BR122015017827B1 - Método para analisar sementes em uma população de sementes tendo diferenças genéticas - Google Patents

Abstract

resumo patente de invenção: "métodos de amostrar e aumentar sementes em uma população, de tirar amostras de tecido de sementes mantendo a sua viabilidade, de analisar sementes em população de sementes tendo diferenças genéticas, de prognosticar zigosidade de embrião para gene de interesse e de aumentar população de semente tendo traço desejado". a presente invenção refere-se ao campo técnico de métodos agrícolas aplicados ao melhoramento genético vegetal. particularmente, a presente invenção refere-se a métodos de amostrar sementes dispostas em compartimentos separados em uma bandeja que compreende: sequencialmente transportar cada semente individual para uma estação de amostragem (26, 72, 502, 600); reter a semente na estação de amostragem; raspar uma amostra da semente; transportar a amostra raspada para um compartimento em uma bandeja de amostra (82, 668); transportar a semente para um compartimento correspondente em uma bandeja de semente (80, 686). a presente invenção refere-se ainda aos métodos de aumentar sementes em uma população, de aumentar uma quantidade de semente de planta tendo uma característica desejada, de tirar amostras de tecido de sementes mantendo a sua viabilidade, analisar sementes em uma população de sementes tendo diferenças genéticas, de aumentar sementes em uma população de sementes tendo diferenças genéticas, de prognosticar zigosidade de embrião para um gene de interesse, e de aumentar uma população de semente tendo um traço desejado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA ANALISAR SEMENTES EM UMA POPULAÇÃO DE SEMENTES TENDO DIFERENÇAS GENÉTICAS.

Dividido do PI0514685-2, depositado em 26.08.2005. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se aos sistemas e métodos para tirar amostras de materiais biológicos como sementes.

[002] Em desenvolvimento e melhoria de planta, melhorias genéticas são feitas na planta, ou através de procriação seletiva ou manipulação genética, e quando uma melhoria desejável é alcançada, uma quantidade comercial é desenvolvida plantando e colhendo as sementes em várias gerações. Nem todas as sementes expressam os traços desejados, e desse modo estas sementes necessitam ser separadas da população. Para acelerar o processo de aumentar a população, amostras estatísticas são tiradas e testadas para selecionar sementes da população que não adequadamente expressam o traço desejado. Porém esta amostragem estatística necessariamente permite algumas sementes sem o traço desejável permanecer na população, e também pode inadvertidamente excluir algumas sementes com o traço desejável da população desejada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [003] A presente invenção refere-se aos sistemas e métodos de não destrutivamente colher material das sementes. Os métodos são particularmente adaptados para automatização, que permite maior coleta que foi previamente praticado. Com colhimento automatizado,

Petição 870170031661, de 12/05/2017, pág. 6/12

2/41 não destrutivo permitido por pelo menos algumas das modalidades desta invenção, é possível testar cada semente na população, e separar aquelas sementes que não expressam o traço desejado. Isto acelera grandemente o processo de aumentar uma população de semente dada, e pode resultar em uma população final melhorada.

[004] Modalidades desta invenção facilitam a testagem de maior parte ou todas as sementes em uma população antes da plantação, de forma que o tempo e recursos não são perdidos em cultivar plantas sem os traços desejados.

[005] Em geral o sistema desta invenção compreende: uma estação de amostragem; coletor para remover o material de uma semente na estação de amostragem; um transportador de semente para transportar a semente da estação de amostragem para um compartimento em uma bandeja de semente; e um transportador para transportar o material removido da semente para um compartimento correspondente em uma bandeja de amostra.

[006] De acordo com o método desta invenção, as sementes são individualmente alimentadas para uma estação de amostragem; e contidas na estação de amostragem enquanto uma amostra é tirada da semente. Cada amostra é transportada para pelo menos um compartimento individual em uma bandeja de amostra, e cada semente é transportada para um compartimento em uma bandeja de semente com uma relação conhecida com o(s) compartimento(s) da bandeja de amostra para o(s) qual(is) a amostra correspondente foi transportada. As amostras podem ser testadas, e as sementes podem ser classificadas com base nos resultados do teste.

[007] Este sistema e método desta invenção facilitam a coleta automatizada, não-destrutiva das sementes. Eles permitem a testagem e classificação de volumes grandes de sementes, assim facilitando o aumento das populações de semente com traços desejáveis. Estas e

3/41 outras características e vantagens serão em parte evidentes, e em parte apontadas doravante.

APLICAÇÕES [008] A presente invenção fornece métodos para analisar as sementes tendo um traço, marcador ou genótipo desejado. Em um aspecto da invenção, os métodos analíticos permitem analisar as sementes individuais que estão presentes em uma batelada ou uma população de volume de sementes de modo que as características químicas e/ou genéticas das sementes individuais podem ser determinadas.

[009] As amostras preparadas pela presente invenção podem ser usadas para determinar uma ampla variedade de traços físicos, químicos e/ou genéticos. Exemplos de análises químicas para o uso nos métodos da presente invenção incluem teor de amido, teor de proteína, teor de óleo, determinação de perfis de ácido graxo, etc.

[0010] Em uma modalidade, os métodos e dispositivos da presente invenção podem ser usados em um programa de procriação para selecionar plantas ou sementes que têm um traço, marcador ou genótipo desejado. Os métodos da presente invenção podem ser usados em combinação com qualquer metodologia de procriação e podem ser usados para selecionar uma geração simples ou selecionar gerações múltiplas. A escolha do método de criação depende do modo de reprodução da planta, da hereditariedade do(s) traço(s) sendo melhorado(s) e do tipo de cultivar usado comercialmente (e.g., cultivar de híbrido F1, cultivar de purelina, etc). Métodos não-limitativos selecionados para criar as plantas da presente invenção estão expostos abaixo. É também entendido que quaisquer cultivares comerciais e não comerciais podem ser utilizados em um programa de procriação. Fatores como, por exemplo, vigor de emergência, vigor vegetativo, tolerância à tensão, resistência a doenças, ramificação,

4/41 florescência, colocação da semente, tamanho da semente, densidade da semente, sustentabilidade e capacidade de debulha etc. em geral ditarão a escolha.

[0011] Em uma modalidade particular, os métodos da presente invenção são usados para determinar as características genéticas de sementes em um programa de procriação assistida por marcador. Tais métodos permitem programa de procriação assistida por marcador melhorado em que amostragem de semente direta não-destrutiva pode ser conduzida ao mesmo tempo mantendo a identidade dos indivíduos do coletor de semente para o campo. Como resultado, o programa de procriação assistida por marcador resulta em uma plataforma de processamento alto em que uma população de sementes tendo um traço, marcador ou genótipo desejado pode ser aumentada mais eficazmente em um período mais curto de tempo, com menos recursos de campo e de trabalho requeridos. Tais vantagens serão descritas completamente abaixo.

[0012] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para analisar sementes individuais dentro de uma população de sementes tendo diferenças genéticas. O método compreende remover uma amostra compreendendo células com DNA de sementes na população sem afetar a viabilidade da germinação das sementes; triar o DNA extraído da amostra para a presença ou ausência de pelo menos um marcador genético; selecionar as sementes da população com base nos resultados da triagem de DNA; e cultivar as plantas da semente selecionada.

[0013] Como descrito acima, os sistemas e métodos de amostragem desta invenção protegem a viabilidade da germinação das sementes para não ser destrutiva. A viabilidade de germinação significa que um número predominante de sementes amostras, (isto é, maior que 50% de todas as sementes amostradas) permanece viável

5/41 após a amostragem. Em uma modalidade particular, pelo menos cerca de 75% das sementes amostradas, e em algumas modalidades pelo menos cerca de 85% das sementes amostradas permanece viável. Deveria ser observado que taxas inferiores de viabilidade de germinação podem ser toleráveis sob certas circunstâncias ou em certas aplicações, por exemplo, visto que os custos de genotipagem diminuem com o tempo porque um número maior de sementes poderia ser amostrado para o mesmo custo de genótipo.

[0014] Em outra modalidade, viabilidade de germinação é mantida por pelo menos cerca de seis meses após amostragem para assegurar que a semente amostrada será viável até alcançar o campo para plantação. Em uma modalidade particular, os métodos da presente invenção também compreendem tratar as sementes amostradas para manter viabilidade de germinação. Tal tratamento pode em geral incluir quaisquer dispositivos conhecidos na técnica para proteger uma semente das condições ambientais enquanto em armazenamento ou transporte. Por exemplo, em uma modalidade, as sementes amostradas podem ser tratadas com um polímero e/ou um fungicida para proteger a semente amostrada enquanto em armazenamento ou em transporte para o campo antes da plantação.

[0015] DNA pode ser extraído da amostra usando qualquer método de extração de DNA conhecido àqueles de habilidade na técnica que fornecerá rendimento de DNA suficiente, qualidade de DNA e resposta de PCR. Um exemplo não-limitativo de métodos de extração de DNA adequados é extração com base em SDS com centrifugação. Além disso, o DNA extraído pode ser amplificado após extração usando qualquer método de amplificação conhecido àqueles versados na técnica. Por exemplo, um método de amplificação adequado é a prep de amplificação de DNA GenomiPhi® de Amersham Biosciences.

6/41 [0016] O DNA extraído é triado pela presença ou ausência de um marcador genético adequado. Uma ampla variedade de marcadores genéticos está disponível e conhecida àqueles de versados na técnica. A triagem de DNA pela presença ou ausência do marcador genético pode ser usada para a seleção de sementes em uma população de procriação. A triagem pode ser usada para selecionar para loci de traços quantitativos (QTL), alelos ou regiões genômicas (haplotipos). Os alelos, QTL ou haplotipos podem ser identificados para ser selecionados para usar técnicas mais novas de biologia molecular com modificações de estratégias de procriação clássicas.

[0017] Em uma modalidade, a semente é selecionada com base na presença ou ausência de um marcador genético que está ligado geneticamente com um QTL. Exemplos de QTLs que são freqüentemente de interesse incluem, mas não são limitados a, rendimento, resistência a hospedeiros, altura, maturidade, resistência a doenças, resistência a pestes, resistência à deficiência de nutrientes e composição do grão. Alternativamente, a semente pode ser selecionada com base na presença ou ausência de um marcador que está ligado geneticamente com um haplotipo associado a um QTL. Exemplos de tal QTL podem incluir novamente sem limitação rendimento, resistência a hospedeiros, altura, maturidade, resistência a doenças, resistência a pestes, resistência à deficiência de nutrientes e composição do grão.

[0018] Seleção de uma população de procriação poderia ser iniciada já no nível de procriação F2, se os pais inatos homozigotos forem usados no cruzamento de procriação inicial. Uma geração de F1 poderia também ser amostrada e avançada se um ou mais dos pais da cruza forem heterozigotos para os alelos ou marcadores de interesse. O criador pode triar uma população de F2 para recuperar o genótipo de marcador de todo indivíduo na população. Tamanhos iniciais da

7/41 população, limitado apenas pelo número de sementes disponíveis para triagem, podem ser ajustados para conhecer a probabilidade desejada de com sucesso identificar o número desejado de indivíduos. Ver Sedcole, J. R. Number of plants necessary to recover a trait. Crop Sci. 17:667-68 (1977). Conseqüentemente, a probabilidade de encontrar o genótipo desejado, o tamanho de população inicial e o tamanho de população resultante alvejado pode ser modificada por várias metodologias de procriação e nível de procriação consangüínea da população amostrada.

[0019] As sementes selecionadas podem ser avolumadas ou mantidas separadas dependendo da metodologia de procriação e do alvo. Por exemplo, quando um criador estiver triando uma população de F2 para resistência a doenças, todos os indivíduos podem ser avolumados com o genótipo desejado e plantados no berçário de procriação. Inversamente, se múltiplos QTLs com efeitos variados para um traço como rendimento de grão estão sendo selecionados de uma população dada, o criador pode manter a identidade individual preservada, indo para o campo para diferenciar os indivíduos com várias combinações dos QTLs alvos.

[0020] Vários métodos de preservar a identidade da semente simples podem ser usados ao mesmo tempo transferindo a semente do laboratório de aparas para o campo. Métodos incluem, mas não são limitados a, transferir os indivíduos selecionados para fita de semente, uma bandeja de cassete, ou bandeja de indexação, transplantar com potes de turfa e plantar à mão os pacotes de semente individuais.

[0021] Múltiplos ciclos de seleção podem ser utilizados dependendo dos alvos de procriação e complexidade genética.

[0022] Vantagens de usar os métodos de triagem desta invenção incluem, sem limitação, redução dos recursos de trabalho e de campo

8/41 requeridos por população ou linhagem de procriação, capacidade aumentada para avaliar um número maior de populações de procriação por unidade de campo e capacidade aumentada para triar populações de procriação para traços desejados antes da plantação. Recursos de campo por população são reduzidos limitando o espaço do campo requerido para avançar os genótipos desejados. Por exemplo, uma população de 1.000 indivíduos pode ser plantada em 25 sementes por fileira que consomem um total de 40 fileiras no campo. Usando amostragem de tecido convencional, todas as 1.000 plantas seriam marcadas e manualmente amostradas classificando o tecido da folha. Os resultados de marcadores moleculares seriam necessários antes da polinização e apenas aquelas plantas que contêm a composição genética desejada seriam polinizadas. Desse modo, se fosse determinado que 50 sementes contivessem a composição genética desejada, a metodologia de procriação convencional teria requerido a plantação de 1000 plantas para obter 50 sementes. Em contraste, os métodos de triagem desta invenção permitem ao criador triar as 1.000 sementes no laboratório e selecionar as 50 sementes desejadas antes da plantação. Os 50 indivíduos podem ser depois plantados no campo, consumindo apenas duas 25 fileiras de semente. Adicionalmente, os métodos de triagem desta invenção não requerem marcação ou amostragem no campo, assim reduzindo significativamente os recursos de trabalho manuais requeridos.

[0023] Além de reduzir o número de fileiras no campo por população, os métodos de triagem desta invenção podem também aumentar o número de populações que o criador pode avaliar em um berçário de procriação dado. Usando o exemplo acima em que 50 sementes de cada população de 1000 sementes contivessem a composição genética desejada, um criador que aplica os métodos desta invenção poderia avaliar 20 populações de 50 sementes cada

9/41 uma usando a mesma área de campo consumida por uma população simples usando técnicas convencionais de amostragem de tecido de campo. Até mesmo se as populações forem selecionadas para um alelo simples, usando uma razão de 1:2:1 de segregação esperada para uma população de F2, o criador poderia avaliar 4 populações na mesma área de campo como uma única população de amostras de tecido de campo.

[0024] Uma outra vantagem potencial para cinzelar semente é que isso poderia ser usado para mitigar os riscos associados às plantas em crescimento em certas geografias onde plantas podem crescer mal ou podem sofrer condições ambientais pobres, ou podem ser destruídas até mesmo durante tempestades. Por exemplo, sementes com o melhor genótipo ou composição de marcador poderiam ser plantadas na geografia 1 e as sementes com o genótipo próximo de melhor poderiam ser plantadas na geografia 2. Neste caso geografia 2 seria um reserva no caso de qualquer problema acontecesse com as plantas crescidas na geografia 1. Isto é muito difícil de ver com o método tradicional de tirar amostras de tecido de plantas germinadas para genotipagem, porque estas plantas depois necessitarão de ser desarraigadas e transplantadas para a segunda geografia. Usando os métodos desta invenção evita o problema de transplantação.

[0025] Os métodos de triagem da invenção podem também ser usados em um programa de procriação para introduzir um traço em uma planta. Tais métodos compreendem remover uma amostra compreendendo as células com DNA de sementes em uma população, triar o DNA extraído de cada semente para a presença ou ausência de pelo menos um marcador genético, selecionar as sementes da população com base nos resultados da triagem de DNA; cultivar uma planta fértil da semente; e utilizar a planta fértil como uma origem feminina ou origem masculina em um cruzamento com outra planta.

10/41 [0026] Exemplos de triagem genética para selecionar sementes para integração de traço incluem, sem limitação, identificação das frequência de alelo de origem recorrentes altas, rastreamento dos transgenes de interesse ou triagem para a ausência de transgenes indesejados, seleção de semente de testagem híbrida e testagem de zigosidade.

[0027] A identificação das frequência de alelo de pares recorrentes altas por meio dos métodos de triagem da presente invenção novamente permite um número reduzido de fileiras por população e um número aumentado de populações, ou linhas consangüíneas, ser plantadas em uma unidade de campo dado. Desse modo, os métodos de triagem da presente invenção podem também eficazmente reduzir os recursos requeridos para completar a conversão das linhagens consangüíneas.

[0028] Os métodos da presente invenção também fornecem garantia de qualidade (QA) e controle de qualidade assegurando que transgenes regulados ou indesejados sejam identificados e descartados antes da plantação. Esta aplicação em uma capacidade de QA poderia eficazmente eliminar infrações de liberação não intencionais.

[0029] Os métodos da presente invenção podem ser também aplicados para identificar semente híbrida para testagem de transgene. Por exemplo, em uma conversão de uma linhagem consangüínea no estágio de BCnF1, um criador poderia eficazmente criar um lote de sementes híbridas (exceto seleção de gameta) que fosse 50% hemizigotas para o traço de interesse e 50% homozigotas para a falta do traço para gerar semente híbrida para testagem. O criador poderia depois triar todas as sementes de F1 produzida no cruzamento de teste e identificar e selecionar aquelas sementes que fossem hemizigotas. Tal método é vantajoso em que conclusões das

11/41 experimentações híbridas representariam genéticas híbridas comerciais com respeito à zigosidade de traço.

[0030] Outras aplicações dos métodos de triagem desta invenção para identificar e rastrear traços de interesse carregam as mesmas vantagens identificadas acima com respeito aos recursos requeridos de campo e de trabalho. Em geral, programas de conversão transgênicos são executados em localizações de multi-estações climáticas que acarretam uma estrutura de custo e gerenciamento da terra muito mais alto. Como tal, o impacto ou de reduzir a fileira necessária por população ou aumentar o número de populações dentro de uma unidade de campo dado é significativamente mais dramático em uma base de custo versus aplicações temperadas.

[0031] Ainda também, os métodos de triagem desta invenção podem ser usados para melhorar a eficiência do programa haplóide dobrado através da seleção de genótipos desejados para o estágio haplóide e identificação do nível de ploidia para eliminar sementes não-haplóides de serem processadas e avançar para o campo. Ambas as aplicações resultam novamente na redução de recursos de campo por população e a capacidade de avaliar um número maior de populações dentro de uma unidade de campo dado.

[0032] Em outra modalidade, a invenção também fornece um ensaio para prognosticar zigosidade de embrião para um gene particular de interesse (GOI). O ensaio prognostica zigosidade de embrião com base na razão dos números de cópias relativas de um GOI e de um gene de controle interno (IC) por célula ou por genoma. Em geral, este ensaio usa um gene de IC que é de zigosidade conhecida, e.g., homozigoto no locus (duas cópias de IC por célula diplóide), para normalizar a medição do GOI. A razão dos números de cópias relativas do IC para o GOI prognostica o número de cópias de GOI na célula. Em uma célula homozigota, para qualquer gene dado

12/41 (ou seqüência genética única), o número de cópias de gene é igual ao nível de ploidia da célula uma vez que a seqüência está presente no mesmo locus em todos os cromossomos homólogos. Quando uma célula for heterozigota para um gene particular, o número de cópias de gene será inferior que o nível de ploidia da célula. A zigosidade de uma célula em qualquer locus pode desse modo ser determinada pelo número de cópia de gene na célula.

[0033] Em uma modalidade particular, a invenção fornece um ensaio para prognosticar zigosidade de embrião de milho. Em semente de milho, o tecido do endosperma é triplóide, enquanto que o tecido do embrião é diplóide. Endosperma que é homozigoto para o IC conterá três cópias de IC. Número de cópias de GOI do endosperma pode variar de 0 (negativo homozigoto) para 3 (positivo homozigoto); e o número de cópias de GOI do endosperma de 1 ou 2 é encontrado na semente heterozigota para o GOI (ou hemizigoto para o GUI se o GOI for um transgene). Número de cópia do endosperma é refletivo da zigosidade do embrião: um endosperma homozigoto (positivo ou negativo) acompanha um embrião homozigoto, endosperma heterozigoto (se um número de cópias de GOI de 1 ou 2) reflete um embrião heterozigoto (número de cópias de GOI de 1). O número de cópias do endosperma (que pode variar de 0 a 3 cópias) pode ser determinado da razão do número de cópias de IC do endosperma para o número de cópias do endosperma (que pode variar de 0/3 a 3/3, ou seja, de 0 a 1) que pode depois ser usado para prognosticar zigosidade do embrião.

[0034] Números de cópias do GOI ou do IC podem ser determinados por qualquer técnica de ensaio conveniente para quantificação de números de cópia, como é conhecido na técnica. Exemplos de ensaios adequados incluem, mas não são limitados a, ensaios de Real Time (TagMan®) PCR (Applied Biosystems, Foster

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City, CA) e Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI). Preferivelmente, tais ensaios são desenvolvidos em um tal modo que a eficiência de amplificação das seqüências de IC e de GOI é igual ou bem parecida. Por exemplo, em um ensaio de PCR de Real Time TaqMan®, o sinal de um GOI de cópia única (a célula fonte é determinada para ser heterozigota para o GOI) será detectado um ciclo de amplificação depois que o sinal de um IC de cópia única, porque a quantidade do GOI é a metade da de IC. Para a mesma amostra heterozigota, um ensaio de Invader® mediria uma razão de GOT/IC de cerca de 1:2 ou 0,5. Para uma amostra que é homozigota para o GOI e o IC, o sinal de GOI seria detectado ao mesmo tempo que o sinal de IC (TaqMan®), e o ensaio de Invader® mediria uma razão de GOI/IC de cerca de 2:2 ou 1.

[0035] Estas diretrizes se aplicam a qualquer célula de poliplóide, ou às células haplóides (como células de pólen), uma vez que o número de cópias do GOI ou do IC permanece proporcional ao número de cópias de genoma (ou nível de ploidia) da célula. Desse modo, estes ensaios de zigosidade podem ser executados em tecidos triplóides como endosperma de milho.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0036] Figura 1 é uma vista em perspectiva de uma primeira modalidade de um sistema coletor de semente construído de acordo com os princípios desta invenção;

Figura 2 é uma vista em perspectiva aumentada do conjunto de coletor de semente do sistema coletor de semente;

Figura 3 é uma vista em perspectiva aumentada do depósito-alimentador e mecanismo de alimentação de semente do conjunto de coletor de semente;

Figura 4 é uma vista em perspectiva do furador para raspar amostras das sementes;

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Figura 5 é uma vista em perspectiva da corrediça para dirigir o furador;

Figura 6 é uma vista em perspectiva do pistão no mecanismo de alimentação do depósito-alimentador;

Figura 7 é uma vista em perspectiva de uma plataforma com uma pluralidade de bandejas de semente e bandejas de amostra montadas nelas;

Figura 8 é uma vista em perspectiva do mecanismo de translação bidimensional;

Figura 9 é uma vista em perspectiva da entrada do transportador de semente;

Figura 10 é uma vista em perspectiva da saída do transportador de semente;

Figura 11 é uma vista em perspectiva da saída do transportador de amostra;

Figura 12 é uma vista em perspectiva do multiplicador de ar usado nos transportadores de semente e de amostra;

Figura 13 é uma vista de cima do topo de um sistema coletor de semente de processamento alto de acordo com os princípios desta invenção;

Figura 14 é uma vista de elevação lateral do sistema coletor de semente de processamento alto;

Figura 15 é uma vista em perspectiva frontal do sistema coletor de semente;

Figura 16 é uma vista em perspectiva traseira do sistema coletor de semente;

Figura 17 é uma vista em perspectiva da estação de amostragem do sistema coletor de semente de processamento alto;

Figura 18A é uma vista em perspectiva parcial de uma porção da estação de amostragem de semente de acordo com os

15/41 princípios desta invenção, com o furador retraído;

Figura 18B é uma vista em perspectiva parcial de uma porção da estação de amostragem de semente de acordo com os princípios desta invenção, com o furador estendido;

Figura 19A é uma vista de elevação lateral da estação de amostragem de semente, com o furador em sua posição retraída;

Figura 19B é uma vista de elevação lateral da estação de amostragem de semente, com o furador em sua posição estendida;

Figura 20 é uma vista de corte transversal longitudinal da estação de amostragem de semente;

Figura 21 é uma vista de elevação de extremidade frontal da estação de amostragem de semente;

Figura 22 é uma vista de corte transversal da estação de amostragem de semente;

Figura 23A é uma vista de elevação lateral da roda de seleção de semente;

Figura 23B é uma vista explodida da roda de seleção de semente;

Figura 23C é uma vista de corte transversal vertical da roda de seleção de semente;

Figura 24 é uma vista de elevação frontal do mecanismo de alimentação;

Figura 25 é uma vista de elevação lateral do mecanismo de alimentação;

Figura 26A é uma vista em perspectiva do mecanismo de alimentação;

Figura 26B é uma vista de elevação lateral do mecanismo de alimentação;

Figo 26C é uma vista de corte transversal longitudinal do mecanismo de alimentação, tirada do plano da linha 26C-26C na

16/41

Figura 26B;

Figura 26D é uma vista de cima do fundo do mecanismo de alimentação;

Figura 27A é uma vista de corte transversal longitudinal vertical do mecanismo de amostragem;

Figura 27B é uma vista de corte transversal vertical parcial aumentada do mecanismo de amostragem como mostrado na Figura 27A;

Figura 28A é uma vista de corte transversal vertical do mecanismo de amostragem;

Figura 28B é uma vista de corte transversal parcial aumentada do mecanismo de amostragem como mostrado na Figura 28A; e

Figura 29 é um Alelograma que descreve amostras de tecido de endosperma de milho que sofreram PCR para detecção de um polimorfismo de SNP particular.

[0037] Numerais de referência correspondentes indicam partes correspondentes ao longo das várias vistas dos desenhos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS [0038] Em referência as Figuras 1 a 12, uma primeira modalidade de um coletor de semente automatizado construído do sistema de acordo com os princípios da presente invenção é indicada em geral como 20 na Figura 1. O sistema coletor de semente 20 é adaptado para isolar uma semente de um depósito-alimentador, alimentar para uma estação de amostragem, raspar uma amostra da semente, transportar a amostra para um recipiente de amostra e transportar a semente para um recipiente de semente correspondente. Como mostrado na Figura 1, o sistema coletor de semente compreende um suporte 22, uma estrutura 24 no suporte; conjunto de coletor 26, uma plataforma 28 montada em um mecanismo de translação

17/41 bidimensional 30 (vide também Figuras 7 e 8), um transportador de semente 32 para transportar as sementes do conjunto de coletor de semente e um transportador de amostra 34 para transportar uma amostra removida de uma semente para o conjunto de coletor de semente.

[0039] Como mostrado na Figura 1, na primeira modalidade preferida o suporte 22 compreende um carro com rodas 40, tendo uns quatro postes verticais 42 conectados por membros longitudinais superiores e inferiores 44 e 46, na frente e atrás, e membros transversais superiores e inferiores 48 e 50 nos lados esquerdo e direito e um tampo de mesa 52 montado sobre eles. Um rodízio 54 pode ser montado no fundo de cada poste 42 para facilitar mover o suporte 22. Os detalhes da construção do suporte 22 não são críticos à invenção, e desse modo o suporte 22 poderia ter alguma outra configuração sem divergir dos princípios desta invenção.

[0040] Como também mostrado na Figura 1, a estrutura 24 compreende quatro postes 60 verticalmente se estendendo montados no tampo de mesa 52, que suporta uma placa em geral horizontal 62. O conjunto de coletor 26 é montado na placa 62, como descrito em mais detalhe abaixo. Uma pérgula 64 é também montada na placa, e se estende em geral horizontalmente dele. A extremidade livre da pérgula 64 tem primeiro e segundo postes verticais 66 e 68 para montar um transportador de semente 32 e partes do transportador de amostra 34, respectivamente. Os detalhes da construção da estrutura 24 não são críticos à invenção, e desse modo a estrutura poderia ter alguma outra configuração sem divergir dos princípios desta invenção.

[0041] Como mostrado nas Figs. 1 e 2, o conjunto de coletor 26 é montado na placa 62 da estrutura 24. O conjunto de amostra compreende uma caixa ou depósito-alimentador 70, uma estação de amostragem 72 e um mecanismo de alimentação 74 para liberar uma

18/41 semente simples do depósito-alimentador 70 para a estação de amostragem.

[0042] Como mostrado nas Figs. 1 e 7, o estágio 28 é adaptado para montar com segurança uma pluralidade de bandejas de semente 80 e bandejas de amostra 82 em posições e orientações fixas. Cada uma das bandejas de semente 80 e bandejas de amostra 82 é preferivelmente dividida em uma pluralidade de compartimentos. O número e arranjo dos compartimentos nas bandejas de semente 80 preferivelmente corresponde ao número e arranjo dos compartimentos nas bandejas de amostra 82. Isto facilita a correspondência de umpara-um entre uma semente e sua amostra. Porém, em algumas modalidades pode ser desejável fornecer compartimentos múltiplos na bandeja de amostra para cada compartimento na bandeja de semente, por exemplo, onde testes múltiplos podem ser feitos nas amostras, ou onde diferentes amostras podem ser tiradas da mesma semente (e.g. amostras de profundidades diferentes).

[0043] Em referência adicional a Figura 8, a plataforma 28 é montada em um mecanismo de translação bidimensional 30 que nesta modalidade preferida compreende uma base 90 com um primeiro atuador linear 92, tendo um carro transladável 94 montado em uma base 90, e um segundo atuador linear 96, tendo o carro 98 montado no carro 94 do primeiro atuador linear 92. A plataforma 28 é montada em carro 98 do segundo atuador 96 linear, e desse modo pode ser movido precisamente em duas dimensões através da operação do primeiro e segundo atuadores lineares 92 e 96.

[0044] Em referência, novamente, a Figura 1, o transportador de semente 32 compreende um tubo 100 com uma extremidade de entrada 102 adjacente à estação de amostragem 72, e uma extremidade de saída 104 montada no poste 66 da estrutura 24. Há um primeiro dispositivo venturi 106 (vide Figuras 9, 10 e 12) na

19/41 extremidade de entrada 102 do tubo 100 para induzir um fluxo de ar no tubo para a extremidade de saída 104 do tubo, e um segundo dispositivo de venturi 108 na extremidade de saída 104 do tubo 100 para induzir um fluxo de ar para a extremidade de entrada 102 do tubo. O primeiro dispositivo de venturi 106 é operado para criar um fluxo de ar no tubo e tirar uma semente da estação de amostragem no tubo ao longo da primeira extremidade. O segundo dispositivo de venturi 108 é depois operado para criar um fluxo de ar na direção oposta, assim desacelerando a semente para reduzir o potencial de danificar a semente à medida que sai da extremidade de saída 104 do tubo e é liberada para um compartimento na bandeja. Nesta modalidade preferida, o segundo venturi 108 de fato pára o movimento da semente, permitindo-a cair sob gravidade em seu compartimento em uma bandeja 90. Vários sensores de posição no tubo 100 podem ser fornecidos para detectar a presença da semente, e confirmar a operação apropriada do transportador de semente 32.

[0045] Conforme mostrado também na Figura 1, o transportador de amostra 34 compreende um tubo 120 com uma extremidade de entrada 122 adjacente à estação de amostragem 72, e uma extremidade de saída 124 montada no poste 68 da estrutura 24. Há um primeiro dispositivo venturi 126 (vide também Figura 12) na extremidade de entrada 122 do tubo 120 para induzir um fluxo de ar no tubo para a extremidade de saída 124 do tubo. Um separador 128 (Figura 11) é fornecido na extremidade de saída para separar o material de amostra da corrente de ar que o carrega, de forma que a corrente de ar não assopra a amostra para fora do compartimento na bandeja 92. O separador preferivelmente também contém um filtro para impedir contaminação secundária das amostras.

[0046] Como mostrado na Figura 2, o conjunto de amostragem de semente 26 é adaptado para ser montado na placa 62 em um poste

20/41

140. O conjunto de amostragem de semente 26 compreende uma placa de montagem do depósito-alimentador 142, uma placa de montagem da corrediça 144 e quatro suportes de isolamento corrediços 146 entre eles. O depósito-alimentador 70 (mostrado na Figura 3) que alimenta sementes individuais para uma estação de amostragem 72 (vide também Figura 1) é montado na placa do depósito-alimentador 142. A estação de amostragem 72 compreende um ninho de semente 148 montado em uma base de ninho 150 que é suportada da placa de montagem da corrediça 144 por um par de isolantes 152. O ninho 148 tem um recesso abrindo em sua superfície de fundo, dentro do qual o depósito-alimentador 70 alimenta uma única semente. Há uma fenda no topo do ninho de semente 148 através da qual uma porção de uma semente no recesso é exposta. Um furador 154 (Figura 4) é montado em um retentor de furador 156 que é montado em uma placa de transição de corrediça 158 em uma corrediça programável 160, com um bloco de travamento do furador 162. A corrediça programável 160 (Figura 5) é montada no lado inferior da placa de montagem da corrediça 144, e move o furador 154 através da fenda no ninho de semente 148 para remover uma amostra de uma semente no recesso no ninho de semente.

[0047] Como melhor mostrado na Figura 4 o furador 154 tem uma pluralidade de dentes 164 que aumenta em altura para a extremidade proximal, de forma que à medida que o furador 154 é avançado na fenda, ele corta cada vez mais profundo na semente no recesso no ninho 148. A raspa gradual resultante reduz o dano à semente, ao mesmo tempo protegendo sua viabilidade. Além disso, como descrito em mais detalhe abaixo, cortando em profundidades diferentes em tempos diferentes, amostras de profundidades diferentes da mesma semente podem ser separadas para análise separada.

[0048] Em referência, novamente, a Figura 2, um tubo de

21/41 transferência de amostra 166 estende-se do recesso no ninho de semente 148, e tem um conector 168 em sua extremidade para conexão ao transportador de amostra 34.

[0049] O conjunto de amostragem 26 também inclui um depósitoalimentador 70, melhor mostrado na Figura 3. O depósito-alimentador 70 compreende placas de montagem do depósito-alimentador esquerda e direita 170 e 172, e uma placa de montagem do cilindro 174 e um consolo de cilindro superior 176. O depósito-alimentador 70 também tem um painel frontal 178, um painel traseiro 180, primeiro e segundo painéis de extremidade 182 e 184, e fundo 186. Um divisor 188 divide o depósito-alimentador em primeiro e segundo compartimentos 190 e 192. O primeiro compartimento 190 retém uma provisão de sementes que são transferidas individualmente ao segundo compartimento 192.

[0050] Um atuador de pistão 194 opera um pistão 196 para içar uma semente do primeiro compartimento. Um conjunto de jato de ar 198 transfere uma semente da extremidade do pistão 196 para o segundo compartimento 192. O segundo compartimento tem um fundo configurado 200, com um poço 202 para receber a semente e posicioná-la. Um atuador de pistão 210 opera um pistão 214 para içar uma semente do segundo compartimento 192. Um conjunto de jato de ar 216 é usado para agitar as sementes durante o procedimento de captura de semente.

[0051] Como mostrado na Figura 7, a plataforma 28 tem consolos 220 para montar as bandejas de semente 90 e bandejas de amostra 92 em registro de forma que o transportador de semente e o transportador de amostra liberem as sementes e amostras para os compartimentos correspondentes, nas respectivas bandejas. As bandejas de amostra 92 podem (como mostrado) ser adaptadas para reter frascos individuais. Claro que, bandejas de diferentes

22/41 configurações poderiam ser usadas, por exemplo, onde múltiplos compartimentos são providos para múltiplas amostras da mesma semente. Por exemplo, onde uma amostra é dividida em várias amostras, ou onde as amostras são separadas de onde elas são tiradas, e.g. através de profundidade.

[0052] Como mostrado na Figura 8, o mecanismo de translação bidimensional 30 também inclui uma corrediça 230 tendo um trilho 232 e um carro 234, que é posicionado paralelo ao primeiro atuador linear 92. O segundo atuador linear 96 é montado no carro 94 tendo o carro 98 montado no carro 94 do primeiro atuador linear 92. A plataforma 28 é montada no carro 98 do segundo atuador linear 96, e desse modo pode ser movido precisamente em duas dimensões através da operação dos primeiro e segundo atuadores lineares 92 e 96. O mecanismo de translação pode alinhar os compartimentos individuais das bandejas de semente 90 e bandejas de amostra 92 com as saídas do transportador de semente e transportador de amostra sob controle apropriado.

[0053] Como mostrado nas Figuras 1 e 9, na extremidade de entrada 102 do tubo 100 do transportador de semente 32, um consolo 240 monta um amplificador de ar 242 e um tubo de sensor de semente 244. O consolo 240 compreende seções 246, 248, 250, 252 e 254. Como mostrado na Figura 2, o consolo 240 é montado na placa de montagem do depósito-alimentador 142. O amplificador de ar 242 (também mostrado na Figura 12) é adaptado para ser conectado a uma fonte de ar comprimido. Quando ar for aplicado ao amplificador de ar, ele induz um fluxo de ar através do tubo 100, empregando o efeito venturi. O tubo de sensor 244 carrega sensores de semente 256 por sentir a passagem de uma semente através dele. Os sensores 256 são preferivelmente sensores ópticos alinhados com aberturas no tubo de sensor 244 que opticamente detectam a passagem de uma

23/41 semente.

[0054] Como mostrado nas Figuras 1 e 10, uma conjunto de descarga de semente 260 está disposto na extremidade de saída 104 do tubo 100 do transportador de semente 32. O conjunto de descarga é montado no poste 66, com um consolo 262 e um suporte de descarga 264. Um tubo de sensor de semente 266 é montado no consolo 262, e carrega sensores de semente 268 para sentir a passagem de uma semente através dele. Os sensores 268 são preferivelmente sensores ópticos alinhados com aberturas no tubo de sensor 266 que opticamente detecta a passagem de uma semente. Um amplificador de ar 270 é conectado ao tubo de sensor de semente 266. O amplificador de ar 270 (conforme também mostrado na Figura 12) é adaptado para ser conectado a uma fonte de ar comprimido. Quando ar for aplicado ao amplificador de ar, induz um fluxo de ar através do tubo 100, empregando o efeito venturi. Abaixo do amplificador de ar 270 está um tubo conector 272, e abaixo dele está um tubo de descarga de semente ventilado 274 que é também suportado por um retentor do tubo de descarga de semente 276, carregado em um atuador do tubo de descarga de semente 278.

[0055] Em referência, novamente, as Figuras 1 e 2, a extremidade de entrada 122 do tubo 120 do transportador de amostra 34 é conectada por meio do conector 168 ao tubo de descarga de amostra 166. Em referência a na Figura 11, a extremidade de saída 124 do tubo 120 é conectada a um conector de amostra 280, que por sua vez é conectado ao amplificador de ar 282, que é conectado ao conjunto de bico de cinzelamento 284. O conjunto de bico de chip 284 é montado no retentor do tubo de descarga de semente 286, que é carregado em um atuador de descarga 288. O atuador de descarga é montado no poste 68. Filtros 290 são montados nas saídas do conjunto de bico de chip 284, para impedir amostras que são

24/41 descarregadas de contaminar os outros compartimentos.

OPERAÇÃO DO SISTEMA COLETOR [0056] Em operação, uma pluralidade de sementes, por exemplo, feijões-sojas, são depositadas no depósito-alimentador 70. O mecanismo de alimentação de semente 74 carrega uma semente individual para a estação de amostragem 72. Na estação de amostragem, uma amostra de material é removida da semente de uma maneira que minimiza o impacto à viabilidade da semente.

[0057] A amostra é removida da estação de amostragem 72 pelo transportador de amostra 34. O dispositivo venturi 126 cria um fluxo de ar no tubo 120 para a extremidade de saída 124. O material de amostra é tirado do tubo e em direção ao compartimento da bandeja de amostra alinhado com a extremidade de saída 124 do tubo 120. O separador 128 separa a amostra da corrente de ar que o carrega, e permite a amostra cair no compartimento. Em algumas modalidades, a amostra pode ser distribuída a dois ou mais compartimentos na bandeja de amostra em cujo caso o mecanismo de translação bidimensional 30 é operado para colocar um ou mais compartimentos mais adicionais em alinhamento com a saída 124. É possível coordenar com precisão o movimento das bandejas de amostra com a operação da estação de amostragem 72 de forma que as amostras de porções diferentes da semente, e em particular profundidades diferentes da semente, possam ser liberadas a compartimentos separados na bandeja de amostra.

[0058] Após a amostragem da semente ser completada, o transportador de semente 32 é operado para remover a semente da estação de amostragem. O primeiro dispositivo venturi 106 é operado para criar um fluxo de ar no tubo e tirar uma semente da estação de amostragem 72 no tubo 100. O segundo dispositivo venturi 108 é depois operado para criar um fluxo de ar na direção oposta, assim

25/41 desacelerando a semente para reduzir dano à semente à medida que sai da extremidade de saída 104 do tubo 100 e é liberada a um compartimento na bandeja de semente 92. O segundo venturi 108 preferivelmente pára o movimento da semente, permitindo-a cair sob gravidade em seu compartimento em uma bandeja 90. A operação dos primeiro e segundo venturis 106 e 108 pode ser temporizada, ou eles podem ser acionados por sensores de posição que monitoram o tubo 100.

[0059] Outra modalidade de um sistema coletor de semente de processamento alto é indicada em geral como 500 nas Figs. 13-28. Como mostrado nas Figs. 13 e 14, o sistema coletor de semente 500 compreende uma estação de amostragem 502, uma estação de manipulação de amostra 504 e uma estação de manipulação de semente 506. É desejável, mas não essencial, que o sistema coletor de semente 500 encaixe em um ou mais carros com rodas que podem passar através das entradas convencionais, de forma que o sistema pode ser convenientemente transportado. Nesta modalidade preferida, a amostragem da estação de semente 502 é montada em um carro 508, a estação de manipulação de amostra é montada em um carro 510, e a estação de manipulação de semente é montada em um carro 512.

[0060] A estação de amostragem de semente 502 compreende um alimentador de semente 514 e suporta o cinzelador de semente 516. Uma pluralidade de colunas 518 se estendem verticalmente para cima da superfície 520 do carro 508. Uma plataforma 522 é montada em cima das colunas 518 e suporta o cinzelador de semente 514. Dois consolos em L 524 se estendem horizontalmente das colunas 518, e suportam uma plataforma 526. Uma plataforma 528 é montada na plataforma 526 por uma pluralidade de postes 530 e suporta o alimentador de semente 514.

26/41 [0061] Em referência adicional à Figura 17, uma pluralidade de pilares 532 se estende para cima da placa 522. Uma placa 534 é montada nos pilares 532. Uma pluralidade de postes 536 depende da placa 534 e suporta uma prateleira 538.

[0062] Como mostrado nas Figs. 13, 14, 15 e 16, o alimentador de semente 514 compreende um depósito-alimentador 550, com uma superfície configurada adaptada para alimentar as sementes depositadas no depósito-alimentador para uma roda separadora 552 (ver também Figs. 23A a 23C). A roda separadora 552 é montada para rotação em um plano vertical adjacente ao depósito-alimentador 550, e tem uma pluralidade de recessos espaçados 554 cada um tendo uma abertura 556 que comunica com um sistema de vácuo (não mostrado). A roda 552 é avançada com um motor de indexação 560. Sementes individuais são apanhadas pelos recessos 554 na roda 552 e contidas nos recessos através de sucção do sistema de vácuo por meio das aberturas 556. Um limpador 562 limpa as sementes individuais dos recessos 554, lhes permitindo cair através de um guia 564 em uma abertura em um distribuidor 566.

[0063] Em referência adicional as Figs. 24-26, o distribuidor 566 compreende um eixo 568 tendo uma pluralidade (seis na modalidade preferida) de passagens 570 transversalmente estendendo-se por dele. Luvas 572 e 574 são deslizavelmente montadas em cada extremidade do eixo 568 para transladar entre as primeira (interna) e segunda (externo) posições. As luvas 572 e 574 têm uma pluralidade de pares de aberturas alinhadas 576 e 578 em lados opostos destas. As aberturas 576 são alongadas, e as aberturas 576 e 578 são dimensionadas e dispostas de forma que quando as luvas 572 e 574 estão primeiro em sua posição (interna) (no lado esquerdo na Figura 24), uma porção das aberturas alongadas 576 é alinhada com uma passagem 570 no eixo 568, e quando as luvas estão em suas

27/41 segundas posições (externas), uma porção das aberturas alongadas 576 e das segundas aberturas 578 é alinhada com a passagem (no lado direito na Figura 24). Um atuador 580 seletivamente desliza as luvas 572 e 574 entre suas primeira e segunda posições.

[0064] O distribuidor 566 é montado por um consolo 582 no carro 584 de um atuador linear 586 para transladar com relação ao guia 564, sucessivamente colocando cada uma das passagens 570 no eixo 568 em alinhamento com o guia 564 de forma que uma semente possa ser depositada nele. Um sensor de semente (não mostrado) pode ser montado adjacente ao guia 564 para confirmar que uma semente seja depositada em cada passagem 570. Uma pluralidade de bicos de ar 590 é montada na plataforma 528, e é alinhada com as passagens 570 quando o distribuidor 566 é movido para sua posição de dispensação pelo atuador 586. Um tubo 592 é alinhado com cada passagem 570, e cada tubo conecta a um de uma pluralidade de estações de amostragem de semente 600 no cinzelador de semente 516. As luvas 572 e 574 são transladadas permitindo as sementes nas passagens 570 cair nos tubos 592. Um dos bicos 590 é alinhado com cada uma das passagens 570, e é atuado para facilitar o movimento das sementes das passagens 570 através dos tubos 592 para suas respectivas estações de amostragem de semente 600.

[0065] Há preferivelmente uma porta 596 através do depósito-alimentador 550 que alinha com a abertura 556 em cada recesso 554 à medida que a roda 552 gira. A porta 596 pode ser conectada a um vácuo para retirar qualquer sujeira ou pedaços de cascas de semente ou semente que poderiam entupir as aberturas 556 nos recessos 554, e prejudicar a habilidade da roda 552 para selecionar sementes individuais do depósito-alimentador 550.

[0066] Em referência as Figuras 17-22 e 27A-28B, o cinzelador de semente 516 compreende pelo menos um, e nesta modalidade

28/41 preferida seis, estações de amostragem 600. Cada estação de amostragem de semente 600 remove uma amostra de material de uma semente liberada nele. Nesta modalidade preferida, as estações de amostragem 600 são dispostas ou reunidas em dois grupos de três, mas o número e arranjo das estações de amostragem poderiam variar. A estação de manipulação de amostra 504 recebe amostras de tecido removidas de uma semente e transportou longe de cada estação de amostragem 600. Similarmente, a estação de manipulação de semente 506 recebe uma semente após a amostra ter sido removida da semente, e a semente é transportada da estação de amostragem 600.

[0067] Cada estação de amostragem de semente 600 tem um colar de entrada 602 conectado ao tubo 590, que abre para uma câmara 604 (Figura 20). A superfície de fundo da câmara 604 é formada no final de uma haste 606 do atuador 608. A superfície do fundo fica abaixo do colar de entrada 602 para assegurar que a semente inteira caia na câmara 604 e não seja pega em uma posição apenas em parte na câmara. Uma abertura 610 pode ser posicionada oposta ao colar de entrada 602 para permitir ar dos bicos de ar 590 escapar. A abertura 610 pode ser coberta com uma grade de malha 612 para impedir a semente de escapar da câmara 604 e amortecer a semente quando for liberado dentro da câmara.

[0068] Esta haste 606 iça uma semente da câmara 604 e para dentro de um recesso de recepção de semente 614 no lado inferior de uma placa de amostragem de semente 616. A placa de amostragem 616 tem uma abertura de amostragem 618 através da qual uma semente no recesso de recepção de semente 614 protrae. Um sulco de amostragem 620 é formado na superfície de topo da placa de amostragem 616 de modo que uma porção de uma semente no recesso 614 protrae no sulco. A placa de amostragem 616 também

29/41 tem aberturas lateralmente orientadas 622 e 624 alinhadas com o recesso de recepção de semente 614. Quando a haste 606 iça uma semente liberada à estação de amostragem 600 no recesso 614 na placa 616, dedos 626 e 628 se estendem transversalmente através das aberturas 622 e 624 e são operados através do atuador 630 para engastar e comprimir a semente. Foi descoberto que comprimindo pelo menos certos tipos de sementes durante o processo de amostragem pode melhorar a viabilidade das sementes após a amostragem. Para sementes como sementes de feijão-soja, foi observado que uma pressão compressiva intensifica a viabilidade da semente, e aquela pressão compressiva de entre cerca de 1,13 e cerca de 2,26 kg (entre cerca de 2,5 e cerca de 5 libras) é suficiente para intensificar a viabilidade.

[0069] Um perfurador de amostragem 650 tendo uma pluralidade de bordas cortantes 652 recíproca no sulco 620 de forma que as bordas cortantes 652 podem raspar uma amostra de uma semente que é retida no recesso 614 pela haste 606 e pelos dedos 626 e 628. As bordas cortantes 652 são preferivelmente paralelas e orientadas a um ângulo oblíquo menor que 90° com relação à direção de percurso do furador. É desejável, mas não essencial, que as bordas cortantes 652 sejam suficientemente anguladas à borda que permanece em contato com a semente em todo o momento. Angulando as bordas cortantes permite a próxima lâmina estabelecer contato com a semente antes de a lâmina atual perder contato com a semente. Na modalidade preferida, as bordas cortantes são orientadas a um ângulo de cerca de 60°, embora este ângulo dependerá um po uco da largura do furador. A largura do furador pode também ser importante para preservar a viabilidade da semente após amostragem, e pode variar, dependendo do tipo de semente e seu teor de umidade.

[0070] As bordas cortantes 652 são escalonadas, cada uma

30/41 cortando progressivamente mais profundo que a anterior. A quantidade de material de amostra e a profundidade do corte podem ser controlados controlando o avanço do furador 650. Para amostras menores e profundidades mais rasas de corte, o curso do furador 650 é mais curto, e para amostras maiores ou profundidades mais profundas de corte, o curso do furador é mais longo. Para cursos parciais, o tecido da semente pode ser capturado entre as bordas 652. O furador 650 pode ser avançado e retraído para ajudar a liberar toda a amostra. Por exemplo, após a semente ser liberada, o furador pode ser avançado e retraído para ajudar a remover o tecido de semente capturado entre as bordas cortantes. A faixa total de percurso do furador 650 é mostrada nas Figs. 19A e 19B.

[0071] O perfurador de amostragem 650 é preferivelmente dirigido por um atuador linear 654. Na modalidade preferida, três perfuradores 650 são acionados por um atuador simples 654. Usando um atuador simples para operar múltiplos perfuradores poupa espaço e é mais econômico.

[0072] Em referência as Figuras 17-22 e 27A-28B, um sistema de transporte de amostra 656 compreendendo um canal 658 tendo uma entrada 660 que comunica com uma passagem 662 que abre na abertura de amostragem 618 e no sulco 620 na placa de amostragem 616 remove as amostras de tecido feitas pela ação das bordas cortantes 652 do perfurador de amostragem 650. O canal 658 transporta a amostra para a saída 664 onde é depositada em um único retentor de amostra na estação de manipulação de amostra 504 (Figuras 13-16). Este retentor de amostra pode ser, por exemplo, um poço 666 em uma bandeja 668 montada em uma tabela de indexação x-y 670 no carro 510, de forma que a relação entre as amostras e suas respectivas sementes possa ser determinada. O sistema de transporte de amostra 656 inclui um jato de ar 672 que induz fluxo de ar através

31/41 do canal 658 para mover a amostra através do canal.

[0073] Um segundo mecanismo de amostragem pode ser montado no atuador linear 654 e pode ser movido com o furador 650. O segundo mecanismo de amostragem pode compreender um dispositivo centralizador 674 tendo uma ferramenta de centralização 676 para tirar uma amostra de tampão da semente do entalho feito pelo furador 650. Este tecido nesta amostra é de uma localização mais profunda que o tecido raspado pelo furador 650, e fornece informação diferente. Em algumas modalidades o material removido pelo furador 650 poderia ser simplesmente descartado, e apenas a amostra tira com dispositivo de centralizador 674 mantida. Em algumas modalidades ambas as amostras podem ser retidas e separadamente armazenadas para testagem separada. Em ainda outras modalidades a única amostra é a amostra removida pelo furador 650. Em modalidades sem o segundo mecanismo de amostragem, o dispositivo centralizador 674 e ferramenta de centralização 676 podem ser substituídos com um atuador com uma haste de empurrar simples que se estende através da abertura de amostragem 618 para ajudar a empurrar uma semente para dentro do recesso 614.

[0074] Um sistema de transporte de semente 680 que tem uma entrada 682 adjacente ao recesso 614 para capturar sementes após elas serem liberadas pelos dedos 626 e 628 e pela haste 606 diminui a semente após a operação de amostragem. O sistema de transporte de semente 680 transporta as sementes para um único retentor de semente na estação de manipulação de semente 506 no carro 512. Este retentor de semente pode ser, por exemplo, um poço 684 em uma bandeja 686 montado em uma tabela de indexação x-y 688 no carro 612, de forma que a relação entre as amostras e suas respectivas sementes pode ser determinada. O mecanismo de transporte de semente 680 inclui um jato de ar 690 que induz fluxo de

32/41 ar através do canal 680 para mover a amostra através do canal. OPERAÇÃO [0075] Em operação, uma pluralidade de sementes, e.g. sementes de feijão-soja, é descarregada no depósito-alimentador 550 do sistema de amostragem 500. Estas sementes fluem sob gravidade para o disco 552, sucção através das portas 556 prende uma semente em cada cavidade 554. À medida que o disco 552 é girado pelo motor de indexação 560, sementes individuais são limpadas do disco pelo limpador 562, e caem sob gravidade através do guia 564 para a saída. O atuador linear 586 move o distribuidor 566 de forma que cada passagem 570 do distribuidor alinha com o guia 564 para carregar uma semente através da abertura 576 e sob passagem 570. Quando todas as passagens 570 no distribuidor 566 estão cheias, o atuador linear 586 move o distribuidor para posição para carregar suas sementes para dentro das estações de amostragem 600 no cinzelador de semente 516. As luvas 572 e 574 são movidas pelo atuador 580 que alinha as aberturas 578 com as passagens 570 permitindo as sementes nas passagens 570 entrarem nos tubos 592 que leva às unidades de amostragem 600. Os bicos 590 fornecem uma explosão de ar que ajuda empurrar as sementes das passagens 570 através dos tubos 592 para as câmaras 604 nas unidades de amostragem 600.

[0076] Preferivelmente todas as passagens 570 são carregadas em série e descarregadas suas sementes simultaneamente para as unidades de amostragem 600, mas o distribuidor poderia ser programado para operar de alguma outra maneira. Uma vez as sementes chegam às estações de amostragem 600, as hastes 606 içam as sementes nos recessos 614 no lado inferior das placas 616. Os recessos 614 podem ser dimensionados e configurados para ajudar a orientar otimamente a semente. Nos recessos 614, uma

33/41 porção das sementes protrae através dos orifícios de amostragem 618 e nos sulcos 620. Os furadores 650 são transladados nos sulcos 620, permitindo suas bordas cortantes 652 remover o material das porções das sementes que protraem nos sulcos 620, e formando entalhos pequenos nas sementes. À medida que cada furador 650 remove o material, o sistema de transporte de amostra 656 retira o material de amostra através da passagem 662 e na entrada 660. As amostras percorrem nos canais 658 distantes das estações de amostragem 600 para uma localização de armazenamento de amostra, como poços 666 em uma bandeja de amostra 668. Uma segunda amostra pode ser tirada pela ferramenta de centralização 676 do dispositivo de amostragem 674 através da abertura 618 na placa de amostragem 616. Após a amostragem estar concluída, a haste 606 retrai, e à medida que a semente cai o sistema de transporte de semente amostrada 680 transporta a semente amostrada para uma localização de armazenamento de semente, como um poço 684 em uma bandeja de semente 686.

[0077] As tabelas de indexação 670 e 688 movem-se para alinhar os poços diferentes com as saídas do sistema de transporte de amostra 656 e o sistema de transporte de semente 680, e o processo da amostra é repetido. Quando todos os poços 666 em uma bandeja de amostra 668 estão cheios, as amostras podem ser testadas na bandeja de amostra, e as sementes na bandeja de semente 686 correspondente podem ser selecionadas com base nos resultados da testagem das amostras. A amostragem preferivelmente não afeta de forma substancial adversamente a viabilidade das sementes.

EXEMPLOS [0078] Os exemplos a seguir são meramente ilustrativos, e não limitam esta revelação de forma alguma.

EXEMPLO 1

34/41 [0079] Este exemplo descreve um ensaio para prognosticar a zigosidade de embriões de milho usando um gene homozigoto de controle interno (IC) no locus (isto é., duas cópias de IC no embrião diplóide e três cópias de IC no endosperma triplóide). Em uma linhagem consangüínea de um organismo diplóide (ou ploidia mais alta) como milho, o controle interno endógeno é tipicamente homozigoto; eventos transgênicos em tais organismos na primeira geração (denominada R0 em milho) são tipicamente hemizigotos (ou seja, o transgene está tipicamente presente em apenas um dos dois ou cromossomos mais homólogos). Milho (Zea mays) é um organismo diplóide, desse modo um evento de cópia única de R0 tem uma cópia do GOI por célula, mas 0,5 cópia por genoma haplóide, um evento de duas cópias de R0 tem duas cópias do GOI por célula, mas 1 cópia por genoma haplóide, e assim sucessivamente.

[0080] Neste exemplo, tubulina foi usada como o gene de IC, e o GOI era um transgene que codifica neomicina fosfotransferase II (NPT II) que é usada para seleção de resistência à canamicina. Tecido de endosperma (triplóide) foi tirado da semente (ou amostragem à mão ou raspando uma semente com coletor automatizado da presente invenção). A semente de amostra de endosperma foi germinada, e o tecido de folha (diplóide) das plantas com sucesso germinadas foi também amostrado para análise genética. O tecido de folha correlata diretamente com a zigosidade do embrião e foi desse modo usado para demonstrar que a zigosidade do endosperma em geral prognosticou zigosidade do embrião e confirmar chamadas de homozigosidade do endosperma. DNA genômico total foi extraído do tecido de endosperma e do tecido de folha, e quantitativamente analisado usando um ensaio Invader® com sondas de oligonucleotídeos específicos para o gene de interesse, NPT II, ou para o gene de controle interno, tubulina. A razão do GOI para IC foi

35/41 medida usando técnicas de biologia moleculares convencionais. Ver Tabela 1. Um sumário dos resultados de múltiplos experimentos é mostrado na Tabela 2.

[0081] Resultados indicaram que a zigosidade do endosperma em geral prognosticou zigosidade do embrião (como indicado pela zigosidade de folha) e foi seguro em prognosticar a homozigosidade para todas as sementes que germinaram. Além disso, análise da zigosidade de endosperma deu poucas predições homozigotas falsonegativas (especialmente quando o tecido do endosperma foi obtido com o coletor automatizado). Estes resultados demonstram que para uma célula de um nível de ploidia conhecido, a razão de número de cópias de um GOI para o de um IC indica a zigosidade daquela célula. Além disso, o ensaio de zigosidade da presente invenção pode prognosticar zigosidade de um tecido com base na zigosidade de outro, ou seja, o ensaio pode prognosticar a zigosidade do embrião com base na zigosidade do endosperma.

TABELA 1

razão automatizada	zigosidade automatizada	razão manual	zigosidade manual
1,39	heterozigoto	1,42	Heterozigoto
0,14	homozigoto neg	0,12	homozigoto neg
0,08	homozigoto neg	0,08	homozigoto neg
0,13	homozigoto neg	0,10	homozigoto neg
0,10	homozigoto neg	0,08	homozigoto neg
1,55	Heterozigoto	1,38	Heterozigoto
0,84	Heterozigoto	1,45	Heterozigoto
0,14	homozigoto neg	1,48	Heterozigoto

36/41

1,48	Heterozigoto	1,37	Heterozigoto
1,39	Heterozigoto	1,47	Heterozigoto
2,03	homozigoto pos	1,93	homozigoto pos
0,13	homozigoto neg	0,05	homozigoto neg
1,71	Inconclusive	1,81	homozigoto pos
0,81	Heterozigoto	1,41	Heterozigoto
1,84	homozigoto pos	1,77	homozigoto pos
1,54	Heterozigoto	1,43	Heterozigoto
1,48	Heterozigoto	1,50	Heterozigoto
0,92	Heterozigoto	1,40	Heterozigoto
1,51	Heterozigoto	1,42	Heterozigoto
1,60	Heterozigoto	1,37	Heterozigoto
0,86	Heterozigoto	1,47	Heterozigoto
1,81	homozigoto pos	2,02	homozigoto pos
0,15	homozigoto neg	DNA baixo
1,89	homozigoto pos	1,85	homozigoto pos
0,21	homozigoto neg	0,10	homozigoto neg
0,09	homozigoto neg	0,11	homozigoto neg
0,89	Heterozigoto	1,50	Heterozigoto
1,50	Heterozigoto	1,37	Heterozigoto
1,82	Inconclusive	2,02	homozigoto pos
2,14	homozigoto pos	0,99	Inconclusive
1,22	Heterozigoto	1,44	Heterozigoto
2,22	homozigoto pos	2,24	homozigoto pos

37/41

0,79	Heterozigoto	1,40	Heterozigoto
1,23	Heterozigoto	1,47	Heterozigoto
1,49	Heterozigoto	1,38	Heterozigoto
1,33	Heterozigoto	1,37	Heterozigoto

TABELA 2

Método de amostragem de endosperma	número de sementes homozigotas identificadas por análise de endosperma	número de sementes homozigota s prognostica das que não germinaram	número de chamadas homozigot as confirmada s com base na análise de folha	número de chamadas homozigotas falsonegativas com base na análise de endosperma
Manual	8 de 36	0	8(todas)	5(13,9%)
Automatizad o	6 de 24	1	5	0
Manual	6 de 36	0	6 (todas)	2(5,6%)
Automatizad o	6 de 24	1	5	0
Manual	5 de 36	0	5(todas)	7(19,4%)
Automatizad o	7 de 24	2	5	0
Manual	7 de 36	1	6	0
Automatizad o	5 de 24	2	3	0

EXEMPLO 2 [0082] Este exemplo demonstra o uso dos métodos de triagem da presente invenção em um programa para seleção assistida por marcador de feijões-sojas para Ácido Linoléico Baixo.

38/41 [0083] Feijão-soja é a mais valiosa plantação de legume, com muitos usos nutricionais e industriais devido a sua única composição química. Sementes de feijão-soja são uma fonte importante de óleo vegetal que é usado em produtos alimentícios ao longo do mundo. O nível relativamente alto (usualmente cerca de 8%) de ácido linolênico (18:3) em óleo de feijão-soja reduz sua estabilidade e sabor. Hidrogenação de óleo de feijão-soja é usada para diminuir o nível de ácido linolênico (18:3) e melhora a estabilidade e sabor dos óleos de feijão-soja. Porém, hidrogenação resulta na produção de ácidos graxos trans que aumentam o risco de cardiopatia coronariana quando consumidos. O desenvolvimento de feijão-soja de ácido linolênico baixo foi complicado pela natureza quantitativa do traço. As variedades que foram desenvolvidas de feijão-soja de ácido linolênico baixo foram observadas render pobremente, limitando sua utilidade na maioria dos cenários comerciais. Desenvolvendo um produto com rendimento de semente comercialmente de significação é uma prioridade alta na maioria dos programas de desenvolvimento de cultivar de feijão-soja.

[0084] Um exemplo da aplicação dos métodos de triagem da presente invenção é seleção de plantas de feijão-soja com rendimento alto e teor de ácido linoléico baixo. Desempenho de progênie de feijãosoja diminuído uma vez que ele diz respeito ao ácido linoléico baixo conta principalmente com dois locus de traço quantitativo principal (QTL) em Fad3-1b e Fad3-1c. Análise de plantas de segregação demonstrou que Fad3-1b e Fad3-1c aditivamente controlam o teor linolênico em feijão-soja. Portanto, usando uma combinação de marcadores para Fad3-1b e Fad3-1c, o criador usando a invenção pode prognosticar o teor de ácido linolênico com precisão em plantas de feijão-soja. Os marcadores podem ser usados para deduzir o estado genotípico de uma semente em qualquer plataforma no processo de procriação, por exemplo, no estágio de linhagem

39/41 consanguínea acabado, ou o F1, F₂, F₃, etc.

[0085] Um híbrido de F1 seminal pode ser produzido cruzando duas linhagens de feijão-soja consanguíneas (por exemplo, cruzando uma planta contendo os alelos de Fad3-1b e/ou Fad3-1c associados ao teor de ácido linoléico diminuído para uma planta que carece destes alelos) seguido por auto-polinização natural. Uma vez que os marcadores podem ser usados para deduzir o estado genotípico de uma semente simples obtida de um intercombinação de tais linhagens consangüíneas, procriação assistida por marcador de geração precoce (isto é., F₂) pode ser conduzida.

[0086] Semente de feijão-soja em temperatura e umidade ambientes tipicamente equilibram em 8% de umidade em uma base de peso seco. Semente de feijão-soja neste nível de umidade tende a rachar quando cinzelada. Para reduzir a rachadura, a semente deveria ser umedecida em nível de umidade de 12%. Quando pré-tratada desta maneira, a rachadura é significativamente reduzida para < 5%.

[0087] A semente de F₂ selecionada tendo o genótipo desejado pode ser avolumada ou mantida separada dependendo dos objetivos de procriação. Se QTLs múltiplos com efeitos variados estivessem sendo selecionados de uma população dada, o criador poderia preservar a identidade da semente simples para diferenciar os indivíduos com várias combinações da resistência de QTL alvo. Estas sementes poderiam ser plantadas no campo com identificação de campo apropriada. Vários métodos de preservar a identidade de semente simples podem ser usados enquanto transferindo a semente do laboratório de cinzelamento para o campo. Métodos incluem transferir os indivíduos selecionados para fita de semente hortícola que poderia também incluir identificação da radiofreqüência para auxiliar na identificação da semente genotipada individual. Outros métodos seriam para usar uma bandeja de indexação, sementes de

40/41 planta em potes de turfa e depois as transplantar, ou plantar à mão os pacotes de semente individuais.

EXEMPLO 3 [0088] Este exemplo demonstra o uso dos métodos de triagem da presente invenção em um programa para alelos de origem recorrentes em um programa de procriação recessiva.

[0089] Os métodos de triagem da presente invenção podem ser usados para seleção de transgenes como também identificação de alelos de origem recorrentes. A identificação de genótipos com frequência de alelo de origem recorrentes desejadas antes da plantação permite o número de fileiras por população ser reduzido ao longo do programa de procriação inteiro junto com um aumento no número de populações inclusas no programa de conversão dentro de uma unidade de campo dada. Isto resulta em uso de terra melhorado, custos de terra e de mão-de-obra reduzidos, etc.

[0090] Um exemplo de triar o tecido de endosperma de milho para alelos de origem recorrentes em um programa de procriação recessiva é mostrado na Figura 29.

EXEMPLO 4 [0091] Este exemplo demonstra o uso dos métodos de triagem da presente invenção para uso em impressão digital de linhagem de DNA e determinação da fase de ligação.

[0092] Combinada com aumento do DNA de uma semente simples, impressão digital da linhagem poderia ser realizada sem a necessidade de amostrar a linhagem no campo.

[0093] Usando tecido de endosperma de semente (revestimento de semente em feijão-soja) derivado de uma planta diplóide, os haplotipos de marcadores parentais podem ser determinados usando um sistema de genotipagem que permite a detecção de frequências de alelo diferentes nas amostras de DNA. Uma vez que tecido de

41/41 endosperma é triplóide, com duas cópias derivadas do gameta fêmea, a fase de ligação da linhagem parental pode ser derivada dissecando os genótipos de progênie heterozigota. A amostra de DNA do tecido de endosperma permite uma determinação do nível de ploidia do marcador genético. Um nível de ploidia diplóide no marcador genético indica a herança materna e um nível de ploidia haplóide no marcador genético indica herança paterna.

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para analisar sementes em uma população de sementes tendo diferenças genéticas, caracterizado pelo fato de que compreende:

   a) remover uma amostra compreendendo células com DNA de sementes na população usando um sistema de amostragem de semente automatizado (20, 500) enquanto a viabilidade de germinação das sementes é protegida;

   b) triar o DNA extraído da amostra para a presença ou ausência de um marcador genético;

   c) selecionar as sementes da população com base nos resultados da triagem de DNA; e

   d) cultivar as plantas da semente selecionada.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método também compreende determinar o caráter genotípico da descendência da semente antes de selecionar as sementes da população.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as plantas férteis cultivadas da semente selecionada são usadas como ou uma fonte materna ou paterna em um cruzamento com outra planta.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende tecido de endosperma e o método também compreende determinar o nível de ploidia do marcador genético.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que um nível de ploidia diplóide no marcador genético indica herança materna e um nível de ploidia haplóide no marcador genético indica herança paterna.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado

   Petição 870170031661, de 12/05/2017, pág. 7/12

   2/2 pelo fato de que o marcador genético é encontrado na fonte materna da semente.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador genético é encontrado na fonte paterna da semente.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende selecionar a semente com base na presença de um marcador genético que está geneticamente ligado com um QTL selecionado do grupo que consiste em rendimento, resistência temporária, altura, maturidade, resistência a doenças, resistência a pestes, resistência à deficiência de nutrientes e composição do grão.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende selecionar a semente com base na presença de um marcador genético que está geneticamente ligado com um haplotipo associado a um QTL selecionado do grupo que consiste em rendimento, resistência temporária, altura, maturidade, resistência a doenças, resistência a pestes, resistência à deficiência de nutrientes e composição do grão.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende selecionar a semente com base na presença de um marcador genético que está geneticamente ligado com um transgene.