PT2445528E - Método de tratamento do cancro com um antagonista de dll4 e um agente quimioterapêutico - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Método de tratamento do cancro com um antagonista de D114 e um agente quimioterapêutico"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Campo do invento

Este invento refere-se a métodos para tratar cancros ou tumores com um antagonista do ligando de tipo delta 4 (D114), em particular anticorpos humanos ou seus fragmentos que se ligam de forma especifica ao D114 humano, em combinação com um ou mais agentes quimioterapêuticos, e a composições farmacêuticas compreendendo um antagonista de D114 e um agente quimioterapêutico.

Descrição da técnica relacionada 0 D114 é um membro da família Delta de ligandos Notch que apresenta uma expressão extremamente seletiva por parte do endotélio vascular (Shutter et ai., 2000, Genes Develop. 14:1313-1318) . O D114 é um ligando para os recetores Notch, incluindo Notch 1 e Notch 4. Os antagonistas de D114 são úteis para inibir o crescimento tumoral em vários cancros. As sequências de ácido nucleico e aminoácidos para o D114 humano (hD114) estão apresentadas nas SEQ ID NOS: 1 e 2, respetivamente. Anticorpos específicos para o D114 humano e o tratamento de cancros/tumores usando anticorpos para o D114 estão descritos nas publicações dos pedidos de patente internacional WO 2007/143689, WO 2008/042236 e WO 2007/070671.

Os agentes quimioterapêuticos são amplamente usados para o tratamento do cancro, tanto isoladamente como em combinação com a cirurgia e/ou a radioterapia. As terapêuticas de combinação usando um antagonista de D114 e agentes quimioterapêuticos estão descritas nas publicações dos pedidos de patente U.S. US 2008/0014196 e US 2008/0107648.

BREVE SUMÁRIO DO INVENTO

Num primeiro aspeto, o invento contempla um método de tratamento do cancro num indivíduo necessitado do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de um antagonista de D114 em combinação com um agente quimioterapêutico, em que o cancro é tratado. 0 indivíduo que será tratado pelo método do invento poderá incluir qualquer espécie de mamífero, mas de preferência serão seres humanos que sofrem de cancro.

As terapêuticas de combinação do presente invento são particularmente úteis numa perturbação ou doença associada a D114 ou mediada por D114, que é afetada direta ou indiretamente pela modulação da atividade de D114. Mais especificamente, como agora está demonstrado que o D114 está envolvido no crescimento e no desenvolvimento dos vasos sanguíneos, a inibição ou redução do crescimento ou do desenvolvimento ou da maturação mediados por D114 dos vasos sanguíneos, utilizando antagonistas de D114, é um tratamento eficaz para um cancro/tumor que requer um fornecimento suficiente de sangue para o seu crescimento e sobrevivência. Além disso, a combinação de antagonistas de D114 com agentes quimioterapêuticos, incluindo agentes inibidores do crescimento e outros agentes citotóxicos, reforça sinergisticamente os seus efeitos anticancro/antitumor. Os cancros/tumores que podem ser tratados pelos métodos do presente invento incluem, embora não de forma limitativa, várias malignidades sólidas, incluindo o cancro do ovário, o cancro do útero, o cancro da mama, o cancro do pulmão, o cancro do fígado, o cancro colorretal, o cancro da bexiga, o cancro renal, o cancro da próstata, o cancro do pâncreas, o cancro do estômago, o cancro ósseo, o cancro da pele, incluindo o melanoma, o sarcoma de tecidos moles maligno, incluindo, mas não exclusivamente, o sarcoma de Ewing, o rabdomiossarcoma, o leiomiossarcoma, o sarcoma adipocitário, o sarcoma sinovial, o histiocitoma fibroso maligno, o hemangioendotelioma epitelioide, o angiossarcoma, o fibrossarcoma, os sarcomas não classificados e similares.

Numa concretização, o antagonista de D114 é um anticorpo para D114 ou um seu fragmento ("Ac D114") que se liga de forma específica ao D114 com uma afinidade elevada e bloqueia a ligação do D114 aos recetores Notch e/ou neutraliza as atividades do D114. 0 anticorpo poderá ser policlonal, monoclonal, quimérico, humanizado ou um anticorpo totalmente humano. Preferencialmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um fragmento de anticorpo monoclonal totalmente humano. 0 fragmento de anticorpo poderá ser um anticorpo de cadeia única, um Fab ou um (Fab' à·

Noutra concretização, o Ac D114 liga-se a um epitopo presente no domínio N-terminal (S27-R172) ou no domínio DSL (V173-C217) ou no domínio N-terminal-DSL (S27-C217) de D114 (SEQ ID N0:2). 0 Ac D114 que será usado nos métodos do invento é capaz de se ligar ao D114 humano com uma afinidade elevada e a sua constante de dissociação (KD) é cerca de 500 pM ou inferior, incluindo cerca de 300 pM ou inferior, e incluindo cerca de 200 pM ou inferior, conforme medida por ressonância de plasma de superfície. Por exemplo, o Ac D114 possui uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo três CDR de cadeia pesada (H-CDR) e uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo três CDR de cadeia leve (L-CDR), em que as três CDR de cadeia pesada compreendem as CDR1, CDR2 e CDR3 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20 e as três CDR de cadeia leve compreendem as CDR1, CDR2 e CDR3 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:28. Noutra concretização, as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada do Ac D114 compreendem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 22, 24 e 26, respetivamente. Noutra concretização, as CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve do Ac D114 compreendem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 30, 32 e 34, respetivamente. Ainda noutra concretização, o Ac D114 compreende sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada compreendendo as SEQ ID NOS: 22, 24 e 26, respetivamente, e sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve compreendendo as SEQ ID NOS: 30, 32 e 34, respetivamente. Noutra concretização ainda, o Ac D114 compreende uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 ou 116, ou uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 ou 118. Ainda noutra concretização, o Ac D114 compreende uma combinação HCVR/LCVR de SEQ ID NO :20/28 (REGN281) ou 116/118 (REGN421) .

Noutro aspeto, o Ac D114 compreende uma combinação CDR1/CDR2/CDR3 de cadeia pesada e uma combinação CDR1/CDR2/CDR3 de cadeia leve selecionadas entre: SEQ ID NO:6/8/10 e SEQ ID NO:14/16/18, respetivamente; SEQ ID NO:38/40/42 e SEQ ID NO:46/48/50, respetivamente; SEQ ID NO:54/56/58 e SEQ ID NO:62/64/66, respetivamente; SEQ ID NO:70/72/74 e SEQ ID NO:78/80/82, respetivamente; SEQ ID NO:86/88/90 e SEQ ID NO:94/96/98, respetivamente; e SEQ ID NO:102/104/106 e SEQ ID NO:110/112/114, respetivamente. Noutro aspeto, o Ac D114 compreende uma HCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, 36, 52, 68, 84 ou 100, ou uma LCVR compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:12, 44, 60, 76, 92 ou 108. Ainda noutro aspeto, o Ac D114 compreende uma combinação HCVR/LCVR selecionada entre: SEQ ID NO:4/12 (REGN279); SEQ ID NO:36/44 (REGN290); SEQ ID NO:52/60 (REGN306); SEQ ID NO:68/76 (REGN309); SEQ ID NO:84/92 (REGN310); e SEQ ID N0:100/108 (REGN289).

As sequências nucleotidicas que codificam as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116 e 118 são apresentadas como as SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115 e 117, respetivamente.

Numa concretização, o agente quimioterapêutico é um agente antimitótico como docetaxel, paclitaxel e similares; um composto quimioterapêutico à base de platina como cisplatina, carboplatina, iproplatina, oxaliplatina e similares; outro agente citotóxico convencional como 5-fluorouracilo (5-FU), capecitabina, irinotecano, leucovorina, gemcitabina; ou inibidores de recetores tirosina-cinase e/ou da angiogénese como os inibidores do ErbB, os inibidores de RTK de classe III, os inibidores do VEGFR e similares, e o antagonista de D114 é um anticorpo para D114 ou um seu fragmento como descrito acima.

Num segundo aspeto, o invento inclui um método para diminuir, reduzir ou deter o crescimento tumoral num indivíduo necessitado do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de um antagonista de D114 em combinação com um agente quimioterapêutico, em que o crescimento tumoral é diminuído, reduzido ou detido.

Num terceiro aspeto, o invento inclui um método para reduzir a quantidade de um agente quimioterapêutico ou de um antagonista de D114 necessária para obter um efeito terapêutico desejado, em comparação com a administração de cada um dos agentes sozinhos, compreendendo a administração do agente quimioterapêutico com um antagonista de D114. Num aspeto, a quantidade de um agente quimioterapêutico para obter um efeito terapêutico desejado, como, por exemplo, a paragem ou a redução do crescimento tumoral, é pelo menos 10% inferior, pelo menos 20% inferior, pelo menos 30% inferior, pelo menos 40% inferior ou pelo menos 50% inferior na presença do antagonista de D114 coadministrado, ou vice-versa. Em geral, é desejável que a quantidade de um agente quimioterapêutico ou do antagonista de D114 possa ser reduzida em cerca de 30% a cerca de 50%. Assim, os métodos do invento são particularmente benéficos para os doentes de cancro, que têm uma tolerância baixa aos efeitos secundários provocados pelas doses elevadas necessárias para o tratamento por qualquer agente sozinho, ao serem capazes de reduzir as doses eficazes.

Num quarto aspeto, o invento contempla uma composição farmacêutica compreendendo um antagonista de D114, um agente quimioterapêutico e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa concretização, o antagonista de D114 é um Ac D114 ou seu fragmento que se liga de forma específica ao D114 com uma afinidade elevada e neutraliza as atividades do D114, e o agente quimioterapêutico é qualquer um daqueles aqui descritos.

Num quinto aspeto, o invento inclui um conjunto compreendendo um recipiente que compreende a composição farmacêutica do presente invento e um folheto incluso com umas instruções de utilização. Numa concretização, um conjunto poderá compreender um recipiente no qual está contido um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga de forma específica ao hD114, um ou mais recipientes adicionais onde está contido pelo menos um agente quimioterapêutico selecionado entre qualquer um daqueles aqui descritos e um folheto incluso com umas instruções de utilização.

Outros objetos e vantagens tornar-se-ão evidentes a partir de uma revisão da descrição detalhada que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Fig. 1 ilustra os efeitos do Ac D114 em combinação com cisplatina no crescimento de tumores VMCubl humanos (carcinoma da bexiga) implantados em ratinhos com imunodeficiência combinada grave (SCID de Severe Combined ImmunoDeficiency) que expressam a proteína D114 humanizada (ratinhos SCID com D114 humanizado) (Exemplo 1). Controlo de Fc humano (♦ com linha contínua); REGN421 (Ac D114) 2 mg/kg/injeção (♦ com linha tracejada); cisplatina 0,5 mg/kg/injeção ( ); cisplatina 2 mg/kg/injeção ( ); REGN421 2 mg/kg/injeção + cisplatina 0,5 mg/kg/injeção ( ); e REGN421 2 mg/kg/injeção + cisplatina 2 mg/kg/injeção ( ) .

A Fig. 2 ilustra os efeitos do Ac D114 em combinação com cisplatina no crescimento de tumores A549 humanos (cancro do pulmão de não pequenas células) implantados em ratinhos SCID com D114 humanizado (Exemplo 2) . Controlo de Fc humano ( ) ; REGN421 6 mg/kg dose total ( ); cisplatina 5 mg/kg dose total ( ); cisplatina 9 mg/kg dose total AO; REGN421 6 mg/kg + cisplatina 5 mg/kg doses totais (O) ; e REGN421 6 mg/kg + cisplatina 9 mg/kg doses totais (♦) . A Fig. 3 ilustra os efeitos do Ac D114 em combinação com 5-FU no crescimento de HCT116 humano (carcinoma colorretal) implantado em ratinhos SCID com D114 humanizado (Exemplo 5) .

Controlo de Fc humano ( ) ; REGN421 6 mg/kg dose total ( ); 5- FU 45 mg/kg dose total ( ); 5-FU 75 mg/kg dose total AO ; REGN421 6 mg/kg + 5-FU 45 mg/kg doses totais (O) ; e REGN421 6 mg/kg + 5-FU 75 mg/kg doses totais (♦) . A Fig. 4 ilustra os efeitos do Ac D114 em combinação com irinotecano no crescimento de tumores HCT116 humanos implantados em ratinhos SCID com D114 humanizado (Exemplo 6).

Controlo de Fc humano ( ) ; REGN421 6 mg/kg dose total ( ) ; irinotecano 22,5 mg/kg dose total ( ); irinotecano 75 mg/kg dose total (A); REGN421 6 mg/kg + irinotecano 22,5 mg/kg doses totais (O); e REGN421 6 mg/kg + irinotecano 75 mg/kg doses totais (♦) . A Fig. 5 representa a variação média (4 ratinhos/grupo) em número de vezes da expressão do gene Heyl em células de tumor colorretal humano Colo205 implantadas em ratinhos SCID com D114 humanizado, com uma dose única de REGN421 a 0,5; 5 ou 15 mg/kg, em comparação com hFc a 15 mg/kg, medida às 5, 10, 24 e 72 horas e aos 7 dias após a administração da dose.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Antes de os presentes métodos serem descritos, deverá reconhecer-se que este invento não está limitado aos métodos e condições experimentais particulares descritos, pois esses métodos e condições poderão variar. Deverá também reconhecer-se que a terminologia aqui usada destina-se somente a descrever concretizações particulares e não pretende ser limitativa, uma vez que o âmbito do presente invento será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

Tal como utilizadas neste fascículo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referências no plural, exceto se o contexto ditar claramente o contrário. Assim, por exemplo, uma referência a "um método" inclui um ou mais métodos e/ou passos do tipo aqui descrito e/ou que serão evidentes para os peritos na especialidade após a leitura desta divulgação.

Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o significado normalmente atribuído por um perito na especialidade a que este invento pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou nos testes do presente invento, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.

Definições

Os termos "ligando de tipo delta 4", "D114" e "hD114" são utilizados indistintamente para designar a proteína codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID N0:1 e a proteína que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2.

Os antagonistas de D114 incluem anticorpos para D114 e seus fragmentos capazes de bloquearem a ligação de D114 a um recetor Notch (como Notchl e Notch4), proteínas de fusão compreendendo o domínio extracelular de D114 fundido com um componente de multimerização, ou seus fragmentos (ver, por exemplo, as publicações dos pedidos de patente U.S. n.os 2006/0134121 e 2008/0107648), e péptidos e pepticorpos (ver, por exemplo, a publicação do pedido de patente U.S. n.2 2003/0229023) .

Salvo indicação específica em contrário, o termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, será entendido como englobando as moléculas de anticorpo que compreendem duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina (isto é, "moléculas de anticorpo completas"), assim como fragmentos de ligação ao antigénio destas moléculas. Os termos "parte de ligação ao antigénio" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antigénio" de um anticorpo e similares, tal como aqui utilizados, incluem qualquer polipéptido ou glicoproteína natural, obtenível enzimaticamente, sintético ou manipulado geneticamente que se liga de forma específica a um antigénio para formar um complexo. Os fragmentos de ligação ao antigénio de um anticorpo poderão ser obtidos, por exemplo, a partir de moléculas de anticorpo completas usando quaisquer técnicas convencionais adequadas, como a digestão proteolítica, ou técnicas de engenharia genética recombinante envolvendo a manipulação e a expressão do ADN que codifica os domínios variáveis, e opcionalmente os domínios constantes, do anticorpo. Esse ADN é conhecido e/ou está facilmente disponível através de, por exemplo, fontes comerciais e bibliotecas de ADN (incluindo, por exemplo, bibliotecas de anticorpos em fago) ou pode ser sintetizado. O ADN poderá ser sequenciado e manipulado quimicamente ou via técnicas de biologia molecular, por exemplo, para dispor um ou mais domínios variáveis e/ou constantes numa configuração adequada, ou para introduzir codões, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou eliminar aminoácidos, etc.

Os exemplos não limitativos de fragmentos de ligação ao antigénio incluem: (i) os fragmentos Fab; (ii) os fragmentos F(ab')2; (iii) os fragmentos Fd; (iv) os fragmentos Fv; (v) as moléculas Fv de cadeia única (scFv); (vi) os fragmentos dAb (anticorpos de domínio) e (vii) as unidades de reconhecimento mínimas consistindo nos resíduos de aminoácidos que mimetizam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementaridade isolada (CDR)). Outras moléculas manipuladas, como os diacorpos, os triacorpos, os tetracorpos e os minicorpos, também estão englobadas na expressão "fragmento de ligação ao antigénio", tal como aqui utilizada.

Um fragmento de ligação ao antigénio de um anticorpo compreenderá normalmente pelo menos um domínio variável. 0 domínio variável poderá ter qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e compreenderá geralmente pelo menos uma CDR que é adjacente a, ou está in-frame com, uma ou mais sequências framework. Nos fragmentos de ligação ao antigénio que possuem um domínio Vh associado a um domínio Vl, os domínios Vh e Vl poderão estar situados um em relação ao outro em qualquer disposição apropriada. Por exemplo, a região variável poderá ser dimérica e conter os dímeros VH-VH, VH-VL ou VL-VL. Em alternativa, o fragmento de ligação ao antigénio de um anticorpo poderá conter um domínio Vh ou Vl monomérico.

Em determinadas concretizações, um fragmento de ligação ao antigénio de um anticorpo poderá conter pelo menos um domínio variável ligado covalentemente a pelo menos um domínio constante. As configurações exemplificativas e não limitativas de domínios variáveis e constantes que poderão ser encontradas num fragmento de ligação ao antigénio de um anticorpo do presente invento incluem: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1_Ch2; (v) Vh-Ch1_Ch2-Ch3 ; (vi) Vh~Ch2-Ch3; (vii) Vh-CL; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3 ; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; e (xiv) Vl-Cl. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo quaisquer das configurações exemplificativas indicadas acima, os domínios variáveis e constantes poderão estar diretamente ligados uns aos outros ou poderão estar ligados por meio de uma região espaçadora ou de dobradiça total ou parcial. Uma região de dobradiça poderá consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos, que dão origem a uma ligação flexível ou semiflexível entre os domínios variáveis e/ou constantes adjacentes numa molécula polipeptídica única. Além disso, um fragmento de ligação ao antigénio de um anticorpo do presente invento poderá compreender um homodímero ou um heterodímero (ou outro multímero) de quaisquer das configurações de domínios variáveis e constantes indicadas acima em associação não covalente uma com a outra e/ou com um ou mais domínios VH ou Vl monoméricos (por exemplo, por meio de uma ligação ou ligações dissulfureto).

Tal como acontece com as moléculas de anticorpo completas, os fragmentos de ligação ao antigénio poderão ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento multiespecífico de ligação ao antigénio de um anticorpo compreenderá tipicamente pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada domínio variável é capaz de se ligar de forma específica a um antigénio separado ou a um epitopo diferente no mesmo antigénio. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os formatos de anticorpos biespecíficos exemplificativos aqui descritos, poderá ser adaptado para utilização no contexto de um fragmento de ligação ao antigénio de um anticorpo do presente invento, usando técnicas de rotina disponíveis na técnica. O termo "anticorpo humano", tal como aqui utilizado, pretende incluir os anticorpos que possuem regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas da linha germinal humana. Os AcM humanos do invento poderão incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulinas da linha germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou dirigida in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nas CDR, em particular na CDR3. Contudo, o termo "anticorpo humano", tal como aqui utilizado, não pretende incluir os AcM em que as sequências CDR derivadas da linha germinal de outra espécie de mamífero (por exemplo, o ratinho) foram enxertadas em sequências FR humanas.

Os anticorpos anti-D114 totalmente humanos aqui descritos poderão compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos nas regiões framework e/ou CDR dos domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada em comparação com as sequências da linha germinal correspondentes. Essas mutações podem ser facilmente determinadas comparando as sequências de aminoácidos aqui descritas com as sequências da linha germinal disponíveis a partir de, por exemplo, bases de dados públicas de sequências de anticorpos. 0 presente invento inclui anticorpos, e seus fragmentos de ligação ao antigénio, que derivam de quaisquer das sequências de aminoácidos aqui descritas, em que um ou mais aminoácidos, numa ou mais regiões framework e/ou CDR, sofrem mutação reversa para o(s) resíduo (s) correspondente (s) da linha germinal ou para uma substituição de aminoácidos conservativa (natural ou não natural) do(s) resíduo(s) correspondente (s) da linha germinal (estas alterações da sequência são aqui designadas por "mutações reversas de linha germinal"). Um perito na especialidade, partindo das sequências das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada aqui descritas, pode facilmente produzir numerosos anticorpos e fragmentos de ligação ao antigénio que compreendem uma ou mais mutações reversas de linha germinal individuais ou combinações delas. Em determinadas concretizações, todos os resíduos framework e/ou CDR nos domínios Vh e/ou Vl sofrem mutação reversa para a sequência da linha germinal. Noutras concretizações, apenas determinados resíduos sofrem mutação reversa para a sequência da linha germinal, por exemplo, apenas os resíduos mutados encontrados nos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou nos últimos 8 aminoácidos de FR4, ou apenas os resíduos mutados encontrados em CDR1, CDR2 ou CDR3. Além disso, os anticorpos do presente invento poderão conter qualquer combinação de duas ou mais mutações reversas de linha germinal nas regiões framework e/ou CDR, isto é, em que determinados resíduos individuais sofrem mutação reversa para a sequência da linha germinal ao passo que certos outros resíduos que diferem da sequência da linha germinal são mantidos. Uma vez obtidos, os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antigénio que contêm uma ou mais mutações reversas de linha germinal podem ser facilmente testados quanto a uma ou mais propriedades desejadas, tais como uma melhor especificidade de ligação, uma maior afinidade de ligação, propriedades biológicas antagonisticas ou agonisticas melhoradas ou reforçadas (consoante o caso), uma menor imunogenicidade, etc. Os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antigénio obtidos desta forma geral estão incluídos no presente invento. 0 presente invento também divulga anticorpos anti-D114 compreendendo variantes de quaisquer das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR aqui descritas que possuem uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, o presente invento divulga anticorpos anti-D114 possuindo sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, 2 ou 1 substituição/substituições de aminoácidos conservativa(s) em relação a quaisquer das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR aqui descritas. Num aspeto, uma HCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 116 com 10 ou menos substituições de aminoácidos conservativas. Noutro aspeto, uma HCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:116 com 8 ou menos substituições de aminoácidos conservativas. Noutro aspeto, uma HCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:116 com 6 ou menos substituições de aminoácidos conservativas. Noutro aspeto, uma HCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:116 com 4 ou menos substituições de aminoácidos conservativas. Noutro aspeto ainda, uma HCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:116 com 2 ou 1 substituição/substituições de aminoácidos conservativa(s). Num aspeto, uma LCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:118 com 10 ou menos substituições de aminoácidos conservativas. Noutro aspeto, uma LCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:118 com 8 ou menos substituições de aminoácidos conservativas. Noutro aspeto, uma LCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:118 com 6 ou menos substituições de aminoácidos conservativas. Noutro aspeto, uma LCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:118 com 4 ou menos substituições de aminoácidos conservativas. Noutro aspeto ainda, uma LCVR compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:118 com 2 ou 1 substituição/substituições de aminoácidos conservativa(s).

Um anticorpo "neutralizante" ou "bloqueador" pretende designar um anticorpo cuja ligação ao D114 resulta em inibição da atividade biológica do D114. Esta inibição da atividade biológica do D114 pode ser avaliada medindo um ou mais indicadores da atividade biológica do D114. Estes indicadores da atividade biológica do D114 podem ser avaliados por meio de um ou mais de vários ensaios padrão in vitro ou in vivo conhecidos na técnica. Por exemplo, a capacidade de um anticorpo para neutralizar a atividade do D114 é avaliada pela inibição da ligação do D114 a um recetor Notch. 0 termo "liga-se de forma especifica", ou similar, significa que um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio forma um complexo com um antigénio que é relativamente estável em condições fisiológicas. A ligação especifica pode ser caracterizada por uma constante de dissociação em equilíbrio de pelo menos cerca de 1 x 10~6 M ou inferior (por exemplo, uma Kd mais pequena indica uma ligação mais forte). Os métodos para determinar se duas moléculas se ligam ou não de forma especifica são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a diálise de equilíbrio, a ressonância de plasma de superfície e técnicas similares. Um anticorpo isolado que se liga de forma específica ao hD114 poderá, contudo, apresentar reatividade cruzada com outros antigénios, tais como as moléculas D114 de outras espécies. Além disso, os anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos) que se ligam ao hD114 e a um ou mais antigénios adicionais são considerados anticorpos que se "ligam de forma específica" ao hD114, tal como o termo é aqui utilizado. 0 termo "Kd", tal como aqui utilizado, pretende designar a constante de dissociação de uma interação anticorpo-antigénio particular. 0 termo anticorpo de "alta afinidade" refere-se àqueles anticorpos que se ligam ao D114 com uma Kd inferior a cerca de 500 pM, inferior a cerca de 400 pM, inferior a cerca de 300 pM ou inferior a cerca de 200 pM, conforme medida por ressonância de plasma de superfície, por exemplo, BIACORE™, ou por ELISA de afinidade em solução, usando, por exemplo, D114 monomérico; ou uma Kd inferior a cerca de 100 pM, inferior a cerca de 50 pM ou inferior a cerca de 20 pM, conforme medida por ressonância de plasma de superfície usando D114 dimérico. O termo "ressonância de plasma de superfície", tal como aqui utilizado, refere-se a um fenómeno ótico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real através da deteção de alterações nas concentrações de proteína num biossensor, por exemplo usando o sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, Nova Jérsia). O termo "epitopo" desiqna uma reqião de um antiqénio que é ligada por um anticorpo. Os epitopos poderão ser definidos como estruturais ou funcionais. Os epitopos funcionais são geralmente um subconjunto dos epitopos estruturais e possuem aqueles resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da interação. Os epitopos também poderão ser conformacionais, isto é, constituídos por aminoácidos não lineares. Em determinadas concretizações, os epitopos poderão incluir determinantes que são agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, como aminoácidos, cadeias laterais de açúcares, grupos fosforilo ou grupos sulfonilo, e, em determinadas concretizações, poderão ter características estruturais tridimensionais e/ou características específicas de carga.

Os agentes quimioterapêuticos são compostos químicos úteis no tratamento do cancro e incluem agentes inibidores do crescimento ou outros agentes citotóxicos. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos que podem ser usados nos presentes métodos incluem agentes alquilantes como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN®); alquilsulfonatos como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; mostardas nitrogenadas como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosureias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos como metotrexato e 5-FU; análogos do ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purinas como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidinas como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgénios como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; um regenerador do ácido fólico como ácido folinico; aceglatona; glicosideo de aldofosfamida; ácido aminolevulinico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilinico; 2-etilidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; membros da familia dos taxoides ou taxanos como paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, Nova Jérsia), docetaxel (TAXOTERE®; Aventis Antony, França) e seus análogos; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina; navelbina; novantrone; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina; inibidores de recetores tirosina-cinase e/ou da angiogénese, incluindo sorafenib (NEXAVAR® de

Bayer Pharmaceuticals Corp.), sunitinib (SUTENT® de Pfizer), pazopanib (VOTRIENT™ de GlaxoSmithKline), toceranib (PALLADIA™ de Pfizer), vandetanib (ZACTIMA™ de AstraZeneca), cediranib (RECENTIN® de AstraZeneca), regorafenib (BAY 73-4506 de Bayer), axitinib (AG013736 de Pfizer), lestaurtinib (CEP-701 de Cephalon), erlotinib (TARCEVA® de Genentech), gefitinib (IRESSA™ de AstraZeneca), BIBW 2992 (TOVOK™ de Boehringer Ingelheim), lapatinib (TYKERB® de GlaxoSmithKline), neratinib (HKI-272 de Wyeth/Pfizer), compostos similares e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de guaisguer uns dos exemplos acima. Nesta definição estão também incluídos os agentes anti-hormonais gue atuam de forma a regular ou inibir a ação hormonal sobre os tumores, como os antiestrogénios incluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazóis gue inibem a aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, gueoxifeno, LY 117018, onapristona e toremifeno (FARESTON®); os antiandrogénios como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, goserrelina; e os sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de guaisguer uns dos exemplos acima. Outros compostos químicos citotóxicos convencionais, como aqueles descritos em Wiemann et ai., 1985, in Medical Oncology (Calabresi et ai., eds.), Chapter 10, McMillan Publishing, também são aplicáveis aos métodos do presente invento. O termo "agentes inibidores do crescimento" refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente de uma célula cancerosa, in vitro ou in vivo. Os exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem os agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (num local distinto da fase S), por exemplo os agentes que induzem a paragem na fase G1 e a paragem na fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina) , membros da família dos taxanos, incluindo, embora não exclusivamente, paclitaxel (TAXOL®), docetaxel (TAXOTERE®) e seus análogos (por exemplo, XRP9881 e XRP6258; ver Ojima et ai., Curr Opin Investig Drugs 4:737, 2003) e inibidores de topoisomerases como irinotecano, topotecano, camptotecina, lamelarina D, doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido e bleomicina. Aqueles agentes que induzem a paragem na fase G1 também alastram para paragem da fase S, por exemplo, os agentes alquilantes do ADN como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-FU e ara-C.

Descrição geral 0 presente invento baseia-se na constatação de que a coadministração de um antagonista de D114, por exemplo, um anticorpo para D114 ou um seu fragmento que se liga de forma especifica a D114 e bloqueia as atividades do D114, com um agente quimioterapêutico, por exemplo, cisplatina ou docetaxel, resulta em maior inibição do crescimento do tumor do que qualquer um dos agentes individuais. Para obter uma descrição do Ac D114 totalmente humano, incluindo o Ac D114 humano recombinante, consultar a publicação do pedido de patente internacional n.2 WO 2008/076379. Métodos de preparação do Ac D114

Os métodos de preparação de anticorpos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495-497; Harlow & Lane (1988) Antibodies: a Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY) . Os anticorpos que são isolados de organismos não humanos, como sejam os ratinhos, os ratos, os coelhos ou as vacas, podem ser convertidos em anticorpos de tipo mais humano através de quimerização ou humanização.

As formas "humanizadas" ou quiméricas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos destas (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio dos anticorpos) que contêm as sequências mínimas necessárias para a ligação ao antigénio derivadas da imunoglobulina não humana. Elas possuem uma afinidade e uma especificidade de ligação iguais ou idênticas às do anticorpo de ratinho ou do outro anticorpo não humano que fornece o material de partida para a construção do anticorpo quimérico ou humanizado. Os anticorpos quiméricos são anticorpos cujos genes das cadeias leve e pesada foram construídos, tipicamente por engenharia genética, a partir de segmentos de genes de imunoglobulinas pertencentes a espécies diferentes. Por exemplo, os segmentos variáveis (V) dos genes de um anticorpo monoclonal de ratinho poderão ser unidos a segmentos constantes (C) humanos, tais como IgGl e IgG4 . Um anticorpo quimérico típico é pois uma proteína híbrida consistindo no domínio V ou domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo de ratinho e no domínio C ou domínio efetor de um anticorpo humano. Os anticorpos humanizados possuem os resíduos framework da região variável essencialmente de um anticorpo humano (denominado um anticorpo aceitador) e as regiões determinantes de complementaridade (regiões CDR) essencialmente de um anticorpo de ratinho (designado por imunoglobulina dadora). Ver Queen et ai., Proc. Natl. Acad Sei. USA 86:10029-10033 (1989), a publicação do pedido de patente internacional n.2 WO 90/07861 e as patentes U.S. 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089, 5,530,101 e 5,225,539. A(s) região/regiões constante (s), caso estejam presentes, também são essencial ou integralmente provenientes de uma imunoglobulina humana. Os domínios variáveis humanos são normalmente escolhidos de anticorpos humanos cujas sequências framework apresentam um nível elevado de identidade de sequência com os domínios das regiões variáveis murinas de onde as CDR provêm. Os resíduos framework da região variável de cadeia leve e de cadeia pesada podem ser obtidos da mesma ou de diferentes sequências de anticorpos humanos. As sequências de anticorpos humanos podem ser as sequências de anticorpos humanos naturais ou podem ser as sequências de consenso de vários anticorpos humanos. Ver a publicação do pedido de patente internacional n.2 WO 92/22653. Determinados aminoácidos dos resíduos framework da região variável humana são selecionados para serem substituídos com base na sua possível influência sobre a conformação das CDR e/ou a ligação ao antigénio. A investigação destas possíveis influências poderá ser efetuada por modelagem, exame das características dos aminoácidos em posições particulares ou observação empírica dos efeitos da substituição ou da mutagénese de aminoácidos particulares. Por exemplo, quando um aminoácido difere entre um resíduo framework da região variável murina e um resíduo framework da região variável humana selecionada, o aminoácido framework humano deverá normalmente ser substituído pelo aminoácido framework equivalente do anticorpo de ratinho quando é razoável esperar que o aminoácido: (1) se ligue diretamente ao antigénio de forma não covalente; (2) seja adjacente a uma região CDR; (3) interaja de outra forma com uma região CDR (por exemplo, esteja a menos de uma distância de cerca de 6 À de uma região CDR) ou (4) participe na interface VL - VH. Outros candidatos para serem substituídos são os aminoácidos framework humanos aceitadores que são invulgares para uma imunoglobulina humana nessa posição. Estes aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos da posição equivalente do anticorpo dador de ratinho ou das posições equivalentes de imunoglobulinas humanas mais comuns. Outros candidatos para serem substituídos são os aminoácidos framework humanos aceitadores que são invulgares para uma imunoglobulina humana nessa posição. As frameworks da região variável das imunoglobulinas humanizadas normalmente apresentam uma identidade de sequência de pelo menos 85% com uma sequência framework de região variável humana ou uma sequência de consenso dessas sequências.

Os métodos para gerar anticorpos humanos incluem, por exemplo, VELOCIMMUNE™ (Regeneron Pharmaceuticals) , a tecnologia XENOMOUSE™ (Abgenix) , a abordagem "minilocus" e a apresentação em fagos. A tecnologia VELOCIMMUNE™ (patente U.S. 6,596,541) inclui um método para gerar um anticorpo totalmente humano de alta especificidade para um antigénio selecionado. Esta tecnologia envolve a geração de um ratinho transgénico possuindo um genoma que compreende regiões variáveis de cadeias leve e pesada humanas ligadas de forma funcional a loci de regiões constantes endógenas de ratinho, de forma que o ratinho produz um anticorpo compreendendo uma região variável humana e uma região constante de ratinho em resposta à estimulação antigénica. 0 ADN que codifica as regiões variáveis das cadeias leve e pesada do anticorpo é isolado e ligado de forma funcional ao ADN que codifica as regiões constantes de cadeias leve e pesada humanas. 0 ADN é depois expresso numa célula capaz de expressar o anticorpo totalmente humano. Numa concretização, a célula é uma célula CHO. A tecnologia XENOMOUSE™ (Green et ai., 1994, Nature Genetics 7:13-21) produz um ratinho que possui regiões variáveis e constantes humanas provenientes dos loci da cadeia pesada e da cadeia leve kappa. Numa abordagem alternativa, outros autores utilizaram uma abordagem "minilocus" em que um locus de uma Ig exógena é mimetizado através da inclusão dos genes individuais do locus da Ig (ver, por exemplo, a patente U.S. 5,545,807). O ADN que codifica as regiões variáveis pode ser isolado, estando ou não ligado de forma funcional ao ADN que codifica a região constante das cadeias leve e pesada humanas.

Em alternativa, é possível utilizar a apresentação em fagos ou tecnologias de apresentação relacionadas para identificar anticorpos, fragmentos de anticorpos, como sejam os domínios variáveis, e fragmentos Fab heteroméricos que se ligam especificamente ao D114 (ver, por exemplo, a publicação do pedido de patente U.S. n.2 2003/0229023) . O rastreio e a seleção das imunoglobulinas (anticorpos) preferidas podem ser efetuados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. O rastreio inicial quanto à presença de anticorpos monoclonais específicos para D114 poderá ser efetuado, por exemplo, através da utilização de métodos baseados em ELISA ou da apresentação em fagos. Preferencialmente, é realizado um rastreio secundário para identificar e selecionar um anticorpo monoclonal desejado. O rastreio secundário poderá ser efetuado por qualquer método apropriado conhecido na técnica. Um método preferido, denominado "Biosensor Modification-Assisted Profiling" ("BiaMAP"), está descrito na publicação do pedido de patente U.S. n.2 2004/101920. O BiaMAP permite a identificação rápida de clones de hibridomas que produzem os anticorpos monoclonais com as características desejadas. Mais especificamente, os anticorpos monoclonais são divididos em grupos distintos relacionados com os epitopos com base na avaliação das interações anticorpo:antigénio. Em alternativa, é possível utilizar ensaios de competição baseados em ELISA, baseados em esferas ou baseados em BIACORE® para identificar pares de ligação que se ligam a diferentes epitopos de D114 e que, por conseguinte, é provável que cooperem para se ligarem ao ligando com afinidade elevada. Métodos de administração O presente invento disponibiliza métodos de tratamento que compreendem a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um antagonista de D114, tal como um Ac D114, e um agente quimioterapêutico, como sejam os agentes antimitóticos, por exemplo, docetaxel, paclitaxel e compostos similares (taxanos); os compostos quimioterapêuticos à base de platina, como cisplatina, carboplatina, iproplatina, oxaliplatina e compostos similares; os análogos de pirimidinas, como 5-FU, capecitabina (XELODA®, Roche) e compostos similares; os inibidores de topoisomerases, como irinotecano, topotecano, camptotecina, lamelarina D e compostos similares; e/ou os adjuvantes, como leucovorina (ácido folínico) e compostos similares (para obter pormenores, ver a secção de definições acima). 0 antagonista de D114 e o agente quimioterapêutico podem ser coadministrados em conjunto ou separadamente. Quando se utilizam formas farmacêuticas separadas, o antagonista de D114 e o agente quimioterapêutico podem ser administrados em simultâneo ou separadamente em alturas escalonadas, isto é, sequencialmente. São conhecidos e podem ser usados vários sistemas de entrega para administrar a composição farmacêutica do invento, por exemplo, a encapsulação em lipossomas, micropartícuias, microcápsulas, as células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, a endocitose mediada por recetores (ver, por exemplo, Wu & Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Os métodos de introdução incluem, embora não estejam limitados a estes exemplos, as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, intraocular, epidural e oral. A composição poderá ser administrada por qualquer via, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, por absorção através dos revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, a mucosa oral, a mucosa retal e intestinal, etc.) e poderá ser administrada juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistémica ou local. A administração pode ser aguda ou crónica (por exemplo, diariamente, semanalmente, mensalmente, etc.) ou em combinação com outros agentes. Também é possível utilizar a administração pulmonar, por exemplo, mediante a utilização de um inalador ou nebulizador e a formulação com um agente de aerossolização.

No que diz respeito à entrega subcutânea, um dispositivo de entrega do tipo caneta tem aplicações na entrega de uma composição farmacêutica do presente invento. Esse dispositivo de entrega do tipo caneta pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo de entrega do tipo caneta reutilizável usa um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Uma vez administrada toda a composição farmacêutica contida no cartucho e o cartucho vazio, o cartucho vazio pode ser facilmente eliminado e substituído por um cartucho novo que contém a composição farmacêutica. 0 dispositivo de entrega do tipo caneta pode depois ser reutilizado. Num dispositivo de entrega do tipo caneta descartável, não existe cartucho substituível. Em vez disso, o dispositivo de entrega do tipo caneta descartável é fornecido com a composição farmacêutica previamente contida num reservatório no interior do dispositivo. Um vez o reservatório vazio da composição farmacêutica, todo o dispositivo é eliminado.

Numerosos dispositivos de entrega do tipo caneta reutilizáveis têm aplicações na entrega subcutânea de uma composição farmacêutica do presente invento. Os exemplos incluem, mas não estão certamente limitados a, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), caneta DISETRONIC™ (Disetronic Medicai Systems, Burghdorf, Suíça), caneta HUMALOG MIX 75/25™, caneta HUMALOG™, caneta HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianápolis, Indiana), NOVOPEN™ I, II e III (Novo Nordisk, Copenhaga, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhaga, Dinamarca), caneta BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nova Jérsia), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ e OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemanha), para nomear apenas alguns. Os exemplos de dispositivos de entrega do tipo caneta descartáveis que possuem aplicações na entrega subcutânea de uma composição farmacêutica do presente invento incluem, mas não estão certamente limitados a, caneta SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) e KWIKPEN™ (Eli Lilly).

Noutra concretização, o agente ativo pode ser entregue numa vesícula ou num lipossoma (ver Langer (1990) Science 249:1527-1533). Ainda noutra concretização, o agente ativo pode ser entregue num sistema de libertação controlada. Numa concretização, é possível utilizar uma bomba (ver Langer (1990) acima). Noutra concretização, é possível usar materiais poliméricos (ver Howard et ai. (1989) J. Neurosurg. 71:105) .

Noutra concretização em que o agente ativo do invento é um ácido nucleico que codifica uma proteína, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover a expressão da proteína codificada, construindo-o como parte de um vetor de expressão de ácidos nucleicos apropriado e administrando-o de forma a ficar intracelular, por exemplo, mediante a utilização de um vetor retroviral (ver, por exemplo, a patente U.S. 4,980,286), ou por injeção direta, ou recorrendo ao bombardeamento de micropartícuias (por exemplo, uma pistola de genes; Biolistic, Dupont), ou ao revestimento com lípidos ou recetores de superfície celular, ou a agentes de transfeção, ou administrando-o em ligação a um péptido de tipo homeobox que se sabe que entra no núcleo (ver, por exemplo, Joliot et ai., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:1864-1868), etc. Em alternativa, um ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado no ADN da célula hospedeira através de recombinação homóloga, de modo a ser expresso.

Numa concretização específica, poderá ser desejável administrar as composições farmacêuticas do invento localmente, na área que requer tratamento. Isto poderá obter-se, por exemplo, e não como limitação, por infusão local durante a cirurgia, por aplicação tópica, por exemplo, por injeção, por meio de um cateter ou por meio de um implante, em que o referido implante é de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, por exemplo membranas de Silastic, fibras ou substitutos comerciais de pele. A quantidade do agente ativo do invento que será eficaz no tratamento do cancro/tumor pode ser determinada por meio de técnicas clínicas padrão baseadas na presente descrição. Além disso, poderão opcionalmente utilizar-se ensaios in vitro para ajudar a identificar os intervalos de dose ótimos. A dose precisa a utilizar na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da perturbação e deve ser decidida de acordo com a opinião do médico e as circunstâncias de cada indivíduo. Contudo, os intervalos de dose adequados para a administração intravenosa são geralmente de cerca de 0,2 a 30 mg de composto ativo por quilograma de peso corporal. Os intervalos de dose apropriados para a administração intranasal são geralmente de cerca de 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. As doses eficazes poderão ser extrapoladas a partir das curvas dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou com modelos animais.

No caso da administração sistémica, uma dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios in vitro. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para obter um intervalo de concentrações em circulação que inclui o valor IC50, conforme determinado em cultura celular. Essa informação pode ser usada para determinar com maior precisão as doses úteis nos seres humanos. As doses iniciais também podem ser estimadas a partir de dados in vivo, por exemplo, modelos animais, recorrendo a técnicas que são bem conhecidas na técnica. Um perito na especialidade pode otimizar facilmente a administração aos seres humanos com base em dados de animais. A dose poderá variar dependendo da idade e do tamanho (por exemplo, do peso corporal ou da área de superfície corporal) do indivíduo que receberá a administração, da doença visada, das condições, da via de administração e de fatores similares. No caso da administração sistémica de antagonistas de D114, em particular de anticorpos para D114, os intervalos de dose típicos para a administração intravenosa situam-se numa dose diária de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/kg ou cerca de 0,2 a cerca de 10 mg/kg. No caso da administração subcutânea, os anticorpos podem ser administrados numa quantidade de cerca de 10 mg a cerca de 500 mg, cerca de 20 mg a cerca de 400 mg, cerca de 30 mg a cerca de 300 mg ou cerca de 50 mg a cerca de 200 mg, à concentração de anticorpo de pelo menos cerca de 25 mg/ml, cerca de 50 mg/ml, cerca de 75 mg/ml, cerca de 100 mg/ml, cerca de 125 mg/ml, cerca de 150 mg/ml, cerca de 175 mg/ml, cerca de 200 mg/ml ou cerca de 250 mg/ml, pelo menos 1 a 5 vezes por dia, 1 a 5 vezes por semana ou 1 a 5 vezes por mês. Em alternativa, os anticorpos podem ser inicialmente administrados via injeção intravenosa, seguida de administração subcutânea sequencial.

Em geral, os agentes quimioterapêuticos são utilizados intravenosa ou oralmente, num intervalo de dose compreendido entre 50 mg/m2 e 5.000 mg/m2 por semana, embora os intervalos de dose variem dependendo de vários fatores, incluindo o indivíduo em tratamento, o peso e a idade do indivíduo, a gravidade da afeção, a forma de administração, o tipo de agente quimioterapêutico utilizado, a opinião do médico e fatores similares. A terapêutica poderá ser repetida de forma intermitente enquanto os sintomas forem detetáveis ou mesmo quando não são detetáveis. A duração do tratamento também poderá variar dependendo da gravidade das perturbações tratadas, assim como dos níveis de tolerância dos sujeitos a possíveis efeitos adversos, caso existam, e poderá durar tanto tempo quanto o necessário ou enquanto o benefício se sobrepuser a qualquer efeito adverso. A dose de cada agente poderá ser adicionalmente ajustada na terapêutica de combinação, onde a quantidade de cada agente necessária para obter um efeito terapêutico desejado é reduzida (isto é, apresenta um efeito sinérgico) em comparação com a administração de qualquer um dos agentes sozinho (ver os Exemplos 1 e 2, abaixo) .

Os agentes quimioterapêuticos que podem ser usados nas terapêuticas de combinação do invento também incluem aqueles que são utilizados em regimes quimioterapêuticos bem conhecidos. Por exemplo, FOLFOX é um regime quimioterapêutico para tratar o cancro colorretal (OCR) e é uma combinação de 5-FU, ácido folínico e oxaliplatina. FOLFIRI é outro regime quimioterapêutico para o OCR e é uma combinação de 5-FU, ácido folínico e irinotecano. XELOX é um regime quimioterapêutico de segunda linha para o CCR e é uma combinação de capecitabina e oxaliplatina.

Além disso, a terapêutica com a combinação de um agente quimioterapêutico e um antagonista de D114 poderá ser fornecida sozinha ou em combinação com fármacos adicionais, tais como outros agentes antiangiogénicos, por exemplo, antagonistas de VEGF, incluindo anticorpos anti-VEGF (por exemplo, AVASTIN® de Genentech) , proteínas de fusão que se ligam a VEGF (por exemplo, aflibercept de Regeneron Pharmaceuticals) e similares, e outros agentes terapêuticos, como analgésicos, agentes anti-inflamatórios, incluindo anti-inflamatórios não esteroides (ΑΙΝΕ) como inibidores de Cox-2, e similares, de forma a melhorar e/ou reduzir os sintomas que acompanham o cancro/tumor subjacente.

Quimioterapias metronómicas A quimioterapia metronómica está a emergir como uma forma melhorada de administração da quimioterapia. A quimioterapia tradicional tem sido administrada, em doses únicas ou ciclos curtos de terapia, como a dose mais elevada possível que não causa níveis de toxicidade potencialmente fatais, por exemplo, à dose máxima tolerada (DMT). A terapia DMT requer intervalos prolongados de 2-3 semanas entre ciclos sucessivos da terapia. Apesar da variedade de agentes quimioterapêuticos e do grande número de ensaios clínicos realizados para testá-los, o progresso tem sido modesto em termos de curar ou prolongar de forma significativa a vida dos doentes com cancro (Kerbel et ai., 2004, Nature Reviews Cancer 4:423-436). A quimioterapia metronómica refere-se à administração frequente, mesmo diária, de agentes quimioterapêuticos em doses significativamente abaixo da DMT, sem intervalos prolongados sem fármacos. Além de uma toxicidade aguda reduzida, a eficácia da quimioterapia metronómica poderá aumentar quando é administrada em combinação com fármacos antiangiogénicos específicos, como sejam os inibidores do VEGF (Kerbel et al., 2004, acima).

Por conseguinte, o presente invento inclui uma quimioterapia metronómica para tratar um cancro num indivíduo necessitado do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de um antagonista de D114 em combinação com um agente quimioterapêutico, em que o cancro é tratado. Numa concretização específica, o antagonista de D114 e um agente quimioterapêutico poderão ser administrados em conjunto ou sequencialmente durante um período de tempo relativamente curto, por exemplo, 1-12 semanas, seguido da administração metronómica do agente quimioterapêutico durante um período de tempo prolongado, por exemplo, 6-24 meses.

Composições farmacêuticas

O presente invento disponibiliza composições farmacêuticas compreendendo um antagonista de D114, um agente quimioterapêutico e um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou de um governo estatal, ou referido na Farmacopeia dos Estados Unidos ou noutra farmacopeia reconhecida em geral, para uso em animais e, mais particularmente, em seres humanos. 0 termo "veiculo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou transportador com o qual o agente terapêutico é administrado. Estes veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo aqueles de origem petrolífera, animal, vegetal ou sintética, como o óleo de amendoim, o óleo de soja, o óleo mineral, o óleo de sésamo e similares. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem o amido, a glucose, a lactose, a sacarose, a gelatina, o malte, o arroz, a farinha, a cal, o gel de sílica, o estearato de sódio, o monoestearato de glicerol, o talco, o cloreto de sódio, o leite magro em pó, o glicerol, o propilenoglicol, a água, o etanol e similares. A composição, se assim desejado, também pode conter quantidades secundárias de agentes emulsionantes ou molhantes ou de agentes de tamponamento do pH. Estas composições podem adotar a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação prolongada e similares. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e veículos tradicionais como os triglicéridos. Uma formulação oral pode incluir veículos convencionais, como sejam as qualidades farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de veículos farmacêuticos apropriados estão descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.

Numa concretização preferida, a composição é formulada, de acordo com procedimentos de rotina, como uma composição farmacêutica adaptada a administração intravenosa aos seres humanos. Sempre que necessário, a composição também poderá incluir um agente solubilizante e um anestésico local, como a lidocaína, para aliviar a dor no local da injeção. Quando se destina a ser administrada por infusão, a composição pode ser distribuída com um frasco de infusão contendo água ou soro fisiológico estéril de qualidade farmacêutica. Quando a composição é administrada por injeção, pode disponibilizar-se uma ampola de água ou soro fisiológico estéril para injeção para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

Os agentes ativos do invento podem ser formulados como formas neutras ou como sais. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com grupos amino livres, como aqueles derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e aqueles formados com grupos carboxilo livres, como aqueles derivados dos hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio e férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

Uma composição útil na prática dos métodos do invento poderá ser um líquido compreendendo um agente do invento em solução, em suspensão ou em ambas as formas. 0 termo "solução/suspensão" refere-se a uma composição líquida em que uma primeira porção do agente ativo está presente em solução e uma segunda porção do agente ativo está presente na forma particulada, em suspensão numa matriz líquida. A composição líquida poderá ser aquosa e também inclui uma forma em gel e uma forma de unguento.

Uma suspensão ou solução/suspensão aquosa útil para a prática dos métodos do invento poderá conter um ou mais polímeros como agentes de suspensão. Os polímeros úteis incluem polímeros solúveis em água, como sejam os polímeros reticulados contendo grupos carboxilo. Uma suspensão ou solução/suspensão aquosa do presente invento é preferencialmente viscosa ou mucoadesiva ou, ainda mais preferencialmente, simultaneamente viscosa e mucoadesiva.

Conjuntos 0 invento divulga adicionalmente um artigo de manufatura ou conjunto, compreendendo um material de acondicionamento, um recipiente e um agente farmacêutico contido no recipiente, em que o agente farmacêutico compreende pelo menos um antagonista de D114, como um anticorpo para D114, e pelo menos um agente quimioterapêutico, e em que o material de acondicionamento compreende um rótulo ou um folheto incluso que indica que o antagonista de D114 e o agente quimioterapêutico podem ser usados para tratar um cancro ou para reduzir ou deter o crescimento de um tumor. Num aspeto, o antagonista de D114 e o agente quimioterapêutico poderão estar contidos em recipientes separados. Assim, o invento divulga um conjunto que compreende um recipiente no qual está contido um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga de forma especifica ao hD114, e um ou mais recipientes adicionais onde está contido pelo menos um agente quimioterapêutico.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são apresentados para proporcionar aos peritos na especialidade uma divulgação e uma descrição completas da forma de preparar e utilizar os métodos e as composições do invento e não se destinam a limitar o âmbito daquilo que os inventores consideram o seu invento. Embora tenham sido feitos esforços no sentido de garantir a exatidão dos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), alguns erros e desvios experimentais deverão ser considerados. Exceto indicação em contrário, as partes são partes em peso, a temperatura é em graus Celsius, a pressão é a pressão atmosférica ou uma pressão próxima e as barras de erro nas figuras = média ± EPM.

Exemplo 1: Efeito do anticorpo anti-hD114 em combinação com cisplatina 0 efeito do anticorpo anti-D114 (REGN421) em combinação com cisplatina (platinol, cis-diaminodicloroplatina) no crescimento tumoral foi avaliado em tumores implantados em ratinhos com imunodeficiência combinada grave (SCID de Severe Combined ImmunoDeficiency) que expressam uma proteína D114 humanizada (ratinhos SCID com D114 humanizado). 0 ratinho SCID com D114 humanizado foi preparado substituindo todo o domínio extracelular do gene D114 de ratinho pela região extracelular correspondente do gene D114 humano (7 kb) em células-tronco embrionárias (CTE). Os ratinhos hD114 homozigóticos foram gerados e criados no ambiente SCID.

Cada ratinho recebeu um implante subcutâneo (s.c.) de 1 x 106 células de tumor VM-Cubl humano (células de carcinoma da bexiga) mais MATRIGEL™ (BD Biosciences, n.2 354234). Após o estabelecimento dos tumores nos ratinhos (tamanho do tumor igual a 150-200 mm3 aproximadamente 14 dias após o implante), os tumores foram medidos, aleatorizados e tratados com hFc, REGN421, cisplatina ou uma combinação de REGN421 e cisplatina. Dividiu-se um total de 45 ratinhos em nove grupos (n = 5 por coorte). 0 primeiro grupo foi tratado subcutaneamente (s.c.) com hFc a 2 mg/kg; o segundo e o terceiro grupos foram tratados s.c. com REGN421 a 0,5 e 2 mg/kg, respetivamente; o quarto e o quinto grupos foram tratados intraperitonealmente (i.p.) com cisplatina a 0,5 e 2 mg/kg, respetivamente; o sexto grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 0,5 mg/kg e i.p. com cisplatina a 0,5 mg/kg; o sétimo grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 0,5 mg/kg e i.p. com cisplatina a 2 mg/kg; o oitavo grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 2 mg/kg e i.p. com cisplatina a 0,5 mg/kg; e o nono grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 2 mg/kg e i.p. com cisplatina a 2 mg/kg. O REGN421 foi administrado de 3-4 em 3-4 dias, começando no dia 14, e os ratinhos receberam um total de três doses. A cisplatina foi administrada de 24 em 24 horas, começando no dia 14, e os ratinhos receberam um total de quatro doses.

Para avaliar os efeitos do REGN421 e da cisplatina como agentes individuais ou em tratamentos de combinação, registaram-se as alterações no tamanho dos tumores. O crescimento tumoral foi medido três dias antes do tratamento inicial com REGN421, no dia de cada tratamento com REGN421 (dias 14, 17 e 21) e, em seguida, a cada 3-4 dias até os tumores atingirem um tamanho de -600 mm3. O tamanho dos tumores in vivo foi calculado utilizando a fórmula (comprimento x largura2)/2 (Fig. 1 e Tabela 1) .

A inibição do crescimento tumoral, ICT, foi determinada calculando a diferença no tamanho do tumor para os tumores tratados (T) versus os tumores de controlo (C) no dia em que o coorte de controlo foi eutanasiado (isto é, no dia 32); ICT = [ 1 — (T final - Tinicial) / (Cfinal “ Cinicial) ] X 100. O atraso no crescimento tumoral, ACT, foi avaliado como a diferença em dias entre os tumores tratados (T) e os tumores de controlo (C) quando cada coorte atingiu um determinado tamanho de tumor especificado. O tamanho predeterminado do tumor para esta experiência foi de 600 mm3.

Os resultados mostram que o tratamento com REGN421 sozinho provocou uma redução de 54% do crescimento tumoral. O tratamento com cisplatina sozinha resultou num crescimento tumoral reduzido (redução de 61% para a dose de 0,5 mg/kg/injeção e redução de 54% para a dose de 2 mg/kg/injeção) . Os tratamentos de combinação originaram reduções mais elevadas do crescimento tumoral do que o tratamento com qualquer um dos agentes individuais (redução de 104% para 0,5 mg/kg/injeção de cisplatina mais 2 mg/kg/injeção de REGN421; e redução de 58% para 2 mg/kg/injeção de cisplatina mais 2 mg/kg/injeção de REGN421).

Estes resultados mostraram que o tratamento dos tumores com uma combinação de bloqueador do D114 e cisplatina, a 2 mg/kg/injeção de bloqueador do D114 e 0,5 mg/kg/injeção de cisplatina, pode resultar em maior inibição do crescimento tumoral do que com qualquer um dos agentes individuais.

Exemplo 2: Efeito do anticorpo anti-hD114 em combinação com cisplatina O efeito do REGN421 em combinação com cisplatina no crescimento tumoral foi avaliado em tumores implantados em ratinhos SCID com D114 humanizado, como descrito acima. Cada ratinho recebeu um implante subcutâneo (s.c.) de 5 χ 105 células de tumor A549 humano (cancro do pulmão de não-pequenas células ou "CPNPC"). Após o estabelecimento dos tumores nos ratinhos (tamanho do tumor igual a 100-150 mm3 aproximadamente 29 dias após o implante), os tumores foram medidos, aleatorizados e tratados com hFc, REGN421, cisplatina ou uma combinação de REGN421 e cisplatina. Dividiu-se um total de 36 ratinhos em 6 grupos (n = 6 por coorte). O primeiro grupo foi tratado s.c. com hFc a 2 mg/kg; o segundo grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 2 mg/kg; o terceiro e o quarto grupos foram tratados i.p. com cisplatina a 2,5 e 4,5 mg/kg, respetivamente; o quinto grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 2 mg/kg e i.p. com cisplatina a 2,5 mg/kg; e o sexto grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 2 mg/kg e i.p. com cisplatina a 4,5 mg/kg. O REGN421 foi administrado de 3-4 em 3-4 dias, começando no dia 29, e os ratinhos receberam um total de três doses. A cisplatina foi administrada de 24 em 24 horas, começando no dia 29, e os ratinhos receberam um total de duas doses.

Para avaliar os efeitos do REGN421 e da cisplatina como agentes individuais ou em combinação, mediu-se o tamanho dos tumores (volume), começando três dias antes do tratamento inicial com REGN421, depois no dia de cada tratamento com um agente (dias 29, 30, 33 e 36) e, em seguida, a cada 3-4 dias até os tumores atingirem um tamanho de -600 mm3. O tamanho dos tumores in vivo foi calculado utilizando a fórmula (comprimento x largura2)/2. Os efeitos no crescimento tumoral estão indicados na Figura 2 e na Tabela 2.

Os resultados mostram que o tratamento com REGN421 sozinho provocou uma redução de 54% do crescimento tumoral. 0 tratamento com cisplatina sozinha resultou num crescimento tumoral reduzido (redução de 35% para a dose de 2,5 mg/kg/in jeção e redução de 22% para a dose de 4,5 mg/kg/injeção) . Os tratamentos de combinação originaram reduções mais elevadas do crescimento tumoral do que o tratamento com qualquer um dos agentes individuais (redução de 69% para 2,5 mg/kg/injeção de cisplatina mais 2 mg/kg/injeção de REGN421; e redução de 80% para 4,5 mg/kg/in jeção de cisplatina mais 2 mg/kg/injeção de REGN421). Os tratamentos de combinação atrasaram significativamente o crescimento tumoral (21 dias para 2,5 mg/kg/injeção de cisplatina mais 2 mg/kg/injeção de REGN421 e 26 dias para 4,5 mg/kg/injeção de cisplatina mais 2 mg/kg/injeção de REGN421), em comparação com o controlo e com qualquer um dos agentes individuais (p<0,01) .

Estes resultados mostram que o tratamento dos tumores com uma combinação de bloqueador do D114 e cisplatina, a 2 mg/kg/injeção de bloqueador do D114 e 2,5-4,5 mg/kg/injeção de cisplatina, pode resultar em maior inibição do crescimento tumoral do que com qualquer um dos agentes individuais.

Exemplo 3: Efeito do anticorpo anti-hDH4 em combinação com docetaxel 0 efeito do anticorpo anti-D114 em combinação com docetaxel (TAXOTERE®) no crescimento tumoral foi avaliado em tumores implantados em ratinhos com imunodeficiência combinada grave (SCID). Cada ratinho recebeu um implante subcutâneo (s.c.) de 1 x 106 células de tumor C6 de rato (células de glioblastoma). Após o estabelecimento dos tumores (tamanho do tumor igual a ~ 100-150 mm3 aproximadamente 13 dias após o implante), os ratinhos foram tratados com hFc, docetaxel, anticorpo para D114 ou uma combinação de docetaxel mais anticorpo para D114. Como estes ratinhos expressavam D114 de ratinho, o Ac D114 usado nesta experiência foi preparado internamente, com base na sequência publicada (publicação do pedido de patente internacional WO 2007/143689), e designado por REGN 577. O anticorpo REGN 577 liga-se ao D114 humano e de ratinho, mas não se liga de forma detetável ao JAG1 e ao Dill humanos. Um total de 30 ratinhos macho portadores de tumor foram aleatorizados em seis grupos (N=5). O primeiro grupo foi tratado subcutaneamente com hFc (a 25 mg/kg) e intravenosamente (i.v.) com veiculo; o segundo grupo foi tratado s.c. com REGN577 a 5 mg/kg; o terceiro grupo foi tratado i.v. com docetaxel a 4,5 mg/kg; o quarto grupo foi tratado i.v. com docetaxel a 6 mg/kg; o quinto grupo foi tratado i.v. com docetaxel a 4,5 mg/kg e s.c. com REGN577 a 5 mg/kg; e o sexto grupo foi tratado i.v. com docetaxel a 6 mg/kg e s.c. com REGN577 a 5 mg/kg. O docetaxel e/ou o anticorpo para D114 foram administrados no mesmo dia. Os animais foram tratados 2 vezes por semana e receberam um total de 3 doses. Começando no dia do tratamento inicial, registou-se o peso corporal e mediram-se os tumores duas vezes por semana até os ratinhos serem eutanasiados quando os tumores atingiram o tamanho de -600 mm3. O tamanho dos tumores foi calculado utilizando a fórmula (comprimento x largura2)/2.

Os tumores de controlo atingiram o tamanho de -600 mm3 e foram colhidos no dia 25. No dia 25, os resultados mostram que o tratamento com o anticorpo para D114 sozinho originou uma redução modesta do crescimento tumoral (de cerca de 44%) . O tratamento com docetaxel sozinho resultou num crescimento reduzido do tumor (redução de 62% para a dose de 4,5 mg/kg e redução de 70% para a dose de 6 mg/kg) . Os tratamentos de combinação produziram reduções maiores do crescimento tumoral (redução de 75% para 4,5 mg/kg de docetaxel mais Ac D114 e redução de 81% para 6 mg/kg de docetaxel mais Ac D114) do que o tratamento de controlo e o tratamento com qualquer um dos agentes individuais. Determinou-se a ICT e o ACT (Tabela 3).

Estes resultados mostram que o tratamento dos tumores com uma combinação de bloqueador do D114 e várias doses de docetaxel pode atrasar o crescimento tumoral quase para o dobro do tempo e resultar em maior inibição do crescimento tumoral do que com qualquer um dos agentes individuais.

Exemplo 4: Efeito do anticorpo anti-hD114 em combinação com docetaxel O efeito do anticorpo anti-D114 em combinação com docetaxel (TAXOTERE®' Sanofi-Aventis) no crescimento tumoral foi avaliado em tumores implantados em ratinhos com imunodeficiência combinada grave (SCID). Cada ratinho recebeu um implante "pseudo-ortotópico" (subcutaneamente na glândula mamária n.2 3) de 5 χ 106 células de tumor da mama MDA-MB-213 humano com MATRIGEL™ (BD Biosciences, lote n.2 84540). Após o estabelecimento dos tumores nos ratinhos (tamanho do tumor igual a ~ 150-200 mm3 aproximadamente 45 dias após o implante), os ratinhos foram tratados com hFc, docetaxel, anticorpo para D114 ou uma combinação de docetaxel mais anticorpo para D114. Um total de 25 ratinhos macho portadores de tumor foram aleatorizados em cinco grupos (N=5 ratinhos por grupo). O primeiro grupo foi tratado subcutaneamente com hFc (a 25 mg/kg) e intravenosamente (i.v.) com veiculo; o segundo grupo foi tratado s.c. com o anticorpo para D114 REGN577 a 5 mg/kg; o terceiro grupo foi tratado i.v. com docetaxel a 4,5 mg/kg; o guarto grupo foi tratado i.v. com docetaxel a 6 mg/kg; e o guinto grupo foi tratado i.v. com docetaxel a 6 mg/kg e s.c. com REGN577 a 5 mg/kg. 0 docetaxel e/ou o anticorpo para D114 foram administrados no mesmo dia. Os animais foram tratados 2 vezes por semana e receberam um total de 3 doses. Começando no dia do tratamento inicial, registou-se o peso corporal e mediram-se os tumores duas vezes por semana até os ratinhos serem eutanasiados. Os ratinhos foram eutanasiados guando os tumores atingiram o tamanho de -600 mm3. O tamanho dos tumores foi calculado utilizando a fórmula (comprimento x largura2)/2.

Os tumores de controlo atingiram -600 mm3 e foram colhidos no dia 63. No dia 63, os resultados mostram gue o tratamento com docetaxel sozinho originou uma redução modesta do crescimento tumoral (redução de 37% para a dose de 4,5 mg/kg e redução de 52% para a dose de 6 mg/kg). O tratamento com o anticorpo para D114 sozinho produziu uma redução significativa do crescimento tumoral (redução de aproximadamente 85%). Entretanto, o tratamento de combinação resultou em regressão do tumor (redução de 105% para 6 mg/kg de docetaxel mais Ac D114). Determinou-se a ICT e o ACT (Tabela 4).

O tratamento com docetaxel sozinho resultou num atraso minimo do crescimento tumoral (4 dias para a dose de 4,5 mg/kg e 4 dias para a dose de 6 mg/kg) . Os tumores tratados com o anticorpo para D114 sozinho atrasaram o crescimento tumoral em 21 dias. Os tratamentos de combinação atrasaram adicionalmente o crescimento tumoral em comparação com o controlo e o tratamento com qualquer um dos agentes individuais (28 dias para 6 mg/kg de docetaxel mais Ac D114; p<0,5).

Estes resultados mostram que os tumores MDA-MB-213 são modestamente suscetíveis ao tratamento com docetaxel sozinho, mas são muito sensíveis ao tratamento com o anticorpo anti-D114. A combinação de bloqueador do D114 e docetaxel pode atrasar adicionalmente o crescimento tumoral e melhorar ligeiramente a inibição do crescimento tumoral (regressão tumoral) em comparação com qualquer um dos agentes individuais.

Exemplo 5: Efeito do anticorpo anti-hD114 em combinação com 5—FU 0 efeito do anticorpo anti-D114 (REGN421) em combinação com 5-FU no crescimento tumoral foi avaliado em tumores implantados em ratinhos SCID com D114 humanizado. Cada ratinho recebeu um implante subcutâneo (s.c.) de 5 χ 106 células de tumor HCT166 humano (CCR). Após o estabelecimento dos tumores nos ratinhos (tamanho do tumor igual a -150 mm3 22 dias após o implante), os tumores foram medidos e aleatorizados. Os ratinhos foram depois tratados com hFc, REGN421, 5-FU ou uma combinação de REGN421 e 5-FU. Dividiu-se um total de 30 ratinhos em 6 grupos (n = 5 por coorte). O primeiro grupo foi tratado s.c. com hFc a 2 mg/kg; o segundo grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 2 mg/kg; o terceiro e o quarto grupos foram tratados i.p. com 5-FU a 15 e 25 mg/kg, respetivamente; o quinto grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 2 mg/kg e i.p. com 5-FU a 15 mg/kg; e o sexto grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 2 mg/kg e i.p. com 5-FU a 25 mg/kg. O REGN421 foi administrado de 3-4 em 3-4 dias, começando no dia 22, e os ratinhos receberam um total de três doses. O 5-FU foi administrado de 3-4 em 3-4 dias, começando no dia 22, e os ratinhos receberam um total de três doses.

Para avaliar os efeitos do REGN421 e do 5-FU como agentes individuais ou em combinação, mediram-se as alterações no tamanho dos tumores (volume), começando três dias antes do tratamento inicial com REGN421, depois no dia de cada tratamento com um agente (dias 22, 26, 29) e, em seguida, a cada 3-4 dias até os tumores atingirem um tamanho de -600 mm3. O tamanho dos tumores in vivo foi calculado utilizando a fórmula (comprimento x largura2)/2 (Fig. 3 e Tabela 5) .

0 tratamento com 5-FU sozinho resultou num atraso mínimo do crescimento tumoral (4 dias para a dose total de 45 mg/kg e 2 dias para a dose total de 75 mg/kg). Os tumores tratados com o anticorpo para D114 sozinho atrasaram o crescimento tumoral em 6 dias. Os tratamentos de combinação atrasaram adicionalmente o crescimento tumoral em comparação com o controlo (p<0,043).

Exemplo 6: Efeito do anticorpo anti-hD114 em combinação com irinotecano 0 efeito do anticorpo anti-D114 (REGN421) em combinação com irinotecano (cloridrato de irinotecano) no crescimento tumoral foi avaliado em tumores implantados em ratinhos SCID com D114 humanizado.

Cada ratinho recebeu um implante subcutâneo (s.c.) de 5 x 106 células de tumor HCT166 humano. Após o estabelecimento dos tumores nos ratinhos (tamanho do tumor igual a -150 mm3 15 dias após o implante), os tumores foram medidos e aleatorizados. Os ratinhos foram depois tratados com hFc, REGN421, irinotecano ou uma combinação de REGN421 e irinotecano. Dividiu-se um total de 30 ratinhos em 6 grupos (n = 5 por coorte). O primeiro grupo foi tratado s.c. com hFc a 2 mg/kg; o segundo grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 2 mg/kg; o terceiro e o quarto grupos foram tratados i.p. com irinotecano a 7,5 e 25 mg/kg, respetivamente; o quinto grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 2 mg/kg e i.p. com irinotecano a 7,5 mg/kg; e o sexto grupo foi tratado s.c. com REGN421 a 2 mg/kg e i.p. com irinotecano a 25 mg/kg. O REGN421 foi administrado de 3-4 em 3-4 dias, começando no dia 15, e os ratinhos receberam um total de três doses. 0 irinotecano foi administrado de 3-4 em 3-4 dias, começando no dia 15, e os ratinhos receberam um total de três doses.

Para avaliar os efeitos do REGN421 e do irinotecano como agentes individuais ou em tratamentos de combinação, mediram-se as alterações no tamanho dos tumores (volume) , começando três dias antes do tratamento inicial com REGN421, depois no dia de cada tratamento com um agente (dias 15, 19, 22) e, em seguida, a cada 3-4 dias até os tumores atingirem um tamanho de -600 mm3. O tamanho dos tumores in vivo foi calculado utilizando a fórmula (comprimento x largura2)/2. Os resultados estão apresentados na Fig. 4 e na Tabela 6.

O tratamento com irinotecano sozinho resultou num atraso do crescimento tumoral (8 dias para a dose total de 22,5 mg/kg e 16 dias para a dose total de 75 mg/kg). Os tumores tratados com o anticorpo para D114 sozinho atrasaram o crescimento tumoral em 9 dias. Os tratamentos de combinação melhoraram significativamente a eficácia antitumoral e atrasaram adicionalmente o crescimento tumoral, em comparação com o tratamento com qualquer um dos agentes individuais (19 dias para 75 mg/kg de irinotecano mais Ac DII4; p<0,0001).

Exemplo 7: Efeito do anticorpo anti-hD114 na expressão do gene Heyl no tumor Colo205 O efeito do anticorpo anti-hD114 na expressão génica diferencial em tumores foi estudado em ratinhos SCID com D114 humanizado contendo um implante de células de tumor colorretal

Colo205 humano. Resumidamente, ratinhos SCID machos e fêmeas com D114 humanizado receberam um implante subcutâneo de 2 x 106 células de Colo205 por ratinho. Quando os tumores atingiram -150 mm3, os ratinhos (4 animais por grupo) foram tratados com uma dose única de REGN421 a 0,5; 5 ou 15 mg/kg, ou uma dose única de hFc de controlo a 15 mg/kg. Os tumores foram excisados às 5 h, 10 h, 24 h, 72 h e 7 dias após o tratamento e armazenados em reagente de estabilização para ARN (Qiagen). O ARN do tumor foi purificado utilizando o kit RNEASY® Midi (Qiagen). O tecido foi homogeneizado em tampão de lise contendo β-mercaptoetanol num moinho misturador, introduzido nas colunas e os contaminantes não ligados foram arrastados. A digestão com ADNase I foi efetuada na coluna e o ARN foi eluido em água isenta de ARNases. Utilizando o kit QUICK AMP™ RNA Amplification (Agilent Technologies), incorporou-se cianina 3 (Cy3) -CTP no ARNc amplificado a partir de 500 ng de ARN total. O ARNc marcado com Cy3 de cada amostra foi depois hibridado com um array personalizado abrangendo tanto o transcritoma de ratinho como o transcritoma humano. A hibridação e a lavagem dos arrays foram efetuadas de acordo com o protocolo do fabricante e os arrays foram lidos num leitor Microarray da Agilent. Os dados foram extraídos das imagens dos arrays utilizando o software Feature Extraction 9.5 da Agilent.

Para identificar os genes diferencialmente expressos entre os grupos de controlo e de tratamento, aplica-se a centralização da mediana por chip ao perfil genómico completo de cada amostra. Os valores da expressão génica são depois comparados entre os dois grupos usando um teste t para um modelo de variâncias aleatórias (Simon, R.A. et ai., 2007, "Analysis of Gene Expression Data Using BRB-Array Tools", Cancer Inform 3:11-7). Aqueles genes com uma diferença média superior a 1,5 vezes e urn valor p<0,05 entre os dois grupos são selecionados e ordenados por ordem decrescente de variação em número de vezes. Efetua-se também um teste global em que os marcadores das amostras individuais são permutados até 1000 vezes e o processo de seleção de genes é repetido. Isto determina se o número de genes identificados como diferencialmente expressos entre os dois grupos é maior do que seria de esperar devido apenas ao acaso. 0 gene Heyl é um membro da família Hey que engloba alvos diretos a jusante da ativação Notch, tendo sido demonstrado que a inibição da via de sinalização D114-Notch em tumores in vivo, em estudos com ratinhos, resulta na redução dos níveis de ARN de Hey-1 (Noguera-Troise, I et al. , 2006, Nature 444(7122) :1032-7) . Como ilustrado na Fig. 5, a análise dos níveis de ARNm de Heyl no presente estudo, usando microarrays, revelou que os níveis de ARNm de Heyl diminuíram nos ratinhos tratados com REGN421 em comparação com os ratinhos tratados com hFc de controlo com início às 10 horas pós-tratamento, mas sofreram a diminuição mais significativa às 72 horas e aos 7 dias pós-tratamento. Não se observou nenhuma diminuição significativa a 0,5 mg/kg, isto é, a dose mais baixa de REGN421. Estes resultados indicaram que o REGN421 bloqueou de forma eficaz a via de sinalização Notch e que o gene Heyl poderia constituir um marcador farmacodinâmico útil para a inibição da sinalização Notch por um anticorpo para D114.

Exemplo 8: Estudo farmacocinético preliminar de fase I

O REGN421 está a ser presentemente estudado num ensaio de primeira administração humana. O objetivo primário do estudo consiste em determinar a dose recomendada de REGN421 para ensaios de eficácia futuros. Os objetivos secundários consistem em caracterizar o perfil de segurança do fármaco e a sua farmacocinética, imunogenicidade e farmacodinâmica, assim como os dados preliminares de eficácia. Neste estudo, o anticorpo anti-hD114 REGN421 é administrado intravenosamente, de 3 em 3 semanas, a doentes cujo cancro progrediu na terapia convencional. A conceção do estudo segue a metodologia convencional quanto ao escalonamento de dose e a definição de toxicidade dose-limitante. Até agora, 7 doentes foram tratados com 0,25 mg/kg/dose de três em três semanas e 6 doentes foram tratados com 0,50 mg/kg/dose de três em três semanas. Para o estudo farmacocinético, colheram-se amostras de sangue pré-dose, na hora 0 e pós-dose às 1, 2, 4 e 8 horas no dia 1, seguido dos dias 2, 3, 4, 8 e 15 do Ciclo 1; e pré-dose, na hora 0 do dia 1 dos Ciclos >2 e no acompanhamento pós-tratamento nos dias 15, 30 e 60. Os níveis plasmáticos/séricos de REGN421 nas amostras são medidos por ELISA com um limite superior de quantificação de 2,5 pg/ml e um limite inferior de quantificação de 0,039 pg/ml na amostra sérica não diluída. O estudo está em curso com o objetivo de administrar doses mais elevadas, definidas no protocolo como 1, 2, 4 e 7 mg/kg/dose.

Os dados presentemente disponíveis que ilustram os parâmetros farmacocinéticos plasmáticos após uma única infusão i.v. de 30 minutos de REGN421, a 0,25 mg/kg (7 doentes) e 0,5 mg/kg (2 doentes), estão apresentados na Tabela 7. Cmax: concentração sérica máxima do fármaco; Túit: tempo para a última concentração quant if icável do fármaco; Cúit: última concentração quant if icável do fármaco; ASCúit: área sob a curva até à última concentração do fármaco; ASC: área total sob a curva (isto é, exposição ao fármaco); ti/2z: semivida terminal; Vee : volume da distribuição no estado estacionário; CL: taxa de clearance do fármaco. Os valores são: média, (%CV) e [intervalo] (a: mediana [intervalo]) .

Como apresentado na Tabela 7, as concentrações séricas máximas de REGN421 foram valores médios de 6,27 pg/ml ao nível de dose de 0,25 mg/kg e 9,88 pg/ml ao nível de dose de 0,50 mg/kg. Estes valores estão dentro do intervalo de concentrações de REGN421 associadas a uma atividade antitumoral em modelos animais de xenoenxerto. O efeito farmacodinâmico do REGN421 na via de sinalização D114-Notch foi analisado utilizando a tecnologia de microarrays nas amostras séricas dos doentes colhidas antes da administração de REGN421, bem como 24 horas após a sua administração. Os resultados estão apresentados na Tabela 8.

Como ilustrado na Tabela 8, a expressão do gene Hey-1 após a administração de REGN421 foi reduzida em comparação com as amostras pré-tratamento, em todas as amostras. Conforme observado no modelo de xenoenxerto de tumor em ratinhos SCID com D114 humanizado (ver o Exemplo 7 acima), os resultados sugerem que o REGN421 está efetivamente a inibir a atividade biológica do D114 nos seres humanos.

Exemplo 9: Ac D114 em combinação com gemcitabina a doentes de fase I 0 estudo será efetuado em doentes adultos com cancro avançado ou metastático que é refratário à terapia convencional ou não tem opções de tratamento aprovadas. Os doentes diagnosticados com malignidades sólidas avançadas de acordo com o exame patológico, fisico e radiológico, com um indice de desempenho ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) de 0-2 (escala de 0-5) e parâmetros laboratoriais renais, hepáticos e hematológicos adequados, são elegíveis para participarem no estudo. Os doentes podem receber cuidados médicos concomitantes de apoio, como transfusões de sangue e analgésicos, durante o estudo. Os doentes poderão ter recebido quimioterapia ou terapêutica biológica prévia para a doença metastática. Os doentes são atribuídos a coortes sequenciais numa conceção 3+3. Três doentes serão registados num nível de dose e, se não se verificarem toxicidades dose-limitantes (TDL), ocorrerá um escalonamento de dose para o nível de dose seguinte. Se 1 dos primeiros 3 doentes experimentar uma TDL, então três doentes adicionais poderão ser registados nesse nível de dose. Se 2 dos primeiros 3 doentes experimentarem uma TDL, então considerar-se-á que esse nível de dose apresenta uma toxicidade excessiva e 3 doentes adicionais serão registados no nível de dose prévio. Os doentes receberão no Dia 1: anticorpo anti-D114 (por exemplo, REGN421 ou REGN281) a 0,25 a 10 mg/kg i.v. ao longo de 30 minutos mais gemcitabina 1250 mg/m2 em infusão i.v. ao longo de 30 minutos e Dia 8: gemcitabina 1250 mg/m2 em infusão i.v. ao longo de 30 minutos. O regime de combinação é repetido de 3 em 3 semanas até ocorrer uma progressão do cancro ou se desenvolver uma toxicidade intolerável. O parâmetro de avaliação primário consiste em avaliar a segurança, a tolerabilidade e as toxicidades dose-limitantes do anticorpo anti-D114 em combinação com gemcitabina e identificar a dose máxima tolerada (DMT) do anticorpo anti-D114 em combinação com gemcitabina em doentes com malignidades sólidas avançadas. Os parâmetros de avaliação secundários incluem uma descrição da atividade antitumoral de acordo com os critérios RECIST (por Eisenhauer et ai., 2009, Eur J Cancer 4 5:228-247), a avaliação do perfil farmacocinético do anticorpo anti-D114 quando administrado em combinação com gemcitabina e a determinação da imunogenicidade para o anticorpo anti-D114. A remissão da doença é avaliada usando o exame físico e métodos radiológicos (raios X, tomografia computadorizada ou ressonância magnética). Os eventos adversos são avaliados utilizando os critérios de terminologia comum para eventos adversos do Instituto Nacional do Cancro (CTCAE versão 4.0, disponível sob Cancer Therapy Evaluation Program (programa de avaliação da terapêutica do cancro), ou CTEP, no sítio da web do Instituto Nacional do Cancro). Recolhem-se amostras de soro dos doentes para medir as concentrações do anticorpo anti-D114, assim como a presença de possíveis anticorpos contra o anticorpo anti-D114.

Exemplo 10: Administração de Ac D114 e FOLFOX a doentes com CCR

Resumidamente, os doentes adultos que são diagnosticados com cancro colorretal localmente avançado ou metastático de acordo com o exame patológico, físico e radiológico, com um Índice de desempenho ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) de 0-2 (escala de 0-5) e parâmetros laboratoriais renais, hepáticos e hematológicos adequados, são elegíveis para participarem no estudo. Os doentes podem receber cuidados médicos concomitantes de apoio, como transfusões de sangue e analgésicos, durante o estudo. Os doentes não poderão ter recebido quimioterapia (ou terapêutica antiangiogénica ou anti-EGFR) prévia para a doença metastática. Uma terapêutica prévia para o tratamento adjuvante da respetiva doença é permitida e necessita ter sido concluída pelo menos 12 meses antes da participação neste estudo. Os doentes são distribuídos aleatoriamente, numa relação de 1:1, para receberam quimioterapia FOLFOX intravenosa (Dia 1: oxaliplatina 85 mg/m2 em infusão i.v. e leucovorina (ácido folínico) 200 mg/m2 em infusão i.v., seguidos de 5-FU 400 mg/m2 em bolus i.v. administrado ao longo de 2-4 minutos, seguido de 5-FU 600 mg/m2 i.v. como uma infusão contínua ao longo de 22 horas. Dia 2: leucovorina 200 mg/m2 em infusão i.v., seguida de 5-FU 400 mg/m2 em bolus i.v. administrado ao longo de 2-4 minutos, seguido de 5-FU 600 mg/m2 i.v. como uma infusão contínua ao longo de 22 horas) com bevacizumab (AVASTIN®: Ac monoclonal humanizado contra o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), Genentech) (Dia 1: 10 mg/kg i.v.) de 2 em 2 semanas, ou com um anticorpo anti-D114 (REGN421) a 0,25 a 10 mg/kg i.v. no dia 1, em combinação com o tratamento previamente mencionado. O tratamento é repetido de 2 em 2 semanas até ocorrer uma progressão do cancro ou se desenvolver uma toxicidade intolerável. O parâmetro de avaliação primário é a proporção de doentes que conseguiu pelo menos uma remissão parcial (uma diminuição de 30% ou mais na soma dos diâmetros de lesões cancerosas identificadas) de acordo com os critérios RECIST (por Eisenhauer et al., 2009, acima), e os parâmetros de avaliação secundários incluem o tempo para a progressão do tumor e a sobrevivência global. A remissão da doença é avaliada usando o exame físico, métodos radiológicos (raios X, tomografia computadorizada ou ressonância magnética) e o nível do antigénio carcinoembrionário (CEA) medido no soro. Outros parâmetros clínicos, como os eventos adversos, também são avaliados, utilizando os critérios de terminologia comum para eventos adversos do Instituto Nacional do Cancro (CTCAE versão 4.0, acima) . Recolhem-se amostras de soro dos doentes para medir as concentrações séricas do anticorpo anti-D114, assim como a presença de possíveis anticorpos contra o anticorpo antÍ-D114.

Exemplo 11: Fase II de Ac D114 em combinação com docetaxel O estudo será efetuado em doentes adultos com cancro da mama avançado inoperável ou metastático. Os doentes poderão ter tido uma terapêutica adjuvante prévia fracassada. Os doentes diagnosticados com cancro da mama de acordo com o exame patológico, físico e radiológico, com um índice de desempenho ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) de 0-2 (escala de 0-5) e parâmetros laboratoriais renais, hepáticos e hematológicos adequados, são elegíveis para participarem no estudo. Os doentes podem receber cuidados médicos concomitantes de apoio, como transfusões de sangue e analgésicos, durante o estudo. Os doentes não poderão ter recebido quimioterapia ou terapêutica biológica prévia para a doença metastática. Um coorte sequencial de até 100 doentes será tratado após passar com êxito os procedimentos de seleção para determinar a elegibilidade dos doentes. Os doentes receberão no dia 1: anticorpo anti-D114 (REGN421) a 0,25 a 10 mg/kg i.v. ao longo de 30 minutos mais docetaxel 75 mg/m2 em infusão i.v. ao longo de 30 minutos. O regime de combinação é repetido de 3 em 3 semanas até ocorrer uma progressão do cancro ou se desenvolver uma toxicidade intolerável. O parâmetro de avaliação primário consiste em avaliar a eficácia do tratamento com base na taxa de resposta tumoral de acordo com os critérios RECIST (por Eisenhauer et ai., 2009, Eur J Cancer 4 5:228-247) e no tempo para a progressão da doença. Os parâmetros de avaliação secundários incluirão uma descrição da segurança e do perfil farmacocinético do anticorpo anti-D114 quando administrado em combinação com docetaxel, assim como a determinação da imunogenicidade para o anticorpo anti-D114. A remissão da doença é avaliada usando o exame fisico e métodos radiológicos (raios X, tomografia computadorizada ou ressonância magnética). Os eventos adversos são avaliados utilizando os critérios de terminologia comum para eventos adversos do Instituto Nacional do Cancro (CTCAE versão 4.0, disponível sob Cancer Therapy Evaluation Program (programa de avaliação da terapêutica do cancro), ou CTEP, no sítio da web do Instituto Nacional do Cancro) . Recolhem-se amostras de soro dos doentes para medir as concentrações do anticorpo anti-D114, assim como a presença de possíveis anticorpos contra o anticorpo anti-D114.

Exemplo 12: Um estudo de fase II de Ac D114 com cisplatina/gemcitabina O estudo será efetuado em doentes adultos com cancro da bexiga avançado inoperável ou metastático. Os doentes diagnosticados com cancro da bexiga invasivo de acordo com o exame patológico, físico e radiológico, com um índice de desempenho ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) de 0-2 (escala de 0-5) e parâmetros laboratoriais renais, hepáticos e hematológicos adequados, são elegíveis para participarem no estudo. Os doentes podem receber cuidados médicos concomitantes de apoio, como transfusões de sangue e analgésicos, durante o estudo. Os doentes não poderão ter recebido quimioterapia ou terapêutica biológica prévia para a doença metastática. Um coorte sequencial de até 100 doentes será tratado após passar com êxito os procedimentos de seleção para determinar a elegibilidade dos doentes. Os doentes receberão anticorpo anti-D114 (REGN421) a 0,25 a 10 mg/kg i.v. ao longo de 30 minutos no dia 1 mais gemcitabina 1.000 mg/m2 durante 30 a 60 minutos nos dias 1, 8 e 15, mais cisplatina 70 mg/m2 no dia 2. O regime de combinação é repetido de 4 em 4 semanas até ocorrer uma progressão do cancro ou se desenvolver uma toxicidade intolerável. O parâmetro de avaliação primário consiste em avaliar a eficácia do tratamento com base na taxa de resposta tumoral de acordo com os critérios RECIST (por Eisenhauer et ai., 2009, Eur J Cancer 4 5:228-247) e no tempo para a progressão da doença. Os parâmetros de avaliação secundários incluirão o perfil de segurança e uma descrição do perfil farmacocinético do anticorpo anti-D114 quando administrado em combinação com docetaxel, assim como a determinação da imunogenicidade para o anticorpo anti-D114. A remissão da doença é avaliada usando o exame fisico e métodos radiológicos (raios X, tomografia computadorizada ou ressonância magnética). Os eventos adversos são avaliados utilizando os critérios de terminologia comum para eventos adversos do Instituto Nacional do Cancro (CTCAE versão 4.0, disponível sob Cancer Therapy Evaluation Program (programa de avaliação da terapêutica do cancro), ou CTEP, no sítio da web do Instituto Nacional do Cancro). Recolhem-se amostras de soro dos doentes para medir as concentrações do anticorpo anti-D114, assim como a presença de possíveis anticorpos contra o anticorpo anti-D114.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> Método de tratamento do cancro com um antagonista de DLL4 e um agente quimioterapêutico

<130> 6043A-WO <140> A atribuir <141> Apresentado em anexo <150> 61/301,881 <151> 2010-02-05 <150> 61/220,465 <151> 2009-06-25 <160> 118 <170> FastSEQ para Windows, Versão 4.0

<210> 1 <211> 2058 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 1 atggcggcag cgtcccggag cgcctctggc tgggcgctac tqctgctggt ggcactttgg 60 cagcagcgcg cggccggctc cggcgtctit.c cagctgcagc tgcaggagtt catcaacgag 120 cgcggcgtac tggccagtgg gcggccttgc gagcccggct gccggacttt cttccgcgtc 180 tgccttaagc acttccaggc ggtcgtctcg cccggaccct gcaccttcgg gaccgtctcc 240 acgceggtat tqggcaccaa ctccttcgct gtccgggacg aeagtagcgg cggggggcgc 300 aac.ectct.ee aactgccctt caatttcacc tggccgggta ccttctcgct catcatcgaa 360 gcttggcacg cgccaggaga cgacctgcgg ccagaggcct tgccaccaga tgcactcatc 420 agcaagatcg ccatcoaggg ctccctagct gtgggtcaga actggttatt ggatgageaa 480 accagcaccc tcacaaggct gcgetactct Laccyggtca tctgcagtga caactactat 540 ggagacaact gctcccgcct gtgcaagaag cgcaatgacc acttcggcea etatgtgtgc 600 cayccagatg gcaacttgtc ctgcctgece ggttggactg gggaatattg ceaaeagcct 6S0 atctgtcttt cggqctqtca tgaacagaat ggctactqca gcaaqccaqc aqaqtqcctc 720 tyccgcccag gctggcaggg ccggctgtgt aacgaatgca tcccccacaa tggctgtcgc 780 cacggcacct gcagcactcc ctggcaatgt scttgtgatg agggctgggg aggcctgttt 840 tgtgaccaag alclcaacta cLgcacccac cactccceat gcaagaatgy ggud.acgt.gc 900 tecaacagtg ggcagcgaag ctacacctgc acctgtcycc caggctacac tggtgtggac 960 tgtgagctgg agctcagcga gtgtgacagc aacccctgt.c gcaatggagg cagct.gtaag 102 0 gaccaggagg atggctacca ctgcctgtgt cctccgggct actatggcct gcattgtgaa 1030 cacageacct tgagctgcgc cgactccccc tgcttoaaty ggggctcctg ccgggagcgc 1140 aaccaygggg ccaactatyc ttgtgaatgt ccccccaact tcaccggctc caactgcgay 1Ξ00 aagaaagtgg acaggtgcac cagcaacccc tgtgccaacg ggggacagtg cctgaaccga. 1260 ggtccaagcc geatgtgc.cg ctgccgtcct ggattcacgg gcacctactg tgaactccac 1320 gtcagcgact gtgcccgtaa cccttgcgcc cacggtggca cr.tgccatga -cetggagaat 133 0 gggctcatgt gcacctgccc tgccggcttc Lctggccgac gctgtgaygt gcggacatcc 1440 atcgatgcct gtgcctcgag tccctgcttc aacagggcca cctgctacac -cgacctctcc 1500 acagacacct ttgtgtgcaa ctgccottat. ggctttgtgg gcagccgctg cgagttcccc 1560 gtgggcttgc cgcccagctt cccctgggtg gccgtctcgc tgggtgtggg gctggcagtg 1620 ctgctggtac tgctgggcat ggtggcagtg gctgtgcggc egctgcggct tcgacggccg 1530 gacgacggca gcagggaagc catgaacaac ttgtcggact tccagaagga caacctgatt 1740 cetgcegccc agct.t.aaaaa cacaaaccag aagaaggagc tggaagtgga ctgtggcctg 1800 qacaagtcca actgtqqcaa acaqcaaaac cacacattgg actataatct qgccccaggg 1860 cccctggggc gggggaccat gccaggaaag tttccccaca. gcgacaayag cttagqagaq 1920 aaggcgccac tgcggttaca cagtgaaaag ccagagtgtc ggatatcagc gatatgetcc 1990 cccagggact ccatgtacca gtctgtgt.gt tt.gatatcag aggagaggaa t-.gaatgtgtc 204 0 aLtqccacgg aggtataa 2058

<210> 2 <211> 685 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 2

Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Val Ala Leu Trp Gin Gin Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gin Leu 20 25 30

Gin Leu Gin Glu Pile lie Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45

Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60

Phe Gin Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80

Ihr Prc Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp 3er Ser 85 90 95

Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gin Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Fro ICO 105 110

Gly Ihr Phe Ser Leu lie He Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp A.sp 115 120 125

Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu lie Ser lys lie Ala 130 135 140 lie Gin Gly Ser Leu Ala Val Gly Gin Asn Trp Teu T.eu Asp Glu 31n 145 150 155 160

Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val lie Cys Ser 165 170 175

Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn

180 185 * ISO

Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gin Pro Asp Gly Ann Leu Ser Cys 195 200 205

Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gin Gin Pro lie Cys Leu Ser 210 215 220

Gly Cys His Glu Gin Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ara Glu Cys Leu 225 230 235 240

Cys Arg Pro Gly Irp Gin Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys lie Pro His 245 250 255

Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gin Cys Thr Cys 260 265 270

Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gin Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285

Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly A_a Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300

Gin Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320

Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335

Gly Ser Cys Lys Asp Gin Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 3_y Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365

Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gin Gly Ala 370 375 380

Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Prc Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400

Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn sly Gly Sin 'JO 5 410 415

Cys Leu Asn Arg Gly Pro Set Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 433

Thr Gly Thr Tyr Cys Glu leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445

Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp leu Glu Asn Gly leu Met Cys 453 455 4 SO

Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 4 ~ 0 475 480 lie Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495

Thr Asp leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys A.sn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510

Val Gly Ger Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro 515 520 5 Ξ 5

Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly leu Ala Val Leu Leu Val Leu 533 535 540

Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gin Leu Arg Leu Arg Arg Pro 545 550 555 560

Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn A.sn Leu Ser Asp Phe Gin Lys 565 570 575

Asp Asn Leu Tie Pro A_a Ala S_n Leu Lys Asn Thr Asn Gin Lys Lys 580 535 593

Glu Leu Glu Val .Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gin 595 600 505 G’n Asn H- s Thr Leu Asp Tyr Asn Leu A.la Pro Gly Pro Leu Gly Arg 613 615 620

Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro Hi s Ser Asp Lys Ser Leu Gly G_u 625 630 635 640

Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg lie Ser 645 650 655

Ala [le Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gin Ser Val Cys Leu lie 660 665 670

Ser Glu Glu Arg A.sn Glu Cys Val lie A.la Thr Glu Val 6 T 5 680 685

<210> 3 <211> 372 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 3 caggtgusgc tggtgcagt.c aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagaa uctctcactc 60 acctgtgcca tntscggaga cagtgtct.ct agtgatagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120 oagtsssuat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180 aat.gal l.at.g ragl.al nt.gt gaaaagtuga ataascttca acccagatac atccaagaac 240 cacatatccc tgsagstgaa cr.ntgtgant. nnngaggnna eggehatct.a ttactgtgca 300 agagaggggg ataattggaa tracggctgg ctcgacncct. ggggnnnggg aaccacggtc 360 accqtctcct ca 372

<210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 4

Sin val Sin Leu Val Sin Ser Gly Pro Gly Leu val Lys Pro Ser 31n 15 10 15

Asn Leu Ser Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lya Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 50

Val Ser Val Lys Ser Arg lie Thr Phe Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 SCI

His Tie Ser Leu Gin Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala He 85 30 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Asn Trp A.sn Tyr Gly Trp Leu Asp 100 105 110

Pro Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 5 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 5 ggagacagtg tctctagtga tagtgctgct 30

<210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 6

Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp Ser Ala Ala 1 5 10

<210> 7 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 7 acatactaca ggtccaagtg gtataat 27

<210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 8

Thr Tyr Tyr ftrg Ser Lys Trp Tyr Asn 1 5

<210> 9 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 9 gcaagagagg gggataattg gaattacggc tggctcgacc cc 42

<210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 10

Ala Arg Glu Gly Asp Asr. Trp Asn Tyr Sly Trp leu Asp Fro is in <210> 11 <211> 336

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 11

gacateeagt tgaccoagte tccactctcc ctgcccgtca ccectggaga gccggcetcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctt cttagtaarg gat.acaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctncacaa ctcctgatct atttggttte tagtcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcsgt ggatccggca oagattt-tac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga trttggaatt tattattgta tgcaagctrt acaaacLccg 300 tacacttttg gccgggggac caaqqtggaa atcaaa 33E

<210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 12

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Leu 5er Leu Pro Val Thr Pro 31y 15 10 15

Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser 5er Sin Ser Leu Leu Leu Ser 20 25 3Π

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Set 35 40 45

Pro Gin Leu Leu He Tyr Leu Val Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Ehe Ser Gly Ser Gly Ser G_y Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 go

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Phe Gly lie Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 55

Leu Gin Thr Fro Tyr Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu lie Ly3 inn ins no

<210> 13 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 13 cagagcctcc ttcttagtaa tggatacaac tat 33

<210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 14

Gin Ser Leu Leu Leu Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr 1 5 10

<210> 15 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 15 ttggtttct 9

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Leu Va_ Ser 1

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<210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 18

Met Gin Ala leu Gin Thr Pro Tyr Thr 1 5

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<210> 20 <211> 123 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4Ο0> 20

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser 31y Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly A.rg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Fhe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 20 30

Gly Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Phe Leu Trp Tyr A.sp Gly Thr Asn Lys Asn Tyr Vai Glu Ser va_

50 55 6C

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr S5 70 75 S0

Leu Glu Met Asn Ser Leu A.rg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 8 5 30 9 5

Ala Arg A.sp His Anp Phe Arq Ser Gly Tyr Glu Gly Trp Phe Asp Pro .00 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 21 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 21 ggattcacct tcagtagtta tggc 24

<210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 22

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5

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<210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 24

Leu Tip Tyr Asp Gly Thr Asm Lys 1 5

<210> 25 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 25 gcgagagatc acgattttag gagtggttat gaggggtggt tcgacccc 48

<210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 26

Ala Arg Asp His Asp Phe Arg Ser Gly Tyr Glu Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 15

<210> 27 <211> 321 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 27 gaaatagtga tgacacagtc tccagccd^c ctgtctttgt crccagggga aagagccacc SO ctctcctgca gggccagtua gagt-gLlagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatcsaaca gggcsactgg catcccagcc 1ÍI0 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac rtcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta crgtcaacac cgtagcaact ggcctcccac tt.tcggegga 30 0 gqqaecaagg tgqaaatcaa a 321

<210> 28 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 28

Glu lie Val Mat Thr Gin Ser Pro Ala Thr leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Ihr Leu Ser Cys Arg A_a Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Ξ0 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Glri L-ys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Aep Ala Ser Aon Arg Ala Thr Gly He Pro Ala Arg Pile Ser Gly 50 55 SO

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Pile Ala Val Tyr Tyr Cys Gin His Arg Ser Asn Trp Pro Pro 35 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr T,ys Val G' Li Tie Lys 100 105

<210> 29 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 29 cagagtgtta gcagctac 18

<210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 30

Gin Set Val Set Ser Tyr 1 5

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<210> 32 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 32 Asp Ala Ser 1

<210> 33 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 33 caacaccgta gcaactggcc tcccact 27 <210> 34 <211> 9

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 34

Gin His Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr 1 5

<210> 35 <211> 357 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 35

caggtgcagc tgcaggagtc gggcrcagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc SO

acctgcactg tctctgatgg crccateaac agtgttgaat cctactggac ctggatccgc 12U cagcacccag ggaagggcst ggagtggatt ggatacatca aatacautgg gggcatccac 180 tataacccgt ccctcaagag tcgacttgcc atatcagtgg acacgtcaaa gaaccagttc 240 tccctgaaaa tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagca 300 cqtqqaagte atacttttga tgtctqqqgc caggggacaa tgqtcacegt ctcttca 357

<210> 36 <211> 119 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 36

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Eer Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Sly Ser He Asn Ser Val 23 25 * 30

Glu Ser Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gin His Pro Giy Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr He Lys Tyr Thr Gly Gly He His Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Ala lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 30

Ser Leu Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Ala Arg Gly Ser His Thr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 37 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 37 gatggctcca tcaacagtgt tgaatcctac 30

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Asp Gly Ser lie Asn Ser Val Glu Ser Tyr 1 5 10

<210> 39 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 39 atcaaataca ctgggggcat c 21

<210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4Ο0> 40 lie Lys Tyr Thr Gly Gly lie i 5

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<210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 42

Ala Arg Ala Arg Gly Ser His Thr Phe Asp Val 1 5 10

<210> 43 <211> 324 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 43 gaaattgtgc tgastsagtc tccaggcacc ctgtcttggt ctccagggga aagagccacc 63 ctctcstgca gggseagtca gagtattagc agtaactact tagcstggta ccagcagaaa 123 cctggc^agg ctcccagact catcatttat ggtgcatcca gcagggtcac tggcatccca 10 0 gacaggttca gtggsagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccateag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcactgta ttattgtcag cagtatagta ggtca^cgat caccttcggc 333 caagggacca aagLggatat oaaa 324 <210> 44 <211> 108

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 44 61u lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Trp Ser Pro 31y 15 13 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser Asn 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 43 45

lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Val Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 SO

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Arg Ser Pro 85 93 95

Tie Thr Phe Gly Gin Gly Thr T.ys Val Asp lie Lys 100 105

<210> 45 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 45 cagagtatta gcagtaacta c 21

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Gin Ger lie Ger Ger Asn Tyr 1 5 <210> 47 <211> 9

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<210> 48 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 48

Gly Ala Ser 1

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<210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 50

Gin Gin Tyr Ser Arg Ser Fro lie Thr 1 5

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tacaacccgt ccctcaaggg tcgagtcacc atateagtgg acacgtctaa gaacceattc ZAO tccsttaaaa ttaactctgt gactqccgcg gacacggccg tgttttactg tgcgagagcr 300 tctggaagtc atacttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 52 <211> 119 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 52

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Fro Gly Leu Val Lys Fro Ser Gin 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu 7hr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Asn Ser Val Ξ0 25 30

Thr Tyr Tyr Irp Thr Trp lie Arg G_n His Pro G_y Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr lie Lys Phe Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Gly Arc Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 ao

Ser Leu Lys lie Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Phe Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Ala Ser Gly Ser Hrs Thr Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Met val Thr val Ser Ser 115

<210> 53 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4Ο0> 53 ggtggctcca tcaacagtgt tacttactac 30

<210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 54

Gly Gly Eer lie Asn Eer Val Thr Tyr Tyr r s :o

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He Lys Phe Ser Gly Ser Thr 1 5

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Ala Arg Ala Se; Gly Ser His Ih: Phe Asp lie 1 s in

<210> 59 <211> 324 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 59 gaaacgacac tcacgcagtc tccaggcecc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca ggg^cagtca gagtgttagc aacagctact tagc^tggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctct ggtgcgtcca gcagggtcac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggsca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttggaatgta ttactgtcag cagtatagta qgtcaccgat caecttcggc 300 caagggacca agctggagat caaa 324

<210> 60 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4Ο0> 60

Glu Thr Thr Leu The Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Sly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Asn Ser 20 25 30

Tyr leu Ala Trp Tyr Gin Gin lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu leu 35 40 45

lie Ser Gly Ala Ser Ser Arg Va_ Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 SO

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Slu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Gly Met Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Arg Ser Pro 35 30 35

Tie “hr Phe Gly Gin Gly Thr lys Leu Glu lie lys 100 105

<210> 61 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 61 cagagtgtta gcaacagcta c 21

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Gin Ser Val Scr Asn Ser Tyr 1 5

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Gly Ala Eer

<210> 65 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 65 cagcagtata gtaggtcacc gatcacc 27

<210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 6 6

Gin Gin Tyn Ser Arg Sen Ρϊο lie Phr 1 s

<210> 67 <211> 360 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 67 gaagtgcagc tggtgcagtc Lgggggagcc ttggtacaac ctggggggtc cctgagactc 50 tcctgtgcag cctctggatt cacctttaac aactttgcca tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gcctgçagtg qgtctcaast attagtggta gtggcgttga cacatactgc li)0 gcagactccg tgaagcgccg gttcaccatc tccagagaca atteeaagaa cacactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attastgttc gaaagatggc 300 gccttctuca gtggotacga acactactgq qqccagggaa ccarggtcac cgtctcctca 360

<210> 68 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 68

Glu Val Gin Leu Val Gin £er Gly Gly Ala Leu Val Glu Pro Gly Sly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe 20 25 30

Ala Ket Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ssr Thr lie Ser Gly Ser Gly Val Asp Thr Tyr Cys Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn. Ser Lys Asr. Thr Leu Tyr

65 70 75 SO

Leu eln Met Asn Ser Leu Arg A_a Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 30 95

Ser Lys Asp Gly Ala Phe Tyr Ser Gly Tyr G_u His Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 69 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 6 9 ggattcacct ttaacaactt tgcc 24 <210> 70 <211> 8

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 70

Giy Phe Thr Phe Asn Asn Phe Ala

C 1 „j

<210> 71 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 71 attagtggta gtggcgttga caca 24

<210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 72

He Ser sly Ser G_y Val Asp Thr 1 5

<210> 73 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 73 tcgaaagatg gcgccttcta tagtggctac gaacactac 39

<210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 74

Ser Lys Asp Gly Ala Phe Tvr Ger Gly Tyr Glu His Tyr

1 5 " ID

<210> 75 <211> 324 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 75 gaaacgacac tcaugcagrc tceaggcauc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc SO etctcctgca gggseagtca gagtgttagc agcagctact tagcetggta ccagcagaaa 12U cctggccagg cteecsggct ootcatctat ggtacatcca acagggccac tgguatccca 1BU gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaea gacttcactc tcaccatcag cagactggag 2-40 tctgaagatt ttgcagtgia ttactgtcag caqtatggta gctcacctcg gacgttcggc 3D0 caaggcjacca aggtggagat caaa 324

<210> 76 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 76

Glu rhr Thr Leu Thr Gin Ser Fro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

He Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 63

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phc Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 " 75 80

Ser Glu Asp Fhe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin 3_n Tyr Gly Ser Ser Pro 85 93 35

Arg Thr Fhe Gly Gin Gly Thr Lye Val Glu He Lys 100 105

<210> 77 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 77 cagagtgtta gcagcagcta c 21

<210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 78

Gin Ser va] Ser Ser Ser Tyr 1 5

<210> 79 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 79 ggtacatcc 9

<210> 80 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 80 Gly Ihr Ser

<210> 81 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 81 cagcagtatg gtagctcacc tcggacg 27

<210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 82

Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Arg 7hx 1 " 5

<210> 83 <211> 357 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4Ο0> 83 gaagtgcage tggtgcagtc tggacntgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 50 tcctgcaagg cttctggtta cacctttasc tactatggta tcagttggat acgacagacc 120 cctggacaag ggcttgagtg gat.gggatgg atcagcgctt acgatggtaa cacagactat 133 gcacagsagt tccaagacag aatcarcatg accacagaca caLccLcgac cacagcctac 243 atggaactga ggagcctgag atctgasgac acggccgtct attactgtgc qaqqtatagt 300 tqqaacaagc actqqttcga cccctggggc cagggaacca t.ggtcaecgt ctcttca 357

<210> 84 <211> 119 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 84

Glu Val Gin Leu Val Gin Ecr Gly Pro Glu Val Lys lys Pro Gly Ala 15 10 lb

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser G_y Tyr Thr Fhe Thr Tyr Tyr 20 25 30

Gly lie Ser Trp lie Arg Gin Thr Pro Gly Gin Gly leu Glu Trp Mat 35 40 45

Gly Trp II-a Ser Ala Tyr Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Gin Lys Fhe 50 55" 50

Glr. Asp Arg lie Thr Met. Thr Thr Asp Thr Eer Ser Thr Thr Ala Tyr €5 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp ihr Ala Val Tyr Tyr Gys 85 30 85

Ala Arg Tyr Ser “rp Asn Lys f-Us Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin G’. y 100 135 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 85 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 85 ggttacacct ttacctacta tggt 24

<210> 86 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 86

Gly Tyr Thr Fhe Thr Tyr Tyr Gly 1 5

<210> 87 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 87 atcagcgctt acgatggtaa caca 24

<210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 88

He Ser Ala Tyr Asp Gly Asn Thr 1 5

<210> 89 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 89 gcgaggtata gttggaacaa gcactggttc gacccc 36 <210> 90 <211> 12

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 90

Ale Arg Tyr Ser Trp Asn Lys His Trp Phe Asp Pro 1 5 1!)

<210> 91 <211> 324 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 91 gaaattgtga tgacacagtc tccaggcacc ctgtutttgt ctccagggga cagagccacc 63 ctctcctçca gggccagLca gagtgLtaoc ggcagctact tagcctggta ccagcagaaa 123 cctggcoagg ctcccagact cctcatctat ggtgnatcca acagggncac tggcatccca 183 gacaggttca ctggcagtgg gtctgggaca gacttoacrc tcaccatcag cagaetggag 243 cctgaagatt ttgcagtgta tttctgtcaa cagtctgctt tctcaccgtg gacgttcggc 333 caqgggacea aqqtqqaaat caaa 324

<210> 92 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 92

Glu lie Val Met Thr Gin Set Pro Gly "hr Leu Ser Leu Ser Pro Giy 1 5 10 15

Asp Arg A^a Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Thr Gly Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Prc Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Thr 53 55 60

Gly Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe Thr ^eu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 TO 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Ala Phe Ser Pro 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gin G_y Thr Lys Val Glu lie Lys 100 135

<210> 93 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 93 cagagtgtta ccggcagcta c 21

<210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 94

Gin Ser Val Thr 3_y Ser Tvi 1 5

<210> 95 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 95 ggtgcatcc 9

<210> 96 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4Ο0> 9 6

Sly Ala Ser

I

<210> 97 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 97 caacagtctg ctttctcacc gtggacg 27

<210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 98

Gin Gin Ser Ala Phe Ser Pro Trp Thr 1 5

<210> 99 <211> 363 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 99 cnggtgr.agc tgcaggagto gggcccagga ctggtgaagc cttcacagao cctgtteetc 60 acctgcactg tctctggtgg crccatcagc agtgqtçqtt actactggag ttggatccgc 120 cagcacccag ggaagggtct qgagtggatt qggtaaatcc attatagtgg gaacacocac ISO tacaatccga ccctcaagag tcgaattasc atateagtag acaegtctaa gaaccagttc 240 tcccttgagg tgaactctgt gactgccgcg gacacggccg tatactactg tgcgaggaat 300 at.ggttsggg gagttcactg gttcgacccc tggggocagg gaaccaoggt caccgtotcc 3G0 tea 3 S 3 <210> 100 <211> 121

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 100

Gin Val Gin Leu Sin Glu Ser Gly Frc Gly Leu Val Lys Fro Ser Gin 1 5 10 15

Thr Leu. Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Ser Ser Gly 20 25 30

Gly Tyr Tyr irp Ser Trp lie Arg G_n His Fro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp lie Gly Tyr lie His Tyr Ser Gly Asu Thr His Tyr Asn Pro Thr 50 55 60

Leu Lys Ser Srg lie Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lya Ann Gin Phe

65 70 75 SO

Ser Leu Glu Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 35 90 95

Cys Ala Arg Asn Met Val Arg Gly Val His Trp Phe .Asp Pro Trp Gly 100 105 HO

Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 101 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 101 ggtggctcca tcagcagtgg tggttactac 30

<210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 102

Gly Gly Ser lie Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr 15 10 <210> 103 <211> 21

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 103 atccattata gtgggaacac c 21

<210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 104 lie His Tyr Ser Gly Asr Thr 1 5

<210> 105 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 105 gcgaggaata tggttcgggg agttcactgg ttcgacccc 39

<210> 106 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 106

Ala Arg Asn Met Val Arg Sly Val liis Tip Phe Asp Pro 15 10

<210> 107 <211> 324 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 107 gaaatagtgt tgaeaoagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga gagagccacc GO crcttctgtt gggecagtcg gagtgttagc agcagctact tagcetggta ccagcagaaa 123 cctggccagg ctcccaggct cctcatctct ggtgcatoca gcagggccac tggcatccca 1B□ gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaeuc tcaccatcag cagaetggag 240 cctgaagatt ttgaagtata tttctgtcaa cagtatagra gttcaccgct cactttcggc 300 ggagggacca agctgqagat caaa 3Ξ4

<210> 108 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 108

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Sly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Phe Cys Trp Ala Ser Arg Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

lie Ser Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 SO

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 55 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ssr Ser Ser Pro 35 30 35

Leu Thr Phe G'i y G1 y G' y Thr Lys Leu Glu lie Lys 10 0 10 h

<210> 109 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 109 cggagtgtta gcagcagcta c 21

<210> 110 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 110

Arg Ser Val Ser Ser 2er Tyr 1 5

<210> 111 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <400> 111 ggtgcatcc 9

<210> 112 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 112 G_y Ala Eer

<210> 113 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 Ο 0> 113 caacagtata gtagttcacc gctcact 27

<210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 114

Gin Gin Tyr Ser Ser Ser Pro Leu Thr 1 5

<210> 115 <211> 369 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 115 caggtgcagc t.ggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc SO tcctgtgcag cqtctqqatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtgtcattt t.tatggtatg atggaactaa taaaaactat 180 gtagagtccg tgaagggcog artcaccatc tcaagagaca attccaagaa tatgutgtat 240 ctggaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attaetgtgc gagagstcac 300 gattttagga gtggttatga ggggtggttc gacccetggg gccagggaac cctggtca.cc 3S0 qtctcctca 369

<210> 116 <211> 123 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 Ο 0> 116 31η Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Fhe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Giu Trp val 35 40 45

Ser Phe Leu Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Asn Tyr Val Glu Ser Va! 50 55 50

Lys Gly .Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asr_ Met Leu Tyr 55 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Giu Asp Ihr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp His Asp Phe Arg Ser Gly Tyr Glu Gly Trp Phe Asp Pro 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 117 <211> 321 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 0 0> 117 gaaatagtgt tgacacagts tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtsa gagtgttagc agctaottag cctggtacca acagaaacct. 120 ggccaggctc ccaggctect catctatgat gcatssaaca gggccactgg catsccagcc 130 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacacac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta crgtcaacac cgtageaact ggcctcccac tttcggcgga 300 qqqaccaagg LggaaaLcaa a 321

<210> 118 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sintético <4 Ο 0> 118

Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Aid Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 23 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Açp Aid Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Fro Ale Arg File Ser Gly 50 55 SO

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 30

Glu Acp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin His Arg Ser Asn Trp Pro Pro 35 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile lys 130 105

Lisboa, 2015-12-15

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo humano isolado ou seu fragmento de ligação ao antigénio que se liga especificamente ao ligando de tipo delta 4 humano (hD114), para utilização no tratamento de um cancro ou na redução ou paragem do crescimento de um tumor num indivíduo por administração em combinação com um agente quimioterapêutico, em que o anticorpo humano ou seu fragmento de ligação ao antigénio compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO:22, 24 e 26, respetivamente, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 30, 32 e 34, respetivamente, o agente quimioterapêutico é um agente quimioterapêutico à base de platina ou um análogo de pirimidinas, e o cancro ou o tumor é uma malignidade sólida.
2. 2. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antigénio para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma sequência de HCVR de SEQ ID NO:20 ou SEQ ID NO:116, ou uma sequência de LCVR de SEQ ID NO:28 ou SEQ ID NO:118.
3. 3. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antigénio para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compreende uma combinação HCVR/LCVR de SEQ ID NO :20/28 ou 116/118.
4. 4. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antigénio para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que: (a) o agente quimioterapêutico à base de platina é cisplatina, carboplatina, iproplatina ou oxaliplatina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; (b) o análogo de pirimidinas é gemcitabina, 5-FU ou capecitabina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
5. 5. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antigénio para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o agente quimioterapêutico é cisplatina ou 5-FU.
6. 6. Utilização de um anticorpo humano ou um fragmento de ligação ao antigénio compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO:22, 24 e 26, respetivamente, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 30, 32 e 34, respetivamente, no fabrico de um medicamento destinado ao tratamento de um cancro ou à redução ou paragem do crescimento de um tumor num indivíduo por administração em combinação com um agente quimioterapêutico, em que o agente quimioterapêutico é um agente quimioterapêutico à base de platina ou um análogo de pirimidinas, e o cancro ou o tumor é uma malignidade sólida.
7. 7. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antigénio para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o cancro é selecionado entre o cancro do ovário, o cancro do útero, o cancro da mama, o cancro do pulmão, o cancro do fígado, o cancro colorretal, o cancro da bexiga, o cancro renal, o cancro da próstata, o cancro do pâncreas, o cancro do estômago, o cancro ósseo, o cancro da pele e o sarcoma de tecidos moles maligno.
8. 8. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antigénio para utilização, ou utilização, de acordo com a reivindicação 7, em que o cancro é selecionado entre o cancro do pulmão, o cancro colorretal ou o cancro da bexiga.
9. 9. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antigénio para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 7 a 8, ou utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio e o agente quimioterapêutico se destinam a ser administrados concomitante ou sequencialmente.
10. 10. Anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antigénio para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 7 a 8, ou utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, em que o referido anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antigénio é administrado a um indivíduo humano em combinação com o referido agente quimioterapêutico.
11. 11. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO:22, 24 e 26, respetivamente, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO:30, 32 e 34, respetivamente, um agente quimioterapêutico selecionado entre um agente quimioterapêut ico à base de platina ou um análogo de pirimidinas, em que o agente quimioterapêutico é opcionalmente cisplatina ou 5-FU, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
12. 12. Conjunto compreendendo um recipiente no qual está contido um anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO:22, 24 e 26, respetivamente, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO:30, 32 e 34, respetivamente, e um ou mais recipientes adicionais onde está contido pelo menos um agente quimioterapêutico selecionado entre um agente quimioterapêutico à base de platina ou um análogo de pirimidinas, opcionalmente em que o agente quimioterapêutico é cisplatina ou 5-FU.
13. 13. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilização num método terapêutico de redução da quantidade de um agente quimioterapêutico necessária para obter um efeito terapêutico desejado num indivíduo que tem um cancro ou um tumor, compreendendo a administração ao indivíduo do referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio em combinação com o agente quimioterapêutico; em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO:22, 24 e 26, respetivamente, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO:30, 32 e 34, respetivamente; em que o agente quimioterapêutico é um agente quimioterapêutico à base de platina ou um análogo de pirimidinas, opcionalmente em que o agente quimioterapêutico é cisplatina ou 5-FU; e em que a quantidade do agente quimioterapêutico é reduzida em comparação com a quantidade necessária para obter o mesmo efeito terapêutico na ausência do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antigénio.
14. 14. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilização de acordo com a reivindicação 13, em que a quantidade de um agente quimioterapêutico necessária para obter o efeito terapêutico desejado é reduzida em pelo menos 20%, ou 30% a 50%. Lisboa, 2015-12-15