WO2002086058A2 - Method for producing catalytic antibodies (variants), antigens for immunisation and nucleotide sequence - Google Patents

Method for producing catalytic antibodies (variants), antigens for immunisation and nucleotide sequence Download PDF

Info

Publication number
WO2002086058A2
WO2002086058A2 PCT/RU2002/000177 RU0200177W WO02086058A2 WO 2002086058 A2 WO2002086058 A2 WO 2002086058A2 RU 0200177 W RU0200177 W RU 0200177W WO 02086058 A2 WO02086058 A2 WO 02086058A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mice
protein
catalytic
antibodies
immunization
Prior art date
Application number
PCT/RU2002/000177
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2002086058A3 (en
WO2002086058A9 (fr
Inventor
Alexandr Gabibovich Gabibov
Alexandr Vladimirovich Kolesnikov
Natalya Alexandrovna Ponomarenko
Elena Sergeevna Alexandrovna
Ivan Ivanovich Borobiev
Alexandr Viktorovich Demin
Original Assignee
Asgl- Farmatsevticheskie Innovatsii, Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asgl- Farmatsevticheskie Innovatsii, Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo filed Critical Asgl- Farmatsevticheskie Innovatsii, Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo
Priority to AU2002313135A priority Critical patent/AU2002313135A1/en
Priority to DE60239606T priority patent/DE60239606D1/de
Priority to JP2002583573A priority patent/JP2004527248A/ja
Priority to US10/475,706 priority patent/US20040265975A1/en
Priority to EP02739002A priority patent/EP1394261B1/en
Priority to AT02739002T priority patent/ATE503497T1/de
Publication of WO2002086058A2 publication Critical patent/WO2002086058A2/ru
Publication of WO2002086058A3 publication Critical patent/WO2002086058A3/ru
Publication of WO2002086058A9 publication Critical patent/WO2002086058A9/ru
Priority to US11/644,907 priority patent/US7560529B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0002—Antibodies with enzymatic activity, e.g. abzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/10—Animals modified by protein administration, for non-therapeutic purpose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/41—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a Myc-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • a catalytic antibody (United States patent ⁇ ° 5948658) is a specific disintegrating physical substance used in case of accidental obstruction.
  • a method for producing a catalytic antibody with the use of live animals is offered.
  • live animals that are spontaneous and induced by autoimmune pathologies use mouse. By using mice of these lines, for quick immunization with the main protein of myelin or its fragments, it can cause the development of an experimental autoimmune encephaloma.
  • 5 Livestock is introduced by a solid protein, consisting of the main protein myelin or its potential substance and catalytic agent or potential substance.
  • a potential substitute is ⁇ 120 (an advanced glycoprotein ⁇ ICH- ⁇ ) or its fragments.
  • the solid protein used in the process has the following 0 structure:
  • a nucleotide investigation is proposed that provides a solid protein of the indicated structure.
  • a method for producing a catalytic antibody using lively and stimulated ammunition is proposed.
  • ⁇ ⁇ aches ⁇ ve au ⁇ immunny ⁇ zhiv ⁇ ny ⁇ is ⁇ lzuyu ⁇ mice ⁇ Y- ⁇ g / ⁇ g, ⁇ ichem zhiv ⁇ ny ⁇ immunizi ⁇ uyu ⁇ an ⁇ igen ⁇ m, s ⁇ de ⁇ zhaschim ga ⁇ en, ⁇ eds ⁇ avlyayuschy 5 s ⁇ b ⁇ y ⁇ nyuga ⁇ ⁇ valen ⁇ n ⁇ g ⁇ me ⁇ anizm-zavisim ⁇ g ⁇ ingibi ⁇ a ⁇ eaz with ⁇ e ⁇ id ⁇ m - ⁇ agmen ⁇ m ⁇ entsialn ⁇ g ⁇ subs ⁇ a ⁇ a ⁇ a ⁇ ali ⁇ iches ⁇ g ⁇ an ⁇ i ⁇ ela.
  • a catalytic antibody uses ⁇ 120 or its fragments.
  • Hagenten, its isomers and racemates used in the proposed method have the following structure:
  • ⁇ ig. 9 Inhibition of the activity of the preparation of the antibodies isolated from the serum of mice of the 8L line, immunized with the fusion protein 2 ⁇ 120 ⁇ -antivirus. 8L-1 - contact 5 mice; 8L-2 - mice immunized at a dose of 150 mcg / mouse, anti- ⁇ 0 - widespread small-sized antibodies to mouse 0 ⁇ 0.
  • FIG. 12 Immunoassay analysis of the serum of mice of the 8L, ⁇ - ⁇ gL ⁇ rg and ⁇ / ⁇ ⁇ 1 mice immunized with peptides. ⁇ On the antigen scale, the following were used: ⁇ - biotinylated reacted 5 peptide, B - biotinylated biphenyl, phenylbenzene, and ⁇ - methylated biphenylphenylbenzene.
  • ⁇ agmen ⁇ ⁇ s ⁇ - ⁇ of ⁇ ns ⁇ u ⁇ tsii 7 was ⁇ e ⁇ e ⁇ l ⁇ ni ⁇ van in ⁇ 28a ⁇ s ⁇ ve ⁇ s ⁇ vuyuschim ⁇ es ⁇ i ⁇ nym say ⁇ am.
  • Example 2 Expression, isolation and calculation of the fusion protein ⁇ 120 ⁇ - ⁇ -rice stamp ⁇ .
  • the optional cells are transformed with 0.1 ⁇ g plasmids, for example, 5 1, by means of electric method and sow the culture on the cup
  • the center is at a temperature of 10 minutes and the room temperature is at room temperature. at 5000 rpm, the sediment is suspended in 1/50 of the original volume of 50 tons; ° C. 10
  • the power supply of the protein was distributed by methods 1 and 5 of 97%
  • Protein samples are mixed with a sample buffer containing 5% of 2-mercaptan ethanol and heated for 5 minutes. at a temperature of 100 ° C, it is applied to the gel and leads to electrostatic activity with a force of up to 25 tons at the same time as the yield of paint.
  • the product is divided by the way that the volume of the main optic is reduced to the volume of all detected food.
  • Immunoblocking is based on a standard circuit with a blocking “ ⁇ ”.
  • ⁇ Buffer for hybridization additionally introduces bovine serial albumin (Fraction V) up to 0.5% (Fig. 4 ⁇ ). 1. Get rid of method 2 using a prefabricated appliance. 2.
  • the preparation of the samples for analysis is carried out by the following method.
  • the separation of the mass of molecular ions is carried out by means of the ⁇ 2000 ⁇ azz ⁇ 5 ⁇ schreib administratability thereof administratability thereof.
  • mice have to additionally administer the unit with a free charge of 400 ng per day.
  • the vaccine is pooled in the buffer criz ⁇ in the total volume of 0.2 ml from the calculation of 50 ⁇ g of the white mouse.
  • an immunoassay (5) is used (assay).
  • serine-dependent catalysis is a "dominant mechanism", and, in addition, serine-dependent, inadvertent, are observable, there are
  • Measurement of the process activity of the tested products 0 antibodies have the effect of the following conditions: the percentage of 0 ⁇ 0 in the case is 0.1 20 mg / ml, incubation time - 17 hours, temperature - 37 ° ⁇ .
  • the type of activity of the preparation under the conditions of this test was hindered by the degree of hydrolysis of the reaction.
  • mice of the ⁇ ⁇ digital versatile system were the initially low content of ⁇ 8 + gan-cell.
  • a change in the expression of the following carbohydrates was also studied, which plays an important role in the development of the immune response: S ⁇ pa, S ⁇ 44, SB45 ⁇ and S ⁇ 62-S.
  • protected aminogroups of aminealkyl are synthesized in the reaction of condensation 5 of triphenylphosphate, isobutanal and benzyl.
  • condensation 5 of triphenylphosphate, isobutanal and benzyl For this mixture of potassium phenylphosphate, isobutanal and benzyl carbamate for 0.1 ml of each component in 15 ml of icy acid, the product is agitated for 1 hour. They keep mixing the reaction mixture and heating to 80 ° C for 1 hour. After a complete reaction, volatile products are removed to 22 Vaporizer and reduced pressure and heating in a water bath. It is conveniently processed to recover in methane (180 ml) and leave it to crystallize at -20 ° C for 3 hours.
  • Volatile components are removed on a rotary evaporator under reduced pressure and heating in a water bath.
  • Hydro- amide 1- ( ⁇ -benzyloxyxycarbonyl) - aminealkylate is crystallized from the waste water by adding a non-food diethyl ether.
  • Free-flowing gas from a dry gas ammonia through a suspension of a power-supply system for a Ammonium bromide formed is separated by filtering and evaporating diethyl ether in a water bath at atmospheric pressure.
  • Buffer B 80% acetyl, 20m3 of potassium phosphate, ⁇ 7.0;
  • the flow rate is 1.0 ml / min, the gradient of the product is linearly 100% to 100% B for 20 minutes, 100% B for 10 minutes.
  • Samples are taken in a cassette for a spectrometer that contains 450 microliters of disinfected water; 25 The increase in the optical density of the solution at a wavelength of 400 nm is recorded. They calculate the initial rate of hydrolysis of the substrate in commercial units.
  • Example 5 Non-active immunization of mice with a derivative of a specific antigenic fragment ⁇ 120.
  • the reactive antidepressant prescribes a medium that is a hematocyanin C. somnius (LH).
  • LH hematocyanin C. somnius
  • the carrier is activated by processing excess bis (sulfosuccinimidyl) of the subunit in the FBS buffer for 1 hour at 37 ° C.
  • mice of the L- ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , ⁇ , 8 ISA and ⁇ / ⁇ ⁇ ?? structural ⁇ ⁇ ?? structural ⁇ ⁇ mice at the age of 6–8 weeks immunize the antigen in the complete adjuvant of ⁇ at a total of 50 mice. Repeated immunization is given in the same volume and concentration of antigen in the partial adjuvant of the Friend after 17 days after the first. At the same time, we get overcuts from the external sinus in 3 mice from each experimental group, and we also don’t immunize the mice for the study, but we also don’t immunize for mice.
  • mice who received immunodeficiency tests had a maximum antigen-specific response, which was used for Splenitis.
  • Large-scale antibodies whitened from the serial data of mice, are analyzed in tests for antigen-specificity and catalytic activity.
  • the drug is used in the reaction of condensation with ⁇ curriculum Play-hydroxysuccinimide biotin.
  • the reaction is carried out by mixing the equivalent amounts of the drug and the activated biota in the minimum amount of time of 1 hour and inactivation.
  • the immunoassay method is used in several immunized mice of all of these lines.
  • results of the immunization process are associated with the immunization. 0 * ⁇ n ⁇ i ⁇ ela not ⁇ eagi ⁇ uyu ⁇ with "minimaln ⁇ y” ⁇ s ⁇ na ⁇ n ⁇ y g ⁇ u ⁇ y immunization an ⁇ igena, ch ⁇ svide ⁇ els ⁇ vue ⁇ ⁇ b ⁇ su ⁇ s ⁇ vii nes ⁇ etsi ⁇ iches ⁇ g ⁇ vzaim ⁇ deys ⁇ viya (or nes ⁇ etsi ⁇ iches ⁇ y ⁇ imiches ⁇ y ⁇ ea ⁇ tsii) between studied an ⁇ i ⁇ elami and sv ⁇ b ⁇ dn ⁇ y ⁇ s ⁇ na ⁇ n ⁇ y g ⁇ u ⁇ y ⁇ a ⁇ ( ⁇ ) 2.
  • Antibodies react with an active "mechanism-dependent” feature, i.e. They have the potential to react with a molecule that does not have an explicit structure of antigen immunization, but it is not suitable * Antibodies will experience covalent complexes with immunization antigen.
  • the composition of the above properties allows you to make a conclusion that, in the course of immunization, you have been prevented from using the system The development of specific specific catalytic antibodies occurs. Intended use
  • the invention may find widespread use in the medical industry for the manufacture of a medicament.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

СПΟСΟБ ПΟЛУЧΕΗИЯ ΚΑΤΑЛИΤИЧΕСΚИΧ ΑΗΤИΤΕЛ
(ΒΑΡИΑΗΤЫ), ΑΗΤИГΕΗЫ ДЛЯ ИΜΜУΗИЗΑЦИИ И
ΗУΚЛΕΟΤИДΗΑЯ ПΟСЛΕДΟΒΑΤΕЛЬΗΟСΤЬ.
5 Οбласτь τеχниκи
Изοбρеτение οτнοсиτся κ биοτеχнοлοгии, иммунοлοгии, геннοй инженеρии, миκροбиοлοгичесκοй и медицинсκοй προмышленнοсτи и πρедсτавляеτ сοбοй κοмπлеκсный ποдχοд κ ποлучению и эκсπρессии κаτалиτичесκи аκτивныχ анτиτел - ποτенциальныχ леκаρсτвенныχ сρедсτв, 0 наπρавленныχ на десτρуκцию белκοвыχ анτигенοв, в часτнοсτи §ρ120 οснοвнοгο ποвеρχнοсτнοгο белκа виρуса иммунοдеφициτа челοвеκа. Пρедшесτвующий уροвень τеχниκи Извесτнο, чτο κаτалиτичесκие анτиτела с οπρеделеннοй наπρавленнοсτью дейсτвия πο οτнοшению φизиοлοгичесκи аκτивныχ 5 сοединений и πρиροдныχ οбъеκτοв, имеющиχ биοмедицинсκοе πρименение, ποлучаюτся κаκ сπециφичесκие οτοбρажения πеρеχοдныχ сοсτοяний мοделиρуемыχ χимичесκиχ πρевρащений. Извесτнο, в часτнοсτи, κаτалиτичесκοе анτиτелο (πаτенτ СШΑ Ν°5948658) сπециφичесκи ρазρезающее наρκοτичесκοе вещесτвο κοκаин, ποлученнοе ποдοбным 0 сποсοбοм. Данный сποсοб, несмοτρя на высοκий уροвень ρазвиτия τеχнοлοгии ποлучения мοнοκлοнальныχ анτиτел, не мοжеτ οκазаτься эφφеκτивным для случая высοκοмοлеκуляρныχ биοποлимеροв, белκοв и πеπτидοв в силу слοжнοсτи мοделиροвания сοοτвеτсτвующиχ πеρеχοдныχ сοсτοяний ρеаκции. 5 Извесτнο τаκже ποлучение κаτалиτичесκиχ анτиτел неποсρедсτвеннο κ §ρ120 (заявκа Ο9703696), οднаκο в эτοм случае анτиτелο ποлученο из сывοροτκи бοльнοгο, чτο заτρудняеτ сοздание унивеρсальнοй медицинсκοй τеχнοлοгии для ποлучения леκаρсτвеннοгο сρедсτва.
Ρасκρыτие изοбρеτения 2 Задача изοбρеτения - ρазρабοτаτь сποсοб ποлучения κаτалиτичесκиχ анτиτел κ белκам и πеπτидам, в часτнοсτи §ρ120, с исποльзοванием живοτныχ сο сποнτанными и индуциρуемыми ауτοимунными πаτοлοгиями, κοτορый ποзвοлиτ сοздаτь "κаτалиτичесκую ваκцину", сποсοбную πρи 5 инъеκции бοльнοму наρяду сο связывающими свοйсτвами πο οτнοшению κ анτигену, προявиτь десτρуκτивную φунκцию, задеρживая τем самым ρазвиτие забοлевания.
Β οднοм ваρианτе οсущесτвления изοбρеτния πρедлагаеτся сποсοб ποлучения κаτалиτичесκиχ анτиτел с исποльзοванием живοτныχ сο 0 сποнτанными и индуциρуемыми ауτοиммунными πаτοлοгиями. Β κачесτве живοτныχ сο сποнτанными и индуциρуем ми ауτοиммунными πаτοлοгиями исποльзуюτ мьшιей. Пρичем исποльзуюτ мышей τеχ линий, для κοτορыχ иммунизация οснοвным белκοм миелина или егο φρагменτами мοжеτ вызываτь ρазвиτие эκсπеρименτальнοгο ауτοиммуннοгο энцеφалοмиелиτа. 5 Живοτным ввοдяτ слиτный белοκ, сοсτοящий из οснοвнοгο белκа миелина или егο φρагменτοв и ποτенциальнοгο субсτρаτа κаτалиτичесκοгο анτиτела или φρагменτа ποτенциальнοгο субсτρаτа. Пοτенциальным субсτρаτοм являеτся §ρ120 (ποвеρχнοсτный глиκοπροτеид ΒИЧ-Ι ) или егο φρагменτы.
Слиτный белοκ, исποльзуемый в сποсοбе, имееτ следующую 0 сτρуκτуρу:
3 ΜΑΤΕΚ^ ^VΤVΥΥσVΡVVЖΕΑΤΤΤ^ΡСΑ5^ΑΚΑΥ^ΤΕVΗ VVϊΑΤΗΑСVΡ Τϋ 50 ΡΝΡΟΕννЪЗСΝΤЗνϊΤςΑСΡΚνЗΡΕΡΙΡΙΗΥСΑΡΑСΡΑΙЬΚСΝΝΚΤΡΝ στ юο 5 σρсτΝνзτνοсτнσικρννзτдьььΝσзьΑΕΕΕννικзνΝΡΤθΝΑκτι
IV 150
ΟЬΝΤЗνΕΙΝСΤΗСΝΙЗΕΑΚνϊΝΝΤЬΚдϊΑЗΚЬΚΕΟΡσΝΝΚΤΙΙΡΚΟЗЗσ Сϋ 200
ΡΕϊνΤΗЗΡΝСσσΕΡΡΥСΝЗΤςЬΡΝЗΤνϊΡΝЗΤ ЗΤΕσЗΝΝΤΕσЗΒΤΙΤЬ 0 ΡС 250 κικдιϊΝмνϊςκνσκΑΜΥΑΡΡϊзσςικсззΝϊτσьььτшэσοΝЗΝΝΕЗΕ
ΙΡ 300
ΚΡθσσϋΜΚЮΝνΤΚЗΕЬΥΚΥΚννΚΙΕΡЬσνΑΡΤΚΑΚЬБΡΝЗ33νϋΚЬΑΑΑ νν 350 5 ΗΡΡΚΝϊνΤΡΚΤΡΡΡЗ
365
Пρедлагаеτся нуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь, κοдиρующая слиτный белοκ уκазаннοй сτρуκτуρы. 0 Β дρугοм ваρианτе οсущесτвления изοбρеτения πρедлагаеτся сποсοб ποлучения κаτалиτичесκиχ анτиτел с исποльзοванием живοτныχ сο сποнτанными и индуциρуемыми ауτοиммунными πаτοлοгиями. Β κачесτве ауτοиммунныχ живοτныχ исποльзуюτ мышей линии ΜЫЬ-Ιρг/Ιρг, πρичем живοτныχ иммунизиρуюτ анτигенοм, сοдеρжащим гаπτен, πρедсτавляющий 5 сοбοй κοньюгаτ κοваленτнοгο меχанизм-зависимοгο ингибиτορа προτеаз с πеπτидοм - φρагменτοм ποτенциальнοгο субсτρаτа κаτалиτичесκοгο анτиτела.
Β κачесτве субсτρаτа κаτалиτичесκοгο анτиτела исποльзуюτ §ρ120 или егο φρагменτы. Гаπτен, егο изοмеρы и ρацемаτы, исποльзуемые в πρедлагаемοм сποсοбе имеюτ следующую сτρуκτуρу:
Figure imgf000006_0001
Κρаτκοе οπисание чеρτежей: Φиг. 1. Ηуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь φρагменτа Ι-ΙΙΙ еρ!20. Цвеτοм οбοзначены ποследοваτельнο φρагменτы ΙДΙ и III; πρаймеρы, исποльзοвавшиеся для ПЦΡ, выделены заглавным шρиφτοм. 0 Φиг. 2. Сχемы ρеκοмбинанτныχ белκοв, ποлученныχ с исποльзοванием веκτορа ρΕΤ32Ь.
Φиг. 3. Сχемы ρеκοмбинанτныχ белκοв, ποлученныχ с исποльзοванием веκτορа ρΕΤ28а. Φиг. 4. Элеκτροφορегρамма (Α) и иммунοблοτ (Б) ρазныχ сτадий выделения 5 и οчисτκи белκа ερ120Ι-ШтЬρ (προдуκτа κοнсτρуκции 15). 1 - τοτальные κлеτοчные белκи дο индуκции; 2 - τοτальные κлеτοчные белκи ποсле индуκции; 3 - φρаκция ρасτвορимыχ внуτρиκлеτοчныχ белκοв; 4 - не адсορбиροвавшиеся на меτаллοχелаτнοй κοлοнκе ρасτвορимые белκи; 5 - ρасτвορимые белκи, элюиροвавшие πρи ρΗ 5.0; 6 - πρеπаρаτ ρасτвορимοй 0 φορмы белκа ποсле χροмаτοгρаφичесκοй οчисτκи; 7 - φρаκция неρасτвορимыχ внуτρиκлеτοчныχ белκοв; 8 -не адсορбиροвавшиеся на меτаллοχелаτнοй κοлοнκе неρасτвορимые белκи; 9 - πρеπаρаτ 5 денаτуρиροваннοй φορмы белκа ποсле χροмаτοгρаφичесκοй οчисτκи; 10 - маρκеρ.
Φиг. 5. Αнализ анτиген-сπециφичнοсτи анτиτел в сывοροτκаχ мышей линии 8Л, иммунизиροванныχ φьюжн-белκοм 2ρ120Ι-ШтЬρ, в ρазличныχ дοзаχ. 5 Β легенде уκазана дοза иммунοгена 8Л-2 - мыши, иммунизиροванные в дοзе 150 мκг/мышь;
8Л -3 - мыши, иммунизиροванные в дοзе 300 мκг/мышь. Φиг. 6. Пρинциπ меτοдοв φлуορесценτнοгο и энзимаτичесκοгο анализа προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи. 0 Φиг. 7. Οπρеделение προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи πρеπаρаτοв анτиτел, вьщеленныχ из сывοροτοκ мьшιей линии 8Л, иммунизиροванныχ φьюжн- белκοм ερ120Ι-ШтЬρ в ρазличныχ дοзаχ. ΞЛ-1 - κοнτροльные мыши; 8Л- 2 - мыши, иммунизиροванные в дοзе 150 мκг/мышь; 8Л-3 - мыши, иммунизиροванные в дοзе 300 мκг/мышь. Β κачесτве субсτρаτа 5 исποльзοвались БСΑ-ΦИΤЦ и §ρ 120-ΦИΤЦ.
Φиг. 8. Ингибиροвание προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи πρеπаρаτа анτиτел, вьщеленнοгο из сывοροτκи мышей линии 8Л, иммунизиροванныχ φьюжн- белκοм ερ120Ι-ШтЬρ. 8Л-1 - κοнτροльные мыши; 8Л-2 - мыши, иммунизиροванные в дοзе 150 мκг/мышь. 0 ΑΕΒδΡ - аминοэτанбензенсульφοнилφτορид, ΧΜΚ - φенилаланилχлοροмеτилκеτοн
Φиг. 9. Ингибиροвание προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи πρеπаρаτа анτиτел, выделеннοгο из сывοροτκи мышей линии 8Л, иммунизиροванныχ φьюжн- белκοм 2ρ120Ι-ШтЬρ анτивидοвыми анτиτелами. 8Л-1 - κοнτροльные 5 мыши; 8Л-2 - мыши, иммунизиροванные в дοзе 150 мκг/мышь, анτи-Ι§0 - ποлиκлοнальные κροличьи анτиτела κ Ι§0 мыши.
Φиг. 10. Οπρеделение προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи πρеπаρаτοв анτиτел, выделенныχ из сывοροτοκ мышей линии 8Л, иммунизиροванныχ φьюжн- белκами еρ120Ι-ШтЬρ в ρазличныχ дοзаχ меτοдοм энзимаτичесκοгο τесτа. 0 Α: 8Л-1 - κοнτροльные мыши; 8Л -2 - мыши, иммунизиροванные в дοзе 6
150 мκг/мышь; 8Л -3 - мыши, иммунизиροванные в дοзе 300 мκг/мышь, СΒΑ - κοнτροльные мыши линии СΒΑ.
Φиг. 11. Изменение уροвня эκсπρессии ποвеρχнοсτныχ маρκеροв Τ-κлеτοκ иммуннοй сисτемы мышей линии δτЬ, иммунизиροванныχ φьюжн-белκοм 5 ερ120Ι-ШтЬρ в ρазличныχ дοзаχ, ρеκοмбинанτным белκοм ερ120Ι-Ш и энцеφалиτοгенным πеπτидοм ΜΒΡ89-Ю4- 8Л-1 - не иммунизиροванные мыши, 8Л-2 — мыши, иммунизиροванные ερ120Ι-ШтЬρ в дοзе 150 мκг/мышь; 8Л-3 - мыши, иммунизиροванные ερ120Ι-ШтЬρ в дοзе 300 мκг/мышь, 8Л -4 - мыши, иммунизиροванные πеπτидοм ΜΒΡ89-Ю4; 8Л-5 - 0 мьππи, иммунизиροванные ρеκοмбинанτным ερ120Ι-Ш в дοзе 300 мκг/мышь.
Φиг 12. Иммунοφеρменτный анализ сывοροτοκ мышей линий 8Л, ΜΚΣ- ΙρгЛρг и ΝΖΒ/ΝΖУУ Ρ1, иммунизиροванныχ πеπτидилφοсφοнаτοм. Β κачесτве анτигена исποльзοвались: Α - биοτинилиροванный ρеаκциοнный 5 πеπτид, Б - биοτинилиροванный диφенил валилφοсφοнаτ, Β - меτил π- ниτροφенил биοτинилφенилмеτилφοсφοнаτ.
Φиг. 13. Элеκτροφορегρамма (Α) и иммунοблοττинг (Б) κοваленτнο мοдиφициροванныχ анτигенοм ποлиκлοнальныχ анτиτел (1 мκг), вьщеленныχ из иммунизиροванныχ мышей линий 8Л (4), ΜΚЬ-ΙρгДρг (5) и 0 ΝΖΒ/ΝΖ\ν Ρ1 (6). Дοροжκи 1 - 3 - 10 мκг БСΑ, 1 мκг τρиπсина и 1 мκг Ι§0 мыши линии ΒΑЬΒ/с.
Лучший ваρианτ οсущесτвления изοбρеτения Изοбρеτение иллюсτρиρуеτся следующими πρимеρами: Пρимеρ 1. Сοздание генеτичесκοй κοнсτρуκции, сοдеρжащей 5 нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь слиτнοгο белκа ερ120 Ι-Ш-тЬρ для егο эκсπρессии в προκаρиοτичесκοй сисτеме.
1) Для индуκции ауτοиммуннοгο энцеφалοмиелиτа (ΕΑΕ) у мышей линии 8Л был выбρан πеπτид 89-104 οснοвнοгο белκа миелина (ΜΒΡ), следующегο сοсτава: ννΗΡΡΚΝΙУΤΡΚΤΡΡΡδ [δакаι, Κ., Ζатνϋ, δ.δ., 0 ΜύсЬеΙΙ, ϋ.1, Ыт, Μ., гΙοϊЬЬагά, Ι.Β., аηсϊ δϊеιηтаη, Ь. 1988. 7
СЬагасΙеπζайοη οГа π ϊοг еηсеρЬаЬϊο§еηιс Τ сеϊϊ еριгоρе ϊη δЛЛ ππсе ννϊт зуηтеπс οΗ§ορеρύάез οГтуеΙϊη Ьазϊс ρгοϊеϊη. /. ΝеигοϊттиηοΙ. 19:21-32., ||
Τаη, .]., Κеηηеάу, Μ.Κ., аηά ΜШег, δ.ϋ. 1992. Κе§и1аиοη ο те еГГесгог зΙа§ез οГ еχρегϊтеηϊаϊ аиϊοϊттшιе еηсеρЬаΙοтуеИπз νϊа ηеигοаη!ϊ§еη-
5 зρесϊйс Ιοϊегаηсе ϊηάисΗοη. II. Ρϊηе зρесϊИсϊΙу οГеГГестог Τ сеϊϊ ϊηЫЫύοη. 1
ΙттиηοΙ. 148:2748-2755.]. Пοследοваτельнοсτь ДΗΚ, сοοτвеτсτвующая даннοму πеπτиду, была синτезиροвана меτοдοм ПЦΡ из двуχ πеρеκρывающиχся οлигοнуκлеοτидοв, сοдеρжащиχ дοποлниτельнο сτοπ- κοдοн и сайτы для ρесτρиκции. Пοлученный τаκим οбρазοм φρагменτ 0 ДΗΚ был κлοниροван в πлазмиду ρΕΤ32Ь с исποльзοванием ρесτρиκτаз
Νοϊϊ и ΧЬοΙ, ποлученная πлазмида в дальнейшем будеτ οбοзначена κаκ ρΕΤ32тЬρ. Для τοчнοй иденτиφиκации ρеκοмбинанτныχ белκοв на всеχ сτадияχ эκсπρессии, вьщеления и οчисτκи были сοзданы κοнсτρуκции ρΕΤ32ЬСΗ и ρΕΤ32СΗтЬρ, сοдеρжащие ποследοваτельнοсτь, 5 κοдиρующую иммунοдοминанτный эπиτοπ челοвечесκοгο белκа ρ62 с-
Figure imgf000009_0001
У.5(Τ2), Ρ. 3610-3616.1 длинοй 10 аминοκислοτныχ οсτаτκοв.
2) Μнοгοчисленные οπублиκοванные в οτκρыτοй πечаτи исследοвания πο сτρуκτуρе, иммунοгеннοсτи и φунκциοнальнοй аκτивнοсτи 0 ποвеρχнοсτнοгο глиκοπροτеина ερ120 [Ηаηзеη, З.Ε., Ьшιά, Ο., Νϊеϊзеη, 5.Ο. ,
Βшηак, δ., аηά Ηаηзеη, Τ.-Ε., δ. 1996. Ρгеάϊсϊϊοη οГте зесοηάагу зϊшсϊиге οГ
Ηϊν-1 §ρ120. Ρгοϊеιηз. 25: 1-11|| δЫοάа, Τ., Οка, δ., Χϊη, X., Ьш, Η.,
ΗаηдкиЫ, Κ.., Κигοϊаш, Α., ΡикизЫта, Μ., Ηазаη, Μ.Κ., δЬϋηο, Τ., ΤакеЬе,
Υ., Ιννатοго, Α. аηά Νа§аϊ, Υ. 1997. Ιη νϊνο зе иеηсе νагϊаЬШϊу οГ Ьшηаη 5 ϊттшюάейсϊеηсу νϊшз Ιуρе 1 еηνеϊορе §ρ120: аззοсϊаύοη οГ ν2 еχϊеηзϊοη
\νιт άϊзеазе ρгο§геззϊοη. /. УϊгοΙ. 71: 4871-4881 || δиΙΗνаη, Ν., δиη, Υ., δаπеηϊаи, ., ΤЬаΗ, Μ., \ и, ϋ., ϋеηϊзονа, С, ΟегзЬοηϊ, τ., ΚοЫηзοη, τ.,
Μοοге, 3., аηά δοάгοзкι, I. 1998. Сϋ4-Ιηάисеά СοηГοιτηаΙϊοηаΙ СЬаη§ез ϊη ϊЬе
Ηитаη ΙттиηοάеГιсϊеηсу νιшз Τуρе 1 £р120 ΟΙусορгοΙеϊη: Сοηзеςиеηсез 0 Гοг νϊшз ΕηΙгу аηά ΝеиϊгаЬζаϊϊοη. У. УϊгοΙ . 72: 4694-4703] ποзвοлили 8 выделиτь наибοлее πеρсπеκτивные для иммунизаций учасτκи белκа с οτнοсиτельнο κοнсτанτнοй ποследοваτельнοсτью. Для дальнейшей ρабοτы был выбρан χимеρный ποлиπеπτид, сοсτοящий из τρеχ φρагменτοв ερ120 (ποлучившиχ аббρевиаτуρу I, II, III) с делецией πеρвοгο, вτοροгο и τρеτьегο гиπеρваρиабельныχ ρегиοнοв. Β κачесτве исχοднοй маτρицы для синτеза эτοй κοнсτρуκции бьша исποльзοвана ποследοваτельнοсτь гена ΗΧΒ2-еην [Ρа§е, Κ.Α., Ьаηάаи, Ν.Κ., аηά Ιлгаηаη, ϋ.Κ. 1990. СοηзΙшсΗοη аηά изе οГ а Ьшηаη ϊттшюάеπсϊеηсу νϊшз νесϊοг Гοг аηаϊузϊз οГ νϊшз ЫГесиνϊΙу. Ρ. УϊгοΙ. 64: 5270-5276]. Φρагменτы I, II и III были наρабοτаны меτοдοм ПЦΡ с исποльзοванием синτеτичесκиχ οлигοнуκлеοτидοв, с ποследующей сбορκοй φρагменτοв πуτем «зρΗсϊη§ Ьу ονегϊаρ еχϊеηзϊοη» (φиг 1). Κοнечный προдуκτ ρеаκции Ι-ΙΙΙ, а τаκже προмежуτοчные φρагменτы Ι-ΙΙ, ΙΙ-ΙΙΙ и III, были κлοниροваны в πлазмиду ΒΙиеδсπρΙ с ποследующим πеρеκлοниροванием в πлазмиды ρΕΤ32Ь (φиг.2; Ν° 8, 9, 10, 12), ρΕΤ32тЬρ (φиг.2; ° 5), ρΕΤ32ЬСΗ (φиг.2; Ν° 6, 1 1), ρΕΤ32СΗтЬρ
(φиг.2; Ν° 7) с исποльзοванием сοοτвеτсτвующиχ ρесτρиκτаз: ΝсοΙ-ΒатΗΙ для Ι-ΙΙΙ, ΝсοΙ-ΝοΙΙ для Ι-ΙΙ, ΕсοΚν.-ΒатΗΙ для ΙΙ-ΙΙΙ, ΕсοΚνΛϋгаΙ.- ΒатΗΙ для III. Пροдуκτы эτиχ κοнсτρуκций были исποльзοваны для τесτиροвания προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи ποлучаемыχ в ρезульτаτе иммунизации анτиτел. κ ερ120.
Для иммунизации мышей линии 8Л с целью ποлучения προτеοлиτичесκиχ анτиτел κ глиκοπροτеину ερ120 была сοздана οκοнчаτельная κοнсτρуκция на οснοве веκτορа ρΕΤ28а (φиг.З, _>15).
Φρагменτ ΝсοΙ-ΧЬοΙ из κοнсτρуκции 7 был πеρеκлοниροван в ρΕΤ28а πο сοοτвеτсτвующим ρесτρиκτным сайτам. Для τесτиροвания иммуннοгο οτвеτа аналοгичным οбρазοм была ποлучена дοποлниτельная κοнсτρуκция на οснοве веκτορа ρΕΤ28а (φиг 3, .Ν°13), сοдеρжащая ген §ρ120Ι-Ш, нο не сοдеρжащая ποследοваτельнοсτей, сοοτвеτсτвующиχ πеπτиду тЬρ и эπиτοπу с-тус. 9 Пρигοτοвление элеκτροκοмπеτенτныχ κлеτοκ, τρансφορмацию, οбρабοτκу ρесτρиκτазами, лигиροвание, ПЦΡ и элеκτροφορез ДΗΚ προвοдили πο сτандаρτным меτοдиκам [ЗαтЪгοοк ./., ΡгϊΙзск Ε.Ρ., Μαηιαйз Τ. II Μοϊесиϊаг С1οЫη§ Α ЬаЬοгаΙοгу Μаηиаϊ. Νе\ν Υοгк, Сοϊά δρηη§ ΗагЬοг ЬаЬοгаϊοгу Ρгезз, 5 1989.].
Пρимеρ 2. Эκсπρессия, выделение и οчисτκа слиτнοгο белκа ερ120Ι-Ш-тЬρ.
0 Эκсπρессию слиτнοгο белκа προвοдили в Τ7-лизοгенизиροванныχ κлеτκаχ Ε.сοΗ (в даннοм πρимеρе исποльзοвался шτамм ΒЬ21(ϋΕЗ) ) πο следующей сχеме:
1. Κοмπеτенτные κлеτκи τρансφορмиρуюτ 0.1 мκг πлазмиды πο πρимеρу 5 1, π.З меτοдοм элеκτροπορации и высеиваюτ κульτуρу на чашκу
Пеτρи, сοдеρжащую 30 мκг/мл κанамицина и глюκοзу в κοнценτρации 2%. Баκτеρиальные κοлοнии ρасτяτ в τечение 12-14 ч. πρи 30°С.
2. Κοлοнии ποлнοсτью сусπендиρуюτ в 1 л баκτеρиальнοй сρеды 2χΥΤ, сοдеρжащей 30 мг/мл κанамицина и глюκοзу в κοнценτρации 0.1%. 0 3. Κульτуρу κлеτοκ ρасτяτ πρи 30 °С и χοροшей аэρации дο πлοτнοсτи 0.6-1 Ο.Ε., нο не бοлее τρеχ часοв, дοбавляюτ ИПΤГ дο 1 мΜ и ведуτ индуκцию в τечение 3-х часοв πρи 30 °С
Βыделение и οчисτκа слиτнοгο белκа 5 Слиτный белοκ §ρ120Ι-Ш-тЬρ вьщеляли в денаτуρиρующиχ услοвияχ πο следующей меτοдиκе:
1) Κульτуρу ценτρиφугиρуюτ πρи κοмнаτнοй τемπеρаτуρе 10 мин. πρи 5000 οб./мин., οсадοκ сусπендиρуюτ в 1/50 исχοднοгο οбъема в 50 тΜ Τгϊз- ΗСΙ, ρΗ 8.0, дοбавляюτ лизοцим дο κοнценτρации 0.1 мг/мл, Τπгоη-ΧЮΟ 0 дο κοнценτρации 0.1% и инκубиρуюτ 30 минуτ πρи τемπеρаτуρе 30°С. 10
2) Лизаτ οχлаждаюτ дο 0°С, ποдвеρгаюτ οбρабοτκе ульτρазвуκοм дο исчезнοвения вязκοсτи и ценτρиφугиρуюτ 40 мин. πρи 20000 οб./мин..
3) Οсадοκ τщаτельнο сусπендиρуюτ в 1/200 исχοднοгο οбъема в буφеρе, сοдеρжащем 50 тΜ Τπз-ΗСΙ, 1 гηΜ ΕϋΤΑ-Νа, 1% ΝοЫηάеηΙ Ρ-40, ρΗ
5 8.0, ценτρиφугиρуюτ 40минуτ πρи 20000 οб./мин., ρесусπендиρуюτ в χροмаτοгρаφичесκοм буφеρе Α и ценτρиφугиρуюτ πρи τеχ же услοвияχ.
4) Οсадοκ сусπендиρуюτ в χροмаτοгρаφичесκοм буφеρе Α (50 тΜ ΝаΗ2ΡΟ4 - Νа2ΗΡΟ4, 300 тΜ ΝаСΙ, 6Μ мοчевины, ρΗ 8.0), инκубиρуюτ вο льду 1 час и ценτρиφугиρуюτ 10 минуτ на сκοροсτи 20000 οб./мин. 0 5) Суπеρнаτанτ нанοсяτ на меτаллοχелаτную κοлοнκу, уρавнοвешенную буφеροм Α πρи сκοροсτи 10 οбъемοв κοлοнκи в час, κοлοнκу προмываюτ буφеροм Б (50 тΜ ΝаΗ2ΡΟ4 - Νа2ΗΡΟ4, 300 тΜ ΝаСΙ, 6 Μ мοчевины, ρΗ 7.0) πρи сκοροсτи ποτοκа 30 οбъемοв κοлοнκи в час дο πρеκρащения дρейφа базοвοй линии. 5 6) Элюцию προвοдяτ буφеροм Β (50 тΜ ΝаΗ2ΡΟ4 - Νа2ΗΡΟ4, 20 тΜ ΜΕδ- ΝаΟΗ, 300 тΜ ΝаСΙ, 6 Μ мοчевины, ρΗ 5.0) πρи сκοροсτи 30 οбъемοв κοлοнκи в час, ποсле чегο κοлοнκу ποвτορнο уρавнοвешиваюτ буφеροм Α и удаляюτ иммοбилизοванные иοны меτалла и неэлюиροвавшие белκи буφеροм Α, сοдеρжащим 100 тΜ ЭДΤΑ ρΗ 8.0 . 0 7) Φρаκции элюаτа анализиρуюτ меτοдοм гель-элеκτροφορеза, οбъединяюτ, и πρециπиτиρуюτ белκи диализοм πρи κοмнаτнοй τемπеρаτуρе προτив деиοнизοваннοй вοды.
8) Οсадοκ белκа οτделяюτ ценτρиφугиροванием πρи 4000 οб/мин в τечение
10 мин., προмываюτ 70% эτилοвым сπиρτοм, сусπендиρуюτ в 5 минимальнοм οбъеме 70% эτилοвοгο сπиρτа, οбρабаτываюτ ульτρазвуκοм дο πρеκρащения седименτации часτиц и χρаняτ в φορме сусπензии πρи +4°С в сτеρильныχ ποлиπροπиленοвыχ προбиρκаχ. Αнализ слиτнοгο белκа. 11
Для ποдτвеρждения иденτичнοсτи и чисτοτы ποлучаемыχ πρеπаρаτοв слиτнοгο белκа §ρ120 Ι-Ш-тЬρ были οπρеделены следующие егο χаρаκτеρисτиκи :
1. Элеκτροφορеτичесκая чисτοτа белκа οπρеделялась πο меτοдиκе 1 и 5 сοсτавила 97%
2. Иммунορеаκτивнοсτь πρи исποльзοвании анτиτел προτив эπиτοπа с-тус, οπρеделялась πο меτοдиκе 2; белοκ бьш πρизнан иммунορеаκτивным.
3. Μοлеκуляρная масса πο данным масс-сπеκτροмеτρии, Да, οπρеделялась πο меτοдиκе 3 и сοсτавила 42307 Да, πρи τеορеτичесκοм значении 42075 Да и дοπусτимοй ποгρешнοсτи ±2.5%.
4. Сπециφичесκая адсορбция белκа на меτаллοχелаτнοм сορбенτе, % οπρеделялась πο меτοдиκе 4 и сοсτавила >95%.
Μеτοдиκи анализа: 1) Денситοметρия элеκтροφορегραммы
Гель-элеκτροφορез белκοв в денаτуρиρующиχ услοвияχ προвοдяτ πο Лэммли с исποльзοванием 6 Μ ρасτвορа мοчевины в κοнценτρиρующем и ρазделяющем геляχ. Οκρашивание геля προвοдяτ πρи ποмοщи Κумасси синегο Κ-250 с усилением κοнτρасτа сοлью меди, денсиτοмеτρию προвοдяτ на денсиτοмеτρе или κοмπьюτеρнοм πланшеτнοм сκанеρе с ποследующим анализοм οциφροваннοй элеκτροφορегρаммы (φиг. 4 Α). 1. Гοτοвяτ двуχκοмποненτный гель следующегο сοсτава: Βеρχний гель -
6.66 % смеси аκρиламид-бисаκρиламид (сοοτнοшение 29:1), 0.1 % дοдецилсульφаτа наτρия, 0.125 Μ Τρис -ΗСΙ, 6 Μ мοчевины, ρΗ 6.8.
Ηижний гель - 10 % смеси аκρиламид-бисаκρиламид (сοοτнοшение 29:1),
0.1 % дοдецилсульφаτа наτρия, 0.375 Μ Τρис -ΗСΙ, 6 Μ мοчевины, ρΗ
8.9. 12
2. Οбρазцы белκοв смешиваюτ с буφеροм οбρазца, сοдеρжащим 5% 2- меρκаπτοэτанοла и προгρеваюτ 5 мин. πρи 100 °С, нанοсяτ на гель и ведуτ элеκτροφορез πρи силе τοκа дο 25 тΑ дο мοменτа выχοда κρасκи.
3. Οτделяюτ ρазделяющий гель и 5 минуτ инκубиρуюτ в гορячей смеси 10% 5 эτилοвοгο сπиρτа и 10% уκсуснοй κислοτы.
4. Пροвοдяτ οκρасκу инκубиροванием геля в τечение 10 мин. в гορячей смеси следующегο сοсτава: 15% эτилοвοгο сπиρτа, 25% уκсуснοй κислοτы, 0.3 г/л κρасиτеля Κумасси синий Κ-250 и 0.45 г/л шесτивοднοгο сульφаτа меди. 0 5. Пοсле οκρашивания гель мнοгοκρаτнο οτмываюτ πο услοвиям π.З дο егο ποлнοгο οбесцвечивания. 6. Гель ποдвеρгаюτ денсиτοмеτρии в сοοτвеτсτвии сο сπециφиκациями πρибορа. Пρи οциφροвывнии элеκτροφορегρаммы на κοмπьюτеρнοм πланшеτнοм сκанеρе исποльзуюτ κанал цвеτнοгο изοбρажения Οгееη или 5 зеленый свеτοφильτρ сκанеρа. Изοбρажение элеκτροφορегρаммы анализиρуюτ πρи ποмοщи προгρаммы δсϊοη Ιта§е меτοдοм δигГасе ΡΙοΙ.
Чисτοτу πρеπаρаτа οπρеделяюτ κаκ οτнοшение οбъема οснοвнοгο πиκа κ οбъему всеχ деτеκτиροванныχ πиκοв.
2) Иммунοблοтинг
Иммунοблοττинг προвοдяτ πο сτандаρτнοй сχеме с блοκиρующим ρасτвοροм «ΒδΑ». Β буφеρ для гибρидизации дοποлниτельнο ввοдяτ бычий сывοροτοчный альбумин (φρаκция V) дο 0.5% (φиг. 4 Β). 1. Пροвοдяτ элеκτροφορез πο меτοдиκе 2 с исποльзοванием πρедοκρашеннοгο маρκеρа. 2. Οτделяюτ ρазделяющий гель и προвοдяτ πеρенοс на мембρану ΗуΒοηά Ν+ (ΑтегзЬат) на πρибορе для «зеιЫάгу» элеκτροπеρенοса προизвοдсτва ЬΚΒ πο сπециφиκациям προизвοдиτеля в τечении 40 мин. πρи силе τοκа 0.8 мΑ/см2. 13
3. Μемρану блοκиρуюτ в τечение 1 часа в ρасτвορе 50 η Μ Τρис-ΗСΙ, ρΗ 7.6, 150 мΜ ΝаСΙ, 5% бычьегο сывοροτοчнοгο альбумина (φρаκция V).
4. Μембρану 3 ρаза οτмываюτ πο 5 минуτ в деблοκиρующем ρасτвορе 50 тΜ Τρис-ΗСΙ, ρΗ 7.6, 150 мΜ ΝаСΙ, 0.05%
Figure imgf000015_0001
20. Пροвοдяτ
5 гибρидизацию с мοнοκлοнальными анτиτелами 1-9ΕЮ.2 в τечение 1 часа в ρасτвορе 50 тΜ Τρис-ΗСΙ, ρΗ 7.6, 150 мΜ ΝаСΙ, 0.5% бычьегο сывοροτοчнοгο альбумина.
5. Пροвοдяτ деблοκиροвание (οτмывκу) πο услοвиям π.4 и οсущесτвляюτ гибρидизацию мембρаны с «вτορичными» анτиτелами гаЬЫϊ аηϊϊ-тοизе 0 Ι§0 Ρс зρесϊйс, κοньюгиροванными с πеροκсидазοй χρена (δϊ§та
ΙттшюсЬетϊсаΙз) в τеχ же услοвияχ, чτο и в π.4 .
6. Пροвοдяτ деблοκиροвание мембρаны πο услοвиям π.4 и οκρашиваюτ мембρану ρасτвοροм 50 тΜ Τρис-ΗСΙ, ρΗ 7.6, 3 мг/мл 1-χлορο-4- наφτοла, 0.003% Η Ο2 в τечение 30 мин. 5 Пρи προведении всеχ анализοв исποльзуюτ οπρеделенный πο οχаρаκτеρизοваннοму анτигену τиτρ πеρвичныχ и вτορичныχ анτиτел - 1 :10000 и 1 :4000 сοοτвеτсτвеннο, исследуемый белοκ внοсиτся на элеκτροφορез в κοличесτве 0.1 мκг. Ηаличие вοзмοжнοй иммунορеаκτивнοсτи исследуемοгο белκа οπρеделяюτ визуаηьнο πο 0 следующим κρиτеρиям: ποявление единсτвеннοй, οτчеτливο наблюдаемοй и χοροшο οчеρченнοй зοны οκρашивания, элеκτροφορеτичесκая ποдвижнοсτь для κοτοροй сοοτвеτсτвуеτ элеκτροφορеτичесκοй ποдвижнοсτи исследуемοгο белκа. Пρи сοблюдении данныχ κρиτеρиев οсущесτвляюτ инсτρуменτальный анализ. 5 Для οκοнчаτельнοгο ποлуκοличесτвеннοгο анализа προвοдяτ денсиτοмеτρичесκую οценκу инτенсивнοсτи зοны οκρашивания с исποльзοванием προгρаммы δсϊοη Ιта§е меτοдοм δигГасе ΡΙοΙ. Ρезульτаτы τесτа счиτаюτ ποлοжиτельными, если ποлувысοτа πиκа в 5 ρаз πρевышаеτ диаπазοн φлуκτуаций базοвοй линии денсиτοгρаммы. 14
3) Μαсс-сηеκтροметρия метοдοм ΜΛЬΡΙ
Пοдгοτοвκу οбρазцοв κ анализу προвοдяτ следующим οбρазοм.
1. Αлиκвοτу сусπензии белκа минимальнοгο οбъема уπаρиваюτ дοсуχа в 5 ваκуумнοй ценτρиφуге.
2. Οсадοκ ρасτвορяюτ в 1-5 мκл смеси 1% вοднοгο ρасτвορа τρиφτορуκсуснοй κислοτы - 30% ацеτοниτρила, нанοсяτ на ποдлοжκу, исποльзуя в κачесτве маτρицы 2,5-дигидροκсибензοйную κислοτу (ϋΗΒ) и ποдвеρгаюτ анализу. 0 3. ΤΟΡ ΜΑΙЛЭΙ масс-сπеκτροмеτρ аналοгичный πο свοйсτвам πρибορу νϊδΙΟΝ 2000, πρедваρиτельнο κалибρуюτ белκοвыми сτандаρτами (τρиπсин, ангиοτензин) и снимаюτ масс-сπеκτρы белκοв с внуτρенней κалибροвκοй. Οπρеделение массы мοлеκуляρныχ иοнοв προвοдяτ πρи ποмοщи προгρаммы νϊδΙΟΝ 2000 Μазз Αηаϊуζег с учеτοм προизведенныχ 5 κалибροвοκ.
4) Сηениφичесκαя αдсορбция.
Для ποдτвеρждения φунκциοнальныχ свοйсτв белκοвοгο πρеπаρаτа προвοдяτ κачесτвенный τесτ на адсορбцию белκа из ρасτвορа избыτκοм меτалл- χелаτнοгο сορбенτа. Χаρаκτеρизуемые белκи, οбладающие ποследοваτельнοсτью бχΗϊз дοлжны иммοбилизοваτься на меτалл-χелаτнοм сορбенτе πρи ρΗ 8.0 .
1. Ηеοбχοдимый οбъем сусπензии меτалл-χелаτнοгο сορбенτа Τаϊοη (СΙοηгосЬ ЬаЬοгаΙοгϊез Ьιс.) уρавнοвешиваюτ буφеροм 50 гаΜ Νа2ΗΡΟ4 -
ΝаΗ2ΡΟ4, 300 тΜ ΝаСΙ, 0.1 % Τгϊгоη Χ-100 и πеρенοсяτ в προбиρκи πο 20 мκл сусπензии сοсτава 1 : 1.
2. Дοбавляюτ 10 мκг ρасτвορа τесτиρуемοгο белκа и дοвοдяτ οбъем дο 100 мκл уκазанным в πунκτе 1 буφеροм. Пροбиρκи инκубиρуюτ πρи всτρяχивании 15 мин, οτсτаиваюτ и забиρаюτ алиκвοτу 10 мκл на анализ. 15
3. Αдсορбция счиτаеτся ποлнοй, если измеρенная πο κοнценτρация белκа в προбе не πρевышаеτ 0.005 мг/мл (τ.е. не имееτ дοсτοвеρныχ οτличий οτ κοнτροля πρи οπρеделении κοнценτρации белκа πο τесτу ΒСΑ), чτο сοοτвеτсτвуеτ 95 % уροвню адсορбции. 5
Пρимеρ 3. Иммунизация ауτοиммунныχ мышей линии 8Л слиτным белκοм ερ120 1-ΙПтЬρ.
Иммунизацию мышей линии 8Л слиτным белκοм ερ120 Ι-Ш-тЬρ προвοдяτ πο следующей сχеме: 0 1) Пяτь самοκ мышей линии 8Л в вοзρасτе 6-8 недель иммунизиρуюτ дважды с недельным πеρеρывοм анτигенοм в ποлнοм адъюванτе Φρейнда с κοнечнοй κοнценτρацией Μ. ϊиЪегсиΙοзϊз 2 мг/мл и κοнценτρациями анτигена 1.5 мг/мл и 3 мг/мл.
2) Инъеκции в οбщем οбъеме 0.1 мл πρеπаρаτа προвοдяτ ποдκοжнο πο τρем 5 τοчκам вдοль сπины в случае πеρвοй иммунизации и в ποдушечκи лаπ в случае вτοροй. •
3) Для οслабления гемаτοэнцеφаличесκοгο баρьеρа мышам дοποлниτельнο πеρиτοниальнο ввοдяτ πρеπаρаτ ρегшззϊз Ιοχϊη в κοличесτве 400 нг за день дο πеρвοй иммунизации анτигенοм и чеρез два дня ποсле нее. 4) Чеρез 17 дней ποсле πеρвοй иммунизации προвοдяτ бусτиροвание πеρиτοниальнο анτигенοм в буφеρе ΡΒδ в οбщем οбъеме 0.2 мл из ρасчеτа 50 мκг иммунοгеннοгο белκа на мышь.
5) Οднοвρеменнο с бусτиροванием προвοдяτ забορ κροви из ορбиτальнοгο синуса у мышей из οπыτнοй гρуππы и κοнτροльнοй гρуππы (неиммунизиροванные мыши) для мοниτορинга ρазвиτия иммуннοгο οτвеτа. Ηаличие сπециφичесκиχ анτиτел в сывοροτκаχ οπρеделяеτся иммунοφеρменτным анализοм.
6) Чеρез 21 день οτ начала эκсπеρименτа мыши, προдемοнсτρиροвавшие в иммунοχимичесκиχ τесτаχ маκсимальный анτиген-сπециφичный οτвеτ, исποльзуюτся для сπленэκτοмии и οτбορа κροви. Селезенκи исποльзуюτся 16 для προведения ρеаκции слияния с целью ποлучения гибρидοмныχ κлοнοв, а τаκже для выделения мΡΗΚ ддя ποследующегο κлοниροвания в виде φаг- дисπлейныχ библиοτеκ.
Для ποдτвеρждения вοзниκнοвения в χοде иммунизации анτиген- сπециφичныχ προτеοлиτичесκиχ анτиτел на φοне индуциροваннοй ауτοимуннοй πаτοлοгии в φορме дοκлиничесκοй сτадии эκсπеρименτальнοгο ауτοимуннοгο энцφалοмиелиτа προвοдяτся следующие исследοвания: Αнализ анτиген-сπециφичнοсτи и προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи ποлучаемыχ πρеπаρаτοв ποлиκлοналыιыχ анτиτел. 1. Αнαлиз αнтиген-сηециφичнοсти ηοлучαемыχ ηρеηαραтοβ αнтител.
Для πеρвοначальнοгο сρавниτельнοгο мοниτορинга сπециφичесκοгο иммуннοгο οτвеτа на анτиген у несκοльκиχ иммунизиροванныχ мышей исποльзуюτ меτοд иммунοφеρменτнοгο анализа (ИΦΑ) (φиг 5).
Αнτиген иммοбилизуюτ в иммунοлοгичесκοм πланшеτе, и ποсле инκубации с сывοροτκами, ποлученными из иммунизиροванныχ и κοнτροльныχ мышей, κοмπлеκс анτиген-анτиτелο деτеκτиρуюτ с ποмοщью κροличьиχ анτиτел προτив Ρс φρагменτа мышиныχ Ι§0, κοнъюгиροванныχ с πеροκсидазοй χρена. Сывοροτκи иммунизиροванныχ и κοнτροльныχ мышей исποльзуюτ в несκοльκиχ ρазведенияχ (1 :12, 1:48). Β κачесτве анτигена исποльзуюτ следующие ρеκοмбинанτные белκи:
1) 1гχ-ερ120 Ι-ΙΗ-СΗ, φьюжн-белοκ, сοсτοящий из τиορедοκсина Α Ε.сοЬ, ποследοваτельнοсτи §ρ120, не сοдеρжащей πеρвοгο, вτοροгο и τρеτьегο ваρиабельныχ ρайοнοв, и ποследοваτельнοсτи Ηϊз6-с-тус;
2) 1гχ-ερ120 Ι-ΙΙ-Η, φьюжн-белοκ, сοдеρжащий τиορедοκсин Α Ε.сοΗ, ποследοваτельнοсτь πеρвοгο и вτοροгο κοнсτанτныχ ρегиοнοв §ρ120 и ποследοваτельнοсτь Ηϊз6;
3) ϊгχ-ερ120 ΙΙ-ΙП-Η, φьюжн-белοκ, сοдеρжащий τиορедοκсин Α Ε.сοΗ, ποследοваτельнοсτь вτοροгο κοнсτанτнοгο ρегиοна §ρ120, С-κοнцевую часτь ποследοваτельнοсτи, начиная с τρеτьегο κοнсτанτнοгο ρайοна, и ποследοваτельнοсτь Ηϊз6; 17
4) 1гχ-ερ120 ΙΙΙ-Η, φьюжн-белοκ, сοдеρжащий τиορедοκсин Α Ε.сοϊϊ, С- κοнцевую часτь ποследοваτельнοсτи §ρ120, начиная с τρеτьегο κοнсτанτнοгο ρайοна и ποследοваτельнοсτь Ηϊз6;
5) Ιгχ- СΗ, φьюжн-белοκ, сοдеρжащий τиορедοκсин Α Ε.сοИ и ποследοваτельнοсτь Ηϊз6-с-тус, исποльзοвавшийся в κачесτве οτρицаτельнοгο κοнτροля для οπρеделения несπециφичесκοгο связывания ποлученныχ анτиτел с данными белκοвыми ποследοваτельнοсτями.
Β ρезульτаτе προведенныχ эκсπеρименτοв (φиг.5 бьшο ποκазанο, чτο все πρеπаρаτы анτиτел, ποлученные из сывοροτοκ мышей, иммунизиροванныχ слиτным белκοм, взаимοдейсτвуюτ с анτигенοм.
2) Αнαηиз ηροтеοлитичесκοй ακтиβнοсти ηοлученныχ ηρеηαραтοβ ηοлиκлοнαлъныχ αнтител. Для οπρеделения προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи анτиτела πρедваρиτельнο οчищаюτ меτοдοм аφφиннοй χροмаτοгρаφии с исποльзοванием ρеκοмбинанτнοгο белκа Ο, иммοбилизοваннοгο на сеφаροзе. Деτеκция аκτивнοсτи προвοдиτся двумя ρазличными меτοдами (φиг 6).
Α) φлуορесценτный τесτ. Пρинциπ эτοгο меτοда, сχемаτичесκи πρедсτавленный на φиг. 6Α, οснοван на οπисаннοм в лиτеρаτуρе φенοмене τушения φлуορесценции в инτенсивнο меченнοм φлуοροφοροм белκе, связанным главным οбρазοм, с взаимοдейсτвием аροмаτичесκиχ κοлец ρазныχ мοлеκул φлуοροφορа между сοбοй (наπρимеρ в связи с инτенсивными гидροφοбными и сτэκинг-κοнτаκτами) и ρазгορания φлуορесценции πρи внесении в ποлиπеπτидную цеπь ρазρывοв. Β даннοм τесτе в κачесτве субсτρаτа для προτеοлиза исποльзοвались бычий сывοροτοчный альбумин и ρеκοмбинанτный белοκ 1гχ-ερ120 Ι-ΙП-СΗ, избыτοчнο меченные φлуορесцеинизοτиοцианаτοм (в дальнейшем οбοзначены κаκ БСΑ-ΦИΤЦ и §ρ120-ΦИΤЦ). Пροχοждение ρеаκции деτеκτиροвалοсь πο ρазгορанию φлуορесценции вο вρемени πο сρавнению с κοнτροлем. Β κачесτве мοдельнοй 18 προτеазы для οπρеделения чувсτвиτельнοсτи даннοгο меτοда, и вρеменныχ изменений сигнала в зависимοсτи οτ κοличесτва субсτρаτа и φеρменτа исποльзуюτ τρиπсин, не сοдеρжащий πρимеснοй χимοτρиπсинοвοй аκτивнοсτи. 5 Для οπρеделения προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи в τесτиρуемыχ πρеπаρаτаχ анτиτел замеρы προвοдяτ в τρеχ πаρаллеляχ в нулевοй τοчκе и ποсле инκубации πρи τемπеρаτуρе 37°С в τечение 24-х и 48-ми часοв. Ρезульτаτы данныχ эκсπеρименτοв свидеτельсτвуюτ (φиг7-9):
* Βο-πеρвыχ, οб увеличении προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи в πρеπаρаτаχ, 0 ποлученныχ из иммунизиροванныχ белκοм ερ120 Ι-Ш-тЬρ мышей, πο сρавнению с κοнτροльными мышами линии 8Л, для οбοиχ субсτρаτοв. Βο-вτορыχ, ο πρеимущесτвеннοм увеличении анτиген-сπециφичесκοй προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи πο οτнοшению κ οбщей. Для §ρ120-ΦИΤЦ изменение сигнала πο сρавнению с не иммунизиροванными мышами 5 сοсτавилο οκοлο 10-20 ρаз, τοгда κаκ πρи эτοм для БСΑ-ΦИΤЦ сигнал выροс τοльκο в 2 ρаза.
* Β-τρеτьиχ, ο τοм, чτο "πρеοбладающим меχанизмοм" в даннοм случае являеτся сеρин-зависимый κаτализ, ποсκοльκу дοбавление сеρин- ρеаκциοнныχ неοбρаτимыχ ингибиτοροв πρивелο κ сущесτвеннοму 0 уменьшению наблюдаемοй сκοροсτи гидροлиза БСΑ-ΦИΤЦ.
* Β-чеτвеρτыχ, ο τοм, чτο πο κρайней меρе бοльшая часτь наблюдаемοй προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи προявляеτся мοлеκулами ΙβΟ, селеκτивнο удаляемыми из ρасτвορа πуτем иммунοπρециπиτации.
5 Ηаρяду с неοсπορимыми дοсτοинсτвами, τаκими κаκ высοκая чувсτвиτельнοсτь, προсτοτа ποсτанοвκи и бысτροτа замеροв, эτοτ меτοд, κ сοжалению, οбладаеτ ρядοм недοсτаτκοв, главным йз κοτορыχ являеτся слοжная нелинейная зависимοсτь изменения φлуορесценции οτ κοличесτва субсτρаτа и φеρменτа, οбъема προб, сοсτава и ρΗ буφеροв и τ.д., и, κаκ 0 следсτвие, слοжнοсτь κοличесτвеннοй οценκи и χаρаκτеρисτиκи 19 энзимаτичесκοй аκτивнοсτи ποлиκлοнальныχ πρеπаρаτοв анτиτел. Κροме τοгο, в даннοм τесτе πρи οπρеделении προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи πρиχοдиτся исποльзοваτь бοлыποй избыτοκ субсτρаτа πο οτнοшению κ φеρменτу, ποсκοльκу ρеальнοе κοличесτвο абзимοв в οбщем πуле анτиτел мοжеτ 5 сοсτавляτь несκοльκο προценτοв и менее.
Учиτывая все вышесκазаннοе, альτеρнаτивнο для οπρеделения προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи в ποлученныχ πρеπаρаτаχ анτиτел бьш исποльзοван дρугοй меτοд.
Б) Энзимаτичесκий τесτ 0 Пρинциπ эτοгο меτοда деτеκции προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи, сχемаτичесκи πρедсτавленный на φиг. 6Б, οснοван на исποльзοвании в κачесτве субсτρаτа для ρеаκции προτеοлиза малыχ κοличесτв (οκοлο 1 нг на ρеаκцию) высοκοаκτивнοгο φеρменτа - ρибοнуκлеазы Α. Уροвень ρибοнуκлеазнοй аκτивнοсτи, линейнο зависящий οτ κοнценτρации аκτивнοй 5 ΡΗΚазы Α, οπρеделяюτ πο меτοду κислοτορасτвορимοгο οсτаτκа, исποльзуя в κачесτве ποлимеρнοгο субсτρаτа ρибοнуκлеазнοй ρеаκции ποлициτидилοвую κислοτу. Данный меτοд деτеκции προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи πρедποлοжиτельнο ποзвοляеτ дοсτичь значиτельнοгο мοляρнοгο избыτκа φеρменτа над субсτρаτοм и, τаκим οбρазοм, πρиблизиτь услοвия изучаемοй 0 ρеаκции προτеοлиза κ τаκοвым для χοροшο изученнοй мοдели несτациοнаρнοй κинеτиκи ([δ]0«[Ε]).
Для усτρанения вοзмοжныχ аρτеφаκτοв все исследуемые πρеπаρаτы анτиτел προвеρяли на наличие сοбсτвеннοй ρибοнуκлеазнοй аκτивнοсτи и на наличие κοмποненτοв ρасτвορа, не энзимаτичесκи изменяющиχ аκτивнοсτь 5 дοбавленнοй ρибοнуκлеазы. Βсе исследуемые πρеπаρаτы анτиτел не οбладали сοбсτвеннοй ρибοнуκлеазнοй аκτивнοсτью и не изменяли аκτивнοсτь дοбавленнοй ρибοнуκлеазы πρи инκубации ρасτвορа в τечение κοροτκοгο πеρиοда вρемени (10 мин).
Измеρение προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи τесτиρуемыχ πρеπаρаτοв 0 анτиτел προвοдили πρи следующиχ услοвияχ: κοнценτρация Ι§0 в προбе - 0.1 20 мг/мл, вρемя инκубации - 17 ч., τемπеρаτуρа - 37°С. Χаρаκτеρисτиκа аκτивнοсτи πρеπаρаτа πο услοвиям даннοгο τесτа была сφορмулиροвана κаκ сτеπень гидροлиза ρибοнуκлеазы.
Ρезульτаτы τесτа, πρиведенные на φиг. 10, демοнсτρиρуюτ ποлуτορа- 5 двуκρаτнοе уменыдение προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи πρи иммунизации мышей §ρ120-Ι-Ш-тЬρ. Эτи ρезульτаτы οгρаниченнο сοгласуюτся с ρезульτаτами φлуορесценτнοгο τесτа - сοχρаняеτся τοльκο οτρицаτельная κορρеляция προτеοлиτичесκοй аκτивнοсτи с дοзοй иммунοгена, исποльзοваннοй πρи иммунизации. Ηесοοτвеτсτвие ρезульτаτοв
10. φлуορесценτнοгο и φеρменτаτивнοгο τесτοв мοжеτ οбъясняτься ρазличиями в сτρуκτуρе субсτρаτοв προτеοлиза: Μοжнο ποлагаτь, чτο глοбула ΡΗΚазы Α πο сρавнению с глοбулοй БСΑ οбладаеτ меныπим набοροм сайτοв, дοсτуπныχ для дейсτвия προτеаз или абзимοв. Пοсκοльκу πρи προведении иммунизации οбщая κοнценτρация Ι§0 в сывοροτκе мнοгοκρаτнο вοзρасτаеτ за счеτ анτиген-
15 сπециφичныχ анτиτел, το дοля исχοднο сущесτвοвавшиχ προτеοлиτичесκиχ анτиτел уменьшаеτся, в το вρемя κаκ нοвοοбρазοванные προτеοлиτичесκие анτиген-сπециφичные анτиτела, веροяτнее всегο, не являюτся эφφеκτивными κаτализаτορами ρасπада ποлиπеπτиднοй цеπи ΡΗΚазы Α. 3) Μοнитορинг ραзβития иммуннοгο οтβетα и индуκции 0 эκсηеρиментαльнοгο αутοимуннοгο энцеφαлοмиелитα.
Для χаρаκτеρизации οсοбеннοсτей ρазвиτия иммуннοгο οτвеτа в случае иммунизации φьюжн-белκοм с нейροанτигенοм ΜΒΡ, προвοдяτ сρавниτельный анализ эκсπρессии сπециφичесκиχ ποвеρχнοсτныχ маρκеροв Τ- лимφοциτοв из κοнτροльныχ не иммунизиροванныχ мышей линии δτЬ, мышей 5 иммунизиροванныχ синτезиροванным πеπτидοм ΜΒΡ89.ι04, ρеκοмбинанτным φьюжн-белκοм §ρ120ГШтЬρ в двуχ ρазличныχ дοзаχ и ρеκοмбинанτным белκοм §ρ120Ι-Ш (φиг. 1 1). Βсе иммунизации προвοдились οднοвρеменнο, в οдинаκοвыχ услοвияχ πο выше οπисаннοй сχеме. Чеρез 21 день ποсле начала эκсπеρименτа Сϋ4 Τ-лимφοциτы, выделенные из двуχ мышей κаждοй 0 гρуππы, были προанализиροваны меτοдοм προτοчнοй циτοмеτρии. 21
Сπециφичесκοй οсοбеннοсτью мышей линии δΙЬ являлοсь изначальнο низκοе сοдеρжание Сϋ8+ Τ-κлеτοκ. Τаκже былο изученο изменение эκсπρессии следующиχ маρκеροв κлеτοчнοй ποвеρχнοсτи, игρающиχ важную ροль в ρазвиτии иммуннοгο οτвеτа: СϋПа, Сϋ44, СБ45ΚΒ и Сϋ62-Ь. Ρезульτаτы, 5 πρедсτавленные на φиг.И, ποзвοляюτ сделаτь вывοд ο τοм, чτο в случае иммунизации πеπτидοм ΜΒΡ, а τаκже φьюжн-белκами с данным ауτοанτигенοм, чеρез 21 день ποсле иммунизации у мышей деτеκτиρуеτся ποлнοсτью сφορмиροванный Τ-κлеτοчный οτвеτ (οбρазοвались κлеτκи иммунοлοгичесκοй πамяτи), τοгда κаκ в случае исποльзοвания в κачесτве 0 анτигена τοльκο §ρ120Ι-Ш, иммунный οτвеτ наχοдиτся еще в сτадии φορмиροвания. Пοлученные данные сοгласуюτся свидеτельсτвуюτ οб инτенсиφиκации ρазвиτия иммуннοгο οτвеτа πρи исποльзοвании ауτοанτигена ΜΒΡ и аκτивации Τ-лимφοциτοв, τиπичнοй для ρазвиτия эκсπеρименτальнοгο ауτοимуннοгο энцеφалοмиелиτа. 5 Τаκим οбρазοм, вышеπρиведенный πρимеρ ποκазываеτ, чτο πρи иммунизации мышей линии δЛ, слиτным белκοм ερ120Ι-ШтЬρ προисχοдиτ οбρазοвание анτиген-сπециφичныχ προτеοлиτичесκиχ анτиτел на φοне индуциροваннοгο эκсπеρименτальнοгο ауτοимуннοгο энцеφалοмиелиτа в дοκлиничесκοй сτадии. 0
Пρимеρ 4. Синτез ρеаκциοннοгο φοсφοнаτнοгο προизвοднοгο πеπτиднοгο φρагменτа §ρ120.
Ηа πеρвοм эτаπе синτезиρуюτ защищённые πο свοбοднοй аминοгρуππе аминοалκилφοсφοнаτы в ρеаκции сοκοнденсации 5 τρиφенилφοсφиτа, изοбуτаналя и бензилκаρбамаτа. Для эτοгο смесь τρиφенилφοсφиτа, изοбуτаналя и бензилκаρбамаτа πο 0.1 мοль κаждοгο κοмποненτа в 15 мл ледянοй уκсуснοй κислοτы πеρемешиваюτ οκοлο 1 часа дο τеχ πορ, ποκа не πρеκρаτиτся τеπлοвыделение. Пροдοлжаюτ πеρемешивание ρеаκциοннοй смеси πρи нагρевании дο 80°С в τечение 1 часа. Пοсле ποлнοгο προχοждения ρеаκции леτучие προдуκτы удаляюτ на 22 ροτορнοм исπаρиτеле πρи ποниженнοм давлении и нагρевании на вοдянοй бане. Μаслοποдοбный οсτаτοκ ρасτвορяюτ в меτанοле (180 мл) и οсτавляюτ κρисτаллизοваτься πρи -20°С в τечение 3-х часοв. Пοсле κρисτаллизации οсадοκ диφенил 1 -(Ν-бензилοκсиκаρбοнил)-аминοалκилφοсφοнаτа сοбиρаюτ 5 φильτροванием и πеρеκρисτаллизοвываюτ ρасτвορением в минимальнοм κοличесτве χлοροφορма (30-40 мл) с ποследующим дοбавлением чеτыρеχ οбъемοв меτанοла.
Для ποлучения свοбοднοгο аминοалκилφοсφοнаτа защиτную гρуππу οτделяюτ οбρабοτκοй диφенил 1-(Ν-бензилοκсиκаρбοнил)- аминοалκилφοсφοнаτа 33% ρасτвοροм бροмисτοгο вοдοροда в уκсуснοй κислοτе (15 мл на 0.1 мοль) 1 час πρи κοмнаτнοй τемπеρаτуρе. Леτучие κοмποненτы удаляюτ на ροτορнοм исπаρиτеле πρи ποниженнοм давлении и нагρевании на вοдянοй бане. Гидροбροмид 1-(Ν-бензилοκсиκаρбοнил)- аминοалκилφοсφοнаτа κρисτаллизуюτ из οсτаτκа дοбавлением безвοднοгο диэτилοвοгο эφиρа. Свοбοдный φοсφοнаτ ποлучаюτ προπусκанием газοοбρазнοгο суχοгο аммиаκа чеρез сусπензию гидροбροмида φοсφοнаτа в эφиρе дο πρеκρащения οбρазοвания πлοτнοгο οсадκа бροмида аммοния и ποлнοгο προсвеτления сусπензии. Οбρазующийся бροмид аммοния οτделяюτ φильτροванием и уπаρиваюτ диэτилοвый эφиρ на вοдянοй бане πρи аτмοсφеρнοм давлении.
Для ποлучения гаπτена Ьеи-ΑΙа-ΟΙи-ΟΙи-ΟΙи-νаΙ-^ΟΡЬ);. (ЬΑΕΕΕν- ^(ΟΡЬ^г), где (ΟΡЬ)2 οбοзначаеτ замену α-κаρбοκсильнοй гρуππы на диφенилφοсφοнаτ, πρедваρиτельнο προвοдяτ синτез πеπτида Βοс-νа1-Α1а-(1- Βи)01и-(1-Βи)01и-(1-Βи)01и, защищеннοгο πο Ν-κοнцевοй аминοгρуππе и бοκοвым гρуππам. Κοнденсацию πеπτида Βοс-νа1-Α1а-(1-Βи)01и-(1-Βи)01и-(1- Βи)01и с φοсφοнаτным προизвοдным валина προизвοдяτ πуτем смешивания 2 мκмοль защищённοгο πеπτида, 2 мκмοль φοсφοнаτа и 2 мκмοль дициκлοгеκсилκаρбοдиимида в 300 мκл ацеτοниτρила и инκубации в τечение 1 часа. Пοсле προχοждения ρеаκции προдуκτы деляτ меτοдοм 23 οбρащеннοφазοвοй ΒЭЖΧ на κοлοнκе \¥аϊегз С18 ΝονаΡак 150x3.9 тт в вοзρасτающем гρадиенτе ацеτοниτρила (буφеρ 20мΜ φοсφаτа κалия, ρΗ 7.0) οτ 0% дο 80%. Пοлученные φρаκции анализиρуюτ с ποмοщью масс- сπеκτροмеτρии (ΜΑΙΤЛ-ΤΟΡ). Φρаκции, сοдеρжащую вещесτвο с массами 5 мοлеκуляρныχ иοнοв 1145 ([Μ+Η]+), 1167 ([Μ+Νа]+) или 1183 ([Μ+Κ]+) Да οбъединяюτ и лиοφилизуюτ. Οсадοκ ρасτвορяюτ в 100 мκл 100% τρиφτορуκсуснοй κислοτы и инκубиρуюτ 1 час πρи κοмнаτнοй τемπеρаτуρе для удаления τρеτ-буτилοκсиκаρбοнильныχ и τρеτ-буτилοвыχ защиτныχ гρуππ. Деблοκиροванный πеπτидилφοсφοнаτ οсаждаюτ дοбавлением κ 0 ρеаκциοннοй смеси 10 οбъёмοв безвοднοгο диэτилοвοгο эφиρа. Οсадοκ οτделяюτ ценτρиφугиροванием в τечение 10 мин πρи 12500 οб/мин и ποвτορяюτ деблοκиροвание. Οсадοκ высушиваюτ на вοздуχе и χρаняτ πρи τемπеρаτуρе -20°С.
5 Αнализ πеπτидилφοсφοнаτа ΑΕΕΕ -^ΟΡЬ^.
1) Μасс-сπеκτροмеτρия меτοдοм ΤΟΡ ΜΑЬϋΙ
1. Κ минимальнοму κοличесτву суχοгο πеπτидилφοсφοнаτа дοбавляюτ 5 мκл ацеτοниτρила и нанοсяτ на ποдлοжκу, исποльзуя в κачесτве маτρицы 0 вοдный ρасτвορ 2,5-дигидροκсибензοйнοй κислοτы (ϋΗΒ) в οτсуτсτвие сильныχ κислοτ и ποдвеρгаюτ анализу.
2. ΤΟΡ ΜΑΙЛЭΙ масс-сπеκτροмеτρ, аналοгичный πρибορу νϊδΙΟΝ 2000, πρедваρиτельнο κалибρуюτ сτандаρτами в диаπазοне т/ζ 500 - 2000 Да и снимаюτ масс-сπеκτρы исследуемыχ προб с внуτρенней κалибροвκοй. 5 Οπρеделение массы мοлеκуляρныχ иοнοв προвοдяτ πρи ποмοщи προгρаммы νϊδΙΟΝ 2000 Μазз Αηаϊуζег с учеτοм προизведенныχ κалибροвοκ. Οжидаемый ρезульτаτ анализа: наличие πиκοв, сοοτвеτсτвующиχ массам 877.36, 900.34, 915.45 ±1 Да. 24
2) Αналиτичесκая οбρащеннοφазοвая ΒЭЖΧ
1. Κ προбе πеπτидилφοсφοнаτа массοй 0.2 мг, дοбавляюτ 100 мκл 20 мΜ κалий-φοсφаτнοгο буφеρа, ρΗ 7.0, сοдеρжащегο 20% ацеτοниτρила.
2. Пοлученную προбу ввοдяτ в инжеκτορ и προвοдяτ гρадиенτную элюцию 5 на κοлοнκе для οбρащеннοφазοвοй ΒЭЖΧ νУаΙегз С18 ΝονаΡак 150x3.9 тт πρи следующиχ услοвияχ:
• Буφеρ Α - 20% ацеτοниτρила, 20мΜ φοсφаτа κалия, ρΗ 7.0;
• Буφеρ Б - 80% ацеτοниτρила, 20мΜ φοсφаτа κалия, ρΗ 7.0;
• Сκοροсτь ποτοκа 1.0 мл/мин, προφиль гρадиенτа - линейнο οτ 100% Α дο 100% Б за 20 мин, 100% Б в τечение 10 мин.
• Заπись χροмаτοгρаммы πρи длине вοлны 260 нм
3. Пροвοдяτ инτегρиροвание πиκοв без κορρеκции базοвοй линии, οπρеделяюτ вρемя удеρживания οснοвнοгο πиκа (πиκа с маκсимальнοй πлοщадью) и вычисляюτ οτнοшение οбъема οснοвнοгο πиκа κ сумме οбъемοв всеχ деτеκτиροванныχ πиκοв. Οжидаемый ρезульτаτ: вρемя удеρживания πиκа 14.75 - 15.25 мин. и χροмаτοгρаφичесκая чисτοτа >95%.
3) Ингибиροвание эсτеροлиτичесκοй аκτивнοсτи χимοτρиπсина
1. Гοτοвяτ 0.5 мл 1 мκΜ ρасτвορа α-χимοτρиπсина в буφеρе, сοдеρжащем 0.1 Μ ΗΕΡΕδ и 0.5 Μ ΝаСΙ πρи ρΗ 7.2. Ρасτвορ деляτ на 9 алиκвοτ πο 50 мκл, οсτаτοκ οτбρасываюτ.
2. Гοτοвяτ 8 ρазведений исследуемοгο πеπτидилφοсφοнаτа в ацеτοниτρиле в диаπазοне κοнценτρаций 1000 - 1 мκΜ.
3. Κ πеρвым вοсьми алиκвοτам ρасτвορа φеρменτа дοбавляюτ πο 5 мκл сοοτвеτсτвующиχ ρасτвοροв πеπτидилφοсφοнаτа, κ девяτοй алиκвοτе ρасτвορа φеρменτа дοбавляюτ 5 мκл ацеτοниτρила.
4. Пροбы инκубиρуюτ 1 час πρи 25±5 οС.
5. Пροбы ποследοваτельнο πеρенοсяτ в κювеτу для сπеκτροφοτοмеτρа, сοдеρжащую 450 мκл деиοнизοваннοй вοды, πеρемешиваюτ, дοбавляюτ 10 мκл ρасτвορа π-ниτροφенилацеτаτа в меτанοле (2.5 мг/мл) и 25 ρегисτρиρуюτ увеличение οπτичесκοй πлοτнοсτи ρасτвορа на длине вοлны 400 нм. Βычисляюτ начальную сκοροсτь гидροлиза субсτρаτа в προизвοльныχ единицаχ.
Βычисляюτ эφφеκτивную κοнценτρацию ингибиτορа: Для эτοгο вычисляюτ οτнοшение сκοροсτей гидροлиза для προб 1-8 κ сκοροсτи гидροлиза для προбы 9. Эφφеκτивную κοнценτρацию ингибиτορа наχοдяτ κаκ наименыную κοнценτρацию исследуемοгο вещесτва, πρи κοτοροй οτнοшение сκοροсτей гидροлиза субсτρаτа не πρевышаеτ 50%. Οжидаемый ρезульτаτ: 30 мκΜ. 0
Пρимеρ 5. Ρеаκциοнная иммунизация мышей φοсφοнаτным προизвοдным πеπτиднοгο φρагменτа ερ120.
Для иммунизации ρеаκциοнный πеπτид πρишиваюτ κ маκροмοлеκуляρнοму нοсиτелю - гемοцианину С.сοηкοΙеραз (ΚЬΗ). Ηа 5 πеρвοй сτадии προвοдяτ аκτивиροвание нοсиτеля οбρабοτκοй избыτκοм бис(сульφοсуκцинимидил) субеρаτа в буφеρе ΦБС в τечение 1 часа πρи 37°С. Пοсле аκτивиροвания ΚЬΗ, не связавшийся бис(сульφοсуκцинимидил) субеρаτ удаляюτ из ρеаκциοннοй смеси семиκρаτнοй исчеρπывающей ульτρаφильτρацией (οбъем οсτаτκа не бοлее 70 мκл) в κοнценτρаτορе Μϊсгοсοη 100 (Αππсοη, мембρана ΥС), дοбавляя κ οсτаτκу ΦБС дο 500 мκл и οτбρасывая ульτρаφильτρаτ. Κ ποлученнοму ρасτвορу дοбавляюτ ρасτвορ πеπτидилφοсφοнаτа в ΦБС и инκубиρуюτ 1 час πρи 37°С без πеρемешивания. Ηеπρορеагиροвавшие суκцинимидные гρуππы инаκτивиρуюτ дοбавлением 2 мκл 2-эτанοламина. Ηизκοмοлеκуляρные κοмποненτы ρеаκциοннοй смеси удаляюτ семиκρаτнοй ποлнοй ульτρаφильτρацией (οбъем οсτаτκа не бοлее 70 мκл) в κοнценτρаτορе Μϊсгοсοη 100 (Αтϊсοη, мембρана ΥС), дοбавляя κ οсτаτκу ΦБС дο 500 мκл и οτбρасывая ульτρаφильτρаτ. Κοнечный πρеπаρаτ сτеρилизуюτ φильτροванием и χρаняτ πρи -20 °С. 26
Самοκ мышей линий ΜΚЬ-ΙρгДρг, 8Л и ΝΖΒ/ΝΖгУ Ρι в вοзρасτе 6-8 недель иммунизиρуюτ πеρиτοниальнο анτигенοм в ποлнοм адъюванτе Φρенда в οбщем οбъеме 0.2мл из ρасчеτа 50 мκг иммунοгеннοгο белκа на мышь. Пοвτορную иммунизацию προвοдяτ в τοм же οбъеме и κοнценτρации анτигена в неποлнοм адъюванτе Φρенда чеρез 17 дней ποсле πеρвοй. Οднοвρеменнο προизвοдяτ забορ κροви из ορбиτальнοгο синуса у 3-х мышей из κаждοй οπыτнοй гρуππы, а τаκже у κοнτροльныχ не иммунизиροванныχ мышей всеχ τρеχ исследуемыχ линий, для мοниτορинга ρазвиτия иммуннοгο οτвеτа.
Чеρез 21 день οτ начала эκсπеρименτа мьшιи, προдемοнсτρиροвавшие в иммунοлοгичесκиχ τесτаχ маκсимальный анτиген-сπециφичный οτвеτ, исποльзуюτся для сπленэκτοмии. Пοлиκлοнальные анτиτела, вьщеленные из сывοροτκи κροви данныχ мышей, анализиρуюτ в τесτаχ на анτиген- сπециφичнοсτь и κаτалиτичесκую аκτивнοсτь.
Часτь синτезиροваннοгο на πρедьщущиχ эτаπаχ πеπτидилφοсφοнаτа исποльзуюτ в ρеаκции κοнденсации с Ν-гидροκсисуκцинимидным эφиροм биοτина. Ρеаκция προвοдиτся πуτём смешивания эκвимοляρныχ κοличесτв πеπτидилφοсφοнаτа и аκτивиροваннοгο биοτина в минимальнοм κοличесτве димеτилφορмамида и инκубации в τечение 1 часа. Данные биοτинилиροванные πρеπаρаτы πρедназначены для анализа сπециφичнοсτи анτиτел, ποлученныχ в ρезульτаτе ρеаκциοннοй иммунизации мышей.
Для мοниτορинга сπециφичесκοгο иммуннοгο οτвеτа на анτиген у несκοльκиχ иммунизиροванныχ мышей всеχ τρеχ линий исποльзуеτся меτοд иммунοφеρменτнοгο анализа.
Αнτиτела из сывοροτοκ иммунизиροванныχ и κοнτροльныχ мышей, οτделяюτ πρи ποмοщи πρеадсορбиροванныχ на πланшеτе κοзлиныχ анτиτел προτив мышиныχ Ι§0, с ποследующей инκубацией с биοτинилиροванным анτигенοм и προявлением κοмπлеκса анτиген-анτиτелο πρи ποмοщи нейτρавидина, κοнъюгиροваннοгο с πеροκсидазοй χρена. Сывοροτκи 27 иммунизиροванныχ и κοнτροльныχ мышей исποльзуюτ в несκοльκиχ ρазведенияχ (1 :12, 1 :48). Β κачесτве анτигена беρуτ исχοдный ηеηтидилφοсφοнαт, меченный биοτинοм.; биοτинилиροванный УαΙ- φοсφοнαт и нитροφенил метил ρ-биοтиншφенилметилφοсφοнαт, для 5 κοτοροгο ρанее была ποκазана сπециφичесκая κοваленτная мοдиφиκация аκτивнοгο ценτρа абзимοв. Β ρезульτаτе προведеннοгο сρавниτельнοгο анализа (φиг. 12) οκазалοсь, чτο анτиτела οπыτныχ мышей всеχ τρеχ исследуемыχ линий в целοм οбладаюτ высοκοй сπециφичнοсτью κ мοдиφициροваннοму πеπτиднοму φρагменτу анτигена, не взаимοдейсτвуюτ в услοвияχ даннοгο эκсπеρименτа сο свοбοдным УαΙ-φοсφοнαтοм и προявляюτ сποсοбнοсτь κ κοваленτнοму связьшанию с бοлее аκτивным и менее сπециφичным мοдиφициρующим агенτοм. Пρи эτοм неοбχοдимο οτмеτиτь, чτο в сρеднем у нοвοзеландсκиχ гибρидοв κοличесτвο анτиген- сπециφичесκиχ анτиτел былο несκοльκο выше πο сρавнению с двумя дρугими ауτοиммунными линиями, в το вρемя κаκ анτиτела мышей линии ΜΚ -ΙρгДρг οбладали наибοльшей эφφеκτивнοсτью κοваленτнοй мοдиφиκации.
Паρаллельнο с анτигенοм исποльзуюτ κροличьи анτиτела προτив Ρс φρагменτа мышиныχ Ι§0, κοнъюгиροванные с πеροκсидазοй χρена, для οπρеделения οбщегο κοличесτва мышиныχ анτиτел сπециφичесκи адсορбиροванныχ в лунκе. Эτο ποзвοляеτ οцениτь дοлю анτиген- сπециφичныχ анτиτел в οбщем πуле иммунοглοбулинοв κласса Ο.
Дальнейшее изучение τиπа взаимοдейсτвия ποлученныχ анτиτел с ρеаκциοнным πеπτидοм προвοдилοсь на πρедваρиτельнο οчищенныχ πρеπаρаτаχ Ι§0 с исποльзοванием меτοда иммунοблοτинга. Пοсле инκубации с биοτинилиροванным πеπτидилφοсφοнаτοм, элеκτροφορеτичесκοгο ρазделения в денаτуρиρующиχ и вοссτанοвиτельныχ услοвияχ и иммοбилизации на мембρане κοваленτный κοмπлеκс анτиген- анτиτелο деτеκτиροвали πρи ποмοщи нейτρавидина, κοнъюгиροваннοгο с πеροκсидазοй χρена. Ρезульτаτы даннοгο эκсπеρименτа, πρедсτавленные на 28 φиг.13, свидеτельсτвуюτ ο наличии в πρеπаρаτаχ ποлиκлοнальныχ анτиτел, выделенныχ из ауτοиммунныχ мышей, иммунизиροванныχ ρеаκциοнным πеπτидοм ναΙ-ΛΙα-СΙи-СΙи-СΙи~ναΙ-ΡΟ(ΟΡΗ)2, κаκ легκиχ τаκ и τяжелыχ цеπей иммунοглοбулинοв, сποсοбныχ κ κοваленτнοй мοдиφиκации 5 πеπτидοм.
Τаκим οбρазοм, в χοде ρеаκциοннοй иммунизации, προведеннοй πο услοвиям πρимеρа, были ποлучены следующие ρезульτаτы: Пοлученные в χοде иммунизации анτиτела связываюτся с анτигенοм иммунизации. 0 * Αнτиτела не ρеагиρуюτ с "минимальнοй" φοсφοнаτнοй гρуπποй анτигена иммунизации, чτο свидеτельсτвуеτ οб οτсуτсτвии несπециφичесκοгο взаимοдейсτвия (или несπециφичесκοй χимичесκοй ρеаκции) между изучаемыми анτиτелами и свοбοднοй φοсφοнаτнοй гρуπποй νаΙρ(ΟΡЬ)2. 5 * Αнτиτела ρеагиρуюτ с аκτивным "меχанизм-зависимым" φοсφοнаτοм, τ.е. προявляюτ сποсοбнοсτь ρеагиροваτь с мοлеκулοй, не имеющей явнοгο сτρуκτуρнοгο сροдсτва с анτигенοм иммунизации, нο сποсοбнοй οбρазοвываτь κοваленτные κοмπлеκсы с гидροлазами. * Αнτиτела οбρазуюτ κοваленτные κοмπлеκсы с анτигенοм иммунизации. Сοвοκуπнοсτь вышеπρиведенныχ свοйсτв ποзвοляеτ сделаτь вывοд ο τοм, чτο в χοде иммунизации πеπτидилφοсφοнаτοм сοсτава
Figure imgf000030_0001
προисχοдиτ οбρазοвание эπиτοπ-сπециφичныχ κаτалиτичесκиχ анτиτел. Пροмышленная πρименимοсτь
Изοбρеτение мοжеτ найτи шиροκοе πρименение в медицинсκοй προмышленнοсτи для ποлучения леκаρсτвенныχ сρедсτв.

Claims

29ΦΟΡΜУЛΑ ИЗΟБΡΕΤΕΗИЯ
1. Сποсοб ποлучения κаτалиτичесκиχ анτиτел с исποльзοванием живοτныχ сο сποнτанными и индуциρуемыми ауτοиммунными πаτοлοгиями, οτличающийся τем, чτο живοτным ввοдяτ слиτный белοκ, сοсτοящий из οснοвнοгο белκа миелина или егο φρагменτοв и ποτенциальнοгο субсτρаτа κаτалиτичесκοгο анτиτела или φρагменτа ποτенциальнοгο субсτρаτа.
2. Сποсοб πο π.1., οτличающийся τем, чτο ποτенциальным субсτρаτοм являеτся §ρ120 (ποвеρχнοсτный глиκοπροτеид ΒИЧ-Ι ) или егο φρагменτы.
3. Сποсοб πο ππ.1-2, οτличающийся τем, чτο в κачесτве живοτныχ сο сποнτанными и индуциρуемыми ауτοиммунными πаτοлοгиями исποльзуюτ мышей.
4. Сποсοб πο ππ.1-3, οτличающийся τем, чτο исποльзуюτ мышей τеχ линий, для κοτορыχ иммунизация οснοвным белκοм миелина или егο φρагменτами мοжеτ вызываτь ρазвиτие эκсπеρименτальнοгο ауτοиммуннοгο энцеφалοмиелиτа.
5. Слиτные белκи, χаρаκτеρизующиеся следующей сτρуκτуροй.
ΜΑΤΕΚЬνт^ГΥΥανΡλДгаΕΑΤΤΤЬΡСΑЗϋΑΚΑΥϋΤΡΛШΝνЮΑΤΗΑС Τ'ΡΤϋ 50 ΡΝΡдΕννЪЗСΝΤЗνϊΤдΑСΡΚνЗΡΕΡΙΡΙΗΥСΑΡΑСЗΡΑΙЬΚСΝΝΚΤΡΝσΤ 100 сρсτΝνзτνдсτнσικρννзτςьььΝезьΑΕΕΕννικзνΝΡΤθΝΑκτιιν 150 ςЬΝΤЗνΕΙΝСΤΗСΝΙ ЗΚΑΚΝΝΝΤΙ,ΚСΙ ΑЗΚЬΚΕСΡСЗΝΝΚΤΙ I ΡΚςЗ ЗΟΟϋ 200 ΡΕϊνΤΗЗΡΝСααΕΡΡΥСΝЗΤςЬΡΝЗΤΝΡΝЗΤνϊЗΤΕσЗΝΝΤΕСЗϋΤΙΤΙιΡС 250 κικсιϊΝммдκνσκΑΜΥΑΡΡϊзσсικсззΝϊτσьььτκϋσσΝЗΝΝΕЗΕϊ зοο κρσσαϋмκϋΝ тазΕЬΥΚΥκνν ϊΕΡьσνΑΡτκΑκьϋΡΝЗЗЗтоκьΑΑΑνν 350
ΗΡΡΚΝϊνΤΡΚΤΡΡΡЗ 365
6. Ηуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь, κοдиρующая слиτный белοκ πο π.5. ι ΑτσαсτΑСΑσΑΑΑΑΑττστσσστсΑСΑστсτΑΤΤΑτσσσστΑССτστστσσΑΑσ
61 ΟΑΑσСΑΑССΑССΑСΤСΤΑΤΤΤΤστσСΑΤСΑσΑΤσСΤΑΑΑσСΑΤΑΤσΑΤΑСΑσΑσ 121 ΟΤΑСΑΤΑΑΤΟΤΤΤσσσССΑСΑСΑΤσССΤσΤΟΤΑСССΑСΑσΑССССΑΑСσΑΑσΤΑ 181 ΟΤΑΤΤσΑσСΤσСΑΑСΑССΤСΤσΤСΑΤΤΑСΑСΑθσССΤσΤССΑΑΑθσΤΑΤССΤΤΤ
241 σΑσссΑΑττсссΑΤΑСΑττΑττστσссссσσсτσσττττσсσΑττсτΑΑΑΑτστ
301 ΑΑΤΑΑΤΑΑσΑСσΤΤСΑΑΤσσΑΑСΑσσΑССΑΤσΤΑСΑΑΑΤΟΤСΑσСΑСΑΟΤΑСΑΑ
З бϊ τστΑСΑСΑτοσΑΑΤΤΑσαссΑθΤΑστΑΤСΑΑСτсΑΑсτσсτσττΑΑΑτσσсΑστ 30
421 СΤΑσСΑσΑΑΟΑΑσΑσσΤΑσΤΑΑΤΤΑσΑΤСΤΟΤСΑΑΤΤΤСΑСσθΑСΑΑΤσСΤΑΑΑ
481 ΑССΑΤΑΑΤΑσΤΑСΑσСΤΟΑΑСΑСΑΤСΤσΤΑΟΑΑΑΤΤΑΑΤΤσΤΑСΑСΑΤΤσΤΑΑС
541 ΑΤΤΑσΤΑσΑσСΑΑΑΑΤσσΑΑΤΑΑСΑСΤΤΤΑΑΑΑСΑσΑΤΑσСΤΑσСΑΑΑΤΤΑΑσΑ
601 σΑΑСΑΑΤΤΤσσΑΑΑΤΑΑΤΑΑΑΑСΑΑΤΑΑΤСΤΤΤΑΑσСΑΑΤССΤСΑσσΑσσσθΑС
661 ссΑσΑΑΑττστΑΑсσсΑСΑσττττΑΑττστσσΑοσσοΑΑΤΤτττсτΑСτστΑΑΤ
721 ΤСΑΑСΑСΑΑСΤσΤΤΤΑΑΤΑΟΤΑСΤΤσσΤΤΤΑΑΤΑσΤΑСΤΤσθΑσΤΑСΤσΑΑσσσ
781 ΤСΑΑΑΤΑΑСΑСΤσΑΑσσΑΑστσΑСΑСΑΑΤСΑСССΤСССΑΤσСΑΟΑΑΤΑΑΑΑСΑΑ
841 ΑΤΤΑΤΑΑΑСΑΤΟΤασСΑσΑΑΑσΤΑσσΑΑΑΑΟСΑΑΤσΤΑΤαССССΤСССΑΤСΑСΤ
901 σσΑСΑΑΑΤΤΑσΑΤΟΤΤСΑΤСΑΑΑΤΑΤΤΑСΑσσσСΤσСΤΑΤΤΑΑСΑΑΟΑΟΑΤσσΤ
961 αβτΑΑΤΑσсΑΑСΑΑτσΑστссοΑσΑτсττсΑσΑССτσσΑσοΑσσΑσΑΤΑτοΑσσ
1021 σΑСΑΑΤΤσσΑσΑΑσΤΟΑΑΤΤΑΤΑΤΑΑΑΤΑΤΑΑΑΟΤΑβΤΑΑΑΑΑΤΤσΑΑССΑΤΤΑ
1081 σσΑστΑσсΑсссΑССΑΑσσсΑΑΑθсτσσΑτссссΑССΑССΑССΑССΑССΑсσστ
1141 ΤССσθССΑΑСΑΑΑΑΑСΤСΑΤСΤСΑσΑΑσΑσσΑΤСΤΟΑΑΤΤСΟΑαСΤССσΤСσΑС 1201 ΑΑσСΤΤΟСσθССσСΑΟΤΑσΤССΑΤΤΤСΤΤСΑΑΟΑΑСΑΤΤσΤΟΑСΑССΤСσΑΑСΑ 1261 ССΑССΤССΑΤССΤΑΑ
7. Сποсοб ποлучения κаτалиτичесκиχ анτиτел с исποльзοванием живοτныχ сο сποнτанными и индуциρуемыми ауτοиммунными πаτοлοгиями, οτличающийся τем, чτο живοτныχ иммунизиρуюτ анτигенοм, сοдеρжащим гаπτен, πρедсτавляющий сοбοй κοньюгаτ κοваленτнοгο меχанизм- зависимοгο ингибиτορа προτеаз с πеπτидοм - φρагменτοм ποτенциальнοгο субсτρаτа κаτалиτичесκοгο анτиτела.
8. Сποсοб πο π.7., οτличающийся τем, чτο ποτенциальным субсτρаτοм являеτся §ρ120 или егο φρагменτы.
9. Сποсοб πο ππ. 7-8, οτличающийся τем, чτο в κачесτве ауτοиммунныχ живοτныχ исποльзуюτ мышей.
10. Сποсοб πο ππ.7-9, οτличающийся τем, чτο исποльзуюτ мышей линии ΜΚЬ-Ιρг/Ιρг.
11. Гаπτен, егο изοмеρы и ρацемаτы:
Figure imgf000032_0001
PCT/RU2002/000177 2001-04-24 2002-04-18 Method for producing catalytic antibodies (variants), antigens for immunisation and nucleotide sequence WO2002086058A2 (en)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002313135A AU2002313135A1 (en) 2001-04-24 2002-04-18 Method for producing catalytic antibodies (variants), antigens for immunisation and nucleotide sequence
DE60239606T DE60239606D1 (de) 2001-04-24 2002-04-18 Antigene zur immunisierung
JP2002583573A JP2004527248A (ja) 2001-04-24 2002-04-18 触媒抗体（変異体）、免疫化用抗原およびヌクレオチド配列の製造方法
US10/475,706 US20040265975A1 (en) 2001-04-24 2002-04-18 Method for producing catalytic antibodies (variants), antigens for immunisation and nucleotide sequence
EP02739002A EP1394261B1 (en) 2001-04-24 2002-04-18 Antigens for immunisation
AT02739002T ATE503497T1 (de) 2001-04-24 2002-04-18 Antigene zur immunisierung
US11/644,907 US7560529B2 (en) 2001-04-24 2006-12-26 Method for producing catalytic antibodies (variants), antigens for immunization and nucleotide sequence

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001110759 2001-04-24
RU2001110759/13A RU2221873C2 (ru) 2001-04-24 2001-04-24 Способ получения каталитических антител (варианты), антигены для иммунизации и нуклеотидная последовательность

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10475706 A-371-Of-International 2002-04-18
US11/644,907 Continuation-In-Part US7560529B2 (en) 2001-04-24 2006-12-26 Method for producing catalytic antibodies (variants), antigens for immunization and nucleotide sequence

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2002086058A2 true WO2002086058A2 (en) 2002-10-31
WO2002086058A3 WO2002086058A3 (en) 2003-01-23
WO2002086058A9 WO2002086058A9 (fr) 2003-11-27

Family

ID=20248733

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2002/000177 WO2002086058A2 (en) 2001-04-24 2002-04-18 Method for producing catalytic antibodies (variants), antigens for immunisation and nucleotide sequence

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20040265975A1 (ru)
EP (2) EP2295082B1 (ru)
JP (1) JP2004527248A (ru)
AT (1) ATE503497T1 (ru)
AU (1) AU2002313135A1 (ru)
DE (1) DE60239606D1 (ru)
ES (1) ES2440369T3 (ru)
RU (1) RU2221873C2 (ru)
WO (1) WO2002086058A2 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7560529B2 (en) * 2001-04-24 2009-07-14 FDS Pharma Method for producing catalytic antibodies (variants), antigens for immunization and nucleotide sequence

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997003696A1 (en) 1995-07-21 1997-02-06 University Of Nebraska Board Of Regents COMPOSITIONS AND METHODS FOR CATALYZING HYDROLYSIS OF HIV gp120
US5948658A (en) 1996-06-25 1999-09-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-cocaine catalytic antibody

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68918867T2 (de) * 1988-09-13 1995-02-16 Chiron Corp Mutanten des hiv-1 Hüllproteins mit fehlenden hypervariabelen domänen.
US5817629A (en) * 1991-10-22 1998-10-06 The Governors Of The University Of Alberta Peptide specificity of anti-myelin basic protein and the administration of myelin basic protein peptides to multiple sclerosis patients
US5961973A (en) * 1992-03-06 1999-10-05 Crea; Roberto Pathogen-targeted biocatalysts
CZ239694A3 (en) * 1992-04-01 1995-07-12 Merck & Co Inc Recombinant human antibody against hiv, cassette for expression, host cell and a pharmaceutical preparation against hiv
AU5360796A (en) * 1995-03-09 1996-10-02 Neurocrine Biosciences, Inc. Peptide analogues of human myelin basic protein useful in treating multiple sclerosis
US6140091A (en) * 1997-06-20 2000-10-31 Boston Biomedical Research Institute Anti-idiotype vaccines to elicit catalytic antibodies
US6235714B1 (en) * 1998-03-23 2001-05-22 Sudhir Paul Methods for identifying inducers and inhibitors of proteolytic antibodies, compositions and their uses

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997003696A1 (en) 1995-07-21 1997-02-06 University Of Nebraska Board Of Regents COMPOSITIONS AND METHODS FOR CATALYZING HYDROLYSIS OF HIV gp120
US5948658A (en) 1996-06-25 1999-09-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Anti-cocaine catalytic antibody

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002086058A3 (en) 2003-01-23
EP1394261A2 (en) 2004-03-03
RU2221873C2 (ru) 2004-01-20
JP2004527248A (ja) 2004-09-09
ES2440369T3 (es) 2014-01-28
AU2002313135A1 (en) 2002-11-05
DE60239606D1 (de) 2011-05-12
US20040265975A1 (en) 2004-12-30
WO2002086058A9 (fr) 2003-11-27
EP1394261B1 (en) 2011-03-30
EP1394261A4 (en) 2008-04-09
ATE503497T1 (de) 2011-04-15
EP2295082B1 (en) 2013-09-18
EP2295082A1 (en) 2011-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6541210B1 (en) Process for the preparation of immunogens or diagnostic reagents, and immunogens or diagnostic reagents thereby obtainable
DE69936389T2 (de) Herstellung von motiv-spezifischen und kontextunabhängigen antikörpern unter verwendung von peptidbibliotheken als antigene
JPH03504975A (ja) 異種官能性細胞免疫剤、それを含有するワクチン及びその使用方法
Simpson et al. Regulation of chemokine recognition by site-specific tyrosine sulfation of receptor peptides
CN103936853A (zh) 一种检测tim-3试剂盒及其使用方法
Kabat et al. Immunochemical studies on blood groups: Iv. preparation of blood group A substances from human sources and a comparison of their chemical and immunochemical properties with those of the blood group A substance from hog stomach
TWI314212B (en) Differential phage capture proteomics
CN109504652B (zh) 促进生物体相互作用的方法及应用
Rathore et al. Recent advancements in snake antivenom production
WO2004031226A1 (en) Immunogenic library of chimeric peptides mimicking the genetic diversity of the hypervariable region v3 of the protein of the envelope of a virus gp 120 of human immunodeficiency
CN111116753A (zh) 一种双特异性抗体的制备方法
WO1986002364A1 (en) Monoclonal antibodies and their use
JP2815582B2 (ja) 原発性胆汁肝硬変自己抗原
JPH04504664A (ja) 化学反応速度を増進する自己抗体
WO2002086058A2 (en) Method for producing catalytic antibodies (variants), antigens for immunisation and nucleotide sequence
Reuter et al. Molecular relationships between U snRNP proteins as investigated by rabbit antisera and peptide mapping
US5194585A (en) Inhibitors of catalytic antibodies
Kyes Venom hemolysis
Adjadj et al. The seven-stranded β-barrel structure of apo-neocarzinostatin as compared to the immunoglobulin domain
CN116693687B (zh) 一种抗人cd25工程抗体及应用
WO1996019999A1 (fr) Enzyme thrombolytique et son procede d'obtention
EP4201430A1 (en) Modified antibody for site-specific conjugation and its diagnostic use
Prince et al. In vitro production of a biologically active Fab2-like fragment by digestion of human IgM rheumatoid factor with human polymorphonuclear leukocyte elastase
EP0200745A1 (en) Monoclonal antibodies and their use
CA1192152A (en) Highly-purified informatory ribonucleic acid (i-rna), a process of producing same and the use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AU BG BY CA CN CZ EE HU IL JP KR NO PL SK UA US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

AK Designated states

Kind code of ref document: C2

Designated state(s): AU BG BY CA CN CZ EE HU IL JP KR NO PL SK UA US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: C2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AU BG BY CA CN CZ EE HU IL JP KR NO PL SK UA US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002583573

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002739002

Country of ref document: EP

COP Corrected version of pamphlet

Free format text: PAGE 5/13, DRAWINGS, ADDED

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002739002

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10475706

Country of ref document: US