ES2380695T3

ES2380695T3 - Muestreador automatizado de semillas y procedimiento de muestreo, ensayo y aumento de semillas

Info

Publication number: ES2380695T3
Application number: ES07016960T
Authority: ES
Inventors: Kevin Deppermann; Qiang Zhang; Terri B. Hinchey; Michael W. Petersen; Sam Eathington; David Butruille; Heather M. Forbes; John Tamulonis; Bruce Schnicker
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2004-08-26
Filing date: 2005-08-26
Publication date: 2012-05-17
Anticipated expiration: 2025-08-26
Also published as: US10775275B2; CN102754543A; US8561346B2; EP1786261A2; ZA200701589B; EP2798947B1; US8436225B2; CN102742394A; US20200371002A1; CN102742394B; US20060046244A1; ATE542419T1; EP1786261A4; CN101080165B; US20100086963A1; US20100196950A1; EP1869961A3; US20090025288A1; US7611842B2; WO2006026466A2

Abstract

Un procedimiento automatizado para analizar semillas en una población de semillas que tienen diferencias genéticas, comprendiendo el procedimiento: aislar semillas individuales de la población de semillas; colocar las semillas individuales aisladas en un portasemillas; cortar muestras de tejido que comprendan células con ADN de las semillas individuales asiladas y colocadas en el portasemillas usando un muestreador de semillas automatizado mientras se mantiene la viabilidad de germinación de las semillas; cribar el ADN extraído de la muestra para la presencia o ausencia de un marcador genético; seleccionar semillas de la población basándose en los resultados del cribado de ADN; y cultivar plantas a partir de la semilla seleccionada.

Description

Muestreador automatizado de semillas y procedimiento de muestreo, ensayo y aumento de semillas

Antecedentes de la invenciÃ³n

La invenciÃ³n se refiere a procedimientos, para tomar muestras de materiales biolÃ³gicos tales como semillas.

En el desarrollo y mejora de las plantas, se han llevado a cabo mejoras genÃ©ticas en las plantas, bien mediante cultivo o manipulaciÃ³n genÃ©tica, y cuando se consigue una mejora deseable, se desarrolla una cantidad comercial plantando y recolectar semillas a lo largo de varias generaciones. No todas las semillas expresan los rasgos deseados, y de este modo estas semillas deben ser elimiadas de la poblaciÃ³n. Para acelerar el procedimiento de aumentar el volumen de la poblaciÃ³n, las muestras estadÃsticas se toman y ensayan para eliminar semillas de la poblaciÃ³n que no expresan adecuadamente el rasgo deseado. Sin embargo, este muestreo estadÃstico permite necesariamente que algunas semillas sin el rasgo deseable permanezcan en la poblaciÃ³n, y asimismo puede excluir accidentalmente algunas semillas con el rasgo deseable de la poblaciÃ³n deseada.

El documento de POST VON REBECKA ET AL. : “A high-throughput DNA extraction methods for barely seed” EUPHYCA, vol 130, nÂº 2, 1 de Enero 2003, pÃ¡ginas 255-260, divulga un protocolo rÃ¡pido de extracciÃ³n de ADN para analizar muestras tomadas de semillas. Describe la perforaciÃ³n manual de orificios a travÃ©s de las semillas para retirar muestras de las semillas.

Los documentos de MCCARTHY PAUL ET AL.: “Rapid identification of transformed wheat using a half-seed PCR assay” BITECHNIQUES; vol 32, nÂº 3 marzo 2002, pÃ¡ginas 560-654, y CHUNGWONGSE J ET AL.: “Pre-germination genotyping screening using PCR amplification of half-seeds” THEORETICAL AND APPLIEDGENETICS, vol. 86, nÂº 6, 1 de enero de 1993, pÃ¡ginas 694-698, divulgan un procedimiento selecciÃ³n basado en PCR para evaluar semillas cortadas por la mitad.

Sumario de la invenciÃ³n

La presente invenciÃ³n se refiere a procedimientos para muestrear de manera no destructiva material de semillas. Los procedimientos se adaptan particularmente a la automatizaciÃ³n, lo cual permite un mayor muestreo respecto de la prÃ¡ctica anterior. Con el muestreo no destructivo automatizado permitido por al menos algunas de las realizaciones de la invenciÃ³n, es posible ensayar cada semilla de la poblaciÃ³n, y eliminar las semillas que no expresan el rasgo deseado. Esto acelera en gran medida el proceso de aumento de volumen de una poblaciÃ³n de semillas dada, y puede dar como resultado una poblaciÃ³n final mejorada.

Las realizaciones de la invenciÃ³n facilitan el ensayo de la mayorÃa sino todas las semillas de una poblaciÃ³n antes de plantar, de manera a no desperdiciar el tiempo y los recursos en la cultivo de plantas sin los rasgos deseados.

SegÃºn el procedimiento de la invenciÃ³n, las semillas se alimentan individualmente a una estaciÃ³n de muestreo; y se mantienen en la estaciÃ³n de muestreo mientras se toma una muestra de la semilla. Cada muestra es transportada a al menos un compartimento individual en una bandeja de muestras, y cada semilla se transporta a un compartimento en una bandeja de muestras con una relaciÃ³n conocida con el o los compartimentos de la bandeja de muestras al cual se transportÃ³ la muestra correspondiente. La muestra se puede ensayar, y las velocidades se pueden reducir basÃ¡ndose en los resultados de los ensayos.

Generalmente, el sistema para llevar a cabo el procedimiento de la invenciÃ³n comprende: una estaciÃ³n de muestreo; un muestreador para retirar material de una semilla en la estaciÃ³n de muestreo; un transportador de semillas para transportar la semilla desde la estaciÃ³n de muestreo a un compartimento en una bandeja de semillas; y un transportador para transportar el material retirado de la semilla a un compartimento en una bandeja de muestras.

Este procedimiento de la invenciÃ³n facilita el muestreo automatizado no destructivo de semillas. Permite el ensayo y la clasificaciÃ³n de grandes volÃºmenes de semillas, facilitando de este modo el aumento de volumen de la poblaciÃ³n de semillas con rasgos deseables. Esta y otras caracterÃsticas y ventajas serÃ¡n en parte evidentes, y en parte seÃ±aladas en lo sucesivo.

Breve descripciÃ³n de los dibujos

La figura 1 es una vista en perspectiva ampliada de una primera realizaciÃ³n de un sistema muestreador de semillas para llevar a cabo el procedimiento de esta invenciÃ³n;

La figura 2 es una vista en perspectiva ampliada del conjunto muestreador de semillas del sistema muestreador de semillas;

La figura 3 es una vista en perspectiva ampliada de la tolva y el mecanismo de alimentaciÃ³n de semillas del conjunto muestreador de semillas

La figura 4 es una vista en perspectiva del husillo para raspar muestras de las semillas; La figura 5 es una vista en perspectiva de la corredera para conducir el husillo; La figura 6 es una vista en perspectiva del pistÃ³n en el mecanismo de alimentaciÃ³n de la tolva; La figura 7 es una vista en perspectiva de un piso con una pluralidad de bandejas de semillas y bandejas de

muestras montadas en las mismas; La figura 8 es una vista en perspectiva del mecanismo de traslaciÃ³n bidimensional. La figura 9 es una vista en perspectiva de la entrada del transportador de semillas. La figura 10 es una vista en perspectiva de la salida del transportador de semillas. La figura 11 es una vista en perspectiva de la salida del transportador de muestras. La figura 12 es una vista en perspectiva del multiplicador de aire usado en los transportadores de semillas y

muestras;

La figura 13 es una vista superior en planta de un sistema muestreador de semillas de alto rendimiento para llevar a

cabo el procedimiento de esta invenciÃ³n;

La figura 14 es una vista en alzado lateral del sistema muestreador de semillas de alto rendimiento;

La figura 15 es una vista en perspectiva frontal del sistema muestreador de semillas de alto rendimiento;

La figura 16 es una vista en perspectiva posterior del sistema muestreador de semillas de alto rendimiento;

La figura 17 es una vista en perspectiva de la estaciÃ³n de muestreo del sistema muestreador de semillas de alto

rendimiento;

La figura 18A es una vista en perspectiva parcial de una porciÃ³n de la estaciÃ³n de muestreo de semillas, con el husillo retraÃdo; La figura 18B es una vista en perspectiva parcial de una porciÃ³n de la estaciÃ³n de muestreo de semillas, con el

husillo extendido;

La figura 19A es una vista en alzado lateral de la estaciÃ³n de muestreo de semillas, con el husillo en su posiciÃ³n retraÃda; La figura 19B es una vista en alzado lateral de la estaciÃ³n de muestreo de semillas, con el husillo en su posiciÃ³n

extendida; La figura 20 es una vista en secciÃ³n transversal longitudinal de la estaciÃ³n de muestreo de semillas; La figura 21 es una vista en alzado de extremo frontal de la estaciÃ³n de muestreo de semillas; La figura 22 es una vista en secciÃ³n transversal transversal de la estaciÃ³n de muestreo de semillas; La figura 23A es una vista en alzado lateral de la rueda de selecciÃ³n de semillas; La figura 23B es una vista de despiece ordenado de la rueda de selecciÃ³n de semillas; La figura 23C es una vista en secciÃ³n transversal vertical de la rueda de selecciÃ³n de semillas; La figura 24 es una vista en alzado frontal del mecanismo de alimentaciÃ³n; La figura 25 es una vista en alzado lateral del mecanismo de alimentaciÃ³n; La figura 26A es una vista en perspectiva del mecanismo de alimentaciÃ³n; La figura 26B es una vista en alzado lateral del mecanismo de alimentaciÃ³n; La figura 26C es una vista en secciÃ³n transversal longitudinal del mecanismo de alimentaciÃ³n, tomada a lo largo del

plano de la lÃnea 26C-26C en la figura 26B; La figura 26D es una vista en planta inferior del mecanismo de alimentaciÃ³n; La figura 27A es una vista en secciÃ³n transversal longitudinal vertical del mecanismo de muestreo;

La figura 27B es una vista en secciÃ³n transversal vertical parcial ampliada del mecanismo de muestreo mostrado en la figura 27A;

La figura 28A es una vista en secciÃ³n transversal transversal vertical del mecanismo de muestreo;

La figura 28B es una vista en secciÃ³n transversal parcial ampliada del mecanismo de muestreo mostrado en la figura 28A; y

La figura 29 es un alelograma que representa muestras de tejido del endospermo del maÃz que han experimentado PCR para la detecciÃ³n de un polimorfismo SNP particular.

DescripciÃ³n detallada de las realizaciones preferidas

Una primera realizaciÃ³n de un sistema muestreador automatizado de semillas para el rendimiento del procedimiento de la invenciÃ³n se indica generalmente mediante 20 en la figura 1. El sistema muestreador de semillas 20 se adapta para asilar una semilla de una tolva, alimentarla a una estaciÃ³n de muestreo, rascar una muestra de la semilla, transportarla muestra a un recipiente de semillas, y transportar la semilla a un recipiente de semillas correspondiente. Como se muestra en la figura 1, el sistema muestreador de semillas comprende un soporte 22, un bastidor 24 sobre el soporte; un conjunto muestreador 26, un piso 28 montado sobre un mecanismo de traslaciÃ³n bidimensional 30, un transportador de semillas 32 para transportar semillas desde el conjunto muestreador de semillas, y un transportador de semillas 34 para transportar una muestra retirada de una semilla al conjunto muestreador de semillas.

Como se muestra en la figura 1, en la primera realizaciÃ³n preferida, el soporte 22 comprende una carretilla con ruedas 40, que tiene cuatro montantes verticales 42 conectados por miembros longitudinales superior e inferior 44 y 46, en la parte delantera y frontal, y por miembros transversales superior e inferior 48 y 50 en los lados izquierdo y derecho, y una mesa 52 montada sobre el mismo. Una rueda 54 se puede montar en la parte inferior de cada montante 42 para facilitar el desplazamiento del soporte 22. Los detalles de la construcciÃ³n del soporte 22 no son crÃticos para la invenciÃ³n, y por lo tanto el soporte 22 podrÃa tener alguna otra configuraciÃ³n.

Como se muestra tambiÃ©n en la figura 1, el bastidor 24 comprende cuatro vÃ¡stagos de extensiÃ³n vertical 60 sobre la mesa 52, que soportan una placa 62 generalmente horizontal. El conjunto muestreador 26 se monta sobre la placa 62, como se describe mÃ¡s en detalle en lo sucesivo. Un Ã¡rbol 64 se monta tambiÃ©n sobre la placa, y se extiende generalmente en horizontal desde la misma. El extremo libre del Ã¡rbol 64 tiene un primer y un segundo montantes verticales 66 y 68 para montar un transportador de semilla 32 y partes del transportador de muestras 34, respectivamente. Los detalles de la construcciÃ³n del bastidor 24 no son crÃticos para la invenciÃ³n, y de este modo el bastidor podrÃa tener alguna otra configuraciÃ³n.

Como se muestra en las figuras 1 y 2, el conjunto muestreador 28 se monta sobre la placa 62 del bastidor 24. El conjunto de muestras comprende un silo o tolva 70, una estaciÃ³n de muestreo 72, y un mecanismo de alimentaciÃ³n 74 para proporcionar una Ãºnica semilla desde la tolva 70 a la estaciÃ³n de muestreo.

Como se muestra en las figuras 1 y 3, el piso 28 se adapta para montar de manera segura una pluralidad de bandejas de semillas 80 y bandejas de muestras 82 en posiciones y orientaciones fijas. Cada una de las bandejas de semillas 80 y bandejas de muestras 82 se divide preferiblemente en una pluralidad de compartimentos. El nÃºmero y las disposiciones de los compartimentos en las bandejas de semillas 80 corresponden preferiblemente al nÃºmero y las disposiciones de los compartimentos en las bandejas de muestras 82. Esto facilita la correspondencia unÃvoca entre una semilla y su muestra. Sin embargo, en algunas realizaciones puede ser deseable proporcionar mÃºltiples compartimentos en la bandeja de muestras para cada compartimento en la bandeja de semillas, por ejemplo donde se pueden efectuar mÃºltiples ensayos en las muestras, o donde se pueden tomar diferentes muestras de la misma semilla (por ejemplo, muestras de diferentes profundidades).

El piso 28 se monta sobre un mecanismo de traslaciÃ³n bidimensional 30, que en esta realizaciÃ³n preferida comprende una base 90 con un primer accionador lineal 92 que tiene un carro desplazable 94 montado sobre una base 90, y un segundo accionador lineal 96, que tiene un carro 98 montado sobre el carro 94 del primer accionador lineal 92. El piso 28 se monta sobre el carro 98 del segundo accionador lineal 96, y de este modo se puede desplazar con precisiÃ³n en dos dimensiones a travÃ©s del funcionamiento del primer y del segundo accionadores lineales 92 y 96.

El transportador de semillas 32 comprende un tubo 100 con un extremo de entrada 102 adyacente a la estaciÃ³n de muestreo 72, y un extremo de salida 104 montado sobre el montante 66 del bastidor 24. Hay un primer dispositivo Venturi 106 en el extremo de entrada 102 del tubo 100 para inducir un flujo de aire en el tubo hacia el extremo de salida 104 del tubo, y un segundo dispositivo Venturi 108 en el extremo de salida 104 del tubo 100 para inducir un flujo de aire hacia el extremo de entrada 102 del tubo. El primer dispositivo Venturi 106 se usa para crear un flujo de aire en el tubo y extraer una semilla de la estaciÃ³n de muestreo dentro del tubo a lo largo del primer extremo. El segundo dispositivo Venturi 108 se usa entonces para crear un flujo de aire en la direcciÃ³n opuesta, ralentizando la semilla para reducir el potenciar de daÃ±o a la semilla cuando sale por el extremo de salida 104 del tubo y se

suministra a un compartimento en la bandeja. En esta realizaciÃ³n preferida, el segundo Venturi 108 detiene efectivamente el movimiento de la semilla, permitiÃ©ndole por gravedad en su compartimento en una bandeja 90. Varios sensores de posiciÃ³n pueden disponerse sobre el tubo 100 para detectar la presencia de la semilla, y confirmar el funcionamiento apropiado del transportador de semillas 32.

El transportador de muestras 34 comprende un tubo 120 con un extremo de entrada 122 adyacente a la estaciÃ³n de muestreo 72, y un extremo de salida 124 montado en el montante 68 del bastidor 24. Hay un primer dispositivo Venturi 126 en el extremo de entrada 122 del tubo 120 para inducir un flujo de aire en el tubo hacia el extremo de salida 124 del tubo. Se dispone un separador 128 en el extremo de salida para separar el material de muestra de la corriente de aire que lo lleva, de manera que la corriente de aire no saque la muestra del compartimento en la bandeja 92. El separador contiene asimismo preferiblemente un filtro para evitar la contaminaciÃ³n cruzada de las muestras.

Como se muestra en la figura 2, el conjunto de muestreo de semillas 26 se adapta para montarse en la placa 62 sobre un montante 140. El conjunto de muestreo de semillas 26 comprende una placa de montaje de tolva 142, una placa de montaje de corredera 144 y cuatro soportes separados de corredera 146 entre medias de las mismas. La tolva 70 (mostrado en la figura 3), que alimenta semillas individuales a una estaciÃ³n de muestreo 72, se monta sobre la placa de tolva 142. La estaciÃ³n de muestreo 72 comprende un nido de semilla 148 montado en un montaje de nido 150, que estÃ¡ soportado desde la placa de montaje de corredera 144 por un par de separadores 152. El nido 148 tiene un rebaje que se abre a su superficie inferior, dentro del cual la tolva 70 alimenta una Ãºnica semilla. Hay una ranura en la parte superior del nido de semillas 148 a travÃ©s de la cual se expone una porciÃ³n de una semilla en el rebaje. Un husillo 154 (figura 4) se monta en el portahusillo 156 que se monta sobre una placa de transiciÃ³n de corredera 158 sobre una corredera programable 160, con un bloque de sujeciÃ³n de husillo 162. La corredera programable 160 (figura 5) se monta sobre la parte inferior de la placa de montaje de corredera 144, y desplaza el husillo 154 a travÃ©s de la ranura en el nido de semillas 148 para retirar una muestra de una semilla en el rebaje en el nido de semillas.

Como se observa mejor en la figura 4, el husillo 154 tiene una pluralidad de dientes 164 que aumentan en altura hacia el extremo proximal, de manera que a medida que el husillo 154 avanza en la ranura, corta cada vez mÃ¡s profundamente en la semilla en el rebaje en el nido 148. El rebajado gradual resultante reduce el daÃ±o a la semilla, protegiendo su viabilidad. AdemÃ¡s, como se describe mÃ¡s en detalle en lo sucesivo, cortando a diferentes profundidades en momentos diferentes, las muestras de diferentes profundidades de la misma semilla se pueden separar para anÃ¡lisis separados.

Un tubo de transferencia de muestras 166 se extiende desde el rebaje en el nido de muestras 148, y tiene un conector 168 sobre su extremo para su conexiÃ³n al transportador de muestras 34.

La estaciÃ³n de muestreo 26 incluye asimismo una tolva 70, que se observa mejor en la figura 3. La tolva 70 comprende placas de montaje de tolva izquierda y derecha 170 y 172, y una placa de montaje de cilindro 174 y un soporte de cilindro superior 176. La tolva 70 tiene asimismo un panel frontal 178, un panel trasero180, un primer y un segundo paneles de extremo 182 y 184, y un fondo 186. Un divisor 188 divide la tolva en un primer y un segundo compartimentos 190 y 192. El primer compartimento 190 contiene un suministro de semillas que se transfieren individualmente al segundo compartimento 192.

Un accionador de pistÃ³n 194 acciona un pistÃ³n 196 para extraer una semilla del primer compartimento. Un conjunto de chorro de aire 198 transfiere una semilla desde el extremo del pistÃ³n 196 al segundo compartimento 192. El segundo compartimento tiene un fondo conformado 200 con un pocillo 202 para recibir la semilla y colocarla. Un accionador de pistÃ³n 210 acciona un pistÃ³n 214 para extraer una semilla del segundo compartimento 192. Un conjunto de chorro de aire 216 se usa para agitar las semillas durante el procedimiento de recogida de semillas.

Como se muestra en la figura 7, el piso 28 tiene soportes 220 para montar las bandejas de semillas 90 y las bandejas de muestras 92 en registro de manera que el transportador de semillas y el transportador de muestras suministren semillas y muestras a los compartimentos correspondientes, en las bandejas respectivas. Las bandejas de muestras 92 pueden (como se muestra) adaptarse para contener viales individuales. Evidentemente, se pueden usar bandejas de diferentes configuraciones, por ejemplo donde mÃºltiples compartimentos estÃ¡n provistos de mÃºltiples muestras de la misma semilla. Por ejemplo, donde una muestra se divide en varias muestras, o donde las muestras se separan del emplazamiento donde se han tomado, por ejemplo pro profundidad.

Como se muestra en la figura 8, el mecanismo de traslaciÃ³n bidimensional 30 incluye asimismo un cursor 230 que tiene un carril 232 y un carro 234, que se posiciona en paralelo al primer accionador lineal 92. El segundo accionador 96 se monta sobre el carro 96 que tiene el carro 98 montado sobre el carro 94 del primer accionador lineal 92. El piso 28 se monta sobre el carro 98 del segundo accionador lineal 96, y de este modo se puede desplazar con precisiÃ³n en dos dimensiones a travÃ©s del funcionamiento del primer y el segundo accionadores lineales 92 y 96. Bajo el control apropiado, el mecanismo de traslaciÃ³n puede alinear compartimentos individuales de las bandejas de semillas 90 y las bandejas de muestras 92 con las salidas del transportador de semillas y el transportador de muestras.

Como se muestra en la figura 9 en el extremo de entrada 102 del tubo 100 del transportador de semillas 32, un soporte 240 monta un amplificador de aire 242 y un tubo de sensores de semillas 244. El soporte 240 comprende secciones 246, 248, 250, 252 y 254. Como se muestra en la figura 2¸el soporte 240 se monta en la placa de montaje de tolva 142. El amplificador de aire 242 (mostrado en la figura 12) se adapta para conectarse a una fuente de aire comprimido. Cuando se aplica aire al amplificador de aire, se induce un flujo de aire a travÃ©s del tubo 100, empleando el efecto Venturi. El tubo sensores 244 lleva sensores de semillas 256 para detectar l paso de una semilla a travÃ©s del mismo. Los sensores 256 son preferiblemente sensores Ã³pticos alineados con aberturas en el tubo de sensores 244 que detectan Ã³pticamente el paso de una semilla.

Como se muestra en la figura 10, un conjunto de descarga de semillas 260 se dispone en el extremo de salida 104 del tubo 100 del transportador de semillas 32. El conjunto de descarga se monta sobre el montante 66, con un soporte 262 y un soporte de descarga 264. El tubo de sensores de semillas 266 se monta en el soporte 262, y lleva sensores de semillas 268 para detectar el paso de una semilla a travÃ©s del mismo. Los sensores 268 son preferiblemente sensores Ã³pticos alineados con aberturas en el tubo de sensores 266 que detectan Ã³pticamente el paso de una semilla. Un amplificador de aire 270 se conecta al tubo de sensores de semillas 266. El amplificador de aire 270 (Figura 12) se adapta para conectarse a una fuente de aire comprimido. Cuando se aplica aire comprimido al amplificador de aire, se induce un flujo de aire a travÃ©s del tubo 100, empleando el efecto Venturi. Por debajo del amplificador de aire270 se encuentra un tubo de conector 272, y por debajo del mismo hay un tubo de descarga de semilla ventilado 274, que estÃ¡ asimismo soportado por un porta-tubo de descarga de semillas 276, llevado sobre un accionador de tubo de descarga de semilla 278.

El extremo de entrada 122 del tubo 120 del transportador de semillas 34 se conecta mediante 168 al tubo de descarga de muestras 166. Como se muestra en la figura 11, el extremo de salida 124 del tubo 120 se conecta a un conector de muestra 280, que a su vez se conecta al amplificador de aire 282, que se conecta al conjunto de boquilla de fragmentos 284. El conjunto de boquilla de fragmentos 284 se monta sobre el porta-tubo de descarga de semilla 286, que es llevado sobre un accionador de descarga 288 El accionador de descarga se monta sobre el montante 68. Los filtros 290 se montan sobre las salidas del conjunto de boquilla de chip 284, para evitar que las muestras que se estÃ¡n descargando contaminen los otros compartimentos.

Funcionamiento del sistema muestreador

En funcionamiento, una pluralidad de semillas, por ejemplo semillas de soja, se depositan en la tolva 70. El mecanismo de alimentaciÃ³n de semillas 74 transporta una semilla individual a la estaciÃ³n de muestreo 72. En la estaciÃ³n de muestreo, se retira una muestra de material de la semilla de manera a reducir al mÃnimo el impacto sobre la viabilidad de la semilla.

La muestra se retira de la estaciÃ³n de muestreo 74 por el transportador de muestras 34. El dispositivo Venturi 126 crea un flujo de aire en el tubo 120 hacia el extremo de salida 124. El material de muestra es arrastrado dentro del tubo y hacia el compartimento de la bandeja de muestras alineada con el extremo de salida 124 del tubo 120. El separador 128 separa la muestra de la corriente de aire que la lleva, y permite que la muestra caiga dentro del compartimento. En algunas realizaciones, la muestra se puede distribuir en dos o mÃ¡s compartimentos en la misma bandeja, en cuyo caso el mecanismo de traslaciÃ³n bidimensional 30 se usa para poner uno o mÃ¡s compartimentos adicionales en alineaciÃ³n con la salida 124. Es posible coordinar con precisiÃ³n el movimiento de las bandejas de muestras con el funcionamiento de la estaciÃ³n de muestreo 72 de manera que las muestras de diferentes porciones de la semilla, y en particular diferentes profundidades de la semilla, puedan ser proporcionadas a compartimentos separados en la bandeja de muestras.

DespuÃ©s de terminar el muestreo de la semilla, se acciona el transportador de semillas 32 para retirar la semilla de la estaciÃ³n de muestreo. El primer dispositivo Venturi 106 se acciona para crear un flujo de aire en el tubo y arrastrar una semilla de la extracciÃ³n de muestreo 72 dentro del tubo 100. El segundo dispositivo Venturi 108 se acciona entonces para crear un flujo de aire en la direcciÃ³n opuesta, permitiendo de este modo ralentizar la semilla para reducir el daÃ±o a la semilla a medida que sale por el extremo de salida 104 del tubo 100 y se suministra a un compartimento en la bandeja de semillas 92. El segundo Venturi 108 detiene preferiblemente el movimiento de la semilla, haciendo que caiga por gravedad en su compartimento en una bandeja 90. El funcionamiento del primer y el segundo Venturi 106 y 108 se puede temporizar, o se pueden poner en marcha por sensores de posiciÃ³n que vigilan el tubo 100.

Una realizaciÃ³n de un sistema muestreador de semillas de alto rendimiento se indica generalmente como 500 en las figuras 13-26. Como se muestra en las figuras 13 y 14, el sistema muestreador de semillas 500 comprende una estaciÃ³n de muestreo 502, una estaciÃ³n de manipulaciÃ³n de muestras 504, y una estaciÃ³n de manipulaciÃ³n de semillas 506. Es deseable, pero no esencial, que el sistema muestreador de semillas 500 se ajuste en uno o mÃ¡s carretillas con ruedas que pueden pasar a travÃ©s de puertas convencionales, de manera que el sistema pueda ser transportado de manera convencional. En la realizaciÃ³n preferida, la estaciÃ³n de muestreo de semillas 502 se monta sobre una carretilla 508, la estaciÃ³n de manipulaciÃ³n de muestra se monta sobre una carretilla 510, y la estaciÃ³n de manipulaciÃ³n de semillas se monta sobre una carretilla 512.

La estaciÃ³n de muestreo de semillas 502 comprende un alimentador de semillas 514 y una trituradora 516. Una

pluralidad de columnas 518 se extiende verticalmente hacia arriba desde la superficie 520 de la carretilla 508 Una plataforma 522 se monta sobre la parte superior de unas columnas 518 y soporta la trituradora de semillas 514. Dos soportes en forma de L 524 se extienden horizontalmente desde las columnas 518, y soportan una plataforma 526. Un piso 528 se monta sobre la plataforma 526 por una pluralidad de montantes 530 y soporta el alimentador de semilla 514.

Una pluralidad de pilares 532 se extienden hacia arriba desde la placa 522. Una placa 534 se monta sobre los pilares 532. Una pluralidad de montantes 536 dependen de la placa 534, y soportan un estante 538.

Como se muestra en las figuras 13, 14, 15 y 16, el alimentador de semillas 514 comprende una tolva 550, con una superficie conformada adaptada para alimentar semillas depositadas en la tolva hacia una rueda de separaciÃ³n 552 (vÃ©ase tambiÃ©n las figuras 13A a 23C). La rueda de separaciÃ³n 552 se monta para girar en un plano vertical adyacente a la tolva 550, y tiene una pluralidad de rebajes espaciados 554 que tienen cada uno una abertura 556 en su interior que comunica con un sistema de vacÃo (no mostrado). La rueda 552 avanza con un motor de indexaciÃ³n

560. Las semillas individuales son recogidas por los rebajes 554 en la rueda 552 y mantenidas en los rebajes por succiÃ³n a partir del sistema de vacÃo por las aberturas 556. Una rasqueta 562 elimina las semillas individuales de los rebajes 554, permitiÃ©ndolas caer a travÃ©s de una guÃa 564 dentro de una abertura en un distribuidor 566.

Como se muestra en las figuras 24-26, el distribuidor 566 comprende un Ã¡rbol 568 que tiene una pluralidad (seis en la realizaciÃ³n preferida) de pasos 570 que se extienden transversalmente a travÃ©s del mismo. Las camisas 572 y 574 se montan deslizantemente sobre cada extremo del Ã¡rbol 568 para trasladarse entre la primera posiciÃ³n (interior) y la segunda posiciÃ³n (exterior). Las camisas 572 y 574 tienen una pluralidad de pares de aberturas alineadas 576 y 578 sobre lados opuestos de las mismas. Las aberturas 576 son alargadas y las aberturas 576 y 578 se dimensionan y disponen de manera que cuando las camisas 572 y 574 estÃ¡n en su primera posiciÃ³n 8interior) (en el lado izquierdo en la figura 24), una parte de las aberturas alargadas 576 se alinea con un paso 570 en el Ã¡rbol 568, y cuando las camisas se encuentran en su segundas posiciones (exteriores) una porciÃ³n de las aberturas alargadas 576 y las segunda aberturas 578 se alinean con el paso (en el lado derecho en la figura 24). Un accionador 580 desliza selectivamente las camisas 572 y 574 entre su primera y segunda posiciones.

El distribuidor 566 se monta mediante un soporte 582 sobre el carro 582 de un accionador lineal 586, para trasladar respecto de la guÃa 564, poniendo sucesivamente cada uno de los paso 570 en el Ã¡rbol 568 en alineaciÃ³n con la guÃa 564 para que una semilla se pueda depositar en su interior. Un sensor de semillas (no mostrado) se puede montar adyacente a la guÃa 564 para confirmar que una semilla se deposita en cada paso 570. Una pluralidad de boquillas de aire 590 se montan en el piso 528, y se alinean con los pasos 570 cuando el distribuidor 566 se desplaza dentro de su posiciÃ³n de dispensaciÃ³n por el accionador 586. Un tubo 592 se alinea con cada paso 570, y cada tubo se conecta a una de una pluralidad de estaciones de muestreo de semillas 600 en la trituradora de semillas 515. Las semillas 572 y 574 se trasladan permitiendo a las semillas en los pasos 570 caer dentro de los tubos 592 Una de las boquillas 590 se alinea con cada uno de los pasos 570, y se acciona para facilitar el movimiento de las semillas desde los pasos 570 a travÃ©s de los tubos 592 a sus estaciones de muestreo de semillas 600 respectivas.

Hay preferiblemente un orificio 596 a travÃ©s de la tolva 550 que se alinea con la abertura 556 en cada rebaje 554 a medida que la rueda 552 gira. El orificio 596 se puede conectar a un hueco para extraer cualquier suciedad o fragmentos de cascaras de semillas o semilla que pueda atascar las aberturas 556 en el rebaje 554, y dificultar la capacidad de la rueda 552 de seleccionar semillas individuales de la tolva 550.

La trituradora de semillas 516 comprende al menos una, y en esta realizaciÃ³n preferida seis, estaciones de muestreo

600. Cada estaciÃ³n de muestreo de semillas 600 retira una muestra de material de una semilla suministrada a la misma. En esta realizaciÃ³n preferida, las estaciones de muestreo 600 se disponen o agrupan en dos grupos de tres, pero el nÃºmero y disposiciÃ³n de las estaciones de muestreo podrÃa variar. La estaciÃ³n de manipulaciÃ³n de muestras 504 recibe muestras de tejido retiradas de una semilla y transportadas separadas de cada estaciÃ³n de muestreo

600. Asimismo, la estaciÃ³n de manipulaciÃ³n de semillas 506 recibe una semilla despuÃ©s de haberse retirado una muestra de la semilla, y la semilla se transporta desde la estaciÃ³n de muestreo 600.

Cada estaciÃ³n de muestreo 600 tiene un anillo de entrada 602 conectado al tubo 590, que se abre a una cÃ¡mara

604. La superficie de fondo de la cÃ¡mara 604 se forma mediante el extremo de una varilla 606 de accionador 608. La superficie del fondo estÃ¡ por debajo del anillo de entrada 602 para garantizar que toda la semilla cae dentro de la cÃ¡mara 604 y no queda atrapada en posiciÃ³n solo parcialmente en la cÃ¡mara. Un respiradero 610 se puede situar opuesto al anillo de entrada 602 para permitir que el aire de las boquillas de aire 590 se escape. El respiradero 610 se puede cubrir con una rejilla de malla 612 para evitar que la semilla se escape de la cÃ¡mara 604 y para amortiguar la semilla a medida que se suministra dentro de la cÃ¡mara.

Esta varilla 606 extrae una semilla de la cÃ¡mara 604 y la introduce dentro de un rebaje de recepciÃ³n de semillas 614 en la parte inferior de una placa de muestreo de semillas 616. La placa de muestreo 616 tiene una abertura de muestreo 618 a travÃ©s de la cual sobresale una semilla en el rebaje de recepciÃ³n de semillas 614. Una ranura de muestreo 620 se forma en la superficie superior de la placa de muestreo 616 de manera que una porciÃ³n de una semilla en el rebaje 614 sobresale dentro de la ranura. La placa de muestreo 616 tiene tambiÃ©n aberturas

lateralmente orientadas 622 y 624 alineadas en su interior con el rebaje de recepciÃ³n de semillas 614. Cuando la varilla 606 introduce una semilla proporcionada a la estaciÃ³n de muestras dentro del rebaje 614 en la placa 616, los dedos 626 y 628 se extienden transversalmente a travÃ©s de las aberturas 622 y 624 y son accionadas por el accionador 630 para enganchar y comprimir la semilla. Se ha descubierto que la compresiÃ³n en algunos tipos de semillas durante el proceso de muestreo puede mejorar la viabilidad de las semillas despuÃ©s del muestreo. Para las semillas tales como las semillas de soja, se ha descubierto que una presiÃ³n compresiva mejora la viabilidad de las semillas, y que la presiÃ³n compresiva de entre aproximadamente 0,12 kPa y aproximadamente 0,24 kPa es suficiente para mejorar la viabilidad.

Un husillo de muestreo 650 que tiene una pluralidad de borde de corte 652 que oscilan en la ranura 620 de manera que los bordes de corte 652 pueden raspar una muestra de una semilla retenida en el rebaje 614 por la varilla 606 y los dedos 626 y 628. Los bordes de corte 652 son preferiblemente paralelos, y orientados formando un Ã¡ngulo oblicuo inferior a 90Âº respecto de la direcciÃ³n de avance del husillo. Es deseable, pero no esencial, que los bordes de corte 652 se pueden ajustar suficientemente en Ã¡ngulo para que un borde permanezca en contacto con la semilla en todo momento. El ajuste en Ã¡ngulo de los bordes de corte permite que la siguiente cuchilla entre en contacto con la semilla antes de que la cuchilla actual pierda el contacto con la semilla. En la realizaciÃ³n preferida, los bordes de corte se orientan formando un Ã¡ngulo de aproximadamente 60Âº, aunque este Ã¡ngulo dependerÃ¡ en alguna medida de la anchura del husillo. La anchura del husillo puede tambiÃ©n ser importante para preservar la viabilidad de las semillas despuÃ©s del muestreo, y puede variar dependiendo del tipo de semilla y su contenido en humedad.

Los bordes de corte 652 estÃ¡n escalonados, siendo cada corte progresivamente mÃ¡s profundo que el anterior. La cantidad de material de muestra y la profundidad del corte se pueden controlar controlando el avance del husillo 650. Para muestras mÃ¡s pequeÃ±as y profundidades mÃ¡s superficiales de corte, la carrera del husillo 650 es menor, y para muestras mayores o profundidades mÃ¡s profundas de corte, la carrera del husillo es mÃ¡s larga. Para carreras parciales, los tejidos de la semilla pueden quedar atrapados entre los bordes 652. El husillo 650 puede avanzar y retraerse para ayudar a la liberaciÃ³n de toda la muestra. Por ejemplo, despuÃ©s de la libraciÃ³n de la semilla, el husillo puede avanzar y retraerse para ayudar a retirar el tejido de semilla atrapado entre los bordes de corte. Todo el intervalo de desplazamiento del husillo 650 se muestra en las figuras 19A y 18B.

El husillo de muestreo 650 es impulsado preferiblemente por un accionador lineal 654. En la realizaciÃ³n preferida, tres husillos 650 son impusados por un solo accionador 654. Usar un Ãºnico accionador para accionar mÃºltiples husillos ahorra espacio y es mÃ¡s econÃ³mico.

Un sistema de transporte de muestras 656 que comprende un conducto 658 que tiene una entrada 660 que comunica con un paso 662 que se abre a la abertura de muestreo 618 y la ranura 620 en la placa de muestreo 616 retira muestras de tejido realizadas por la acciÃ³n de los bordes de corte 652 del husillo de muestreo 650. El conducto 658 trasporta la muestra a la salida 664 donde se deposita en un Ãºnico portamuestras en la estaciÃ³n de manipulaciÃ³n de muestras 504. Este porta-muestras puede ser, por ejemplo, un pocillo 666 en una bandeja 686 montada en una tabla de indexaciÃ³n x-y 688 sobre la carretilla 612, de manera que se pueda determinar la relaciÃ³n entre las muestras y sus semillas respectivas. El mecanismo de transporte de semillas 680 incluye un chorro de aire 690 que induce un flujo de aire a travÃ©s del conducto 658 para desplazar la muestra a travÃ©s del conducto.

Se puede montar un segundo mecanismo de muestreo sobre el accionador lineal 654 y moverse con el husillo 650. El segundo mecanismo de muestreo puede comprender un dispositivo de muestreo 674, que tiene una herramienta de extracciÃ³n 676 para tomar una muestra de la semilla del corte hecho por el husillo 650. El tejido de esta muestra procede de una zona mÃ¡s profunda que el tejido levantado por el husillo 650 y proporciona una informaciÃ³n diferente. En algunas realizaciones, el material retirado por el husillo 650 simplemente se puede desechar y solo se conservarÃ¡ el material tomado por el dispositivo de muestreo 674. En algunas realizaciones pueden conservarse ambas muestras y almacenarlas por separado para analizarlas de manera individual. En otras realizaciones mÃ¡s, la Ãºnica muestra es la tomada por el husillo 650. En las realizaciones sin el segundo mecanismo de muestreo, se pueden sustituir el dispositivo de muestreo 674 y la herramienta de extracciÃ³n 676 por un accionador con una varilla de empuje simple que se extiende a travÃ©s de la abertura de muestreo 618 para ayudar a empujar a una semilla hasta el rebaje 614.

DespuÃ©s de la operaciÃ³n de muestro, un mecanismo de transporte de semillas 680, que tiene un rebaje 614 adyacente a una entrada 682 para introducir semillas despuÃ©s de que hayan sido liberadas por los dedos 626 y 626 y la varilla 606, hace descender la semilla. El sistema de transporte de semilas 680 transporta en la carretilla 512 las semillas a un receptÃ¡culo para semillas Ãºnico de la estaciÃ³n de manipulaciÃ³n de semillas 506. Este receptÃ¡culo puede ser, por ejemplo, un pocillo 684 de una bandeja 686 montada en una tabla de indexaciÃ³n 688 de la carretilla 612, de tal manera que se puede determinar la relaciÃ³n entre muestras y sus respectivas semillas. El mecanismo de transporte de semillas 680 incluye un chorro de aire 690 que induce un flujo de aire a travÃ©s del conducto 680 para desplazar la muestra a travÃ©s del conducto.

Funcionamiento

En funcionamiento, una pluralidad de semillas, por ejemplos semillas de soja, se vierten en la tolva 550 del sistema de muestreo 500. Estas semillas fluyen por gravedad hacia el disco 552, la succiÃ³n a travÃ©s de los orificios 556

retiene una semilla en cada cavidad 554. A medida que el disco 552 gira mediante el motor de indexaciÃ³n 560, las semillas individuales se eliminan del disco mediante la rasqueta 562, y caen por gravedad a travÃ©s de la guÃa 564 en la salida. El accionador lineal 586 desplaza el distribuidor 566 para que cada paso 570 del distribuidor se alinee con la guÃa 564 para cargar una semilla a travÃ©s de la abertura 576 y dentro del paso 570. Cuando todos los pasos 570 en el distribuidor 566 estÃ¡n llenos, el accionador lineal 568 desplaza el distribuidor a la posiciÃ³n de carga de sus semillas dentro de las estaciones de muestreo 600 en la trituradora de semillas 516. Las camisas 572 y 574 se desplazan mediante el accionador 580, que alinea las aberturas 578 con los pasos 570, permitiendo que las semillas en los pasos 570 caigan dentro de los tubos 592 que conducen a las unidades de muestreo 600. Las boquillas 590 proporcionan una rÃ¡faga de aire que ayuda a empujar las semillas desde los pasos 570 a travÃ©s de los tubos 592 a las cÃ¡maras 604 en las unidades de muestreo 600.

Preferiblemente todos los pasos 570 se cargan en serie y descargan sus semillas simultÃ¡neamente a las unidades de muestreo 600, pero el distribuidor se podrÃa programar para accionar de alguna manera. Una vez que las semillas llegan a las estaciones de muestreo 600, las varillas 606 levantan las semillas dentro de los rebajes 614 en la parte inferior de las placas 616. Los rebajes 614 se pueden dimensionar y conformar para ayudar a orientar de manera Ã³ptima la semilla. En los rebajes 614, una porciÃ³n de las semillas sobresale a travÃ©s de los orificios de muestreo 618 y dentro de las ranuras 620. Los husillos 650 se trasladan en las ranuras 620 permitiendo que sus bordes de corte 652 retiren material de las porciones de las semillas que sobresalen dentro de las ranuras 620, y formando pequeÃ±os cortes en las semillas. A medida que cada husillo 650 retira material, el sistema de transporte de muestras 656 arrastra el material de muestra a travÃ©s del paso 662 y dentro de la entrada 660. Las muestras se desplazan en los conductos 658 alejÃ¡ndose de las estaciones de muestreo 600 a una localizaciÃ³n de almacenamiento de muestras, tal como pocillos 666 en una bandeja de muestras 668. Una segunda muestra puede ser tomada por una herramienta de extracciÃ³n 676 del dispositivo de muestreo 674 a travÃ©s de la abertura 618 en la placa de muestreo

616. DespuÃ©s de terminar el muestreo, la varilla 606 se retrae, y a medida que la semilla cae el sistema de transporte de semillas muestreadas 680 transporta la semilla muestreada a una localizaciÃ³n de almacenamiento de semillas, tales como un pocillo 684 en una bandeja de semillas 688.

Las tablas de indexaciÃ³n 670 y 688 se desplazan para alinear diferentes pocillos con las salidas del sistema de transporte de muestras 565 y el sistema de transporte de semillas 680, y se repite el proceso de muestreo. Cuando todos los pocillos 666 en una bandeja de muestras 668 estÃ¡n llenos, las muestras en la bandeja de muestras se pueden ensayar, y las semillas en la bandeja de semillas 686 correspondientes se pueden seleccionar basÃ¡ndose en los resultados del ensayo de muestras. El muestreo no afecta preferiblemente de manera sustancialmente adversa la viabilidad de las semillas.

Aplicaciones

La presente invenciÃ³n proporciona procedimientos para analizar un rasgo, marcador o genotipo deseado. En un aspecto de la invenciÃ³n, los procedimientos analÃticos permiten que las semillas individuales a analizar que estÃ¡n presentes en una partida o una poblaciÃ³n a granel de semillas para que se puedan determinarlas caracterÃsticas quÃmicas y/o genÃ©ticas de las semillas individuales.

Se pueden usar muestras preparadas por la presente invenciÃ³n para determinar una gran variedad de rasgos fÃsicos, quÃmicos y/o genÃ©ticos. Ejemplos de anÃ¡lisis quÃmicos para su uso en los procedimientos de la presente invenciÃ³n incluyen el contenido de almidÃ³n, contenido de proteÃnas, contenido de aceites, la determinaciÃ³n de perfiles de Ã¡cidos grasos, etc.

En una realizaciÃ³n, los procedimientos de la presente invenciÃ³n se pueden usar en un programa de cultivo para seleccionar plantas o semillas que tienen un rasgo, marcador o genotipo deseado. Los procedimientos de la presente invenciÃ³n se pueden usar en combinaciÃ³n con cualquier metodologÃa de cultivo y se pueden usar para seleccionar una Ãºnica generaciÃ³n o para seleccionar mÃºltiples generaciones. La elecciÃ³n de los procedimientos de cultivo depende del modo de reproducciÃ³n de plantas, siendo la heredabilidad del o de los rasgos mejorada, y el tipo de cultivar usado comercialmente (por ejemplo, cultivar hÃbrido F1, cultivar de lÃnea pura, etc.). Los enfoques no limitativos seleccionados para cultivar las plantas de la presente invenciÃ³n se establecen en lo sucesivo. Cabe entender ademÃ¡s, que cualesquiera cultivares comerciales y no comerciales se pueden usar en un programa de cultivo. Los factores tales como, por ejemplo, vigor de emergencia, vigor vegetativo, tolerancia al estrÃ©s, resistencia a enfermedades, ramificaciÃ³n, floraciÃ³n, desarrollo de semillas, dimensiÃ³n de semillas, densidad de semillas, resistencia, y desgranabilidad, etc. DictarÃ¡n generalmente la elecciÃ³n.

En una realizaciÃ³n particular, los procedimientos de la presente invenciÃ³n se usan para determinar las caracterÃsticas genÃ©ricas de las semillas en un programa de cultivo asistido por marcadores. Tales procedimientos permiten programas de cultivo asistidos por marcadores mejorados en los cuales se puede llevar a cabo el muestreo directo de semillas de manera no destructiva mientras se mantiene la identidad de los individuos del muestreador de semillas al campo. En consecuencia, el programa de cultivo asistido por marcadores da como resultado una plataforma de “alto rendimiento” en la cual una poblaciÃ³n de semillas que tiene un rasgo, marcador o genotipo deseado se pueden agrupar mÃ¡s efectivamente en un periodo de tiempo mÃ¡s corto, con menos recursos requeridos de campo y de mano de obra. Tales ventajas se describirÃ¡n de manera mÃ¡s completa en lo sucesivo.

En una realizaciÃ³n, la presente invenciÃ³n proporciona un procedimiento para analizar semillas individuales dentro de una poblaciÃ³n de semillas que tienen diferencias genÃ©ticas. El procedimiento comprende retirar una muestra que comprende cÃ©lulas con ADN de semillas en la poblaciÃ³n sin afectar a la viabilidad de germinaciÃ³n de las semillas; seleccionar del ADN extraÃdo de la muestra para la presencia o ausencia de al menos un marcador genÃ©tico; seleccionar semillas de la poblaciÃ³n basÃ¡ndose en los resultados de la selecciÃ³n de ADN; y cultivar plantas a partir de la semilla seleccionada.

Como se ha descrito anteriormente, los sistemas y procedimientos de muestreo de esta invenciÃ³n protegen la viabilidad de germinaciÃ³n de las semillas y no son destructivos. La viabilidad de germinaciÃ³n significa que un nÃºmero predominante de semillas muestreadas, (es decir, superior al 50% de todas las semillas muestreadas) permanecen viables despuÃ©s del muestreo. En una realizaciÃ³n particular, al menos aproximadamente el 75% de las semillas muestreadas, y en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 85% de las semillas muestreadas siguen siendo viables. Cabe resaltar que pueden ser tolerables proporciones inferiores de viabilidad de germinaciÃ³n en algunas circunstancias o para algunas aplicaciones, por ejemplo, ya que los costes de genotipificaciÃ³n se reducen con el tiempo porque un mayor nÃºmero de semillas se podrÃa muestrear con el mismo coste de genotipo.

En otra realizaciÃ³n, la viabilidad de germinaciÃ³n se mantiene durante al menos seis meses despuÃ©s del muestreo para garantizar que la semilla muestreada serÃ¡ viable hasta que alcance el campo para su plantaciÃ³n. En una realizaciÃ³n particular, los procedimientos de la presente invenciÃ³n comprenden, ademÃ¡s, tratar las semillas muestreadas para mantener la viabilidad de germinaciÃ³n. Tal tratamiento puede incluir generalmente cualquier medio conocido en la tÃ©cnica para proteger una semilla de las condiciones ambientales durante el almacenamiento o el transporte. Por ejemplo, en una realizaciÃ³n, las semillas muestreadas se pueden tratar con un polÃmero y/o un fungicida para proteger la muestra muestreada durante el almacenamiento o el transporte al campo antes de su plantaciÃ³n.

El ADN se puede extraer de la muestra usando cualesquiera procedimientos de extracciÃ³n de ADN conocidos por el experto en la tÃ©cnica, el cual proporcionarÃ¡ rendimiento de ADN, calidad de ADN y respuesta PCR suficientes. Un ejemplo no limitativo de procedimientos de extracciÃ³n de ADN apropiados es la extracciÃ³n basada en SDS con centrifugaciÃ³n. AdemÃ¡s, el ADN extraÃdo se puede amplificar despuÃ©s de la extracciÃ³n usando cualquier procedimiento de amplificaciÃ³n conocido por el experto en la tÃ©cnica. Por ejemplo, un procedimiento de amplificaciÃ³n apropiado es la preparaciÃ³n de amplificaciÃ³n de ADN FenomphiÂ® de AmershamBiosciences.

Le ADN extraÃdo se criba para la presencia o ausencia de un marcador genÃ©tico apropiado. Una gran variedad de marcador genÃ©ticos son disponibles y conocidos por el experto en la tÃ©cnica. El cribado de ADN para la presencia o ausencia del marcador genÃ©tico se puede usar para la selecciÃ³n de semillas en una poblaciÃ³n de cultivo. Los alelos, QTL, o halotipos a seleccionar para poder ser identificados usando recientes tÃ©cnicas de biologÃa molecular con modificaciones de las estrategias de cultivo clÃ¡sicas.

En una realizaciÃ³n, la semilla se selecciona basÃ¡ndose en la presencia o ausencia de un marcador genÃ©tico que se une genÃ©ticamente a un QTL. Ejemplos de QTL que son a menudo de interÃ©s incluyen pero no se limitan a rendimiento, resistencia al acostado, altura, madurez, resistencia a enfermedades, resistencia a plagas, resistencia a deficiencia de nutrientes y composiciÃ³n del grano. Alternativamente, la semilla se puede seleccionar basÃ¡ndose en la presencia o ausencia de un marcador que estÃ¡ unido genÃ©ticamente a un halotipo asociado a un QTL. Ejemplo de tal QTL puede de nuevo incluir sin limitaciÃ³n rendimiento, resistencia al acostado, altura, madurez, resistencia a enfermedades, resistencia a plagas, resistencia a deficiencia de nutrientes y composiciÃ³n del grano.

La selecciÃ³n de una poblaciÃ³n de cultivo se puede iniciar ya al nivel de cruce F2, si los parentales endÃ³gamos homocigÃ³ticos se usan en el cruce inicial. Una generaciÃ³n F1 tambiÃ©n se podrÃa muestrear y avanzar si uno o mÃ¡s de los parentales del cruce son heterocigÃ³ticos para los alelos o marcadores de interÃ©s. Le cultivador puede cribar cualquier poblaciÃ³n F2 para recuperar el genotipo marcador de cada individuo en la poblaciÃ³n. Las dimensiones de poblaciÃ³n inicial, limitadas solo por el nÃºmero de semillas disponibles para cribar, se pueden ajustar para cumplir con la probabilidad deseada de identificar con Ã©xito el nÃºmero deseado de individuos. VÃ©ase Sedcole, J.R. “Number of plants necessary to recover a trait”. Crop Sci. 17:667-68 (1977). En consecuencia, la probabilidad de encontrar el genotipo deseado, la dimensiÃ³n de poblaciÃ³n inicial, y la dimensiÃ³n de poblaciÃ³n resultante diana se puede modificar para varias metodologÃas de cultivo y el nivel de endogamia de la poblaciÃ³n muestreada.

Las semillas seleccionadas se pueden agrupar o mantener separadas dependiendo de la metodologÃa de cultivo y la diana. Por ejemplo, cuando un criador estÃ¡ cribando una poblaciÃ³n F2 para resistencia a enfermedades, todos los individuos con el genotipo deseado se pueden agrupar y plantar en viveros. Inversamente, si se seleccionan mÃºltiple QTL con efectos variables para un rasgo tal como rendimiento de granos a partir de una poblaciÃ³n dada, el criador puede mantener la identidad individual preservada, yendo al campo para diferenciar individuos con varias combinaciones del QTL diana.

Se pueden usar varios procedimientos para preservar una Ãºnica identidad de semilla, mientras se transfiere la semilla del laboratorio al campo. Los procedimientos incluyen, pero no se limitan a, transferir individuos seleccionados a una banda de semillas, una bandeja de casete, o la bandeja de indexaciÃ³n, trasplantar con macetas con turba, y plantar a mano a partir de paquetes de semillas individuales.

Se pueden usar mÃºltiples ciclos dependiendo de las dianas de cultivo y la complejidad genÃ©tica.

Las ventajas de usar los procedimientos de criba de la invenciÃ³n incluyen, sin limitaciÃ³n, la reducciÃ³n de mano de obra y los recursos de campo requeridos por poblaciÃ³n o lÃnea de cultivo, mayor capacidad para evaluar un mayor nÃºmero de poblaciones de cultivo por unidad de campo, y mayor capacidad para cribar poblaciones de cultivo para rasgos deseados antes de la plantaciÃ³n. Los recursos de campo por poblaciÃ³n se reducen limitando el espacio de campo requerido para avanzar los genotipos deseados. Por ejemplo, una poblaciÃ³n de 1.000 individuos se pueden plantas en 25 semillas por fila consumiendo un total de 40 filas en el campo. Usando el muestreo de tejido convencional, las 1.000 plantas se catalogan y muestrean manualmente evaluando el tejido foliar. Los resultados del marcador molecular serÃan necesarios antes de la polinizaciÃ³n y solo se polinizarÃan las plantas que contienen la composiciÃ³n genÃ©tica deseada. De este modo, si se determinase que 50 semillas contenÃan la composiciÃ³n genÃ©tica deseada, la metodologÃa de cultivo convencional requerirÃa la plantaciÃ³n de 1.000 plantas para obtener 50 semillas. Por el contrario, los procedimientos de cribado de esta invenciÃ³n permiten que al criador cribar las 1.000 semillas en el laboratorio y seleccionar las 50 semillas deseadas antes de la plantaciÃ³n. Los 50 individuos se pueden entonces plantar en el campo, consumiendo dos filas de 25 filas de semillas. AdemÃ¡s, los procedimientos de cribado de esta invenciÃ³n no requieren catalogaciÃ³n o muestreo en el campo, reduciendo de este modo de manera significativa los recursos de mano de obra necesarios.

AdemÃ¡s, de reducir el nÃºmero de filas de campo por poblaciÃ³n, los procedimientos de cribado de la invenciÃ³n pueden aumentar, ademÃ¡s, el nÃºmero de poblaciones que el criador puede evaluar en un vivero dado. Usando el ejemplo anterior en el cual 50 semillas de cada poblaciÃ³n de 1.000 semillas contenÃan la composiciÃ³n genÃ©tica deseada, un criador que aplica los procedimientos de la invenciÃ³n podrÃan evaluar 20 poblaciones de 50 semillas cada uno usando la misma Ã¡rea de campo consumida por una Ãºnica poblaciÃ³n usando tÃ©cnicas de muestreo de tejido de campo convencionales. Incluso si se seleccionan las poblaciones para un Ãºnico alelo, usando una relaciÃ³n de segregaciÃ³n esperada de 1:2:1 para una poblaciÃ³n F2, el criador evaluarÃa 4 poblaciones en la misma Ã¡rea de campo que una Ãºnica poblaciÃ³n muestreada de tejido de campo.

Una ventaja potencial adicional a la divisiÃ³n de semillas es que se podrÃa usar para mitigar los riesgos asociados al cultivo de plantas en algunas geografÃas en las que las plantas pueden crecer con dificultad o experimentar condiciones ambientales pobres. O incluso destruirse durante las tormentas. Por ejemplos, las semillas con la “mejor” composiciÃ³n de genotipo o marcador se podrÃan plantar en la geografÃa 1 y las semillas con el “siguiente mejor genotipo” se podrÃan plantar en la geografÃa 2. En este caso, la geografÃa 2 serÃa una copia de seguridad en caso de que se produzca cualquier problema en las plantas cultivadas en la geografÃa 1. Esto es muy difÃcil de llevar a cabo con el procedimiento tradicional de toma de muestras de tejido de plantas germinadas para genotipificaciÃ³n, porque estas plantas necesitarÃan entonces desarraigarse y trasplantarse en la segunda geografÃa. Usando los procedimientos de esta invenciÃ³n se evita el problema del trasplante.

Los procedimientos de cribado de la invenciÃ³n se pueden usar, ademÃ¡s, en un programa de cultivo para la introgresiÃ³n de un rasgo en una planta. Tales procedimientos comprenden retirar una muestra que comprende cÃ©lulas con ADN de las semillas en una poblaciÃ³n, cribar el ADN extraÃdo de cada semilla para la presencia o ausencia de al menos un marcador genÃ©tico, seleccionar semillas de la poblaciÃ³n basÃ¡ndose en los resultados del cribado de ADN, cultivar una planta fÃ©rtil a partir de la semilla; y usar la planta fÃ©rtil bien como un parental hembra o un parental macho en un cruce con otra planta.

Ejemplo de cribado genÃ©tico para seleccionar semillas para la integraciÃ³n de rasgos incluyen, sin limitaciÃ³n, la identificaciÃ³n de frecuencias de alelo s parentales recurrentes altas, seguimiento de transgenes de interÃ©s o cribado para la ausencia de transgenes no deseados, selecciÃ³n de semilla hÃbridas de ensayo, y ensayo de cigosidad.

La identificaciÃ³n de frecuencias de alelos pares recurrentes por los procedimientos de cribado de la presente invenciÃ³n permite de nuevo un nÃºmero reducido de filas por poblaciÃ³n y un nÃºmero mayor de poblaciones, o lÃneas endogamas, a plantar en una unidad de campo dada. De este modo, los procedimientos de cribado de la presente invenciÃ³n pueden tambiÃ©n reducir efectivamente los recursos requeridos para terminar la conversiÃ³n de lÃneas endogamas.

Los procedimientos de la presente invenciÃ³n se pueden aplicar, ademÃ¡s, para identificar una semilla hÃbrida para ensayo de transgenes. Por ejemplo, en una conversiÃ³n en una lÃnea endogama en el piso BCnF1, un criador podrÃa crear efectivamente un lote de semillas hÃbridas (salvo la selecciÃ³n de gametos) que era del hemicigÃ³tico al 50% para el rasgo de interÃ©s y homocigÃ³tico al 50% para la falta de raso con el fin de generar una semilla hÃbrida para ensayo. El criador podrÃa entonces cribar todas las semillas F1 producidas en el cruce de ensayo e identificar y seleccionar las semillas que eran homocigÃ³ticas. Tal procedimiento es ventajoso porque las interferencias de los ensayos hÃbridos representarÃan productos genÃ©ticos hÃbridos comerciales respecto de la cigosidad del rasgo.

Otras aplicaciones de los procedimientos de cribado de la invenciÃ³n para identificar y seguir los rasgos de interÃ©s tienen las mismas ventajas identificadas anteriormente respecto del del campo y los recursos de mando de obra requeridos. Generalmente, los programas de conversiÃ³n transgÃ©nica se ejecutan en localizaciones multitemporada que llevan una mayor estructura de coste de gestiÃ³n y una de tierra. De este modo, el impacto bien en la reducciÃ³n de las necesidades de filas por poblaciÃ³n o bien en el aumento del el nÃºmero de poblaciones dentro de una unidad

de campo dada es significativamente mÃ¡s drÃ¡stico en el coste frente a aplicaciones modelo.

Asimismo, los procedimientos de cribado de la invenciÃ³n se pueden usar para mejorar la eficiencia del programa de doble haploide a travÃ©s de la selecciÃ³n de genotipos deseados en la etapa haploide y la identificaciÃ³n del nivel de ploidÃa para eliminar el procesamiento de las semillas no haploides y su avance en el campo. Ambas aplicaciones dan de nuevo como resultado la reducciÃ³n de los recursos de campo por poblaciÃ³n y la capacidad de evaluar un mayor nÃºmero de poblaciones dentro de una unidad de campo dada.

En otra realizaciÃ³n, la invenciÃ³n proporcionar, ademÃ¡s, un ensayo para predecir la cigosidad embrionaria para un gen particular de interÃ©s (GOI). El ensayo predice cigosidad embrionaria basÃ¡ndose en la relaciÃ³n del nÃºmero relativo de copias de un GOI y de un gen de control interno (IC) por cÃ©lula o por genoma. Generalmente, este ensayo usa un gen IC que es de cigosidad conocida, por ejemplo, homocigÃ³tico en el locus (dos copias IC por cÃ©lula diploide), para normalizar la mediciÃ³n del GOI. La relaciÃ³n de los nÃºmeros relativos de copias del IC respecto del GOI predice el nÃºmero de copias GOI en la cÃ©lula. En una cÃ©lula homocigÃ³tica para cualquier gen dado, (o secuencia genÃ©tica Ãºnica), el nÃºmero de copia de gen es igual al nivel de ploidia de la cÃ©lula ya que la secuencia estÃ¡ presente en el mismo locus en todos los cromosomas homÃ³logos. Cuando una cÃ©lula es heterÃ³loga para un gen particular, el nÃºmero de copia del gen serÃ¡ inferior al nivel de ploidia de la cÃ©lula. La cigosidad de una cÃ©lula en cualquier locus se puede determinar de este modo por el nÃºmero de copias de gen en la cÃ©lula.

En una realizaciÃ³n particular, la invenciÃ³n proporciona un ensayo para predecir la cigosidad embrionaria del maÃz. En la semilla de maÃz, el tejido de endospermo es triploide, mientras que el tejido embrionario es diploide. El endospermo que es homocigÃ³tico para IC contendrÃ¡ tres copias de IC. El nÃºmero de copias del endospermo GOI puede variar entre 0 (homocigÃ³tico negativo) y 3 (homocigÃ³tico positivo); y el nÃºmero de copias de endospermo GOI de 1 o 2 se encuentra en la semilla que es homocigÃ³tico para el GOI (o hemicigÃ³tico para el GOI si el GOI es un transgen). El nÃºmero de copias de endospermo es un reflejo de la cigosidad del embriÃ³n: un endospermo homocigÃ³tico (positivo o negativo) acompaÃ±a un embriÃ³n homocigÃ³tico, el endospermo heterocigÃ³tico (con un nÃºmero de copia de 1 o 2) refleja un embriÃ³n heterocigÃ³tico (nÃºmero de copia GOI de 1). El nÃºmero de copia de endospermo GOI (que puede variar entre 0 y 3 copias) se puede determinar a partir de la relaciÃ³n del nÃºmero de copias de endospermo IC respecto del nÃºmero de copias del endospermo GOI (que puede variar de 0/3 a 3/3, es decir, de 0 a 1), que se puede usar entonces para predecir la cigosidad del embriÃ³n.

Los nÃºmeros de copias del GOI o el IC se pueden determinar por cualquier tÃ©cnica de ensayo apropiada para la cuantificaciÃ³n de nÃºmeros de copias, como es conocido en la tÃ©cnica. Ejemplos de ensayos apropiados incluyen, pero no se limitan, a ensayos de PCR entiempo real (TaqManÂ®) (Applied Biosystems, Foster City, CA) e InvaderÂ® (Third Wave Technologies, Madison, WI). Preferiblemente, tales ensayos se desarrollan de manera que la eficiencia de amplificaciÃ³n tanto de las secuencias IC como GOI son iguales o muy similares. Por ejemplo en un ensayo de PCR en tiempo real con TaqMAnÂ®, la seÃ±al de un GOI de copia Ãºnica (se determina que la cÃ©lula fuente sea heterocigÃ³tica para el GOI) serÃ¡ detectada un ciclo de amplificaciÃ³n mÃ¡s tarde que la seÃ±al de un IC de dos copias, porque la cantidad del GOI es la mitad de la del IC. Para la misma muestra heterocigÃ³tica, un ensayo InvaderÂ® medirÃa una relaciÃ³n GOI/IC de aproximadamente 1:2 o 0,5. Para una muestra que es homocigÃ³tica tanto para GOI como para IC, la seÃ±al GOI serÃa detectada al mismo tiempo que la seÃ±al IC (TaqManÂ®), y el ensayo InvaderÂ® medirÃa una relaciÃ³n GOI/IC de aproximadamente 2:2 o 1.

Estas directrices se aplica a cualquier cÃ©lula diploide, o a las cÃ©lulas haploides (tales como cÃ©lulas de polen), ya que el nÃºmero de copias del GOI o del IC siguen siendo proporcionales al nÃºmero de copias de genoma (o nivel de polidia) de la cÃ©lula. De este modo, tales ensayos de cigosidad se pueden llevar a cabo en tejidos tripoides tales como el endospermo de maÃz.

Ejemplo

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos, y no limitan en modo alguna esta divulgaciÃ³n.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe un ensayo para predecir la cigosidad de embriones de maÃz usando un gen de control interno (IC) homocigÃ³tico en el locus (es decir, dos copias IC en el embriÃ³n diploide y tres copias en el endospermo triploide). En una lÃnea endogama de un organismo diploide (o ploidia superior) tal como maÃz, el control interno endogamo es normalmente homocigÃ³tico, los eventos transgÃ©nicos en tales organismos en la primera generaciÃ³n (denominada “R0” en el maÃz) son normalmente hemicigÃ³tico (es decir, el transgen estÃ¡ normalmente presente en solo uno de los dos o mÃ¡s cromosomas homÃ³logos). El maÃz (Zea mays) es un organismo diploide, de este modo, una evento R0 de “copia Ãºnica” tiene una copia del GOI por cÃ©lula, pero 0,5 copias por genoma haploide, un evento R0 de “dos copias” tiene dos copias del GOI por cÃ©lula, pero 1 copia por genoma haploide, y asÃ sucesivamente.

En este ejemplo, se usÃ³ tubulina como el gen IC y el GOI fue un transgen que codifica fosfotransferasa de neomincina II (NPT II), que se usa para selecciÃ³n de resistencia a la Kanamicina. El tejido de endospermo (triploide) se tomÃ³ de la semilla (bien por muestreo manual o raspando una semilla con un muestreador automatizado de la presente invenciÃ³n). La semilla de endospermo muestreado se germinÃ³, y el tejido foliar (diploide) de una planta germinada con Ã©xito se muestreo tambiÃ©n para anÃ¡lisis genÃ©tico. El tejido foliar se correlaciona directamente con la cigosidad embrionaria y de ese modo se uso para demostrar que la cigosidad de endospermo predice generalmente la cigosidad del embriÃ³n y para confirmar las cÃ©lulas de homocigosidad del endospermo. El ADN genÃ³mico total se extrajo del tejido de endospermo y del tejido foliar, y se analizÃ³ cuantitativamente usando un ensayo InvaderÂ® con

5 sondas oligonucleotÃdicas especÃficas para el gen de interÃ©s, NPT II, o para el gen de control interno, tubulina. La relaciÃ³n del GOI respecto del IC se midiÃ³ usando tÃ©cnica convencionales de biologÃa molecular. VÃ©ase la Tabla 1. Se muestra un sumario de resultados de mÃºltiples experimentos en la Tabla 2.

Los resultados indicaron que la cigosidad de endospermo predijo generalmente la cigosidad del embriÃ³n (como se indica mediante la cigosidad de la hoja) y fue fiable en predecir homocigosidad para todas las semillas que 10 germinaron. Asimismo, el anÃ¡lisis de cigosidad de endospermo dio predicciones homogicÃ³gitas de faso negativo (especialmente cuando el tejido de endospermo se obtuvo con el muestreador automatizado). Estos resultados demuestran que para una cÃ©lula de un nivel de ploidia conocido, la relaciÃ³n de nÃºmero de copias de un GOI respecto del de un IC que indica la cigosidad de esa cÃ©lula. Asimismo, el ensayo de cigosidad de la presente invenciÃ³n puede predecir cigosidad de un tejido basÃ¡ndose en la cigosidad de otro, es decir, el ensayo puede

15 predecir la cigosidad embrionaria basÃ¡ndose en la cigosidad de endospermo

Tabla 1 Tabla 2

RelaciÃ³n Automatizada: Cigosidad automatizada RelaciÃ³n manual Cigosidad manual

1,39: HeterocigÃ³tico 1,42 HeterocigÃ³tico

0,14: HomocigÃ³tico negativo 0,12 HomocigÃ³tico negativo

0,08: HomocigÃ³tico negativo 0,08 HomocigÃ³tico negativo

0,13: HomocigÃ³tico negativo 0,10 HomocigÃ³tico negativo

0,10: HomocigÃ³tico negativo 0,08 HomocigÃ³tico negativo

1,55: HeterocigÃ³tico 1,38 HeterocigÃ³tico

0,84: HeterocigÃ³tico 1,45 HeterocigÃ³tico

0,14: HomocigÃ³tico negativo 1,48 HeterocigÃ³tico

1,48: HeterocigÃ³tico 1,37 HeterocigÃ³tico

1,39: HeterocigÃ³tico 1,47 HeterocigÃ³tico

2,03: HomocigÃ³tico POS 1,93 HomocigÃ³tico POS

0,13: HomocigÃ³tico negativo 0,05 HomocigÃ³tico negativo

1,71: HomocigÃ³tico POS 1,81 HomocigÃ³tico POS

0,81: HeterocigÃ³tico 1,41 HeterocigÃ³tico

1,84: HomocigÃ³tico POS 1,77 HomocigÃ³tico POS

1,54: HeterocigÃ³tico 1,43 HeterocigÃ³tico

1,48: HeterocigÃ³tico 1,50 HeterocigÃ³tico

0,92: HeterocigÃ³tico 1,40 HeterocigÃ³tico

1,51: HeterocigÃ³tico 1,42 HeterocigÃ³tico

1,60: HeterocigÃ³tico 1,37 HeterocigÃ³tico

0,86: HeterocigÃ³tico 1,47 HeterocigÃ³tico

1,81: HomocigÃ³tico POS 2,02 HomocigÃ³tico POS

0,15: HomocigÃ³tico negativo ADN bajo

1,89: HomocigÃ³tico POS 1,85 HomocigÃ³tico POS

0,21: HomocigÃ³tico negativo 0,10 HomocigÃ³tico negativo

0,09: HomocigÃ³tico negativo 0,11 HomocigÃ³tico negativo

0,89: HeterocigÃ³tico 1,50 HeterocigÃ³tico

1,50: HeterocigÃ³tico 1,37 HeterocigÃ³tico

1,82: Inconcluso 2,02 HomocigÃ³tico POS

2,14: HomocigÃ³tico POS 0,99 Inconcluso

1,22: HeterocigÃ³tico 1,44 HeterocigÃ³tico

2,22: HomocigÃ³tico POS 2,24 HomocigÃ³tico POS

0,79: HeterocigÃ³tico 1,40 HeterocigÃ³tico

1,23: HeterocigÃ³tico 1,47 HeterocigÃ³tico

1,49: HeterocigÃ³tico 1,38 HeterocigÃ³tico

1,33: HeterocigÃ³tico 1,37 HeterocigÃ³tico

Procedimiento de muestreo de endospermo: NÃºmero de semillas homocigÃ³ticas identificadas por anÃ¡lisis de endospermo NÃºmero de semillas homocigÃ³ticas predichas que no germinaron NÃºmero de cÃ©lulas homocigÃ³ticas confirmadas basadas en anÃ¡lisis de hoja NÃºmero de cÃ©lulas homocigÃ³ticas falso negativo

Manual: 8 de 36 0 8 (todas) 5 (13,9%)

Automatizado: 6 de 24 1 5 0

Manual: 6 de 36 0 6 (todas) 2 (5,6%)

Automatizado: 6 de 24 1 5 0

Manual: 5 de 36 0 5 (todas) 7 (19,4 %)

Automatizado: 7 de 24 2 5 0

Manual: 7 de 36 1 6 0

Automatizado: 5 de 24 2 3 0

Ejemplo 2

5 Este ejemplo demuestra el uso de los procedimientos de cribado de la presente invenciÃ³n en un programa para selecciÃ³n asistida por marcador de sojas con bajo contenido en Ã¡cido linoleico.

La soja es el cultivo de leguminosas mÃ¡s valioso, con muchos usos nutricionales e industriales debido a su

composiciÃ³n quÃmica Ãºnica. Las semillas de soja son una fuente importante de aceite vegetal, que se usa en

productos alimentarios por todo el mundo. El nivel relativamente alto (habitualmente aproximadamente el 8%) de 10 Ã¡cido linoleico (18:3) en el aceite de soja reduce su estabilidad y sabor. La hidrogenaciÃ³n del aceite de soja se usa

para reducir el nivel de Ã¡cido linoleico (18:3) y mejorar tanto la estabilidad como el sabor de los aceites de soja. Sin

embargo, la hidrogenaciÃ³n da como resultado la producciÃ³n de Ã¡cidos grasos trans, que aumentan el riesgo de

enfermedad cardiaca coronaria cuando se consumen. El desarrollo de soja con bajo contenido de Ã¡cido linoleico se

ha complicado por la naturaleza cuantitativa del rasgo. Las variedades de soja con bajo contenido de Ã¡cido linoleico 15 que se han desarrollado se han encontrado tener un bajo rendimiento, limitando su utilidad en la mayorÃa de los

Ã¡mbitos comerciales. Desarrollar un producto con un rendimiento de semillas comercialmente significante es una prioridad elevada en la mayorÃa de los programas de desarrollo de cultivares de soja.

Un ejemplo de la aplicaciÃ³n de los procedimientos de cribado de la presente invenciÃ³n es la selecciÃ³n de plantas de soja tanto con gran rendimiento con un rendimiento de la progenie de Soja con un contenido de Ã¡cido linoleico reducido entorno al bajo contenido en Ã¡cido linoleico se basa principalmente en dos locus principales de rasgo cuantitativo (QTL) en Fad3-1c. El anÃ¡lisis de la segregaciÃ³n de plantas demuestra que fad3-1b y Fad3-1c controlan adicionalmente el contenido linolÃ©nico en soja. Por lo tanto, usando una combinaciÃ³n de marcadores para Fad3-1b y Fad3-1c, un criador que usa la invenciÃ³n puede predecir con precisiÃ³n el contenido de Ã¡cido linolÃ©nico en las plantas de soja. Los marcadores se pueden usar para inferir el estado genotÃpico de una semilla en cualquier etapa en el proceso de cultivo, por ejemplo, en la etapa de lÃnea endogama acabada, o la F1, F2, F3, etc.

Un hÃbrido F1 seminal se puede producir cruzando dos lÃneas de soja endogamas (por ejemplo, cruzando una planta que contiene los alelos Fad3-1b y/o Fad3-1c asociados a contenido de Ã¡cido linoleico reducido a una planta que carece de estos alelos) seguido de autopolinizaciÃ³n natural. Puesto que los marcadores se pueden usar para inferir el estado genotÃpico de una Ãºnica semilla obtenida a partir de un interacoplamiento de tales lÃneas endogamas, se puede llevar a cabo el cultivo asistido por marcado de primera generaciÃ³n (es decir, F2).

La semilla de soja a temperatura y humedad ambiente se equilibran normalmente a una humedad del 8% de peso en seco. La semilla de soja a este nivel de humedad tiende a partirse cuando se corta. Para reducir la divisiÃ³n, la semilla deberÃa humedecerse hasta un nivel de humedad del 12%. Cuando se pretrata de esta manera, la divisiÃ³n se reduce significativamente hasta menos del 5%.

Las semillas F2 seleccionadas que tienen el genotipo deseado se pueden agrupar o mantener separadas dependiendo de los objetivos de cultivo. Si se hubiesen seleccionado mÃºltiple QTL con efectos variables a partir de una poblaciÃ³n dada, el criador podrÃa preservar la Ãºnica identidad de semilla para diferenciar los individuos con varias combinaciones del QTL de resistencia diana. Estas semillas se podrÃan plantar en el campo con identificaciÃ³n de campo apropiada. Varios procedimientos de preservaciÃ³n de identidad de semillas Ãºnica se pueden usar mientras se transfiere la semilla desde el laboratorio de corte al campo. Los procedimientos incluyen transferir individuos seleccionados a la cinta se semillas hortÃcolas que tambiÃ©n podrÃa incluir identificaciÃ³n de radiofrecuencia para ayudar a la identificaciÃ³n de la semilla individual genotipificada. Otros procedimientos serÃan usar una bandeja de indexaciÃ³n, semillas de plantas en macetas con turba y a continuaciÃ³n trasplantarlas, o plantar a mano a partir de paquetes individuales de semillas.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra el uso de los procedimientos de cribado de la presente invenciÃ³n en un programa para alelos parentales recurrentes en un programa de crÃa por retrocruzamiento.

Los procedimientos de cribado de la presente invenciÃ³n se pueden usar para la selecciÃ³n de transgenes asÃ como la identificaciÃ³n de alelos parentales recurrentes. La identificaciÃ³n de genotipos con frecuencias de alelos parentales recurrentes deseadas antes de la plantaciÃ³n permite que el nÃºmero de filas por poblaciÃ³n se reduzca a lo largo de todo el programa de cultivo junto con un aumento en el nÃºmero de poblaciones incluidas en el programa de conversiÃ³n dentro de una unidad de campo dada. Estos dan como resultado un uso mejorado de la tierra, costes de manos de obra y de la tierra reducidos, etc.

Un ejemplo de cribado de tejido de endospermo a partir de maÃz para alelos parentales recurrente en un programa de cultivo por retrocruzamiento se muestra en la figura 29.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra el uso de procedimientos de cribado de la presente invenciÃ³n para el uso en la determinaciÃ³n de la base de vinculaciÃ³n e impresiones digitales de lÃneas de ADN.

Combinado con el ADN de cÃ©lula Ãºnica, la huella genÃ©tica de lÃnea se puede llevar a cabo si la necesidad de muestrear la lÃnea en el campo.

Usando tejido de endospermo de semillas (revestimiento de semilla en soja) derivado de una planta diploide, los halotipos de marcador parental se puede determinar usando un sistema de genotipificaciÃ³n que permite la detecciÃ³n de diferentes frecuencias de alelos en muestras de ADN. Puesto que el tejido de endospermo es triploide, con dos copias derivadas del gameto femenino, la fase de vinculaciÃ³n de la lÃnea parental se puede derivar diseccionando genotipos de progenie heterocigÃ³tica. La muestra de ADN de tejido de endospermo permite una determinaciÃ³n del nivel de ploidia del marcador genÃ©tico. Un nivel de ploidia diploide en el marcador genÃ©tico indica la herencia materna y un nivel de ploidia haploide en el marcador genÃ©tico indica la herencia paterna.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un procedimiento automatizado para analizar semillas en una poblaciÃ³n de semillas que tienen diferencias genÃ©ticas, comprendiendo el procedimiento:

aislar semillas individuales de la poblaciÃ³n de semillas; colocar las semillas individuales aisladas en un portasemillas; cortar muestras de tejido que comprendan cÃ©lulas con ADN de las semillas individuales asiladas y colocadas en el portasemillas usando un muestreador de semillas automatizado mientras se mantiene la viabilidad de germinaciÃ³n de las semillas; cribar el ADN extraÃdo de la muestra para la presencia o ausencia de un marcador genÃ©tico; seleccionar semillas de la poblaciÃ³n basÃ¡ndose en los resultados del cribado de ADN; y cultivar plantas a partir de la semilla seleccionada.
2.- El procedimiento segÃºn la reivindicaciÃ³n 1 en el cual el procedimiento comprende, ademÃ¡s, determinar el carÃ¡cter genotÃpico de la descendencia de la semilla antes de seleccionar las semillas de la poblaciÃ³n.
3.- El procedimiento segÃºn la reivindicaciÃ³n 1 en el cual las plantas fÃ©rtiles cultivadas a partir de la semilla seleccionada se usan bien como parental femenino o masculino en un cruce con otra planta.
4.- El procedimiento segÃºn la reivindicaciÃ³n 1 en el cual la muestra de tejido comprende tejido de endospermo y el procedimiento comprende, ademÃ¡s, determinar el nivel de ploidÃa del marcador genÃ©tico.
5.- El procedimiento segÃºn la reivindicaciÃ³n 2, en el cual el nivel de ploidÃa diploide en el marcador genÃ©tico indica la herencia materna y un nivel de ploidia haploide en el marcador genÃ©tico indica la herencia paterna.
6.- El procedimiento segÃºn la reivindicaciÃ³n 1, en el cual e marcador genÃ©tico se encuentra en el parental materno de la semilla.
7.- El procedimiento segÃºn la reivindicaciÃ³n 1, en el cual e marcador genÃ©tico se encuentra en el parental paterno de la semilla.
8.- El procedimiento segÃºn la reivindicaciÃ³n 1, en el cual el procedimiento comprende seleccionar la semilla basÃ¡ndose en la presencia de un marcador genÃ©tico que estÃ¡ genÃ©ticamente vinculado a un QTL seleccionado a partir del grupo constituido por rendimiento, resistencia al acostado, altura, madurez, resistencia a enfermedades, resistencia a plagas, resistencia a deficiencia de nutrientes y composiciÃ³n del grano.
9.- El procedimiento segÃºn la reivindicaciÃ³n 1, en el cual el procedimiento comprende seleccionar la semilla basÃ¡ndose en la presencia de un marcador genÃ©tico que estÃ¡ genÃ©ticamente vinculado a un halotipo asociado a un QTL seleccionado a partir del grupo constituido por rendimiento, resistencia al acostado, altura, madurez, resistencia a enfermedades, resistencia a plagas, resistencia a deficiencia de nutrientes y composiciÃ³n del grano.
10.- El procedimiento segÃºn la reivindicaciÃ³n 1, en el cual el procedimiento comprende seleccionar la semilla basÃ¡ndose en la presencia de un marcador genÃ©tico que estÃ¡ vinculado genÃ©ticamente a un transgen.
11.- El procedimiento segÃºn la reivindicaciÃ³n 1 en el cual las semillas en la poblaciÃ³n son semillas de soja.
12.- Un procedimiento automatizado para agrupar semillas en una poblaciÃ³n de semillas que tienen diferencias genÃ©ticas, comprendiendo el procedimiento:

(a)

aislar semillas individuales de una poblaciÃ³n de semillas, colocar las semillas individuales aisladas en un portasemillas, cortar muestras de tejido que comprenden cÃ©lulas con ADN de las semillas individuales asiladas y colocadas en el portasemillas usando un muestreador de semillas automatizado;

(b)

cribar el ADN extraÃdo de cada muestra para la presencia o ausencia de al menos un marcador genÃ©tico;

(c)

seleccionar semillas de la poblaciÃ³n basÃ¡ndose en los resultados del cribado de ADN;

(d)

cultivar plantas a partir de la semilla seleccionada;

(e)

recolectar las semillas de las plantas cultivadas y repetir las etapas (a) a (d).