ES2397680T3

ES2397680T3 - Membrana de transferencia de wester, hidrófila, de alta unión a proteínas, con baja fluorescencia

Info

Publication number: ES2397680T3
Application number: ES09168000T
Authority: ES
Inventors: Antoni Peters; Philip Goddard; John Charkoudian; Neil Soice; Dave Brewster; Anja Dedeo
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 2008-08-18
Filing date: 2009-08-17
Publication date: 2013-03-08
Anticipated expiration: 2029-08-17
Also published as: CN101703923B; SG159461A1; US20110045493A1; JP5661848B2; ES2461616T3; CN103364565B; US8132676B2; EP2302386A1; US20100044302A1; EP2302386B1; CN103364565A; SG190664A1; JP5254903B2; JP2013140183A; US8143067B2; EP2157430B1; EP2157430A1; JP2010043263A; CN101703923A

Abstract

Una membrana porosa que comprende una membrana de sustrato polimérico, estando dicha membrana desustrato polimérico formada por un polímero seleccionado de polímeros de sulfona aromáticos, politetrafluoroetileno,polímeros termoplásticos perfluorados, polímeros poliolefínicos, polietileno de ultra-alto peso molecular, poliamidas yfluoruro de polivinilideno y caracterizada por que tiene su superficie provista de un revestimiento poliméricoreticulado hidrófilo que comprende acrilamida y metilen-bis-acrilamida y porque puede producirse a partir de unasolución de reactante que contiene del 0,20 al 2,0 % de acrilamida y del 0,20 % al 2,00 % de metilen-bis-acrilamida,y en la que: dicha superficie tiene una capacidad de unión a proteína de 250-325 μg/cm2; el nivel medio de carbono orgánico total de dicha membrana es inferior a 1,5 μg/cm2; y los niveles de monómero extraíble son inferiores a 0,02 μg/cm2 para la acrilamida e inferiores a 0,15 μg/cm2para la metilen-bis-acrilamida.

Description

Membrana de transferencia de Western, hidrófila, de alta unión a proteínas, con baja fluorescencia

Antecedentes de la invención

La “transferencia” o “electro-transferencia” se refiere al procedimiento usado para transferir muestras biológicas

5 desde un gel a una membrana bajo la influencia de un campo eléctrico. El procedimiento requiere una membrana que pueda inmovilizar muestras biomoleculares para su detección posterior. Estos requisitos específicos situados sobre las membranas están relacionados con el área superficial, la porosidad y la capacidad de unión a proteínas.

La transferencia de Western es una modificación de esta técnica que implica la inmovilización de las proteínas sobre las membranas antes de la detección usando anticuerpos monoclonales o policlonales. Antes de la inmovilización de 10 las proteínas sobre la membrana, las proteínas de la muestra se separan usando electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) para separar las proteínas nativas o desnaturalizadas. Después, las proteínas se transfieren o se electro-transfieren sobre una membrana, donde se exploran y finalmente se detectan usando anticuerpos específicos contra una proteína diana. Las membranas de transferencia de Western se fabrican normalmente con nitrocelulosa (NC) o con fluoruro de polivinilideno (PVDF). La especificidad de la interacción

15 anticuerpo-antígeno puede permitir identificar una sola proteína entre una mezcla compleja de proteínas.

Resumiendo, la transferencia de Western implica la aplicación de una muestra de proteínas (lisado) sobre un gel de poliacrilamida, la separación posterior de dicha mezcla compleja mediante electroforesis y la transferencia o “electrotransferencia” de las proteínas separadas sobre una segunda matriz, generalmente una membrana de nitrocelulosa

o de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de la transferencia, la membrana se “bloquea” para impedir la unión

20 no específica de anticuerpos a la superficie de la membrana. Los expertos en la técnica conocen muchas estrategias para marcar o etiquetar anticuerpos. En los protocolos más sencillos, las proteínas transferidas se incuban o forman complejos con un anticuerpo primario marcado con enzimas que ejerce de sonda. Después de bloquear los sitios de unión no específicos, se añade un sustrato adecuado al complejo con la enzima y conjuntamente reaccionan para formar productos cromogénicos, quimioluminiscentes o fluorogénicos detectables que permiten la detección visual,

25 quimioluminiscente o fluorescente, respectivamente. Los esquemas de detección más sensibles utilizan fenómenos quimioluminiscentes o fluorescentes. En una detección quimioluminiscente, un complejo enzima-sustrato produce emisiones ópticas detectables (quimioluminiscencia). Estas emisiones se registran y se miden usando detectores adecuados, tales como dispositivos de película o fotónicos. La ausencia o presencia de señal indica si en el lisado está presente una proteína específica y la intensidad de la señal se relaciona con el nivel de la proteína de interés,

30 que en algunos casos puede cuantificarse.

El uso de membranas de nitrocelulosa es común en un trabajo de ensayo de inmunodetección, particularmente en la transferencia de Western. Esto se debe en parte a cuestiones históricas y a la facilidad de su uso. Las membranas de transferencia de nitrocelulosa no requieren ninguna etapa de pre-humectación con líquidos orgánicos, un requisito para trabajar con membranas hidrófobas. Las membranas hidrófobas requieren una etapa de pre35 humectación con alcohol seguida de una etapa de intercambio acuoso (para eliminar el alcohol), antes del ensamblaje dentro del ensamblaje de transferencia-mancha. Las membranas intrínsecamente hidrófobas permiten un periodo de tiempo limitado para este ensamblaje; la capacidad de secado de la membrana es significativa. Una vez seca, la membrana no puede volver a humedecerse salvo que se repita la secuencia de pre-humectación. Una vez que la membrana está en contacto con el gel, la eliminación antes de la transferencia puede dañar realmente al

40 gel y a las muestras de proteínas separadas que contiene. La etapa de pre-humectación es lenta y puede bloquear considerablemente la dinámica de trabajo. Una membrana hidrófila permanecerá húmeda durante más tiempo y puede volver a humedecerse con agua si se seca antes del ensamblaje.

Las membranas de transferencia de nitrocelulosa pueden humedecerse con agua y muestran un rendimiento satisfactorio para la mayoría de las aplicaciones de transferencia. No obstante, la nitrocelulosa no es tan mecánica ni

45 químicamente estable como lo es el PVDF. El PVDF conservará su integridad mecánica durante un periodo de tiempo más largo, mientras que la NC se volverá frágil y descolorida. Las transferencias con membranas de PVDF pueden separarse de los anticuerpos y pueden volver a explorarse. Las transferencias con NC no pueden hacerlo. La NC es propensa a la oxidación atmosférica, por lo que puede volverse tóxica. Requiere una corriente residual individual y cuando se desecha debe humedecerse con un agente humectante, normalmente agua.

50 Las membranas de transferencia de PVDF hidrófobas poseen una capacidad de unión a proteínas equivalente a la de las membranas de transferencia de NC, pero presentan mejor rendimiento de transferencia. En las mismas condiciones, pueden detectarse concentraciones de muestra mucho más reducidas sobre estas membranas de PVDF en comparación con las de NC. Las membranas de transferencia de PVDF hidrófobas con baja fluorescencia de fondo presentan la misma detección de muestras potenciada al permitir utilizar esquemas de detección por

55 fluorescencia.

Los autores de la presente invención tienen en cuenta la publicación de patente internacional WO 03103814 (Millipore Corporation) que describe medios o membranas porosos con un revestimiento superficial que incluye un primer revestimiento de un terpolímero reticulado y un segundo revestimiento que comprende un copolímero o un

terpolímero modificado con un grupo funcional hidrófilo o hidrófobo con mejor combinación de propiedades, que incluyen propiedades adsortivas resistentes a biomoleculas termoestables, resistencia a soluciones muy alcalinas y bajos niveles de material extraíble.

Los autores de la presente invención también tienen en cuenta la publicación de patente de Estados Unidos 2004/007459 (Applied Materials Inc.) que describe una célula de revestimiento electroquímico que tiene una membrana permeable diferenciada por difusión multinivel situada entre un compartimento anódico y un compartimento catódico. La membrana permeable diferenciada por difusión multinivel está generalmente configurada para separar el compartimento anódico del compartimento catódico, permitiendo que una solución fluida fluya a su través en una dirección desde el compartimento anódico hacia el compartimento catódico. En una realización, una membrana permeable diferenciada por difusión multinivel comprende: una primera capa de membrana situada próxima a un ánodo de la célula de revestimiento electroquímico, siendo la primera capa de membrana una capa de disco de tipo porex; una segunda capa de membrana situada adyacente a la primera capa de membrana, siendo la segunda capa de membrana una membrana de tipo PVDF; y una tercera capa de membrana situada adyacente a la segunda capa de membrana, teniendo la tercera capa de membrana láminas y laminados de fibras. La primera capa de membrana se sitúa cerca del ensamblaje anódico, siendo la primera capa de membrana una capa Tyvek. La segunda capa de membrana se sitúa adyacente a la primera capa de membrana y es una capa de PVDF. La tercera capa de membrana se sitúa adyacente a la segunda capa de membrana y es una capa de HDPE con un espesor de aproximadamente 0,9 mm y un tamaño de poro de entre aproximadamente 12 !m y aproximadamente 50 !m.

Los autores de la presente invención también tienen en cuenta el artículo "Polypropylene-based membrane adsorbers via photo-initiated graft copolymerization: Optimizing separation performance by preparation conditions"

(A. H. M. Yusof y M. Ulbricht), publicado en el Journal of Membrane Science, Elsevier Scientific Publ. Company. Amsterdam, PB, vol. 311, no. 1-2, 23 de diciembre del 2007 (), páginas 294-305. El artículo describe que la preparación de membranas de separación puede realizarse de manera muy eficaz con funcionalización superficial controlada. La copolimerización fotoiniciada de injerto selectiva de superficie puede realizarse usando un procedimiento de atrapamiento por el fotoiniciador benzofenona (BP), y usando ácido acrílico (AA) como monómero funcional se obtienen estructuras poliméricas en cepillo de débil intercambio catiónico sobre las superficies porosas de la membrana de polipropileno. La copolimerización del AA con acrilamida monomérica (AAm) "diluyente" y metilen-bis-acrilamida monomérica (MBAA) “reticulada” se realizó por variaciones de la capa injertada. El análisis composicional del copolímero de injerto se realizó usando espectroscopía FTIR-ATR. Las caracterizaciones del rendimiento se realizaron por mediciones de permeabilidad de membrana a pH bajo y alto así como a diferentes concentraciones salinas, por unión reversible de una proteína patrón (lisozima), por pH transitorios inadvertidos en condiciones de cromatografía de membrana y por curvas de saturación por análisis de dispersión de sistemas. Se supone que el resultado más importante de este estudio es que la reticulación química dentro de las capas injertadas, aproximadamente con la misma cantidad de grupos funcionales que la de los polímeros injertados lineales, conduce a una mejora significativa del rendimiento adsorbedor de los poros ya que puede aumentarse la capacidad de unión dinámica a proteínas, la permeabilidad de membrana aumenta significativamente y su sensibilidad frente a cambios en pH eluyente y concentración salina disminuye mucho más y por consiguiente la dispersión de solutos dentro de la membrana se reduce como indican las curvas de saturación más significativamente pronunciadas.

Sería por tanto deseable proporcionar una membrana de PVDF hidrófila, para ensayos de inmunodetección, tal como transferencia de Western, con características de rendimiento que se aproximen a límites de detección de muestra más bajos y a una fluorescencia de fondo baja que son característicos de las membranas de PVDF hidrófobas. La presente invención aborda estos requisitos.

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una membrana porosa que comprende una membrana de sustrato polimérico, estando dicha membrana de sustrato polimérico formada por un polímero seleccionado entre polímeros de sulfona aromáticos, politetrafluoroetileno, polímeros termoplásticos perfluorados, polímeros poliolefínicos, polietileno de ultra-alto peso molecular, poliamidas y fluoruro de polivinilideno. La membrana se caracteriza por tener en su superficie un revestimiento polimérico reticulado hidrófilo que comprende acrilamida y metilen-bis-acrilamida y por poder producirse a partir de una solución de reactante que contiene del 0,20 % al 2,0 % de acrilamida y del 0,20 % al 2,00 % de metilen-bis-acrilamida, y en la que:

dicha superficie tiene una capacidad de unión a proteína de 250-325 !g/cm2; y el nivel de carbono orgánico total medio de dicha membrana es inferior a 1,5 !g/cm2; y los niveles de monómero extraíbles son inferiores a 0,02 !g/cm2 para la acrilamida e inferiores a 0,15 !g/cm2 para la metilen-bis-acrilamida.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar una membrana hidrófila, porosa, comprendiendo dicho procedimiento:

proporcionar un sustrato de membrana poroso hidrófobo formado a partir de un polímero seleccionado entre

polímeros de sulfona aromáticos, politetrafluoroetileno, polímeros termoplásticos perfluorados, polímeros poliolefínicos, polietileno de ultra-alto peso molecular, poliamidas y fluoruro de polivinilideno; poner en contacto la superficie de dicha membrana porosa con una solución de reactante monomérico y un fotoiniciador; eliminar dicha membrana de la solución de reacción; eliminar el exceso de solución de reactante; polimerizar dicha solución de reactante en condiciones anaerobias directamente sobre toda la superficie de la membrana porosa hidrófoba para formar un revestimiento hidrófilo continuo; y secar dicha membrana.

El procedimiento se caracteriza porque dicha solución de reactante monomérico comprende del 0,20 % al 2,00 % de acrilamida y del 0,20 % al 2,00 % de metilen-bis-acrilamida, para formar así una membrana porosa que tiene:

una capacidad de unión a proteína de dicha superficie de 250-325 !g/cm2; y un nivel de carbono orgánico total medio de dicha membrana inferior a 1,5 !g/cm2; y niveles de monómero extraíbles inferiores a 0,02 !g/cm2 para la acrilamida e inferiores a 0,15 !g/cm2 para la metilen-bis-acrilamida.

La capacidad de unión a proteína puede medirse mediante un ensayo de unión a IgG.

Los niveles de monómero extraíbles pueden determinarse mediante HPLC.

Los expertos en la técnica de modificación de superficies con objeto de modificar energías de superficie de sustrato y en particular con respecto a superficies destinadas para ponerse en contacto con sistemas biológicos, estarán de acuerdo en que las modificaciones de superficies hidrófilas tradicionalmente presentan un comportamiento de unión a proteína más bajo. Las realizaciones desveladas en el presente documento se fundamentan en el descubrimiento fortuito e inesperado de que los polímeros espaciales derivados de mezclas de acrilamida monomérica y metilen-bisacrilamida usados en la presente invención y formados usando reacciones de polimerización de radicales libres, pueden dar lugar a modificaciones superficiales que no son solamente hidrófilas, sino también demuestran un alto nivel de unión a proteína.

La mayor parte de la técnica anterior describe el uso de monómeros que contienen hidroxilo, normalmente polímeros de acrilato que contienen carbonil éster, para producir modificaciones en la superficie de las membranas que tienen carácter hidrófilo y una alta resistencia para unirse a proteínas. Sin embargo, se sabe que los polímeros de dichos monómeros no son resistentes a soluciones alcalinas fuertes. Por ejemplo, una solución de hidróxido de sodio 1,0 normal hidrolizará los polímeros de acrilato que contienen carbonilo en polímeros que contienen ácido acrílico. Dichos polímeros que contienen ácido acrílico están iónicamente cargados en determinadas condiciones de pH, y atraerán y se unirán a proteínas o biomoléculas con carga opuesta, aumentando así la sorción y la contaminación de las membranas. Además, los polímeros que contienen ácido acrílico se hinchan en agua hasta un grado en el que los pasos de los poros se estrechan, reduciendo así la permeabilidad y productividad de las membranas. Además, los polímeros de monómeros que contienen hidroxilo, tales como los hidroxi acrilatos, reaccionan también en soluciones alcalinas fuertes y se degradan en fragmentos de bajo peso molecular solubles, que disuelven y exponen los medios o membranas de sustrato poroso subyacentes.

Los facultativos que intentan desarrollar membranas optimizadas para aplicaciones tanto de filtración como de no filtración en la industria farmacéutica y biotecnológica deben superar problemas significativos. Enfrentándose a exigencias respecto a coste, rendimiento y seguridad, un facultativo debe usar materiales y desarrollar procedimientos de fabricación que produzcan membranas que no solo tengan características de retención y flujo optimizadas sino que también sean económicas de producir, que cumplan con criterios asépticos, que sean estables a los diversos entornos químicos que normalmente se encuentran y que sean muy resistentes a la adsorción de biomoléculas, o se adsorban muy fuertemente, dependiendo del uso final deseado. Por tanto, en este caso, es muy deseable tener una modificación de membrana que de como resultado una superficie adsortiva biomolecular hidrófila que sea termoestable, resistente a la degradación por cualquier solución de reactivo potencial y que tenga niveles muy bajos de material capaz de extraerse de la misma.

Los resultados de unión a proteínas de investigaciones previas realizadas en modificaciones de superficies poliméricas de acrilamida mixtas indican que determinadas mezclas de monómeros reticulantes de bis-acrilamida hidrófila y acrilamidas monofuncionales neutras o cargadas pueden, cuando se copolimerizan usando técnicas de radicales libres iniciadas por haces de electrones o iniciadas por UV, producen modificaciones de la superficie hidrófila de alta unión a proteína. Sin embargo, antes de observar una morfología de transferencia puntual y un rendimiento de transferencia de mancha satisfactorios, los niveles de partida iniciales de cada monómero deben disminuir en gran medida.

Las realizaciones de la presente invención superan los problemas de la técnica anterior, ya que proporcionan una membrana hidrófila, particularmente adecuada para aplicaciones de transferencia, preferentemente transferencia de Western. Más específicamente, un sustrato de membrana hidrófobo previamente humedecido, preferentemente fabricado con PVDF, se pone en contacto con una solución monomérica y se somete a condiciones de

polimerización para hacer que el sustrato sea permanentemente hidrófilo.

La membrana resultante presenta fluorescencia de fondo baja, alta unión a proteínas, excelente retención de morfología de manchas de la muestra de proteína y un intervalo dinámico ampliado (una alta proporción de señal con respecto a ruido, mejor detectabilidad de la muestra). Cuando para la detección se usa quimioluminiscencia, el nivel de fluorescencia de fondo intrínseca de la membrana primaria, no modificada, no es crítico. La membrana demuestra un rendimiento comparable o superior en aplicaciones de transferencia de Western con respecto a las membranas de transferencia de nitrocelulosa convencionales, particularmente para la detección a bajas concentraciones de muestra y puede humedecerse directamente con agua, eliminando la necesidad de realizar una etapa de pre-humectación con alcohol antes de su uso. La membrana presenta una humectación completa, instantánea y uniforme tras ponerse en contacto con el agua y presenta una humectación prolongada cuando se pone en contacto con una solución acuosa, saturada, de cloruro de aluminio. Es decir, cuando dicha membrana se coloca sobre la superficie de esta solución acuosa, saturada, de cloruro de aluminio se humedece durante un intervalo de tiempo mínimo (no inferior a 1 segundo).

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1-3 son diagramas de resultados de transferencias de Western usando las membranas tratadas de acuerdo con determinadas realizaciones.

Descripción detallada

Las membranas modificadas desde el punto de vista hidrófilo de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación proporcionan plataformas de ensayo de inmunodetección que son comparables a, o presentan un rendimiento de transferencia superior, a las membranas de nitrocelulosa, particularmente con respecto a la expansión del extremo inferior del intervalo dinámico de la detectabilidad de muestra. Por ejemplo, en la FIGURA 1, los resultados de la transferencia de Western de un proceso de desarrollo típico demuestran diferencias en cuanto al rendimiento entre una membrana de transferencia de PVDF hidrófila de la presente invención, y los controles (membrana de PVDF hidrófoba - FL, y membrana de NC – Whatman/S y S BA-85). En la figura, cada tira horizontal contiene 5 transferencias de Western individuales; tres transferencias sobre muestras de desarrollo en PVDF hidrófilo y una transferencia en cada una de las membranas de control. Cada tira horizontal de 5 transferencias de Western es el resultado de una electroforesis y un experimento de transferencia (en cada experimento se procesaron 5 geles seguido de 5 transferencias). Para el diseño, cada experimento representa condiciones idénticas en cada gel/transferencia con idénticas cantidades de muestra de proteína (aplicado en 4 carriles a través de cada gel) antes de la electroforesis y transferencia. Los resultados mostrados son las manchas de transferencia registradas (quimioluminiscencia) para la detección de 2 proteínas (HSP70 y GAPDH) a partir de una mezcla de muestra compleja (lisado), aplicada a concentraciones decrecientes de muestra, de izquierda a derecha en cada gel y que corresponden a: 5 ug, 2,5 ug, 1,25 ug, 0,67 ug.

Las membranas porosas adecuadas incluyen las formadas a partir de polímeros de sulfona aromáticos, politetrafluoroetileno, polímeros termoplásticos perfluorados, polímeros poliolefínicos, polietileno de ultra alto peso molecular, poliamidas, incluyendo Nylon 6 y Nylon 66, y fluoruro de polivinilideno, siendo particularmente preferido el fluoruro de polivinilideno. Las membranas porosas incluyen membranas microporosas y membranas de ultrafiltración y están preferentemente en forma de láminas. Generalmente los tamaños de poro promedio incluyen los que se encuentran entre 0,001 y 10 micrómetros. Las membranas de transferencia son nominalmente materiales con un tamaño de poro de 0,45 um. Las membranas de partida preferidas tienen un intervalo de porosidad característico (volumen inicial) del 68-73 %. Las membranas de transferencia son tradicionalmente simétricas. Sin embargo, el revestimiento podría aplicarse a una membrana asimétrica.

El revestimiento polimérico puede ser un copolímero o un terpolímero formado a partir de al menos un monómero polifuncional modificado al menos con un grupo hidrófilo funcional, seleccionándose dicho monómero (o monómeros) polifuncional hidrófilo del grupo que consiste en acrilamidas polifuncionales, metacrilamidas polifuncionales y diacroilpiperazinas y formado a partir de al menos un monómero monofuncional modificado al menos con un grupo hidrófilo funcional, seleccionándose dicho monómero (o monómeros) monofuncional hidrófilo del grupo que consiste en acrilamidas monofuncionales, metilacrilamidas monofuncionales y acriloilpiperazinas.

Se observó que una membrana hidrófoba porosa, preferentemente fabricada con fluoruro de polivinilideno revestida con un copolímero de acrilamida - metilen-bis-acrilamida reticulado se hizo altamente hidrófilo. Adicionalmente, al nivel del copolímero que se aplicó a las muestras de membrana porosa de PVDF en series tempranas de la presente invención, los ensayos de unión a IgG revelaron niveles de unión a proteína próximos a 400 ug/cm2. Este nivel es típico de una membrana primaria de PVDF hidrófoba y de membranas de nitrocelulosa convencionales. El primer resultado sorprendente fue que las membranas preparadas de esta manera eran hidrófilas y presentaban alta unión a proteínas. Sin embargo, el rendimiento de la transferencia de Western de estas muestras iniciales (las que presentaban este alto nivel de unión a proteína) no fue satisfactorio en cuanto al mantenimiento del tamaño de la mancha de muestra pequeña (morfología de la mancha) y en cuanto a la captura de la muestra en las transferencias de las manchas. Modificando el nivel de revestimiento del copolímero, se realizó un rendimiento de transferencia satisfactorio. A estos niveles modificados, los niveles de unión a proteína se redujeron a aproximadamente 250 y

325(00) ug/cm2, aunque el rendimiento de la transferencia de Western ascendió a niveles intermedios entre la membrana de nitrocelulosa y la de PVDF hidrófoba preferida primaria. Sorprendentemente, los autores de la presente invención descubrieron que el nivel de unión a proteína no era el mejor o que solo era pronosticador de un rendimiento de membrana de transferencia Western. Sacrificando alguna capacidad de unión a proteína, modificando el nivel de revestimiento sobre el sustrato puede obtenerse un rendimiento de transferencia mejorado.

Por tanto, para obtener un rendimiento de ensayo de inmunodetección aceptable los niveles de los componentes y concentraciones relativas al modificar la formulación son críticos. Una concentración de sólidos global baja en una proporción de componente altamente específica equilibra rendimiento de agua-humectación frente al rendimiento de transferencia.

El nivel de fluorescencia de fondo bajo de la membrana sustrato se conserva. Sin embargo, si el nivel de química de modificación de superficie es demasiado bajo, el resultado es una membrana que no puede humedecerse con agua a un grado aceptable. Si el nivel de modificación de superficie es demasiado alto las membranas resultantes presentan energías de superficie extremadamente elevadas. Como se ha expuesto anteriormente, a niveles más altos de química de modificación de superficie, la capacidad de unión a proteína medida es generalmente equivalente a la de las membranas de nitrocelulosa y de PVDF hidrófoba, pero con malos resultados en cuanto a rendimiento de electrotransferencia.

De acuerdo con determinadas realizaciones, el nivel total de sólidos en la solución de modificación/reactante debe ajustarse a entre el 0,90 % y el 1,10 % en peso. Una concentración de sólidos total en este intervalo con la proporción de componentes especificados produce un rendimiento de transferencia óptimo. Esta formulación incluye un componente fotoiniciador UV.

Las cantidades adecuadas del monómero monofuncional de acrilamida y del monómero reticulante bis-acrilamida en la solución de reactante deben de ser entre el 0,20 % y el 2,00 % en peso (cada una), preferentemente con cantidades entre el 0,30 % y el 0,60 % en peso (cada una) y más preferentemente entre el 0,40 % y el 0,50 % en peso (inclusivo, cada una). La proporción preferida de acrilamida con respecto a bis-acrilamida de la solución de reactante monomérica es de aproximadamente 1:1 (masa/masa). La concentración monomérica global preferida de la solución de reactante de monómero de acrilamida:metilen-bis-acrilamida es entre el 0,5 % y el 1,5 % en masa. Un componente fotoiniciador UV adecuado está presente en 0,01 % al 0,20 % en peso preferentemente entre 0,02 y 0,15 % en peso, y más preferentemente entre 0,09 % y 0,11 % en peso. Los fotoiniciadores UV adecuados incluyen Irgacure 500, 754, 2959 y 819DW. Los procedimientos para la preparación del sustrato de membrana poroso modificado de acuerdo con determinadas realizaciones incluyen las etapas de proporcionar un sustrato de membrana poroso, poner en contacto la superficie de sustrato de membrana poroso con una solución de reactante que comprenda acrilamida y metilen-bis-acrilamida y un fotoiniciador adecuado, eliminar la membrana de la solución y polimerizar el revestimiento in situ sobre el sustrato de membrana exponiendo la misma a radiación de una longitud de onda e intensidad adecuadas durante un intervalo de tiempo adecuado. Preferentemente la membrana porosa que se ha puesto en contacto con la solución de reacción se irradia con una fuente de luz ultravioleta. Para reducir o eliminar longitudes de onda no deseables que puedan ocasionar daños a la membrana porosa pueden usarse filtros. Los expertos en la técnica deben conocer el tiempo de exposición a la luz ultravioleta y su intensidad.

En la realización preferida de la invención, se realiza una preparación a escala de laboratorio de la solución monomérica de reactante disolviendo 1,00 g de acrilamida, [H2C=CH-C(O)-NH2] monómero funcional, 0,80 g de metilen-bis-acrilamida, [H2C(-NH-C(O)CH=CH2)2] monómero reticulante y 0,20 g de fotoiniciador Irgacure 2959 en 198,00 g de agua Milli-Q®. Se requiere un intervalo de mezcla prolongado de aproximadamente 2 horas para disolver completamente el reticulador y el fotoiniciador.

Más específicamente, la membrana de partida hidrófoba porosa se humedece previamente sumergiéndola en un líquido orgánico o en una solución acuosa del mismo que hinche o disuelva la membrana porosa y que se prehumedezca toda la superficie porosa de la membrana.

El líquido puede ser un alcohol de bajo peso molecular, o una mezcla de agua y un líquido orgánico miscible. Los líquidos o composiciones adecuados incluyen metanol, etanol, isopropanol, mezclas de agua de los mismos, mezclas de acetona/agua y mezclas de tetrahidrofurano/agua de tensión superficial suficientemente baja para afectar a la humectación de toda la superficie de la membrana.

El objeto de esta etapa de pre-humectación es garantizar que toda la superficie de membrana se vuelva humectable al agua, y posteriormente a la solución monomérica del reactante acuoso. Después de la etapa de pre-humectación debe haber una etapa de intercambio riguroso con agua para eliminar la presencia del disolvente orgánico. Estos disolventes pre-humectantes o sus mezclas con agua pueden ejercer una influencia negativa sobre la polimerización deseada de los monómeros de reactante.

La inmersión posterior y una suave agitación de la membrana porosa humedecida con agua en la solución de reactante permiten que toda la superficie de la membrana porosa se humedezca con la solución de reactante. Siempre y cuando se elimine el exceso de agua de la membrana antes de la inmersión en la solución de reactante, no se producirá ninguna dilución significativa de la solución de reactante.

La muestra se retira después de un corto intervalo de tiempo (dos minutos) y el exceso de solución de reactante se elimina de la muestra de membrana. La membrana humedecida con la solución de reactante se expone anaeróbicamente a radiación UV para efectuar la polimerización directamente sobre toda la superficie de la membrana porosa. La membrana revestida resultante presenta: Humectación inmediata, completa y totalmente 5 uniforme cuando se pone en contacto sobre una superficie acuosa; Un alto nivel de rendimiento de transferencia de Western; Un alto nivel de unión a proteína (�250 ug/cm2 a IgG) mediante ensayo radiomarcado; y una fluorescencia de fondo baja (aproximadamente 2000 ufr a longitudes de onda de excitación/emisión de 485 nm/535 nm usando un lector de fluorescencia TECAN GENios FL con una ganancia del detector ajustada a 86 y un programa informático de procesamiento Magellan 5,0), que es aproximadamente dos veces la fluorescencia de fondo de la membrana no

10 tratada (hidrófoba primaria no modificada) en las mismas condiciones de medición. Cuando la membrana se coloca sobre la superficie de una solución acuosa de cloruro de aluminio saturada, se humedecerá por completo en un intervalo de tiempo mínimo no inferior a 1 segundo y en un intervalo de tiempo máximo que puede superar los 60 segundos.

Ejemplo 1

15 Una membrana de PVDF hidrófoba disponible en el mercado de Millipore Corporation (IPFL00000) se sumergió en alcohol metílico. La membrana se retiró y se sumergió en agua durante 1 minuto, agitando para extraer el metanol. La membrana se retiró y se sumergió en agua corriente durante un intervalo adicional de 2 minutos y después se colocó en agua corriente antes de sumergirla en una solución monomérica de reactante. El exceso de agua se drenó de la membrana y después se sumergió en una solución monomérica de reactante agitando suavemente durante 2

20 minutos. Después, ambos lados de la membrana se expusieron a radiación UV en un proceso de curado con UV a una velocidad lineal de 15 a 25 fpm. La membrana se recuperó y se colocó en un baño con agua para eliminar el monómero que no había reaccionado y los oligómeros y polímeros no adherentes. Las muestras se secaron bien al aire a temperatura ambiente durante una noche o bien en un horno estático impulsado por aire entre 60 ºC y 80 ºC durante 10 minutos o en una secadora de impacto a 90-110 ºC a una velocidad lineal de 15 a 25 fpm. Se midió la

25 media de extraíbles de la membrana, determinada mediante un procedimiento con TOC (Carbono Orgánico Total) interno, que era de aproximadamente 1,44 ug/cm2, como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1 – Carbono Orgánico Total (TOC) - Cinco (5) discos de 47 mm.

Solicitante ID: ML6UJP37: Membrana de IPFL Hidrófila de PVDF Recibida

Solicitante: Antoni Peters: Para Aplicaciones de Transferencia e Inmunoensayos

Ext. Para Análisis TOC

Extracción Por: A. Pervez

TOC Por: M Santos-Rosa y A. Pervez

Fecha: 16-19/10/2006

Ext.: Temperatura Ext. Tiempo Ext. Vol. Ext. Área Ext.

Disolvente: [ºC] [Horas] [g] [cm2]

Agua MilliQ: Temperatura Ambiente 24 40 86,75

Resumen

Resultados

TOC Ácido/Óxido: TOC TOC Corregido TOC TOC

ID de Muestra: [!l/min] [ppm C] [ppm C] [!g C] [!g C/cm2]

Blanco Agua: 0,20/0,20 0,0639

T102 072806 A-MBAM/AC/I2959: 0,75/1,00 3,29 3,23 129 1,49

T102 072806 B:-MBAM/AC/I2959: 0,75/1,00 291 2,85 114 1,31

T102 072806 C:-MBAM/AC/I2959: 0,75/1,00 3,33 3,27 131 1,51

Los niveles monoméricos residuales extraíbles promedio se determinaron mediante HPLC. Como se indica en la Tabla 2, los valores se determinaron a partir de 3 muestras.

Tabla 2. Niveles Monoméricos Extraíbles Mediante HPLC – Mismas muestras que las mostradas en la Tabla 1.

Muestra: Acrilamida (!g/cm2) MBAM (!g/cm2) Irgacure 2959 (!g/cm2)

T102 072806A: 0,002 0,105 N.D.

T102 072806B: 0,005 0,091 N.D.

T102 072806C: 0,011 0,094 N.D.

Ejemplo 2

Para tratar membranas de PVDF que tenían las características, condiciones de tratamiento y soluciones de reactante mostradas en las Tablas 3A-D, 4A-D y 5A-D, se usó el procedimiento del Ejemplo 1

Tabla 3A

DATOS DE MODIFICACIÓN para Membrana de Transferencia de Western de PVDF Hidrófila

Propiedades de la Membrana de Partida

Nº de proceso: Nº de Lote de la Mezcla Monomérica Datos del Lote de la membrana de partida Temperatura del secador de formación de la membrana (F) Espesor (um) Porosidad (%) Pt Bbl (psi) Tiempo de Flujo (segundos)

PROCESO R – Sin ajuste de la mezcla - Longitud frente a la concentración de la mezcla de monómero

ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND

R01: R Mezcla 1 IPFL 071007 T214 300 112 72,8 9,4 56,0

R02: R Mezcla 1 IPFL 071007 T205 300 113 73,0 9,4 63,0

R03: R Mezcla 1 IPFL 071007 T205 300 113 73,0 9,4 63,0

R04: R Mezcla 1 IPFL 071007 T205 300 113 73,0 9,4 63,0

R05: R Mezcla 1 IPFL 071007 T205 300 113 73,0 9,4 63,0

R06: R Mezcla 1 IPFL 071007 T206 300 111 72,4 9,5 65,0

R07: R Mezcla 1 IPFL 071007 T206 300 111 72,4 9,5 65,0

R08: R Mezcla 1 IPFL 071007 T206 300 111 72,4 9,5 65,0

R09: R Mezcla 1 IPFL 071007 T206 300 111 72,4 9,5 65,0

R10: R Mezcla 1 IPFL 071007 T214 300 112 72,8 9,4 56,0

R11: R Mezcla 1 IPFL 071007 T214 300 112 72,8 9,4 56,0

R12: R Mezcla 1 IPFL 071007 T214 300 112 72,8 9,4 56,0

R12 Final: ND ND 300 ND ND ND ND

Tabla 3B

Concentraciones del Componente de Mezcla Monomérica

Nº de proceso: ID de la Muestra de la Mezcla Monomérica AC Real % Peso (HPLC) MBAM Real % Peso (HPLC) 1-2959 Real % Peso (HPLC) Sólidos Totales Reales % Peso (HPLC) Longitud Totalizada por Proceso

NA: R Mezcla 1 TAMBOR 0,5156 0,4214 0,1130 1,0500 0

R01: MM1 Inicial 0,5091 0,4042 0,1102 1,0235 0

R02: MM2 0,5105 0,3957 0,1094 1,0156 500

R03: MM3 0,5038 0,3837 0,1055 0,9931 800

R04: MM4 0,4996 0,3773 0,1001 0,9771 1100

R05: MM5 0,4948 0,3708 0,0999 0,9655 1250

R06: MM6 0,4935 0,3685 0,1020 0,9640 1550

R07: MM7 0,4868 0,3618 0,0995 0,9481 1850

R08: MM8 0,4868 0,3605 0,0974 0,9448 2150

R09: MM9 0,4777 0,3553 0,0956 0,9286 2300

R10: MM10 0,4721 0,3528 0,0956 0,9204 2600

R11: MM11 0,4673 0,3521 0,0932 0,9125 2900

R12: MM12 0,4682 0,3561 0,0918 0,9161 3200

R12 Final: MM13 Final 0,4574 0,3546 0,0879 0,8999 3300

Tabla 3C

Condiciones de la Cámara UV

Nº de Proceso: Presión de contacto en el pasillo (psi) Presión de contacto en la pared (psi) Velocidad Lineal (ft/min) Tipo/Nº de Lámparas Config. de las Lámparas Flujo de N2 Superior/ Inferior (SCFM) UV P1 Pulgadas HWC UV P3 Pulgadas HWC UV P2 Pulgadas HWC Nivel de O2 Inicial (ppm)

ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND: 1,0 1,6 1,0 90,0

R01: 20 20 20 H/4 Escalonada 10/9,5 1,1 1,7 1,1 70,0

R02: 20 20 20 H/4 Escalonada 10/9,5 1,1 1,7 1,1 56,7

R03: 20 20 20 H/4 Escalonada 10/9,5 1,1 1,7 1,1 39,3

R04: 20 20 20 H/4 Escalonada 10/9,5 1,1 1,7 1,1 33,0

(continuación)

R05: 20 20 20 H/4 Escalonada 10/9,5 1,1 1,7 1,1 28,8

R06: 20 20 20 H/4 Escalonada 10/9,5 1,1 1,7 1,1 27,8

R07: 20 20 20 H/4 Escalonada 10/9,5 1,1 1,7 1,1 26,9

R08: 20 20 20 H/4 Escalonada 10/9,5 1,1 1,7 1,1 26,4

R09: 20 20 20 H/4 Escalonada 10/9,5 1,1 1,7 1,1 27,4

R10: 20 20 20 H/4 Escalonada 10/9,5 1,1 1,7 1,1 25,2

R11: 20 20 20 H/4 Escalonada 10/9,5 1,1 1,7 1,1 27,1

R12: 20 20 20 H/4 Escalonada 10/9,5 1,1 1,7 1,1 27,8

R12 Final: ND ND ND ND ND ND 1,1 1,7 1,1 25,2

Tabla 3D

Nº deProceso: Humidificacióncon AguaVerificaciónde laVelocidad Humidificacióncon AguaVerificaciónde Red-X Uniforme Humidificacióncon AguaVerificaciónde Paso HumidificaciónSalina Tiempo Segundos HumidificaciónSalinaTiempo Segundos HumidificaciónSalinaTiempo Segundos HumidificaciónSalinaTiempo Segundos Fluorescencia BKG RFU Control de Calidad deTransferencia Aprobado/Reprobado Transferencia de WesternLisado Vivo

PROCESO R – Sin ajuste de la mezcla - Longitud frente a la concentración la mezcla de monómero

ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND: ND NC

R01: Y Y Y 4,7 3,5 3,0 3,7 1750,57 Aprobado Banda 9 NC

R02: Y Y Y' 1,4 2,4 2,4 2,1 N/Disponible. N/Disponible. NC

R03: Y Y Y 1,4 2,4 2,4 2,1 N/Disponible. N/Disponible. NC

R04: Y Y Y 2,1 2,2 2,5 2,3 N/Disponible. N/Disponible. NC

R05: Y Y Y 2,9 3,1 2,9 3,0 2015,63 Aprobado Banda 9 NC

R06: Y Y Y 2,2 2,3 2,3 2,3 N/Disponible. N/Disponible. NC

R07: Y Y Y 4,1 3,9 4,0 4,0 N/Disponible. N/Disponible. NC

R08: Y Y Y 2,3 3,7 3,2 3,1 N/Disponible. N/Disponible. NC

R09: Y Y Y 5,7 7,3 5,3 6,1 1927,95 Aprobado Banda 9 NC

R10: Y Y Y 5,4 7,1 5,4 6,0 N/Disponible. N/Disponible. NC

R11: Y Y Y 6,3 7,5 5,6 6,5 N/Disponible. N/Disponible. NC

R12: Y Y Y 8,5 7,8 7,6 8,0 1708,5 Aprobado Banda 9 NC

R12Final: Y Y Y 16,7 16,5 16,3 16,5 ND ND NC

Tabla 4A

DATOS DE MODIFICACIÓN DE MEMBRANA -Membrana de Transferencia de Western de PVDF Hidrófila

Segmento de Proceso: Nº de Proceso Nº de Lote de la Mezcla Monomérica Datos de Lote de Membrana de Partida Temperatura del Secador del Tratamiento Térmico T o Modo Línea Temperatura del secador de formación de la membrana (F)

PROCESO S – POROSIDAD/ESPESOR/TEMPERATURA DEL SECADOR VMF4, VELOCIDAD LÍNEAL

ND
ND
ND
ND

Ensayo: R01 S Mezcla 1 IPFL 071007 T203 205 300

S1: R02 S Mezcla 1 IPX 070907 R103 205 300

S1: R03 S Mezcla 1 IPX 091407 T103 205 310

S1: R04 S Mezcla 1 IPX 120307T107 205 300

S1: R05 S Mezcla 1 IPX 091407 T102 205 310

S1: R06 S Mezcla IPX 070907 R105 204 300

S2: R07 S Mezcla 1 IPX 120307 T107 200 300

S2: R08 S Mezcla 1 IPX 120307 T107 Transición 300

S2: R09 S Mezcla 1 IPX 120307 T107 205 300

S2: R10 S Mezcla 1 IPX 120307 T107 Transición 300

S2: R11 S Mezcla 1 IPX 120307 T107 210 300

S2: R12 S Mezcla 1 IPX 120307 T107 210 300

S2: R13 S Mezcla 1 IPX 120307 T107 210 300

Segmento 1 Variación de propiedades de membrana de partida Segmento 2 Variación de la velocidad lineal y de la temperatura del secador

Tabla 4B

Propiedades de Membranade partida: Muestras de Mezcla Monoméricas y Concentraciones de Componente de la Mezcla

Segmento deProceso: Nº deProceso Espesor(um) Porosidad (%) Pt Bbl(psi) Tiempo de Flujo (segundos) ID Muestra de laMezcla Monomérica AC Real% Peso(HPLC) MBAM Real% Peso(HPLC) I-2959 Real% Peso(HPLC) Sólidos TotalesReales% Peso(HPLC) LongitudTotalizada por Proceso

PROCESO S – POROSIDAD/ESPESOR/TEMPERATURA DEL SECADOR VMF4, VELOCIDAD LINEAL

ND
ND
ND
ND
ND
ND: MM1B 0,4979 0,3894 0,1005 0,9878 150

Ensayo: R01 112 72,8 9,6 61,0 MM1 C Inicial 0,4926 0,3877 0,1005 0,9808 300

S1: R02 115 74,8 9,3 55,0 MM2B 0,4893 0,3849 0,0996 0,9738 450

S1: R03 115 66,4 9,6 59,0 MM3B 0,4812 0,3785 0,0971 0,9568 600

S1: R04 126 72,9 9,4 65,0 MM4B 0,4780 0,3760 0,0963 0,9503 750

S1: R05 122 66,2 11,1 78,3 MM5B 0,4761 0,3733 0,0954 0,9448 950

S1: R06 130 74,7 10,7 74,0 MM6B 0,4785 0,3757 0,0953 0,9495 1100

S2: R07 126 72,9 9,4 65,0 MM7B 0,4699 0,3678 0,0934 0,9311 1200

S2: R08 126 72,9 9,4 65,0 MM8B 0,4673 0,3656 0,0926 0,9255 1305

S2: R09 126 72,9 9,4 65,0 MM9B 0,4660 0,3644 0,0925 0,9229 1405

S2: R10 126 72,9 9,4 65,0 MM10B 0,4655 0,3637 0,0917 0,9209 1505

S2: R11 126 72,9 9,4 65,0 MM11B 0,4642 0,3619 0,0910 0,9171 1605

S2: R12 126 72,9 9,4 65,0 MM12B 0,4618 0,3598 0,0903 0,9119 1705

S2: R13 126 72,9 9,4 65,0 MM13B NoDisponible NoDisponible NoDisponible No Disponible 1855

Tabla 4C

Condiciones de la Cámara de UV

Segmento de Proceso: Nº de Proceso Presión de contacto en el pasillo (psi) Presión de contacto en la pared (psi) Velocidad Lineal (ft/min) Flujo de N2 Superior/ Inferior (SCFM) UV P1 Pulgadas HWC UV P3 Pulgadas HWC UV P2 Pulgadas HWC Nivel de O2 Inicial (ppm)

ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND

Ensayo: R01 20 20 20 10/9,5 1,0 1,5 1,1 15,0

31: R02 20 20 20 10/9,5 1,0 1,5 1,1 42,0

S1: R03 20 20 20 10/9,5 1,0 1,5 1,1 40,0

S1: R04 20 20 20 10/9,5 1,0 1,5 1,1 40,0

S1: R05 20 20 20 10/9,5 1,0 1,5 1,1 40,0

S1: R06 20 20 20 10/9,5 1,0 1,5 1,1 40,0

S2: R07 20 20 22 10/9,5 1,0 1,4 1,1 53,7

S2: R08 20 20 20 10/9,5 1,0 1,4 1,1 39,1

S2: R09 20 20 20 10/9,5 1,0 1,4 1,1 37,6

S2: R10 20 20 18 10/9,5 1,0 1,4 1,1 33,0

S2: R11 20 20 18 10/9,5 1,0 1,4 1,1 30,5

S2: R12 20 20 20 10/9,5 1,0 1,4 1,1 24,9

S2: R13 20 20 25 10/9,5 1,0 1,4 1,1 25,2

Tabla 4D

DATOS DE MODIFICACIÓN DE MEMBRANA - Membrana de Transferencia de Western de PVDF Hidrófila

SegmentodeProceso: Nº deProceso Humidificacióncon AguaVerificación dela Velocidad Humidificacióncon AguaVerificación deRed-XUniforme Humidificacióncon AguaVerificación dePaso HumidificaciónSalinaTiempoSegundos HumidificaciónSalinaTiempoSegundos HumidificaciónSalinaTiempoSegundos HumidificaciónSalinaTiempoSegundos FluorescenciaBKG RFU Control de Calidad de TransferenciaAprobado/Reprobado Transferenciade WesternLisado Vivo

ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND

Ensayo: R01 Y Y Y 8,2 8,8 4,9 7,3 N/Disponible. N/Disponible. NC

S1: R02 Y Y Y 26,2 15,2 5,3 15,6 N/Disponible. N/Disponible. NC

S1: R03 Y Y Y 4,2 4,2 2,9 3,8 N/Disponible. N/Disponible. NC

S1: R04 Y Y Y 5,4 13,6 10,3 9,8 N/Disponible. N/Disponible. NC

S1: R05 Y N N 7,8 4,6 5,7 6,0 N/Disponible. N/Disponible. NC

S1: R06 Y Y Y 12,7 8,0 9,9 10,2 N/Disponible. N/Disponible. NC

S2: R07 Y Y Y >120* 90,0 25,0 NoSignificativo N/Disponible. N/Disponible. NC

S2: R08 Y Y Y >120* >120 40,0 NoSignificativo N/Disponible. N/Disponible. NC

S2: R09 Y Y Y >120* >120 30,0 NoSignificativo N/Disponible. N/Disponible. NC

S2: R10 Y Y Y >120* >120 55,0 NoSignificativo N/Disponible. N/Disponible. NC

S2: R11 Y Y Y >120* >120 80,0 NoSignificativo N/Disponible. N/Disponible. NC

S2: R12 Y Y Y >120* >120 80,0 NoSignificativo N/Disponible. N/Disponible. NC

S2: R13 Y Y Y >120 >120 55,0 NoSignificativo N/Disponible. N/Disponible. NC

Segmento 1 Variación de propiedades de membrana de partidaSegmento 2 Variación de la velocidad lineal y de la temperatura del secador

Tabla 5A

Segmento de Proceso: Nº de Proceso Nº de Lote de la Mezcla Monomérica Datos de Lote de Membrana de Partida Longitud Buena Temperatura del Secador del Tratamiento Térmico T o Modo Línea Temperatura del secador de formación de la membrana (F)

PROCESO T – POROSIDAD/ESPESOR, TEMPERATURA DEL SECADOR VMF4, VELOCIDAD LINEAL

1: ND 010908M1 TAMBOR 0 NA NA

1: ND 010908M1 -MM1 Tanque 0 NA NA

1: ND 010908M1 -MM2 Tanque Diluido 0 NA NA

1: R01 010908M1 IPVH 050107 T101 B 155 200

1: R02 010908M1 IPFL 071007 T203 90 200 300

2: R03 1010908M1 IPX 120307 T109 90 200 300

2: R04 010908M1 IPX 120307 T109 90 200 300

2: R05 010908M1 IPX 120307 T109 90 Transición 300

2: R06 010908M1 IPX 120307 T109 90 220 300

2: R07 010908M1 IPX 120307 T109 90 215 300

2: R08 010908M1 IPX 120307 T109 90 215 300

2: R09 010908M1 IPX 120307 T109 90 Transición 300

2: R10 010908M1 IPX 120307 T109 90 220 300

3: R11 010908M1 IPX 091407 T101 10 205.4 300

3: R12 010908M1 IPX 071007 T213 90 205.5 300

3: R13 010908M1 IPX 120307 T104 90 205.8 300

3: R14 010908M1 IPX 070907 T105 90 206.1 300

3: R15 010908M1 IPX 070907 R102 90 205 300

3: R16 010908M1 IPX 070907 R106 90 205 300

3: R17 010908M1 IPX 120307 R110 90 205 300

3: NA 010908M1 ND 0 205

Segmento 1 Diagnóstico Segmento 2 Temperatura de Secador y Variación de Velocidad Lineal Segmento 3 Porosidad y Variación de espesor – Membrana de partida

Tabla 5B (continuación)

Propiedades de la Membrana departida: Muestras de Mezcla Monomérica y Concentraciones de Componentes

Segmento deProceso: Nº deProceso Espesor(um) Porosidad (%) Pt Bbl (psi) Tiempo de Flujo (segundos) ID de Muestra de la Mezcla Monomérica AC Real% Peso(HPLC) MBAMReal% Peso(HPLC) I-2959Real% Peso(HPLC) Sólidos TotalesReales% Peso(HPLC) LongitudTotalizada por Proceso

PROCESO T – POROSIDAD/ESPESOR, TEMPERATURA DE SECADOR VMF4 - VELOCIDAD LINEAL

1: NA NA NA NA NA TAMBOR 0,76 0,60 0,15 1,51 0

1: NA NA NA NA NA MM1 0,75 0,58 0,15 1,48 0

1: NA NA NA NA NA MM2 de partida 0,51 0,40 0,10 1,00 0

1: R01 109-125 NoDisponible NoDisponible No Disponible No Extraída ND ND ND ND 375

1: R02 112 72,8 9,6 61,0 No Extraída ND ND ND ND 675

2: R03 120 71,0 9,5 63,0 MM3 0,50 0,39 0,10 0,99 775

2: R04 120 71,0 9,5 63,0 No Extraída ND ND ND ND 875

2: R05 120 71,0 9,5 63,0 No Extraída ND ND ND ND 975

2: R06 120 71,0 9,5 63,0 No Extraída ND ND ND ND 1075

2: R07 120 71,0 9,5 63,0 No Extraída ND ND ND ND 1175

2: R08 120 71,0 9,5 63,0 No Extraída ND ND ND ND 1275

2: R09 120 71,0 9,5 63,0 No Extraída ND ND ND ND 1375

2: R10 120 71,0 9,5 63,0 No Extraída ND ND ND ND 1675

3: R11 118 66,7 8,3 46,7 MM4 0,48 0,38 0,09 0,96 1775

3: R12 116 72,3 9,0 56,0 No Extraída ND ND ND ND 1875

3: R13 119 72,4 9,7 66,0 No Extraída ND ND ND ND 1975

3: R14 130 74,7 10,7 74,0 No Extraída ND ND ND ND 2075

3: R15 134 73,4 9,9 65,0 No Extraída ND ND ND ND 2175

3: R16 114 72,4 9,7 67,0 No Extraída ND ND ND ND 2275

3: R17 113 70,2 9,4 61,0 No Extraída ND ND ND ND 2375

3: ND ND ND ND ND MM5 0,47 0,37 0,09 0,94 2675

Segmento 1 Diagnóstico Segmento 2 Temperatura de Secador y Variación de Velocidad LinealSegmento 3 Porosidad y Variación de espesor – Membrana de partida

Tabla 5C

Condiciones de la Cámara de UV

PROCESO T – POROSIDAD/ESPESOR/TEMPERATURA DEL SECADOR VMF4, VELOCIDAD LINEAL

1: NA 20 20 NA ND ND ND ND ND

1: NA 20 20 NA ND ND ND ND ND

1: NA 20 20 NA ND ND ND ND ND

1: R01 20 20 18 10/9,5 0,9 1,4 1,0 52,0

1: R02 20 20 20 10/9,5 0,9 1,4 1,0 77,0

2: R03 20 20 22-20 10/9,5 0,9 1,4 1,0 78,0

2: R04 20 20 18 10/9,5 0,9 1,4 1,0 44,0

2: R05 20 20 18 10/9,5 0,9 1,4 1,0 32,0

2: R06 20 20 18 10/9,5 0,9 1,4 1,0 32,0

2: R07 20 20 22-20 10/9,5 0,9 1,4 1,0 30,0

2: R08 20 20 18 10/9,5 0,9 1,4 1,0 26,0

2: R09 20 20 18-20 10/9,5 0,9 1,4 1,0 20,0

2: R10 20 20 20 10/9,5 0,9 1,4 1,0 22,0

3: R11 20 20 20 10/9,5 0,9 1,4 1,0 38,0

3: R12 20 20 20 10/9,5 0,9 1,4 1,0 34,0

3: R13 20 20 20 10/9,5 0,9 1,4 1,0 41,0

3: R14 20 20 20 10/9,5 0,9 1,4 1,0 21,0

3: R15 20 20 20 10/9,5 0,9 1,4 1,0 21,0

3: R16 20 20 20 10/9,5 0,9 1,4 1,0 21,0

3: R17 20 20 20 10/9,5 0,9 1,4 1,0 21,0

3: ND ND ND ND ND ND ND ND ND

Tabla 5D

SegmentodeProceso: Nº de Proceso Humidificacióncon Agua Verificación de laVelocidad Humidificacióncon Agua Verificación de Red-X Uniforme Humidificacióncon Agua Verificación de Paso Nivel de MoteadoVerificación Opacidad/ TransparenciaVerificación HumidificaciónSalinaTiempoSegundos HumidificaciónSalinaTiempoSegundos HumidificaciónSalinaTiempoSegundos HumidificaciónSalinaTiempoSegundos Fluorescencia BKG RFU Control de Calidad de Transferencia Aprobado/Reprobado Transferencia de Western Lisado Vivo

1: ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

1: ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

1: ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

1: R01 Y Y Y Y Y 2,4/5,6 3,4/6,2 3,1/6,2 3,0/6,0 N/Disponible. N/Disponible. NC

1: R02 Y Y Y Y Y 2,9/12,6 3,2/11,4 2,9/2,9 3,0/9,0 N/Disponible. N/Disponible. NC

2: R03 Y Y Y Y Y 1,1/24,1 1,4/10,8 1,1/4,1 1,2/13,0 N/Disponible. N/Disponible. NC

2: R04 Y Y Y Y Y 1,2/14,5 1,5/19,9 1,3/5,6 1,3/13,3 N/Disponible. N/Disponible. NC

2: R05 Y Y Y Y Y 1,3/10,5 1,5/15,4 1,3/4,2 1,4/10,0 N/Disponible. N/Disponible. NC

2: R06 Y Y Y Y Y 1,3/24,7 1,4/9,5 1,3/4,0 1,3/12,7 N/Disponible. N/Disponible. NC

2: R07 Y Y Y Y Y 2,5/60,0 2,3/25,4 2,5/5,4 2,4/30,0 N/Disponible. N/Disponible. NC

2: R08 Y Y Y Y Y 2,1/9,7 2,6/14,0 2,6/5,5 2,8/9,7 N/Disponible. N/Disponible. NC

2: R09 Y Y Y Y Y 2,8/13,1 3,5/22,6 2,5/5,9 2,9/9 3,9 N/Disponible. N/Disponible. NC

2: R10 Y Y Y Y Y 3,1/28,7 3,5/15,7 2,5/7,1 3,0/17,2 N/Disponible. N/Disponible. NC

3: R11 Y Y Y Y Y 24,1 6,5 4,2 11,6 N/Disponible. N/Disponible. NC

3: R12 Y Y Y Y Y 47,1 35,7 8,6 30,5 N/Disponible. N/Disponible. NC

3: R13 Y Y Y Y Y 67,9 70,7 34,5 57,7 N/Disponible. N/Disponible. NC

3: R14 Y Y Y N(ALTO) N (Blanco) >180 >180 >180 >180 N/Disponible. N/Disponible. NC

(continuación)

3: R15 Y Y Y N(ALTO) N (Blanco) >180 >180 >180 >180 N/Disponible. N/Disponible. NC

3: R16 Y Y Y N(ALTO) Y >180 57,3 16,4 >180 N/Disponible. N/Disponible. NC

3: R17 Y Y Y Y Y 19,3 40,8 5,1 21,7 N/Disponible. N/Disponible. NC

3: ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

Ejemplo 3

El protocolo usado para la transferencia de Western y para la detección quimioluminiscente es el siguiente:

•: Las muestras de proteínas se separan electroforéticamente usando un gel en gradiente midi Bis:Tris (4�12 %) (Invitrogen, WG1402BOX).

•: Las muestras se electro-transfieren a 45 V durante 1h 15m usando un aparato de transferencia de tanque BioRad (Criterio de Transferencia Nº 165-6024) sobre una membrana hidrófila preparada como se indica en el Ejemplo 1.

•: Las manchas se lavan 2x (3 min cada una) en TBS-T (Tween al 0,1 %)

•: Las manchas se bloquean durante 1 h a TA en TBS-T con NFM (leche descremada, non fat milk , Carnation) al 3 %

•: Las manchas se lavan 2x (3 min cada una) en TBS-T (Tween al 0,1 %)

•: Las manchas se incuban con anticuerpo primario en TBS-T durante 1 h.

•: Las manchas se lavan 3x (5 min cada una) en TBS-T (Tween al 0,1 %)

•: Las manchas se incuban con anticuerpo secundario en TBS-T durante 1 h.

•: Las manchas se lavan 4x (5 min cada una) en TBS-T (Tween al 0,1 %)

•: Las bandas de proteínas se visualizan usando ECL (Millipore Immobilon-HRP) y película de rayos X.

Este protocolo se usó sobre las muestras preparadas en el Ejemplo 2 y los resultados de la transferencia se muestran en las Figuras 1, 2 y 3.

Los resultados de la transferencia de Western de un proceso de desarrollo típico demuestran las diferencias de rendimiento entre la membrana de transferencia de PVDF hidrófila de la presente invención y los controles (membrana FL – hidrófoba de PVDF y membrana NC – Whatman/S y S BA-85). En las figuras, cada tira horizontal contiene 5 manchas de transferencia de Western separadas; tres manchas en muestras de desarrollo de PVDF hidrófila y una mancha en cada una de las membranas de control. Cada tira de 5 manchas Western es el resultado de un experimento de electroforesis y de transferencia (se procesaron 5 geles en cada experimento). Por diseño, cada experimento representa condiciones idénticas con idénticas cantidades de muestra de proteína (aplicada en 4 carriles a través de cada gel) antes de la electroforesis y transferencia. Los resultados mostrados son las manchas de transferencia para la detección de 2 proteínas (HSP70 y GAPDH) de una mezcla de muestra compleja (lisado), aplicada a sólidos de muestra en disminución (concentraciones), de derecha a izquierda y correspondiente a: 5 ug, 2,5 ug, 1,25 ug, 0,67 ug.

Obsérvese que en cada fila, se compara el resultado de una sola electroforesis y experimento de electrotransferencia, tres membranas de transferencia hidrófilas de la presente invención, con dos membranas de transferencia de control. Un control consiste en una membrana de transferencia de nitrocelulosa (NC) y el otro control es una membrana de transferencia de PVDF hidrófoba (FL). En el caso de cada experimento individual, la membrana de FL demuestra que existe una intensidad de señal más alta para las cuatro titulaciones de la solución de proteína analito, y la membrana de NC demuestra una intensidad de señal más baja. Puede observarse, cuando se comparan los tramos de señal entre las membranas de transferencia de control de NC y las membranas de transferencia de PVDF hidrófilas de la invención, que a titulaciones de muestra analito más altas (lado izquierdo de cada mancha) las membranas de NC y las de PVDF hidrófilas presentan tramos de señal similares. Sin embargo, con el avance a titulaciones de muestra analito cada vez menores (progresando de izquierda a derecha), los tramos de señal disminuyen más rápidamente para la membrana de NC. Esto demuestra que, comparada con la membrana de NC, la membrana de PVDF hidrófila permite una detección de muestra a menores concentraciones de proteína.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una membrana porosa que comprende una membrana de sustrato polimérico, estando dicha membrana de sustrato polimérico formada por un polímero seleccionado de polímeros de sulfona aromáticos, politetrafluoroetileno, polímeros termoplásticos perfluorados, polímeros poliolefínicos, polietileno de ultra-alto peso molecular, poliamidas y fluoruro de polivinilideno y caracterizada por que tiene su superficie provista de un revestimiento polimérico reticulado hidrófilo que comprende acrilamida y metilen-bis-acrilamida y porque puede producirse a partir de una solución de reactante que contiene del 0,20 al 2,0 % de acrilamida y del 0,20 % al 2,00 % de metilen-bis-acrilamida, y en la que:

dicha superficie tiene una capacidad de unión a proteína de 250-325 !g/cm2; el nivel medio de carbono orgánico total de dicha membrana es inferior a 1,5 !g/cm2; y los niveles de monómero extraíble son inferiores a 0,02 !g/cm2 para la acrilamida e inferiores a 0,15 !g/cm2 para la metilen-bis-acrilamida.
2.

La membrana porosa de cualquier reivindicación anterior, en la que dicho sustrato tiene un valor de fluorescencia de fondo, y en donde dicha membrana modificada presenta una fluorescencia de fondo que es el doble de la del valor de fluorescencia de fondo de dicho sustrato en condiciones de medida idénticas.
3.

La membrana porosa de cualquier reivindicación anterior, en la que dicho sustrato de membrana comprende fluoruro de polivinilideno.
4.

La membrana porosa de la reivindicación 1, en la que la proporción de acrilamida con respecto a metilen-bisacrilamida de la solución de reactante monomérica es de 1:1 (masa/masa).
5.

La membrana porosa de cualquier reivindicación anterior, en la que la concentración de monómero global de la solución de reactante monomérica de acrilamida : metilen-bis-acrilamida es entre el 0,5 % y el 1,5 % en masa.
6.

La membrana porosa de cualquier reivindicación anterior, que tiene un nivel de fotoiniciador entre el 0,01 % y el 0,20 %.
7.

Un procedimiento para preparar una membrana porosa, hidrófila, comprendiendo dicho procedimiento:

proporcionar un sustrato de membrana porosa hidrófoba formado a partir de un polímero seleccionado de polímeros de sulfona aromáticos, politetrafluoroetileno, polímeros termoplásticos perfluorados, polímeros poliolefínicos, polietileno de ultra-alto peso molecular, poliamidas y fluoruro de polivinilideno; poner en contacto la superficie de dicha membrana porosa con una solución de reactante monomérica y un fotoiniciador; retirar dicha membrana de la solución de reacción; retirar la solución de reacción sobrante; polimerizar dicha solución de reactante en condiciones anaerobias directamente sobre toda la superficie de membrana porosa hidrófoba para formar un revestimiento hidrófilo continuo; y secar dicha membrana.

caracterizado por que dicha solución de reactante monomérica comprende del 0,20 % al 2,00 % de acrilamida y del 0,20 % al 2,00 % de metilen-bis-acrilamida, para formar así una membrana porosa que tiene:

una capacidad de unión a proteína de dicha superficie de 250 - 325 !g/cm2; un nivel medio de carbono orgánico total de dicha membrana inferior a 1,5 !g/cm2; y niveles de monómero extraíble inferiores a 0,02 !g/cm2 para la acrilamida e inferiores a 0,15 !g/cm2 para la metilen-bis-acrilamida.
8.

El procedimiento de la reivindicación 7, en el que las cantidades de acrilamida y de metilen-bis-acrilamida en dicha solución de reacción son, respectivamente, del 0,50 % y del 0,40 %.
9.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en el que la cantidad de fotoiniciador en dicha solución de reacción está comprendida entre el 0,01 % y el 0,20 %.
10.

El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la cantidad de fotoiniciador en dicha solución de reacción es del 0,10 %.
11.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el fotoiniciador es Irgacure 2959 (marca registrada).

Figura 1 Resultados de transferencias de Western del proceso R.

Los resultados corresponden a las condiciones del proceso proporcionadas en la Tabla 1. Figura 2. Resultados de transferencias de Western del proceso S

Los resultados corresponden a las condiciones del proceso proporcionadas en la Tabla 2. Figura 3 Resultados de transferencias de Western del proceso T

Los resultados corresponden a las condiciones del proceso proporcionadas en la Tabla 3