ES2400666T3 - Uso terapéutico de un antagonista de DII4 y un inhibidor de VEGF para inhibir el crecimiento tumoral - Google Patents

Abstract

Un antagonista de ligando de tipo delta 4 (Dll4) y un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) para su uso en un método para tratar el desarrollo o crecimiento tumoral, siendo dicho antagonista de Dll4 un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente con Dll4 y bloquea la unión de Dll4 con un receptor Notch, o una proteína de fusión que comprende un dominio extracelular de Dll4 y un dominio Fc humano de SEC ID Nº: 20.

Description

Uso terapéutico de un antagonista de DII4 y un inhibidor de VEGF para inhibir el crecimiento tumoral

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la inhibición del crecimiento tumoral con antagonistas del ligando de tipo delta 4 (Dll4) e inhibidores de VEGF. Los antagonistas de Dll4 pueden ser particularmente útiles para tratar el crecimiento tumoral en tumores que no son sensibles a otros agentes antitumorales.

Descripción de la técnica relacionada

La ruta de señalización de Notch es un sistema para comunicación entre células usado por una amplia serie de eucariotas para muchos procesos biológicos, tales como diferenciación, proliferación y homeostasis. El tipo delta 4 (Dll4) o ligando de tipo delta 4 (Dll4) (en lo sucesivo en este documento “Dll4”) es un miembro de la familia delta de los ligandos de Notch que muestra expresión altamente selectiva por el endotelio vascular (Shutter et al. (2000) Genes Develop. 14:1313-318). Dll4 es un ligando para receptores Notch, incluyendo Notch 1 y Notch 4. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para Dll4 humano y de ratón se muestran en SEC ID Nº: 1-2 y SEC ID Nº: 3-4, respectivamente. Se han generado ratones con Dll4 dirigido a genes (Duarte et al. (2004) Genes & Dev 18: doi: 10.11 01/gad.1239004; Krebs et al. (2004) Genes & Dev 18: doi: 10.1101/gad.1239204; Gale et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:15949-15954).

Patel et al. (Cancer Research, Vol. 65, páginas 8690-8697 (2005)) describen regulación positiva del ligando de tipo delta 4 en la vasculatura tumoral humana y el papel de la expresión basal en la función celular endotelial. Gale et al. (PNAS, Vol. 101, páginas 15949-15954 (2004)) describen que la insuficiencia haploide del ligando de tipo delta 4 da como resultado letalidad embrionaria debido a defectos importantes en el desarrollo arterial y vascular. Noguera et al. (Proceedings of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, Vol. 46, SuplS., página 1104 (2005)) describen la expresión del ligando de tipo delta 4 (Dll4) en modelos de tumorales de ratón. Mailhos et al. (Differentiation, Vol. 69, páginas 135-144 (2001)) describen delta 4, como un ligando de Notch específico endotelial expresado en sitios de angiogénesis fisiológica y tumoral. El documento WO 03/050502 describe posible identificación y caracterización de células madre de cáncer de mama. El documento WO 03/042246 describe un inhibidor de la ruta de señalización de Notch en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de cáncer.

Breve sumario de la invención

Los experimentos descritos posteriormente muestran que los antagonistas de Dll4 son eficaces en la inhibición del crecimiento tumoral, particularmente en tumores que no son sensibles a otros agente terapéuticos antitumorales, tales como un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

La invención presenta antagonistas de Dll4 capaces de inhibir Dll4. En una realización, el antagonista de Dll4 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a Dll4 y bloquea la unión de Dll4 con un receptor Notch, tal como por ejemplo, Notch 1. En otra realización, el antagonista de Dll4 de la invención es una proteína de fusión.

La invención proporciona de este modo un antagonista del ligando de tipo delta 4 (Dll4) y un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) para su uso en un método para tratar el desarrollo o crecimiento tumoral, en el que dicho antagonista de Dll4 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a Dll4 y bloquea la unión de Dll4 con un receptor Notch, o una proteína de fusión que comprende un dominio extracelular de Dll4 y un dominio Fc humano de SEC ID Nº: 20.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo usado en la invención puede ser policlonal o monoclonal, y puede ser humanizado, quimérico o completamente humano. Preferentemente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo monoclonal completamente humano. El fragmento de anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla, un Fab, un F(ab')2, un pepticuerpo, etc.

Cuando el antagonista de Dll4 es una proteína de fusión, el dominio extracelular de Dll4 o un fragmento o fragmento modificado del mismo se fusiona con un componente de multimerización. El componente de multimerización es un Fc humano de SEC ID Nº: 20. La proteína de fusión puede comprender opcionalmente una secuencia señal, que puede ser nativa de la célula, recombinante o sintética.

También se describe en este documento una composición farmacéutica útil para inhibición del crecimiento o desarrollo de vasos sanguíneos, que comprende un agente capaz de inhibir la actividad de Dll4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que bloquea la unión de Dll4 con un receptor Notch. Preferentemente, el antagonista de Dll4 es un anticuerpo completamente humano o fragmento del mismo capaz de inhibir la unión de Dll4 con el receptor Notch 1. En otra realización, el agente es una proteína de Dll4 modificada que es capaz de unirse a su receptor Notch pero dicha unión no da como resultado activación del receptor.

Se describe además en este documento un método para tratar una afección mediada por Dll4, que comprende administrar un agente capaz de inhibir la actividad o expresión de Dll4. La afección mediada por Dll4 es una afección en la que es deseable inhibir el crecimiento o desarrollo de vasos sanguíneos. El antagonista de Dll4 de la invención puede ser particularmente útil en el tratamiento de tumores que no son sensibles o son sensibles de forma menor que la óptima a otros agentes terapéuticos. El antagonista de Dll4 puede bloquear la producción de vasos sanguíneos funcionales y suministro de oxígeno a los tumores. En realizaciones específicas, el antagonista es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-Dll4 o una proteína de fusión. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-Dll4 preferentemente inhibe la unión de Dll4 con el receptor Notch1. La proteína de fusión de la invención comprende un fragmento de la región extracelular nativa que conserva la capacidad para unirse a receptores Notch y carece de una región transmembrana y la cola citoplasmática de Dll4. En una realización, el antagonista de Dll4 de la invención se usa de forma terapéutica para tratar tumores que no son sensibles al tratamiento con un antagonista de VEGF.

También se describe en este documento el uso de un agente capaz de inhibir la actividad del ligando de tipo delta 4 (Dll4) para un sujeto que lo necesite para inhibir el desarrollo o crecimiento tumoral. En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, policlonal o monoclonal. Cuando el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado, quimérico o completamente humano. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla, un Fab o un F(ab')2. En una realización, el antagonista de Dll4 es un fragmento de Dll4 fusionado con un componente de multimerización. Se describe adicionalmente en este documento el uso de un agente capaz de inhibir la actividad de Dll4 como se ha definido anteriormente como un primer agente terapéutico, y un agente terapéutico adicional que es un inhibidor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en la fabricación de un medicamento para inhibir el desarrollo o crecimiento tumoral. Preferentemente, el inhibidor de VEGF es anticuerpo anti-VEGF o un bloqueador de VEGF. Cuando el inhibidor de VEGF es un bloqueador de VEGF, el agente es la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 19.

Otros objetos y ventajas resultarán evidentes a partir de una revisión de la descripción detallada a continuación.

Breve sumario de las figuras

La Figura 1 muestra que la sobreexpresión de Dll4-Fc por células tumorales C6 da como resultado tumores C6 más pequeños.

La Figura 2 muestra que Dll4-Fc suministrado por vía sistémica es altamente eficaz en la reducción de tumores HT1080 en relación con un antagonista de VEGF basado en receptor. Panel izquierdo: Dll4-Fc o proteína bloqueadora de VEGF en un momento del implante tumoral, tumores recogidos el día 25; Panel derecho: Dll4-Fc o proteína bloqueadora de VEGF proporcionada el día 15 después del implante, tumores recogidos el día 25.

La Figura 3 muestra que los anticuerpos policlonales de Dll4 o proteína Dll4-Fc purificada inhiben el crecimiento tumoral de HT1080.

La Figura 4 muestra la inhibición de la unión de Dll4 con el receptor Notch 1 por los anticuerpos policlonales para Dll4, en un ensayo de resonancia de plasmón superficial (BiaCore®).

Descripción detallada

Antes de describirse los presentes métodos, debe entenderse que la presente invención no se limita a métodos particulares, y las condiciones experimentales descritas, ya que tales métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en este documento es para el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, puesto que el alcance de la presente invención se limitará solamente por las reivindicaciones adjuntas.

Como se usa en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un” y “el” incluyen referencias plurales a no ser que el contexto claramente indique otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, las referencias a “un método” incluyen uno o más métodos, y/o etapas del tipo descrito en este documento y/o que resultarán evidentes para los expertos en la materia tras leer la presente descripción y así sucesivamente.

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen ahora los métodos y materiales preferidos.

Definiciones

Por la expresión afección o enfermedad “asociada con Dll4” o “mediada por Dll4” se entiende una afección que está afectada directa o indirectamente por la modulación de la actividad de Dll4. Más específicamente, se ha mostrado ahora que Dll4 está implicado en el crecimiento y desarrollo de vasos sanguíneos. En consecuencia, en una realización, una afección asociada con Dll4 que puede tratarse por el método de la invención es una en la que es deseable inhibir o reducir el crecimiento, desarrollo o maduración de vasos sanguíneos mediado por Dll4, por ejemplo, inhibir el desarrollo tumoral.

Por el término “inhibidor” o “antagonista” se entiende una sustancia que retarda o evita una reacción o respuesta química o fisiológica. La inhibición de la actividad de Dll4 puede ser directa, a través de la inhibición de la activación de receptores con un anticuerpo de bloqueo, por ejemplo, o indirecta, resultante de la interferencia con la expresión del gen que codifica Dll4. Los inhibidores habituales incluyen pero sin limitación moléculas antisentido, anticuerpos, receptores solubles, antagonistas y sus derivados, y ligandos de Dll4 modificados que se unen a su receptor Notch pero son incapaces de activar la señalización a través de dicha unión.

Un anticuerpo “neutralizador” o “de bloqueo”, pretende referirse a un anticuerpo cuya unión con Dll4 da como resultado inhibición de la actividad biológica de Dll4. Esta inhibición de la actividad biológica de Dll4 puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de Dll4. Estos indicadores de la actividad biológica de Dll4 pueden evaluarse por uno o más de varios ensayos in vitro o in vivo convencionales conocidos en la técnica. (véanse ejemplos posteriores). Preferentemente, la capacidad de un anticuerpo para neutralizar la actividad de Dll4 se evalúa por la inhibición de la unión de Dll4 con un receptor Notch, tal como Notch 1.

Descripción general

La ruta de señalización de tipo delta/Notch es necesaria para establecer una vasculatura organizada y jerárquica durante el desarrollo. Las deleciones dirigidas de diversos genes de tipo delta/Notch, incluyendo Dll4, dan como resultado ratones que mueren durante el desarrollo embrionario debido a defectos vasculares graves. Usando análisis de micromatrices, los inventores descubrieron que el ligando de tipo delta 4 (Dll4) es un gen regulado por VEGF en modelos tumorales de xenoinjerto de ratón. Además, se descubrió que en estos modelos tumorales, la expresión de Dll4 era significativamente mayor en vasos tumorales en comparación con los de piel normal adyacente. Para explorar los efectos de bloquear la señalización de Dll4/Notch en tumores, se realizaron estudios de xenoinjerto en ratones, en los que se suministró una molécula de Dll4-Fc soluble localmente por sobreexpresión mediada por retrovirus en células tumorales o se suministró de forma sistémica usando un enfoque adenoviral o inyectando proteína purificada. Todos los métodos para suministrar Dll4-Fc dieron como resultado crecimiento tumoral reducido en comparación con controles. Adicionalmente, los vasos tumorales tratados con Dll4-Fc fueron más ramificados que los controles, formando finas redes con crecimiento vascular denso, pero estos vasos eran menos eficaces que los de los tumores de control. Como se reveló por análisis de matriz y Taqman™, estos efectos se asociaron con una reducción de la señalización de Notch. También se observaron efectos similares en el crecimiento tumoral usando una solución de anticuerpo policlonal que se inyectó en ratones por vía sistémica. También se descubrió que esta solución de anticuerpos policlonales inhibía la unión de Dll4 con el receptor Notch 1. Adicionalmente, se descubrió que Dll4-Fc es más eficaz en la reducción del crecimiento de ciertos tumores que un bloqueador basado en receptor de VEGF (“bloqueador de VEGF”, Patente de Estados Unidos Nº 7.070.959). Estos hallazgos muestran que Dll4 desempeña un papel clave en el crecimiento tumoral y apoyan el Dll4 como una diana para el desarrollo de terapias antiangiogénicas.

Antagonistas de Dll4

Los antagonistas de Dll4 incluyen anticuerpos para Dll4 y fragmentos de los mismos capaces de bloquear la unión de Dll4 con un receptor Notch (tal como Notch 1), proteínas de fusión que comprenden el dominio extracelular de Dll4 fusionado con un componente de multimerización, o fragmentos del mismo, y péptidos y pepticuerpos (véase por ejemplo, Publicación de Patente de Estados Unidos 2003/0229023 Oliner et al.).

Anticuerpos de Dll4. La expresión “inmunoglobulina o anticuerpo” como se usa en este documento se refiere a un polipéptido de mamífero, incluyendo humano, que comprende una región marco conservada de un gen de inmunoglobulina o fragmentos de la misma que se une específicamente y reconoce a un antígeno, que, en el caso de la presente invención, es una proteína de Dll4 o parte de la misma. Si el anticuerpo o proteína de tipo de anticuerpo pretendido se usa como un compuesto terapéutico o de mamífero, las regiones de unión a inmunoglobulina deberían derivar de las inmunoglobulinas de mamífero correspondientes. Si se pretende que la molécula sea para uso no terapéutico, tal como para diagnóstico y ELISA, las regiones de unión a inmunoglobulina pueden derivar de mamíferos humanos o no humanos, tales como ratones. Los genes o fragmentos de genes de inmunoglobulina humana incluyen las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como los múltiples genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de cada clase de IgG, hay diferentes isotipos (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) así como alotipos de los mismos.

Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ejemplar de IgG humana, comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, tendiendo cada par una cadena ligera (aproximadamente 25 kD) y una cadena pesada (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. Las expresiones “cadena ligera variable” (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente.

Existen anticuerpos como inmunoglobulinas intactas, o como varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. Por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces de disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que es en sí mismo una cadena ligera unida con VH-CH por un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiendo de este modo el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región bisagra. Aunque se definen diversos fragmentos de anticuerpo con respecto a la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que tales fragmentos pueden sintetizarse de nuevo de forma química o usando metodología de ADN recombinante. Por lo tanto, el término anticuerpo, como se usa en este documento, también incluye fragmentos de anticuerpo producidos por la modificación de anticuerpos completos o los sintetizados nuevos usando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, dominios variables sencillos (Dab) de Fv de cadena sencilla (scFv)) o los identificados usando bibliotecas de presentación tales como bibliotecas de presentación de fagos, E. coli o levadura (véase, por ejemplo. McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554).

Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497; Harlow y Lane (1988) Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Cold Spring Harbor, NY). Los anticuerpos que se aíslan de organismos distintos de seres humanos, tales como ratones, ratas, conejos, vacas, pueden hacerse más de tipo humano a través de quimerización o humanización.

Son formas “humanizadas” o quiméricas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) las inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígenos de anticuerpos) que contienen secuencias mínimas requeridas para unión de antígenos derivadas de inmunoglobulina no humana. Tienen la misma o similar especificidad de unión y afinidad que un anticuerpo de ratón u otro no humano que proporcione el material de partida para construcción de un anticuerpo quimérico o humanizado. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada se han construido, típicamente por ingeniería genética, a partir de segmentos génicos de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes humanos (C), tales como IgG1 e IgG4. Un anticuerpo quimérico típico es por lo tanto una proteína híbrida consistente en el dominio de unión a antígeno o V de un anticuerpo de ratón y el dominio efector o C de un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados tienen restos marco de región variable sustancialmente de un anticuerpo humano (denominado un anticuerpo aceptor) y regiones determinantes de complementariedad (regiones CDR) sustancialmente de un anticuerpo de ratón (denominado la inmunoglobulina donadora). Véase, Queen et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:10029-10033 (1989) y documento WO 90/07861, Patentes de Estados Unidos 5.693.762, 5.693.761, 5.585.089, 5.530.101 y 5.225.539. La región o las regiones constantes, si están presentes, también son sustancialmente o completamente de una inmunoglobulina humana. Los dominios variables humanos se seleccionan habitualmente de anticuerpos humanos cuyas secuencias marco conservadas muestran un alto grado de identidad de secuencia con los dominios de región variable murinos de los que derivaron las CDR. Los restos marco de región variable de cadena ligera y pesada pueden derivar de la misma o diferentes secuencias de anticuerpos humanos. Las secuencias de anticuerpos humanos pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos de origen natural o pueden ser secuencias consenso de varios anticuerpos humanos. Véase documento WO 92/22653. Ciertos aminoácidos de los restos marco de región variable humana se seleccionan para sustitución basándose en su posible influencia en la conformación de CDR y/o unión con antígeno. La investigación de tales posibles influencias es por realización de modelos, examen de las características de los aminoácidos en localizaciones particulares, u observación empírica de los efectos de sustitución o mutagénesis de aminoácidos particulares. Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un resto marco de región variable murina y un resto marco de región variable humana seleccionado, el aminoácido marco humano debería sustituirse habitualmente por el aminoácido marco equivalente del anticuerpo de ratón cuando se espera razonablemente que el aminoácido: (1) se una de forma no covalente directamente al antígeno; (2) sea adyacente a una región CDR; (3)interaccione de otro modo con una región CDR (por ejemplo esté a una distancia de aproximadamente 6 Å de una región CDR), o (4) participe en la interfaz VL-VH. Otros candidatos para sustitución son aminoácidos marco humanos aceptores que son poco habituales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden sustituirse con aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo donador de ratón o de las posiciones equivalentes de inmunoglobulinas humanas más típicas. Otros candidatos para sustitución son aminoácidos marco humanos aceptores que son poco habituales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Los armazones de región variable de inmunoglobulinas humanizadas habitualmente muestran al menos 85% de identidad de secuencia con una secuencia marco conservada de región variable humana o consenso de tales secuencias.

Los métodos para generar anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo, VelocImmune™ (Regeneron Pharmaceuticals), tecnología XenoMouse™ (Abgenix), el enfoque de “minilocus”, y presentación de fagos. La tecnología VelocImmune™ (documento US 6.596.541) abarca un método para generar un anticuerpo completamente humano de alta especificidad para un antígeno seleccionado. Esta tecnología implica la generación de un ratón transgénico que tenga un genoma que comprenda regiones variables de cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente con loci de región constante de ratón endógenos de modo que el ratón produzca un anticuerpo que comprenda una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se une operativamente al ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas. El ADN se expresa después en una célula capaz de expresar el anticuerpo completamente humano. En realizaciones específicas, la célula es una célula CHO.

La tecnología de XenoMouseTM (Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21) genera un ratón que tiene regiones tanto variables como constantes humanas de los loci tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera kappa. En

un enfoque alternativo, otros han utilizado un enfoque de “minilocus” en el que se imita un locus de Ig exógeno a

través de la inclusión de genes individuales del locus de Ig (véase, por ejemplo, documento US 5.545.807). El ADN que codifica las regiones variables puede aislarse estando unido o no operativamente con el ADN que codifica la región constante de cadena pesada y ligera humana.

Como alternativa, puede usarse presentación de fagos o tecnologías de presentación relacionadas para identificar anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, tales como dominios variables, y fragmentos Fab heteroméricos que se unen específicamente a Dll4. (Véase, por ejemplo, Publicación de Patente de Estados Unidos 2003/0229023).

La exploración y selección de inmunoglobulinas (anticuerpos) preferidas puede realizarse por una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Puede realizarse exploración inicial con respecto a la presencia de anticuerpos monoclonales específicos para Dll4 a través del uso de métodos basados en ELISA o presentación de fagos, por ejemplo. Se realiza preferentemente una exploración secundaria para identificar y seleccionar un anticuerpo monoclonal deseado. Puede realizarse exploración secundaria con cualquier método adecuado conocido en la

técnica. Un método preferido, denominado “Realización de Perfiles Asistida por Modificación de Biosensores” (“BiaMAP”) se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2004/101920. BiaMAP permite la identificación rápida de clones de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales con características deseadas. Más específicamente, los anticuerpos monoclonales se clasifican en grupos relacionados con epítopos definidos basándose en la evaluación de las interacciones anticuerpo:antígeno. Como alternativa, pueden usarse ensayos de competición basados en ELISA; basados en perlas o basados en Biacore® para identificar pares de unión que se unen a diferentes epítopos de DII4 y por lo tanto es probable que cooperen en la unión del ligando con alta afinidad.

Proteínas de fusión de DII4. Cuando el antagonista de DII4 es una proteína de fusión, el componente de multimerización puede seleccionarse del grupo que consiste en (i) un dominio de inmunoglobulina, (ii) un componente de multimerización truncado, (iii) una secuencia de aminoácidos de entre 1 y aproximadamente 500 aminoácidos de longitud, que comprende opcionalmente al menos un resto de cisteína, (iv) una cremallera de leucina, (v) un motivo de hélice bucle y (vi) un motivo de superenrollamiento. De acuerdo con la invención, el componente de multimerización es un Fc humano de SEC ID Nº: 20. La proteína de fusión puede comprender opcionalmente una secuencia señal, que puede comprender cualquier secuencia conocida por un experto en la materia para dirigir la secreción de un polipéptido o proteína de una célula, incluyendo secuencias naturales o sintéticas. Generalmente, se sitúa una secuencia señal al comienzo o en el extremo amino terminal de la proteína de fusión de la invención. Dicha secuencia señal puede ser nativa de la célula, recombinante o sintética. Los componentes de la proteína de fusión de la invención pueden conectarse directamente entre sí o conectarse mediante una o más secuencias espaciadoras. En una realización preferida, los componentes se fusionan directamente entre sí. En otra realización preferida, los componentes se conectan con una secuencia de ácido nucleico que codifica un espaciador de 1-200 aminoácidos. Puede usarse cualquier espaciador conocido en la técnica para conectar los componentes proteicos. Una secuencia espaciadora también puede incluir una secuencia usada para potenciar la expresión de la proteína de fusión, proporcionar sitios de restricción y permitir que los dominios componentes formen estructuras terciarias y cuaternarias óptimas y/o potencien la interacción de un componente con su receptor. En una realización, la proteína de fusión comprende una o más secuencias peptídicas entre uno o más componentes que es o son de entre 1 y 25 aminoácidos.

El dominio extracelular de DII4 está compuesto de un dominio Delta/Serrado/Lag-2 (DSL) y un tándem de ocho repeticiones de tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF). En general, se reconoce que los dominios EGF aparecen aproximadamente en la posición 218-251 (dominio 1), 252-282 (dominio 2), 284-322 (dominio 3), 324-360 (dominio 4) y 362-400 (dominio 5), con el dominio DSL aproximadamente en la posición 173-217 y el dominio Nterminal aproximadamente en la posición 27-172 de hDll4 (SEC ID Nº: 2). En realizaciones específicas, el antagonista de hDll4 capaz de inhibir la actividad de Dll4 es DSL-hFc que comprende de aproximadamente el aminoácido 27 a aproximadamente 172 de SEC ID Nº: 2 fusionado con hFc (SEC ID Nº: 20) (SEC ID Nº: 21), dominio N-terminal-DSL-hFc que comprende aproximadamente 27-217 de SEC ID Nº: 2 fusionado con hFc (SEC ID Nº: 22), dominios EGF 1-5-hFc que comprenden aproximadamente 218-400 fusionado con hFc (SEC ID Nº: 23), dominios EGF 1-4hFc que comprende aproximadamente 218-360 fusionado con hFc (SEC ID Nº: 24), dominios EGF 1-3-hFc que comprende aproximadamente 218-322 fusionado con hFc (SEC ID Nº: 25), dominios EGF 1-2-hFc que comprenden aproximadamente 218-282 fusionado con hFc (SEC ID Nº: 26) o variantes de los mismos que comprenden opcionalmente engarces entre los componentes de dominio. Los componentes de la proteína de fusión también pueden disponerse en una diversidad de configuraciones conservando a la vez la capacidad para actuar como antagonistas de DII4.

Métodos de administración

Se describen en este documento métodos de tratamiento que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un agente de la presente descripción. En un aspecto preferido, el agente está sustancialmente purificado (por ejemplo, sustancialmente sin sustancias que limiten su efecto o produzcan efectos secundarios no deseados). El sujeto es preferentemente un animal, por ejemplo, tal como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc., y es preferentemente un mamífero, y más preferentemente ser humano. Se conocen diversos sistemas de suministro y pueden usarse para administrar un agente de la presente descripción, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429.4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro, etc. Los métodos de introducción pueden ser entéricos o parenterales e incluyen pero sin limitación las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de embolada, por absorción a través de revestimientos epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir composiciones farmacéuticas descritas en este documento en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular o intratecal; la inyección intraventricular puede facilitarse por un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya. También puede emplearse administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o un nebulizador, y formulación con un agente de aerosolización.

En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas descritas en este documento por vía local al área que necesite tratamiento; esto puede conseguirse, por ejemplo, y sin limitación, por infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, por inyección, por medio de un catéter, o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas de sialastic, fibras o sustitutos cutáneos comerciales.

En otra realización, el agente activo puede suministrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990) Science 249: 1527-1533). En otra realización más, el agente activo puede suministrase en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer (1990) mencionado anteriormente). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos (véase Howard et al. (1989) J. Neurosurg.

71: 105). En otra realización en la que el agente activo de la presente descripción es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ácido nucleico puede administrase in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de modo que se haga intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.980.286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont) o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo en enlace con un péptido de tipo caja homeótica que se sabe que entra en el núcleo (véase por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868), etc. Como alternativa, puede introducirse un ácido nucleico por vía intracelular e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedadora para expresión, por recombinación homóloga.

Composiciones farmacéuticas

Se describen en este documento composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente activo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o uno estatal o enumerada en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto terapéutico. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados en “Remington's Pharmaceutical Sciences” por E.W. Martin.

En una realización preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Cuando sea necesario, la composición puede incluir también un agente solubilizador y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Cuando la composición debe administrase por infusión, esta puede distribuirse con un frasco de infusión que contenga agua o solución salina de uso farmacéutico estéril. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.

Los agentes activos de la presente descripción pueden formularse como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libres tales como las derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres tales como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

La cantidad del agente activo en la presente descripción que será eficaz en el tratamiento de una afección mediada por DII4 puede determinarse por técnicas clínicas convencionales basándose en la presente descripción. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa para emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la gravedad de la afección, y debería decidirse de acuerdo con el criterio del facultativo y las circunstancias de cada sujeto. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados para administración intravenosa son generalmente de aproximadamente 0,5 a 20 mg de compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los intervalos de dosificación adecuada para administración intranasal son generalmente de aproximadamente 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a dosis derivadas de sistemas de ensayo in vitro o de modelo animal.

Terapias de combinación

La presente invención proporciona un antagonista de DII4 y un inhibidor de VEGF para su uso en un método para tratar el desarrollo o crecimiento tumoral. En numerosas realizaciones, los antagonistas de DII4 para su uso de acuerdo con la presente invención pueden administrarse en combinación con uno o más compuestos o terapias adicionales. Por ejemplo, pueden co-administrarse múltiples proteínas de fusión o anticuerpos anti-DII4, o administrase junto con uno o más compuestos terapéuticos. En una realización preferida, el inhibidor de DII4 de la invención se administra con un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF o un bloqueador de VEGF de SEC ID Nº: 19. Un bloqueador de VEGF (como se describe en el documento WO 00/75319) es VEGFR1R2Fc C1(a). La expresión “agente citotóxico” como se usa en este documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o provoca destrucción de células. La expresión pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo I131 I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.

La terapia de combinación incluye administración de una formulación de dosificación farmacéutica única que contiene un antagonista de DII4 y uno o más antagonistas de VEGF; así como administración de un antagonista de DII4 y uno o más agentes adicionales en su propia formulación de dosificación farmacéutica separada. Por ejemplo, un antagonista de DII4 y un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor del crecimiento pueden administrase al paciente juntos en una composición de dosificación sencilla tal como una formulación combinada, o cada agente puede administrarse en una formulación de dosificación separada. Cuando se usan formulaciones de dosificación separadas, puede administrase una proteína de fusión para su uso de acuerdo con la invención y uno o más agentes adicionales simultáneamente, o en momentos escalonados por separado, es decir secuencialmente.

Un “agente quimioterapéutico” es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN®); alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirubicina, esorrubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, paplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; suministrador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; Ionidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (TAXOTERE®; Aventis Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como anti-estrógenos incluyendo por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide, y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Un “agente inhibidor del crecimiento” cuando se usa en este documento se refiere a un compuesto o composición

que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa in vitro o in vivo. Los ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen detención de G1 y detención de la fase M. Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), TAXOL® e inhibidores de topo II tales como doxorrubicina, epirubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que detienen G1 también se extienden a detención de fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos habituales en la materia una descripción y divulgación completa de cómo preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado intentos de asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deberían tenerse en cuenta ciertos errores y desviaciones experimentales. A no ser que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular medio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana.

Ejemplo 1: Dirección al gen DII4 en ratones.

Dirección génica. Se usó tecnología VelocigeneTM (Valenzuela et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21: 652-9) para generar una deleción precisa e intercambio de la región codificante de DII4, que se extiende desde el codón de inicio hasta el de terminación (correspondiente a una región de 8,1 kB que comprende todo los exones codificantes e intrones intermedios), con el gen indicador de -galactosidasa así como un casete de selección de neomicina. Brevemente, se modificó un cromosoma artificial de bacteria (BAC) que contenía la región codificante de DII4 de 8,1 kb y 140 Kb de secuencias flanqueantes (clon 475d4 de una biblioteca de BAC 129/SvJ obtenida de Incyte Genomics) para generar un vector de dirección basado en BAC que después se linealizó y se usó como un vector de dirección para remplazar el gen de Dll4 en células madre embrionarias de ratón (ES) F1H4 (híbrido C57BU6:129). Las células madre embrionarias correctamente dirigidas se identificaron usando el ensayo de pérdida de alelo nativo (LONA) (Valenzuela et al. (2003) mencionado anteriormente). Se usaron dos líneas de ES dirigidas correctamente independientes para generar ratones macho quiméricos que eran transmisores completos de esperma derivado de ES. Después las quimeras se reprodujeron con hembras C57BU6 y/o ICR para generar ratones o embriones F1, que se genotiparon por ensayos de LONA y ensayos histoquímicos de -galactosidasa. Los ratones derivados de ambas líneas de ES se comportaron de forma idéntica, y se usaron datos agrupados de ambos clones para estadística.

Resultados. La dirección del gen DII4 en ratones dio como resultado letalidad embrionaria y graves defectos vasculares, incluso en ratones marcados en un único alelo (véase Gale et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101: 15949-15954).

Implantaciones tumorales. Se implantaron por vía subcutánea células de carcinoma de pulmón de Lewis (ATCC) en el flanco de ratones quiméricos para DII4, se recogieron después de 16 días, se cortaron en secciones de 80 micrómetros y se tiñeron con respecto a CD31/PECAM o -galactosidasa como se ha descrito (Holash et al. (2002) Proc Natl. Acad. Sci. USA 99: 11393-8).

Tinción de PECAM e indicadora. Se realizó tinción de embriones montados completos, así como secciones tisulares de embriones y adultos como se ha descrito previamente para CD31/PECAM para definir el endotelio vascular y para -galactosidasa para visualizar el producto del gen indicador de DII4 (Gale et al. (2004) PNAS 101: 15949-54).

Ejemplo 2. Construcción de Dll4-Fc y estudios de xenoinjerto de ratón.

Construcción de Dll4-Fc (-TM). Se construyó una secuencia de ácido nucleico que tenía 2297 nucleótidos correspondiente al dominio extracelular de Dll4 de ratón (SEC ID Nº: 3) sin el dominio transmembrana (-TM), con un dominio Fc humano. La secuencia de aminoácidos codificada tenía 765 aminoácidos incluyendo la proteína de Dll4 (SEC ID Nº: 18) y un peso molecular de aproximadamente 85 kDa.

La Figura 1 muestra que la sobreexpresión de Dll4-Fc por células tumorales C6 dio como resultado tumores C6 más pequeños (media ± DT).

Ingeniería retroviral de células tumorales para sobreexpresar Dll4-Fc. Se infectaron células tumorales de glioma de rata C6 (ATCC) con retrovirus para sobreexpresar la proteína verde fluorescente (GFP) y Dll4-Fc soluble; las células infectadas solamente con GFP se usaron como controles. Las células se separaron por FACS con respecto a fluorescencia de GFP dos veces.

Dll4-Fc suministrado por retrovirus. Se implantaron 106 células/ratón por vía subcutánea en el flanco derecho afeitado de ratones SCID/CB17 macho (8-10 semanas de edad) con células C6 modificadas por ingeniería retroviral con GFP o Dll4-Fc.

Mediciones del volumen tumoral: Después de que los tumores se hicieran palpables, se registraron las mediciones de tamaño cada tres días usando un calibrador (tamaño = (longitud x anchura2)/2). Una vez que se habían sacrificado los animales, se obtuvieron mediciones ex vivo con calibradores y se calculó el volumen usando la fórmula longitud x anchura x altura).

Histología tumoral. De doce a dieciséis días después de la implantación de células tumorales, los tumores se recogieron y se procesaron para análisis histológico o de expresión. Los tumores se cortaron en secciones de 80

m, se tiñeron con anticuerpos para CD31/Pecam-1 seguido de reacción de peroxidasa-DAB, y se contratiñeron con pironina Y. Se realizó análisis morfométrico de los vasos usando el programa de análisis de imágenes NIH 1.62.

Transferencia de Northern y PCR en tiempo real. Se preparó ARN total de tejido tumoral usando el reactivo Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY). El ARN (10 mg) se separó en geles de agarosa al 1,2%, se transfirió a una membrana de nylon y se inmovilizó por reticulación de UV. Después de prehibridación, se añadieron sondas específicas para gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) o Dll4 marcado con 32P, y los filtros se hibridaron a 42 °C durante una noche. Se realizaron lavados rigurosos por protocolos convencionales (un lavado de tampón SSPE 0,5 X seguido de dos lavados con tampón SSPE 0,2 X realizado a 55 °C durante 30 minutos cada uno). Se obtuvo una autorradiografía después de 48 horas de exposición a película de rayos x con pantallas intensificadoras. Además, se analizó la expresión específica de tejido en reacciones separadas usando la química de PCR en tiempo real Taqman® (Applied Biosystems, Foster City, California) y sistema de detección con los pares de cebadores y sondas marcadas específicas para Dll4, los receptores Notch 1 y 4 y dianas cadena abajo de Notch, Hes1, Hey2, HeyL y Nrarp. Se obtuvo el número de ciclos necesario para alcanzar el umbral para amplificación del ADNc (o valores de CT), y se normalizó a una referencia constitutiva (GAPDH) (= 2-DCT). Los resultados se normalizaron a una línea basal, el control de vehículo para el experimento, que proporciona el cambio de abundancia de ARNm relativo (= 2DDCT) y se expresa como la media ± E.T.M. para al menos 4 muestras separadas procesadas por triplicado (Livak y Schmittgen (2001) Methods. Dic; 4:402-8).

Análisis de RT-PCR cuantitativa para Dll4, HeyL, Nrarp y Hes1. El análisis de RT-PCR se realizó como se ha descrito (Livak et al. (2001) Methods 24:402-8). Los resultados se expresan como la relación de la cantidad del ARN de interés y la cantidad de ARN de control (GAPDH) como se ha descrito (Daly et al. (2004) Genes Dev. 18:1060-71) en un 7900HT de Applied Biosystems usando cebadores y sondas específicos como sigue: cebadores de Dll4: Dll41574F (SEC ID Nº: 9) y Dll4-1644R (SEC ID Nº: 10) y sonda de Dll4: Dll4-1594T (SEC ID Nº: 11); cebadores de HeyL: mHeyL-135F (SEC ID Nº: 12) y mHeyL-216R (SEC ID Nº: 13) y sonda HeyL: mHeyL-154T (SEC ID Nº: 14); cebadores de Nrarp: mNrarp-350F (SEC ID Nº: 15) y mNrarp-418R (SEC ID Nº: 16) y sonda de Nrarp: mNrarp-373T: (SEC ID Nº: 17) y mHesl (ID Mm00468601 m1, Hes1) (ABI, servicios de ensayo a petición). Los ADNc derivaron de tumores de C6-Dll4 y Dll4-Fc.

Ensayo in vitro para determinar si el Dll4-Fc secretado expresado en células C6 puede activar señalización de Notch en HUVEC. Se sembraron 4 x 105 células HUVEC en una placa de 60 mm para obtener cultivos confluyentes a 50% al día siguiente. Al día siguiente, se sembraron 8 x 105 células C6 sobre las HUVEC. Después de 24 horas de cultivo conjunto, las células se pasaron por raspado a 1 ml de reactivo Tri y se preparó ARN total como se ha descrito previamente. Se analizaron las muestras por Taqman® usando sondas de Hes1, HeyL y Nrarp específicas humanas.

Ejemplo 3. Efecto de la administración sistémica de Dll4-Fc.

Proteína de Dll4-Fc. Se transfectó un plásmido que codificaba la construcción de ADNc de Dll4-Fc descrita anteriormente en células CHO, y se purificó la proteína secretada del sobrenadante. Se purificó proteína Dll4-Fc y se usó para tratar ratones portadores de tumores mediante inyección subcutánea (10 mg/kg, 3 por cada semana).

Resultados. Se realizaron experimentos en los que se implantaron tumores HT1080 en ratones como se ha descrito anteriormente el día 0. Comenzando el día 0 o día 15 (a 100 mm3 de tamaño), los ratones se trataron con proteína Dll4-Fc purificada (10 mg/kg, 3 por cada semana) o proteína de control. Otros grupos se trataron con antagonista de VEGF (bloqueador de VEGF, SEC ID Nº: 19) a una dosis de 25 mg/kg, tres veces por semana. Los resultados se muestran en la Figura 2. En tumores tratados desde el día 0 (lado izquierdo), tanto el antagonista de VEGF como Dll4-Fc fueron eficaces en el control del crecimiento tumoral. En tumores tratados a partir de 100 mm3 de tamaño (lado derecho), Dll4-Fc fue eficaz de nuevo en el control del crecimiento tumoral, y fue de hecho más eficaz que el antagonista de VEGF.

Cuantificación de Dll4-Fc y hFc en circulación. Se analizaron muestras de suero obtenidas de ratones tratados con GFP o Dll4-Fc portadores de tumores por ensayo de ELISA. Se realizó ELISA recubriendo placas con hFc como el anticuerpo de captura, bloqueado con solución de bloqueo I 0,2% (Tropix) y usando hFc conjugado con peroxidasa como un anticuerpo indicador. Se incluyeron proteínas hFc y Dll4-Fc purificadas como curvas patrón.

Tratamiento con inhibidor de VEGF. Se administró bloqueador de VEGF (R1 R2) (Regeneron Pharmaceuticals) (SEC ID Nº: 19) o placebo (PBS/glicerol 5% v/v) por vía subcutánea a ratones que portaban tumores de 100 mm3 a una dosis de 25 mg/kg cada tres días hasta el final del estudio.

Suministro de Dll4-Fc por adenovirus. Otros experimentos no mostrados han usado adenovirus para suministrar Dll4-Fc por vía sistémica. Se implantaron células tumorales C6, HT1080 o MMT por vía subcutánea en el flanco derecho afeitado de ratones SCID/CB17 macho (8-10 semanas de edad). Después de 24 horas, se inyectaron 1 x 109 UFP de adeno-hFc o adeno-Dll4-Fc en la vena yugular de los ratones. Se vieron resultados similares en el crecimiento tumoral con adeno-Dll4-Fc que con el tratamiento sistémico con proteína Dll4-Fc.

Ejemplo 4. Efecto de los anticuerpos policlonales para Dll4-Fc en tumores HT1080.

Se realizaron experimentos en los que se implantaron tumores HT1080 en ratones el día 0 como se ha descrito anteriormente. Cuando los tumores alcanzaron 100 mm3 (aproximadamente el día 15), los ratones se trataron tres veces por semana con Dll4-Fc solamente (25 mg/kg), anticuerpo de control (Ig de conejo) o anticuerpos policlonales anti-Dll4 empobrecidos con respecto a unión con Fc humano (10 mg/kg). Los resultados muestran el tamaño tumoral en cada grupo de tratamiento ± D.T. (Figura 3) Los anticuerpos de Dll4 fueron altamente eficaces contra crecimiento tumoral de HT1080 y tuvieron una eficacia similar a la vista con Dll4-Fc. Estos resultados muestran que un bloqueador específico de Dll4 es un agente antitumoral potente.

Se realizaron ensayos de resonancia de plasmón superficial (BiaCore®) que confirmaban que los anticuerpos de Dll4 eran capaces de bloquear la unión de Dll4 con receptor Notch. Se recubrió la superficie de la microplaca con Notch 1 y se incubó Dll4-Fc con cantidades crecientes de anticuerpo anti-Dll4 policlonal de conejo (descrito anteriormente). Los resultados en la Figura 4 muestran que la cantidad creciente de anticuerpo de Dll4 bloqueó de forma creciente la unión de Dll4-Fc con Notch1 (control = Dll4-Fc + anticuerpo policlonal de conejo no específico).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc

<120> Métodos terapéuticos para inhibir el crecimiento tumoral con antagonistas de DLL4

<130> 2071A-WO

<140> A asignar

<141>

<150> 60/751.176

<151>

<150> 60/771.276

<151 >

<150> 60/788.456 <151>

5

<150> 60/830,543 <151>

<160> 26

10 15

<170> FastSEQ para windows versión 4.0 <210> 1 <211> 2058 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1

<210> 2

<211> 685

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 3427

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 3 <210> 4

<211> 686

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

<210> 5

<211> 9312

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 2556

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 6009

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 2003 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8 10

<210> 9

<211> 19

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 9 gaggtccaag ccgaacctg

<210> 10

<211> 21

<212> ADN

<213> mus musculus

<400> 10 atcgctgatg tgcagttcac a

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 11 cgctgccggc ctggattcac

<210> 12

<211> 18

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 12 gatgcaagcc cggaagaa

<210> 13

<211> 22

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 13 tcgcaattca gaaaggctac tg

<210> 14

<211> 17

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 14 cgcagaggga tcataga

<210> 15

<211> 19

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 15 ctacacatcg ccgctttcg

<210> 16

<211> 18

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 16 cgcgtacttg gccttggt

<210> 17

<211> 15

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 17 ccaccaggac atcgt 15

<210> 18

<211> 530

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 18

<210> 19

<211> 458 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 19

<210> 20

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 272 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 21 <210> 22

<211> 418 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 22 <210> 23

<211> 410 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 23 <210> 24

<211> 370 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 24 <210> 25

<211> 332 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 25 <210> 26

<211> 292 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 26

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un antagonista de ligando de tipo delta 4 (Dll4) y un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) para su uso en un método para tratar el desarrollo o crecimiento tumoral, siendo dicho antagonista de Dll4 un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente con Dll4 y bloquea la unión de Dll4 con un receptor Notch, o una proteína de fusión que comprende un dominio extracelular de Dll4 y un dominio Fc humano de SEC ID Nº: 20.

2. 2.

   El antagonista de Dll4 e inhibidor de VEGF para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo

   o fragmento de anticuerpo de Dll4 es policlonal.
3. 3. El antagonista de Dll4 e inhibidor de VEGF para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo

   o fragmento de anticuerpo de Dll4 es monoclonal.

4. 4.

   El antagonista de Dll4 e inhibidor de VEGF para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado.

5. 5.

   El antagonista de Dll4 e inhibidor de VEGF para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo quimérico.

6. 6.

   El antagonista de Dll4 e inhibidor de VEGF para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo completamente humano.

7. 7.

   El antagonista de Dll4 e inhibidor de VEGF para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla.

8. 8.

   El antagonista de Dll4 e inhibidor de VEGF para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el fragmento de anticuerpo es un Fab.

9. 9.

   El antagonista de Dll4 e inhibidor de VEGF para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el fragmento de anticuerpo es un F(ab')2.

10. 10.

    El antagonista de Dll4 e inhibidor de VEGF para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el inhibidor de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.

11. 11.

    El antagonista de Dll4 e inhibidor de VEGF para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el inhibidor de VEGF es un bloqueador de VEGF de SEC ID Nº: 19.