectal, de riñón, de hígado, de pulmón y de cerebro. En
realizaciones en las que la población de células es una población de
células cancerosas, pueden visualizarse usando el conjugado de
vitamina-agente de formación de imágenes células
tumorales, incluyendo células de tumor primario o células que han
experimentado metástasis o están en el proceso de disociarse del
tumor primario.
Los conjugados de
vitamina-agente de formación de imágenes de la
presente invención pueden usarse para diagnosticar un estado
patológico o monitorizar la progresión de una enfermedad. Por
ejemplo, el método de formación de imágenes de diagnóstico según la
invención puede usarse para monitorizar la progresión del cáncer en
combinación con tratamientos profilácticos para prevenir la
reaparición de un tumor tras su eliminación mediante cualquier
enfoque terapéutico incluyendo la eliminación quirúrgica del tumor,
radioterapia, quimioterapia o tratamiento biológico.
Las composiciones y los métodos de la presente
invención pueden usarse para aplicaciones tanto de medicina clínica
en humanos como veterinarias. Por tanto, el animal que alberga la
población de células que se visualizan pueden ser un ser humano o,
en el caso de aplicaciones veterinarias, puede ser un animal de
laboratorio, agrícola, doméstico o salvaje. La presente invención
puede aplicarse a animales incluyendo, pero sin limitarse a, seres
humanos, animales de laboratorio tales como roedores (por ejemplo,
ratones, ratas, hámsters, etc.), conejos, monos, chimpancés,
animales domésticos tales como perros, gatos y conejos, animales
agrícolas tales como vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, y
animales salvajes en cautividad tales como osos, pandas, leones,
tigres, leopardos, elefantes, cebras, jirafas, gorilas, delfines y
ballenas.
Las composiciones para formación de imágenes de
diagnóstico comprenden una cantidad del conjugado de
vitamina-agente de formación de imágenes eficaz
para visualizar las células seleccionadas como diana para la
formación de imágenes de diagnóstico en un animal cuando se
administra en una o más dosis. La composición de formación de
imágenes de diagnóstico que contiene el conjugado de
vitamina-agente de formación de imágenes se
administra preferiblemente al animal por vía parenteral, por
ejemplo, por vía intradérmica, por vía subcutánea, por vía
intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa o por
vía intratecal. Alternativamente, la composición que contiene el
conjugado de vitamina-agente de formación de
imágenes puede administrarse al animal mediante otros
procedimientos médicamente útiles, y puede usarse cualquier dosis
eficaz y forma farmacéutica adecuada, incluyendo formas
farmacéuticas para inhalación y orales.
Los ejemplos de formas farmacéuticas
parenterales incluyen disoluciones acuosas del conjugado de
vitamina-agente de formación de imágenes, en
solución salina isotónica, glucosa al 5% u otros vehículos líquidos
farmacéuticamente aceptables bien conocidos tales como alcoholes,
glicoles, ésteres y amidas líquidos. La forma farmacéutica
parenteral según esta invención puede estar en forma de un
liofilizado que puede reconstituirse que comprende la dosis del
conjugado de vitamina-agente de formación de
imágenes.
La dosificación del conjugado de
vitamina-agente de formación de imágenes en la
composición de formación de imágenes de diagnóstico puede variar de
manera significativa dependiendo del tamaño del animal, la población
de células seleccionadas como diana para la formación de imágenes
de diagnóstico, el conjugado de vitamina-agente de
formación de imágenes específico que está usándose y la vía de
administración del conjugado. La cantidad eficaz que va a
administrarse al animal se basa en el área de superficie corporal,
peso y evaluación por el médico del estado del animal. Una dosis
eficaz puede oscilar desde aproximadamente 1 ng/kg hasta
aproximadamente 1 mg/kg, más preferiblemente desde aproximadamente
100 ng/kg hasta aproximadamente 500 \mug/kg y lo más
preferiblemente desde aproximadamente 100 ng/kg hasta
aproximadamente 25 \mug/kg.
Puede usarse cualquier régimen eficaz para
administrar la composición de formación de imágenes de diagnóstico
que contiene el conjugado de vitamina-agente de
formación de imágenes. Por ejemplo, puede administrarse la
composición de formación de imágenes de diagnóstico como dosis
única, o puede administrarse en dosis múltiples, si es necesario,
para conseguir la visualización de la población de células
seleccionadas como diana. Pueden administrarse inyecciones
adicionales de la composición de formación de imágenes de
diagnóstico que contiene el conjugado de
vitamina-agente de formación de imágenes al animal a
un intervalo de días o meses tras la(s)
inyección/inyecciones inicial(es), y las inyecciones
adicionales pueden se útiles para monitorizar el progreso del
estado patológico. La composición de formación de imágenes de
diagnóstico que contiene el conjugado de
vitamina-agente de formación de imágenes puede
administrarse también en combinación con vitamina sin marcar. "En
combinación con" significa que la vitamina sin marcar o bien
puede administrarse conjuntamente con el agente de formación de
imágenes o bien la vitamina sin marcar puede inyectarse previamente
antes de la administración del agente de formación de imágenes para
mejor la calidad de la imagen. Por ejemplo, el agente de formación
de imágenes puede administrarse en combinación con de
aproximadamente 0,5 ng/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o de
aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o de
aproximadamente 100 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg de la
vitamina sin marcar.
La composición de formación de imágenes de
diagnóstico se formula normalmente para administración parenteral y
se administra al animal en una cantidad eficaz para permitir formar
imágenes de la población de células seleccionadas como diana.
Normalmente, la composición de formación de imágenes de diagnóstico
que contiene la vitamina-agente de formación de
imágenes dirigido se administra al animal, y tras un periodo de
tiempo para permitir el suministro y la concentración del conjugado
de vitamina-agente de formación de imágenes en la
población de células seleccionadas como diana, se somete al animal
al procedimiento de formación de imágenes y la formación de
imágenes se posibilita por el conjugado de
vitamina-agente de formación de imágenes. Cuando se
usa para monitorizar la progresión de la enfermedad o el
diagnóstico, los procedimientos de formación de imágenes se llevan
a cabo normalmente de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 horas
tras la administración de la composición de formación de imágenes
de diagnóstico que contiene el conjugado de
vitamina-agente de formación de imágenes.
Se compró ácido
N^{10}-trifluoroacetilpteroico de Eprova AG,
Schaffhausen, Suiza. Se compraron los reactivos para síntesis de
péptidos de NovaBiochem y Bachem. Syncor suministró el
^{99m}Tc-pertecnetato de sodio. Se preparó
[Re02(en)2]Cl según Rouschias (Rouschias, G.,
Chem. Rev., 74:531 (1974)). Se compraron placas de celulosa y
placas de intercambio iónico de DEAE de J. T. Baker.
Se preparó EC20 mediante un enfoque secuencial
de soporte en polímero usando la estrategia de Fmoc (véase el
esquema 1 a continuación; Fmoc =
9-fluorenilmetiloxicarbonilo; Boc =
terc-butiloxicarbonilo; Dap = ácido
diaminopropiónico; DMF = dimetilformamida; DIPEA =
diisopropiletilamina). Se sintetizó EC20 en una resina de Wang
sensible a ácido cargada con
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH.
Se aplicó hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio
(PyBOP) como reactivo activante para garantizar un acoplamiento
eficaz usando equivalentes bajos de aminoácidos. Se eliminaron los
grupos protectores de Fmoc tras cada etapa de acoplamiento en
condiciones convencionales (piperidina al 20% en DMF). Después de
la última etapa de ensamblaje, se escindió el péptido del soporte
polimérico mediante tratamiento con ácido trifluoroacético al 92,5%
que contenía un 2,5% de etanoditiol, un 2,5% de triisopropilsilano
y un 2,5% de agua desionizada. Esta reacción también dio como
resultado la eliminación simultánea de los grupos protectores de
tritilo, Boc y t-Bu. Por último, se eliminó el resto
de trifluoroacetilo en hidróxido de amonio acuoso dando EC20.
Se purificó el producto EC20 bruto mediante HPLC
usando una columna (Waters) de 7 \mum, 30 x 300 mm Xterra RP18;
fase móvil HCl (A) 32 mM, MeOH (B); condiciones de gradiente
partiendo con el 99% de A y el 1% de B, y alcanzando el 89% de A y
el 11% de B en 37 min mediante una velocidad de flujo de 20 ml/min.
En estas condiciones, el monómero de EC20 eluyó normalmente a 14,38
min, mientras que el dímero de disulfuro de EC20 (contaminante
minoritario) eluyó a 16,83 min. Todos los demás componentes
mostrados en la figura 10 pueden prepararse usando un esquema de
síntesis similar excepto para EC15 que se sintetiza tal como se
muestra en el esquema 2 a continuación.
Se disolvieron dos miligramos de EC20 purificado
mediante HPLC en 0,62 ml de D_{2}O, y se recogió un espectro de
^{1}H-RMN a 500 MHz. La tabla 1 (véase a
continuación) enumera los desplazamientos químicos, las formas de
señal y los valores J para todos los protones no intercambiables en
la molécula de EC20.
También se analizó EC20 mediante espectrometría
de masas por electrospray. Picos del ion positivo principal (m/z,
intensidad relativa): 746,1, 100; 747,1, 44; 556,8, 32; 570,8,
16.
Esquema
1ª
Se disolvió EC20 en D_{2}O y se recogió un
espectro a 500 MHz. Los desplazamientos químicos (\delta) están en
ppm. La señal para HOD a \delta = 4,80 ppm se usó como referencia,
pD = 4,78; s = singlete; d = doblete; m = multiplete
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esquema
2ª
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se usaron kits de EC20 para la preparación de la
sustancia farmacológica radiactiva de
^{99m}Tc-EC20. Cada kit contenía una mezcla
liofilizada apirógena, estéril de 0,1 mg de EC20, 80 mg de
\alpha-_{D}-glucoheptonato de
sodio, 80 mg de cloruro de estaño (II) dihidratado, y suficiente
hidróxido de sodio o ácido clorhídrico para ajustar el pH a 6,8
\pm 0,2 antes de la liofilización. Se selló el polvo liofilizado
en un vial de 5 ml bajo una atmósfera de argón. Entonces se
almacenaron los kits en congelación a -20ºC hasta su uso o caducidad
(vida útil de almacenamiento actual es > 2 años). De manera
importante, se requiere el componente cloruro de estaño (II) para
reducir el ^{99m}Tc-pertecnetato añadido, mientras
que el componente
\alpha-_{D}-glucoheptonato es
necesario para estabilizar el ^{99m}Tc reducido recientemente
antes de su quelación final para dar el compuesto EC20.
Se preparó ^{99mm}Tc-EC20 tal
como sigue (es decir, quelación de ^{99m}Tc para dar EC20). En
primer lugar, se preparó un baño de agua en ebullición que contenía
un elemento de protección de vial de plomo parcialmente sumergido.
Se limpió con hisopo la parte superior del vial de EC20 con etanol
al 70% para desinfectar la superficie y se colocó el vial en un
recipiente de protección adecuado. Usando una jeringa protegida con
aguja de calibre 27, se inyectó 1 ml de la inyección de
^{99m}Tc-pertecnetato de sodio estéril (de 15 a 20
mCi) en cloruro de sodio al 0,9%, en el vial protegido. Antes de
retirar la jeringa del vial, se extrajo un volumen de gas del vial
igual al volumen de pertecnetato añadido con el fin de normalizar la
presión en el interior del vial. Se agitó suavemente el vial
durante 30 segundos para garantizar la completa disolución del polvo
liofilizado. Después, se colocó el vial en el elemento de
protección de plomo que estaba situado en el baño de agua en
ebullición. Se calentó la disolución durante \sim18 minutos y se
enfrió entonces hasta temperatura ambiente durante un mínimo de 15
min. La disolución puede almacenarse a temperatura ambiente
(15-25ºC) protegida de la luz, pero debe usarse en
un plazo de 6 horas de su preparación.
Se determinó la estabilidad radioquímica de la
sustancia farmacológica radiactiva mediante HPLC después de su
almacenamiento a temperatura ambiente protegida de la luz durante
hasta 24 horas. Se analizaron muestras de la disolución de
^{99m}Tc-EC20 (20 \mul) usando un sistema de
HPLC que consistía en un detector UV 490 y sistema de suministro
multisolvente 600E de Waters, un radiodetector
EC-3200 de Bioscan, un software de
radiocromatograma Laura v1.5, y una columna C18 (3,9 x 150 mm)
Nova-Pak de Waters. Se eluyeron isocráticamente las
muestras inyectadas usando una fase móvil acuosa que contenía
metanol al 20% y ácido trifluoroacético al 0,1% a una velocidad de
flujo de 1 ml/min. Se monitorizó el análisis por HPLC con tanto el
detector UV (280 nm) como el radiodetector de rayos gamma.
Notablemente, la pureza radioquímica de
^{99m}Tc-EC20 permaneció mayor que el 90% durante
al menos 24 horas en todos los casos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las impurezas radioquímicas principales en la
preparación de ^{99m}Tc-EC20 serán 1)
^{99m}Tc-pertecnetato, 2)
^{99m}Tc-glucoheptonato (precursor de intercambio
de ligando), 3) ^{99m}Tc de unión no específica (^{99m}Tc unido
a un sitio diferente del resto quelante
Dap-Asp-Cys esperado de la molécula
EC20) y 4)Tc hidrolizado. Dado que estaba sometiéndose a
prueba ^{99m}Tc-EC20 para determinar su posible
uso clínico, se desarrolló un método a base de tres CCF para
determinar las cantidades de cada impureza y estimar la pureza
radioquímica global de ^{99m}Tc-EC20.
En el primer sistema, se reveló una placa de
celulosa con agua desionizada. ^{99m}Tc-EC20,
^{99m}Tc-glucoheptonato, ^{99m}Tc de unión no
específica y ^{99m}Tc-pertecnetato se mueven al
frente de disolvente (R_{f} = 1,0), mientras que ^{99m}Tc
hidrolizado permanece en el origen (R_{f} = 0,0). Se cortó la
placa de celulosa en dos fragmentos a R_{f} = 0,3 (1,5 cm del
origen) y se sometió a recuento cada fragmento usando un calibrador
de dosis. Se calculó el por ciento de ^{99m}Tc hidrolizado tal
como sigue: A = % de hidrolizado;Tc = (\muCi en el fragmento
inferior/\muCi en ambos fragmentos) x 100.
En el segundo sistema, se reveló una placa de
celulosa con acetona y NaCl al 0,9% (7:3, v/v).
^{99m}Tc~pertecnetato se mueve con R_{f} = 0,9, mientras
^{99m}Tc-EC20,
^{99m}Tc-glucoheptonato, ^{99m}Tc de unión no
específica y ^{99m}Tc hidrolizado permanecen en el origen
(R_{f} = 0,0). Se cortó la placa de
celulosa/acetona-solución salina en dos fragmentos
a R_{f} = 0,6 (3,0 cm del origen) y se sometió a recuento cada
fragmento usando un calibrador de dosis. Se calculó el por ciento
de ^{99m}Tc-pertecnetato tal como sigue: B = % de
^{99m}Tc-pertecnetato = (\muCi en el fragmento
superior/ \muCi en ambos fragmentos) x 100.
Por último, en el tercer sistema, se reveló una
placa de intercambio iónico de DEAE con Na_{2}SO_{4} 0,3 M.
^{99m}Tc-glucoheptonato se mueve al frente de
disolvente (R_{f} = 1,0), ^{99m}Tc de unión no específica se
mueve con R_{f} = 0,6, y ^{99m}Tc\simEC20, ^{99m}Tc
hidrolizado y ^{99m}Tc-pertecnetato permanecen
cerca del origen (^{99m}Tc-EC20. R_{f} = 0,1;
^{99m}Tc hidrolizado: R_{f} = 0,0;
^{99m}Tc-pertecnetato: R_{f} = 0,3). Se cortó
la placa de celulosa/Na_{2}SO_{4} en dos fragmentos a 2,5 cm del
origen y se sometió a recuento cada fragmento usando un calibrador
de dosis. Se calculó el por ciento de
^{99m}Tc-glucoheptonato y ^{99m}Tc de unión no
específica tal como sigue: C = % de
(^{99m}Tc-glucoheptonato + ^{99m}Tc de unión no
específica) = (\muCi en el fragmento superior/ \muCi en ambos
fragmentos) x 100. Se calculó entonces la pureza radioquímica global
de ^{99m}Tc-EC20 tal como sigue: pureza
radioquímica = 100 - (A+B+C).
Tal como se muestra en la figura 2, el análisis
por HPLC de la formulación ^{99m}Tc-EC20 muestra
cuatro componentes radioquímicos, denominados picos A hasta D. Se
confirmó que el pico A era ^{99m}Tc libre y este subproducto está
presente de manera reproducible a < 2%. El pico B, que era
diferente del de ^{99m}Tc-glucoheptonato (no se
muestran los datos), eluyó con un tiempo de retención de 2,8 min.
Este componente representó aproximadamente el 3% de la mezcla y se
creía que resultaba de la quelación de ^{99m}Tc en algún otro
sitio de la molécula de EC20 además del resto
Dap-Asp-Cys esperado. Los picos C y
D (tiempos de retención de 4,8 minutos y 13,2 minutos,
respectivamente), representan la mayoría de la actividad
radioquímica formulada.
Se disolvieron cincuenta y dos mg (0,010 mmol)
de EC20 y [ReO_{2}(en)_{2}]Cl (52 mg, 0,14
mmol) en 6 ml y 1 ml de tampón fosfato purgado con argón (0,05 M,
pH 5,8), respectivamente. Se combinaron las dos disoluciones y se
calentaron bajo una atmósfera de argón en un baño de agua en
ebullición durante 2 horas. Se congeló y se liofilizó durante la
noche la mezcla de reacción. Se purificó el producto bruto mediante
HPLC (columna Xterra RP18, 19 x 150 mm, NH_{4}OAc 10
mM/CH_{3}CN, velocidad de flujo 10 ml/mm; gradiente del 1% al 8%).
Se recogieron las fracciones, se liofilizaron y se almacenaron a
-20ºC hasta su uso.
Puesto que no estaban disponibles instalaciones
para espectros de masas para el análisis de materiales radiactivos,
se analizó el análogo de renio no radiactivo,
Re-EC20. Tanto renio como tecnecio son metales del
grupo VIIA que tienen similitud significativa en propiedades
químicas y físicas. También forman complejos similares con ligandos
orgánicos. Este comportamiento químico análogo se ha usado
frecuentemente en la aclaración de estructuras de nuevas clases de
productos radiofarmacéuticos de tecnecio basados en análogos de
renio no radiactivos. De manera interesante, el análisis por HPLC
de Re-EC20 mostró también dos picos principales que
eluyeron a 5 y 14,2 minutos, respectivamente, similares a los picos
C y D para ^{99m}Tc-EC20 (cromatograma no
mostrado). El análisis de espectros de masas confirmó que estos dos
componentes eran isómeros correspondientes al complejo
Re-EC20 (m/z = 945). De hecho, es probable que estas
especies fueran diastereómeros que presentaban una configuración o
bien syn o bien anti del enlace
tecnecio-oxígeno en el anillo quelante
Dap-Asp-Cys, tal como se representa
en la figura 3. Puesto que i) los dos picos en el cromatograma de
Re-EC20 representan complejos isoméricos, y ii)
existen informen de isomerismo similar en complejos de tecnecio, es
probable que los componentes C y D en el radiocromatograma de
^{99m}Tc-EC20 también sean isómeros.
Se hicieron crecer células de manera continua
como una monocapa usando medio RPMI libre de folato (FFRPMI) que
contenía suero de ternero fetal inactivado por calor (HIFCS) al 10%
a 37ºC en una atmósfera del 5% de CO_{2}/95% humidificada con
aire sin antibióticos. El HIFCS contenía su complemento normal de
folatos endógenos que permitió que las células crecieran de manera
sostenida en este medio más fisiológicamente apropiado. Se
realizaron todos los experimentos celulares usando FFRPMI que
contenía HIFCS al 10% (FFRPMI/HIFCS) como el medio de crecimiento,
excepto cuando se indica.
Se determinó la afinidad relativa de diversos
derivados de folato según el método descrito por Westerhoff et
al. (Mol. Pharm., 48:459-471 (1995)) con una
ligera modificación. En resumen, se tripsinizaron ligeramente
células KB positivas para RF en tripsina al 0,25%/PBS a temperatura
ambiente durante 3 minutos y se diluyeron después en FFRPMI/HIFCS.
Tras una centrifugación de 800 x g durante 5 minutos y un lavado con
PBS, se suspendió el sedimento de células final en FFRPMI 1640 (sin
suero). Se incubaron las células durante 15 min en hielo con 100 nM
de ácido ^{3}H-fólico en ausencia y presencia de
concentraciones crecientes de artículos de prueba que contenían
folato. Se centrifugaron las células a 10.000 x g durante 5 min, se
suspendieron los sedimentos de células en tampón, se transfirieron
a viales individuales que contenían 5 ml del cóctel de centelleo, y
se sometieron entonces a recuento para determinar la radiactividad.
Los tubos de control negativo contenían solamente el ácido
^{3}H-fólico en FFRPMI (sin competidor). Los tubos
de control positivo contenían una concentración final de ácido
fólico 1 mM, y las CPM medidas en estas muestras (que representan la
unión no específica del marcado) se restaron de todas las muestras.
Notablemente, se definieron las afinidades relativas como la razón
molar inversa del compuesto requerido para desplazar el 50% de ácido
^{3}H-fólico unido a RF de KB, y la afinidad
relativa del acido fólico por el RF se estableció en 1.
La capacidad de EC20 para competir de manera
directa con el ácido fólico para unirse a los RF de superficie
celular se midió usando este ensayo. De manera importante, un valor
de afinidad relativa de 1,0 implica que el ligando del artículo de
prueba tiene una afinidad por el RF igual al ácido fólico. Así
mismo, los valores inferiores a la unidad reflejan una afinidad más
débil y los valores superiores a la unidad reflejan una afinidad
más fuerte.
Se incubaron células KB cultivadas con ácido
^{3}H-fólico 100 nM en presencia de
concentraciones crecientes de ácido fólico no radiactivo, EC20,
renio-EC20 (isómero A; pico C),
renio-EC20 (isómero B; pico 0) o un producto
radiofarmacéutico a base de folato, DTPA-folato.
Tras una incubación durante 15 minutos a 4ºC, se enjuagaron las
células libres de material sin unir y se sometieron a recuento para
determinar la radiactividad asociada a célula residual. La cantidad
de radiactividad unida se representó frente a la concentración del
ligando sin marcar, y se estimaron los valores de CI_{50}
(concentración de ligando requerida para bloquear el 50% de unión
del ácido ^{3}H-fólico). Tal como se muestra en la
figura 4 y tabla 2 (a continuación), se determinó que EC20 tenía
una afinidad de 0,92 en relación con la del ácido fólico por los RF
humanos. Ambos isómeros de renio-EC20 mostraron
valores de afinidad relativa que eran muy similares a, si no mejores
que, la molécula de EC20 original (1,42 y 1,37 para el isómero A e
isómero B de Re-EC20, respectivamente).
DTPA-folato, un agente radiofarmacéutico de folato
que quela a ^{111}In, mostró una afinidad relativa de 0,87 por el
receptor de folato. Por tanto, la modificación química de folato
con diversos motivos quelantes de metal no alteró la afinidad
intrínseca de la vitamina por el RF.
\vskip1.000000\baselineskip
Se definieron las afinidades relativas (AR) como
la razón molar inversa de compuesto requerido para desplazar el 50%
del ácido ^{3}H-fólico unido a células KB
positivas para RF. La afinidad relativa del ácido fólico se
estableció en 1. Se evaluó cada artículo de prueba por
triplicado
Se sembraron células KB en placas Falcon de 12
pocillos y se permitió que formaran monocapas subconfluentes
durante la noche. Tras un enjuague con 1 ml de FFRPMI/HIFCS recién
preparado, cada pocillo recibió 1 ml de FFRPMI/HIFCS que contenía
^{99m}Tc-EC20 10 nM. Se incubaron las células
durante tiempos predeterminados a 37ºC y se enjuagaron después
cuatro veces con 1 ml de PBS helado, pH 7,4. Se disolvieron las
monocapas de células en 0,5 ml de PBS, pH 7,4 que contenía
dodecilsulfato de sodio al 1% durante 15 min a temperatura ambiente
y se sometieron a recuento entonces para determinar la radiactividad
usando un contador de rayos gamma de Packard. Se cuantificó la
proteína en cada muestra usando un kit de ensayo de proteína DC de
BioRad, y se convirtieron los valores de proteína celular en número
de células usando el factor de conversión de 2,23 x 10^{-7} mg de
proteína por célula. Se expresaron los valores tabulados finales en
términos de moléculas de EC20 por célula.
La cinética de captación de
^{99m}Tc-EC20 en células KB positivas para RF se
midió cuantitativamente usando este protocolo. Tal como se muestra
en la figura 5, se alcanzó la captación en estado estacionario en el
plazo de dos horas a 37ºC, en el que aproximadamente 3,2 millones
de moléculas de EC20 estaban asociadas a células, mientras que la
mitad de la asociación celular máxima se produjo 9 minutos tras el
mezclado de 10 nM de este producto radiofarmacéutico con las
células. De manera interesante, se alcanzó la mitad del punto de
saturación máximo en sólo 37 segundos cuando se incubaron las
células con una concentración 10 veces mayor de
^{99m}Tc-EC20 (100 nM; datos no mostrados).
Se sembraron células KB en placas Falcon de 12
pocillos y se permitió que formaran monocapas subconfluentes
durante la noche. Tras un enjuague con 1 ml de FFRPMI/HIFCS fresco,
cada pocillo recibió 1 ml de FFRPMI/HIFCS que contenía
concentraciones crecientes de ^{99m}Tc-EC20. Se
incubaron las células durante 2 horas a 37ºC y se enjuagaron
después cuatro veces con 1 ml de PBS helado, pH 7,4. Se disolvieron
las monocapas en 0,5 ml de PBS, pH 7,4 que contenía dodecilsulfato
de sodio al 1% durante 15 min a temperatura ambiente y se sometieron
a recuento entonces para determinar la radiactividad usando un
contador de rayos gamma de Packard. Se determinó el contenido en
proteína tal como se describió anteriormente, y se expresaron los
valores tabulados finales en términos de moléculas de EC20 por
célula.
Tal como se muestra en la figura 6, se encontró
que la captación celular de ^{99m}Tc-EC20
dependía de la concentración extracelular. Se determinó que las
células KB particulares usadas se unían a un máximo de cuatro
millones de moléculas del producto radiofarmacéutico de folato por
célula. El análisis de Scatchard de los datos estimó que la K_{D}
de unión era 3,2 nM, un valor comparable con la K_{D} observada
para la unión de la vitamina folato a estas mismas células.
Aunque no se estableció la identidad completa
del componente del pico B, el análisis de absorción UV indicó que
contenía un resto de folato (es decir, el espectro de absorción
contenía el pico de absorción secundario distintivo de folato a 363
nm). Se recogió este material radiomarcado purificado mediante HPLC
(material del pico B) y se añadió entonces a células KB cultivadas.
Tal como se muestra en la figura 7, también se encontró que la
captación celular del componente del pico B marcado con ^{99m}Tc
era dependiente de la concentración extracelular. El análisis de
Scatchard de los datos estimó que la K_{D} de unión era 1,1 nM. De
manera interesante, la asociación celular del pico B se bloqueó
completamente en presencia de ácido fólico en exceso, indicando que
este subproducto de formulación minoritario también puede
seleccionar como diana células positivas para RF para fines
radiodiagnósticos.
Se mantuvieron los animales usados para este
estudio con una dieta libre de folato (Harlan n.º
TD-90261) durante aproximadamente tres semanas
antes de la administración de la dosis. La aclimatación a esta dieta
especial es esencial porque las dietas para roedores habituales
contienen grandes cantidades de ácido fólico (6 mg/kg de comida) y
promueven altos niveles de folato sérico en ratones. Además,
estudios anteriores han demostrado que ratones colocados en una
dieta libre de folato durante 3 semanas habían mantenido un nivel de
folato sérico seguro de 25 \pm 7 nM, que es ligeramente superior
a la concentración de 9-14 nM medible en el suero
humano.
Se preparó la disolución de
^{99m}Tc-EC20 el día de su uso y contenía
inicialmente 100 \mug de EC20 por mililitro. Se diluyó
adicionalmente la disolución con solución salina estéril para
preparar las disoluciones madres de trabajo. Se estimó que la
pureza radioquímica del producto era \sim94% mediante CCF. Cada
animal recibió una dosis de 50 \mug/kg de EC20 (67 nmol/kg) en un
volumen i.v. de aproximadamente 0,1 ml por medio de la vena de la
cola durante una breve anestesia con dietil éter. A los tiempos
designados (véase la figura 8) tras la inyección, se sacrificó cada
animal mediante asfixia con CO_{2}, y se extrajo inmediatamente
sangre mediante punción cardiaca.
Tal como se muestra en la figura 8, se eliminó
rápidamente ^{99m}Tc-EC20 de la circulación en el
ratón Balb/c. Se estimó que la semivida plasmática de este producto
radiofarmacéutico era \sim4 minutos, y menos del 0,2% de la dosis
de ^{99m}Tc-EC20 inyectada permaneció en la
circulación después de cuatro horas (suponiendo que la sangre
representa el 5,5% de la masa corporal total). Estos datos indican
que los conjugados de folato se eliminan rápidamente de la
circulación tras la administración intravenosa, y que pueden
obtenerse datos de biodistribución tisular valiosos después de sólo
unas pocas horas tras la inyección sin la preocupación de captación
tisular no específica debido a la radiactividad transmitida por la
sangre.
Se evaluó la capacidad de
^{99m}Tc-EC20 para seleccionar como diana tumores
in vivo usando un modelo M109 positivo para RF. Estas
células tumorales son singénicas para el ratón Balb/c y forman de
manera reproducible tumores sólidos subcutáneos en el plazo de dos
semanas tras la inoculación. También se evaluaron en este bioensayo
^{99m}Tc-EC14, que es estructuralmente similar a
^{99m}Tc-EC20 excepto porque contiene un residuo
de _{D}-Glu adicional (es decir,
Pte-_{D}-Glu-_{D}-Glu-\betaDpr-Asp-Cys),
^{99m}Tc-EC28 (un control que no contiene
pteroato que consiste en
benzoil-_{D}-Glu-_{n}-
Glu-\betaDpr-Asp-Cys) y el producto radiofarmacéutico de ^{111}In-DTPA-folato notificado anteriormente. De manera importante, el agente de control ^{99m}Tc-EC28 no se unirá a los RF de la superficie celular porque carece de un resto de anillo de pteridina esencial.
Glu-\betaDpr-Asp-Cys) y el producto radiofarmacéutico de ^{111}In-DTPA-folato notificado anteriormente. De manera importante, el agente de control ^{99m}Tc-EC28 no se unirá a los RF de la superficie celular porque carece de un resto de anillo de pteridina esencial.
Se compraron ratones (raza Balb/c) de cuatro a
cinco semanas de edad de Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianápolis,
IN) y se mantuvieron con una dieta libre de folato durante un total
de tres semanas antes del experimento. Se inocularon células
tumorales M109 positivas para RF, singénicas (1 x 10^{6} por
animal) en el tejido subcutáneo de la axila derecha dos semanas
antes del experimento. Todos los ratones eran hembras, y los pesos
de los tumores fueron de 54,2 \pm 29,8 mg el día del experimento.
Se preparó una disolución madre de ^{99m}Tc-EC20
que contenía 100 \mug del agente por mililitro el día de su uso, y
su pureza radioquímica fue > 96%. También se prepararon los dos
agentes quelantes de ^{99m}Tc adicionales,
^{99m}Tc-EC14 y ^{99m}Tc-EC28,
así como ^{111}In-DTPA-folato
hasta una pureza radioquímica > 90%. Se diluyeron todas la
disoluciones con o bien solución salina sola o bien una solución
salina que contenía 100 equivalentes de ácido fólico (para
competencia) de manera que la concentración del producto
radiofarmacéutico final era de 10 \mumol/ml.
Los animales recibieron una dosis i.v. de
aproximadamente 40 \mumol/kg del artículo de prueba en un volumen
de 100 \mul por medio de una vena lateral de la cola durante una
breve anestesia con dietil éter. Cuatro horas tras la inyección, se
sacrificaron los animales mediante asfixia con CO_{2} y se
diseccionaron. Se retiraron los tejidos seleccionados, se pesaron y
se sometieron a recuento para determinar la distribución de
^{99m}Tc. Se corrigieron por la degradación los valores de CPM y
se tabularon los resultados como el % de dosis inyectada por gramo
de peso húmedo de tejido.
Tal como se muestra en la tabla 3 (a
continuación), los tres productos radiofarmacéuticos que contenían
"folato", ^{99m}Tc-EC14,
^{99m}Tc-EC20 y
^{111}In-DTPA-folato, se
acumularon de manera predominante en los riñones y el tumor
positivo para RF, sin embargo, los riñones concentraron un
porcentaje superior de dosis inyectada por gramo de tejido (% de
DI/g) que el tumor. De manera interesante, la acumulación neta del
tumor de ^{111}In-DTPA-folato y
^{99m}Tc-EC20 fue casi la misma (19 y 17% de DI/g,
respectivamente), mientras que la captación del tumor de
^{99m}Tc-EC14 fue algo menos de ~10% de DI/g. No
obstante, los tres agentes mostraron altas razones de tumor con
respecto a sangre
(de > 30 a 1).
(de > 30 a 1).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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\newpage
Se demostró además la dirección específica a
folato mediante dos métodos distintos. En primer lugar, se bloqueó
de manera eficaz (> 94%) la acumulación de
^{99m}Tc-EC14, ^{99m}Tc-EC20 y
^{111}In-DTPA-folato en los
riñones y el tumor positivo para RF cuando se administraron
conjuntamente estos agentes con un exceso de 100 veces de ácido
fólico. En segundo lugar, el agente de control
^{99m}Tc-EC28 no se acumuló de manera apreciable
en los riñones y el tumor. Ambas observaciones muestran que se
requiere un resto "similar a folato" (o pteroato) intacto para
proporcionar la captación dirigida y la retención de estos agentes
radiofarmacéuticos en los tejidos positivos para RF.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon células tumorales M109 (1 x
10^{6} por animal) en el tejido subcutáneo de la axila derecha de
ratones Balb/c dos semanas antes del experimento. Los animales
recibieron una dosis i.v. de aproximadamente 50 \mumol/kg del
artículo de prueba en un volumen de 100 \mul por medio de una vena
lateral de la cola durante una breve anestesia con dietil éter.
Cuatro horas tras la inyección, se sacrificaron los animales
mediante asfixia con CO_{2} y se colocaron después en la parte
superior de una superficie de adquisición de imágenes. Se realizó
la adquisición de imágenes del organismo completo durante 1 minuto y
a una tasa de recuento de 50-75.000 recuentos por
minuto usando una cámara para rayos gamma radioisótopos 410 Sigma
500 de Technicare Omega. Se analizaron todos los datos usando un
ordenador basado en MS-DOS de Medasys equipado con
software Pinnacle de Medasys.
Se demostró la captación de
^{99m}Tc-EC20 mediante los riñones y los tumores
M109 positivos para RF usando este protocolo de gammagrafía. Tal
como se muestra en la figura 9, una imagen ventral de un ratón al
que se le inyectó ^{99m}Tc-EC20 tal como se
describió anteriormente localiza la radiación gamma en los dos
riñones (K) y la masa tumoral M109 (T; región de hombro). No se
observó ningún radiotrazador apreciable en otros tejidos
corporales. Se ha notificado un perfil de imagen similar para el
producto radiofarmacéutico
^{111}In-DTPA-folato.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo el perfil de especiación por HPLC
urinario de ^{99m}Tc-EC20 usando ratones Balb/c.
Se les inyectó a los ratones (cada uno de \sim20 g) 1 mCi (6,7
nmol) de ^{99m}Tc-EC20 por medio de una vena
lateral de la cola. Tras un periodo de tiempo de 1, 4 ó 6 horas, se
sacrificaron grupos de dos ratones mediante asfixia con CO_{2} y
se recogió la orina. Tras la filtración a través de un filtro Millex
GV13, se evaluó la especiación radioquímica usando un sistema de
HPLC equipado con una columna C18, de 3,9 x 150 mm,
Nova-Pak y un detector radioquímico. Se eluyó
isocráticamente el sistema con metanol al 20% que contenía TFA al
0,1% a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto.
Se determinó previamente que la vía de
eliminación principal para
^{111}In-DTPA-folato era por medio
de la orina. De manera similar al perfil de HPLC mostrado en la
figura 2, tanto el patrón de ^{99m}Tc-EC20 como
las muestras de orina presentaron cuatro picos radiactivos. Tal como
se muestra en la tabla 4 (a continuación), la pureza radioquímica
del patrón (suma de los picos C y D presumiblemente correspondientes
a ^{99m}Tc-EC20 syn y anti)
permaneció constante a ~93% durante las 6 horas de duración de este
experimento. La cantidad de ^{99m}Tc libre en el patrón (pico A)
era \sim2%. De manera importante, se cree que el pico B dentro de
este perfil radioquímico es EC20 quelado con ^{99m}Tc en una
posición menos estable, no convencional, sin embargo, no se incluyó
la radiactividad medida en esta fracción en la estimación de la
pureza radioquímica global para ^{99m}Tc-EC20.
Estos datos indican en conjunto que la formulación permaneció
estable en solución salina a largo de estas 6 horas de
investigación.
Después de 1 y 4 horas tras la inyección en
ratones Balc/C, no cambió el perfil de especiación radioquímica de
^{99m}Tc-EC20 en la orina del ratón. Sin embargo,
la radiactividad presente en la orina 6 horas tras la inyección era
demasiado baja para someterse a ensayo de manera precisa mediante
HPLC. La proporción de fármaco original entre las especies
radiactivas recuperadas en la orina permaneció relativamente
constante a aproximadamente el 90% durante las cuatro horas durante
las cuales podía cuantificarse. Este valor es muy similar a la
pureza del 93% del patrón indicando que
^{99m}Tc-EC20 se excreta predominantemente en la
orina en forma no modificada.
\newpage
Se les inyectó a los ratones 1 mCi (6,7 nmol) de
^{99m}Tc-EC20 por medio de una vena lateral de la
cola. A los tiempos indicados, se sacrificaron grupos de dos ratones
y se recogió la orina. Se determinó entonces la especiación
radioquímica mediante HPLC. Se usa la suma del porcentaje de área
de los picos C y D (isómeros syn y anti) para calcular
la pureza global de ^{99m}Tc-EC20 intacto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron suero de rata nuevo y suero humano de
hombre comercial (donantes tipo AB, Sigma Chemical Co.) para evaluar
la unión in vitro de ^{99m}Tc-EC20 a
proteínas séricas. Un minuto después de que se mezclara
^{99m}Tc-EC20 con 1 ml de suero a temperatura
ambiente, se transfirieron 0,3 ml de la disolución de suero a un
dispositivo de ultrafiltración Centrifree® de Amicon limpio (30.000
NMWL) por triplicado. En el plazo de un minuto de haber cargado la
centrífuga con la disolución de suero, se centrifugó el dispositivo
a 1000 x g durante 20 minutos a 20ºC. Se transfirieron 50 \mul de
muestras de la disolución original, y del filtrado de cada
dispositivo, a un tubo limpio y se sometió a recuento en un contador
de rayos gamma automático. Se ultrafiltró una disolución control de
^{99m}Tc-EC20 mezclada con 1 ml de solución
salina normal de manera idéntica. Se calculó el porcentaje de
^{99m}Tc libre para cada una de las tres
muestras.
muestras.
Aunque, ^{99m}Tc-EC20
presentaba sólo un nivel minoritario de unión no específica al
dispositivo de ultrafiltración (\sim5%), se encontró que
aproximadamente el 70% de éste se asociaba predominantemente con la
fracción de proteína sérica de > 30 KDa en disoluciones de suero
de rata o humano (69% y 72%, respectivamente). De manera importante,
dado que ^{99m}Tc-EC20 se acumula de manera
preferente y eficaz dentro de los tejidos positivos para RF (véanse
la tabla 2 y la figura 8), su evidente afinidad por las proteínas
séricas no parece afectar a esta capacidad de radiotrazador para
dirigirse a los RF in vivo.
\newpage
Los protocolos usados en este ejemplo son
similares a aquéllos descritos en el ejemplo 11. Se evaluó además la
capacidad de ^{99m}Tc-EC20 para seleccionar como
diana tumores in vivo usando modelos tumorales 4T1 negativo
para RF y M109 positivo para RF. Se compraron ratones Balb/c hembra
de seis semanas de edad (n = 3/grupo de dosis) de Harlan Sprague
Dawley, Inc. (Indianápolis, IN) y se mantuvieron con una dieta libre
de folato (Harlan TEKLAD) durante un total de siete días antes de
la inoculación de células tumorales.
Se inocularon por vía subcutánea células 4T1
negativas para RF (5 x 10^{5} P_{0} por animal) o células
tumorales M109 positivas para RF (2 x 10^{6} P_{0} por animal),
singénicas en 100 \mul de RPMI-1640 libre de
folato que contenía suero de ratón singénico al 1%. Se preparó una
disolución madre de ^{99m}Tc-EC20 que contenía
100 \mug de agente por mililitro el día de su uso tal como se
describió anteriormente.
Dieciséis días después de la inoculación de las
células tumorales, se les inyectaron por vía intravenosa a los
animales 500 ó 1800 nmoles/kg de EC20 para los animales que tenían
tumor M109 y 500 nmoles/kg de EC20 para los animales que tenían
tumor 4T1 (3 ratones por grupo de dosis). Todas las inyecciones
fueron en volúmenes de 100 \mul. Cuatro horas tras la inyección,
se sacrificaron los animales mediante asfixia con CO_{2}, y se
extrajo sangre mediante punción cardiaca y se diseccionaron los
animales. Se retiraron los tejidos seleccionados (corazón, pulmones,
hígado, bazo, riñón, intestinos, estómago, músculo y tumor), se
pesaron y se sometieron a recuento en un contador de rayos gamma
automático para determinar la distribución de ^{99m}Tc. Se calculó
la captación del producto radiofarmacéutico en términos de
porcentaje de dosis inyectada de peso húmedo de tejido (% de DI/g)
con referencia a patrones preparados a partir de diluciones de la
preparación inyectada.
Tal como se muestra en la figura 11, se demostró
la selección específica del receptor de folato porque
^{99m}Tc-EC20 se acumuló predominantemente en los
riñones y los tumores M109 positivos para RF, y no en los tumores
4T1 negativos para RF. La captación en los tumores 4T1 negativos
para RF fue 7,6 veces menor que en los tumores M109 positivos para
RF. La captación de ^{99m}Tc-EC20 en los tejidos
normales, excepto en el riñón como se esperaba, fue baja. Estos
resultados muestran que la selección de
^{99m}Tc-EC20 es específica para RF.
\vskip1.000000\baselineskip
Los protocolos usados en este ejemplo son
similares a aquéllos descritos en el ejemplo 11. Se evaluó la
capacidad de ^{99m}Tc-EC11
(péptido-A_{1}), ^{99m}Tc-EC13
(péptido-A_{3}) y ^{99m}Tc-EC14
(péptido-A_{2}) para dirigirse a tumores in
vivo usando el modelo tumoral KB positivo para RF. Se
mantuvieron ratones desnudos macho de cuatro semanas de edad (n =
4/grupo) con una dieta libre de folato durante un total de diez días
antes de la inoculación de células tumorales.
Se inocularon por vía subcutánea células
tumorales KB positivas para RF (0,25 x 10^{6} por animal) en la
región intracapsular. Catorce días después de la inoculación de las
células tumorales, se les inyectó por vía intravenosa a los
animales (n = 4/grupo) ^{99m}Tc-EC11,
^{99m}Tc-EC13 o ^{99m}Tc-EC14 a
las dosis (aproximadamente 12 \mug/kg) de los conjugados
mostrados en la tabla 5 a continuación. Se prepararon disoluciones
madre de las disoluciones de ^{99m}Tc-EC11,
^{99m}Tc-EC13 y ^{99m}Tc-EC14 el
día de su uso tal como se describió anteriormente. Se administró de
manera conjunta aproximadamente un exceso de 20 veces de folato
libre (aproximadamente 200 \mug/kg) a animales control (n =
4/grupo). Cuatro horas tras la inyección, se sacrificaron los
animales mediante asfixia con CO_{2}, y se extrajo sangre mediante
punción cardiaca y se diseccionaron los animales. Se retiraron los
tejidos seleccionados, se pesaron y se sometieron a recuento en un
contador de rayos gamma automático para determinar la distribución
de ^{99m}Tc. Se calculó la captación del producto
radiofarmacéutico en términos de porcentaje de dosis inyectada de
peso húmedo de tejido (% de DI/g) con referencia a patrones
preparados a partir de diluciones de la preparación inyectada.
Tal como se muestra en la tabla 5, se demostró
la selección específica del receptor de folato porque se acumularon
predominantemente ^{99m}Tc-EC11,
^{99m}Tc-EC13 y ^{99m}Tc-EC14 en
los riñones y los tumores KB positivos para RF. Se bloqueó la
acumulación mediante administración conjunta de folato libre. Estos
resultados muestran que ^{99m}Tc-EC11,
^{99m}Tc-EC13 y ^{99m}Tc-EC14
pueden dirigirse a tumores in vivo de manera específica para
RF.
Se obtuvieron resultados similares (véase la
tabla 6 a continuación) con ^{99m}Tc-EC53 (el
enantiómero D total de EC20) usando protocolos similares excepto
que la dosis de ^{99m}Tc-EC53 era aproximadamente
50 \mug/kg y se usó EC53 frío o aproximadamente un exceso de 100
veces de folato libre. Tal como se muestra en la tabla 6, se
demostró la selección específica del receptor de folato porque se
acumuló predominantemente ^{99m}Tc-EC53 en los
riñones y los tumores KB positivos para RF. Se bloqueó la
acumulación mediante administración conjunta de folato libre. Estos
resultados muestran que ^{99m}Tc-EC53 puede
dirigirse a tumores in vivo de manera específica para
RF.
La invención proporciona un conjugado de una
vitamina y un quelante de radionúclido para su desarrollo clínico
como agente de formación de imágenes. Un ejemplo de un agente de
formación de imágenes de este tipo es el quelante de radionúclido a
base de folato recientemente diseñado, sintetizado y caracterizado
radioquímicamente, ^{99m}Tc-EC20.
^{99m}Tc-EC20, un derivado
peptídico de pequeño peso molecular de folato que contiene un enlace
peptídico _{D}-\gamma-Glu
(véase la figura 1), se sintetizó usando un procedimiento sintético
en fase sólida eficaz. En su forma natural, el folato (o
pteroil-glutamato) tiene un solo residuo de
glutamilo presente en una configuración L. Sin embargo, un residuo
de enantiómero _{D}-Glu se incorporó en la
molécula de EC20. De manera importante, similar a EC20, la
sustitución del residuo de _{L}-Glu en el ácido
fólico por un residuo de _{D}-Glu no altera a la
capacidad del ácido fólico para unirse al RF de alta afinidad.
Se encontró que EC20 quela eficazmente a
^{99m}Tc cuando está en presencia de
\alpha-D-glucoheptonato y cloruro
de estaño (II). Cuando se analizó mediante HPLC radioquímica, >
95% de la formulación de ^{99m}Tc-EC20 resultante
consistía en una mezcla de estereoisómeros syn y anti,
cada uno podía por igual unirse al RF con alta afinidad (véase la
figura 3). Aproximadamente el 3% del ^{99m}Tc en la formulación
estaba quelado a EC20 en algún otro sitio de la molécula de EC20
que en el resto de Dap-Asp-Cys
esperado. Aunque no se aisló este componente en una cantidad
suficiente para su caracterización óptima, se demostró que se unía
al RF con alta afinidad (véase la figura 6). Por último, el 2%
restante de la radiactividad en la formulación de
^{99m}Tc-EC20 se atribuyó a ^{99m}Tc libre.
^{99m}Tc-EC20 demostró
asociación dependiente tanto del tiempo como de la concentración con
células positivas para RF. ^{99m}Tc-EC20 se
aclaró rápidamente de la sangre (t_{1/2} \sim4 min), lo cual es
importante para los agentes de formación de imágenes de
diagnóstico, y el ^{99m}Tc-EC20 se acumuló
preferentemente en grandes cantidades dentro de los tumores
positivos para RF.
El rendimiento de
^{99m}Tc-EC20 se comparó directamente con aquél de
un agente dirigido a RF similar,
^{111}In-DTPA-folato, usando dos
métodos diferentes. En primer lugar, se encontró que ambos productos
radiofarmacéuticos a base de folato competían por igual con el
ácido fólico para unirse a los RF de KB (véanse la figura 3 y la
tabla 1). En segundo lugar, la biodistribución de cada agente en
ratones que tenían tumores era casi idéntica (véase la tabla 2). Se
midieron la alta captación en el tumor y las razones de tumor con
respecto a sangre para ^{99m}Tc-EC20. En su
conjunto, estos resultados sugieren que al igual que
^{111}In-DTPA-folato,
^{99m}Tc-EC20 se localizará eficazmente en los
tumores positivos para RF cuando se administre clínicamente a
pacientes.
Se han descrito anteriormente varios conjugados
de ^{999m}Tc a base de folato. Datos de biodistribución limitados
están disponibles para un conjugado de folato de
^{99m}Tc-12-amino-3,3,9,9-tetrametil-5-oxa-4,8-diaza-2,10-dodecanodiona-dioxima
(OXA), sin embargo, se notificaron niveles moderados (\sim7% de
DI/g) de captación de trazador en un tumor KB. También, se
notificaron estudios que implicaban la biodistribución de un
conjugado de
^{99m}Tc-etilenodicisteína-folato
en ratas que tenían tumores de mama. Las ratas en aquel estudio se
alimentaron con una dieta rica en folato. Por tanto, se obtuvieron
una baja captación en el tumor y bajas razones de tumor con respecto
a sangre. Por último, se demostró que un derivado de folato de
^{99m}Tc-6-hidrazinonicotinamido-hidrazido
(HYNIC) (HYNIC-folato) se acumulaba en grandes
cantidades dentro de tumores 24JK-FBP. De manera
interesante, ^{99m}Tc-EC20 se acumuló dentro de
tumores M 109 a niveles casi idénticos a los de
HYNIC-folato en tumores 24JK-FBP
(\sim17% de DI/g)(tabla 2). Estos dos agentes mostraron también
razones de tumor con respecto a sangre de aproximadamente 50:1 4
horas tras la inyección intravenosa.
En resumen, se creó un nuevo derivado peptídico
de folato para quelar eficazmente a ^{99m}Tc. Este nuevo
compuesto, ^{99m}Tc-EC20, se une con avidez a
células tumorales positivas para RF in vitro e in
vivo. Se encontró que EC20 se unía a células tumorales
positivas para receptor de folato (RF) cultivadas de manera
dependiente tanto del tiempo como de la concentración con muy alta
afinidad (K_{D} \sim3 nM). Usando un ensayo de afinidad
relativa in vitro, se encontró también que EC20 competía
eficazmente con el ácido ^{3}H-fólico para su
unión a células cuando se presentaba o bien solo o bien como quelato
de metal formulado. Tras la inyección intravenosa en ratones
Balb/c, se eliminó rápidamente ^{99m}Tc-EC20 de la
circulación (t_{1/2} plasmática \sim4 min) y se excretó en la
orina en forma no metabolizada. Los datos de estudios de
biodistribución cuantitativa y gammagráficos realizados en ratones
Balb/c que tenían tumores M109 confirmaron que
^{99m}Tc-EC20 se acumula predominantemente en
tejidos de riñón y tumorales positivos para RF. Estos resultados
muestran que ^{99m}Tc-EC20 es un agente de
formación de imágenes de radiodiagnóstico no invasivo, eficaz, para
la detección de tumores positivos para RF. También se demostró que
otros agentes de formación de imágenes relacionados con EC20 eran
eficaces, incluyendo EC11, EC13, EC14 y EC53.
Cada año, se diagnostica a \sim26.000 mujeres
en los Estados Unidos cáncer ovárico, y menos del 50% de esas
mujeres sobreviven más de cinco años. Una de los motivos para la
baja tasa de supervivencia es la dificultad en diagnosticar esta
forma de cáncer. Debido al miedo de romper una masa abdominal no
identificada y el potencial para diseminar el cáncer por toda la
cavidad abdominal, no se realiza con frecuencia la biopsia con aguja
fina. En vez de esto, el diagnóstico y la determinación del estadio
de masas ováricas sospechosas se hace normalmente a través de
laparotomía quirúrgica, que es un procedimiento costoso e invasivo.
Dado que ^{99m}Tc-EC20 se une estrechamente al RF
presente en grandes cantidades en cánceres ováricos (entre otros),
este producto radiofarmacéutico proporciona un método barato, no
invasivo pero fiable para el diagnóstico temprano de cáncer ovárico
maligno. De manera importante, Tc-EC20 puede ayudar
también a guiar el proceso de decisión clínica haciendo posible un
diagnóstico precoz y más definitivo de la enfermedad residual o
recurrente.
Claims (15)
1. Compuesto de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que V es un folato, en la que
el folato se une a un receptor de folato, y en la que el folato es
un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptor
in vivo, o un derivado o análogo del mismo, en la que el
análogo se selecciona de análogos desaza y didesaza de ácido fólico,
ácido folínico, ácido pteroico, ácido pteropoliglutámico y
pteridinas que se unen al receptor de folato, o de aminopterina,
ametopterina (metotrexato), N^{10}-metilfolato,
2-desamino-hidroxifolato, análogos
desaza y ácido
3'5'-dicloro-4-amino-4-desoxi-N^{10}-metilpteroilglutámico
(diclorometotrexato), en la que el derivado o análogo se une al
receptor de folato y es un sustrato para el transporte transmembrana
mediado por receptor in
vivo;
L es un conector divalente;
R es una cadena lateral de un aminoácido de
fórmula H_{2}NCHRCOOH;
M es un catión de un radionúclido;
n es 1 ó 0; y
k es 1 ó 0,
con la condición de que (i) si k = 0, el
compuesto no es el compuesto EC20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y si dicho k = 1 y dicho compuesto
es EC20, M no es
^{99m}Tc.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que el radionúclido se selecciona del grupo que consiste en isótopos
de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.
3. Compuesto según la reivindicación 2, en el
que el radionúclido es un isótopo de tecnecio.
\newpage
4. Composición para formar imágenes de
diagnóstico que comprende un compuesto de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que V es un folato, en la que
el folato se une a un receptor de folato, y en la que el folato es
un sustrato para el transporte transmembrana mediado por receptor
in vivo, o un derivado o análogo del mismo, en la que el
análogo se selecciona de análogos desaza y didesaza de ácido fólico,
ácido folínico, ácido pteroico, ácido pteropoliglutámico y
pteridinas que se unen al receptor de folato, o de aminopterina,
ametopterina (metotrexato), N^{10}-metilfolato,
2-desamino-hidroxifolato, análogos
desaza y ácido
3'5'-dicloro-4-amino-4-desoxi-N^{10}-metilpteroilglutámico
(diclorometotrexato), en la que el derivado o análogo se une al
receptor de folato y es un sustrato para el transporte transmembrana
mediado por receptor in
vivo;
L es un conector divalente;
R es una cadena lateral de un aminoácido de
fórmula H_{2}NCHRCOOH;
M es un catión de un radionúclido;
n es 1 ó 0; y
un vehículo farmacéuticamente aceptable para el
mismo;
con la condición de que si el compuesto es el
compuesto EC20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
M no es ^{99m}Tc.
5. Composición según la reivindicación 4, en la
que el radionúclido en el compuesto se selecciona del grupo que
consiste en isótopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.
6. Composición según la reivindicación 5, en la
que el radionúclido en el compuesto es un isótopo de tecnecio.
7. Composición según la reivindicación 4
adaptada para administración parenteral.
\newpage
8. Composición que comprende un compuesto de
fórmula
en la que V es el folato, o un
derivado o análogo del mismo, en la que el derivado o análogo del
mismo, en la que el análogo se selecciona de los análogos desaza y
didesaza de ácido fólico, ácido folínico, ácido pteroico, ácido
pteropoliglutámico y pteridinas que se unen al receptor de folato, o
de aminopterina, ametopterina (metotrexato),
N^{10}-metilfolato,
2-desamino-hidroxifolato, análogos
desaza y ácido
3'5'-dicloro-4-amino-4-desoxi-N^{10}-metilpteroilglutámico
(diclorometotrexato), se une al receptor de
folato;
L es un conector divalente;
R es una cadena lateral de un aminoácido de
fórmula H_{2}NCHRCOOH;
M es un catión de un radionúclido;
n = 1 ó 0; y
un vehículo farmacéuticamente aceptable para el
mismo; para su uso en la formación de imágenes de una población de
células en un animal en el que dichas células se caracterizan
por un receptor de folato en la superficie de dichas células y la
monitorización de la biodistribución de dicho compuesto en el
animal, en el que el folato, derivado o análogo es un sustrato para
el transporte transmembrana mediado por receptor in vivo;
con la condición de que si el compuesto es el
compuesto EC20:
M no es ^{99m}Tc.
9. Composición según la reivindicación 8, en la
que el radionúclido en el compuesto se selecciona del grupo que
consiste en isótopos de galio, indio, cobre, tecnecio y renio.
10. Composición según la reivindicación 9, en la
que el radionúclido en el compuesto es un isótopo de tecnecio.
11. Composición según la reivindicación 8, en la
que la composición se administra por vía parenteral al paciente.
12. Compuesto o composición según cualquier
reivindicación anterior, en el que V se selecciona de ácido fólico,
ácido folínico, ácido pteroico, ácido pteropoliglutámico y
pteridinas que se unen al receptor.
13. Compuesto o composición según las
reivindicaciones 1-11, en el que el análogo desaza
es 1-desazametopterina o
3-desazametopterina.
14. Composición que comprende un liofilizado que
puede reconstituirse de un compuesto de fórmula:
en combinación con cloruro de
estaño (II) y \alpha_{D}-glucoheptonato de
sodio.
15. Composición según la reivindicación 14, en
la que el compuesto EC20 está quelado a ^{99m}Tc.
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ATE427948T1 (de) * | 2001-04-24 | 2009-04-15 | Purdue Research Foundation | Folat-mimetika und deren folatrezeptorbindende konjugate |
HUP0401127A3 (en) | 2001-05-02 | 2006-03-28 | Purdue Research Foundation | Treatment and diagnosis of macrophage disease |
US8043602B2 (en) | 2002-02-07 | 2011-10-25 | Endocyte, Inc. | Folate targeted enhanced tumor and folate receptor positive tissue optical imaging technology |
US8043603B2 (en) * | 2002-02-07 | 2011-10-25 | Endocyte, Inc. | Folate targeted enhanced tumor and folate receptor positive tissue optical imaging technology |
EP1501551B1 (en) * | 2002-05-06 | 2009-11-18 | Endocyte, Inc. | Folate-receptor targeted imaging agents |
KR20040106547A (ko) * | 2002-05-15 | 2004-12-17 | 엔도사이트, 인코포레이티드 | 비타민-마이토마이신 공액체 |
NZ541846A (en) * | 2003-01-27 | 2008-12-24 | Endocyte Inc | Vitamin receptor binding drug delivery conjugates |
JP2007526238A (ja) * | 2003-05-06 | 2007-09-13 | パーデュー・リサーチ・ファウンデーション | マクロファージまたは葉酸受容体を標的とする狼瘡治療法 |
EP1629281B1 (en) | 2003-05-30 | 2008-10-29 | Purdue Research Foundation | Diagnostic method for atherosclerosis |
EP1789391B1 (en) | 2004-07-23 | 2017-06-28 | Endocyte, Inc. | Bivalent linkers and conjugates thereof |
WO2007008247A2 (en) * | 2004-11-10 | 2007-01-18 | University Of South Florida | Platinum complexes for targeted drug delivery |
US20070276231A1 (en) * | 2004-12-23 | 2007-11-29 | Low Philip S | Positron Emission Tomography Imaging Method |
WO2006101845A2 (en) * | 2005-03-16 | 2006-09-28 | Endocyte, Inc. | Synthesis and purification of pteroic acid and conjugates thereof |
EP1904183B1 (en) | 2005-07-05 | 2014-10-15 | Purdue Research Foundation | Pharmaceutical composition for the treatment of osteoarthritis |
WO2007022494A2 (en) | 2005-08-19 | 2007-02-22 | Endocyte, Inc. | Multi-drug ligand conjugates |
WO2007022493A2 (en) | 2005-08-19 | 2007-02-22 | Endocyte, Inc. | Ligand conjugates of vinca alkaloids, analogs, and derivatives |
EP1940473A2 (en) | 2005-09-23 | 2008-07-09 | Purdue Research Foundation | Multiphoton in vivo flow cytometry method and device |
US8685752B2 (en) * | 2006-11-03 | 2014-04-01 | Purdue Research Foundation | Ex vivo flow cytometry method and device |
CA2677792C (en) * | 2007-02-07 | 2015-04-14 | Purdue Research Foundation | Positron emission tomography imaging method |
US9216228B2 (en) | 2007-02-16 | 2015-12-22 | KTB Tumorforschungsgesellschaft MBM | Receptor and antigen targeted prodrug |
US20100104626A1 (en) | 2007-02-16 | 2010-04-29 | Endocyte, Inc. | Methods and compositions for treating and diagnosing kidney disease |
JP5829793B2 (ja) | 2007-03-14 | 2015-12-09 | エンドサイト・インコーポレイテッドEndocyte, Inc. | 結合性リガンドが結合したツブリシンの薬剤送達結合体 |
WO2008125613A1 (en) | 2007-04-11 | 2008-10-23 | Merck Eprova Ag | 18f-labelled folates |
CA2670385C (en) * | 2007-04-11 | 2016-01-12 | Merck Eprova Ag | Folate-conjugates and corresponding metal-chelate complexes for use in diagnostic imaging and radiotherapy |
EP2164525A2 (en) * | 2007-05-25 | 2010-03-24 | Purdue Research Foundation | Method of imaging localized infections |
US9877965B2 (en) | 2007-06-25 | 2018-01-30 | Endocyte, Inc. | Vitamin receptor drug delivery conjugates for treating inflammation |
EP3569251A1 (en) | 2007-06-25 | 2019-11-20 | Endocyte, Inc. | Conjugates containing hydrophilic spacer linkers |
EP3831380A3 (en) | 2007-08-17 | 2021-12-01 | Purdue Research Foundation | Psma binding ligand-linker conjugates and methods for using |
EP2209374B1 (en) | 2007-10-25 | 2014-12-03 | Endocyte, Inc. | Tubulysins and processes for preparing |
WO2009065002A1 (en) * | 2007-11-15 | 2009-05-22 | Endocyte, Inc. | Method of administering conjugates |
US9332973B2 (en) | 2008-10-01 | 2016-05-10 | Covidien Lp | Needle biopsy device with exchangeable needle and integrated needle protection |
US9186128B2 (en) | 2008-10-01 | 2015-11-17 | Covidien Lp | Needle biopsy device |
US8968210B2 (en) | 2008-10-01 | 2015-03-03 | Covidien LLP | Device for needle biopsy with integrated needle protection |
US9782565B2 (en) | 2008-10-01 | 2017-10-10 | Covidien Lp | Endoscopic ultrasound-guided biliary access system |
US11298113B2 (en) | 2008-10-01 | 2022-04-12 | Covidien Lp | Device for needle biopsy with integrated needle protection |
WO2010083104A2 (en) | 2009-01-13 | 2010-07-22 | Emory University | Conjugates of noscapine and folic acid and their use in treating cancer |
US8975389B2 (en) | 2009-03-02 | 2015-03-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid chemical modifications |
EP2403412A4 (en) * | 2009-03-05 | 2013-08-07 | Purdue Research Foundation | PROCESS FOR EARLY IMAGING OF ATHEROSCLEROSIS |
US9951324B2 (en) | 2010-02-25 | 2018-04-24 | Purdue Research Foundation | PSMA binding ligand-linker conjugates and methods for using |
US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
EP2556171B1 (en) | 2010-04-05 | 2015-09-02 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
WO2011130716A2 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Access Pharmaceuticals, Inc. | A nanostructures containing vitamin b12 for facilitated delivery of drugs across biological barriers |
WO2011133868A2 (en) | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides |
WO2011133876A2 (en) | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs |
KR20140026396A (ko) | 2011-03-08 | 2014-03-05 | 어섹스 팔마큐티칼스 인코포레이티드 | 생물학적 막을 가로질러 활성물질의 전달을 위한 표적화된 나노담체 시스템 |
GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
WO2013024035A1 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | Merck & Cie | Folate conjugates of albumin-binding entities |
WO2013103707A1 (en) | 2012-01-03 | 2013-07-11 | Invictus Oncology Pvt. Ltd. | Ligand-targeted molecules and methods thereof |
WO2013126797A1 (en) | 2012-02-24 | 2013-08-29 | Purdue Research Foundation | Cholecystokinin b receptor targeting for imaging and therapy |
WO2013130776A1 (en) * | 2012-02-29 | 2013-09-06 | Purdue Research Foundation | Folate receptor alpha binding ligands |
US20140080175A1 (en) | 2012-03-29 | 2014-03-20 | Endocyte, Inc. | Processes for preparing tubulysin derivatives and conjugates thereof |
CA2880001A1 (en) * | 2012-07-25 | 2014-01-30 | Emory University | Imaging and therapeutic methods for treating parathyroid tumors |
JP2015536323A (ja) | 2012-10-16 | 2015-12-21 | エンドサイト・インコーポレイテッドEndocyte, Inc. | 非天然アミノ酸を含む薬物送達結合体および使用方法 |
KR101551232B1 (ko) | 2012-10-26 | 2015-09-10 | 한국원자력연구원 | N3s1형의 새로운 킬레이터가 접합된 폴레이트 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 진단 또는 치료용 조성물 |
CA3158675A1 (en) | 2012-11-15 | 2014-05-22 | Endocyte, Inc. | Drug delivery conjugates, and methods for treating diseases caused by psma expressing cells |
WO2014150943A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Purdue Research Foundation | Asthma imaging and therapy |
DK3013983T3 (da) | 2013-06-25 | 2023-03-06 | Prognosys Biosciences Inc | Spatialt kodede biologiske assays ved brug af en mikrofluidisk anordning |
EP4095130B1 (en) | 2013-10-18 | 2024-01-31 | Novartis AG | Labeled inhibitors of prostate specific membrane antigen (psma), their use as imaging agents and pharmaceutical agents for the treatment of prostate cancer |
CA2930581A1 (en) * | 2013-11-14 | 2015-05-21 | Endocyte, Inc. | Compounds for positron emission tomography |
WO2015077303A1 (en) | 2013-11-19 | 2015-05-28 | Purdue Research Foundation | Patient selection method for inflammation |
AU2015241198A1 (en) | 2014-04-03 | 2016-11-17 | Invictus Oncology Pvt. Ltd. | Supramolecular combinatorial therapeutics |
EP3160514A4 (en) * | 2014-06-27 | 2018-02-28 | Reiley Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates derived from non-steroidal anti-inflammatory drugs and methods of use thereof in imaging |
US20160166679A1 (en) * | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Purdue Research Foundation | Method of treatment using folate conjugates and tyrosine kinase inhibitors |
CA2970795A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Reversir compounds |
US10188759B2 (en) | 2015-01-07 | 2019-01-29 | Endocyte, Inc. | Conjugates for imaging |
EP3693022A3 (en) | 2015-01-09 | 2020-09-16 | Reiley Pharmaceuticals, Inc. | Cox-2-targeting, platinum-containing conjugates and their use in the treatment of tumors and cancers |
DK3901281T3 (da) | 2015-04-10 | 2023-01-23 | Spatial Transcriptomics Ab | Rumligt adskilt, multipleks nukleinsyreanalyse af biologiske prøver |
WO2017015109A1 (en) | 2015-07-17 | 2017-01-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Multi-targeted single entity conjugates |
US10420850B2 (en) | 2015-08-14 | 2019-09-24 | Endocyte, Inc. | Method of imaging with a chelating agent |
EP3882357B1 (en) | 2015-12-04 | 2022-08-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid analysis |
WO2017161144A1 (en) | 2016-03-16 | 2017-09-21 | Endocyte, Inc. | Carbonic anhydrase ix inhibitor conjugates and uses thereof |
US11925696B2 (en) | 2016-03-16 | 2024-03-12 | Purdue Research Foundation | Carbonic anhydrase IX targeting agents and methods |
US20170296679A1 (en) * | 2016-04-18 | 2017-10-19 | Intuitive Surgical Operations, Inc. | Compositions of Near IR Closed Chain, Sulfo-Cyanine Dyes and Prostate Specific Membrane Antigen Ligands |
JP7334147B2 (ja) | 2017-08-22 | 2023-08-28 | パーデュー・リサーチ・ファウンデイション | 炭酸脱水酵素陽性がんを標的とするfbsa系治療および放射性造影複合体 |
US20220125823A1 (en) | 2018-05-07 | 2022-04-28 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Extrahepatic delivery |
TW202028465A (zh) | 2018-09-28 | 2020-08-01 | 美商阿尼拉製藥公司 | 甲狀腺素運載蛋白(TTR)iRNA組成物及其治療或預防TTR相關眼部疾病之使用方法 |
JP2022532652A (ja) | 2019-05-17 | 2022-07-15 | アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | オリゴヌクレオチドの経口送達 |
WO2021086982A2 (en) | 2019-10-28 | 2021-05-06 | Beckman Coulter, Inc. | Compounds for the identification of microbial classes and uses thereof |
WO2021092145A1 (en) | 2019-11-06 | 2021-05-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Transthyretin (ttr) irna composition and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases |
AU2020378414A1 (en) | 2019-11-06 | 2022-05-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Extrahepatic delivery |
WO2021252499A1 (en) | 2020-06-08 | 2021-12-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
US11981960B1 (en) | 2020-07-06 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis utilizing degradable hydrogels |
WO2022011214A1 (en) | 2020-07-10 | 2022-01-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Circular sirnas |
CN116916968A (zh) | 2020-10-30 | 2023-10-20 | 托德·斯皮尔 | 基于寡核苷酸的治疗剂及其用途 |
WO2022147214A2 (en) | 2020-12-31 | 2022-07-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Cyclic-disulfide modified phosphate based oligonucleotide prodrugs |
EP4271695A2 (en) | 2020-12-31 | 2023-11-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified nucleoside based oligonucleotide prodrugs |
EP4274619A1 (en) * | 2021-01-08 | 2023-11-15 | Lycia Therapeutics, Inc. | Bifunctional folate receptor binding compounds |
EP4367237A2 (en) | 2021-07-09 | 2024-05-15 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Bis-rnai compounds for cns delivery |
EP4373937A1 (en) | 2021-07-21 | 2024-05-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Metabolic disorder-associated target gene irna compositions and methods of use thereof |
IL311864A (en) | 2021-10-15 | 2024-06-01 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | IRNA compositions for extrahepatic administration and methods of using them |
WO2023220744A2 (en) | 2022-05-13 | 2023-11-16 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Single-stranded loop oligonucleotides |
WO2024006999A2 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Cyclic-disulfide modified phosphate based oligonucleotide prodrugs |
WO2024073732A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Modified double-stranded rna agents |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2816110A (en) | 1956-11-23 | 1957-12-10 | Merck & Co Inc | Methods for the production of substituted pteridines |
US5140104A (en) | 1982-03-09 | 1992-08-18 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of folic acid analogs |
US5242679A (en) * | 1985-01-14 | 1993-09-07 | Neorx Corporation | Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy |
US5175343A (en) * | 1985-01-14 | 1992-12-29 | Neorx Corporation | Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy |
NZ217821A (en) | 1985-10-10 | 1989-07-27 | Biotech Australia Pty Ltd | Oral delivery system; complex of active agent and vitamin b12 or analogue thereof |
GB8608335D0 (en) | 1986-04-04 | 1986-05-08 | Pfizer Ltd | Pharmaceutically acceptable salts |
EP0273085A1 (en) | 1986-12-29 | 1988-07-06 | IntraCel Corporation | A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells |
US5053493A (en) * | 1987-04-02 | 1991-10-01 | Centocor Cardiovascular Imaging Partners, L.P. | Method for labeling antibodies with a metal ion |
US5688488A (en) * | 1989-04-03 | 1997-11-18 | Purdue Research Foundation | Composition and method for tumor imaging |
US7238340B1 (en) * | 1991-11-27 | 2007-07-03 | Cis Bio International | Monoamine, diamide, thiol-containing metal chelating agents |
EP0570493B1 (en) * | 1991-02-08 | 2000-01-05 | Diatide, Inc. | TECHNETIUM-99m LABELED POLYPEPTIDES FOR IMAGING |
US6335434B1 (en) | 1998-06-16 | 2002-01-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc., | Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates |
US5159079A (en) | 1991-12-20 | 1992-10-27 | Eli Lilly And Company | 2-piperidones as intermediates for 5-deaza-10-oxo- and 5-deaza-10-thio-5,6,7,8-tetrahydrofolic acids |
US6022966A (en) | 1993-11-22 | 2000-02-08 | Neorx Corporation | Pretargeting methods and compounds |
DE4310999C2 (de) * | 1993-03-31 | 1996-07-18 | Diagnostikforschung Inst | Bifunktionelle chalkogenatom-unterbrochene Chelatbildner vom Typ XN¶1¶S¶1¶X' für radioaktive Isotope und deren Metallkomplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese enthaltende pharmazeutische Mittel |
DE4311023C2 (de) * | 1993-03-31 | 1996-05-02 | Diagnostikforschung Inst | Bifunktionelle chalkogenatom-unterbrochene Chelatbildner von Typ XN¶1¶S¶1¶O¶1¶ für radioaktive Isotope, deren Metallkomplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese enthaltende pharmazeutische Mittel |
DE4311021A1 (de) * | 1993-03-31 | 1994-10-27 | Diagnostikforschung Inst | Bifunktionelle Chelatbildner, deren Technetium- und Rhenium-Komplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende radiopharmazeutische Mittel |
DE4311022C2 (de) * | 1993-03-31 | 1996-07-11 | Diagnostikforschung Inst | Bifunktionelle chalkogenatom-unterbrochene Chelatbildner vom Typ S¶3¶N¶2¶ für radioaktive Isotope und deren Metallkomplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese enthaltende pharmazeutische Mittel |
DE4425781A1 (de) * | 1994-07-14 | 1996-01-18 | Schering Ag | Technetium-Sulfonamid-Komplexe, deren Verwendung, diese enthaltende pharmazeutische Mittel, sowie Verfahren zur Herstellung der Komplexe und Mittel |
US6083480A (en) * | 1997-05-01 | 2000-07-04 | Diatide, Inc. | Calcitonin receptor binding reagents |
US6093382A (en) * | 1998-05-16 | 2000-07-25 | Bracco Research Usa Inc. | Metal complexes derivatized with folate for use in diagnostic and therapeutic applications |
US6323313B1 (en) * | 1999-06-01 | 2001-11-27 | The University Of Washington | Annexin derivative with endogenous chelation sites |
CA2410906C (en) * | 2000-06-02 | 2012-10-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Ethylenedicysteine (ec)-drug conjugates |
HUP0401127A3 (en) * | 2001-05-02 | 2006-03-28 | Purdue Research Foundation | Treatment and diagnosis of macrophage disease |
EP1501551B1 (en) * | 2002-05-06 | 2009-11-18 | Endocyte, Inc. | Folate-receptor targeted imaging agents |
NZ541846A (en) * | 2003-01-27 | 2008-12-24 | Endocyte Inc | Vitamin receptor binding drug delivery conjugates |
JP2007526238A (ja) * | 2003-05-06 | 2007-09-13 | パーデュー・リサーチ・ファウンデーション | マクロファージまたは葉酸受容体を標的とする狼瘡治療法 |
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