ES2440369T3 - Método para la producción de anticuerpos catalíticos (variantes), antígenos para inmunización y secuencia de nucleótidos - Google Patents
Método para la producción de anticuerpos catalíticos (variantes), antígenos para inmunización y secuencia de nucleótidos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2440369T3 ES2440369T3 ES10183175.8T ES10183175T ES2440369T3 ES 2440369 T3 ES2440369 T3 ES 2440369T3 ES 10183175 T ES10183175 T ES 10183175T ES 2440369 T3 ES2440369 T3 ES 2440369T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antibodies
- mice
- protein
- catalytic
- sjl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 42
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 42
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 29
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 title abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title description 33
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title description 33
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 28
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 41
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 23
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 abstract description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 10
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 abstract description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 5
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 69
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 28
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- -1 peptidyl phosphonate Chemical compound 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 description 11
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 7
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 7
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 6
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 6
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 5
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 5
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 4
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 4
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- HVLLSGMXQDNUAL-UHFFFAOYSA-N triphenyl phosphite Chemical compound C=1C=CC=CC=1OP(OC=1C=CC=CC=1)OC1=CC=CC=C1 HVLLSGMXQDNUAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 3
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- AMIMRNSIRUDHCM-UHFFFAOYSA-N Isopropylaldehyde Chemical compound CC(C)C=O AMIMRNSIRUDHCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N ammonium bromide Chemical compound [NH4+].[Br-] SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- PUJDIJCNWFYVJX-UHFFFAOYSA-N benzyl carbamate Chemical compound NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 PUJDIJCNWFYVJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 2
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 2
- 125000006267 biphenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- GSYSFVSGPABNNL-UHFFFAOYSA-N methyl 2-dimethoxyphosphoryl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)acetate Chemical group COC(=O)C(P(=O)(OC)OC)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 GSYSFVSGPABNNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N phenylbenzene Natural products C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010911 splenectomy Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-L suberate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCCCCCC([O-])=O TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- ZZGAZUBMJYEUHS-VYMRPNJYSA-N (2s,8s)-2,8-diamino-4,6-dichloro-1,9-diphenylnonane-3,5,7-trione Chemical compound C([C@H](N)C(=O)C(Cl)C(=O)C(Cl)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 ZZGAZUBMJYEUHS-VYMRPNJYSA-N 0.000 description 1
- YBADLXQNJCMBKR-UHFFFAOYSA-M (4-nitrophenyl)acetate Chemical compound [O-]C(=O)CC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 YBADLXQNJCMBKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFYIUBWVKZQDOG-UHFFFAOYSA-N 4-[[2-[[2-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C=1C=C([N+]([O-])=O)C=CC=1NC(=O)C(NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CCC(=O)O)CC1=CC=CC=C1 CFYIUBWVKZQDOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 1
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- JWQNMZVYTPNHKI-UHFFFAOYSA-N Br.P(O)(O)=O Chemical compound Br.P(O)(O)=O JWQNMZVYTPNHKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101900082162 Human immunodeficiency virus type 1 group M subtype B Surface protein gp120 Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960003920 cocaine Drugs 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 description 1
- KDBQRAGSEVVHSN-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O KDBQRAGSEVVHSN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000001712 encephalitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 230000020169 heat generation Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000003533 narcotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- CDXVUROVRIFQMV-UHFFFAOYSA-N oxo(diphenoxy)phosphanium Chemical compound C=1C=CC=CC=1O[P+](=O)OC1=CC=CC=C1 CDXVUROVRIFQMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N peptide a Chemical group N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCCC[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C/C=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C(=O)C(\NC(=O)[C@@H](CCCCN)NC(=O)CNC(C)=O)=C\C1=CC=CC=C1 LQRJAEQXMSMEDP-XCHBZYMASA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical group O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000024664 tolerance induction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
- C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0002—Antibodies with enzymatic activity, e.g. abzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/10—Animals modified by protein administration, for non-therapeutic purpose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
- C07K2319/41—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a Myc-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Proteína de fusión que tiene la siguiente estructura: **Tabla**
Description
Método para la producción de anticuerpos catalíticos (variantes), antígenos para inmunización y secuencia de nucleótidos.
Campo de la invención
5 La presente invención se relaciona con biotecnología, inmunología, ingeniería genética, las industrias microbiológicas y medicinales y comprende un enfoque combinado para la fabricación y la expresión de anticuerpos catalíticamente activos que son terapéuticos potenciales destinados a destruir antígenos de proteína, en particular, la gp120, que es la principal proteína de superficie del virus de inmunodeficiencia humana.
Estado de la técnica
10 Se sabe que se pueden diseñar anticuerpos catalíticos dirigidos a las sustancias fisiológicamente activas y a objetos naturales útiles en biomedicina como representaciones específicas de los estados de transición de conversiones químicas modeladas. La patente de los Estados Unidos No. 5.948.658 da a conocer un anticuerpo diseñado por el enfoque anterior y capaz de escindir específicamente al narcótico cocaína. A pesar de una tecnología altamente desarrollada para la producción de anticuerpos monoclonales, este enfoque no puede ser efectivo en el caso de
15 biopolímeros, proteínas y péptidos de elevado peso molecular debido a que es difícil modelar los correspondientes estados de transición de la reacción.
La producción de anticuerpos catalíticos activos directamente contra la gp120 se da a conocer en el documento WO 9703696; sin embargo, de acuerdo con el documento WO 9703696, se obtiene el anticuerpo a partir del suero del paciente, lo que impide el desarrollo de una tecnología médica unificada para la producción de un medicamento.
20 Resumen de la invención
La proteína de fusión de la invención tiene la siguiente estructura:
El objetivo de la presente invención es desarrollar un método para producir anticuerpos catalíticos contra proteínas y péptidos, en particular la gp120, con el uso de animales con patologías autoinmunes espontáneas e inducibles,
25 donde dicho método hará posible el diseño de una "vacuna catalítica" que, después de ser inyectada a un paciente, es capaz no sólo de enlazarse con el antígeno, sino también de destruirlo inhibiendo así el desarrollo de la enfermedad.
Se proporciona un método para la producción de anticuerpos catalíticos con el uso de animales con patologías autoinmunes espontáneas e inducidas. Se utilizan ratones como los animales con patologías autoinmunes
30 espontáneas e inducibles. Los ratones usados pertenecen a cepas para las que la inmunización con proteína básica de mielina o su fragmento puede inducir el desarrollo de encefalomielitis autoinmune experimental. A los animales se les administra una proteína de fusión que consta de la proteína básica de mielina o de sus fragmentos y un sustrato potencial de anticuerpo catalítico o un fragmento del sustrato potencial. El sustrato potencial es la gp120 (glicoproteína de superficie del VIH-1) o sus fragmentos.
35 Se proporciona una proteína de fusión que tiene la siguiente estructura: Se propone una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de la estructura anterior.
Se proporciona un método para la producción de un anticuerpo catalítico utilizando animales con patologías autoinmunes espontáneas e inducidas. El animal con patologías autoinmunes espontáneas e inducibles son ratones MRL-lpr/lpr, siendo los ratones inmunizados con un antígeno que contiene un hapteno, siendo el hapteno un conjugado de un inhibidor de la proteasa covalente que depende de un mecanismo con un péptido, siendo el péptido un fragmento de un sustrato potencial del anticuerpo catalítico.
El sustrato potencial del anticuerpo catalítico es gp120 o su fragmento.
El peptidilfosfonato tiene la siguiente estructura:
Breve descripción de los dibujos:
Figura 1. Secuencia de nucleótidos del fragmento I-III de gp120. Los fragmentos I, II y III, están coloreados de forma secuencial. Los cebadores utilizados en la PCR se señalan con letras mayúsculas.
Figura 2. Diagramas de proteínas recombinantes obtenidas con el uso del vector pET32b.
15 Figura 3. Diagramas de proteínas recombinantes obtenidas con el uso del vector pET28a.
Figura 4. Electroforetograma (A) e inmunotransferencia (B) de las diferentes etapas de aislamiento y purificación de la proteína gp120I-IIImbp (el producto del constructo 15). 1 - proteínas celulares totales antes de la inducción; 2 proteínas celulares totales después de la inducción; 3 - la fracción de proteínas intracelulares solubles; 4 - proteínas solubles no retenidas por la columna quelante de metal; 5 -proteínas solubles eluidas a pH 5,0; 6 - preparación de
20 una forma de proteína soluble después de purificación cromatográfica; 7 - la fracción de proteínas intracelulares insolubles; 8 - proteínas insolubles no retenidas por la columna quelante de metales; 9 - preparación de una forma de proteína desnaturalizada después de purificación cromatográfica; 10 - marcador.
Figura 5. Análisis de la especificidad antigénica de anticuerpos en suero de ratones SJL inmunizados con la proteína de fusión gp120I-IIImbp con diferentes dosis. La leyenda de la figura indica la dosis de inmunógeno; SJL-2 son
25 ratones inmunizados con la dosis de 150 µg por ratón, SJL-3 son ratones inmunizados con la dosis de 300 µg por ratón.
Figura 6. Los principios de análisis de fluorescencia y enzimáticos de la actividad proteolítica.
Figura 7. Determinación de la actividad proteolítica de la preparación de anticuerpos aislados a partir de suero de ratones SJL inmunizados con la proteína de fusión gp120I-IIImbp. SJL-1 son los ratones de control. SJL-2 son los ratones inmunizados con la dosis de 150 µg por ratón. SJL-3 son los ratones inmunizados con la dosis de 300 µg por ratón. BSA-FITC y gp120-FITC se utilizaron como sustratos.
Figura 8. Inhibición de la actividad proteolítica de la preparación de anticuerpos aislados a partir de suero de ratones SJL inmunizados con la proteína de fusión gp120I-IIImbp. SJL-1 son los ratones de control.
SJL-2 son los ratones inmunizados con la dosis de 150 µg por ratón.
AEBSF: fluoruro de aminoetanobencenosulfonilo.
CMC: fenilalanilclorometilcetona.
Figura 9. Inhibición de anticuerpos antiespecie de la actividad proteolítica de la preparación de anticuerpos aislados a partir de suero de ratones SJL inmunizados con gp120I-IIImbp. SJL-1 son los ratones de control. SJL-2 son los ratones inmunizados con la dosis de 150 µg por ratón.
Anti-IgG: anticuerpos policlonales de conejo contra IgG de múrido.
Figura 10. Determinación enzimática de la actividad proteolítica de preparaciones de anticuerpos aislados a partir de sueros de ratones SJL inmunizados con las proteínas de fusión gp120I-IIImbp a diferentes dosis. A: SJL-1 son los ratones de control; SJL-2 son los ratones inmunizados con la dosis de 150 µg por ratón; SJL-3 son los ratones inmunizados con la dosis de 300 µg por ratón; CBA son ratones de control CBA.
Figura 11. Los cambios en el nivel de expresión de marcadores de superficie de las células T del sistema inmune de los ratones SJL inmunizados con la proteína de fusión gp120I-IIImbp a diferentes dosis, con la proteína recombinante gp120I-III, y con el péptido encefalitogénico MBP89-104. SJL-1 son los ratones no inmunizados. SJL-2 son los ratones inmunizados con gp120I-IIImbp con la dosis de 150 µg por ratón. SJL-3: ratones inmunizados con gp120I-IIImbp con la dosis de 300 µg por ratón. SJL-4 son ratones inmunizados con el péptido MBP89-104. SJL-5 son los ratones inmunizados con la proteína recombinante gp120I-III con la dosis de 300 µg por ratón.
Figura 12. Inmunoensayo enzimático de los sueros de ratones SJL, MRL-lpr/lpr y NZB/NZW F1 inmunizados con peptidilfosfonato. El antígeno utilizado fue: A - péptido reactivo biotinilado; B - difenilvalilfosfonato biotinilado; C metil p-nitrofenil biotinilfenilmetilfosfonato.
Figura 13. Electroforetograma (A) e inmunotransferencia (B) de anticuerpos policlonales aislados de los ratones inmunizados de cepas de ratones SJL (4), MRL-lpr/lpr (5) y NZB/NZW F1 (6) y modificados covalentemente con un antígeno. Carriles 1 - 3: 10 µg de BSA, 1 µg de tripsina, y 1 µg de IgG de ratones BALB/c.
La presente invención se ilustra mediante los siguientes Ejemplos:
Ejemplo 1. Desarrollo de un constructo genético que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión gp120I-IIImbp para su expresión en un sistema procariota.
1) Para inducir la encefalomielitis autoinmune (EAE) en ratones SJL, se escogió el péptido 89 - 104 de la proteína básica de mielina (MBP), teniendo el péptido la siguiente composición: VVHFFKNIVTPRTPPPS [Sakai, K., Zamvil,
S. S., Mitchell, D. J., Lim, M. Rothbard, J. B., y Steinman, L. 1988. Characterization of a major encephalitogenic T cell epitope in SJL/J mice with synthetic oligopeptides of myelin basic protein. J. Neuroimmunol. 19:21-32, II Tan, L. J., Kennedy, M. K., y Miller, S. D. 1992. Regulation of the effector stages of experimental autoimmune encephalomyelitis via neuroantigen-specific tolerance induction. II Fine specificity of effector T cell inhibition. J. Immunol. 148: 2748 - 2755]. La secuencia de ADN correspondiente a dicho péptido se sintetizó por medio de PCR a partir de dos oligonucleótidos que se superponen que contienen adicionalmente un codón de detención y sitios de restricción. Se clonó el fragmento de ADN resultante en el plásmido pET32b utilizando las restrictasas NotI y XhoI. El plásmido resultante es denominado en lo sucesivo pET32mbp. Para la identificación precisa de proteínas recombinantes en todas las etapas de su expresión, aislamiento y purificación, se modificaron por ingeniería genética los constructos pET32bCH y pET32CHmbp para contener una secuencia que codifica para el epítopo inmunodominante de 10 aminoácidos de longitud de la proteína humana p62 c-myc [Evan G. I., Lewis G. K., Ramsay G., Bishop J. M., ll Mol. Cell. Biol.. 1985, V. 5 (12), páginas 3610 - 3616.].
2) Numerosas publicaciones disponibles sobre la estructura, la inmunogenicidad y la actividad funcional de la proteína de superficie gp120 [Hansen, J. E., Lund, O., Nielsen, J. O., Brunak, S., y Hansen, J.-E., S. 1996. Prediction of the secundary structure of HIV-1 gp120. Proteins. 25: 1-11 II Shioda, T., Oka, S., Xin, X., Liu, H., Harukuni, R.,
Kurotani, A., Fukushima, M. Hasan, MK, Shiino, T., Takebe, Y., Iwamoto, A. y Nagai, Y. 1997. In vivo sequence variability of human immunodeficiency virus type 1 envelope gp 120: association of V2 extension with slow disease progression. J. Virol. 71: 4871 - 4881 II Sullivan, N., Sun, Y., Sattentau, Q., Thali, M., Wu, D., Denisova, G., Gershoni, J. Robinson, J., Moore, J ., y Sodroski, J. 1998. CD4-Induced Conformational Changes in the Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120 Glycoprotein: Consequences for Virus Entry and Neutralization. J. Virol. 72: 4694 -4703] permitieron la asignación de las regiones de proteínas que tienen una secuencia relativamente constante y más prometedas con respecto a la inmunización. Para trabajo adicional, se eligió un polipéptido quimérico, que consistía de tres fragmentos de gp120 (designados como I, II y III) que carecen de la primera, segunda y tercera regiones hipervariables. Se utilizó la secuencia del gen HXB2-env como la plantilla inicial para la síntesis de este constructo [Page, K. A., Landau, N. R., y Littman, D. R. 1990. Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J. Virol. 64: 5270 - 5276]. Se obtuvieron los fragmentos I, II y III por PCR utilizando oligonucleótidos sintéticos seguido por el ensamblaje de los fragmentos utilizando el enfoque de "empalme por extensión de solapamiento" (FIG. 1). El producto final I-III de la PCR y los productos intermedios I-II, II-III y III se clonaron en el plásmido BlueScript, con la subsiguiente nueva clonación en los plásmidos pET32b (FIG. 2: No. 8, 9, 10 y 12), pET32mbp (FIG. 2: No. 5), pET32bCH (FIG. 2: No. 6 y 11) y pET32CHmbp (FIG. 2: No. 7) usando las restrictasas respectivas, es decir, NcoI-BamHI para I-III, NcoI-NotI para I-II, EcoRV-BamHI para II-III, y EcoRV\DraI.-BamHI para III. Los productos de estos constructos se utilizaron para analizar la actividad proteolítica de los anticuerpos contra la gp120 que habían sido obtenidos como resultado de la inmunización.
Para la inmunización de ratones SJL, con el fin de obtener anticuerpos proteolíticos contra la glicoproteína gp120 proteolíticas, se modificó por ingeniería genética el constructo final basado en el vector pET28a (FIG. 3: No. 15). El fragmento NcoI-XhoI del constructo 7 se volvió a clonar en pET28a en los sitios de restricción respectivos. Para analizar la respuesta inmune, se obtuvo en forma similar un constructo adicional con base en el vector pET28a (FIG.
3: No. 13) y que comprende el gen de gp120I-III, pero no secuencias que codifican el péptido mbp y el epítopo de cmyc.
La preparación de células electrocompetentes, transformación, tratamiento con restrictasa, ligación, PCR, y electroforesis de ADN se llevaron a cabo de acuerdo con métodos estándar [Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. // Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].
Ejemplo 2. Expresión, aislamiento y purificación de la proteína de fusión gp120I-III-mbp.
La proteína de fusión se expresó en células de E. coli lisogenizadas con T7 (se utilizó la cepa BL21 (DE3) en el presente ejemplo). La proteína se expresó de la siguiente manera:
- 1.
- Las células competentes se transforman con 0,1 µg de plásmido de acuerdo con el punto 3 del Ejemplo 1 por medio de electroporación y se siembran en una placa de Petri que contiene 30 µg / ml de kanamicina y 2% de glucosa. Las colonias bacterianas se desarrollan durante 12 - 14 horas a 30 ºC.
- 2.
- Las colonias se suspenden completamente en 11 medios bacterianos 2xYT que contienen 30 mg / ml de kanamicina y 0,1% de glucosa.
- 3.
- El cultivo de células se desarrolla a 30ºC bajo aireación adecuada hasta una densidad de 0,6 - 1 OU pero no más de tres horas; a continuación, se añade IPTG hasta alcanzar 1 mM y se lleva a cabo la inducción durante 3 horas a 30 ºC.
Aislamiento y purificación de proteínas de fusión
Se aisló la proteína de fusión gp120I-III-mbp bajo condiciones desnaturalizantes de la siguiente manera:
- 1.
- El cultivo celular se centrifuga a temperatura ambiente durante 10 min a 5000 rpm; se suspende el sedimento en 1/50 del volumen inicial en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; se añaden lisozima y Triton-X100 hasta alcanzar 0,1 mg / ml y 0,1%, respectivamente; y se incuba la mezcla durante 30 min a 30 ºC.
- 2.
- Se enfría el lisado a 0 ºC, se lo somete a sonicación hasta la desaparición de la viscosidad, y se centrifuga durante 40 min a 20.000 rpm.
- 3.
- Se suspende cuidadosamente el sedimento en 1/200 del volumen inicial en un amortiguador que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA-Na 1 mM, y 1% de Nonidet P-40, se centrifuga durante 40 min a 20.000 rpm, se resuspende en amortiguador cromatográfico A y se centrifuga bajo las mismas condiciones.
- 4.
- Se suspende el sedimento en amortiguador cromatográfico A (NaH2PO4 - Na2HPO4 50 mM, NaCl 300 mM, y urea
6 M, pH 8,0), se incuba sobre hielo durante 1 h, y se centrifuga durante 10 min a 20.000 rpm.
- 5.
- Se aplica el sobrenadante a una columna quelante de metal equilibrada con amortiguador A a razón de 10 volúmenes de columna por hora, y se lava la columna con amortiguador B (NaH2PO4 - Na2HPO4 50 mM, NaCl 300 mM, y urea 6 M, pH 7,0) a razón de 30 volúmenes de columna por hora hasta la descontinuación de la migración de la línea base.
- 6.
- La elución se lleva a cabo con amortiguador B (NaH2PO4 - Na2HPO4 50 mM, MES - NaOH 20 mM, NaCl 300 mM, y urea 6 M, pH 5,0) a razón de 30 volúmenes de columna por hora, después de lo cual se equilibra la columna con amortiguador A por segunda vez, y se inmovilizan los iones metálicos y se remueven las proteínas retenidas con amortiguador A que contiene EDTA 100 mM, pH 8,0.
- 7.
- Se analizan las fracciones de eluato por electroforesis en gel y se combinan, y se precipitan las proteínas por diálisis contra agua desionizada a temperatura ambiente.
- 8.
- El precipitado de proteína se separa por centrifugación a 4.000 rpm durante 10 min, se lava con etanol al 70%, se suspende en un volumen mínimo de etanol al 70%, se somete a sonicación hasta que termina la sedimentación de partículas, y se almacena en forma de suspensión a +4 ºC en tubos de polipropileno estériles.
Análisis de la proteína de fusión
Para confirmar la identidad y la pureza de las preparaciones resultantes de la proteína de fusión gp120I-IIImbp, se determinaron las siguientes características de la proteína:
- 1.
- Se determinó la pureza electroforética de la proteína por el Método 1 y se encontró que era del 97%.
- 2.
- Se determinó la inmunorreactividad con anticuerpos contra el epítopo c-myc por el Método 2, y se encontró que la proteína era inmunorreactiva.
- 3.
- Se determinó el peso molecular (Da) por espectrometría de masas mediante el Método 3 y se encontró que era de 42307 Da, estando el valor calculado de 42.075 dentro del error tolerado de ± 2,5%.
- 4.
- Se determinó la absorción específica de la proteína (%) por el absorbente de quelato metálico mediante el Método 4 y se encontró que era > 95%.
Métodos de análisis:
1. Densitometría del electroforegrama.
La electroforesis desnaturalizante de proteínas se llevó a cabo de acuerdo con Laemmli usando solución de urea 6 M en los geles de concentración y fraccionamiento. Se llevó a cabo la coloración del gel con Azul de Coomassie R250 mediante la mejora del contraste con una sal de cobre. Se llevó a cabo la densitometría con un densitómetro o un escáner de placa asistido por ordenador, con la posterior digitalización y análisis del electroforegrama (FIG. 4A).
1. Se prepara un gel de dos componentes con la siguiente composición:
Gel superior: 6,66% de acrilamida / bis-acrilamida en una relación de 29/1, dodecil sulfato de sodio al 0,1%, Tris-HCl, 0,125 M y urea 6 M, pH 6,8.
Gel inferior: 10% de acrilamida / bis-acrilamida en una relación de 29/1, dodecil sulfato de sodio al 0,1%, Tris-HCl 0,375 M, y urea 6 M, pH 8,9.
- 2.
- Las muestras de proteína se mezclan con amortiguador de la muestra que contiene 5% de 2-mercaptoetanol, se calienta durante 5 min a 100ºC y se aplica a los geles. La electroforesis se lleva a cabo a 25 mA hasta que se eluye el colorante indicador.
- 3.
- Se separa e incuba el gel de fraccionamiento durante 5 min en una mezcla caliente de etanol al 10% y ácido acético al 10%.
- 4.
- La coloración se lleva a cabo por incubación de gel durante 10 minutos en una mezcla caliente de la siguiente composición: 15% de etanol, 25% de ácido acético, 0,3 g / l de azul de Coomassie R-250, y 0,45 g / l de sulfato de cobre hexahidratado.
- 5.
- Después de la coloración, se somete el gel a múltiples lavados, como se describe en el punto 3, hasta decoloración completa.
- 6.
- El gel se somete a densitometría de acuerdo con las especificaciones del densitómetro. Tras la digitalización del electroforegrama con un escáner de la placa asistido por ordenador, se utiliza el canal verde de imagen de color o se usa el filtro de la luz verde del escáner. Se analiza la imagen del electroforegrama utilizando el software Scion Image por el método Surface Plot. La pureza de la preparación se define como la relación entre el pico principal con respecto a la suma de todos los picos detectados.
2. Inmunotransferencia.
Se lleva a cabo la inmunotransferencia de acuerdo con el régimen estándar utilizando una solución de bloqueo de BSA. El amortiguador de hibridación se complementa con albúmina de suero bovino (fracción V) hasta alcanzar el 0,5% (FIG. 4C).
- 1.
- La electroforesis se lleva a cabo de acuerdo con el Método 2 utilizando un marcador de coloración previa.
- 2.
- El gel de fraccionamiento se separa, después de lo cual se realiza el procedimiento de transferencia a una membrana HybondN+ (Amersham) utilizando un aparato LKB para electrotransferencia semiseca de acuerdo con las especificaciones del fabricante durante 40 minutos a 0,8 mA / cm2.
- 3.
- Se bloquea la membrana durante 1 h con la solución de Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM y 5% de albúmina de suero bovino (fracción V).
- 4.
- La membrana se lava tres veces durante 5 min con una solución de desbloqueo que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM y 0,05% de Tween-20. A continuación, se lleva a cabo la hibridación con el anticuerpo monoclonal 1-9E10.2 durante 1 h en la solución de Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM y 0,5% de albúmina de suero bovino.
- 5.
- Se realiza el desbloqueo (lavado) de acuerdo con el punto 4, y se hibrida la membrana con anticuerpos secundarios IgG antirratón específicos de Fc de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma Immunochemicals) en las mismas condiciones que las descritas en el punto 4.
- 6.
- Se desbloquea la membrana como se describe en el punto 4 y se tiñe con la solución de Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), 3 mg / ml de 1-cloro-4-naftol y H2O2 al 0,003% durante 30 min.
Todos los análisis se realizan utilizando títulos de anticuerpos primarios y secundarios de 1:10000 y 1:4000, respectivamente, tal como se determina con un antígeno caracterizado, y se aplica una proteína de ensayo para electroforesis con una dosis de 0,1 µg. La presencia de un posible inmunorreactividad de la proteína de ensayo se determina visualmente por medio de los siguientes criterios: el desarrollo de una única zona de coloración inconfundible bien perfilada cuya movilidad electroforética corresponde a aquella de la proteína de ensayo. Cuando se cumplen estos criterios, se lleva a cabo el análisis instrumental.
Para el análisis semicuantitativo final, se lleva a cabo la evaluación densitométrica de la intensidad de la zona de tinción por el método Surface Plot usando el software Scion Image. Los resultados del ensayo se consideran positivos cuando la altura media del pico es 5 veces mayor que el rango de las fluctuaciones de línea de base sobre la densitograma.
3. Espectrometría de masas MALDI.
Las muestras se preparan para el análisis de la siguiente manera.
- 1.
- Una parte alícuota de la suspensión de proteína de un volumen mínimo se evapora hasta sequedad en una centrífuga de vacío.
- 2.
- El residuo se disuelve en 1 - 5 µl de la mezcla de ácido trifluoroacético acuoso al 1% y acetonitrilo al 30%, se aplica a la placa base utilizando ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) como matriz, y se analiza.
- 3.
- Un espectrómetro de masas con MALDI TOF, similar en desempeño al aparato VISION 2000, se calibra previamente para los estándares de referencia de proteínas (tripsina y angiotensina), y se leen los espectros de masas de proteína usando calibración interna. Las masas de los iones moleculares se determinan utilizando el software del analizador de masas de VISION 2000 teniendo en cuenta las calibraciones realizadas.
4. Adsorción específica.
Para confirmar las propiedades funcionales de una preparación de proteína, se analiza cualitativamente la adsorción de la solución por medio del exceso de absorbente de quelato metálico. Las proteínas analizadas que tienen la secuencia 6xHis serán inmovilizadas por el adsorbente de quelato metálico a pH 8,0.
- 1.
- Se equilibra el volumen requerido del absorbente de quelato metálico Talon (Clontech Laboratories Inc.) con una solución amortiguadora (Na2HPO4 - NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, Triton X-100 al 0,1%) y se transfieren a tubos de ensayo porciones e 20 µl de la suspensión 1 : 1.
- 2.
- Se añaden 10 µg de solución de la proteína del ensayo, y se ajusta el volumen a 100 µl con amortiguador de acuerdo con el punto 1. Los tubos de ensayo se incuban con agitación durante 15 min y se dejaron reposar, después de lo cual se toman alícuotas de 10 µl para el análisis.
- 3.
- Se considera que la adsorción es completa si la concentración de proteína medida en la muestra de ensayo no excede de 0.005 µg / ml (es decir, no es significativamente diferente del control cuando la concentración de proteína se determina por medio del ensayo de BSA), que corresponde al nivel de absorción del 95%.
Ejemplo 3. Inmunización de ratones SJL autoinmunes con la proteína de fusión gp120I-IIImbp.
Se inmunizan ratones SJL con la proteína de fusión gp120 I-III-mbp de la siguiente forma.
- 1.
- Se inmunizaron cinco ratones SJL hembra de 6 - 8 semanas de edad dos veces en un intervalo de una semana con el antígeno en adyuvante completo de Freund que tiene la concentración final de M. tuberculosis de 2 mg / ml y las concentraciones de antígeno de 1,5 mg / ml y 3 mg / ml.
- 2.
- Se aplicaron inyecciones de un volumen total de 0,1 ml de la preparación por vía subcutánea en tres sitios a lo largo de la parte posterior en el caso de la primera inmunización, y en las patas, en el caso de la segunda inmunización.
- 3.
- Para comprometer la barrera hematoencefálica, un día antes de la primera inmunización y dos días después de la misma, se inyectan adicionalmente los ratones en forma intraperitoneal con 400 ng de preparación de la toxina pertussis.
- 4.
- Diecisiete días después de la primera inmunización, los ratones reciben una inyección peritoneal de refuerzo del antígeno en PBS en un volumen total que asciende a 0,2 ml, siendo la dosis de la proteína inmunogénica de 50 µg por ratón.
- 5.
- Al mismo tiempo con el procedimiento de refuerzo, se toma sangre del seno orbital de los ratones experimentales y de control (no inmunizados) para controlar el desarrollo de la respuesta inmune. La presencia de anticuerpos específicos en el suero se determina mediante un inmunoensayo enzimático.
- 6.
- Veintiún días después del comienzo del experimento, se utilizan los ratones que muestran la respuesta máxima específica al antígeno en ensayos inmunoquímicos para esplenectomía y toma de muestras de sangre. Los bazos se utilizan para fusión celular con el fin de obtener clones de hibridoma y para el aislamiento de ARNm para la clonación subsiguiente como bibliotecas de presentación en fagos.
Para confirmar la aparición de anticuerpos proteolíticos específicos del antígeno en el curso de la inmunización realizada contra el trasfondo de la patología autoinmune inducida manifestada como encefalomielitis autoinmune experimental preclínica, se llevan a cabo los siguientes ensayos:
Análisis de la especificidad del antígeno y la actividad proteolítica de las preparaciones obtenidas de anticuerpos policlonales
1. Análisis de la especificidad antigénica de las preparaciones obtenidas de anticuerpos.
Para el control comparativo inicial de la respuesta inmune específica al antígeno en varios ratones inmunizados, se utiliza un inmunoensayo enzimático (EIA) (FIG. 5).
Se inmoviliza un antígeno sobre una placa inmunológica y, después de la incubación con sueros obtenidos de ratones inmunizados y de control, se detecta el complejo antígeno - anticuerpo con anticuerpos IgG antirratón de conejo específicos de Fc conjugados con peroxidasa de rábano picante. Los sueros de los ratones inmunizados y de
control se utilizan en varias diluciones (1:12 y 1:48). Las siguientes proteínas recombinantes se utilizan como antígenos:
1) trx-gp120 I-III-CH, una proteína de fusión que comprende tiorredoxina A de E. coli, una secuencia de gp120 que carece de la primera, segunda y tercera regiones variables, y la secuencia de His6-c-myc;
2) trx-gp120 I-II-H, una proteína de fusión que comprende tiorredoxina A de E. coli, las secuencias de la primera y segunda regiones constantes de la gp120, y la secuencia de His6;
3) trx-gp120 II-III-H, una proteína de fusión que comprende tiorredoxina A de E. coli, la secuencia de las segundas regiones constantes de gp120, con el terminal C de la secuencia a partir de la tercera región constante, y la secuencia de His6;
4) trx-gp120 III-H, una proteína de fusión que comprende tiorredoxina A de E. coli, el terminal C de la secuencia de gp120 a partir de la tercera región constante, y la secuencia de His6; y
5) trx-CH, una proteína de fusión que comprende tiorredoxina A de E. coli y la secuencia de His6, que se utilizó como el control negativo para determinar el enlazamiento no específico de los anticuerpos obtenidos a estas secuencias de proteínas.
Como resultado de los experimentos realizados (FIG. 5), se ha demostrado que todas las preparaciones de anticuerpos obtenidos a partir del suero de los ratones inmunizados con una proteína de fusión que interactúan con el antígeno.
2) Análisis de la actividad proteolítica de las preparaciones obtenidas de anticuerpos policlonales.
Para determinar la actividad proteolítica, los anticuerpos son, en primer lugar, purificados por cromatografía de afinidad usando proteína G recombinante inmovilizada sobre Sefarosa. La actividad se detecta por dos métodos diferentes (FIG. 6).
A. Ensayo de fluorescencia. El principio del método, que se expone en la FIG. 6A, se basa en el fenómeno de la extinción de la fluorescencia por una proteína fuertemente marcada con un fluoróforo, fenómeno que se describe en la literatura y se basa principalmente en las interacciones mutuas de los anillos aromáticos de diferentes moléculas de fluoróforo (por ejemplo, debido a los intensos contactos hidrófobo y de apilamiento), y en el aumento de la fluorescencia por la introducción de rompimientos en la cadena del polipéptido. En el presente ensayo, se utilizaron albúmina de suero bovino y la proteína recombinante trx-gp120 I-III-CH excesivamente marcada con isotiocianato de fluoresceína (designada en lo sucesivo como BSA-FITC y gp120-FITC) como los sustratos para la proteólisis. La reacción se controló por el aumento en la fluorescencia frente al control. Se utilizó tripsina desprovista de la actividad contaminante de la quimotripsina como el modelo de proteasa para determinar la sensibilidad del método y para evaluar los cambios temporales de señal en función de las cantidades de sustrato y de enzima.
Para determinar la actividad proteolítica de las preparaciones analizadas de anticuerpos, se llevan a cabo mediciones por triplicado en la línea base y después de incubación a 37 ºC durante 24 h y 48 h. Los resultados de estos experimentos sugieren lo siguiente (FIGS. 7 - 9):
- •
- En primer lugar, la actividad proteolítica de preparaciones obtenidas a partir de ratones inmunizados con la proteína gp120 I-III-mbp se incrementa en comparación con los ratones SJL de control cuando se utilizan ambos sustratos.
- •
- En segundo lugar, el aumento en la actividad proteolítica específica del antígeno es predominantemente responsable del aumento total. Con gp120-FITC, se incrementó la señal de diez a veinte veces en comparación con los ratones no inmunizados, mientras que con BSA-FITC, la señal sólo se incrementó dos veces.
- •
- En tercer lugar, el mecanismo predominante es, en este caso, la catálisis que depende de la serina, debido a que la adición de inhibidores irreversibles reactivos con la serina resultó en una reducción significativa en la tasa observada de hidrólisis de BSA-FITC.
- •
- En cuarto lugar, las moléculas de IgG, que se remueven de forma selectiva de la reacción mediante inmunoprecipitación, son responsables por, al menos, una parte importante de la actividad proteolítica observada.
Junto con indiscutibles ventajas, tales como una alta sensibilidad y la simplicidad y la rapidez de las mediciones,
este método, por desgracia, tiene algunos inconvenientes, el principal de los cuales es la compleja relación no lineal entre los cambios de fluorescencia y el sustrato y las cantidades de enzima, el volumen de la muestra, la composición del amortiguador y el pH, etc., lo que resulta en dificultades en la evaluación cuantitativa y la caracterización de la actividad enzimática de las preparaciones de anticuerpos policlonales. Además de eso, la determinación de la actividad proteolítica por medio de este ensayo requiere de un gran exceso de sustrato vs. enzima, debido a que la cantidad real de abzimas en el conjunto total de anticuerpos puede hacer algunos porcentajes o menos.
Con respecto a lo anterior, se usó como alternativa otro método para la determinación de la actividad proteolítica de las preparaciones de anticuerpos obtenidos.
B. Ensayo enzimático.
El principio de este método de detección de la actividad proteolítica, que se describe en la figura. 6B, se basa en el uso de pequeñas cantidades (aproximadamente 1 ng por reacción) de una enzima ribonucleasa A altamente activa como el sustrato de la reacción de proteólisis. El nivel de actividad de la ribonucleasa, que depende linealmente de la concentración de ARNasa A activa, se determina por medio del método del residuo soluble en ácido usando ácido policitidílico como el sustrato polimérico de la reacción. Este método de detección de la actividad proteolítica presumiblemente permite el logro de un exceso molar significativo de enzima vs. el sustrato y por lo tanto hace las condiciones de la reacción de proteólisis en estudio más próximas a las del modelo de cinética no estacionaria bien estudiado ([S]0 << [E]).
Para eliminar posibles artefactos, se analizaron todas las preparaciones de anticuerpos bajo estudio para determinar la actividad intrínseca de la ribonucleasa y la presencia de componentes de la solución que alteran en forma no enzimática la actividad de la ribonucleasa añadida. Todas las preparaciones de anticuerpos bajo estudio estaban desprovistas de la actividad intrínseca de ribonucleasa y no alteraron la actividad adicional de la ribonucleasa después de un corto período de incubación (10 min) de la reacción.
La actividad proteolítica de las preparaciones de anticuerpos analizadas se midió bajo las siguientes condiciones: concentración de IgG 0,1 mg / ml, tiempo de incubación 17 h, temperatura 37 ºC. La actividad de la preparación medida por este método se expresó como la velocidad de hidrólisis de la ribonucleasa.
Los resultados del ensayo presentados en la FIG. 10 muestran que la actividad proteolítica disminuyó 1,5 - 2 veces tras la inmunización de los ratones con gp120-I-III-MBP. Estos resultados están en una correspondencia limitada con los resultados del ensayo de fluorescencia: sólo se reproduce la correlación negativa entre la actividad proteolítica y la dosis de inmunógeno utilizada para la inmunización. La discrepancia entre los resultados del análisis fluorescente y enzimático podría explicarse por las diferencias entre las estructuras de los sustratos de la proteólisis. Presumiblemente, un glóbulo de ARNasa A en comparación con un glóbulo de BSA tiene un menor número de sitios disponibles para las proteasas y las abzimas. Dado que, tras la inmunización, la concentración total en suero de IgG se incrementa varias veces por anticuerpos específicos del antígeno, la proporción de los anticuerpos proteolíticos iniciales disminuye, mientras que los anticuerpos proteolíticos específicos del antígeno recientemente formados son, más probablemente, catalizadores ineficientes de escisión proteolítica de ARNasa A.
3. Seguimiento del desarrollo de la respuesta inmune e inducción experimental de encefalomielitis autoinmune.
Para caracterizar las características de desarrollo de la respuesta inmune tras la inmunización con una proteína de fusión que comprende el neuroantígeno MBP, se llevó a cabo un análisis comparativo de la expresión de los marcadores de superficie específicos en linfocitos T de ratones SJL que no fueron inmunizados (control), a partir de ratones inmunizados con el péptido sintético MBP89-104, proteína recombinante de fusión gp120I-IIImbp a dos dosis diferentes y proteína recombinante gp120I-III (Figura 11). Todas las inmunizaciones se realizaron en paralelo bajo condiciones idénticas como se describió anteriormente. Veintiún días después del inicio de un experimento, se analizaron linfocitos T CD4+ aislados a partir de dos ratones de cada grupo por citometría de flujo. Una característica específica de los ratones SJL fueron recuentos inicialmente bajos de células T CD8+. Además, se han estudiado los cambios en la expresión de los siguientes marcadores de superficie importantes para el desarrollo de la respuesta inmune: CD11a, CD44, CD45RB, y CD62-L. Los resultados presentados en la FIG. 11 sugieren que en el caso de la inmunización con el péptido MBP y, también, con las proteínas de fusión que contienen este antígeno, se indujo una respuesta inmune de células T plenamente desarrolladas (parecidas a células de memoria) en ratones el día 21 después de la inmunización, mientras que en caso del uso únicamente de gp120I-III como el antígeno, se continuó desarrollando la respuesta inmune. Los datos obtenidos proporcionan una evidencia del mejoramiento del desarrollo de la respuesta inmune cuando se utiliza el autoantígeno MBP y de la activación de los linfocitos T típicos del desarrollo de encefalomielitis autoinmune experimental.
Por lo tanto, el Ejemplo anterior muestra que, tras la inmunización de ratones SJL con la proteína de fusión gp120I-IIImbp, se generan anticuerpos proteolíticos específicos del antígeno contra el fondo de la fase preclínica de la
encefalomielitis autoinmune experimental inducida.
Ejemplo 4. Síntesis del derivado reactivo de fosfonato del fragmento de péptido de gp120.
En la primera etapa, se sintetizan aminoalquilfosfonatos protegidos en su grupo amino libre en la reacción de cocondensación de trifenilfosfito, isobutanal y bencilcarbamato. Para este fin, se agita la mezcla de trifenilfosfito, isobutanal, y bencilcarbamato, 0,1 moles de cada uno, en 15 ml de ácido acético glacial durante aproximadamente 1 h hasta que se interrumpe la generación de calor. Después de eso, se agita la reacción con calentamiento a 80 ºC durante 1 h. Después de la realización completa de la reacción, se removieron los productos volátiles con un evaporador rotatorio a presión reducida y calentamiento en un baño de agua. El residuo oleoso se disuelve en metanol (180 ml) y se deja cristalizar a -20 ºC durante 3 h. Después de la cristalización, se recoge el residuo de difenil 1 - (N-benciloxicarbonil)-aminoalquilfosfonato por filtración y se recristaliza en un volumen mínimo de cloroformo (30 - 40 ml) seguido por la adición de cuatro volúmenes de metanol.
Para obtener aminoalquilfosfonato libre, se remueve el grupo protector por tratamiento del difenil 1-(N-bencilcarbonil) -aminoalquilfosfonato con una solución al 33% de bromuro de hidrógeno en ácido acético (15 ml por 0,1 moles) durante 1 h a temperatura ambiente. Se remueven los componentes volátiles con un evaporador rotatorio a presión reducida y calentamiento en un baño de agua. Se cristaliza el bromhidrato de 1 - (N-benciloxicarbonil)aminoalquilfosfonato a partir del residuo resultante por adición de éter dietílico anhidro. Se obtiene fosfonato libre al pasar amonio gaseoso seco a través de una suspensión de bromhidrato de fosfonato en éter dietílico hasta que se descontinúa la formación de un precipitado espeso de bromuro de amonio y se observa la floración completa de la suspensión. Se remueve el bromuro de amonio resultante por filtración, y se evapora el éter dietílico en un baño de agua a presión atmosférica.
Para obtener el compuesto Leu-Ala-Glu-Glu-Glu-Val-P (OPh)2 (LAEEEV-P (OPh)2), donde P (OPh)2 significa la sustitución del grupo carboxílico a con difenilfosfonato, se sintetiza primero el péptido Boc-Val-Ala-(t-Bu) Glu-(t-Bu) Glu-(t-Bu) Glu protegido en su grupo amino terminal N y los grupos secundarios. El péptido Boc-Val-Ala-(t-Bu) Glu-(t-Bu) Glu-(t-Bu) Glu se fusiona con el derivado fosfonato de valina mediante la mezcla de 2 µmoles del péptido protegido, 2 µmoles del fosfonato, y 2 µmoles de diciclohexilcarbodiimida en 300 µl de acetonitrilo y se incuba durante 1 h. Después de la finalización de la reacción, se separaron sus productos por HPLC en fase inversa en una columna NovaPak C18 de 150 x 3,9 mm de Waters usando un gradiente de 0% a 80% de acetonitrilo en fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0). Las fracciones resultantes se analizan por espectrometría de masas (MALDI-TOF). Las fracciones que contienen sustancias con masas de iones moleculares de 1145 Da ([M + H]+), 1167 Da ([M + Na]+) o 1183 Da ([M + K]+) se combinan y se liofilizan. El residuo se disuelve en 100 µl de ácido trifluoroacético al 100% y se incuba durante 1 h a temperatura ambiente para remover los grupos de protección tert-butilo y tert-butiloxicarbonilo. Se precipita el peptidilfosfonato desbloqueado por medio de la adición de 10 volúmenes de éter dietílico anhidro a la reacción. Se separa el precipitado mediante centrifugación durante 10 min a 12.500 rpm, y se repite el procedimiento de desbloqueo. Se seca el residuo al aire y se almacena a -20ºC.
Análisis del peptidilfosfonato LAEEEV-P (OPh)2
I. Espectrometría de masas por MALDI TOF.
- 1.
- Se aplica una cantidad mínima de peptidilfosfonato seco, al cual se le añaden 5 µl de acetonitrilo, a una placa base utilizando ácido fuerte acuoso libre de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) como la matriz, y se lleva a cabo el análisis.
- 2.
- Se calibra previamente un espectrómetro de masas con MALDI TOF equivalente al aparato VISION 2000 con estándares de referencia dentro del rango de m/z de 500 - 2000 Da, y se obtienen los espectros de masas de las muestras de ensayo utilizando calibración interna. Se determinan las masas de iones moleculares utilizando el software de analizador de masas del VISION 2000 tenido en cuenta la calibración. El resultado esperado del análisis es la presencia de picos correspondientes a masas de 877.36, 900.34 y 915.45 ± 1 Da.
II. HPLC analítica de fase inversa.
- 1.
- A una muestra de 0,2 mg de peptidilfosfonato, se le añade 100 µl de amortiguador de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0) que contiene acetonitrilo al 20%.
- 2.
- Se administra la muestra resultante en un inyector, y se lleva a cabo la elución por gradiente utilizando una columna NovaPak C18 de 150 x 3,9 mm de Waters para HPLC en fase reversa bajo las siguientes condiciones:
• el amortiguador A es acetonitrilo al 20% y fosfato de potasio 20 mM, pH 7,0;
- •
- el amortiguador B es acetonitrilo al 80% y fosfato de potasio 20 mM, pH 7,0;
- •
- la velocidad de elución es de 1,0 ml / min con un gradiente lineal de 100% de A hasta un gradiente de 100% de B durante 20 min seguido por 100% de B durante 10 min; y
- •
- se registran los cromatogramas a una longitud de onda de 260 nm.
3. Los picos se integran sin corrección para la línea base. Se determina el tiempo de retención del pico principal, que tiene el área máxima, y se calcula la relación entre el área del pico principal con respecto a la suma de todas las áreas de los picos. El resultado esperado: el tiempo de retención es de 14,75 - 15,25 min; la pureza cromatográfica es > 95%.
III. Inhibición de la actividad esterolítica de la quimotripsina.
- 1.
- Se prepara una solución de 0,5 ml 1 µM de a-quimotripsina en un amortiguador que contiene HEPES 0,1 M y NaCl 0,5 M, pH 7,2. La solución se divide en nueve alícuotas de 50 µl, y se descarta el residuo.
- 2.
- Se preparan ocho diluciones del peptidilfosfonato del ensayo en acetonitrilo en un intervalo de 1000 µl a 1 µl.
- 3.
- A cada una de las primeras ocho alícuotas de la solución de enzima se les añade 5 µl de la solución correspondiente de peptidilfosfonato, y se añaden 5 µl de acetonitrilo a la novena parte alícuota.
- 4.
- Las muestras se incuban durante 1 h a 25 ± 5 ºC.
- 5.
- Las muestras se transfieren sucesivamente a una celda de espectrofotómetro que contiene 450 µl de agua desionizada, se mezcla, después de lo cual se añaden 10 µl de solución de acetato de p-nitrofenilo en metanol (2,5 mg / ml), después de lo cual se registra el aumento en la densidad óptica a una longitud de onda de 400 nm. La velocidad inicial de la hidrólisis del sustrato se calcula en unidades arbitrarias.
- 6.
- Se calcula la concentración efectiva de inhibidor. Para este fin, se calculan las relaciones de las velocidades de hidrólisis observadas con muestras 1 - 8 con respecto a la velocidad de hidrólisis observada con la muestra
9. La concentración efectiva de inhibidor se determina como la concentración más baja de la sustancia de ensayo, a la cual la relación de las velocidades de hidrólisis del sustrato no exceda del 50%. El resultado esperado: 30 µM.
Ejemplo 5. Inmunización reactiva de ratones con el derivado de fosfonato de un fragmento de péptido de gp120.
Para inmunización, se conjuga el péptido reactivo es conjugado con el portador macromolecular hemocianina de C. conholepas (hemocianina de lapa californiana, KLH). En la primera etapa, se activa el portador con un exceso de bis (sulfosuccinimidilil)suberato en PBS durante 1 h a 37 ºC. Después de la activación, la KLH no enlazada con bis (sulfosuccinimidilil)suberato se remueve de la reacción por medio de ultrafiltración exhaustiva siete veces (con un volumen residual de no más de 70 µl) utilizando un concentrador Microcon 100 (membrana YC de Amicon), añadiendo cada vez PBS al residuo para hacer 500 µl y descartando el ultrafiltrado. A la solución resultante se le añade una solución de peptidilsulfonato en PBS después de lo cual se incuba la solución durante 1 h a 37 ºC sin agitación. Los grupos succinimida que no reaccionaron se inactivan mediante la adición de 2 µl de 2-etanolamina. Se remueven los componentes de bajo peso molecular de la reacción por medio de ultrafiltración exhaustiva siete veces (con un volumen residual de no más de 70 µl) utilizando un concentrador Microcon 100 (membrana YC de Amicon), añadiendo cada vez PBS al residuo para hacer 500 µl y descartando el ultrafiltrado. Se esteriliza la preparación final por filtración y se almacena a -20ºC.
Se inmunizan en forma intraperitoneal ratones hembra MRL-lpr/lpr, SJL y NZB / NZW F1 de 6 - 8 semanas con el antígeno en adyuvante completo de Freund, siendo el volumen total de 0,2 ml, con una dosis de 50 µg de la proteína inmunogénica por ratón.
La segunda inmunización se realiza con el mismo volumen y a la misma concentración de antígeno en adyuvante incompleto de Freund 17 días después de la primera inmunización. Al mismo tiempo, se extrae sangre del seno orbital de tres ratones de cada grupo experimental y de ratones de control no inmunizados de las tres cepas para controlar el desarrollo de la respuesta inmune.
Veintiún días después del comienzo del experimento, se sacrifican los ratones que mostraron la máxima respuesta específica de antígeno en los ensayos inmunológicos para la esplenectomía. Se analizan los anticuerpos policlonales aislados del suero sanguíneo de estos ratones para la especificidad antigénica y la actividad catalítica.
Una parte del peptidilfofonato sintetizado en las etapas previas se utiliza en la reacción de conjugación con el éster de N-hidroxisuccinimida de biotina. La reacción se lleva a cabo ezclando cantidades equimolares de sulfonato de peptidilo y biotina activada en un volumen mínimo de dimetilformamida e incubación durante 1 h. Las preparaciones biotiniladas están destinadas para el análisis de la especificidad de los anticuerpos obtenidos como resultado de la inmunización reactiva de los ratones.
Para controlar la respuesta inmune específica con el antígeno en diferentes ratones inmunizados de todas las tres cepas, se utiliza inmunoensayo enzimático.
Se aislaron los anticuerpos de los sueros de ratones inmunizados y de control con anticuerpos de cabra absorbidos previamente en placa contra IgG de múrido, con posterior incubación con el antígeno biotinilado y detección de los complejos antígeno-anticuerpo usando neutravidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Los sueros de ratones inmunizados y de control se utilizan en varias diluciones (1:12 y 1:48). Los antígenos empleados son marcados con biotina partiendo de peptidilfosfonato, Val-fosfonato biotinilado, y nitrofenilmetil-pbiotinilfenilmetilfosfonato, para lo cual se demostró primero la modificación covalente específica del centro activo de abzimas. Los análisis comparativos han mostrado (FIG. 12) que los anticuerpos de los ratones experimentales de todas las tres cepas, en conjunto, poseen una alta especificidad hacia el fragmento del péptido modificado de un antígeno, no interactúan bajo las condiciones del presente experimento con Val-fosfonato libre, y exhiben la capacidad de lazarse covalentemente con un agente modificador más activo y menos específico. Cabe señalar que, en promedio, en híbridos de Nueva Zelanda la cantidad de anticuerpos específicos del antígeno fue algo mayor en comparación con las otras dos cepas autoinmunes, mientras que los anticuerpos de ratones MRL-lpr/lpr fueron más efectivos con respecto a covalente modificación.
Junto con un antígeno, se utilizan anticuerpos de conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante contra el fragmento Fc de IgG de múrido para determinar la cantidad total de anticuerpos de múrido absorbidos específicamente en un poso de una placa. Esto permite la estimación de la proporción de anticuerpos específicos del antígeno en el conjunto total de inmunoglobulinas de clase G.
Se llevaron a cabo otros estudios del tipo de interacción de los anticuerpos obtenidos con un péptido reactivo con preparaciones previamente purificadas de IgG utilizando inmunotransferencias. Después de la incubación con peptidilfosfonato biotinilado, fraccionamiento electroforético bajo condiciones reductoras y desnaturalizantes, e inmovilización en membrana, se detectaron los complejos antígeno-anticuerpo utilizando neutravidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Los resultados de este experimento presentado en la FIG. 13 sugieren que tanto las cadenas pesada como liviana de la inmunoglobulina capaces de ser covalentemente modificadas por el péptido estaban presentes en las preparaciones de anticuerpos policlonales aislados de ratones autoinmunes inmunizados con el péptido reactivo Val-Ala-Glu-Glu-Glu-Val-PO (OPh)2.
Por lo tanto, la inmunización reactiva bajo las condiciones del presente ejemplo ha producido los siguientes resultados:
- •
- Los anticuerpos obtenidos en el transcurso de la inmunización se enlazan con antígeno de inmunización.
- •
- Los anticuerpos no reaccionan con el grupo fosfonato "mínimo" de antígeno de inmunización, lo que significa que no existe una interacción específica (o reacción química no específica) entre los anticuerpos bajo de estudio y el grupo fosfonato libre de ValP (OPh)2.
- •
- Los anticuerpos reaccionan con el fosfonato activo "que depende del mecanismo", es decir, muestran la capacidad de reaccionar con una molécula que no tiene una relación estructural aparente con el antígeno de inmunización, pero tiene la capacidad para formar complejos covalentes con hidrolasas.
- •
- Los anticuerpos forman complejos covalentes con antígeno de inmunización.
En combinación, las propiedades anteriores sugieren que en el transcurso de la inmunización con un peptidilfosfonato cuya composición corresponde con LAEEEV-P (OPh)2 se generan anticuerpos catalíticos específicos del epítopo.
Aplicabilidad industrial
La invención puede ser útil en la industria de medicamentos para la fabricación de fármacos.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> "ASGL - Farmatsevticheskie Innovatsii", zakrytoe aktsionernoe obschestvo <120> Método para la producción de anticuerpos catalíticos (variantes), antígenos para inmunización y secuencia de nucleótidos
<140> 2001110759/13 (011749)
<141> 24. 04. 2001
5 <160> 2
<210> 1
<211> 365
<212> PTR
<213> Secuencia Artificial 10 <400> 1
<210> 2
<211> 1149
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<400> 2
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1. Proteína de fusión que tiene la siguiente estructura:
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2001110759 | 2001-04-24 | ||
RU2001110759/13A RU2221873C2 (ru) | 2001-04-24 | 2001-04-24 | Способ получения каталитических антител (варианты), антигены для иммунизации и нуклеотидная последовательность |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2440369T3 true ES2440369T3 (es) | 2014-01-28 |
Family
ID=20248733
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES10183175.8T Expired - Lifetime ES2440369T3 (es) | 2001-04-24 | 2002-04-18 | Método para la producción de anticuerpos catalíticos (variantes), antígenos para inmunización y secuencia de nucleótidos |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040265975A1 (es) |
EP (2) | EP2295082B1 (es) |
JP (1) | JP2004527248A (es) |
AT (1) | ATE503497T1 (es) |
AU (1) | AU2002313135A1 (es) |
DE (1) | DE60239606D1 (es) |
ES (1) | ES2440369T3 (es) |
RU (1) | RU2221873C2 (es) |
WO (1) | WO2002086058A2 (es) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7560529B2 (en) * | 2001-04-24 | 2009-07-14 | FDS Pharma | Method for producing catalytic antibodies (variants), antigens for immunization and nucleotide sequence |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE68918867T2 (de) * | 1988-09-13 | 1995-02-16 | Chiron Corp | Mutanten des hiv-1 Hüllproteins mit fehlenden hypervariabelen domänen. |
US5817629A (en) * | 1991-10-22 | 1998-10-06 | The Governors Of The University Of Alberta | Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients |
US5961973A (en) * | 1992-03-06 | 1999-10-05 | Crea; Roberto | Pathogen-targeted biocatalysts |
CZ239694A3 (en) * | 1992-04-01 | 1995-07-12 | Merck & Co Inc | Recombinant human antibody against hiv, cassette for expression, host cell and a pharmaceutical preparation against hiv |
AU5360796A (en) * | 1995-03-09 | 1996-10-02 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Peptide analogues of human myelin basic protein useful in treating multiple sclerosis |
US6156541A (en) | 1995-07-21 | 2000-12-05 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Compositions and methods for catalyzing hydrolysis of HIV gp120 |
US5948658A (en) | 1996-06-25 | 1999-09-07 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Anti-cocaine catalytic antibody |
US6140091A (en) * | 1997-06-20 | 2000-10-31 | Boston Biomedical Research Institute | Anti-idiotype vaccines to elicit catalytic antibodies |
US6235714B1 (en) * | 1998-03-23 | 2001-05-22 | Sudhir Paul | Methods for identifying inducers and inhibitors of proteolytic antibodies, compositions and their uses |
-
2001
- 2001-04-24 RU RU2001110759/13A patent/RU2221873C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-04-18 WO PCT/RU2002/000177 patent/WO2002086058A2/ru active Application Filing
- 2002-04-18 EP EP10183175.8A patent/EP2295082B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-18 AT AT02739002T patent/ATE503497T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-04-18 US US10/475,706 patent/US20040265975A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-18 EP EP02739002A patent/EP1394261B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-18 JP JP2002583573A patent/JP2004527248A/ja active Pending
- 2002-04-18 ES ES10183175.8T patent/ES2440369T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-18 AU AU2002313135A patent/AU2002313135A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-18 DE DE60239606T patent/DE60239606D1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2002086058A3 (en) | 2003-01-23 |
EP1394261A2 (en) | 2004-03-03 |
RU2221873C2 (ru) | 2004-01-20 |
JP2004527248A (ja) | 2004-09-09 |
AU2002313135A1 (en) | 2002-11-05 |
DE60239606D1 (de) | 2011-05-12 |
US20040265975A1 (en) | 2004-12-30 |
WO2002086058A9 (fr) | 2003-11-27 |
EP1394261B1 (en) | 2011-03-30 |
EP1394261A4 (en) | 2008-04-09 |
ATE503497T1 (de) | 2011-04-15 |
EP2295082B1 (en) | 2013-09-18 |
EP2295082A1 (en) | 2011-03-16 |
WO2002086058A2 (en) | 2002-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Davies et al. | Peptide-specific antibodies as probes of the orientation of the glucose transporter in the human erythrocyte membrane. | |
US6379905B1 (en) | Fragments of prion proteins | |
JP5102205B2 (ja) | 触媒免疫グロブリン | |
ES2225961T3 (es) | Proteina de union a antigeno multivalente y multiespecifica. | |
JP6152090B2 (ja) | 視神経脊髄炎を処置するための組成物および方法 | |
ES2910699T3 (es) | Inmunoglobulinas conjugadas con lisina C-terminal | |
ES2313780T3 (es) | Procedimientos para identificar inductores e inhibidores de anticuerpos proteoliticos, composiciones y sus usos. | |
US20110142847A1 (en) | Methods of Eliciting Broadly Neutralizing Antibodies Targeting HIV-1 GP41 | |
JPS63225398A (ja) | エプスタイン・バーウイルス初期抗原(拡散)に関連する合成ポリペプチドおよび抗体 | |
JPS62500027A (ja) | エプスタイン、バールウィルス核抗原と免疫反応する抗体を産生する化学的に合成されたポリペプチド | |
WO1995031480A1 (en) | Heterodimer polypeptide immunogen carrier composition and method | |
AP211A (en) | Synthetic polypeptides. | |
WO2021226728A1 (es) | Método de gradiente rápido de un solo paso para la generación de nanoanticuerpos | |
US9725503B2 (en) | Peptide-hinge-free flexible antibody-like molecule | |
ES2967613T3 (es) | Inmunoglobulinas conjugadas en Cys80 | |
US7560529B2 (en) | Method for producing catalytic antibodies (variants), antigens for immunization and nucleotide sequence | |
ES2440369T3 (es) | Método para la producción de anticuerpos catalíticos (variantes), antígenos para inmunización y secuencia de nucleótidos | |
EP0293471B1 (en) | Primary biliary cirrhosis autoantigen | |
PT697891E (pt) | Compostos de polioximas e sua preparacao | |
CS131891A3 (en) | Vaccine | |
EP0594879A1 (en) | Cathepsin L-specific monoclonal antibodies, hybridomas for producing the same and a method of using the same | |
CA2118033A1 (en) | Synthetic polypeptides derived from the hiv envelope gylcoprotein | |
BRPI0718698A2 (pt) | Anticorpos de epítopo binário e estimulantes imunes de superantígeno de célula b. | |
Kyte | Immunochemical Probes of Structure | |
Huarte Arrayago et al. | Recognition of Membrane-Bound Fusion-Peptide/MPER Complexes by the HIV-1 Neutralizing 2F5 Antibody: Implications for Anti-2F5 Immunogenicity |