PT697891E - Compostos de polioximas e sua preparacao - Google Patents

Description

1 6n tu

Descrição “Compostos de polioximas e sua preparação” INTRODUÇÃO Campo Técnico [0001] A presente invenção refere-se genericamente a preparações homogéneas de poli-oximas e a preparações de heteropolioximas, sendo tais polioximas macromoléculas de estruturas definida que contêm um conjunto de ligações de tipo oxima, e refere-se também aos reagentes e aos métodos para construir tais moléculas.

Antecedentes da Invenção [0002] Tradicionalmente têm sido utilizados dois métodos para a produção de polímeros complexos tais como os polipeptidos. Um desses métodos assenta em reacções de polimerização relativamente descontroladas, em que as subunidades monoméricas reagem para produzirem polímeros grandes. Utilizando este método é possível produzir macromoléculas polidispersas, tais como polipeptidos e plásticos (v.g. polietileno ou ‘nylon’) a partir de resíduos monoméricos tais como aminoácidos ou pequenas moléculas orgânicas alifádcas ou aromáticas, respecti-vamente. Embora seja relativamente fácil produzir tais macromoléculas polidispersas, os produtos macroscópicos poliméricos não são homogéneos ao nível molecular, sendo antes misturas de polímeros com comprimentos diferentes e mesmo com uma composição diferente, v.g., como sucede num copolímero aleatório. Além disso, a semelhança dos homólogos produzidos em 2 tais preparações polidispersas faz com que seja difícil ou mesmo impossível obter um único produto de peso molecular elevado na sua forma pura.

[0003] O segundo método utilizado para a produção de macromoléculas complexas assenta na montagem sequencial de monómeros reversivelmente protegidos. Esta solução pode ser utilizada para a obtenção de produtos com uma estrutura definida, tipicamente linear. Infelizmente, este método está limitado pelo tamanho e também, de forma muito mais crítica, pela complexidade das moléculas que é possível produzir. Por exemplo, a síntese de poli-peptidos definidos ou de proteínas com mais de cerca de 50 a 80 resíduos aminoácidos está para além das possibilidades destas tecnologia. A condensação de péptidos protegidos, pre-viamente purificados, dois de cada vez, está limitada pelo insolubilidade dos grandes fragmentos protegidos. Em consequência, a síntese de polipeptidos homogéneos e lineares, por exemplo, está condicionada por um limite superior de cerca de 100 resíduos aminoácidos.

[0004] Mutter et al. (Proteins: Structure, Function and Genetics (1989) 5:13-21) sintetizaram polipeptidos de cadeia ramificada num processo de dois passos acoplando os aminoácidos protegidos a uma matriz peptídica sintética e protegida, ligada a uma resina, durante um processo de síntese de péptidos em fase sólida. Foi necessária uma desprotecção e uma clivagem para se obter uma proteína sintética montada numa matriz solúvel. Utilizando também a síntese de péptidos em fase sólida num processo de dois passos, Tam e Zavala (J. Jmmunol. Meth. (1989) 124:52-61) construíram matrizes de cadeia ramificada de tipo “árvore de lisina” com ramificações peptídicas, que receberam a designação de péptidos antigénicos múltiplos, tendo tais matrizes sido obtidas subsequentemente numa forma solúvel e impura após desprotecção com HF e clivagem. 3

[0005] Uma vez que os grupos de protecção utilizados na síntese de polipeptidos fazem diminuir geralmente a solubilidade da molécula protegível, a capacidade para condensar polipeptidos desprotegidos poderia constituir uma melhoria para resolver o problema da solubilidade que se observa quando são utilizados precursores protegidos e também para minimizar as dificuldades dos árduos métodos de desprotecção necessários para se conseguir obter um produto final. No entanto, a utilização de precursores desprotegidos origina o problema aparentemente incontomável da regioespecificidade. Assim sendo, foram feitas tentativas no sentido de se utilizar a condensação regioespecífica de fragmentos desprotegidos, mediante o recurso à ligação quimiosselectiva.

[0006] A ligação quimiosselectiva implica a utilização de pares complementares de grupos reactivos presentes nos locais específicos das moléculas precursoras que irão ser unidas entre si. A utilização de grupos reactivos que possuam reactividade química complementar, tais como um grupo tiol e um grupo bromoacetilo, dá origem à formação de uma ligação de uma forma regioespecífica. Por exemplo, as ligações quimiosselectivas de tipo tiol têm sido utilizadas para a preparação de péptidos multiantigénicos. Numa tentativa para se evitar os difíceis e árduos métodos de desprotecção e a formação de produtos impuros, devido à possível obstrução espacial entre braços peptídicos que estejam a crescer muito próximos uns dos outros durante a síntese progressiva em fase sólida, Drijfhout e Bloemhoff (Int. J. Pepíide Protem Res. (1991) 37:27-32) utilizaram o acoplamento quimiosselectivo de tipo tiol, mediante a sintetização de um péptido ramificado de tipo “árvore de lisina octaaminada” cujos grupos amino desprotegidos foram ampliados de modo a conterem grupos sulfidrilo protegidos (S--acetil-mercapto-acetilo), para um subsequente acoplamento a um péptido antigénico contendo um grupo sulfidrilo, convenientemente modificado. No entanto, o produto obtido 2%. tinha características medíocres, conforme definido por cromatografia em líquido de elevado rendimento, e não foi completamente caracterizado. Mais recentemente utilizou-se a química do tiol para a preparação, num processo de condensação de dois fragmentos, de um análogo funcional e linear, totalmente sintético, da protease dos VIH (Schnolzer e Kent (1992) Science 256:221-225).

[0007] Infelizmente, a química do tiol não é totalmente específica. Por exemplo, sabe-se perfeitamente que os grupos tiòl podem participar no arrastamento de pontes dissulfureto. Além disso, os agentes de alquilação, tais como bromoacetilo e maleoílo, podem reagir com grupos aminoácidos nucleofílicos diferentes de um grupo tiol. Por exemplo, o bromoacetilo pode reagir com uma cadeia lateral de resíduos metionina de um tioéter, limitando assim a homogeneidade e/ou a complexidade de concepção do produto pretendido.

[0008] Existe pois uma necessidade para que haja preparações, em particular preparações homogéneas, de macromoléculas facilmente sintetizadas que tenham uma estrutura definida, com pontes de ligação estáveis, e também é necessário dispor de reagentes e métodos para a elaboração destas preparações de macromoléculas, os quais proporcionem facilidade, rapidez e comodidade de síntese, possibilidade de produção em quantidade, versatilidade de concepção e aplicabilidade de fabrico, recorrendo à utilização de diversas classes de compostos bioquímicos. Além disso, é necessário que haja macromoléculas, em particular macromoléculas homogéneas, de estrutura definida que possam ser concebidas de modo a possuírem a actividade, a solubilidade e a conformação desejadas e ainda outras propriedades desejáveis, que apresentem componentes, tais como péptidos ou oligonucleótidos, numa forma polivalente e não linear, que tenham uma elevada afinidade de ligação e uma elevada especificidade de interacção e tais que possam ser obtidas, no caso das macromoléculas homogéneas, sob a forma de preparações homogéneas. 5 2% É também necessário que haja bancos de macromoléculas, tais como péptidos ou oligo-nucleótidos, que tenham as vantagens aqui descritas. A presente invenção satisfaz todas estas necessidades e proporciona também as vantagens afins.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção descreve preparações homogéneas de macromoléculas homogéneas facilmente sintetizadas e descreve também macromoléculas heterogéneas facilmente sintetizadas, possuindo tais macromoléculas uma estrutura definida e contendo um conjunto de ligações estáveis de tipo oxima, descrevendo também os reagentes e os métodos para a montagem rápida e específica de tais macromoléculas por ligação quimiosselectiva, mediante a formação de oximas.

[0010] As macromoléculas de estrutura definida compreendem uma molécula orgânica (aqui designada por placa de base) à qual irão ser ligadas outras moléculas (aqui designadas por MOCA) que possuem um conjunto de ligações oxima, de preferência pelo menos três, a um conjunto de segundas moléculas orgânicas complementares (MOCA). No caso das macromoléculas de homopolioximas, as MOCA são idênticas umas às outras. De acordo com outra variante, as ligações oxima possuem todas a mesma orientação. No caso das macromoléculas de heteropolioximas, a placa de base é acoplada a um conjunto de segundas moléculas orgânicas complementares, em que há pelo menos uma dessas segundas moléculas orgânicas acoplada à placa de base que é diferente das outras segundas moléculas orgânicas acopladas. A invenção proporciona também dois reagentes para a elaboração destas moléculas: as placas de base que possuem um conjunto de grupos reactivos formadores de dioximas e uma segunda molécula orgânica que possui um grupo reactivo ortogonal que é complementar, na 6 formação de ligação oxima, dos grupos reactivos ortogonais formadores da oxima presentes na placa de base. Para efeitos da presente invenção, as segundas moléculas orgânicas também são designadas, em alternativa, pela expressão ‘moléculas ortogonais complementares especi-ficamente activas (“MOCA”) com a definição que a seguir se indica. As ligações oxima proporcionam um sistema hidroliticamente estável de união de oligómeros ou de subunidades macromoleculares. Os diversos grupos reactivos são aqui designados por “grupos ortogonais”, o que significa que são complementares entre si no que diz respeito à reactividade e que não reagem com outros grupos funcionais presentes nos precursores da macromolécula que irá ser formada.

[0011] A presente invenção também proporciona métodos para a preparação de tais moléculas, incluindo a automontagem paralela que consiste em ligar quimiosselectivamente cada um dos diversos grupos reactivos ortogonais da placa de base ao seu grupo ortogonal reactivo complementar presente numa das diversas segundas moléculas orgânicas, através da formação de uma ponte oxima. A placa de base e as segundas moléculas orgânicas são formadas preferencialmente a partir de resíduos aminoácidos. De acordo com outras variantes, as placas de base e/ou as segundas moléculas orgânicas são formadas a partir de resíduos açúcar, resíduos de ácidos nucleicos e/ou lípidos ou compreendem também qualquer destes resíduos. As placas de base preferidas são preparadas em conformidade com processos da síntese química orgânica, de forma controlada, por exemplo, pelo processo da síntese de péptidos em fase sólida (“SPFS”) ou pelo processo equivalente para as placas de base que contenham ácidos nucleicos ou hidratos de carbono. As placas de base que possuem hidratos de carbono são isoladas preferencialmente a partir de fontes naturais ou recombinantes ou então são preparadas por via enzimática. As preparações homogéneas de péptidos isolados ou de 7

proteínas isoladas (preparados, por exemplo, por métodos recombinantes) também são adequadas para a prática das variantes em que são feitas as placas de base; no entanto, tais moléculas devem ser concebidas ou escolhidas de modo a conterem resíduos compatíveis com a modificação regjoespecífica subsequente, para se obter um conjunto de grupos reactivos ortogonais formadores de oximas e de modo a que seja mantida ainda uma estrutura definida e uma homogeneidade significativa a seguir à modificação regioespecífica. Assim sendo, as preparações de ghcoproteínas heterogéneas de anticorpos, subsequentemente modificadas por oxidação química ou enzimática dos resíduos açúcar, não são placas de base convenientes para as variantes da presente invenção.

[0012] A invenção proporciona também métodos para a utilização destes compostos de polioximas, incluindo a sua utilização como antigénios e imunogénios. A invenção proporciona ainda composições, incluindo composições farmacêuticas que incorporam estas preparações da presente invenção. Além disso, a invenção proporciona também as polioximas da invenção ou os reagentes para a sua síntese.

[0013] Os compostos de polioximas da invenção são macromoléculas relativamente complexas preparadas por via sintética. A espécie de maior massa até agora preparada é um complexo com aproximadamente 20 lcD que contém 195 resíduos aminoácidos: a octaoxima homopolioxima fonnada entre NH2OCH2CO-ELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR-OH (SEQ ID N° 10) e O = CH-CO-Gli3-[Lis(COCHO)]rGli-OH (SEQ 1D N° 9). Como é evidente para os especialistas na matéria, à luz dos preceitos da presente memória descritiva, é agora possível obter facilmente mesmo as moléculas maiores e mais complexas sob uma fornia homogénea e definida, tendo em conta os métodos rápidos, específicos, de elevado rendimento, ligeiros e versáteis para a preparação destes compostos em conformidade com a presente invenção. 8

DESCRIÇÃO ABREVIADA DOS DESENHOS

[0014] A figura 1 ilustra a estrutura da hexa-TCTP-polioxima. Conforme indicado, é acoplada uma TCTP-MOCA a cada um das cinco posições ε dos resíduos lisina na estrutura da placa de base e ao terminal N da estrutura da placa de base. A figura 2 mostra o cromatograma obtido por CLER-FI a partir de uma amostra obtida 3 horas antes do início da reacção de oximação. O pico 1 indica a fiacção que contém a TCTP--MOCA não ligada e o pico 2 indica a fiacção que contém o produto hexa-TCTP-polioxima. A figura 3 mostra o cromatograma obtido por CLER-FI com uma amostra 18 horas após o início da reacção de oximação. O pico 1 indica a fiacção que contém a TCTP-MOCA não ligada e o pico 2 indica a fiacção que contém o produto hexa-TCTP-polioxima. A figura 4 é uma fotografia de um gel de poliacrilamida que ilustra a migração do produto hexa-TCTP-polioxima. A coluna ou pista 1 corresponde aos padrões proteicos e a coluna ou pista 2 corresponde ao produto hexa-TCTP-polioxima. A figura 5 ilustra um espectro de massa obtido por espectrometria de massa por ionização por electropulverização, respeitante ao produto hexa-TCTP-polioxima. O eixo vertical indica o valor percentual da escala completa (EC) da resposta do detector (%EC); o eixo horizontal indica a relação entre massa e carga (M/Z). Os números assinalados em cada máximo (ou pico) indicam o valor M/Z de cada espécie de elevado peso molecular portadora de várias cargas positivas (protões). Por exemplo, o pico para M/Z = 1037,6 é portador de 10 protões (Z = 10). A massa (M) da espécie correspondente pode ser calculada pela expressão (10) x (1037,6) = 10376, menos 10 (por causa dos 10 protões), o que é igual a 10366 u.a.m.. O valor médio da massa, calculado para todos o sinais, é de 10367,41 ± 1,28. O valor teórico é de 10365,49. 70, l

Utilizou-se ο sistema de dados ‘Trio 2/3000 ESI’ (encontrado 10367,41 ± 1,28; calculado 10365,49). A figura 6 (estabilidade da hexaoxima dodecamérica(12-mero) feita com AOA dode-camérica (ΑΟΑ-12-mero)) mostra os cromatogramas obtidos por CLER-F1 com a hexa-TCTP--polioxima a seguir a uma incubação durante 48 horas a pH 2,1 (a), durante 24 horas a pH 4,6 (b) ou durante 30,5 horas a pH 7,0 (c). As setas indicam os tempos previsíveis de eluição para as penta-, tetra-, etc-TCTP-polioximas incompletas; não foram observados produtos parciais. A figura 7 ilustra a estrutura da hexa-Pep C-polioxima. Conforme indicado, é acoplada uma Pep C-MOCA a cada uma das cinco posições ε dos resíduos lisina na estrutura da placa de base e ao terminal N da estrutura de placa de base. A figura 8 mostra o cromatograma obtido por CLER-F1 com uma amostra retirada 18 horas após o início da reacção de oximação. O pico 1 indica a fracção que contém a Pep C--MOCA não ligada e o pico 2 indica a fracção que contém o produto hexa-Pep C-polioxima. A figura 9 (EM-IEP (o mesmo que ESI-MS) da Pep C-hexaoxnna) mostra um espectro de massa obtido por espectrometria de massa por ionização por electropulverização para o produto hexa-Pep C-polioxima. A figura 10 (EM-IEP da Pep C-octaoxima) mostra um espectro de massa obtido por espectrometria de massa por ionização por electropulverização para a substância octa-Pep C--polioxima. A figura 11 mostra a estrutura da hexa-TCTP-polioxima. Conforme indicado, é acoplada uma MOCA a cada uma das cinco posições ε dos resíduos lisina na estrutura da placa de base e ao terminal N da estrutura da placa de base. Veja-se a estereoquímica das pontes oxima, comparativamente com a estrutura ilustrada na figura 1.

As figuras 12A, 12B, 12C e 12D ilustram o espectro de massa e os pesos moleculares calculados que foram obtidos por espectrometria de massa por ionização por electropulverização, correspondentes a 4 produtos oxímicos. A figura 12A mostra o espectro da mono-oxima formada entre o tereftalaldeído da placa de base e o péptido NH2OCH2CO-Me-Asp-His(D-Phe)-Arg--Trp-Lis-OH (um análogo sintético da hormona estimuladora do melanócito α (“HEM”). A figura 12B mostra o espectro da homopolioxima formada entre o tereftalaldeído da placa de base e o péptido NH20CH2C0-Me-Asp-His(D-Phe)-Arg-Trp-Lis-0H. A figura 12C mostra o espectro da heteropolioxima (heterodímero) formada entre o tereftalaldeído da placa de base e os péptidos NH2 OCH2CO-Nle-Asp-His(D-Phe)-Arg-Trp-Lis-OH e NH2 OCH2CO-Lis-Leu--Glu-Glu-Gln-Arg-Val-Lis-Gli-OH (SEQID N° 4). A figura 12D mostra o espectro da heteropolioxima (heterodímero) formada entre o tereftalaldeído da placa de base e os péptidos NH2OCH2CO-Nle-Asp-His(D-Phe)-Arg-Trp-Lis-OH e NH2OCH2CO-Lis-Leu-Glu-Gln-Arg--Pro-Glu-Arg-Val-Lis-Gli-OH (SEQ ID N° 13). DESCRIÇÃO MINUCIOSA DA INVENÇÃO Definições [0015] Na presente invenção são utilizados os termos adiante definidos.

[0016] Define-se um “grupo ortogonal complementar quimicamente reactivo” como sendo um grupo de um par de grupos quimicamente reactivos, o qual reage quimioespecíficamente com o elemento complementar desse par. Por exemplo, os grupos amino-oxi-acetil (“AOA”) e ghoxililo (“GXL”) são grupos ortogonais quimicamente reactivos que reagem para formarem uma ponte oxima.

Zsi* [0017] A expressão “ quiraiosselectivamente ligado” indica a ligação específica que ocorre entre os grupos ortogonais complementares quimicamente reactivos.

[0018] O termo “ortogonal” designa as condições ou os grupos utilizáveis sem comprometer outros grupos presentes ou outras condições químicas que venham a ser aplicadas. Assim, a título de exemplo, no contexto da presente memória descritiva, os grupos amino-oxi--acetilo são ortogonais.

[0019] A expressão ‘'molécula ortogonal complementar específicamente activa” (“MOCA”) designa uma molécula que contém um grupo ortogonal complementar quimicamente reactivo e uma molécula específicamente activa ou uma sua parcela. De forma parcial, define-se uma MOCA pelo facto de possuir um grupo ortogonal complementar quimicamente reactivo capaz de se ligar quimiosselecti vamente ao grupo ortogonal complementar quimicamente reactivo presente numa estrutura da placa de base. Para efeitos da presente invenção, o grupo ortogonal complementar quimicamente reactivo de um MOCA deve ser um elemento de um par reactivo formador de uma ligação oxima. A expressão “específicamente activo” significa que a MOCA também possui uma actividade biológica, química ou física, para além da sua reactividade química ortogonal complementar. Assim, é óbvio que uma actividade definida e inerente de uma MOCA pode não ser imediatamente inferida a partir da própria estrutura da MOCA, antes da reacção com a placa de base para a formação do produto macromolecular final. Assim sendo, a abreviatura MOCA não tem por objecto limitar a natureza das segundas moléculas orgânicas, podendo ser utilizada para as designar em todos os casos. Além do mais, toda a actividade específica associada à segunda molécula orgânica pode ser activada ou realizada após o acoplamento à placa de base. 12 [0020] A expressão “actividade biológica específica” designa uma actividade biológica conferida a uma molécula ou a um grupo particular em virtude da sua estrutura. Uma actividade biológica específica pode ser exclusiva de uma molécula ou de um grupo particular ou pode estar associada aos elementos de uma família a que pertença essa molécula ou esse grupo particular.

[0021] Um especialista na matéria sabe certamente que uma actividade biológica específica também pode estar associada a moléculas ou grupos dissemelhantes, ou não afins, que possuam a mesma actividade biológica específica de uma molécula ou de um grupo particular. Por exemplo, um anticorpo anti-idiotípico pode ter a mesma actividade biológica específica do antigénio utilizado para a criação do anticorpo para o qual foi criado o anticorpo anti-idiotípico, mesmo que o anticorpo anti-idiotípico e o antigénio sejam estruturalmente dissemelhantes.

[0022] A expressão “reactividade química específica” qualifica uma actividade química conferida a uma molécula ou a um grupo particular em virtude da sua estrutura. Uma actividade química específica pode ser exclusiva de uma molécula ou de um grupo particular ou pode estar associada aos elementos de uma família a que pertença essa molécula ou esse grupo particular. Em alternativa, uma actividade química específica pode estar associada a um pequeno número de moléculas ou grupos estruturalmente dissemelhantes, ou não afins, que possuam a mesma actividade química específica de uma molécula ou de um grupo particular.

[0023] A expressão “montagem paralela” designa a reacção controlada multilocais que tem lugar quando um conjunto de segundas moléculas orgânicas (MOCA), possuidoras de um tipo de grupo ortogonal quimicamente reactivo, se liga quimiosselectivamente aos grupos ortogonais complementares quimicamente reactivos da estrutura da placa de base.

[0024] Uma molécula antigénica é uma substância, frequentemente um ARN ou um péptido que pode estimular um organismo animal para a produção de anticorpos e que se pode combinar específicamente com os anticorpos assim produzidos. A expressão ‘complexo anticorpo-antigénio’ designa um agregado molecular que é formado pela interacção específica de antigénios e de anticorpos.

[0025] Um anticorpo é uma glicoproteína do tipo globulina que se forma num organismo de um animal em resposta à administração de um antigénio e que é capaz de se combinar específicamente com esse antigénio. Estes também recebem a designação de imunoglobulinas. Os fragmentados de anticorpos podem conservar uma certa capacidade para se ligarem se-lectivamente ao seu antigénio ou hapteno. A capacidade de ligação com um antigénio, ou um hapteno, é determinada por ensaios de ligação do antigénio (ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane, eds., Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1988), obra que aqui se considera incorporada por referência). Tais fragmentos de anticorpos compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os fragmentos Fac, Fac’ e (Fac’)2. (o mesmo que Fab, Fab’ e (Fab^). Chama-se anticorpo natural aquele que é isolado a partir de um animal ou a partir de uma linhagem de células de um animal, eventualmente híbrido (hibridoma).

[0026] O termo ‘hapteno’ designa a parte de um antigénio que reage com os produtos imunitários de uma resposta imunitária, mas que não pode par si próprio induzir uma resposta imunitária sem ser complexado com um veículo para formar o antigénio completo. Os quelatos metálicos constituem um exemplo de um hapteno.

[0027] A expressão aqui utilizada “região determinante da complementaridade” (RDC) designa as sequências de aminoácidos, em qualquer das regiões de cadeia leve variável e de 14 cadeia pesada variável de um anticorpo, que formam a estrutura do elo tridimensional que contribui para a formação do local de ligação do antigénio ou do hapteno.

[0028] Um agente terapêutico é qualquer molécula que ao ser administrada a um animal evite ou mitigue uma doença ou interrompa ou mitigue um estado patológico no animal. Os agentes terapêuticos podefm ser, sem que isso constitua qualquer limitação, antitumorais, antibióticos, proteínas antivirais, radioisótopos, produtos farmacêuticos ou uma toxina.

[0029] Uma molécula multivalente é uma molécula que possui mais de um local de ligação para interacção entre moléculas. Como exemplo de uma molécula multivalente refere-se um imunogénio polivalente que contém múltiplos antigénios.

[0030] A expressão “veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico” designa qualquer dos veículos farmacêuticos convencionais, tais como um soluto salino tamponado com fosfato, a água ou uma emulsão, por exemplo, uma emulsão de tipo óleo/água, incluindo potencialmente diversos tipos de agentes humectantes.

[0031] O termo ‘administrado’ significa que o animal em causa recebeu uma quantidade eficaz do composto ou da composição farmacêutica. Os métodos de administração a uma animal são bem conhecidos pelos especialistas na matéria e compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a administração pelas vias oral, intravenosa, transdermal e parentética. A administração pode ser realizada continua ou intermitentemente, enquanto decorrem outros tratamentos. Os métodos para a determinação do sistema mais eficaz e da dosagem de administração mais conveniente são bem conhecidos pelos especialistas na matéria e podem variar consoante o composto ou a composição de tratamento, a finalidade da terapia e o animal ou paciente que esteja a ser tratado. 15 7ϋ [0032] Os termos ‘péptido ou proteína’ designam tanto as formas que ocorrem naturalmente como as formas recombinantes e também outras formas de péptidos ou de proteínas que não ocorram naturalmente e que sejam suficientemente idênticas aos péptidos ou às proteínas que ocorrem naturalmente, de modo a possuírem uma actividade química ou biológica semelhante. Conforme é sabido na especialidade, os péptidos podem ser formados a partir de resíduos aminoácidos que ocorram de forma não natural ou que sejam não proteinogénicos. Além disso, conforme também é sabido na especialidade, os resíduos aminoácidos podem ser unidos através de ligações de tipo não amida. Os péptidos ou as proteínas também podem conter grupos de protecção em qualquer dos seus terminais para impedir ou minimizar a degradação do péptido ou da proteína in vivo.

[0033] A expressão “composição de polioximas homogéneas” da invenção qualifica uma composição química em que praticamente todas as moléculas polioxímicas possuem estruturas químicas idênticas (em contraste com um polímero orgânico típico em que cada uma das moléculas difere de outra pelo menos pelo seu comprimento e frequentemente pela sua estrutura específica, tal como sucede num copolímero aleatório). Tais composições também podem ser designadas por composições “autoidênticas”, na medida em que praticamente todas as moléculas que constituem a polioxima são idênticas entre si. No caso vertente, a expressão “praticamente todas” significa que há pelo menos 80% das moléculas da placa de base que possuem o mesmo número de MOCA idênticas acopladas a essa placa de base. Os graus cada vez maiores de pureza, tais como 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, etc., aproximando-se cada vez mais de 100, são significações de preferência cada vez maior para a expressão “praticamente todas”. Conforme aqui descrito na parte restante da presente memória descritiva, para uma heteropolioxima nem todas as MOCA de uma única placa de base irão ?&< ser idênticas, pese embora o facto de a composição poder ser homogénea, tal como aqui definido. Conforme é facilmente compreensível à luz dos preceitos da presente invenção, a composições de polioximas homogéneas podem compreender homopolioximas ou heteropoli-oximas. Por exemplo, a montagem progressiva permite a introdução de uma MOCA diferente em cada passo, para se criar uma composição homogénea de uma heteropolioxima. As preparações heterogéneas de polioximas podem ser produzidas deliberadamente, utilizando uma mistura de diferentes MOCA durante um passo de oximação, por exemplo, ao ser criado um banco peptídico de polioximas ou ao fazer o acoplamento de uma mistura de MOCA constituída por moléculas de uma série homóloga.

[0034] O termo “macromolécula” aqui utilizado designa uma molécula orgânica (o qual compreende as moléculas de origem biológica e também as moléculas orgânicas com componentes inorgânicos) que possuam um peso molecular não inferior a 2000, de preferência não inferior a 5000 e mais preferencialmente não inferior a 10000.

Descrição [0<K35] A presente invenção proporciona novas moléculas multivalentes de estrutura definida que compreendem um conjunto de ligações estáveis de tipo oxima, proporciona composições homogéneas dessas moléculas e os reagentes e os métodos para uma montagem rápida e específica de tais moléculas por ligação quimiosselectiva através da formação de oximas. Para os propósitos da presente invenção tais moléculas são designadas genericamente por polioximas. A invenção proporciona tanto homopolioximas como heteropolioximas. Os compostos de homopolioximas compreendem uma molécula de uma placa de base orgânica que possui um conjunto de ligações de tipo oxima, de preferência pelo menos três, a um conjunto de segundas moléculas orgânicas. De acordo com uma variante, todas as ligações de tipo oxima têm a mesma orientação. Os compostos de heteropolioximas compreendem uma molécula de uma placa de base orgânica que possui um conjunto de ligações de tipo oxima, de preferência pelo menos três, a um conjunto de segundas moléculas orgânicas, em que pelo menos uma das segundas moléculas orgânicas ligada à placa de base possui um composição química diferente de outra segunda molécula orgânica ligada à placa de base. As placas de base são moléculas orgânicas que possuem um conjunto de grupos reactivos ortogonais formadores de oximas que podem reagir quimiosselectivamente com o seu grupo reactivo ortogonal complementar presente numa qualquer das diversas segundas moléculas orgânicas. As composições homogéneas de polioximas são formadas por reacção através da formação de uma ligação de tipo oxima de um grupo reactivo ortogonal complementar, numa placa de base, ao seu grupo reactivo ortogonal complementar numa segunda molécula específícamente activa. De acordo com uma variante preferencial da invenção, a estrutura da placa de base é um péptido que possui uma armação formada por resíduos aminoácidos. Conforme é sabido na especialidade, os péptidos que contêm aminoácidos que ocorrem de forma não natural ou isómeros ópticos D ou aminoácidos substituídos (v.g. N-substituídos), aminoácidos β ou quejandos podem ser preparados por síntese química; os péptidos que contêm aminoácidos invulgares podem ser preparados por técnicas recombinantes, mas são produzidos normalmente por síntese química ou por modificação pós-expressão. A armação da placa de base peptídica compreende os resíduos aminoácidos que possuam na cadeia lateral grupos adequados para serem modificados durante a síntese peptídica para darem origem a grupos reactivos ortogonais complementares formadores de oximas. Os grupos quimicamente reactivos que podem formar ligações de tipo oxima com um grupo complementar quimicamente reactivo ou

com uma MOCA estão presentes preferencialmente pelo menos em três dos resíduos aminoácidos da placa de base. Os resíduos aminoácidos podem ser incorporados durante a formação da ligação peptídica, sob a forma de monómeros modificados que contêm grupos quimicamente reactivos formadores de oximas, ou podem ser modificados a seguir à formação das ligações peptídicas, para conterem tais grupos. Os resíduos vulgares preferidos para o transporte dos grupos formadores de oximas podem ser aqueles que se encontrem disponíveis numa forma diferencialmente protegida, possam ser facilmente modificados por métodos convencionais e que proporcionem derivados estáveis. Os resíduos preferidos são a lisina e a omitina cuja acilação é muito fácil e que podem ser modificados por acilação redutiva, e ainda os resíduos cisterna que podem ser modificados por alquilação ou por formação de dissulfureto. São menos preferidos os resíduos serina, treonina, histidina, metionina (que podem ser alquilados), tirosina (que pode ser alquilada, mas cujos derivados acilados não são muito estáveis) e o triptofano (que pode ser alquilado ou acilado). Os resíduos também podem ser seleccionados de modo a conferirem as desejadas propriedades físicas ou biológicas, v.g., separação, carga ou solubilidade. Também são preferidos os resíduos portadores de um grupo formador de oximas que sejam homólogos desses aminoácidos, de isómeros D em vez de isómeros L, de derivados substituídos (v.g. N-substituídos) e de aminoácidos β.

[0036] No caso das heteropolioximas, todas as MOCA ligadas quimiosselectivamente a uma placa de base podem ser, de forma independente, iguais entre si ou diferentes umas das outras. Há outras variantes que contêm as placas de base e/ou as MOCA formadas na totalidade ou parcialmente a partir de resíduos açúcar, resíduos de ácidos nucleicos e/ou lípidos. Conforme é evidente a partir da descrição da presente invenção, quase todos os resíduos de blocos de construção de oligomoléculas ou macromoléculas podem ser utilizados para a formação de uma MOCA ou de uma placa de base. Como é evidente para os especialistas na matéria, à luz dos preceitos da presente memória descritiva, é agora possível obter facilmente mesmo as moléculas maiores e mais complexas, tendo em conta os métodos rápidos, específicos, de elevado rendimento, cómodos e versáteis para a preparação destes compostos.

[0037] De acordo com uma variante, a placa de base ou a MOCA é concebida e preparada por métodos recombinantes ou isolada a partir de fontes naturais, tendo lugar a formação de um grupo reactivo ortogonal complementar formador de oxima específícamente num local do terminal C do polipeptido por proteólise reversa selectiva catalisada por uma enzima, ou num resíduo serina ou treonina no terminal N por oxidação suave. (Ver, por exemplo, Georghegan et al. (Bioconjugate Chem. (1992) 3:138-146), Gaertner et ai, (Bioconjugate Chem. (1992) 3:262-268), EP 243929 e WO 90/02135, documentos estes que se consideram aqui incorporados por referência). Para efeitos de utilização como placa de base multivalente, recorre-se a uma preparação homogénea de péptidos recombinantes ou naturais que possuam preferencialmente múltiplos terminais C ou N, tal como ocorreria com um dímero ou um tetrâmero, por razões de facilidade de formação específica dos grupos reactivos ortogonais. Por exemplo, é possível juntar um análogo de insulina, que possua uma cadeia A ligada de forma covalente a uma cadeia B, em que cada uma das cadeias possui um resíduo serina (ou treonina) no terminal N, a uma placa de base de um aldeído divalente por oxidação regiosselectiva. De acordo com uma outra variante, é possível modificar os terminais C por proteólise reversa catalisada por uma enzima, para assim se criar uma placa de base de trialdeído ou tetraldeído. Tais placas de base possuem pelo menos as vantagens relativas a tamanho e complexidade, comparativamente com as placas de base de péptidos obtidos por síntese em fase sólida. Conforme aqui explicitado, os especialistas na matéria passam a ter uma grande flexibilidade para conceberem e para obterem as placas de base e as MOCA de sequência, estrutura e actividade desejada, com grupos reactivos complementares montados de forma específica. As polioximas e os métodos para as correspondentes síntese foram desenvolvidos nos laboratórios dos inventores da presente invenção, conforme descrito por Rose (J. Amer. Cherrt. Soc. ‘Tadle synthesis of artificial proteins” (1994) 116:30-33, considerando-se tais trabalhos aqui incorporados por referência).

[0038] Embora as estruturas preferidas das placa de base ou das MOCA sejam feitas tipicamente a parir de resíduos aminoácidos, há outras variantes em que são formadas a partir de resíduos açúcar, resíduos de ácidos nucleícos e/ou lípidos.

[0039] No caso da estrutura da placa de base ou da MOCA ser um péptido, os grupos químicos terminais são normalmente um grupo amino e um grupo carboxilo. Um especialista na matéria sabe que é possível fazer com que tais grupos terminais sejam reactivos ou não reactivos. Os grupos não reactivos podem ser não reactivos devido ao facto de estarem quimicamente protegidos e é possível fazer com que fiquem reactivos realizando uma operação de desprotecção ou modificando de qualquer outra forma esses grupos, conforme aqui explicado e conforme é sabido na especialidade. Em alternativa, os grupos químicos terminais de uma placa de base podem ser ligados de forma covalente a uma resíduo contido na estrutura da placa de base para dar origem a uma estrutura da placa de base cíclica.

[0040] De acordo com uma das suas variantes, a presente invenção proporciona uma estrutura de placa de base em que um dos grupos reactivos complementares, capazes de participarem na formação de uma ligação de tipo oxima, é um grupo amino-oxi ou um grupo aldeído. São preferíveis os grupos amino-oxi-acetilo (“AOA”) ou os grupos aldeído, tais como OHC-CO-, ou glioxililo (“GXL”). Com efeito, é possível utilizar uma estrutura adicional (símbolos XC na fórmula) que vai ligar um grupo aldeído (ou um grupo amino-oxi) a uma j%f21 estrutura relevante: v.g. OCH-X-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lis-OH, em que o símbolo X pode representar simplesmente -CO- ou pode representar uma estrutura mais elaborada; ou NH2 -0-X-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lis-OH, em que o símbolo X pode representar simplesmente -CH2-CO ou uma estrutura mais elaborada.

[0041] No caso de os grupos aldeído estarem na placa de base, então os grupos presentes na estrutura de união adicional adjacente à função aldeído não são críticos; no entanto, como restrição impõe-se que estes grupos não interfiram com a formação da ligação oxímica entre o aldeído e o seu grupo amino-oxi complementar. De preferência, não devem reagir com o grupo aldeído nem com o grupo amino-oxi, e também não devem constituir um obstáculo espacial à reacção nem devem desactivar os grupos reactivos. O grupo de ligação não reage com outras funções presentes, mas se for concebido para reagir, então não o deve fazer de forma indesejável (isto é, de uma fornia que reduza a homogeneidade ou a actividade do produto).

[0042] O grupo de ligação é preferencialmente um grupo não reactivo seleccionado entre grupos aromáticos ou alifáticos substituídos ou insubstituídos, tais como os radicais fenilo ou alquileno (Ci-Qo), grupos alquilo(Ci-Cio) ou uma sua combinação ou ainda uma cadeia de aminoácidos (tal como uma articulação flexível ou uma sequência helicoidal (ver, por exemplo, Aigos, J. Mol. Biol. (1990)211;:943-958), ou uma cadeia de nucleótidos ou uma cadeia de açúcar ou uma cadeia de lípidos ou uma sua combinação, e pode conter heteroátomos.

[0043] No caso de os grupos amino-oxi estarem na placa de base, então os grupos funcionais presentes na estrutura de ligação adicional adjacente à função amino-oxi não são críticos; no entanto, uma restrição imposta a estes grupos de ligação consiste no facto de não poderem interferir com a formação da ligação oxímica entre o grupo amino-oxi e o seu grupo aldeído complementar. De preferência, não devem reagir com o grupo amino-oxi nem com o aldeído e não devem constituir um obstáculo espacial à reacção nem devem desactivar os grupos reactivos.

[0044] A análise descritiva anterior respeitante aos grupos funcionais presentes na estrutura de ligação adicional adjacente à função aldeído ou a função amino-oxi presente nas placas de base aplica-se aos grupos de ligação nas MOCA.

[0045] No caso de a polioxima ser utilizada para fins antigénicos ou imunogénicos, é evidente para um especialista na matéria que devem ser escolhidos grupos que não sejam fortemente imunogénicos. No caso da polioxima vir a ser utilizada para efeitos de ligação, os grupos de união preferidos aumentam ou pelo menos não interferem com propriedades tais como ligação, avidez, estabilidade ou solubilidade do produto.

[0046] O grupo de ligação deve ser escolhido de forma a aumentar a estabilidade hidrolítica da ligação oxímica. A estabilidade hidrolítica das oximas é influenciada pela sua estrutura; os dados indicam que a estabilidade da oxima aumenta segundo a relação seguinte: -C0-NH-CH2-CH2=N-0-CH2< -NH-CO-CH=N-0-CH2 < -C6H4-CH=N-0-CH2.

[0047] Também são aplicáveis as particularidades de um grupo de união quando as placas de base e as MOCA são feitas a partir de resíduos açúcar, ou de resíduos de ácidos nucleicos ou de resíduos lipídicos.

[0048] As placas de base da presente invenção também compreendem facultativamente resíduos que não sejam capazes de formar ligações de tipo oxima com uma MOCA Tais resíduos podem proporcionar um afastamento suficiente entre grupos reactivos complementares, por fornia a acomodar as grandes MOCA. Além disso, tais resíduos, quando localizados convenientemente, podem proporcionar outras particularidades desejáveis, conforme é sabido, ou conforme pode ser determinado pelas sequências de tais resíduos, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a possibilidade de conferirem a desejada conformação terciária, restrições de tipo conformacional, lateralidade (por exemplo, mediante a formação de uma hélice anfipática), criação de uma armação (tal como a que é proporcionada pelos minicorpos de polipeptidos montados artificialmente), maior solubilidade, lipofilicidade, actividade biológica ou função. Como exemplos de tais resíduos quimicamente inertes, refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os resíduos de aminoácidos, açúcares e nucleótidos. Qualquer especialista na matéria sabe perfeitamente distinguir os diversos métodos para antever quais as estruturas secundárias e mesmo terciárias de moléculas complexas, segundo técnicas aplicáveis ao projecto e concepção de placas de base em conformidade com variantes da invenção que possuam a funcionalidade desejada.

[0049] No caso de a estrutura da placa de base compreender um péptido, qualquer especialista na matéria sabe que essa estrutura peptídica da placa de base irá ter uma conformação em solução que vai depender parcialmente da sequência de aminoácidos do péptido. Tal informação é útil para se determinar qual a sequência óptima de aminoácidos da estrutura peptídica da placa de base para um fim específico. Por exemplo, é possível sintetizar uma estrutura peptídica da placa de base de maneira a formar uma estrutura em hélice a, de tal modo que os resíduos aminoácidos que contêm os grupos quimicamente reactivos ortogonais complementares se desenvolvam a partir da mesma face da hélice α. A partir da ligação quimiosselectiva com uma MOCA, a região específicamente activa de cada MOCA irá desenvolver-se na mesma direcção. Qualquer especialista na matéria sabe que há outros tipos de conformações que os péptidos específicos podem assumir em solução, sendo por isso possível sintetizar polioximas que possuam a desejada estrutura terciária, incluindo o desejado 24 afastamento entre as MOCA adjacentes. A título de exemplo, refere-se que há placas de base peptídicas sintéticas, métodos de concepção de péptidos e outras considerações de natureza sintética que foram parcialmente descritos e exemplificados por Altmann e Mutter (Int. J. Biochem. (1990) 22:947-956) e nas referências literárias ali citadas.

[0050] Uma “árvore de lisina” formada por síntese de péptidos em fase sólida, conforme ilustrado por Tam e Zavala (J. Immunol. Meth (1989) 124:52-61), obra que aqui se considera incorporada por referência, é adequada para ser utilizada na formação de uma placa de base, se for modificada conforme aqui descrito, de modo a conter grupos reactivos ortogonais complementares formadores de oxima, os quais podem ter a mesma orientação. Em alternativa, é possível formar uma estrutura de placa de base a partir de um modelo, tal como a utilizada para a “proteína sintética montada num modelo” (“PSMM”), conforme descrito, por exemplo, por Floegel et al. (Biopolymers (1992) 32:1283-1310), obra que aqui se considera incorporada por referência, se a modificação for efectuada como aqui descrito, de modo a conter grupos reactivos ortogonais complementares formadores de oxima, os quais podem ter a mesma orientação. Os carbobastonetes de extremidades funcionalizadas com grupos aldeído ou amino-oxi podem servir de placas de base divalentes ou em alternativa podem servir de MOCA. Os carbobastonetes, que são preparados sob a fornia de moléculas homogéneas com um comprimento discreto e uma estrutura definida, podem ser modificados com uma funcionalidade específica do grupo terminal (ver Moore, (1993) Nature 361:118-119, e nas obras ali citadas, considerando-se todos estes trabalhos aqui incorporados por referência).

[0051] No caso de a placa de base ser formada a partir de aminoácidos, a sequência peptídica de uma estrutura da placa de base pode ser sintetizada por processos vulgares de síntese de péptidos em fase sólida (“SPFS”) e é possível acrescentar, enquanto o péptido

25 ainda estiver acoplado à fase sólida, ácido Boc-amino-oxiacético (Boc-AOA) numa forma activada, tal como o éster de N-hidroxi-succmimida, à cadeia peptídica nascente. Por exemplo, a estrutura da placa de base pode ser constituída por um péptido que tenha cinco grupos reactivos, tais como cinco resíduos lisina. O éster de N-hidroxi-succinimida do ácido Boc-AOA pode reagir com cada um dos grupos arnino ε dos resíduos lisina e também com qualquer grupo amino cc do terminal N, se estiver desprotegido, para formar a estrutura da placa de base que poderia conter, segundo este exemplo, uma sequência ε-ΑΟΑ-pentalisina e um grupo AOA no terminal N, se o grupo amino α do terminal N fosse intencionalmente acilado.

[0052] Em alternativa é possível utilizar Boc-Ser(benzil)-OH ou Boc-Ser(t-butil)-OH numa forma activada, tal como um éster de N-hidroxi-succinimida, para formar o grupo quimicamente reactivo ortogonal complementar na estrutura da placa de base. O éster de N--hidroxi-succinimida de Boc-serina (benzilo) reage com os grupos amino ε dos cinco resíduos lisina e também com o grupo amino <x do terminal N, se desejado, para formar uma placa de base precursora que contém ε-Ser-pentalisina e um grupo α-Ser no terminal N. O tratamento da placa de base precursora com um agente de oxidação suave, tal como um periodato a pH 7, vai converter ε-Ser-pentalisina e também, se estiver presente, o grupo a-Ser do terminal N em ε-GXL-petalisina e num grupo α-GXL no terminal N, respectivamente, produzindo assim uma estrutura de placa de base hexa-GXL.

[0053] É possível terminar a reacção de oxidação utilizando qualquer composto de 1,2-diol ou l-amino-2-ol ou l-ol-2-amino que tenha uma rotação relativamente livre em tomo da ligação em 1,2, tal como o etileno-glicol. Em alternativa, é possível terminar a reacção de oxidação por remoção rápida do periodato, por exemplo, por cromatografia em líquido de elevado rendimento de fase inversa (CLER-FI). Uma vez que a reacção de oxidação apenas tem lugar com resíduos serina que possuam um grupo amino primário, apenas os resíduos ε-serina e os resíduos serina do terminal N do péptido são convertidos em glioxililo. Qualquer especialista na matéria conhece os métodos para proteger quimicamente um resíduo serina no terminal N contra a oxidação, se tal protecção for desejável.

[0054] A seguir à conversão dos resíduos ε-serina e α-serina em grupos GXL, pode ter lugar uma reacção de oximação entre a estrutura da placa de base-GXL e uma MOCA-AOA complementar, a pH 4,6, para assim se formar uma polioxima. As oximas formam-se num intervalo amplo de valores de pH e formam-se rapidamente a valores de pH sensivelmente inferiores a pH 5. A intensidade de formação da polioxima pode ser verificada por CLER-FI e a reacção pode ser terminada por CLER-FI preparativa. É possível determinar o peso molecular do composto resultante por espectrometria de massa por ionização por electropulverização. Em alternativa, é possível utilizar uma estrutura de placa de base-AOA e pode ter lugar uma reacção de oximação entre a estrutura de placa de base-AOA e um conjunto de MOCA que possuam um grupo aldeído.

[0055] Sn alternativa, a oximação tem lugar a valores de pH inferiores a 4,6. Os valores de pH mais baixos podem ser vantajosos por razões de solubilidade de alguns péptidos. E preferível um valor de pH igual a 2,1 para aumentar a solubilidade de alguns péptidos, v.g. ammo-oxi-acetil-YREDGVTPYMIFFKDGLEMEK-OH (SEQID N° 12). Além disso, a reacção de oximação ocorre muito mais rapidamente a pH 2,1 do que a pH 4,6. Qualquer especialista na matéria é capaz de determinar o valor de pH em função do perfil de solubilidade das MOCA e das placas de base para a formação de polioximas e também é capaz de escolher um valor adequado de pH para uma reacção de oximação específica, tomando em consideração a estabilidade das moléculas em função dos valores do pH durante o período de duração da reacção de oximação.

[0056] Os grupos quimicamente reactivos ortogonais complementares presentes na estrutura da placa de base são úteis para ligar quimiosselectivamente uma MOCA à estrutura da placa de base para criar uma polioxima. Por exemplo, no caso de a estrutura da placa de base conter grupos AOA e a MOCA conter um grupo aldeído, tal como um grupo gliolxililo (GXL), a oximação devida à ligação quimiosselectiva dos grupos quimicamente reactivos ortogonais complementares tem lugar rapidamente e de forma quase quantitativa na formação de uma preparação homogénea de uma polioxima de estrutura definida.

[0057] Nas variantes respeitantes às heteropolioximas em que a placa de base contém potencialmente tanto grupos aldeído como grupos amino-oxi quimicamente reactivos, por exemplo, qualquer dos grupos AOA e GXL, um dos grupos pode ser protegido durante a ligação quimiosselectiva de uma primeira MOCA que possua um grupo quimicamente reactivo ortogonal complementar com o grupo desprotegido formador da oxima na placa de base. Os grupos de protecção estão indicados nos exemplos subsequentes. Depois é possível efectuar então uma segunda ligação quimiosselectiva, a seguir à desprotecção dos grupos protegidos na estrutura da placa de base. Mais facilmente, é possível formar uma primeira ponte oxima (ou um conjunto de pontes) antes da conversão de Ser em GXL, após o que é possível formar uma segunda ponte oxima (ou um conjunto de pontes) através dos grupos GXL recém-formados. Sabe-se que a ponte oxima é estável durante a oxidação pelo periodato de Ser em GXL. Deste modo, é possível formar heteropolioximas muito complexas. De acordo com uma variante preferencial, uma placa de base contém um ou vários resíduos lisina que possuem um grupo ε-ΑΟΑ e um ou vários segundos resíduos lisina que possuem um grupo ε-Ser, em que a síntese da 28 polioxima tem lugar mediante uma primeira oximação através do grupo AOA, seguindo-se a oxidação de Ser em GXL e uma subsequente segunda oximação. Em alternativa, a placa de base pode ser concebida de modo conformacional para impedir a formação de oxima intramolecular, podendo ainda a concentração da placa de base e a razão entre placa de base e as MOCA serem ajustadas para minimizar a polimerização da placa de base.

[0058] Também são obtidas heteropolioximas fazendo reagir uma placa de base, que possua grupos reactivos uniformes, com uma mistura de MOCA (aqui designada por população de MOCA).

[0059] De acordo com uma outra variante, uma placa de base pode ter pelo menos um resíduo do terminal da placa de base acoplado a um grupo repórter ou a um grupo ligador, tipicamente através de uma ligação não oxímica. O grupo ligador ou repórter pode ser ligado quimiosselectivamente ao terminal da placa de base ou em alternativa pode ser acrescentado durante a síntese da placa de base. É possível ligar uma polioxima que contenha um grupo ligador ortogonal a uma segunda polioxima que contenha o seu grupo de ligação ortogonal complementar para se obter um dímero de polioxima. Com a excepção da complementaridade dos grupos de ligação, as polioximas podem ser iguais ou diferentes.

[0060] Uma MOCA individualizada é uma molécula orgânica (que pode conter um constituinte inorgânico), tal como um péptido, um polipeptido, um lípido, um oligossacárido, uma sequência de ácidos nucleicos ou uma combinação destas estruturas moleculares. De forma adequada, os carbobastonetes modificados nas extremidades constituem MOCA adequadas. De acordo com uma variante da presente invenção, a formação da oxima tem lugar através dos grupos aldeído terminais para os açúcares redutores ou criados nos açúcares por oxidação enzimática ou química suave. De acordo com outra variante, a formação de oxima tem lugar

29 através de um grupo aldeído criado por oxidação terminal de ácido nucleico, por exemplo, conforme exemplificado por Reines e Cantor (Nucleic Acids Res. (1974) 1:767-786) para o ARN, obra que aqui se considera incorporada por referência, ou criado durante a síntese química ou enzimática de uma sequência de ácidos nucleicos. Tais aldeídos são grupos reactivos complementares adequados para a formação de oximas.

[0061] De acordo com uma variante da formação de homopolioximas da invenção, uma MOCA é um péptido. De acordo com outra variante, uma MOCA, e consequentemente a própria polioxima, é antigénica, de preferência imunogénica. De acordo com uma variante das heteropolioximas da presente invenção, há pelo menos uma MOCA que é um péptido. De acordo com outra variante das heteropolioximas, há pelo menos uma MOCA de uma polioxima, e consequentemente a própria polioxima, que é antigénica, de preferência imunogénica. As polioximas antigénicas são úteis in vitro e in vivo. In vitro as polioximas antigénicas são úteis, por exemplo, como reagentes para imunoensaios. In vivo, as polioximas antigénicas servem, por exemplo, de imunogénios úteis como vacinas. De acordo com outra variante da presente invenção, uma polioxima com uma MOCA hapténica ou peptídica antigénica proporciona uma molécula antigénica que possui uma valência maior comparativamente com o péptido por si só, e possui também uma maior imunogenicidade. A polivalência conduz geralmente a uma ligação superior e a uma especificidade superior de interacção, uma vez que estão implicados mais contactos. No caso de uma polioxima possuir múltiplas cópias de um ligando a um receptor, então os receptores proximais podem ser ligados por meio de pontes se o afastamento e a orientação da MOCA proporcionados pela placa de base forem adequados.

[0062] Tendo em conta a presente memória descritiva, qualquer especialista na matéria pode obter uma MOCA que possua o adequado grupo quimicamente reactivo complementar.

30

Por exemplo, é possível sintetizar uma molécula específicamente activa tal como uma MOCA peptídica purificada, por SPFS. A seguir, ou durante a síntese do péptido, é possível acoplar ao péptido um grupo de um par de grupos quimicamente reactivos ortogonais e complementares formadores de oxima, utilizando os métodos descritos para a síntese das estruturas das placas de base. Também é possível utilizar outros métodos bem conhecidos na especialidade para a preparação de aldeídos polipeptídicos, tais como a síntese automática de aldeídos no terminal C dos péptidos (ver por exemplo, Murphy et al, J. Amer. Chem. Soc.) (1992) 114:3156-3157, obra que aqui se considera incorporada por referência). Os grupos quimicamente reactivos ortogonais complementares formadores de oxima podem ser acoplados quer sob uma forma protegida quer sob uma fornia não protegida. Os métodos para acoplar um grupo quimicamente reactivo artogonal complementar formador de oxima a uma MOCA compreendem o acoplamento através de um grupo quimicamente reactivo de uma cadeia lateral. Por exemplo, é possível acoplar um grupo quimicamente reactivo ortogonal complementar formador de oxima a uma MOCA que contenha cisteína, através de um átomo de S, por alquilação ou mediante a formação de dissulfureto. Depois, após a oximação numa placa de base, tem lugar o acoplamento da MOCA pelo seu resíduo Cis através de uma ligação tioéter (ou ponte dissulfureto) e de uma ligação oxima à placa de base. Os compostos de alquilação preferidos são halogenetos de alquilo aos quais esteja acoplado um grupo AOA. São preferíveis os compostos Br--CH2CO-NHCH2CH2NH-CO-CH2-O-OH-B0C, em que 0 grupo AOA é protegido e pode ser removido antes de um passo de oximação, e Br-CH2-CO-NHCH2CH2NH-CO-CH2-0-NH2. Outro agente de alquilação é Br-CH2CH2NH-COCH2ONH-Boc. O grupo bromoacetilo é muito mais reactivo para alquilação do grupo tiol, por exemplo, dos resíduos Cis. Menos preferível é o grupo iodoacetilo, porque às vezes é muito reactivo e pode ser perdido por fotólise. Há 31 31

outros grupos de alquilação para além do grupo bromoacetilo, entre os quais está o grupo maleoílo. Conforme aqui se explica, como exemplos de ligadores para a modificação de proteínas, utilizando este grupo, refere-se os ligadores AOA-Lis(maleofl-p-alanil)-OH e maleoíl-P-alanil-NHCH2CH2NH-C0CH20NH2. Embora o grupo maleoílo seja útil para fazer conjugados macromoleculares, sabe-se que tem problemas delicados de estabilidade (abertura hidrolítica do anel) e por tal motivo é menos adequado para a preparação de polioximas homogéneas. Além disso, a alquilação envolvendo o grupo maleoílo dá origem a um ligador que é mais rígido e mais volumoso do que a ligação formada por alquilação com um grupo bromoacetilo, o que faz com que seja mais visível pelo sistema imunitário. O ligador preferido para aplicação in vivo é um ligador contra o qual não seja dirigida uma resposta imunitária. Como exemplos de compostos para acoplamento de grupos quimicamente reactivos ortogonais complementares formadores de oxima à cadeia lateral da cisteína, através de uma ponte dissulfureto, refere-se aqueles que contêm um radical 2-piridil-S-S-. Como exemplos preferidos indica-se 2-piridil-S-S-CH2CH2NH-CO-CH2-0-NH-Boc e 2-piridil-S-S-CH2CH2NH--C0-CH2-0-NH2. Os derivados resultantes que contêm Cis possuem um grupo amino-oxi--acetilo (ou amino-oxi-acetílo protegido) acoplado por meio de uma ponte dissulfureto. A modificação aqui descrita é útil para ligar as MOCA a uma placa de base polialdeídica por uma cadeia lateral de Cis através de pontes dissulfureto e oxima. Com esta forma de acoplamento, as MOCA, v.g. os péptidos, podem ser libertados da placa de base por redução do dissulfureto, processo este sobre o qual se sabe que ocorre no corpo. Tal libertação dos péptidos pode aumentar uma resposta imunitária contra a manifestação final do epítopo correspondente no agente patogénico natural. As polioximas proporcionam diversas vantagens comparativamente com os imunogénios peptídicos pequenos (ou não péptidos), uma vez que

as moléculas pequenas são normalmente incorporadas com dificuldade pelas células do sistema imunitário e reconhecidas como alienígenas sem acoplamento a um veículo, v.g. uma proteína tal como a hemocianina dos moluscos gastrópodes. A placa de base polioxímica da própria polioxima pode proporcionar uma eficiente manifestação homogénea da molécula pequena e pode constituir uma fonte de “epítopos auxiliares” para estimular o sistema imunitário. Ao unir diversas cópias de um péptido pequeno conjuntamente numa placa de base, produz-se uma macromolécula que é “vista” pelo sistema imunitário e que é transformada, mesmo por degradação, para ser apresentada ao sistema imunitário e reconhecida por este.

[0063] Noutras variantes da invenção, uma heteropolioxima contém simultaneamente péptidos de ligação para encaminhamento (v.g. análogos de somatostatma que se ligam aos tumores que exprimem de forma excessiva os receptores da somatostatina) e também péptidos citotóxicos, tais com a cadeia A da ricina, que é libertada de um arquétipo de polioxima após a intemalização pela célula destinatária. Isto poderia simular o processos da toxina natural em que a cadeia B da ricina se liga à célula, sendo a cadeia A da ricina libertada no citoplasma a seguir à intemalização da ricina e à redução das suas pontes S-S, daí resultando a morte celular. No caso de as cadeias A e B estarem ligadas por uma ponte não destrutível, a toxicidade (eficácia) é reduzida em várias ordens de grandeza.

[0064] De acordo com outras variantes, é possível utilizar as polioximas em sistemas de administração terapêutica de genes não virais em que sejam necessários elementos que possam ser libertados.

[0065] A ponte S-S constitui uma ligação destrutível. Como exemplos de outras ligações destrutíveis refere-se as que podem ser reconhecidas por enzimas hidrolíticas especificas no local de acção ou de administração, tanto in vitro como in vivo. Tais ligações sensíveis às 33

enzimas hidrolíticas, como são conhecidas na especialidade, podem ser incorporadas na polioxima, conforme aqui se explica, e compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as sequências nucleotídicas das enzimas de restrição, as pontes lipídicas reconhecidas por uma lipase, as pontes de hidratos de carbono reconhecidas por uma glicosidase e as pontes peptídicas reconhecidas por um peptidase ou por uma protease. Para além das ligações S-S é possível escolher ligações destrutíveis em função da sua sensibilidade química preferencial (ao longo do tempo, se desejado) num ambiente químico ou físico particular (v.g. pH, temperatura, presença de um catalisador, fotólise) que ocorra in vitro ou in vivo, por exemplo, hidrólise acídica de uma ponte peptídica Asp-Gli. Assim sendo, a libertação de uma MOCA activa pode ocorrer num determinado local, sem que seja necessária a intemalização celular. É possível utilizar as variantes da invenção em que haja MOCA susceptíveis de serem libertadas, por exemplo, em revestimentos ou materiais aplicados extemamente que possam modificar propriedades em resposta a uma alteração no ambiente, por exemplo, um reagente preventivo contra o míldio e que liberte o ingrediente activo antifungico em resposta à presença de uma enzima ou de uma proteína fúngica (ou uma alteração química, tal como uma oxidação). É possível utilizar as variantes com as MOCA que não possam ser libertadas, por exemplo, em revestimentos ou materiais para os quais não seja necessária uma libertação ao longo do tempo. Por exemplo, uma loção bronzeadora à prova de água pode conter um padrão hidrofóbico com as MOCA bloqueadoras dos UV acopladas de uma forma activa. [0066] As variantes de polioximas da presente invenção podem ser utilizadas em estojos aperfeiçoados para fins de diagnóstico ou como reagentes aperfeiçoados para ensaios, por exemplo, em ensaios de ligação, tais como os imunoensaios. Por exemplo, as composições de polioximas homogéneas portadoras de péptidos antigénicos permitem obter uma maior 7SÍ* sensibilidade de detecção em imunoensaios em fase sólida. As polioximas multivalentes de maiores dimensões podem aderir mais facilmente a determinadas superfícies, tais como as placas de multicavidades utilizadas nos imunoensaios.

[0067] A presente invenção também contempla como variantes os estojos de diagnóstico aperfeiçoados que contenham polioximas.

[0068] O grupo amino-oxi-acetilo e o grupo ditíopiridilo podem estar presentes na mesma MOCA peptídica, por exemplo, como sucede em NH2OCH2CO-Asp-Cis(S-2-piridil)--Thr-Leu-lle-Asp-Ala-Leu-Leu-Gli-Asp-Pro-His-NH2 (SEQID N° 23). Conforme aqui determinado, a presença do grupo de protecção de 2-tiopiridilo nas cadeias laterais de Cis não impede a formação da oxima. Tais polioximas modificadas têm a vantagem complementar de o grupo 2-tiopiridilo ser útil para acoplar ainda outras espécies (MOCA), conforme aqui explicado, mediante a aplicação da química convencional do tiol (ataque realizado por um tiol para originar um dissulfureto com perda de piridina-tiona, ou uma redução para gerar um tiol, seguindo-se uma alquilação). Noutras variantes da presente invenção, as reacções aplicáveis aos tióis com 2,2’-ditiodipiridma (também conhecida pela designação de dissulfureto de 2,2'--dipiridilo) podem ser encontradas no trabalho de Brocklehurst e Litde, Biochem. J., (1972) 128:471-474. Estas reacções também são aplicáveis ao dissulfureto de 4,4’-dipiridilo. Noutras variantes da presente invenção estão previstas as reacções com um tiol transformado por 2-piridiltio, na química das proteínas, conforme descrito, por exemplo, por Carlsson, J., Drevin, H. e Axén, R. (Biochem. J. (1978) 173:723-737). De acordo com outras variantes, é possível que haja grupos de protecção de enxofre, com propriedades químicas reactivas semelhantes às dos compostos descritos supra. Outras variantes compreendem o ácido 2-tio--5-nitrobenzóico e o composto 2-tio-5-nitropiridina. Um reagente preferido é aquele que 35 permite uma síntese de forma conveniente e um isolamento correcto do produto, para além da actividade biológica pretendida. De preferência, utilizar-se-á um reagente que permita uma separação fácil entre o produto resultante desejado, o reagente e os subprodutos. Como é evidente, a selecção do reagente depende também do sistema de separação utilizado e por tal motivo a determinação do reagente exacto fica ao critério do químico macromolecular familiarizado com a instabilidade e as restrições particulares da MOCA macromolecular utilizada. Por exemplo, o composto DTNB introduz uma carga negativa que pode ser explorada nas separações de permuta iónica. No caso da separação por CLER de fase inversa, as reacções são efectuadas em pequena escala, incluindo reagentes analíticos e uma reacção de contraprova com cisterna. Para o exame dos resultados obtidos de um dia para o outro, após injecção automática de tais amostras, para aplicações em escala preparatória selecciona-se o reagente que proporciona a separação mais conveniente. Um reagente preferido para utilização geral e para utilização nos estudos iniciais é o composto 2,2’-ditiodipiridina que pode ser obtido nos circuitos comerciais, v.g. pode ser fornecido por ‘Fluka’.

[0069] As próprias MOCA aqui descritas, que possuam um grupo quimicamente reactivo ortogonal complementar formador de oxima e ainda um outro grupo reactivo, tal como um grupo 2-tiopiridilo, que possam reagir de fornia específica com outra macromolécula que não seja uma placa de base, podem ser utilizadas como ligadores. Por exemplo, uma MOCA que desempenhe simultaneamente as funções de um grupo AOA e de um grupo 2-tiopiridilo pode servir de ligador para acoplamento de outra macromolécula, ou de uma outra MOCA, através da formação de uma ponte dissulfureto com a segunda macromolécula.

[0070] Define-se ainda uma MOCA como sendo um componente de uma molécula específicamente activa ou de uma sua parcela. A expressão “específicamente activo” aqui

utilizada significa que a MOCA possui uma actividade biológica, química ou física definida, para além da sua reactividade química ortogonal complementar. Por exemplo, uma MOCA pode ser específicamente activa como antigénio, epítopo ou hapteno. Em alternativa, uma MOCA pode ser específicamente activa como receptor, por exemplo, uma região de um anticorpo determinante da complementaridade, ou um ligando para um receptor da superfície celular. [0071] A alquilaçao de uma MOCA, conforme descrito supra, constitui outro método de acoplamento de uma macromolécula, por exemplo, fragmentos de anticorpos, a uma placa de base. Os fragmentos F(ac’) (o mesmo que F(ab’)) dos anticorpos de IgG produzidos por redução das pontes dissulíureto que ligam as cadeias pesadas dos fragmentos F(ac>)2 (o mesmo que F(ab’)2), podem ser alquilados para conterem um grupo reactivo complementar formador de oxima. In vivo, a polioxima irá ter uma localização limitada nos rins, daí resultando uma taxa reduzida de excreção. É agora possível realizar a síntese de compostos com heteroespe-cificidades multivalentes. Por exemplo, é possível preparar heteropolioximas utilizando diferentes regiões do mesmo fragmento de IgG ou regiões de diversas IgG com especificidades diferentes. Além do mais, as regiões de combinação de anticorpos podem ser combinadas com moléculas de ligação ao receptor, moléculas de ligação às células ou com outras moléculas de ligação a ligandos para a criação de anticorpos multivalentes. O documento PCT/US88/03414 e o trabalho de Capon et al, (Nature (1989) 337:525-530), considerando-se estas duas obras aqui incorporadas por referência, as quais exemplificam “imunoadesmas” que são moléculas híbridas biespecífícas que possuem, por exemplo, um domínio CD4 (para ligar uma proteína gpl20 dos VIH) ligado a uma região constante (Fc) de uma cadeia leve ou de uma cadeia pesada de uma IgG (para ligar o receptores Fc de células fagocíticas), descrevem algumas das especificidades variáveis que podem ser combinadas numa polioxima da invenção.

[0072] Conforme aqui descrito a propósito das estruturas de placas de base peptídicas, os métodos para o acoplamento regioespecífico ou para a respectiva modificação dos terminais C, por proteólise inversa catalisada por uma enzima, ou dos resíduos serina ou treonina do terminal N (presentes de forma natural ou introduzidos na MOCA por técnicas da engenharia genética) são aplicáveis a preparação das MOCA Os polipeptidos naturais ou sintéticos portadores de grupos amino-oxi ou aldeído, colocados específicamente no local, também podem ser utilizados, conforme descrito, por exemplo, por Qfiford, R.E., em Protein Engjmeering: A Practical Approach, páginas 235-251, ed. Rees et al. (Oxford Press, 1992), obra que aqui se considera incorporada por referência. Os grupos reactivos, tais como os grupos aldeído, podem ser colocados específicamente no local do terminal N de um polipeptido obtido por via recombinante (ver, por exemplo, Geoghegan et al. (Bioconjugate Chem. (1992) 3:138-146); Gaertner et al (Bioconjugate Chem,. (1992) 3:262-268). A combinação da concepção artificial de proteínas por métodos recombinantes, seguindo-se uma modificação específica do local para criar as MOCA capazes de formarem ligações oxímicas, constitui uma ferramenta poderosa para o projecto e concepção e para a criação de preparações homogéneas de polioximas com uma estrutura definida e uma actividade desejada. Não há nenhum limite quanto ao tamanho das MOCA, tendo em conta que apenas é necessário preparar simplesmente uma placa de base em que os grupos reactivos estão afastados ainda mais do que nos exemplos agora apresentados, com a finalidade de permitir a acomodação de MOCA polipeptídicas ainda maiores. Os métodos conhecidos na especialidade e aqui descritos para a concepção conformacional da placa de base também são aplicáveis ao projecto e concepção das MOCA

[0073] Uma MOCA também pode ser um quelador específicamente activo de iões de metais ou uma molécula útil para ligar um marcador detectável. Tais marcadores detectáveis

são seleccionados entre radionuclideos, biotina, luciferina ou um substrato para um método enzimático de detecção, tal como um substrato de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3 -indolilo/azul--de-nitrotetrazólio, que é um substrato para a fosfatase alcalina (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), obra que aqui se considera incorporada por referência). As moléculas adequadas queladoras de metais compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os quelatos de AEDT (ácido etflenodiamina-tetracético) e os análogos de AEDT, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 4 678 667, documento este que aqui se considera incorporado por referência. Tais análogos podem formar complexos com iões de metais, incluindo os iões de metais radioactivos, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 4 622 420, documento este que aqui se considera incorporado por referência. As MOCA também podem compreender outros queladores, tais como AOA-desferrioxamina que realiza a quelação, por exemplo, de gálio-67 e de gálío-68, ou AOA-biocitma que contém biotina em forma solúvel. [0074] No caso do ião metálico ser radioactivo, então as polioximas são particularmente úteis in vivo para a obtenção de imagens ou para o tratamento de tecidos ou tumores malignos. Utilizando os preceitos descritos neste documento e as obras já publicadas sobre esta matéria, um especialista na matéria sabe como construir placas de base que contenham estas MOCA para diagnóstico in vitro e para diagnóstico e tratamento in vivo. Para uma leitura de uma descrição da metodologia geral, veja-se, por exemplo, as patentes de invenção norte-americanas n- 5 185 143, 5 011 676, 5 087 616, 4 707 352, 5 084 266, 4 918 164, 4 865 835, 4 861 581, 4 659 839, 4 652 440 e 4 444 744, documentos estes que aqui se consideram incorporados por referência.

[0075] Conforme se disse antes, a montagem paralela de polioximas por ligação qui-miosselectiva é o resultado da reacção química ortogonal complementar que tem lugar, por exemplo, entre um grupo GXL da estrutura da placa de base e um grupo AOA da MOCA para formar uma preparação homogénea de uma polioxima que possua uma estrutura macromolecular definida. Outras variantes de polioximas possuem as estruturas complementares inversas, isto é, uma placa de base de grupo amino-oxi e uma segunda molécula orgânica aldeídica, em relação às descritas anteriormente. Estas variantes são particulaimente indicadas quando estiver disponível um conjunto de moléculas que contenham aldeído (v.g. açúcares). No entanto, as variantes geralmente preferidas contêm placas de base aldeídicas.

[0076] A invenção também proporciona métodos de montagem paralela para a criação de pohoximas, quer sejam homopolioximas quer sejam heteropolioximas. Conforme descrito antes, a ligação quimiosselectiva dá origem à formação de moléculas polioxímicas possuidoras de uma estrutura e características definidas. O exemplo 3 demonstra particularidades imprevisíveis e surpreendentes da formação de polioximas por montagem paralela com placas de base de valência superior a 2, salientando-se entre tais particularidades a facilidade, a rapidez e a comodidade de síntese, um rendimento e uma produção de natureza praticamente quantitativa e uma falta evidente de obstrução espacial. O exemplo 14 demonstra a formação de heteropolioximas.

[0077] Antes da oximação é possível acrescentar à placa de base outros grupos funcionais, incluindo entidades biológicas, um grupo repórter (tal como a biotina ou um quelador para um radiometal), um elemento de fixação lipofílico (tal como tripalmitoil-S-ghcerol-Cis) ou um grupo de ligação reactiva ortogonal (tal como grupo bromoacetilo ou um grupo tiol dissimulado tal como um grupo S-acetil-tioacetilo ou S-S-2-piridilo), sem que isto constitua qualquer limitação. As placas de base que contêm biocitma e N-acetil-cisteína constam dos exemplos, a título de ilustração. As placas de base modificadas têm maior flexibilidade quando são utilizadas polioximas, por exemplo, para vacinas ou como biodetectores. As variantes de polioximas da invenção etiquetadas com um grupo repórter são verificadas através desse grupo repórter. As polioximas estáveis que possuam simultaneamente um elemento de fixação lipofilico e uma estrutura molecular definida são úteis, por exemplo, para inserção da polioxima nas membranas, o que pode favorecer a produção de vacinas, ou noutros ambientes lipofílicos. O acoplamento das polioximas a outras macromoléculas, a outras polioximas ou a superfícies é favorecido pelas variantes que possuam um grupo de ligação diferente reactivo ortogonal não oxímico utilizável na formação da ligação desejada.

[0078] As placas de base divalentes e trivalentes descritas na secção seguinte dos exemplos conservam a simetria. No entanto, é possível formar polioximas com isómeros posicionais, por exemplo, utilizando como placa de base H-Gli3-Lis(COCHO)-Lis(COCHO)--Gli-OH (SEQ ID N° 11); em tais casos, o ambiente da primeira lisina não é idêntico ao da segunda. Mais geralmente, é possível sintetizar uma placa de base que favoreça deliberadamente a inleracção com uma estrutura destinatária e que não tenha simetria.

[0079] Há outras variantes de heteropolioximas da invenção que são preparadas por formação de heteropolioximas, utilizando uma placa de base que possua quatro grupos reactivos, em que três grupos reactivos com uma orientação são desbloqueados e vão reagir com a MOCA peptídica, seguindo-se depois a desprotecção do quarto grupo reactivo da placa de base e a reacção com uma MOCA diferente.

[0080] Há outras variantes de heteropolioximas da invenção que são bancos de MOCA. Um banco preferido é feito a partir de MOCA peptídicas. Os bancos peptídicos polioxímicos podem ser preparados a partir de uma placa de base e de uma mistura de MOCA peptídicas (população de MOCA). A parcela peptídica de cada MOCA pode ser concebida em conformidade com métodos para a concepção de bancos de péptidos lineares convencionais. Por exemplo, Jung et ai, (em Solid Phase Synthesis, R. Epton, Ed. 1992, Interceptor, Andover, UK, pp 222-235) descrevem um estudo abreviado sobre concepção, síntese e métodos de utilização de bancos de péptidos lineares sintéticos convencionais. As sequências peptídicas que irão estar representadas num banco de péptidos polioxímicos são sintetizadas por forma a conterem um grupo químico reactivo que seja complementar pelo menos com um grupo quimicamente reactivo formador de oxima na placa de base. As sequências peptídicas podem ser sintetizadas individualmente ou em misturas. As MOCA peptídicas também podem reagir sequencialmente com uma placa de base para a formação de compostos heteropolioxímicos de estrutura definida. As polioximas intermédias formadas durante o processo de formação de polioximas podem ser isoladas. As polioximas intermédias contêm grupos formadores de oximas que não reagiram. As polioximas intermédias podem reagir depois com uma outra MOCA peptídica individual ou com uma mistura de MOCA peptídicas para a preparação de bancos de heteropolioximas mais complexas. Se necessário ou desejado, é possível remover o excesso de compostos de grupos amino-oxi (ou de grupos aldeído), por exemplo, fazendo-os passar através de uma coluna de gel de aldeído (ou de amino-oxi-acetilo), respectivamente, antes do joeiramento (conforme adiante descrito) ou de outra utilização. Os bancos de polioximas podem ser utilizados em processos iterativos de joeiramento, de uma forma idêntica à dos bancos de péptidos convencionais.

[0081] As placas de base convenientemente escolhidas podem actuar como “a palma de uma mão” com os “dedos” peptídicos prontos para se fecharem em tomo de uma estrutura visada ou para interactuarem com ela. Nas diversas variantes, a placa de base em forma de “palma” é diferente de caso para caso, por razões de optimizaçao do afastamento, hidrofilicidade, carga, etc..

[0082] A título ilustrativo, tomando como hipótese um banco constituído exactamente pelas 400 amidas dipeptídicas formadas a partir dos 20 aminoácidos L vulgares, todas elas portadoras de um grupo amino-oxi-acetilo, e uma placa de base de polialdeídos de valência 3, desprezando então considerações de simetria, o número possível de trioximas que é possível obter ao fazer a mistura deve ser de 400 = 6,4 x 10 .

[0083] Foram já concebidas diversas estratégias de pesquisa de bancos de péptidos sintéticos. Ao utilizar bibliotecas de péptidos polioxímicos, a estratégia de optimizaçao é essencialmente a que foi descrita por Oughten et al. (Nature(1991) 354:84) e Geysen e Mason (Bio. Med. Chemistry Lett. (1993) 3:397-404), com a excepção do facto de os autores aí terem utilizado apenas péptidos lineares. Por exemplo, é possível preparar 400 conjuntos de péptidos, começando por Gli-Gli-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID N° 14), a seguir Gli-Ala-Xaa-Xaa-Xaa--Xaa (SEQ ID N° 15), etc., por fornia a ter todos os 20 aminoácidos codificados em posição 1 e todos em posição 2. A expressão ‘Xaa-Xaa-Xaa-Xaa’ indica as quatro posições consecutivas em que todos os resíduos aminoácidos estão presentes em todas as posições. A pesquisa das 400 amostras, por meio de ensaios convenientes, permite identificar apenas uma delas como sendo a mais activa. Por exemplo, no caso de se concluir que uma sequência Arg-Tir-Xaa--Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID N° 16) é a mais activa, então, na experiência de pesquisa subsequente fixa-se o par Arg-Tir para as 400 amostras seguintes para se obter Arg-Tir-Gli-Gli-Xaa-Xaa (SEQ ID N° 17), Arg-Tir-Ala-Xaa-Xaa (SEQ ID N° 18), etc.. Se a seguir à pesquisa se concluir que a sequência Arg-Tir-Lis-Glu-Xaa-Xaa (SEQ ID N° 19) é a mais activa, realiza-se 43 uma última pesquisa envolvendo mais 400 amostras, todas elas a começar pela sequência Arg-Tir-Lis-Glu e possuindo quer Gli-Gli, quer Gli-Ala, etc., no terminal C. No caso dos bancos de polioximas, a forma de resolver o problema é semelhante, com a excepção de estes péptidos, em vez de se utilizar hexapeptidos lineares para as experiências, serem montados numa placa de base por um processo de montagem paralela e de formação de pontes oxima.

[0084] As vantagens da utilização de bancos de polioximas são as seguintes: 1) a placa de base pode conter uma estrutura que seja activa numa experiência, permitindo pois a utilização de concentrações menores de polioximas numa experiência e permitindo assim minimizar os problemas de solubilidade, os quais poderiam ser, caso contrário, bastante críticos; 2) a polivalência determina geralmente uma ligação mais intensa e uma especificidade de interacção mais forte, uma vez que estão implicados mais contactos.

[0085] As placas de base contêm preferencialmente grupos quimicamente reactivos aldeído; no entanto, são particularmente indicadas outras variantes de bancos de péptidos polioxímicos que possuam as estruturas complementares inversas, isto é, as placas de base de grupos amino-oxi, quando houver disponível um conjunto de moléculas que contenham grupos aldeído (v.g. açúcares).

[0086] Em determinadas variantes de bancos polioxímicos, uma parte da estrutura polioxímica pode ser sintetizada por métodos convencionais e utiliza-se a oximação para acrescentar outros elementos que representem as sequências relevantes num banco.

[0087] A título ilustrativo, os exemplos aqui descritos demonstram o acoplamento das MOCA peptídicas não idênticas a uma placa de base.

[0088] A utilização de amino-oxi-acetil- (ou aldeído- modificado)-monometoxi-poli-etileno-glicol, ou de outras séries homólogas de polímeros, enquanto mistura de MOCA, vai

44 permitir que uma polioxima tenha heterogeneidade dentro da própria molécula. Tais polioximas são formadas por montagem paralela de uma mistura de elementos de uma série homóloga, por exemplo: NH20CH2C0-NH-CH2CH20(CH2CH20)nCH2CH20CH3 ou O -CHCH20(CH2CH20)I1CH2CH20CH3 ou 0=CHC0NHCH2CH2CXCH2CH20)nCH2CH2QCH3, em que o símbolo n representa um número inteiro. As moléculas de uma série homóloga modificadas por grupos aldeído ou por grupos AOA podem ser utilizadas na formação de uma polioxima por montagem paralela. No contexto da modificação de proteínas, as variantes da invenção em que se utiliza as MOCA permitem a PEGilação de proteínas, a qual pode aumentar a estabilidade, a solubilidade e o período de semi-vida. Em alternativa, é possível acoplar diversas cadeias a uma placa de base que esteja por sua vez acoplada a uma proteína. Embora os produtos sejam nesse caso ligeiramente não homogéneos, devido ao facto de o número n inteiro assumir um conjunto de valores, as polioximas podem ser úteis, por exemplo, para prolongar o período biológico de semi-vida de proteínas pequenas ou para reduzir a imunogenicidade de proteínas terapêuticas.

[0089] De acordo com uma variante autónoma, a polioxima ainda se caracteriza pelo facto de ter capacidade para induzir uma resposta imunitária num animal. As polioximas imunogénicas, que são formadas a partir de uma estrutura de placa de base ligada de forma covalente a um conjunto de MOCA com propriedades imunogénicas, têm capacidade para induzir uma resposta imunitária num animal. Apenas com intuitos ilustrativos, uma tal MOCA pode ser um péptido ou um polipeptido correspondente a um hapteno, um receptor da superfície celular ou um seu fragmento, um agente quelador metálico ou um epítopo de um antigénio virai. Existem inúmeras MOCA peptídicas diferentes imunomoduladoras, tais como os péptidos descritos por Hobbs et al (J. Immunol., 138:2581-2586 (1987)), Antoni et

al (J. lmrmmol., 137:3201-3204 (1986)) eNencioni etal. (J. Immunol., 139:800-804 (1987)), obras estas que aqui se considera incorporadas por referência. Os diversos péptidos acoplados aos agentes queladores também são bem conhecidas e compreendem, por exemplo, os derivados peptídicos da hormona estimuladora dos melanócitos (pedido de patente de invenção europeia n° 0 498 771 A2, depositado a 2 de Março de 1992, cujo texto se considera aqui incorporado por referência). Estas polioximas são úteis in vivo como vacinas e como agentes para a formação de imagens.

[0090] De acordo com outra variante, as MOCA podem ser sequências de ácidos nucleícos que podem ser ligadas quimiosselectivamente a uma placa de base. Também é possível acoplar as bases nucleares às sequências peptídicas ou polipeptídicas para assim se criar um complexo de polipeptido - ácido nucleico (PAN) que pode ser utilizado como MOCA e ligado a uma placa de base. Quando utilizadas em conjunto com marcadores detectáveis, tais como P, biotína, queladores marcados radioactivamente ou enzimas, tais como a fosfatase alcalina (ou um seu substrato), as polioximas resultantes constituem sondas de ácido nucleico reactivas e de elevada especificidade que são úteis em diversas técnicas de diagnóstico, por exemplo, nos ensaios de hibridação de Northern e de Southern (ver Sambrook et al. (1989)).

[0091] De acordo com uma outra variante a polioxima possui um conjunto de diversas MOCA em que cada uma é um polipeptido que possui uma sequência idêntica à sequência de uma região determinante da complementaridade (RDC) de um anticorpo. Qualquer especialista na matéria sabe que a RDC pode ser acoplada a um agente quelador metálico para criar uma MOCA bifuncionai, ou então, em alternativa, o agente quelador ou repórter é acoplado à placa de base, conforme aqui descrito. As polioximas de RDC são úteis in vitro e in vivo. In vitro, podem ser utilizadas em vez de anticorpos policlonais e monoclonais em diversos imimoensaios. In vivo, podem ser úteis para imunizar de forma passiva um animal ou para diagnostico e para tratar uma doença.

[0092] As polioximas da presente invenção também são úteis para purificar moléculas relevantes biologicamente activas que possam ligar-se a uma polioxima (para o estudo de uma metodologia geral, ver, por exemplo, Sambrook et al., (1989) e Harlow e Lane (1988)).

[0093] As polioximas podem ser acopladas a uma fase sólida, tal como a superfície de uma pastilha de silício, uma placa de cultura de tecidos ou uma resina sintética ou natural. É possível ligar quimiosselectivamente uma polioxima a uma fase sólida mediante a utilização, por exemplo, de grupos tiol temporariamente protegidos com grupos tiopiridilo ou acetilo para assim se formar uma ponte tioéter ou uma ponte tioéster. Em alternativa, as polioximas podem ser acopladas a uma fase sólida, tal como uma camada lipídica ou uma membrana celular, através de grupos de fixação lipídicos acoplados de fornia covalente à parcela de uma polioxima da placa de base. As MOCA das polioximas que aderiram ou foram acopladas a superfícies sólidas podem ser utilizadas como ligandos para a purificação ou para a detecção da presença de uma molécula destinatária que se ligue ao ligando de MOCA. Se a MOCA for acoplada à placa de base através de um elo clivável, tal como um elo que contenha uma ponte S-S, conforme aqui explicado, então pode ser libertado um par constituído por MOCA-alvo a partir da placa de base/superfície para facilitar a purificação de análise.

[0094] A presente invenção também proporciona um complexo solúvel para encaminhar uma molécula biologicamente activa para uma célula. O complexo solúvel é constituído por uma estrutura de placa de base ligada a um conjunto de moléculas biologicamente activas e acoplada a um agente de ligação específico da célula. Em alternativa, a placa de base pode estar ligada a um conjunto de agentes de ligação específicos das células e acoplada a uma molécula biologicamente activa. Tais complexos solúveis constituem sistemas de administração, específicos de células ou de tecidos, para que as células expressem o receptor adequado. As moléculas biologicamente activas compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as RDC de anticorpos homogéneos, fragmentos de anticorpos, epítopos, paratopos, ácidos nucleícos, ligandos específicamente reactivos com receptores celulares e ainda os receptores celulares ou os seus fragmentos que conservem a capacidade de se ligarem específicamente à sua molécula destinatária. A molécula biologicamente activa também pode ser um péptido ao qual esteja acoplado um agente terapêutico, por exemplo, uma toxina, um agente quimioterapêutico ou um radioisótopo. Para os fins da presente invenção, um agente de ligação específico da célula é uma molécula que reconhece as moléculas biológicas específicas e se liga a elas. Tais agentes compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, anticorpos, fragmentos de anticorpos e receptores de superfície celular (ou os seus fragmentos biologicamente activos). Por exemplo, o agente de ligação específico da célula pode ser um receptor específico de uma célula tumoral, um receptor da superfície celular ou um ligando para um receptor da superfície celular.

[0095] Para além das composições que contenham apenas polioximas, também fazem parte do âmbito da presente invenção as composições que contenham as polioximas da invenção e pelo menos um outro ingrediente. Também fazem parte do âmbito da presente invenção as composições farmacêuticas que contenham uma polioxima terapêutica de acordo com a invenção e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

[0096] As composições podem ser utilizadas num método de indução de uma resposta imunitária num animal, o qual consiste em administrar a esse animal uma quantidade imuno-genicamente eficaz de uma polioxima antigénica, definida supra, num veículo aceitável sob o 48 ponto de vista farmacêutico. Para os objectivos da presente invenção, um animal é de preferência um vertebrado, tal como um mamífero, em especial um murino, um símio ou um ser humano. De acordo com uma variante, o animal em causa é um paciente humano. Consoante a polioxima antigénica utilizada, assim a resposta imunitária induzida é a imunidade humoral ou celular, ou ambas.

[009η As polioximas da invenção possuem diversas características novas. Uma das novas características das moléculas homopolioxímicas sintéticas da presente invenção assenta no facto de as preparações de polioximas serem homogéneas. As polioximas são multivalentes, são estáveis em solução aquosa ou em solução semiaquosa e podem ser preparadas a temperaturas compreendidas entre -3°C e 50°C, sendo no entanto preparadas mais vantajosamente à temperatura ambiente. As polioximas da presente invenção têm vantagens relacionadas com a reactividade biológica específica e com as reactividades químicas e físicas específicas de cada um dos seus componentes.

[0098] Conforme aqui se demonstra, os grupos complementaimente reactivos que interactuam para formarem uma ligação oxímica entre a placa de base e a MOCA são altamente específicos. As reacções de oximação aqui explicitadas permitem obter o produto da reacção de uma forma exaustiva ou com um rendimento muito elevado. A formação de uma tal molécula complexa tem lugar em condições muito suaves. A rapidez é particularmente surpreendente quando as soluções estão diluídas, o que por vezes é útil para minimizar a agregação ou reacções intermoleculares. A reacção de oximação pode ter lugar sem cuidados particulares, de tal modo que ocorra pois a automontagem das polioximas. As polioximas são purificadas facilmente devido ao rendimento praticamente quantitativo e devido ao facto de os intermediários vestigiais e o produto final tipicamente diferirem bastante (isto é, pela presença ou pela

49 ausência de uma unidade MOCA pelo menos), pelo que os métodos para a sua preparação são facilmente escolhidos e aplicados. As ligações oxímicas possuem uma estabilidade hidrolítica superior num grande intervalo de variação das condições fisiológicas, comparativamente com as hidrazonas e outras substâncias que tais. As ligações oxímicas não são vulgarmente objecto de hidrólise enzimática. As polioximas têm a vantagem de serem particularmente adequadas para aplicações em que seja desejável a integridade e a estabilidade de um complexo. Conforme demonstrado nos exemplos, a reacção de polioximação é muito suave e por tal motivo é adequadamente vantajosa para a preparação de macromoléculas biológicas que conservem a sua actividade ou funções biológicas. A química das polioximas faz com que não seja necessária nenhuma protecção química reversível das subunidades. A presente invenção permite que haja uma grande flexibilidade para a modificação específica do local, tanto das placas de base como das MOCA, para a criação de grupos reactivos capazes de formarem pontes oxima. Devido a esta flexibilidade e ao facto de não ser necessária a protecção reversível, o projecto e a concepção das placas de base e das MOCA é aplicável tanto às moléculas artificiais e naturais como aos seus derivados. A surpreendente falta de obstrução espacial aqui demonstrada (v.g. um péptido 23-mérico (com 23 unidades fundamentais repetitivas) acoplado a cada uma das cadeias laterais de sete resíduos lisina consecutivos) significa que é agora possível projectar e conceber moléculas complexas. Em tais moléculas complexas, as potencialidades de cada subunidade podem ser intensificadas e combinadas, sendo o todo maior do que a soma das partes. Por exemplo, é possível projectar e conceber placas de base para aumentar a solubilidade dos péptidos e também para apresentar os péptidos aos receptores ou aos anticorpos ou ao sistema imunitário de um animal, em formas multivalentes e/ou confinadas. As polioximas 50 formadas a partir das placas de base sintéticas e das MOCA possuem a vantagem complementar de não terem vírus.

[0099] Os exemplos a seguir descritos são apresentados a título ilustrativo. EXEMPLOS

Exemplo 1, Síntese de estruturas placas de base peptídicas que possuem grupos aldeído ou amino-oxi-acetilo quimicamente reactivos Síntese das estruturas de placas de base-GXL

[0100] Efectuou-se a construção das estruturas da placas de base peptídicas recorrendo à síntese de péptidos em fase sólida (SPFS). Dito de forma abreviada, realizou-se uma SPFS utilizando um sintetizador de péptidos* de modelo 430A (Applied Biosystems, Inc.). A sequência de aminoácidos desejada foi programada no sintetizador e a síntese decorreu em conformidade com o protocolo convencional de grupos Fmoc. A resina de partida foi Gli--poliestireno de PAM (0,5 mmol por síntese). Foram sintetizadas duas sequências peptídicas diferentes: H-Gli3-[Lis(Boc)]5-Gli-resina de PAM e H-Gli3-[Lis(Boc)]7-Gli-resina de PAM.

[0101] Efectuou-se a remoção dos grupos Boc, utilizando para tal ácido trifluoroacético (ATT). Dito de forma abreviada, manteve-se em incubação cerca de 15 mL de ATF conjuntamente com 1 g de resina durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois filtrou-se a amostra, lavou-se com diclorometano e secou-se. Os grupos amino α e ε livres foram acilados, utilizando para tal dois equivalentes de éster de Boc-Ser (benzil) N-hidroxi-succínimida activo (0,16 M em DMSO anidro) para cada grupo amino. Mediu-se o valor aparente de pH utilizando papel sensível ao pH, humedecido com água, e ajustou-se para o valor de pH 8-9 com N-metil--morfolina. Agitou-se a resina durante 2 horas. 51 51

[0102] A seguir a esta reacção, o teste convencional com ninidrina comprovou que a acilação estava incompleta. Assim, filtrou-se a resina e repetiu-se a reacção de acilação, mantendo o valor aparente de pH entre 8 e 9 com N-metil-morfolina. A seguir a esta reacção, o teste da ninidrina comprovou que a acilação estava praticamente completa. Filtrou-se a resina, lavou--se com DMSO e depois com diclorometano e a seguir secou-se in vacuo. A reacção permitiu obter 1,7 g de resina a partir de 1,3 g de H-GlÍ3-[Lis(Boc)]5-Gli-resina de PAM.

[0103] Efectuou-se a desprotecção por clivagem dissolvendo a amostra em 17 mL de ATT. Agitou-se a mistura durante 30 minutos e depois, juntou-se-lhe 1,7 mL de ácido tri-fluorometano-sulfónico (ATFMS). Agitou-se a solução durante 1 hora e fez-se precipitar o péptido utilizando éter anidro. Lavou-se o péptido três vezes com éter anidro e secou-se in vacuo.

[0104] Com a mistura resultante de péptido e de resina clivada preparou-se nova suspensão em 60 mL de água. Dissolveu-se o péptido, que é solúvel em água, e depois filtrou-se a solução. A seguir à liofilização dissolveu-se o filtrado em 50 mL de água e purificou-se em porções de 5 mL por CLER-FI (Waters) numa coluna C8 de 250 x 21 mm d.i. carregada com ‘Nucleosil 300A’ de 5pm a trabalhar com um débito de 10 mL/minuto. O solvente foi o ATF a 0,1% e o solvente B foi o ATF a 0,1% em acetonitrilo a 90%.

[0105] Purificou-se o péptido isocraticamente com 100% de solvente A e efectuou-se a eluição logo a seguir à frente. Depois lavou-se a coluna com o solvente B a 50% e equilibrou-se com o solvente A a 100%, antes da injecção subsequente. O produto H-Ser-GlÍ3-[Lis(H-Ser)]5--Gli-OH (SEQ ID N° 7) (produção = 100 mg) eluiu como pico único confirmado por CLER-FI analítica (coluna de 250 x 4 mm d.i.; carga e solventes conforme indicado antes) a trabalhar com um caudal de 0,6 mL/minuto, de forma isocrática, com solvente A a 100% durante 5

minutos, seguindo-se a eluição em gradiente linear de solvente B a 2% por minuto, até se chegar a solvente B a 100% por minuto. O tempo de retenção do péptido foi de 20 minutos.

[0106] Efectuou-se a caracterização do péptido purificado recorrendo à espectrometria de massa por ionização por electropulverização (EM-IEP). Utilizou-se um espectrómetro de modelo ‘Trio 2000’ equipado com um gerador de r.f de 3000 u.m.a. (Fisons Instruments; Altrincham, Reino Unido). A infusão das amostras foi feita à razão de 2 pL/minuto numa mistura de água/metanol/ácido acético (49,5/49,5/1 em volume). O peso molecular medido para a amostra foi de 1410,12 ± 0,66 daltons comparativamente com o valor calculado previsível de 1409,56 daltons.

[0107] Os grupos serina, na estrutura da placa de base precursora, foram convertidos em grupos glioxilo (GXL) quimicamente reactivos, misturando 0,2 mL de H-Ser-Gli3~[Lis(H--Ser)]5-Gli-OH (SEQ Π) N° 7) (10 mM em água) com 7,8 mL de tampão de imidazol-HCl, a pH 6,95, e acrescentando 0,24 mL de Nal04 (0,1M em água). Agitou-se a mistura rapidamente e depois incubou-se à temperatura ambiente durante 5 minutos. A reacção de oxidação terminou por adição de 0,48 mL de etileno-glicol (0,1 M em água) e revolvendo rapidamente a solução. Ajustou-se o valor do pH da solução para 4,0 utilizando para tal ácido acético e depois injectou-se a solução numa coluna C8 de CLER-FI de 250 x 10 mm d.i. carregada com ‘Nucleosil 300A’ de 7 pm. A eluição decorreu à razão de 4 mL/minuto, de forma isocrática, utilizando o solvente A a 100% durante 5 minutos, a que se seguiu um gradiente linear de solvente B a 2%/minuto até à concentração final de solvente B a 100%. O produto hexa-GLX-placa de base (SEQ ID N° 6) eluiu com um tempo de retenção de 16 minutos.

[0108] Removeu-se o solvente por centrifugação hipobárica (Speed-Vac; Savant Instruments), sem aquecimento. A reacção permitiu obter aproximadamente 1 mg de produto purificado hexa-GXL-placa de base, que foi guardado sob a forma de um pó a -20°C e se manteve estável pelo menos durante várias semanas. Foram utilizados métodos idênticos para a preparação de octa-GXL-placa de base (SEQID N° 9).

Síntese das estruturas das placas-AOA

[0109] Em alternativa, efectuou-se a conversão dos grupos amino do péptido da placa de base em grupos AOA para a criação de estruturas poli-AOA-placa de base. Dito de forma abreviada, efectuou-se a incubação de H-Gli3-Lis5-Gli-resma de PAM com éster de Boc-AOA-N--hidroxi-succínimida (0,1 M em DMSO anidro; 2,5 equivalentes para cada grupo amino; 50 mL por cada 0,69 g de resina, com o valor de pH aparente entre 8 e 9 com N-metil-morfolina). A reacção de acilação ficou completa ao fim de 2 horas de incubação à temperatura ambiente, conforme confirmado pelo teste convencional da ninidrina.

[0110] Filtrou-se a resina, lavou-se com DMSO e depois com diclorometano e a seguir secou-se in vacuo. Executou-se o procedimento de clivagem-desprotecção utilizando uma solução que continha 7 mL de ATF e 0,7 mL de ATFS. Fez-se precipitar a amostra com éter e depois dissolveu-se em água, filtrou-se e liofílizou-se conforme descrito supra.

[0111] O produto impuro liofilizado assim obtido foi dissolvido em 4 mL de água e procedeu-se à purificação de fiacções de 0,5 mL por CLER-FI utilizando para tal a coluna de 21 mm anteriormente descrita, a trabalhar com um caudal de 10 mL/minuto. Ao fim de 5 minutos de eluição com o solvente A a 100%, aplicou-se um gradiente de solvente B a 1%/minuto até se chegar à concentração final de solvente B a 5% que se manteve durante 20 minutos. Lavou-se a coluna com o solvente B a 50% e equilibrou-se com o solvente A a 100%, antes de cada injecção.

[0112] O produto hexa-AOA-placa de base (SEQ ID N° 5) eluiu de forma isocrática com a aplicação do solvente B a 5%. O produto eluiu como pico singular, conforme comprovado pela CLER-FI analítica. O peso molecular determinado por EM-IEP foi de 1325,49 ± 0,38 daltons, comparativamente com o peso molecular calculado que era de 1325,4 daltons. A seguir à remoção do solvente, guardou-se o produto hexa-AOA-placa de base sob a forma de um pó a -20°C que se manteve estável pelo menos durante várias semanas. O fiasco de armazenagem foi mantido estanquemente fechado, tendo sido eliminados os aldeídos voláteis.

Exemplo 2. Síntese das moléculas peptídicas ortogonais complementares específicamente activas (MOCA) [0113] Sintetizou-se o componente peptídico das MOCA utilizando o método de SPFS descrito supra. Sintetizou-se um péptido de 12 aminoácidos com a sequência Lis-Leu-Glu--Glu-Gln-Arg-Pro-Glu-Arg-Val-Lis-Gli (SEQ ID N° 1), que corresponde aos resíduos aminoácidos 102 a 112 da proteína tumoral humana traducionalmente controlada (PTTC) (o mesmo que TCTP) que continha mais um resíduo glicina no terminal C. A síntese dos péptidos foi realizada de forma automática, utilizando para tal um sintetizador de péptidos de modelo 430A (Applied Biosystems, Inc.), conforme descrito no exemplo 1, com a excepção de se ter utilizado uma resina Sasrin (Bachem) e se ter utilizado Pmc como grupo de protecção da cadeia lateral para o resíduo arginina.

[0114] O grupo ammo α do resíduo lisina no terminal N do péptido da PTTC foi convertido num grupo α-AOA mediante a incubação de 0,33 mM de PTTC-resina com éster de Boc-AOA-N-hidroxi-succínimida, conforme descrito no exemplo 1. Efectuou-se o procedimento de clivagem-desprotecção utilizando 1,5 mL de uma mistura de fenol/etanoditiol/tioanisol/ /água/ATF (0,75 g/0,25 mL/0,5 mL/0,5 mL/10 mL). Depois de se ter agitado durante três horas, filtrou-se a mistura e fez-se precipitar o péptido com 4 mL de éter metil-terc-butílico frio. Lavou-se o precipitado três vezes com o mesmo éter e secou-se.

[0115] Os precipitados, depois de secos, foram dissolvidos em 15 mL de água e purificados em parcelas de 1,5 mL por CLER-FI na coluna de 21 mm d.i. descrita no exemplo 1. Efectuou-se a eluição da coluna com um caudal de 10 mL/minuto em que foi utilizado o solvente A a 100% durante 5 minutos e depois o solvente B a 1%/minuto até se obter uma concentração final de solvente B a 9% que assim se manteve até à eluição do produto (tempo de retenção de aproximadamente 45 minutos). Lavou-se a coluna com o solvente B a 50% e equilibrou-se com o solvente A a 100% antes de cada injecção.

[0116] A seguir à remoção do solvente por centrifugação hipobárica, caracterizou-se a amostra de AOA-PTTC (SEQ Π) N° 4) por EM-IEP. O peso molecular determinado para a amostra foi de 1542,57 ± 1,14 daltons comparativamente com o valor calculado previsível de 1541,73 daltons. A reacção permitiu obter 120 mg de AOA-PTTC a partir de 1,3 g de AOA--resina polipeptídica. Guardou-se a MOCA de AOA-PTTC sob a forma de um pó a -20°C que se manteve estável pelo menos durante vários meses.

[0117] Em alternativa, acrescentou-se um resíduo serina do terminal N a 707 mg (0,17 mmol) da PTTC-resina Sasrin, utilizando para tal o sintetizador de péptidos de modelo 430A da Applied Biosystems. A seguir à remoção do grupo Fmoc, efectuou-se o procedimento de clivagem-desprotecção conforme descrito para a MOCA de AOA-PTTC. Purificou-se a MOCA (SEQ ID N° 2) precursora de Ser-PTTC por CLER-FI (produção = 90 mg) e caracterizou-se por EM-IEP. O peso molecular medido para a MOCA precursora de Ser-PTTC foi de 56 ?sd 1556,53 ± 1,07 daltons comparativamente com o valor calculado previsível de 1555,75 daltons. A MOCA precursora de Ser-PTTC foi guardada sob a fornia de um pó a -20°C e manteve-se estável indefinidamente.

[0118] Converteu-se o precursor no produto GXL-PTTC quimicamente reactivo (SEQ ED N° 3) mediante a adição de 1,2 mL da MOCA (10 mM em água) precursora de Ser-PTTC a uma solução que continha 6,8 mL de tampão de imidazol-HCl (50 mM, pH 6,95) e 0,24 mL de NaUA» (0,1 M em água) e agitando rapidamente a amostra. Decorridos 5 minutos à temperatura ambiente, interrompeu-se a reacção de oxidação por adição de 0,48 mL de etileno--glicol (0,1 M em água). Ajustou-se o valor do pH da solução para 4,0 utilizando para tal ácido acético e isolou-se o produto GXL-PTTC por CLER-FI na coluna de 10 mm de d.i.. Efectuou-se a eluição com um caudal de 4 mL/minuto em que foi utilizado o solvente A a 100% durante 5 minutos e depois o solvente B a 2%/mmuto até se chegar à concentração final de solvente B a 100%. O tempo de retenção foi de 19 minutos.

[0119] Após a remoção do solvente caracterizou-se o produto GXL-PTTC por EM-IEP. Mediu-se o peso molecular da amostra que foi de 1524,63 ± 0,16 daltons, comparativamente com o valor calculado previsível de 1524,70 daltons. Guardou-se as MOCA de GXL-PTTC sob a forma de um pó a -20°C que se manteve estável pelo menos durante várias semanas.

[0120] Sintetizou-se também um péptido de 23 aminoácidos, correspondente aos resíduos 43 a 65 da sequência do péptido C (Pep C) da proinsulina humana, utilizando para tal o sinte-tizador de péptidos de modelo 430A da Applied Biosystems, tendo sido cumprido o protocolo convencional dos grupos Fmoc. Utilizou-se Fmoc-Arg (Pmc)-resina de Sasrin (Bachem) numa escala de 0,5 mmol. Enquanto estava ainda protegido como péptido ligado à resina, efectuou-se a acilação de 100 mg de resina (aproximadamente 20 pmol do grupo amino α do terminal N), utilizando o éster de Boc-AOA-N-hidroxi-succínimida, conforme descrito supra.

[0121] A seguir à clivagem e à desprotecção utilizando 3,5 mL da mistura fenólica an-teriormente descrita, purificou-se a MOCA de AOA-Pep C (SEQ ID N° 10) por CLER-FI (produção = 8 mg). O valor determinado para a massa molecular da MOCA de AOA-Pep C por EM-IEP foi de 2308,56 ±0,11 daltons comparativamente com o valor calculado de 2308,576 daltons. Guardou-se a MOCA de AOA-Pep C conforme descrito antes, tendo-se mantido estável pelo menos durante vários meses.

Exemplo 3. Montagem paralela de hexa-PTTC-polioximas por ligação quimiosselectiva de hexa-GXL-placa de base e das MOCA de AOA-PTTC

[0122] A montagem paralela de hexa-PTTC-polioxima foi iniciada por adição de 200 pL de AOA-PTTC (SEQ ID N° 4) (10 mM em tampão de acetato de sódio 0,1 M a pH 4,6) a 6,7 pL de hexa-GXL-estrutura da placa de base (SEQ IDN°6) (10 mM em água). Depois de efectuada a mistura deixou-se a reacçao de oximação prosseguir à temperatura ambiente. O produto AOA--PTTC (2 pM) estava presente numa quantidade molar cinco vezes superior à da placa de base (67 nmol; cerca de 400 nmol de grupos GXL). A estrutura do produto previsto hexa-PTTC--polioxima está ilustrada na figura 1.

[0123] A intensidade da ligação quimiosselectiva foi verificada medindo a formação da hexa-PTTC-polioxima por CLER-FI, utilizando para tal a coluna de 4 mm de d.i.. A eluição foi efectuada com um caudal de 0,6 mL/minuto com o solvente A a 100% durante 5 minutos, seguindo-se um gradiente de solvente B a 2%/minuto variando desde 0 até solvente B a 100%. A eluição da amostra foi verificada por adsorção a 240 nanómetros. Os cromatogramas obtidos ao fim de 3 horas (figura 2) e 18 horas após a incubação (figura 3) estão também representados. Ao fim de 3,5 horas de incubação, o pico da polioxima, quando analisada num gradiente mais raso, revelou a existência de uma mistura de formas de tri-, tetra-, penta- e hexa-oximas (dados não representados). A formação da hexa-PTTC-polioxima ficou praticamente completa ao fim de 18 horas de incubação.

[0124] Depois de terminada a reacção purificou-se o produto hexa-PTTC-polioxima por CLER-FI preparativa. As misturas de reacção em escala preparativa foram purificadas em porções de 0,5 mL numa coluna de 250 x 20 mm de d.i. carregada com ‘Nucleosil 300A’ de 5pm, em C8. A eluição teve lugar com um caudal de 4 mL/minuto no caso do solvente A a 100%, durante 5 minutos, a que se seguiu a aplicação de um gradiente linear de solvente B a 1%/minuto até à concentração final de solvente B a 100%.

[0125] O excesso de AOA-PTTC eluiu com um tempo de retenção de 44 minutos e o produto hexa-PTTC-polioxima eluiu com um tempo de retenção de 50 minutos. Tanto o produto hexa-PTTC-polioxima como excesso de AOA-PTTC foram recuperados durante a purificação. Após uma dessecação em sistema hipobárico, calculou-se uma produção de 11 mg de hexa-PTTC-polioxima obtida a partir de 45 g de AOA-PTTC e de 1,4 mg de placa de base de hexa-GXL.

[0126] A hexa-PTTC-polioxima foi caracterizada por electroforese em gel de poli-acrilamida na presença de dodecil-sulfato de sódio (EGPA-DSS), utilizando o sistema ‘Phast’ (Pharmacia). As amostras de proteínas foram aplicadas sobre um gel a 20% e a electroforese foi realizada a 15°C e a 90 volt-hora, sendo a visualização obtida por contrastação com prata. Em pistas paralelas decorreram as experiências com as proteínas de pesos moleculares padrão (Pharmacia), incluindo fosforilase B (94 kDa), albumina do soro de bovino (67 kDa) 59 ovalbumina (43 kDa), anidrase carbónica (30 kDa), inibidor de tripsina de soja (20,1 kDa) e a-lactalbmnina (14,4 kDa), conforme indicado na figura 4.

[0127] Conforme se observa na figura 4, o produto hexa-PTTC-polioxima migrou como banda principal com um peso molecular aparente de cerca de 14 kDa, que é superior ao peso molecular previsto de cerca de 10 quilodaltons (kDa). O peso molecular superior é devido provavelmente à estrutura ampliada previsível do produto hexa-PTTC-polioxima. A presença de bandas esbatidas de maior mobilidade na pista da amostra é devida provavelmente a uma decomposição parcial de amostra, pelo facto de se ter fervido essa amostra antes de a carregar no gel. Seguidamente discute-se a estabilidade do produto hexa-PTTC-polioxima.

[0128] Determinou-se o peso molecular mais exactamente por espectrometria de massa por ionização por electropulverização. A massa molecular medida para o produto foi de 10367,41 ± 1,28 daltons (figura 5), cujo valor é bastante aproximado do peso molecular previsto de 10 365,49 daltons para a ligação quimiosselectiva de 6 MOCA de PTTC (SEQID N° 4) a hexa-GXL-estrutura da placa de base (SEQ ID N° 6).

[0129] Determinou-se a estabilidade do produto hexa-PTTC-polioxima efectuando a incubação da hexaoxima (0,1 mg/mL) à temperatura ambiente durante 48 horas em ATF a 0,1% (pH 2,1), durante 24 hortas em acetato de sódio 0,1 M (pH 4,6) ou durante 30,5 horas em soluto salino tamponado com fosfato (pH 7,0). A seguir à incubação as amostras foram analisadas por CLER-FI. Conforme se observa na figura 6, o produto hexa-PTTC-polioxima manteve-se estável quando incubado a diversos valores o pH.

Exemplo 4. Montagem paralela de hexa-Pep C-polioximas por ligação quimiosselectiva de uma hexa-GXL-placa de base e das MOCA de AOA-Pep C 60 7ii [0130] A montagem paralela do produto hexa-Pep C-polioxima começou mediante a adição de 30 pL de AOA-Pep C (10 mM em acetato de sódio 0,1 M a pH 4,6) a 1 pL de hexa--GXL-estrutura da placa de base (10 mM em água) e realizando a incubação da mistura à temperatura ambiente. O produto AOA-Pep C (SEQID N° 10) estava presente numa quantidade molar de grupos AOA cinco vezes superior em relação em cada grupo GXL na estrutura da placa de base (SEQ ID N° 6). A estrutura do produto previsível hexa-Pep C-polioxima está indicada na figura 1.

[0131] Verificou-se a intensidade da ligação quimiosselectiva medindo a formação da hexa-Pep C-polioxima por CLER-FI na coluna de 4 mm de d.i.. Realizou-se a eluição com um caudal de 0,6 mL/minuto com o solvente A a 100% durante 5 minutos, seguindo-se um gradiente de solvente B a 2%/minuto até à concentração final de solvente B a 100%. A figura 8 mostra o cromatograma obtido ao fim de 18 horas de incubação. Conforme se observou para a formação do produto hexa-PTTC-polioxima, também a formação do produto hexa-Pep C-polioxima ficou praticamente completa ao fim de 18 horas de incubação. A reacção terminou realizando a CLER-FI preparativa, conforme descrito no exemplo 3 anterior.

[0132] Recorrendo à espectrometria de massa por ionização por electropulverização, conforme descrito supra, mediu-se o peso molecular do produto hexa-Pep C-polioxima, tendo sido obtido o valor de 14 965,96 ± 1,44 daltons, comparável com o valor previsto de 14966,58 daltons para a ligação das 6 MOCA de AOA-Pep C à estrutura da placa de base (SEQ ID N° 6) (figura 9). Para efeitos de comparação, está ilustrado também um espectro de massa obtido por ionização por electropulverização, resultante de uma experiência em que as MOCA de AOA-Pep C (SEQ ID N° 10) foram quimiosselectivamente ligadas a octa-GXL-estrutura da placa de base (SEQ ID N° 9) (figura 10). Repetindo mais uma vez, o valor medido de 61 19916,61 ± 3,05 é comparável ao valor previsto de 19 916,097 daltons para uma polioxima contendo 8 MOCA de Pep C.

Exemplo 5. Montagem paralela de hexa-PTTC-polioximas por ligação quimiosselectiva de uma hexa-AOA-placa de base e das MOCA de GXL-PTTC

[0133] A montagem paralela do produto hexa-PTTC-polioxima começou adicionando 1 pL de hexa-AOA-estrutura da placa de base (10 mM em água) a uma mistura que continha 180 pL de tampão de acetato de sódio 0,1 M a pH 4,6 e 30 pL de MOCA de GXL-PTTC (SEQ ÍD N° 3) (10 mM em água). Misturou-se a amostra e incubou-se à temperatura ambiente. O produto GXL-PTTC encontrava-se presente com um excesso molar cinco vezes superior por cada grupo AOA na placa de base (SEQ ID N° 5). A estrutura prevista para o produto hexa--PTTC-polioxima está ilustrada na figura 11 que é semelhante, com a excepção da estereoquímica das pontes oxima, à estrutura da figura 1.

[0134] Verificou-se a intensidade da ligação quimiosselectiva por CLER-FI, conforme descrito supra, estando a formação do produto hexa-PTTC-polioxima completa ao fim de 56 horas de incubação. Não ocorreu mais nenhuma modificação durante um período de observação de 75 horas. Terminou-se a reacção e purificou-se o produto hexa-PTTC-polioxima por CLER-FI preparativa.

[0135] Mediu-se o peso molecular, tal como determinado por espectrometria de massa por ionização por electropulverização, tendo sido obtido o valor de 10 365,72 daltons, que é comparável ao peso molecular previsto de 10 365,49 daltons admissível para a ligação das seis MOCA de PTTC à estrutura da placa de base. O peso molecular medido também é bastante idêntico ao peso molecular do produto indicado na figura 1, cujo valor medido foi de 10367,41 daltons (ver a figura 5). 7íS>«

Exemplo 6. Preparação de uma polioxima utilizando uma MQCA que possui um aldeído no terminal C

[0136] Ligou-se quimiosselectivamente o inibidor de protease, a leupeptina (Sigma Chem. Co), que contém um grupo aldeído no terminal C, a uma hexa-AOA-estmtura de placa de base (SEQ ID N° 5). Acrescentou-se 30 pL de leupeptina (10 mM em água) e 180 pL de tampão de acetato de sódio (0,1 M a pH 4,6) a 1 pL de hexa-AOA-placa de base (10 mM em água). Após a incubação da mistura de reacção durante 165 horas à temperatura ambiente, removeu-se 20 mL da mistura de reacção e analisou-se por CLER-FI, utilizando o gradiente convencional de solvente B a 2%/minuto, desde 0% até 100% de solvente B, conforme descrito no exemplo 1. O produto hexa-leupeptina-oxima eluiu com um tempo de retenção de 43 minutos. Mediu-se o peso molecular do produto hexa-leupeptina-oxima por espectrometria de massa por electropulverização, tendo sido obtido o valor de 3776,45 ± 0,70 daltons, que é comparável de forma muito aproximada ao valor previsto de 3775,66 daltons.

Exemplo 7. Imunização utilizando o produto hexa-MOCA-polioxima [0137] Injectou-se cerca de 100 pg de hexa-MOCA-polioxima, que é o produto hexa--PTTC-polioxima ilustrado na figura 1, em adjuvante completo de Freund, por via subcutânea em cerca de 10 locais de cada coelho de um grupo de vários coelhos. A intervalos de cerca de 4 a 6 semanas foram administradas aos coelhos injecções de reforço que continham 50 pg de hexa-MOCA-polioxima em adjuvante incompleto de Freund. Decorridos cerca de 10 a 14 dias após uma injecção de reforço procedeu-se à extracção de amostras de sangue dos coelhos e ao isolamento do soro sanguíneo. O soro revelou a existência de interreactividade com a hexa-PTTC-polioxima utilizada como antigénio. Qualquer especialista na matéria sabe que é 63 possível fazer variar a quantidade de antigénio utilizado, o tipo de adjuvante, o local e o método de injecção e o calendário de administração das injecções (ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988), capítulo 5). O anti-soro retirado de animais imunizados com o produto hexa--PTTC-polioxima reagiu com o antigénio hexa-PTTC-polioxima. O anti-soro não interreagiu com a proteína PTTC num ensaio de imunotransferência em que a proteína PTTC foi separada por EGPA-DSS bidimensional e foi hibridada com anti-soro, a que se seguiu a aplicação de anti--soro de coelho conjugado na cabra. De igual modo, uma estrutura de octa-PTTC-PAM levou à produção de anticorpos contra o produto octa-PTTC-PAM (PAM é o “Péptido Antigénico Múltiplo” (o mesmo que MAP) descrito por Tam e Zavala (1989)), que não interreagiu com a proteína PTTC mas que originou, em contraste com o produto hexa-PTTC-polioxima, um espúrio ao interreagir com a cadeia β da haptogjobina no ensaio de imunotransferência. Os anticorpos podem ser detectados recorrendo, por exemplo, a um ensaio de imunotransferência e podem ser purificados em conformdiade com métodos bem conhecidos na especialidade (ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988), páginas 178-178 e capítulo 8).

Exemplo 8. Preparação de uma polioxima que possuí um grupo produtor de um sinal [0138] Os grupos produtores de sinais são acoplados a uma MOCA ou à estrutura da placa de base antes ou após a reacção de oximação. Efectua-se o acoplamento de um éster de N-hidroxi-succínimida derivado de biotina ou um éster de Boc-biocitina-N-hidroxi-succmimida a um grupo amino α de H-Gh3[Lis(Boc-Ser(benzil)]5-Gli-resina de PAM nas condições convencionais utilizadas para a síntese de péptidos, conforme descrito antes. Em alternativa, efectua-se o acoplamento de um grupo quelador, tal como um grupo Fmoc-Lis (éster penta-t--butílico de AEDT)-OH a um grupo amino α da estrutura da placa de base, utilizando para tal métodos bem conhecidos na especialidade (ver, por exemplo, Rana et al, Tetrahedron Lett. 33:4521-4524 (1992), obra que aqui se considera incorporada por referência). Nem a biotina nem o AEDT (o mesmo que EDTA) são danificados pela reacção de clivagem-desprotecção, nem pela reacção de oxidação da placa de base de GXL nem pela reacção de oximação da estrutura marcada da placa de base com as AOA-MOCA. A poli-MOCA-oxima resultante contém um grupo biotina ou AEDT no terminal amino.

Exemplo 9. Acoplamento de polioximas a uma superfície sólida [0139] Para se efectuar o acoplamento de uma polioxima a uma superfície sólida é possível recorrer à ligação quimiosselectiva. Por exemplo, é possível acoplar uma polioxima a uma superfície recorrendo à química do tiol. Obtém-se o produto bromoacetil-GlÍ3-[Lis(Ser)]5--Gli-OH mediante técnicas convencionais da síntese de péptidos em fase sólida, sendo oxidado para gerar penta-GXL-placa de base (SEQID N° 8) e oximado com as AOA-MOCA e depois é purificado por CLER-FI, conforme descrito supra.

[0140] Os grupos tiol são acoplados às superfícies utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. Utiliza-se para tal um material sólido que contenha grupos aminopropilo na sua superfície, o qual é em primeiro lugar acilado por tratamento com éster de N-hidroxi-succínimida do ácido S-acetil-tioacético. A superfície acilada é então tratada com uma solução aquosa diluída de hidroxilamina para desacilar e para expor os grupos tiol reactivos. A bromo-acetil-polioxima é acoplada aos grupos tiol sobre a superfície sólida mediante a formação de uma ponte tioéter em condições aquosas suaves para valores de pH entre 4 e 9. De preferência, a formação dos grupos tioéter tem lugar a pH entre 6,5 e 7,5 (ver, por exemplo, Brinkley, M., Bioconj. Chem. 3:2-13 (1992), obra que aqui se considera incorporada por referência). O material não ligado é retirado por lavagem da superfície. 7^>65

Exemplo 10. Acoplamento célula-célula mediado pelas polioximas ligadas [0141] Há dois tipos diferentes de polioximas que são sintetizadas utilizando os métodos descritos supra. Um desse tipos de polioximas contém as MOCA que reconhecem e se vão ligar a um antigénio tumoral. O outro tipo de polioximas contém as MOCA que reconhecem e se vão ligar a um receptor da superfície celular presente, por exemplo, num macrófago, numa célula T ou numa célula aniquiladora. Os dois tipos de polioximas são construídos de talo modo que os terminais C ou os terminais N das estruturas da placa de base contenham grupos quimicamente reactivos ortogonais, tais como um grupo sulfidrilo ou um grupo bromoacetilo.

[0142] Os dois tipos de polioximas podem ser depois ligadas de fonna covalente por formação de tioéter sob condições aquosas suaves para valores de pH entre 4 e 9. De preferência, a formação de tioéter tem lugar a valores de pH entre 6,5 e 7,5. Depois de completada a reacção, as bipolioximas são purificadas por métodos convencionais, tais como a filtração através de gel ou por CLER-FI e são utilizadas de modo a intervirem indirectamente, mediando o acoplamento celular entre células que contenham os receptores adequados ou as moléculas destinatárias, por exemplo, um macrófago, uma célula T ou uma célula aniquiladora e uma célula tumoral. Tais bipolioximas são utilizadas para localizar células efectoras, tais como as descritas supra, numa célula destinatária relevante, por exemplo, uma célula tumoral.

[0143] Qualquer especialista na matéria sabe que foram já identificados inúmeros receptores diferentes de superfície celular e diversas moléculas destinatárias em diferentes tipos de células. Assim sendo, a bipolioximas são construídas por forma a intervirem indirectamente, mediando o acoplamento das células particulares relevantes.

[0144] Qualquer especialista na matéria se apercebe de que a bipolioximas podem conter um tipo de MOCA que reconheça e se ligue a uma célula particular e um segundo tipo de MOCA que séja útil, por exemplo, para efeitos de ligação de uma molécula repórter. Tais bipolioximas são úteis para a detecção da presença e para a determinação da posição da célula particular numa população heterogénea de células ou num animal. Em alternativa, o segundo tipo de MOCA pode ligar-se a uma molécula efectora, tal como a ricina, orientando consequentemente a molécula efectora para a célula particular relevante.

Exemplo 11. Montagem paralela das diversas polioximas análogas da hormona estimuladora dos melanócitos [0145] Procedeu-se à preparação dos polipeptidos sintéticos NH2OCH2 CO-Nle-Asp-His--(D-Phe)-Arg-Trp-Lis-OH e N H2OC H2CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lis-amida (sendo ambos análogos da hormona estimuladora dos melanócitos α (“HEM”) portadores de um grupo amino-oxi-acetilo no terminal N, tendo sido incubados separadamente com uma molécula da placa de base de poli(aldeído), v.g. tereftaldeído ou OCH-CO-Gh3-[Lis(COCHO)]5-Gli-OH (SEQ ID N° 6), em solução aquosa tamponada com tampão acetato a pH 4,6, à temperatura ambiente. A seguir às reacções de oximação foram realizadas as CLER de fase inversa, conforme descrito. As reacções com as placas de base de aldeídos divalentes e trivalentes foram rápidas (1 hora), ao passo que as reacções com placas de base de aldeídos hexavalentes ou octavalentes foram mais demoradas (cerca de 16 horas), tendo todavia prosseguido até ficarem quase completas. Caracterizou-se o produto final em cada um dos casos por espectrometria de massa. Todas as massas determinadas experimentalmente concordaram bastante bem com os valores calculados. As substâncias NH2OCH2CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lis-OH e NH2OCH2CO-Me-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lis-amida reagiram suavemente com o tereftaldeído para proporcionar os homodímeros p-QHdCH = NOCH2CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)- 67 -Arg-Trp-Lis-OH]2 e p-QH4[CH=NOCH2CO-Nle-Aq)-His-(l>Phe)-Aig-Tip-Li&*aimda]2. Na figura 12B está ilustrado o EM-IEP da forma -OH. De um modo geral, os produtos eram fortemente solúveis em água, embora esta propriedade dependa nitidamente da hidrofílicidade dos componentes utilizados. Foram obtidas espécies isoméricas invertendo a polaridade da ponte oxima.

[0146] Λ análise por CLER comprovou que as polioximas eram hidroliticamente estáveis à temperatura ambiente para os valores de pH 2,1, 4,6 e 7,0, pelo menos durante 24 horas. Verificou-se que a estabilidade hidrolítica das pontes oxima, para a qual se verificou que era influenciada pela sua estrutura, aumentava de acordo com a desigualdade seguinte: -CO-NH-CHrCH=N-0-CH2 < -NH-CO-CH=N-0-CHr < -C6H4-CH=N-0-CH2-. Assim ,a estabilidade de uma ponte oxima in vivo é suficiente para permitir estudos de biodistribuição que permitam ir seguindo um imunoconjugado durante vários dias em murganhos e também em estudos clínicos. Como é evidente, estas proteínas artificiais irão estar sujeitas a reacções de desamidação, oxidação, degradação microbiana, etc., tal como sucede com as proteínas e os polipeptidos naturais.

Exemplo 12. Síntese de uma placa de base de um aldeído divalente e de um trivalente [0147] Dissolveu-se ácido nitrioacético (Fluka, 64 mg, 1 mmol de grupos carboxilo), com recurso a ultra-sons, e aqueceu-se ligeiramente em 15 mL de DMF. Acrescentou-se 1 mmol de N -hidroxi-succínimida no estado sólido (Fluka) e dissolveu-se e depois juntou-se 1 mL de diciclo-hexil-cafbodiimida 1 M (Fluka). Depois de a reacção ter decorrido de um dia para o outro à temperatura ambiente já não restava nenhuma DCC e filtrou-se então a mistura de reacção para se remover qualquer precipitado de ureia de DCC. Acrescentou-se ao filtrado 68 1,2 mmol de amino-acetaldeído-dietilacetal (Fluka). Deixou-se reagir de um dia para o outro e acrescentou-se 30 mL de ácido trifluoroacético a 0,1% seguindo-se a adição de 1 mL de ATF a 0,1% em acetonitrilo a 90% e depois juntou-se 0,6 mL de ácido acético. Depois de se misturar muito bem removeu-se mais uma vez a ureia de DCC por filtração através de um filtro de membrana de ‘Teflon’. Purificou-se o produto em porções de 10 mL por CLER preparativa, utilizando a coluna de 250 x 20 mm já descrita, fazendo as verificações a 214 nm e trabalhando comum sistema de ATF com um caudal de 6 mL/minuto. Ao fim de 5 minutos com o solvente A (ATF 0,1%) aplicou-se um gradiente linear de solvente B a 2%tiiinuto (B = ATF a 0,1% em acetonitrilo a 90%). O tempo de retenção do acetal trivalente N[CH2-CO-NH-CH2-CH(OEt)2]3 foi de 42 minutos e o do acetal divalente N[CHrCONH-CH2-CH(OEt)2]2CH2C02H foi de 35 minutos. Os produtos foram identificados por EM-BAR: m/z 537 para Μ+Ι-Γ do acetal trivalente e 422 para M+Ff do acetal divalente.

[0148] Após a remoção dos solventes num evaporador rotativo e a seguir à bofilização, efectuou-se a desacetalização com ATF a 5% à temperatura de 37°C durante 2 horas. O trialdeído decomposto na solução de ATF a 5% foi evaporado directamente, pelo que o produto N[CH2--CO-NH-CH2-CHO]3 foi isolado mediante a injecção de pequenas quantidades (30 pL) na coluna preparativa a trabalhar isocraticamente com o solvente A com um caudal de 6 mL/minuto e efectuando a lavagem da coluna com o solvente B a 100% entre injecções. O ATF em excesso resultante da desprotecção eluiu com um tempo de retenção de 11 minutos e o produto de placa de base do trialdeído eluiu aos 13 minutos. Ajustou-se o valor do pH da solução de trialdeído para cerca de 3 com NaOH 1M e guardou-se a -20°C. A placa de base do aldeído divalente foi isolada de igual modo.

Exemplo 13. Preparação de polioximas divalentes assimétricas e trivalentes simétricas [0149] Efectuou-se a oximação entre a placa de base trivalente simétrica N[CH2-CO-NH--CH2-CHO]3 e o análogo de ácido livre do exemplo 11 amino-oxi-acetil-a-MSH, conforme anteriormente descrito. Procedeu-se à preparação de mono-, di- e tri-oximas. Estes produtos eluíram a partir da CLER analítica (coluna de 250 x 4 mm de d.i., 0,6 mL/minuto, gradiente de solvente B a 2%/íninuto) respectivamente com tempos de retenção de 32,35 e 36 minutos.

Exemplo 14. Síntese de uma placa de base de acetil-cisteína [0150] Acrescentou-se 0,2 mmol de Fmoc-Cis(Trt)-OSu em 20 mL de DMSO anidro a 0,1 mmol de H-Gfr3-Lis[Boc-Ser(Bzl)-]5-GU-<X?H2-resina de PAM. A sigla: “OSu” indica a forma éster de N -hidroxi-succinimida. Decorridas algumas horas de mistura efectuada a um valor de pH aparente igual a 8 (ajustado com N-metil-morfolina), a acilação estava completa, conforme determinado pelo teste da ninidrina. Removeu-se o grupo Fmoc utilizando DMF/ /piperidina e acetilou-se o grupo amino livre resultante, utilizando para tal 5 equivalentes de anidrido acético em DMF e tendo a N-metil-morfolina servido de base. O procedimento de clivagem/desprotecção foi efectuado do modo seguinte: a 100 mg de resina acrescentou-se 150 pL de tioanisol/etanol-ditiol (2:1 em volume); após 10 minutos de agitação à temperatura ambiente acrescentou-se 1 mL de ATF, tendo a agitação prosseguido durante mais 10 minutos; a seguir acrescentou-se lentamente 100 pL de ATFMS (ácido trifluorometano-sulfónico), sob agitação vigorosa, e deixou-se a reacção prosseguir durante 25 minutos sob agitação; acrescentou--se então éter dietílico frio (10 mL) para fazer precipitar o péptido; decorrido 1 minuto de agitação recuperou-se o precipitado por centrifugação conjuntamente com a resina recém--clivada; o péptido impuro foi dissolvido em 0,5 mL de ATF e depois filtrou-se para se 70 remover a resina, através de um filtro de ‘Teflon’, e a seguir fez-se precipitar novamente com éter irio. Purificou-se o produto por CLER numa coluna de 250 x 4 mm de d.i. a trabalhar com o sistema de ATF com um caudal de 0,6 mL/minuto e com o solvente B a 1%/minuto após um período inicial de 5 minutos com solvente A a 100%. O produto eluiu como pico principal com um tempo de retenção de 25 minutos e foi caracterizado por EM-IEP (valor encontrado 1467,92 ± 0,79; valor calculado 1466,62).

Exemplo 15. Preparação de heteropolioximas [0151] Limitando a quantidade de péptido modificado que se acrescentou à placa de base multivalente, formaram-se rapidamente produtos parciais da reacção que foram facilmente isolados. Por exemplo, o produto NH2OCH2CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lis-OH reagiu suavemente com um excesso cinco vezes superior de tereftaldeído (grupos aldeído num excesso 10 vezes superior) para proporcionar o produto OCH-C6H4-/>CH=NOCH2CO-Nle-Asp-His--(D-Phe)-Arg-Trp-Lis-OH que foi isolado por CLER e caracterizado por EM-IEP (figura 12A). A reacção desta monooxima com um excesso ligeiro de NH20CH2C0-Lis-Leu-Glu--Glu-Gln-Arg-Pro-Glu-Arg-Val-Lis-Gli-OH (SEQ Π) N° 4) proporcionou rapidamente a oxima heterodimérica esperada, /?-C6H4[CH=NOCH2CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lis--OH][CH=NOCH2CO-Lis-Leu-Glu-Glu-Gln-Arg-Pro-Glu-Arg-Yal-Lis-Gli-OH] que foi ca-racterizada por EM-IEP (figura 12C). Obteve-se um heterodímero semelhante, utilizando NH2OCH2CO-Lis-Leu-Glu-Gln-Arg-Pro-Glu-Arg-Val-Lis-Gh-OH (SEQ ID N° 13) em vez de NH2OCH2CO-Lis-Leu-Glu-Glu-Gln-Arg-Pro-Glu-Arg-Val-Lis-Gh-OH (SEQ ID N° 4), que também foi caracterizado por EM-IEP (figura 12D).

Exemplo 16. Acoplamento de um grupo reactivo complementar a uma cadeia lateral de cisterna dos péptidos por alquilacão e subsequente formação da polioxima [0152] Efectuou-se a síntese dos compostos (i) Br-CH2-CO-NHCH2CH2NH-CO-CH2--O-NH-Boc e (ii) Br-CH2-C0-NHCH2CH2NH-C0-CH2-0-NH2 conforme a seguir se descreve. A10 mmol de Boc-NHOCH2CO-OSu dissolvido em 85 mL de acetato de etilo juntou-se 1,35 mL (20 mmol) de etileno-diamina, com agitação. Decorrida 1 hora à temperatura ambiente removeu--se por centrifugação o precipitado formado e a seguir removeu-se o solvente por evaporação rotativa, sem aquecimento. O resíduo viscoso resultante foi então retomado com 10 mL de ácido acético a 1%. Nesta altura removeu-se por centrifugação uma pequena quantidade de material diméiico insolúvel. Arrefeceu-se a solução aquosa com gelo e depois aplicou-se a uma coluna ‘Dowex-50W 8’ de malha 200-400 (na forma H4) previamente equilibrada com água, acondicionada numa seringa descartável de polipropileno com a capacidade de 10 mL, e arrefeceu-se com gelo. Utilizou-se o gelo para reduzir as perdas do grupo de protecção Boc após a libertação dos protões pela resina durante o acoplamento da amostra. Efectuou-se a eluição da coluna de ‘Dowex’ com um caudal de cerca de 0,5 mL/minuto com um gradiente de tampão de acetato de piridina, preparado mediante a ligação de um compartimento de 40 mL, que continha tampão a pH 3,5 (piridina/ácido acético/água, 10:100:890 em volume), a uma câmara de 40 mL que continha tampão a pH 6,5 (piridina/ácido acético/água, 250:10:2250 em volume), com a corrente a sair do compartimento a pH 3,5. O efluente da coluna foi verificado por CCF em placas de sílica, utilizando um sistema constituído por butano-l-ol/ácido acético/água/acetona (7:2:4:7, em volume), a que se seguiu a contrastação com ninidrina. O composto intermediário (iii) NH2CH2CH2NH-C0-CH2-0-NH-Boc foi o primeiro material positivo à ninidrina a emergir (o valor do Fr (factor de retenção) foi de cerca de 0,7 no sistema anterior; o valor do Fr para o material desBoc foi de cerca de 0,4; o valor do Fr para a etileno--diamina foi de cerca de 0,07). Depois de efectuada a remoção do solvente por evaporação rotativa com aquecimento, diluiu-se o resíduo com água e liofilizou-se até se obter um óleo incolor. Realizou-se a purificação final por CLER preparativa de fase inversa na coluna com o diâmetro interno de 20 mm, tendo sido utilizado o sistema de ATF com um caudal de 5 mL/ /minuto, a trabalhar isocraticamente durante 10 minutos com o solvente A a 100%, seguindo--se a aplicação de um gradiente linear de solvente B até se chegar à concentração de solvente B a 100% ao longo de 15 minutos, com as verificações feitas a 229 nanómetros. O material pretendido era o único pico principal a seguir à frente de solvente e tinha um tempo de retenção de cerca de 33 minutos. O produto intermediário foi identificado como sendo a substância (iii) por espectrometria de massa por ionização por electropulverização.

[0153] A 250 mg de BrCH2CO-Osu dissolvido em 2 mL de DMSO acrescentou-se, sob agitação, uma solução de 110 mg do composto (iii) dissolvido em 1 mL de DMSO. Ajustou--se o valor aparente do pH (medido com uma fita da Merk indicadora de pH, previamente molhada com água) para cerca de 8 mediante a adição de 50 pL de N-metil-morfolina. Decorridos 20 minutos (o pH caiu para cerca de 4) acrescentou-se 25 mL de água. Removeu-se por filtração uma pequena quantidade de precipitado e depois isolou-se o produto por CLER--FI, tal como descrito antes. Neste caso a amostra foi aplicada em porções de cerca de 8 mL. Ao fim de um período de 5 minutos a trabalhar isocraticamente com o solvente A a 100% aplicou-se então um gradiente linéar de solvente B a 2%/minuto com as verificações feitas a 229 nm. O produto foi o único pico principal após o aparecimento da frente de solvente e teve um tempo de retenção de cerca de 41 minutos. Isolou-se o produto por evaporação rotativa, seguindo-se a liofílização. Obteve-se uma quantidade de cerca de 100 mg. O material obtido, 73 caracterizado como sendo o composto (i) por espectrometria de massa por ionização por electropulverização, tinha o padrão esperado do isótopo do bromo em tomo do valor M+H 355.

[0154] Preparou-se o composto (ii) efectuando a remoção do grupo Boc do composto (i) mediante a dissolução deste último, a 50 mg/mL, em ácido trifluoroacético durante 30 minutos à temperatura ambiente, seguindo-se a secagem sob vácuo intenso.

[0155] Efectuou-se a retoma dos compostos (i) e (ii) em água, respectivamente nas concentrações de 40 e 50 mg/mL, para efeitos de alquilação. Preparou-se o péptido acetil--Asp-Cis-Thr-Leu-He-Asp-Ala-Leu-Leu-Gli-Asp-Pro-His-amida (SEQ Π) N° 20; um epítopo do vírus da gripe de células T; ver Brown et al, J. Virol. (1993) 67:2887-2893), pelas técnicas convencionais dos grupos Fmoc num sintetizador de modelo ‘ABI 430A’, e purificou-se por CLER de fase inversa e identificou-se por espectrometria de massa por ionização por electropulverização: os valores encontrado e calculado para o peso molecular foram de 1423,6. Dissolveu-se o péptido até à concentração de 1,5 mmol em água/acetonitrilo (2:1 v/v). A 100 pL de ácido trifluoroacético a 0,1% acrescentou-se 20 pL da solução do péptido, 20 pL da solução de reagentes (composto (i) e (ii) e 20 pL de tampão de fosfato 1 M (ião simétrico do sódio, pH 7,0). As reacções foram efectuadas à temperatura ambiente. A CLER analítica de fase inversa com o sistema de ATF revelou a existência de uma reacção quantitativa em menos de 30 minutos com qualquer dos compostos (i) e (ii): o péptido que não reagiu (tempo de retenção de 39 minutos) estava ausente e foi substituído por um novo pico para qualquer dos tempos de retenção de 37 minutos (no caso da reacção com o composto (ii)) ou de 41 minutos (no caso da reacção com o composto (i)). Não houve mais nenhuma reacção nas 3 horas subsequentes. Na ausência dos reagentes (i) ou (ii) o péptido oxidou lentamente em dímero de dissulfúreto (cerca de 30% ao longo de 6 horas). Os produtos das reacções de

74 alquilação foram identificados por espectrometría de massa por ionização por electropulve-rização: para o produto obtido com o reagente (i) mediu-se um peso molecular de 1697,0, sendo o valor calculado de 16%,9; para o produto obtido com o reagente (ii) mediu-se um peso molecular de 1596,6, sendo o valor calculado de 1596,8.

[0156] No caso dos polipeptidos alquilados com o composto (i), removeu-se o grupo Boc por meio de um tratamento convencional com ATF antes da oximação. Este tratamento não foi necessário para os polipeptidos alquilados com o composto (ii). Recomenda-se o reagente (i) no caso do péptido alquilado ter de ser guardado durante períodos longos, ao passo que o reagente (ii) é recomendado para ser utilizado com os polipeptidos grandes ou frágeis (tais como fragmentos de anticorpos) que não sobrevivem facilmente intactos com o tratamento para a remoção do grupo Boc.

[0157] Preparou-se outro reagente de alquilação Br-CH2CH2CH2NH-COCH2ONH--Boc por acilação de Br-CH2CH2CH2NH2 (pode ser obtido como bromidrato na empresa Aldrich, Milwaukee, WI) com Boc-AOA-OSu. Este halogeneto de alquilo foi utilizado para alquilar o péptido do vírus da gripe que continha Cis, descrito antes. A reacção decorreu muito lentamente à temperatura ambiente, mesmo com concentrações milimolares.

Exemplo 17. Montagem paralela de péptidos que possuem grupos reactivos complementares amino-oxi-acetilo ligados por tioéter [0158] Foram utilizados os polipeptidos portadores de um grupo amino-oxi-acetilo livre acoplado a uma cadeia lateral de Cis através de uma ponte tioéter nas reacções de oximação, tal como descrito antes a propósito dos polipeptidos portadores de um grupo amino-oxi-acetilo no terminal N ou no terminal C. Isto constitui um método para a produção de polioximas 75 possuidoras de uma MOCA ligada a uma placa de base por meio de uma cadeia lateral de Cis através de pontes tioéter e oxima. Foram utilizados os derivados polipeptídicos do exemplo 16 com as placas de base aqui descritas para a criação de diversas polioximas. Por exemplo, é possível formar a tetraoxima entre acetil-Asp-Cis(CH2C0NHCH2CH2NH-C0CH20NH2)--Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu-Gli-Asp-Pro-His-amida (SEQ ID N° 21) e a placa de base GXL-Lis(GXL)-Lis(GXL>Lis(GXL))-Tir-OH (SEQ ID N° 31). A placa de base foi formada ao longo dos passos que consistiram em acoplar Fmoc-Lis-(Fmoc) a Tir-(tBu)-resina de Sasrin, remover o grupo Fmoc (desFmoc), reacoplar Fmoc-Lis(Fmoc), operação de desFmoc, acoplar Boc-Ser(tBu), efectuar a operação de clivagem/desprotecção e realizar a oxidação de Ser em GXL. Também se preparou AOA-Lis(AOA)-Lis(AOA)-Lis(AOA))-Tir-OH.

Exemplo 18. Acoplamento de um grupo reactivo à cadeia lateral da cisteína através de uma ponte dissulfureto [0159] Os compostos (iv) 2-pmdil-S-SOH2CH2NH-CO-CH2-0-NH-Boc e (v) 2-piridil--S-S-CH2CH2NH-CO-CH2-O-NH2 foram sintetizados conforme a seguir se descreve. Acilou--se dicloridrato de cistamina em DMF com Boc-NHOCEhCO-OSu, utilizando como base N--metil-morfolina e uma quantidade de éster activo em excesso de 20% em relação aos grupos amino. Após a diluição com 3 volumes de água extraiu-se com acetato de etilo o produto acilado e purificou-se numa coluna de gel de sílica, utilizando diclorometano/metanol (240:10) como solvente. O produto, bis(Boc-amino-acetfi)-cistamina revelou um pico único por CLER analítica e tinha 0 espectro de massa previsto. A ponte dissulfureto foi reduzida com um excesso cinco vezes superiores de ditiotreitol em solução de bicarbonato de amónio a 1% e 0 produto resultante Boc-amino-oxi-acetil-cistamina foi isolado por CLER preparativa. Fez-se reagir o grupo tiol com 2,2-ditiodipiridina (um excesso 5 vezes superior em tampão de acetato

76 de sódio 0,1 M a pH 4,6) para se obter o composto (iv) que foi isolado (conjuntamente com o reagente em excesso) por extracção com éter dietílico. A adição de uma pequena proporção de éter de petróleo fez precipitar a maior parte do reagente em excesso, proporcionando o composto (iv) em solução. Após a evporação rotativa purificou-se o composto (iv) por CLER e caracterizou-se por espectrometria de massa por ionização por electropulverização (M+H 360,5). A transformação do composto (iv) em composto (v) foi conseguida por meio de um tratamento convencional com ATF (1 hora, temperatura ambiente).

[0160] Os compostos (iv) e (v) reagiram perfeitamente, através do grupo 2-tiopiridilo, com os péptidos que continham o resíduo Cis, em condições aquosas suaves, v.g. em tampão de acetato a pH 4,6 ou em tampão de fosfato a pH 7 com fracas concentrações milimolares dos reagentes a 22°C; a reacção ficou completa ao fim de 10 minutos). Por exemplo, os compostos (iv) e (v) reagiram com os péptidos acetil-Asp-Cis-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu--Gh-Asp-Pro-His-amida e AOA-Asp-Cis-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu-Gli-Asp-Pro-His-Amida (SEQ ID N° 22). Purificou-se o produto acetil-Asp-Cis(S-CH2CH2NHCOCH2ONH-Boc)-Thr--Leu-fle-Asp-Ala-Leu-Leu-Gli-Asp-Pro-His-amida (SEQ ID N° 30) por CLER e caracterizou--se por espectrometria de massa por ionização por electropulverização: valor medido da massa molecular igual a 1671,1, valor calculado da massa molecular igual a 1671,9. O resíduo Cis possui um átomo de S por convenção, pelo que Cis(S-CH2CH2NHCOCH20NH-Boc) na estrutura referida antes indica, por exemplo, uma cadeia lateral que contém uma ponte dissulfureto, estando essa cadeia entre o átomo S do resíduo Cis e o átomo S de S-CH2CH2NHCOCH2NH--Boc. Esta convenção é utilizada em toda a memória descritiva. Os derivados peptídicos resultantes possuíam um grupo amino-oxi-acetilo (ou um grupo amino-oxi-acetilo protegido) acoplado através de uma ponte dissulfureto. 77 7ί*> [0161] Ο grupo amino-oxi-acetilo e o grupo ditiopiridilo podem estar presentes na mesma MOCA peptídica. Por exemplo, obteve-se o produtoNH2OCH2CO-Aps-Cis(S-2-piridil)-Thr--Leu-Qe-Asp-Ala-Leu-Leu-Gli-Asp-Pro-His-NH2 (SEQID N° 23) fazendo reagir a forma -SH de AOA-péptido com 2,2’-ditiodipiridina (a pH 4,6, as condições descritas antes). Isolou-se o péptido purificado por CLER e obteve-se o espectro de massa previsto, por ionização por electropulverização. Fez-se reagir esta MOCA peptídica numa mistura tampão de acetato 0,1 M (ião de sódio simétrico) e de acetonitrilo (2:1 v/v) com uma placa de base de tetraldeído que foi obtida conforme a seguir se descreve. Construiu-se a placa de base a partir da estrutura cíclica descrita por Mutter (Tuchscherer et ah, em Peptides, 1992, Schneider, C.H. e Eberle, A.N., eds. ESCOM, Leiden, (1993), pp 848-849) que possui uma ponte dissulfiireto entre os dois resíduos Cis(C): Ac-Cis-Lis-Ala-Lis-Pro-Gli-Lis-Ala-Lis-Cis-NH2 (SEQ ID N° 24). As quatro cadeias laterais de Lis (K) deste precursor modelar foram aciladas com Boc-Ser(tBu)-OSu em condições convencionais. Isolou-se o produto acilado por CLER e retirou-se a protecção dos grupos Boc e butilo por tratamento com ATF à temperatura ambiente durante 1 hora. Removeu-se o ATA in vácuo sem aquecimento. O precursor da placa de base resultante, que revelou um pico único por CLER analítica e o espectro de massa previsto por ionização por electropulverização, foi oxidado com periodato, conforme descrito a propósito das placas de base anteriores e foi novamente isolado por CLER. Ao fim de 16 horas de oxidação à temperatura ambiente, isolou-se por CLER a tetraoxima esperada e caracterizou-se por espectrometria de massa por ionização por electropulverização: valor medido de peso molecular igual a 7479,31, valor calculado igual a 7479,43. A polioxima eluiu a partir da coluna analítica ao fim de 45 minutos, tendo sido utilizado para tal um gradiente de solvente B a 2%/minuto variando desde 0% até 100% de solvente B. 7íS* [0162] Conforme foi aqui determinado, a presença do grupo de protecção de 2-tio-piridilo nas cadeias laterais de Cis não impediu a formação da oxima.

Exemplo 19. As MQCA enquanto ligadores [0163] As próprias MOCA aqui preparadas podem ser utilizadas como ligadores. Por exemplo, o produto A0A-M0CA-NH20CH2C0-Asp-Cis(S-2-piridil)-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala--Leu-Leu-Gli-Asp-Pro-His-NH2 (SEQ ID N° 23), que possui simultaneamente funções de AOA e de grupo 2-tiopiridilo, foi utilizado como ligador para criar a MOCA seguinte que possui uma ponte dissulfureto entre os dois resíduos Cis: NH2OCH2CO-DCTLIDALLGDPH-NH2 CH3CO-DCTLIDALLGDPH-CH2

Exemplo 20. Síntese de uma placa de base trivalente com grupos aldeído aromáticos [0164] Sintetizou-se a placa de base

CH2CH2NH-CO-C6H4-p-CHO

I N-CHsCHzNH-CO-Qttrp-CHO (vi)

CH2CH2NH-CO-C6H4-p-CHO

conforme a seguir se descreve. Dissolveu-se 50 pL de tris(2-aminoetil)-amina (cerca de 1/3 mmol; Aldrich Chemical Co.) em 5 mL de DMSO e acrescentou-se ao éster de 4-carboxi-benzaldeído--hidroxi-succínimida (247 mg, 1 mmol, dissolvido em 5 mL de DMSO). Ao fim de 2 horas à temperatura ambiente acrescentou-se 20 mL de água. Decorridas mais 2 horas extraiu-se o produto com 2 x 10 mL de clorofórmio. Juntou-se as fases orgânicas e lavou-se o produto obtido com 10 mL de água e depois submeteu-se a evaporação rotativa até à secura total. O 79 sólido amarelo pálido assim obtido foi tratado com ultra-sons em 50 mL de água e depois foi filtrado e seco sob vácuo intenso para proporcionar 94 mg de um pó ligeiramente esbranquiçado. O produto eluiu comó componente principal único na CLER de fase inversa e foi identificado como sendo o composto (vi) por espectrometria de massa por ionização por electropulverização: valor medido do peso molecular igual ao valor calculado de 542 (543 M+H). Havia pequenos vestígios de um contaminante (menos de 10%) detectado na CLER e que foi identificado como sendo o composto (vi) ao qual faltava um grupo 4-carboxi--benzaldeído (M+H 411), isto é, a placa de base:

CH2CH2NH-CO-C6H4-p-CHO

I N-CH2CHjNH2 (vil)

I

CHjCHjNH-CO-QHrp-CHO

[0165] Para algumas aplicações este contaminante foi removido por CLER preparativa. A utilização de mais tris(2-aminoetil)-amina na reacção de acilação referida antes (e a mesma quantidade de éster activo) permitiu favorecer a produção de (vii) conforme previsto, tendo produto sido isolado facilmente por CLER preparativa, utilizando para tal o sistema de ATF.

[0166] Para os compostos (vi) e (vii) admite-se que a substituição para proporcione pelo menos uma obstrução espacial para a reacção de acilação e para a subsequente formação da oxima. O átomo de azoto central destas estruturas vai garantir a solubilidade em água, apesar de o trialdeído ser solúvel ao nível das concentrações milimolares utilizadas.

[0ΐ6η Os ligadores preferenciais são aqueles que possuem grupos terminais reactivos complementares, tal como aqui explicitado, que proporcionam homogeneidade ao produto de reacção (excepto no caso de ser utilizada uma série homóloga, conforme adiante descrito) e 80 que conferem outras funcionalidades (v.g. solubilidade ou a desejada conformação tridimensional), mas que não interferem com as reacções desejadas (quer sejam de alquilação, de formação de dissulfureto ou de formação de oxima).

Exemplo 21. Polioximas preparadas utilizando matrizes de aldeídos aromáticos.

[0168] Procedeu-se à preparação das polioximas utilizando as matrizes de trialdeídos e dialdeídos aromáticos (vi) e (vii), incluindo as oximas com os péptidos amino-oxi-acetilados, tal como descrito supra (por exemplo, com o análogo de HEM-α (o mesmo que a-MSH): AOA-Nle-Asp-His-(D)Phe-Arg-Trp-Lis-amida). As reacções foram acompanhadas por CLER-FI e por espectrometria de massa por ionização por electropulverização. As polioximas foram purificadas por CLER e caracterizadas por espectrometria de massa por ionização por electropulverização: todas elas tinham o peso molecular previsto. Comprovou-se que os compostos (vi) (vii) formavam oximas que eram particularmente resistentes à hidrólise e que eram também resistentes à redução com ciano-boro-hidreto de sódio (0,3 M) em ácido acético (0,33 M).

[0169] Sabe-se que o análogo Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lis da α-MSH se liga às células do melanoma mesmo quando modificado no grupo amino a e quando ligado a um homodímero através deste grupo (Bagutti et ai, Prog. Histochem. Cytochem. (1992) 26: 110--118). A actividade biológica da HEM pode ser medida, por exemplo, por meio de um ensaio com melanina efectuado in situ, em que o péptido é testado para se ver se estimula as células do melanoma B16-F1 (Bagutti 1992).

[0170] Determinou-se a ligação e a potência de algumas polioximas análogas da hormona estimuladora dos melanócitos a. A ligação relativa determinada no ensaio de ligação,

81 2% utilizando células de melanoma de murganho (Bagutti (1992)), corresponde à constante média de dissociação (Kd) verificada para a hormona natural de comprimento completo a dividir pelo valor de Kd para o análogo oxúnico agora em questão. A potência relativa no ensaio com melanina (Bagutti (1992)) corresponde à proporção entre a concentração (que proporcionam 50% do efeito máximo) da hormona de comprimento completo e a do análogo. São apresentados os resultados obtidos com o análogo da HEM-α, isto é, o produto Nle-Asp-His-(D)Phe-Arg--Trp-Lis-amida. A mono-oxima deste análogo de contraprova (o péptido amino-oxi-acetilado que foi oximado com acetaldeído) tinha uma ligação relativa de 0,82 e uma potência relativa de 1,78. A trioxima formada entre o péptido amino-oxi acetilado e o composto (vi) tinha uma ligação relativa de 4,9 e uma potência relativa de 0,24. A dioxima formada entre o péptido amino-oxi-acetilado e o ghoxal (0=CH-CH=0) tinha uma ligação relativa de 3,33 e uma potência relativa de 3,15.

Exemplo 22. Alquilação de fragmentos de anticorpos e subsequente formação das polioximas [0171] Utilizou-se também o composto (ii) para alquilar polipeptidos muito maiores, incluindo os fragmentos F(ac’) (o mesmo que F(ab’)) dos anticorpos IgG produzidos por redução das pontes dissulfureto que ligam as cadeias pesadas dos fragmentos F(ac’)2. Os fragmentos F(ac’) do anticorpo monoclonal Mac35 foram preparados por meios convencionais. O fragmento F(ac’)2 péptico foi reduzido com cisteamina para dar origem ao produto F(ac’)SH que foi depois alquilado com o reagente (ii) e oximado com qualquer das placas de base (vi) e (vii) adiante indicadas. As reacções foram acompanhadas (com e sem redução completa com ditiotritol 10 mmol antes da análise) por EGPA-DSS, cromatografía por filtração através de gel e espectrometria de massa por ionização por electropulverização. A dioxima esperada

formou-se com um bom rendimento e a trioxima formou-se com um rendimento inferior (provavelmente por razões de obstrução espacial: tal obstrução é normalmente menor quando são utilizados ligadores maiores). In vivo, a polioxima de F(ac’)2 irá ter uma localização reduzida nos rins, dai resultando uma taxa reduzida de excreção.

Exemplo 23. Redução da ponte oxima [0172] As pontes oxima reduzidas são menos sensíveis à hidrólise, para valores de pH neutro e acídicos, do que a oxima alifática não conjugada. A redução da ponte oxima foi efectuada em conformidade com um procedimento descrito em ‘Comprehensive Organic Synthesis’, Bany M. Trost, ed. principal, no volume 8, Ian Fleming, ed., pp 60-78, Pergamon Press, Oxford, 1991. As oximas formadas entre grupos alifáticos não conjugados, v.g. -CHrCH^NO--CH2-, foram facilmente reduzidas à temperatura ambiente num período variável entre alguns minutos e várias horas com ciano-boro-hidreto de sódio 0,3 M em ácido acético 0,33 Μ. O tratamento prolongado (v.g. de um dia para o outro) originou uma decomposição. O produto reduzido eluiu na CLER de fase inversa antes do material de partida que não tinha sido reduzido e foi identificado por espectrometria de massa por ionização por electropulverização que confirmou o aumento previsto de 2 unidades de massa por cada ponte oxima reduzida. A oxima reduzida (que é agora umaN,0-dialquil-hidroxilamina) era menos sensível à hidrólise, para valores de pH neutros e acídicos, do que a oxima alifática não conjugada.

[0173] As oximas alifáticas conjugadas, v.g., -NH-CO-CH=NO-CH2-, apenas puderam ser parcialmente reduzidas ao fim de um tratamento prolongado com o agente redutor. As oximas aromáticas, v.g., -C6H4-CH=NO-CH2-, não puderam ser reduzidas nestas condições. São conhecias condições mais fortes (ver v.g. ‘Comprehensive Organic Synthesis’, Bany M.

83 7%

Trost, edição principal, volume 8, Ian Fleming, ed., pp 60-78, Pergamon Press, Oxford, 1991) que permitem reduzir tais oximas e que podem ser eventualmente úteis em algumas circunstâncias, embora seja necessário tomar precauções para não reduzir outros grupos sensíveis que estejam presentes, tais como a cadeia lateral de triptofano do indol.

Exemplo 24. Polioximas imunogénicas [0174] Utilizou-se o epítopo de células T do péptido H-Asp-Cis-Thr-Leu-Ile-Asp-Leu--Leu-Gli-Asp-Pro-His-NH2 do vírus da gripe (Brown et ai, J. Virol. (1993) 67:2887-2893) e o péptido H-Pro-Lis-Tir-val-Lis-Gln-Asn-Thr-Leu-Lis-Leu-Ala-Thr-Gli-Met-arg-Asn-Val-Pro--Glu-Lis-Gln-Thr-OH (SEQID N° 25; v.g. Jackson, D.C. e Brown, L.E., Peptide Research (1991) 4:114-124) do terminal C que contém os epítopos de células B e T para exemplificar a preparação dos imunogénios polioxímicos.

[0175] O péptido AOA-Pro-Lis-Tir-Val-Lis-Gln-Asn-Thr-Leu-Lis-Leu-Ala-Thr-Gli-Met--Arg-Asn-Val-Pro-Glu-Lis-Gln-Thr-OH (SEQ ID N° 26) foi obtido por síntese automática em fase sólida numa máquina de modelo ‘ABI 430A5, tendo sido utilizados para tal os protocolos convencionais de grupos Fmoc e o produto comercialmente disponível Fmoc-Thr(tBu)-resina de Sasrin (produzido por Bachem, AG, 144 Hauptstrasse, 4416 Bubendorf, Suiça). Antes das operações de clivagem e desprotecção efectuou-se a acilação do péptido montado na resina com Boc-NHOCH2CO-OSu e submeteu-se aos procedimentos descritos supra. Após a purificação por CLER preparativa caracterizou-se o péptido por espectrometria de massa por ionização por electropulverização, quer como péptido amino-oxi-acetílico livre quer como oxima formada por incubação de uma parcela a pH 4,6 com um pequeno excesso de acetaldeído e efectuando o isolamento do produto por CLER. O peso molecular da oxima de acetaldeído obtido por medição foi de 2744,46 e o valor calculado foi de 2744,18. 84 [0176] Para a formação da polioxima utilizou-se a placa de base cíclica descrita antes derivada de Ac-Cis-Lis-Ala-Lis-Pro-Gli-Lis-Ala-Lis-Cis-NH2. Essa placa de base foi oxidada com periodato, conforme descrito, e isolada por CLER. A oximação por montagem paralela foi então realizada entre os grupos glioxililo (criados por oxidação dos grupos Ser nas cadeias laterais de Lis (K)) e o grupo amino-oxi-acetilo do péptido AOA-Pro-Lis-Tir-Tir-Val-Lis-Glbn--Asn-Thr-Leu-Lís-Leu-Ala-Thr-Gli-Met-Arg-Asn-Val-Pro-Glu-Lis-Gln-Thr-OH, nas condições descritas anteriormente (tampão de acetato a pH 4,6 com um excesso cinco vezes superior de péptido relativamente a cada grupo glioxililo durante 16 horas à temperatura ambiente). A tetraoxima resultante foi isolada por CLER e caracterizada por espectrometria de massa por ionização por electropulverização (peso molecular medido de 12097,08 e calculado de 12097,04).

[0177] Testou-se a polioxima, neste caso uma tetraoxima, no ensaio de proliferação de células T e também in vivo em murganhos para lhes conferir protecção contra o estímulo virai.

[0178] Utilizando os métodos aqui descritos, também foi possível produzir as MOCA adiante indicadas, úteis por razões de imugenicidade: AOA-Asp-Cis-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu--Leu-Gli-Asp-Pro-Hís-NHa (SEQ Π) N° 22), Ac-Asp-Cis(CH2CH2CH2NH-AOA>Thr-Leu-Ile--Asp-Ala-Leu-Leu-Gli-Asp-Pro-His-NH2 (SEQ Π) N° 27), Ac-Asp-Cis(CH2CONHCH2CH2NH--AOA)-Thr-Leu-fle-Asp-Ala-Leu-Leu-Gli-Asp-Pro-His-NH2 (SEQ ID N°21) e AOA-DCTLIDALLGDPH-NH2

I

Ac-DCTLIDALLGDPH-NH2.

[0179] Há outras MOCA úteis, designadamente: Ac-Asp-Cis*-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala--Leu-Leu-Gli-Asp-Pro-His-NHCH2CH2NH-AOA (SEQ ID N° 28) em que Cis* é um derivado S--carboxamidometílico de Cis, Ac-Asp-Cis-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu-Gli-Asp-Pro-His- -NHCH2CH2NH-AOA (SEQ ID N° 29) e 85 7%

Ac-DCTLIDALLGDPH-NHCH2CH2NH-AOA

Ac-DCTLE>ALLGDPH-NH2.

[0180] Há uma polioxima imunogénica que é uma heterotetraoxima, conhecida pelo facto de possuir duas cópias de qualquer das sequências AOA-Asp-Cis*-Thr-Leu-He-Asp-Ala-Leu--Leu-Gli-Asp-Pro-His-NH2 e AOA-Pro-Lis-Tir-Val-Lis-Gln-Asn-Thr-Leu-Lis-Leu-Ala-Thr--Gli-Met-Arg-Asn-Val-Pro-Glu-Lis-Gln-Thr-OH em que Cis* é o derivado S-carboxamido-metílico de Cis.

Exemplo 25. Séries homólogas de polioximas [0181] A utilização de amino-oxi-acetil-(ou modificado por aldeído-)-monometoxi--polietileno-glicol, ou de outras séries homólogas de polímeros, enquanto misturas de diversas MOCA, permite que uma polioxima possua heterogeneidade dentro da própria molécula. Tais polioximas são formadas por montagem paralela de uma mistura de elementos de uma série homóloga, por exemplo: NH20CH2C0-NH-CH2CH20(CH2CH20)„CH2CH20CH3 ou 0-CHCH20(CH2CH20)„CH2CH20CH3 ou 0=CHC0NHCH2CH20(CH2CH20)nCH2CH20CH3, em que o símbolo n representa um número inteiro. As moléculas modificadas por aldeído e por AOA, de uma série homóloga, podem ser utilizadas na formação de polioximas por montagem paralela.

[0182] A presente invenção proporciona pois um sistema para sintetizar rapidamente multímeros polioxímicos de compostos biológicos para efeitos de pesquisa, tais como a HEM, que possuem propriedades variáveis de afastamento, carga, liofilicidade, valência, limitações conformadonais, solubilidade e outras propriedades físicas e biológicas desejáveis, (v.g. imunológicas). 86

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Rose, Keith

Offord, Robin (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: “Compostos de polioximas e sua preparação” (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 31 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Cooley Godward Castro Huddleson & Tatum (B) RUA: 5 Paio Alto Square (C) CIDADE: Paio Alto (D) ESTADO: Califórnia (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 94036 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete

(B) COMPUTADOR: CP compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: NÚMERO DE SÉRIE PCT AINDA NÃO ATRIBUÍDO

(B) DATA DE DEPÓSITO: A QUE ESTÁ INCLUSA (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRE SENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Torchia, Timothy E. (B) NÚMERO DO PEDIDO: 36700

(C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: ABIC-001/03WO (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES. (A) TELEFONE: (415) 843 5481 (B) TELEFAX: (415) 857-0663

(C) TELEX: 380816 CooleyPA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 1:

Lis Leu Glu Glu Gin Arg Pro Glu Arg Vai Lis Gli 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Ser Lis Leu Glu Glu Gin Arg Pro Glu Vai Lis Gli 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Amino-oxi-acetil-Lis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Lis Leu Glu Glu Gin Arg Pro Glu Arg Vai Lis Gli 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO. local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Lis Leu Glu Glu Gin Arg Pro Glu Arg Vai Lis Gli 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: AOA-Gli (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: AOA-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: AOA-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: AOA-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: AOA-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 8 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: AOA-Lis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Gli Gli Gli Lis Lis Lis Lis Lis Gli 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Gli (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE. (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 8 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6

Gli Gli Gli Lis Lis Lis Lis Lis Gli 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: \0 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) PARTICULARIDADE: (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (Β) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Serina-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Serina-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Serina-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 8 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Serina-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 9 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Serina-Lis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) NO: 7:

Ser Gli Gli Gli Lis Lis Lis Lis Lis Gli 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:8: (i) CARACTERÍS TICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA. NÃO (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Bromoacetil-Gli 92 (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 8 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8:

Gli Gli Gli Lis Lis Lis Lis Lis Gli 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado 93 (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-GIi (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 8 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 9 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 10 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:9:

Gli Gli Gli Lis Lis Lis Lis Lis Lis Lis Gli 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: AOA-Glu (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

Glu Leu Gli Gli Gli Pro Gli Ala Gli Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu 1 5 10 15

Glu Gli Ser Leu Gin Lis Arg 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: 95

Gli Gli Gli Lis Lis Gli 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO. local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: AOA-Tir (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

Tir Arg Glu Asp Gli Vai Thr Pro Tir Met He Phe Phe Lis Asp Gli 15 10 15

Leu Glu Met Glu Lis 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: AOA-Lis (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13:

Lis Leu Glu Gin Arg Pro Glu Arg Vai Lis Gli 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA Π) NO. 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: SIM (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 3 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 14:

Gli Gli Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA JD NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA, péptido 7i& (iii) HIPOTÉTICA: SIM (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 3 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 15;

Gli Ala Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: SIM (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 3 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (ix) PARTICULARIDADE: 98 (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 16:

Arg Tir Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: SIM (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

Arg Tir Gli Gli Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: SIM (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18:

Arg Tir Gli AlaXaa Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: SIM (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 100 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: qualquer aminoácido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 19:

Arg Tir Lis Glu Xaa Xaa 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO.20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Acetil-Asp (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: His-amida (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.20:

Asp Cis Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gli Asp Pro His 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Acetil-Asp 101 (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 2 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Cis(CH2CONH-CH2CH2NH-COCH2ONH2)-(ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: His-amida (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO.21:

Asp Cis Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gli Asp Pro His 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA, péptido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: AOA-Asp (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: His-amida (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.22:

Asp Cis Thr Leu De Asp Ala Leu Leu Gli Asp Pro His 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: AOA-Asp (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 2 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Cis(S-2-piridil)-(ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: His-amida (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23:

Asp Cis Thr Leu He Asp Ala Leu Leu Gli Asp Pro His 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: cíclica (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Acetil-Cis (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 10 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Cis-amida 103 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:24:

Cis Lis Ala Lis Pro Gli Lis Ala Lis Cis 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:25: (i) C ARACTERÍ STIC AS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:25:

Pro Lis Tir Vai Lis Gin Asn Thr Leu Lis Leu Ala Thr Gli Met 15 10 15

Arg Asn Vai Pro Glu Lis Gin Thr 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: AOA-Pro (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26:

Pro Lis Tir Vai Lis Gin Asn Thr Leu Lis Leu Ala Thr Gli Met 15 10 15

Arg Asn Vai Pro Glu Lis Gin Thr 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Acetil-Asp (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 2 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Cis(CH2CH2CH2NH-AOA) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: His-amida (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:27:

Asp Cis Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gli Asp Pro His 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA Π) NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Acetil-Asp (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 2 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Cis(carboxamidometil) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 13

(D) OUTRAS INFORMAÇÕES: His-NHCH2CH2NH-AOA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:28:

Asp Cis Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gli Asp Pro His 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Acetil-Asp (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 13

(D) OUTRAS INFORMAÇÕES: His-NHCH2CH2NH-AOA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:29:

Asp Cis Thr Leu De Asp Ala Leu Leu Gli Asp Pro His 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO.30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 106 (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Acetii-Asp (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 2 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Cis(S-CH2CH2NHCOCH2ONH-Boc) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 13 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: His-amida (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:30:

Asp Cis Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gli Asp Pro His 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: GXL-Lis(GXL) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 2 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: Lis(GXL-Lis(GXL)) (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO. (B) LOCALIZAÇÃO: (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID N0.31:

Lis Lis Tir 1

Lisboa, 26 de Junho de 2000 O Agente Oficial da Propriedade Industrial

JOSÉ DE SAMPAIO A.O.PI. Rua do Salitre, 195, r/c-Drt. 1250 LISBOA

Claims (14)

1. Reivindicações 1. Composição polioxímica homogénea, em que as moléculas polioxímicas presentes na referida composição compreendem uma primeira molécula orgânica que constitui uma placa de base que possui um conjunto de grupos reactivos ortogonais que formam grupos oxima e que está ligada por um conjunto constituído pelo menos por três ligações oxímicas ao referido conjunto de segundas moléculas orgânicas que possuem um grupo reactivo ortogonal, sendo as referidas ligações oxímicas formadas por reacção de um grupo reactivo ortogonal de cada uma das referidas segundas moléculas orgânicas com um grupo reactivo ortogonal complementar na referida primeira molécula orgânica que forma a placa de base.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o referido grupo reactivo ortogonal complementar na referida placa de base compreende um grupo aldeído ou um grupo amino-oxi-acetilo.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o referido grupo reactivo ortogonal na referida placa de base compreende um grupo amino-oxi-acetilo.
4. 4. Heteropolioxima que compreende uma primeira molécula orgânica que forma uma placa de base, que possui um conjunto de grupos reactivos ortogonais que formam oximas, e que está ligada através de um conjunto constituído pelo menos por três ligações oxímicas a um conjunto de segundas moléculas orgânicas que possuem um grupo reactivo ortogonal, sendo tais ligações oxímicas formadas por reacção de um grupo reactivo ortogonal de cada uma das referidas segundas moléculas orgânicas com um grupo reactivo ortogonal complementar na referida placa de base.
5. 5. Heteropolioxima de acordo com a reivindicação 4, em que cada ligação oxímica possui a mesma orientação.
6. 6. Heteropolioxima de acordo com a reivindicação 4, em que há pelo menos um grupo reactivo ortogonal presente na placa de base que compreende um grupo aldeído.
7. 7. Heteropolioxima de acordo com a reivindicação 6, em que um grupo reactivo ortogonal complementar pertencente pelo menos a uma das segundas moléculas orgânicas é um grupo amino-oxi.
8. 8. Polioxima de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 4, a qual compreende também uma terceira molécula orgânica ligada à placa de base e que é seleccionada entre o conjutno constituído por agentes queladores metálicos, marcadores detectáveis, elementos fixadores lipófilos e grupos ortogonais quimicamente reactivos, diferentes de um grupo formador de oxima.
9. 9. Polioxima de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 4, em que a referida segunda molécula orgânica é um agente terapêutico ou um marcador detectável.
10. 10. Polioxima de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 4, em que a referida polioxima é imunogénica.
11. 11. Composição farmacêutica que incorpora a polioxima de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 4 e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
12. 12. Método para obter in vitro imagens de uma célula, o qual consiste em fazer contactar a célula com uma quantidade detectável da polioxima de acordo com as reivindicações 8 ou 9, em condições convenientes que favoreçam a formação de um complexo entre o agente formador de imagens ou o marcador detectável e a célula em causa, sendo então detectado qualquer complexo assim formado.
13. 13. Processo para a preparação de uma composição polioxímica homogénea de acordo com a reivindicação 1, o qual compreende os passos seguintes: - obter uma primeira molécula orgânica que forma uma placa de base que possui um conjunto constituído pelo menos por três grupos ortogonais reactivos idênticos, capazes de formarem uma ligação oxímica, - obter uma segunda molécula orgânica que possua um grupo reactivo ortogonal complementar capaz de formar uma ligação oxímica com o referido grupo reactivo ortogonal na referida molécula que forma a placa de base, - fazer contactar a referida molécula que forma a placa de base com uma quantidade da referida segunda molécula orgânica, suficiente para completar a reacção entre a referida segunda molécula orgânica e o referido conjunto de grupos reactivos ortogonais na 4 referida molécula que forma a placa de base, em condições que permitam a formação da ligação oxímica e - isolar o produto polioxímico.
14. 14. Processo para a preparação de uma composição heteropolioxímica de acordo com a reivindicação 4, o qual compreende os passos seguintes: - obter uma primeira molécula orgânica que forma uma placa de base que possui um conjunto constituído pelo menos por três grupos reactivos ortogonais, capazes de formarem uma ligação oxímica, - obter uma segunda molécula orgânica que possua um grupo reactivo ortogonal capaz de formar uma ligação oxímica com o seu grupo reactivo ortogonal complementar na placa de base, - obter uma terceira molécula orgânica que possua um grupo reactivo ortogonal capaz de formar uma ligação oxímica com o seu grupo reactivo ortogonal complementar na placa de base, - misturar a placa de base e as segundas moléculas orgânicas, em condições que permitam a formação da ligação oxímica, - misturar a placa de base e as terceiras moléculas orgânicas, simultânea ou sequencialmente em relação ao passo anterior de mistura, em condições que permitam a formação da ligação oxímica e - isolar o produto polioxímico. Lisboa, 26 de Junho de 2000

    JOSÉ DE SAMPAIO A.O.P.L Rua do Salitre, 195, r/c-Drt