CN102821593A - 组织分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于非破坏性地对种子群体中的单粒种子进行取样的方法。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于将污染组织从其他种子材料中去除的有效的、高通量的方法。本发明的方法对于确定种子的基因型以及检测遗传标记或遗传性状是有用的。本发明的方法包括将母体组织（如种皮或果皮）从种子去除，并且对种子的剩余部分进行分析。因为已经去除了复杂的母体组织，本发明的方法降低了在遗传测试中的不明确程度。

Description

组织分离方法

领域

本发明涉及一种用于非破坏性地对种子群体中的单粒种子进行取样的方法。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于从所希望的种子组织中去除不希望的种子组织的有效的、高通量的方法。在另一个实施方案中，该方法包括从种子中去除母体组织，以及针对感兴趣的遗传标记或遗传性状或其他种子表型或基因型如油、淀粉、遗传修饰性状、DNA或RNA序列或蛋白质对种子的剩余部分进行分析。

背景技术

如Chunwongse等人的理论应用遗传学（Theoretical Applied Genetics）86:694-698(1993)所展示，来自种子的胚乳DNA的扩增已为人知至少15年。对种子DNA进行基因分型的高通量基因分型系统用于测试许多品种的种子，这些品种包括玉米、小麦、蔬菜、花卉、向日葵、甜菜、水稻、大豆以及其他品种。高通量种子切削装置是有效的，因为可以鉴定并且抛弃所不希望的种子，并且可以鉴定并且保留所希望的种子。种子切片是适合于基因分型的种子DNA样品并且可以是用于在植物育种计划中使用的大多数育种过程的标记辅助植物选择的实验材料。在种植种子之前，在留下有活力的种子的同时，对来自切下的种子的一部分的种子DNA进行基因分型在许多方面是有益的。对于切下的种子部分的测试允许鉴定并且选择具有优选基因型的有活力的种子，并且它也允许鉴定和消除较不优选的种子基因型。

然而，由于存在像种皮这样的母体组织，由种子切片来确定种胚的基因型可能是复杂的。这些组织增加了测试结果的不明确并且导致选择不适当的种子。这种不明确可以通过在种子DNA测试之前去除母体组织来消除。

从种子样品中去除母体组织经常是不容易的，因为它要求去除外种皮，即种子的果皮。大多数种子的相对较小的大小使得母体种皮的分离和去除是困难的，或者充其量也是费时费力的。作为母体种子组织的实例的玉米果皮是种子的成熟子房雌株组织。种皮或果皮的功能是保护内部胚乳以及胚免于疾病以及水分损失。为了实现这一功能，果皮通常是具有几个细胞厚度并且紧密附着于种子的内部的一个层。母体种皮的坚硬保护性质难以去除，从而使得分析种子材料的剩余部分是具有挑战性的。

例如，玉米以及大豆加工应用时常去除种子的母体组织，这是因为果皮的构成会不利地影响最终产品的性质和组成。因此，加工工业已经开发出许多化学溶剂和浸泡工艺以便去除坚韧的母体种皮组织。然而，这些工业过程是费时的并且并未被设计成保护种子胚乳DNA组织的完整性。因此，这些过程对于保存种子的非母体组织中的种子DNA并不是太理想。

因此，对于一种自动化的、高通量的、有效的方法仍然存在着需要，该方法用于非破坏性地从单粒种子或种子片中去除母体种子组织如种皮，同时以可测试形式保存种子。

简要概述

本发明的方法增加了在种子群体中选择具有所希望的性状或基因型或表型的种子的效率。本发明还涉及一种用于测试种子材料的有效的、高通量的方法。本发明尤其适用于针对遗传修饰性状对纯度标准进行测试。但是本发明还用于测试外来的遗传修饰过的生物体（genetically modified organism）的存在、在育种中进行标记辅助选择、以及染色体型和数量以及胚质的遗传纯度。在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于非破坏性地对种子群体中的单粒种子进行取样，然后基于测试结果从这个群体中选择种子的方法。可以针对特定等位基因、单倍型、基因位点或遗传性状、表型或基因型或感兴趣的在种子中经受检测的其他种子成分对种子进行分析。

在一个实施方案中，本发明涉及一种选择具有某性状的种子的方法，该方法包括：(a)将种子涂覆以涂层，(b)以非破坏性的方式将涂覆的种皮的至少一部分从单粒种子分离，(b)将涂覆的种皮或其一部分从种子或其一部分分离；(c)针对至少一种感兴趣的性状的存在或缺乏对无种皮种子或其种子部分进行分析；以及(d)基于对所述无种皮种子或种子部分的分析来选择种子。这些方法可以在不影响种子的发芽势（germination viability）的情况下执行。在一个实施方案中，涂覆的种子包括涂覆在金属涂料、金属或金属覆盖物中的种子。该方法可以针对至少一种感兴趣的性状的存在或缺乏对无种皮种子或其种子部分的遗传组分进行分析。该方法可以分析遗传物质的序列。

在一个实施方案中，本发明涉及一种选择具有所希望的性状的在群体中的种子的方法，该方法包括：(a)对种子的至少一部分施用一种涂层；(b)以非破坏性的方式将包含种皮的至少一部分的种子切片从涂覆的种子中去除；(c)将种皮从种子切片分离；(d)针对至少一种感兴趣的性状的存在或缺乏对无种皮种子切片进行分析；以及(e)基于至少一种感兴趣的性状的存在或缺乏针对种子群体选择种子。这些方法可以在不影响种子的发芽势的情况下执行。涂层被选择成使得种子的发芽势不受影响。

在一个实施方案中，涂层对磁力有反应。涂层可以是允许不需要的材料与所希望的材料分离的任何物质，包括但是不限于金属涂料、金属、金属涂层。

在一个实施方案中，使用包括但是不限于磁铁、磁性板或磁性液体的吸引剂将种皮从种子切片分离。

在一个实施方案中，本发明涉及一种分析种子的性状的方法，该方法包括：(a)将涂层施用至种子的至少一部分；(b)使涂覆的种皮从种子的至少一部分松开；(c)将涂覆的种皮从种子的这个部分分离；(d)针对至少一种性状的存在或缺乏对无种皮种子或种子部分进行分析。此方法还可以具有基于至少一种感兴趣的性状的存在与否来选择或取消选择种子的步骤。在本发明的至少一个实施方案中，采用吸引力来分离涂覆的种皮。该方法可以包括涂覆，其中所述涂覆是磁性涂覆。在将种皮从种子或其一部分分离的自动化高通量系统中，分离涂覆的种皮的步骤采用吸引力。

在一个实施方案中，本发明涉及一种选择在群体中的种子的方法，其中至少一些种子具有至少一种感兴趣的性状，该方法包括：(a)将涂层施用至种子的至少一部分；(b)以非破坏性的方式将包含涂覆的种皮的至少一部分的种子切片从涂覆的种子去除；(c)将种皮从种子切片分离；(d)针对至少一种性状的存在或缺乏对无种皮种子切片进行分析；以及(f)基于至少一种感兴趣的性状的存在或缺乏从所述种子群体选择种子。

在另一个实施方案中，这些方法包括种植所选择的种子。本发明的这些方法包括用所选择的种子栽培植物。在又另一个实施方案中，可以从所栽培的植物收获种子。本发明的方法的产物包括种子或没有种皮的种子的一部分。该方法的另一种产物是包含种皮部分以及非种皮部分的涂覆的有活力的种子，其中该非种皮部分也缺乏涂层。该方法的另一种产物是具有内表面以及外表面的种皮，其中该外表面用磁性材料涂覆。该方法的另一种产物是具有内表面的种皮的一部分，其中所述种皮内表面被适配成与种子的不是种皮的至少一部分接合，并且其中所述种皮内表面的所述部分从所述种子部分脱离并且所述种皮外表面被涂覆。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于在自动化过程中将种皮的至少一部分从种子的至少一部分去除的方法。本发明涉及一种用于将种皮的至少一部分从种子的至少一部分去除的方法，包括：(a)将涂层施用至种子的至少一部分；(b)使种皮从至少该涂覆的种子部分松开；(c)将涂覆的种皮的至少一部分去除；以及(d)保留在去除涂覆的种皮之后的种子的剩余部分。

本发明的优点是用于选择具有感兴趣的性状的种子的快速的、有效的、任选地自动化的、高通量的方法。

本发明的优点是在没有种皮混淆该分析的情况下对种子的基因型进行精准的分析。对基因型的这种分析对于种子生活力是非破坏性的，并且分析在种植种子之前发生，从而只种植所选择的种子，导致减少与产生具有所希望的性状的种子相关联的时间、成本以及劳动。

本发明的优点是使用不破坏DNA的涂层来去除污染组织，如母体种皮或果皮，并且提高了种子的遗传分析的准确性。

本发明的优点是它可以产生用于测试、基因分型或测试与基因分型的三种种子成分，即种子、种子切片以及种皮。可以使用一种方法测试或基因分型过程来给出所有三种类型的种子成分样品的有效而准确的分析。

本发明的优点是种皮的保存，该种皮可以用于对其DNA进行测试、基因分型或测试与基因分型以便确定母本的基因型。

本发明的优点是它允许分离种子成分样品。这允许在去除脱离的种皮之后通过从种子材料中提取淀粉、粗粉、胚芽、粉末、乙醇、油、蛋白质来测试种子或种子切片。

附图简要说明

图1是具有对于本领域普通技术人员来说并非清晰可辨的纯合以及杂合等位基因的等位基因鉴别图；并且这个等位基因鉴别图的自动化分析是不可能的。

图2是使用与图1中显示的等位基因鉴别图中所使用的样品相同的样品的等位基因鉴别图，除了是在没有将种皮从所测试的样品中排除的情况下测试种子之外。

图3显示了三组大豆种子，一组是未涂覆的对照（左侧），下一组种子用磁性涂料轻微地涂覆（中间），最后一组种子用磁性涂料厚重地涂覆（右侧）。

图4是一个96孔块（96 well block），显示为每一孔含有脱离的种皮和子叶组织（呈现为种子切片），已经通过将种子材料暴露于高温而使种皮和子叶组织分离。

图5显示了96叉磁铁（96 prong magnet），每个磁铁具有附接至一个轴的扩大的头部。每个磁铁被适配成配合在单个孔之内。

图6显示插入在含有种皮和子叶组织的96孔块中的96叉磁铁（种皮和组织未显示）。

图7显示了从含有子叶组织的孔块（well block）中提取的涂覆的种皮，该涂覆的种皮通过吸引力而保持在磁叉（magnetic prongs）上。

图8显示了与磁叉磁性接合的涂覆的种皮的特写照片。

图9显示了在将图7和图8中显示的磁叉引入含有种子材料以及涂覆的脱离种皮的孔中之后的图6的96孔块。这些叉展示附着于叉上的被吸引的涂覆的种皮。这种叉已经与被吸引的涂覆的种皮一起从孔中去除，同时留下未涂覆的脱离子叶组织保持在96孔中。

图10显示了另一种类型的叉磁铁的另一种设计，该叉磁铁具有不同叉数目和不同叉形状，但是仍然被适配成从被涂覆以及未涂覆的种子材料的混合物中选择性地吸引涂覆的种子材料。

图11显示了采用叉磁铁的另一种方法。叉磁铁被放置于96孔块的孔的下方。每个叉将被磁性涂覆的种子颗粒从超过一个孔吸引至孔块底部的磁叉上；可以将孔块倒置以便通过顶部开口去除未涂覆的种子材料，同时通过种子上的涂层与磁铁的磁性吸引强度将涂覆的种子材料保持在闭合的孔底部。

图12显示了具有吸引涂覆的种子材料的足够强度的块状或平坦磁铁。

图13显示了置于96孔块之上以便紧邻磁铁固定所吸引的涂覆的种子材料的平坦磁铁。

详细说明

定义：

本披露中的数值范围是近似值，并且因此可以包括范围之外的值，除非另外指明。数值范围包括在下限值与上限值（包括在内）之间的所有值，这些值以一个单位递增，条件是在任何下限值与任何上限值之间存在至少两个单位的间隔。作为一个实例，如果组成、物理或其他特性（例如像分子量、粘度、熔融指数等）为100至1,000，旨在清楚地列举所有单独的值，如100、101、102等，以及子范围，如100至144、155至170、197至200等。对于含有小于1的值或含有大于1的分数（例如1.1、1.5等）的范围，在适当时，一个单位被考虑为0.0001、0.001、0.01或0.1。对于含有小于10的单个数字的范围（例如1至5），一个单位典型地被考虑为0.1。这些只是特殊预期的实例，并且在所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合将有待考虑清楚地陈述在本披露中。尤其对于混合物中的成分的相对量以及在方法中引述的不同温度和其他参数范围的数值范围提供在本披露中。

术语“吸引剂”是指以足以允许所希望的物质或成分分离的力来吸引所希望的物质或成分的任何物质或成分。

术语“污染组织”是指不希望用于特定分析的组织。

术语“涂覆”或“涂覆的”是指单独或以成分混合物形式添加至种子的任何物质或成分，其中该物质或成分具有吸引或结合至一种吸引剂的特征。

术语“植物”包括单子叶植物、双子叶植物以及转基因植物。

本发明涉及用于测试种子材料的有效的、高通量的方法。本发明尤其有用于要求高纯度标准的研究，例如像对于遗传修饰性状的研究。所要求的种子包装中的种子纯度近似地为95%的种子纯度。这要求95%或更多的植物是该品种并且不能为非正常型。限制种子为非正常型对于最终用户是非常重要的。当种子携带重要性状，如对于害虫、除草剂或病原体的耐受性或抗性时，纯度是尤其重要的。因此，如果种子携带抗昆虫GM性状，那么95%或更多的种子必须含有有效量的这种性状。如果该性状是杀虫剂耐受性，那么杂质的负面后果对于最终种植者是高度可见的，因为使用杀虫剂喷雾剂会导致杂质的消除。因此，严格地测试了种子纯度水平。针对所希望的概貌（profile）使用测定法来测试从种子生长的幼苗，不论这种特征是基因型、表型或遗传工程化性状。使用非正常型幼苗（没有所希望的概貌的幼苗）的检测数目来外推种子批（seed lot）中可能为非正常型的种子的总百分比。虽然当杂质随机分布遍及种子批时这个系统可能是非常准确的，但是如果杂质不是随机散布遍及该种子批，那么所确定的纯度的准确度是有问题的。

总体上，本发明提供了改进的种子切片测试，该测试对于较大取样或者在种子批中的所有种子具有快速的结果（如果总体测试是所希望的话）。本发明的改进有助于消除以前测试方法的一些潜在不准确性。与使用幼苗相比，使用种子切片可能导致针对测定的更少的可检测化学品或化合物。并且与幼苗不同，种子含有更为多样化的DNA混合物。例如，玉米种子在如胚、胚乳以及种皮的不同种子部分中具有不同的倍性。种皮完全是母体的，胚同时是母体与父体的，并且胚乳具有两个用量的母体以及一个用量的父体，使它的倍性成为三倍体。如果测定所检测的特征是在父本上，那么胚和胚乳具有相同的等位基因，并且胚乳中的表达不会使结果偏移。然而，如果特征是在母本上，那么如果等位基因在种皮中表达，则可能获得不准确或不清楚的测定结果。

如果种子来自于自交种类，那么由于杂合体的自交，负面性状可能是不引人注意的，并且当性状发生这种分离时，那么检测更高的性状纯度是实际的。

性状测试经常是复杂的，因为多重性状如性状的三重/四重叠加可能是常见的。在没有由额外的种皮信息增加的混淆复杂性的情况下，能够测试来自同一种子切片的所有性状将是有用的。如果在测试之前去除种皮是简单的，那么就将它去除。然而，种皮难以从用于测试的种子材料上脱离并且然后分离。本发明提供了用于将种皮从其他种子材料分离的自动化高通量方法。本发明提供了无种皮种子或种子部分，该无种皮种子或种子部分对于与鉴定种子材料的事件、标记辅助选择和育种以及遗传纯度相关的测试方法是有用的。

本发明还提供了用于对于种子群体中的没有种皮的单粒种子进行非破坏性地取样的自动化的、有效的方法。非破坏性的种子取样方法可以使种子和种子样品相关联，藉此在一个高通量平台中将种皮去除。这个平台针对某一个或多个的特征来测试已经从它的种皮分离的种子样品，并且选择相关联的具有这一个或多个特征如事件、标记或基因型的种子的种子群体以供进一步使用。借助于无种皮种子切片测试结果的准确性，可以迅速地选择并且膨胀种子。

在一个实施方案中，该方法包括从种子的所希望的组织中去除污染种子组织。在一个实施方案中，该方法包括从种子样品中的胚乳衍生组织中去除母体种子组织污染物。在又另一个实施方案中，本发明提供了一种用于将母体种皮DNA从种子DNA自动分离，进而对种子DNA进行分析以及基因分型的方法。并且任选地包括一种用于对母体种皮DNA进行分析以及基因分型的方法。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于从所希望的种子组织去除污染或不需要的材料的自动化的、高通量的方法。在这个实施方案中，该方法包括从种子组织提取果皮/种皮DNA的步骤。从所得到的组织中提取的DNA的分析提供了未来植物的明确的基因型。改进的种子遗传特征的基因分型允许改进的、更有效的标记辅助育种计划。

种子可以衍生自单子叶植物或双子叶植物。单子叶植物的非限制性实例是草皮、草坪草、谷物、玉米、水稻、燕麦、小麦、大麦、高粱、兰花、鸢尾（iris）、百合、洋葱、香蕉、甘蔗、高粱以及棕榈。双子叶植物的非限制性实例是鳄梨、马铃薯、烟草、番茄、甜菜、绿花椰菜、木薯、甘薯、胡椒、油菜、油菜籽、棉花、瓜类、黄瓜、一品红、豆类、苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、雏菊以及仙人掌。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于非破坏性地对种子群体中的单粒种子进行取样的方法，包括：从种子中去除污染组织；筛查从在污染组织去除之后得到的种子提取的DNA；根据所得到的种子或其一部分的DNA筛查结果选择种子；以及利用所选择的种子来栽培植物。在一个实施方案中，污染组织是母体组织，包括但不限于种皮或果皮。在另一个实施方案中，从种子去除污染组织并不影响种子的发芽势。在另一个实施方案中，去除污染组织是以一种使得保持种子的剩余组织免受害虫以及病毒影响的方式来进行的。

在一个实施方案中，本发明涉及一种选择具有所希望的性状的在群体中的种子的方法，该方法包括：(a)以非破坏性的方式将包含涂覆的种子的至少一部分的种子切片从种子群体中的单粒种子去除，(b)将涂覆的种皮从种子切片分离；(c)针对至少一种感兴趣的性状的存在或缺乏对无种皮种子切片进行分析；以及(d)基于至少一种感兴趣的性状的存或缺乏针对种子群体选择种子。这些方法可以在不影响种子的发芽势的情况下进行，如果这是所希望的话。在一个实施方案中，涂覆的种子包括以材料如金属涂料、磁性涂料、金属或金属覆盖物涂覆的种子。

在又另一个实施方案中，本发明涉及选择具有所希望的性状的在群体中的种子的方法，该方法包括：(a)将涂层施用至种子的至少一部分；(b)以非破坏性的方式将包含涂覆的种皮的至少一部分的种子切片去除，(c)将涂覆的种皮从种子切片分离；(d)针对至少一种感兴趣的性状的存在或缺乏对无种皮种子切片进行分析；以及(e)基于至少一种感兴趣的性状的存或缺乏针对种子群体选择种子。如果种子的发芽势是重要的，那么可以选择涂覆，使得种子的发芽势不受影响。

在另一个实施方案中，该方法包括从种子的至少一部分（如种子切片）去除污染组织的至少一部分。种子切片可以使用手工方法获得，包括但不限于手术刀、刀或美工刀。在另一个实施方案中，种子切片可以使用自动方法获得，包括但不限于钻机、研磨机或种子切削装置。在一些实施方案中，涂覆在种子上的材料可能会负面地影响种子的发芽势。例如，当去除种皮并且在破坏类型的测试参数方面测试种子内容物时，那么涂覆对于发芽势的影响并不是一个问题。然而，对于许多方法来说，选择用于涂覆的材料以避免负面地影响剩余种子的种子切片生活力。如果用于涂覆的具体材料没有负面地影响种子生活力并且需要种子生活力但是不需要种子切片生活力，那么可以将涂层仅仅施用至作为种子切片的种子部分。

在另一个实施方案中，种子切片和种子彼此相关联，使得来自种子切片的组织、DNA、蛋白质、油、淀粉等等的分析的结果可以归因于相关联的种子。例如，种子切片可以被标示为“SC1”并且种子可以被标示为“SE1”，从而允许来自“SC1”的分析的结果可以归因于具体的种子“SE1”。种子切片和种子可以储存在微量滴定板的相应孔中（例如种子切片可以储存在第一块板的A1中并且种子可以储存在第二块板的A1中）。

发芽势表示在取样之后保持有活力的所取样的种子的优势数目（即所有取样种子的50%以上）。在具体的实施方案中，至少大约75%的取样种子并且在一些实施方案中至少大约85%的取样种子保持有活力。应当指出的是，在某些情况下或者对于某些应用来说，较低比率的发芽势可能是可容忍的，例如，随着基因分型成本的降低，对于相同的基因分型成本，可以对更大数目的种子进行取样。

在一个实施方案中，从种子去除污染组织包括将涂层施用至种子并且使用该涂层将所希望的组织从所不希望的组织分离。这种涂覆的污染组织是种皮或果皮。涂层可以施用在整个种子、3/4种子、1/2种子、1/3种子、1/4种子或仅用于测试的种子的一部分或甚至将被测试的种子的一部分的亚群上。必须施用涂层以允许污染组织被吸引并且将其从种子材料的剩余部分去除。取决于在下游如何进一步处理种子，种子的部分涂覆可能是足够的或者完全涂覆可能是必需的。可以在发生种子的任何分隔之前或之后施用涂层。可以施用涂层一次或一次以上。还可以使用超过一种类型的涂层。

该涂层可以是可以用来将所希望的材料从所不希望的材料分离的任何物质，包括但不限于金属涂料、磁性涂层、磁性涂料、基于金属的涂层、金属涂层、带有正电荷的涂层或带有负电荷的涂层。金属涂料的非限制性实例是Krylon，磁性涂料的非限制性实例是Rust Oleum Metallic底漆（Vermon Hills,IL）、液体镶嵌壁磁性涂料（liquid mosaic wall magnetic paint）（Scientifics,Tonawanda,NJ）以及来自Kling Magnetics（Chatham,NJ）的神奇壁磁性涂料（magic wall magnetic paint）。

涂层可以是顺磁性材料，包括但不限于铝、铜、锂、镁、钼、铂以及钽。涂层可以是铁磁性材料，包括但不限于钴、铁、镍、钆、钢。或者可以用作磁化金属的任何化合物。

涂层可以以允许从种子材料的剩余部分中去除污染组织的任何方式进行施用，这些方式包括但不限于喷涂、刷涂、浸涂、电喷涂、浸泡或浸渍。

在一个实施方案中，将一种金属涂料涂层施用于种子。然后将种子置于种子切削装置中，如显示于美国专利号7,502,113中的装置或在美国申请公布2010/0050300中的装置，这些申请通过引用以其全部内容进行结合。将种子切片以及被连接并且被涂抹的种皮安放于容器，如微量滴定板的孔之中。通过紧邻涂层放置例如像磁铁的吸引力来手工或自动地将种皮从种子切片迅速去除。

可以使用任何类型的吸引剂，只要吸引剂对于涂层具有足够的亲和力以允许去除涂覆的材料即可。吸引剂可以采用任何形式，包括固体、液体或气体。吸引剂与涂层可以直接接触或间接接触。可以一次或一次以上施用吸引剂来去除涂覆的材料。吸引剂的多轮施用可能有助于去除涂覆的材料。只要例如遗传分析的测试的效率和准确度得到提高，就可以去除任何量的涂覆的材料，这种提高包括但不限于从大约1%提高直至100%提高，或从大约5%直至95%的任何一点的提高，或大约10%直至90%的任何一点的提高，或大约20%直至80%的任何一点的提高，或大约30%直至70%的任何一点的提高，或大约40%直至60%的任何一点的提高，或大约50%至大约55%。

如果粘附的组合物足够强地被磁化以便用金属来提取，一种有用的吸引剂是金属片。如果种子用磁性或金属组合物涂覆，另一种有用的吸引剂是磁铁。这可以是块磁铁，参见图12。吸引剂可以是由电磁铁产生的磁力，因此该吸引剂能够被接通和断开。具有N48、N50以及N52等级的的磁铁，如钕（NdFeB）磁铁，足以吸引被轻微涂覆的松开的种皮。总体上，磁铁强度与“N”数相关联，但不总是这样。N52是磁铁材料。磁铁的强度来自于它被磁化的充分程度，希望达到饱和。这类钕磁铁（又称为NdFeB、NIB或Neo磁铁）是稀土磁铁。这些被归类为永久磁铁，并且由形成四方晶体结构Nd2Fe14B的钕、铁以及硼的合金制成。这是最强的、容易找到的永久磁铁。但是也可以使用由不同合金或电磁铁制成的其他磁铁。如果磁铁足够强以便吸引涂覆的种皮并且将它从靠近其他种子组织的位置提取出，那么就可以在本发明的范围内使用这种磁铁。

打开或关闭吸引力的能力允许较容易地重新安置所吸引的种皮材料。通过关闭吸引力，可以将涂覆的种皮从磁铁排出至新的位置中，例如在用于测试的不同的孔块中，或者在与从中提取出种皮的切片/或种子相关联的另一个位置中，或者如果不需要种皮时排出至废物容器中。图5显示了作为分叉磁铁的磁铁。这种磁铁的叉被适配成下降至定位或储存种子切片和涂覆的种皮的孔区域之中。种皮上的磁性涂料被吸引至磁铁。这种吸引允许涂覆的种皮组织从未涂覆的种子组织的位置的提取。图5的磁铁具有与这种块所具有的孔的数目相同的叉数目。取决于种子组织的储存容器，磁铁可以被适配成具有不同的叉数目、形状、强度、大小以及长度。

磁铁可以具有任何数目的叉。当从所希望的种子组织自动去除涂覆的污染种子组织时，具有与块中的孔数目相对应的磁铁叉将是有用的。可替代地，磁铁可以具有与孔块中的一行或一列的数目或宽度相关联的叉。另外，磁铁可以具有足以同时处理超过一个孔块的叉，或者它可以是被适配成在个别化基础上提取种皮的单一叉磁铁。如在图6中所示，磁铁被下降至孔中并且被脱离的涂覆的种皮被吸引到磁铁叉上。如在图7和8中所示，当磁铁叉离开孔时，种皮粘附到磁铁上。图9显示了现在仅含没有种皮污染物的种子切片的孔。然而，具有未涂覆的对照的孔将保留于孔中，并且不会粘附至吸引剂，因此不会由磁铁提取出。

图7和8的磁铁叉各自保持单独的污染种子组织，在这种情况下即涂覆的种皮。可以以使种子组织污染物与它的相对应的种子切片/种子相关联的方式将污染种子组织重新安置于分开的微孔之中。这允许采用种子污染物来测试如种子母体基因型这样的信息。

可以用多种方式来完成涂覆的种皮的去除。原则是使可能含有种皮的涂覆的种子部分从所希望的组织分离。一种简单方法是用磁铁覆盖整个微量滴定板，参见图12和图13。使微量滴定板（或其他收集装置）翻转倒置数次。以与微量滴定板的孔中的相关联的种子切片相同的型式将涂覆的种皮定位在磁铁上。为了促进污染种子组织与所希望的种子组织的关联，可以将孔型式（well pattern）放置于磁铁之上，使污染物与所希望的种子组织的关联更加直观。

可替代地，可以将单独的磁铁插入许多孔之中，参见图10和11或者插入孔中的每一个之中，参见图5。可替代地，可以将一个微量滴定板倒置于容纳种子组织的微量滴定板顶部，并且可以将污染种子组织以及磁铁施加于该板顶部，从而将污染种子组织抽吸至第二微量滴定板之中。也有可能通过在原始种子切片收集装置的底部用磁铁捕获种皮，同时将所希望的种子组织倾倒至新的容纳装置中，从而将所希望的组织转移至新的容纳装置中。

这些类型的种子污染物处理程序尤其适合于高通量自动化操作。这个过程包括使种皮从种子切片上脱离，同时将种皮从多个种子切片分离，然后将这些种子切片定位于测试设备之内。一种同时将种皮从多个种子切片分离的方法采用机械臂紧邻种子组织容纳装置而定位吸引剂。污染种子组织被抽出，该臂使所抽出的污染组织移动至新的位置，并且种子切片被进一步处理。容纳装置中的没有污染种子组织的种子切片可以被处理用于测试这种种子组织的基因型或表型特征。测试经常涉及使用来自用于遗传测试的种子组织的DNA。然后将结果进行分析并且用于各种育种选择之中。

在另一个实施方案中，该方法进一步包括在去除污染组织之前将污染组织从种子切片上松开。取决于种子的类型、种子的年龄以及收获种子的方法，可能需要或者可能不需要松开污染组织。一种用于松开污染种子组织的过程显示于美国专利7,141,260中，该专利披露了一种对玉米种子进行超声处理以便将果皮从剩余种子组织上松开的方法。超声处理机制用来产生超声能量并且赋予将污染种子组织（如果皮）松开的超声波能量。然后使用摩擦式研磨机（frictional mill）来研磨经过超声处理的种子以便将松开的污染组织（如种皮）从胚乳分离，而不破坏胚乳DNA。

在另一个实施方案中，可在使种子经受污染组织的松开之前或之后施用涂层。如果在松开步骤之前施用涂层，就要选择能够经受住松开过程的涂层，使得涂层保留在松开的种皮上。

在另一个实施方案中，含有污染组织（如种皮）的涂覆的种子切片可以直接被抽吸至微量滴定板的新的孔中。DNA可以从污染组织中提取出并且进行分析以便确定母体植物的基因型。可替代地，可简单地抛弃污染组织（如种皮/果皮），或者可以测试它的其他基因型性状。

在另一个实施方案中，该方法包括从所希望的组织提取DNA。可以使用为本领域技术人员已知的提供足够DNA产量、DNA质量以及扩增的任何DNA提取方法。适合的DNA提取方法的非限制性实例是使用离心的基于SDS的提取。另外，可以使用已知的扩增方法（包括但不限于PCR以及定量PCR）来扩增提取的DNA。

在另一个实施方案中，该方法包括针对所希望的性状或遗传标记来筛查DNA。标记的非限制性实例包括但不限于基因、内含子、外显子、限制性片段长度多态性（RFLP）、单核苷酸多态性（SNP）、扩增片段长度多态性（AFLP）、随机扩增DNA多态性（Rapd）、确定基因的存在和/或拷贝数（包括GMO以及倍性数）的实时PCR以及简单重复序列（SSR）。另外的标记为本领域技术人员所熟知并且描述于分子克隆实验手册（Molecular Cloning:ALaboratory Manua）（第三版,Cold Spring Harbor Press）中。

通过去除污染组织（如种皮或果皮），剩余种子材料的遗传分析更加准确，导致增加了适当选择的种子的数目。另外，容易地排除了不具有感兴趣的遗传标记或性状的种子，并且因此通过不种植缺乏所希望的概貌的种子而节约资源，如时间、资金以及劳动。通过实施在此披露的方法，可以增加具有感兴趣的所希望的遗传标记、基因型、表型或性状的种子的鉴定。

所希望的性状可以是完整的遗传概貌。可替代地，它可以是作为显性或隐性等位基因而存在的表型或基因位点。在本发明的某些实施方案中，基因位点赋予例如以下性状：例如像雄性不育、蜡质淀粉、抗虫性、除草剂抗性、昆虫抗性，对于细菌、真菌、线虫或病毒疾病的抗性，收率、抗倒伏性、高度、成熟度、水分利用效率、淀粉酶、对养分缺乏的抗性、籽粒组成，以及改变的脂肪酸、肌醇六磷酸或碳水化合物代谢。基因位点可以是通过回交而引入该品种的亲本基因组中的自然存在的基因、自然或诱导突变，或通过遗传转化技术引入的转基因。当通过转化引入时，基因位点可包括整合在单一染色体位置处的一个或多个转基因或者整合在多个染色体位置处的一个或多个转基因。

在一个实施方案中，种子的概貌、基因位点或基因标记是通过选自下组的方法检测的，该组包括等位基因特异性PCR、凝胶电泳、毛细管电泳、微通道电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、荧光检测、荧光偏振、DNA序列测定、桑格双脱氧测序法、ELISA、质谱法、飞行时间质谱法、四极杆质谱法、扇形磁场质谱法、扇形电场质谱法、荧光测定法、红外光谱测定法、紫外光谱测定法、恒电势电流测定法（palentiostatic amperometry）、DNA杂交、DNA微阵列、GeneChip阵列、HuSNP阵列、BeadArrays、MassExtend、SNP-IT、适用于等位基因确定的TaqMan测定以及实时PCR、Invader测定、MassCleave、DNA印迹、狭线印迹（slot blot）以及斑点印迹等等。

转向图1，这个图显示了来自具有种子组织污染物的大豆种子切片的等位基因鉴别图。从具有种皮材料的种子切片中提取DNA。纯合以及杂合等位基因不是清晰可辨的。由于杂合型的幅宽（breadth），不清楚哪些种子系（seedline）实际上是纯合的。基于此图，本领域的普通技术人员不能够鉴定图上的与所有真实纯合测试结果以及所有杂合测试结果相对应的点。污染种子组织的母体DNA使这个图的结果发生偏斜；并且自动化分析是不可能的。

图1曲线可以与图2曲线相比较。图2的图是如图1中显示的样品等位基因鉴别图，然而，这个图涉及到在DNA提取之前污染种子组织（大豆种皮）从其去除的种子切片DNA。用缺乏种皮的种子切片所获得的这个图显示了哪些种子是纯合材料与哪些种子是杂合的之间的清楚区分。

图1和图2中的这些图，分别具有母体DNA和没有母体DNA，显示了种皮所产生的偏斜效应。通过将种子涂覆以涂层并且在必要时通过冷冻干燥、超声处理或加热来使种皮松开，本发明的这些方法以高通量、自动化的方式消除了这种DNA污染物。一旦种皮被松开，通过应用一种吸引剂来去除显示在图2中的涂覆的母体组织。在这种情况下，该涂层是磁性涂料并且该吸引剂是磁铁。

无种皮种子切片以及被去除的种皮两者都具有可以测试并且使用的DNA。种子切片中的遗传物质对于筛查植物倍性、在回交育种计划中的复现亲本等位基因、在批量育种群体中的纯合性，选择或检测转基因、天然等位基因或亲本等位基因是有用的。在种植之前对种子基因型或表型的鉴定允许鉴定并且选择携带所希望的性状的种子，并且因此允许淘汰不需要的种子。

通过在PCR测试之前使用本发明的方法从种子切片中去除母体组织，测试结果更加准确并且改进了种子的选择。去除种皮并且因此去除种皮DNA使得胚乳的分析更加容易。该方法允许在无种皮的偏斜效应的情况下确定准确的种子胚乳接合性（seed endosperm zygosity）。准确地检测所希望的种子的能力导致在育种计划中所种植的每一群体的种子的行数减少。因为较少种子被错误鉴定，种植较少的所希望的种子，更有效地利用了时间以及大田空间，并且育种或转换计划使大田空间增加测试的群体数量。这种测试准确性的提高导致土地利用提高、土地需求减少以及劳动成本降低等。

可以进一步应用本发明的这些方法来鉴定用于转基因测试的杂交种子。例如，在BCnF1阶段中的近交系的转化中，杂交种子批针对感兴趣的性状是50%半合子的并且针对缺乏的性状是50%纯合的。为了产生用于测试的杂交种子，应当筛查不具有果皮污染种子组织的这种材料以便鉴定作为半合子的F1种子。这种种子污染组织分离方法的有利之处在于可以选择并且分析仅仅来自具有正确性状接合性遗传学的杂种的产量数据。可以在具有种子之前获得此数据，这些种子可以产生能够产生这种接合性的大田植物。

本发明提供了一种允许对具有或不具有特定的所希望的性状、标记或基因型的适当种子块进行种子切片测试和鉴定的设备和方法。种子切片，尤其是玉米、甜瓜、南瓜或大豆种子切片，允许以高通量方式从种子切片去除种皮组织。

在本发明方法的操作中，种子是轻微涂覆的。这种涂层可以用吸引剂覆盖整个种子表面或仅仅种子表面的一部分。容易获得的一种涂层是磁性涂料。可以采用任何方式将涂料的薄层施用至种子外表面的一部分。例如，可以使种子在涂料中滚转，用涂层材料刷涂、轻触或喷涂种子。在一个实验中，将Krylon磁性涂料如此薄地喷涂于种子外表面上，使得大豆的种脐保持可见。磁性涂料的这种薄涂层是足以允许发生种子组织分离的涂层。

允许种子的被涂抹的表面干燥，然后将种子材料的小切片去除，留下种子的有活力的剩余部分。种子切片含有种子材料以及附着至切片的外部种子表面的轻微涂抹的种皮。用于从较大种子片切削小的种子片的设备是已知的。多年以来，通过切割、锯切、钻孔、切片、剪裁手工地切削种子，可以用指甲钳、裁纸刀、剪刀、刀子、钻机、钢丝钳、锯子等等的任何一种来切削种子。可以采用能够去除种子片的任何仪器。这些手工种子切削方法已变得自动化，因为种子测试变得更快速而有效。例如，如在WO 2010/022286中显示的自动激光切削装置，以及在EP1991043及其美国副本中显示的自动织锦锯装置已经使先前的手工种子切削程序自动化。通过使用高速锯、电动刀、钻机或激光器的自动切削经常在切片中产生高温，导致种子和种皮组织变得彼此紧紧地成型在一起。因为种皮组织可能使种子测试的结果偏斜，在种子切片测试之前种皮的脱离和去除是所希望的。自动切削产生的高温成型使得种皮从种子切片上松开或脱离是有问题的。

松开种皮的已知方法包括将种子暴露于升高的烘箱温度、延长的在水中的浸泡、以及种子的超声处理。使种皮从种子切片组织上脱离的另一种已知的方法是通过将切片（或如果种子本身不是被保存为用于发芽，将种子）放置于液氮之中。使用液氮使种子与种皮材料脱离是昂贵的并且要求特殊化学储存和处理。使用氮的方法显示于W.John Mullin等人，J.Agric.Food Chem.,2001,49(11),第5331–5335页中。

本发明包括促进污染种子组织从种子组织上松开的新发现的实验方案。将几微升的100%乙醇施用至附着在一起的污染种子组织与种子组织，使两种组织松开。当切片在微孔中时，足以覆盖这些切片的仅少量乙醇迅速与成型的种子切片和种皮相互作用，以便使种皮与子叶组织脱离并松开。出人意料地发现通过添加像醇这样的挥发性液体诱导了种皮从种子组织上脱离。可以用低蒸气压的液体（例如70%乙醇）稀释这种挥发性液体。并且可使用许多不同类型的醇，只要这些化学品没有负面地影响待处理和/或测试的所希望的种子组织的能力即可。可以在没有过度实验的情况下使用挥发性液体，如丙酮、异丙醇、丙醇、甲醇、丁醇等等。

在使污染种子组织从种子组织上松开的本发明方法中，乙醇在室温下在护罩下从容纳种子组织的微孔中蒸发。更有效的过程可以采用在高温下的烘箱以便促进乙醇从微孔中的更有效去除。乙醇有效地将种皮从种子切片上松开，在微孔中留下两个分开的种子组织部分：存在于种皮部分中的母体DNA、以及由子叶组织构成的种子切片部分。

另一种实验方案采用水使种皮与子叶组织脱离。此不是优选的过程，因为两个种子组织倾向于膨胀，使得它们更大并且更重。污染组织中的水的重量要求涂层是更厚的，使用更多磁性涂料和更强的磁铁来升高污染种子组织的重量。然而，水重量问题的一个部分解决方案是使水从孔和种皮中蒸发。

本发明在操作中用磁铁来捕获磁化的污染种子组织。这允许将污染种子组织定位于与所希望的种子组织不同的位置处。最初，将种子用磁性涂料厚重地涂覆，但是已发现轻微地涂覆的种子是非常有用的并且更轻。

切削用磁性涂料涂覆的大豆种子，并且将切片转移至96孔块。然后可将该块放置于65°C的烘箱中以便将种皮组织从子叶组织分离。用磁性涂料磁化的种子在烘箱加热过程中使它们的种皮松开，然后松开的种皮经受处于磁铁形式的吸引力。可替代地，松开可以通过本发明的乙醇实验方案来进行，不管松开两个种子组织的过程如何，在一个组织上的涂层允许种子组织分离。

显示在这些图中的种子组织分离涉及具有被适配成在微孔的开放部分之内滑动的单独的叉的磁铁。在种皮组织上的磁性或金属涂料被吸引到磁铁上，当然，缺乏涂料的内部种子切片组织未被吸引到该磁铁上。因此，与磁铁或金属磁性接合的脱离的种皮然后可以从96孔块中提升出，将子叶种子组织留在孔中。图6显示了与脱离的种子组织分离之后的磁性接合的种皮。涂覆的种皮附着至磁铁；参见图8，处于与孔中的相关联的种子切片相同的型式。这允许所分离的种子组织材料彼此相关联或与从其取得该材料的剩余种子相关联。

总体上，图3-9显示了用本发明的磁化系统来分离大豆污染组织与子叶种子组织的步骤。如果紧邻一个第二相关联器皿定位具有种皮的磁铁的同时释放该磁铁的磁力，则可以将这些污染组织释放到该器皿中。该器皿可为第二微孔滴定板。

这些图显示了可以在这个系统中采用替代性的板样磁铁而不是分叉磁铁。可以用覆盖整个板的大磁铁来分离果皮，该大磁铁充当该孔板的盖子。可将孔板倒置以便将涂覆的果皮紧密靠近磁铁板来放置。然后可以将具有大盖子样磁铁的微孔滴度板扶正。涂覆的果皮材料将粘附到磁铁上并且种子切片将处于孔中。

仅出于说明目的而提供了这些实例并且本发明绝不应当理解为限制于这些实例，而是应当理解为涵盖由于在此提供的传授内容而变得明显的任何以及所有变化形式。

实例

实例1：处理大豆

将大豆种子用磁性涂料在整个种子表面上轻微地涂覆。在种子与喷嘴之间大约15英寸的距离下施用Krylon磁性涂料喷雾剂的非常薄的涂层。

在涂料干燥之后，从每一个种子去除小切片。种子切片或样品的选择可以通过将种子放置于如在美国专利7,502,113中展示的自动种子切割装置中来实现，该专利全部通过引用结合在此。将种子切片收集于微孔滴定板中。

1.涂覆的种子切片可以具有彼此粘附的种皮与种子组织，但是在这种情况下采用剃刀将种子切片从种子分离。通过将孔/块（或所采用的其他收集装置）放置于65°C-75°C的烘箱中来分离这些材料。通过这些高温将大豆种子脱皮是由食品加工行业使用的标准程序。涂覆的种子切片还可以在稍微高于或低于65°C-75°C的温度下干燥，条件是它使外皮或种皮脱离。

2.在使用激光器来切割种子的其他实验中，将种子放置于烘箱或冷冻干燥机/食物加工机中，以便使涂覆的种皮从其余种子组织脱离。高温或冷冻干燥机的使用在大约70%的所有样品上发生作用，将种皮从种子切片切开。

3.如果子叶与种皮组织仍然彼此附着，可以将高温与冷冻干燥机过程结合。另外，这些种皮脱离过程的任何一个或两个可以与振动步骤结合或随后进行振动步骤。微孔滴定板可以放置在振动器中用于使种皮另外地从切片上剥离。为了实现两个组织的更有效地切开，可以采用这些步骤中的所有三个和/或将它们组合而使种子和种皮脱离。

4.如果在使用冷冻干燥机或烘箱之后，将微孔垂直振动，则两个组织的稍微更高程度的切开是有可能的。然而，使用这种切开过程可能导致一些损失（escape）。

步骤2：用磁铁捕获磁化的种皮并且将它们从种子切片位置去除

通过施用吸引剂将用磁性涂料磁化并且松开的种皮从块的孔中去除。在这个实验中，种皮上的磁性涂料被磁铁吸引。可以用各种方式来进行涂覆的种皮的去除：一种简单的方法是用磁铁覆盖整个块。将这个块（或其他收集装置）翻转倒置几次。这样以与微孔中的相关联的种子切片相同的型式将涂覆的种皮定位于磁铁上。

在这个实验中，将显示在图6中的单独的磁铁插入每个孔中。图6显示了可以在此实验中使用的许多磁铁叉。图6-13显示了构成本发明的不同实施方案的不同形式的磁铁。这些类型的磁铁中的每一个可以如图中所示那样使用。

这种磁铁被良好适配成在自动化系统中使用。磁铁可以通过机械方式下降至孔中并且将脱离的种皮吸引到磁铁叉上。

在这个实验中，将这些叉手工地下降至孔中，到达孔底部的极小距离范围之内。当这些磁铁叉从单独的孔中抽出时，种皮粘附到磁铁上，而种子切片保持在这些孔中。

将种皮重新安置于与切片或种子位置分开的位置。可以将种皮定位在具有孔的另一个微孔板中，这些孔与种皮自其脱离的种子切片/种子相关联。这些种皮然后可以用于进一步测试。或者如同在这种情况下，可以通过从磁铁叉的尖端擦掉并且抛弃而重新安置种皮。

可替代地，可以将96孔板放置在种皮/种子切片容纳板的顶部，并且可以将磁铁施用至顶部孔的底部，将涂覆的种皮从种子切片上吸走进入第二孔板中。通过在原始种子切片收集装置的底部用磁铁捕获种皮也将是可能的，从而将子叶组织转移至新的容纳装置中。

然后将具有种子切片并且不具有混淆性种皮的微量滴定板放置在自动PCR系统中以便进行基因型测试。将遗传分析的结果计分并且选择与具有所希望的基因型结果的种子切片相关联的种子，以便进一步培育和收获。

实验2

可以采用实验一的步骤。来自这个实验的种皮可以用于确定磁性涂料的轻微涂覆是否会消除将种皮用于测试目的的能力。一种测试将用于查明是否在用吸引剂涂覆之后DNA提取会变得复杂。所分离的种皮可以放置在自动PCR系统中以便确定是否可以针对母本上的信息或来自母本的性状对母体DNA进行测定。种皮DNA在它被测试时应当提供预期的母本DNA基因型，尽管具有磁性涂料的轻微涂覆。

实验3

这些种子处于三个组中：一个是未被涂抹的种子对照，一个种子组用磁性涂料轻微喷涂，并且另一个种子组用金属涂料轻微喷涂。用剃刀刀片从种子上切割种子切片。将具有三个切片的第二组用激光器切削并且将种子种植于温室中以确定涂料对于种子产生有活力的植物的生活力的影响。检查植物以确定是否存在由切割并且涂覆的种子所产生的正常幼苗。与未被涂抹的种子对照组的出苗和生长相比，这些幼苗的出苗和生长并没有显著不同。

虽然已经在此说明并且描述了具体实施方案，但是将由本领域的普通技术人员认识到的是，可以用被推测为实现相同目的的任何安排来替代所展示的具体实施方案。本申请旨在涵盖根据所描述的本发明的原理起作用的任何改变或变化形式。因此，预期的是本发明仅仅由权利要求书以及其等同物限制。

Claims (20)

1.一种选择具有所希望的性状的在群体中的种子的方法，该方法包括：

(a)将涂层施用至种子群体中的种子的至少一部分上；

(b)以非破坏性的方式将包含种皮的至少一部分的种子切片从该涂覆的种子上去除；

(c)将该种皮从该种子切片分离；

(d)针对至少一种感兴趣的性状的存在或缺乏对该无种皮种子切片进行分析；以及

(e)基于至少一种感兴趣的性状的存在或缺乏选择种子。

2.如权利要求1所述的方法，其中以非破坏性的方式将包含种皮的至少一部分的种子切片从单粒种子上去除不影响发芽势。

3.如权利要求1所述的方法，其中该种子是大豆或玉米种子。

4.如权利要求1所述的方法，其中该涂层对磁力有反应。

5.如权利要求1所述的方法，其中该涂层是磁性涂料。

6.如权利要求1所述的方法，其中将该种皮从该种子切片分离包括使用结合至该涂层的吸引剂。

7.如权利要求1所述的方法，其中对该无种皮种子切片进行分析包括从所述无种皮种子切片提取DNA。

8.如权利要求7所述的方法，其中从所述无种皮种子切片提取DNA产生了DNA，与该种子切片相比，该DNA具有显著更少的母体DNA。

9.如权利要求1所述的方法，其中将该种皮从该种子切片分离包括将许多种子切片定位在测试设备中并且同时将种皮从多个种子切片分离。

10.如权利要求1所述的方法，包括在去除该种子切片之前将该种皮从该种子上松开。

11.如权利要求1所述的方法，包括在分离该种皮之前将该种皮从该种子切片上松开。

12.如权利要求11所述的方法，其中将该种皮松开包括对该种子切片进行超声处理。

13.如权利要求12所述的方法，进一步包括以不显著改变所测试的性状的水平来施加热量。

14.如权利要求1所述的方法，进一步包括用所选择的种子来培育植物并且任选地包括从所培育的植物收获种子。

15.一种用于将种子污染组织从种子组织的至少一部分中分离的方法，包括：(a)将涂层施用至种子的至少一部分；(b)将种子污染组织从该种子组织的至少该部分上松开；(c)将该涂覆的种子污染组织从所述种子组织的至少一部分上分离；以及(d)在去除该涂覆的种子污染组织之后，保留该种子的剩余部分以供进一步使用。

16.如权利要求15所述的方法，其中松开包括将种子污染物和种子组织浸渍于液体中的步骤。

17.如权利要求16所述的方法，其中去除该涂覆的种子污染组织包括使用吸引剂。

18.如权利要求18所述的方法，其中该吸引剂是磁铁。

19.如权利要求15所述的方法，其中将该种子污染组织从该种子组织上松开采用以下至少一个步骤：超声处理、高温暴露、醇接触、氮接触或振动。

20.一种分析从其种皮脱离的种子材料的基因型或表型特征的方法，该方法包括：(a)涂覆种子，(b)以非破坏性的方式将涂覆的种皮的至少一部分从种子材料上松开，(b)通过使用吸引力将该涂覆的种皮或其一部分从该种子材料分离；(c)针对至少一种基因型或表型特征的存在或缺乏对该无种皮种子材料进行分析。

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