CN106715716A - 用于将植物材料基因分型的体系和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于从植物胚获得遗传物质，同时保持它们活性的方法，以及用于对植物胚，尤其是具有少量遗传物质的植物胚进行分子分析的方法。所述方法可包括从一个或多个植物胚收集脱落的细胞材料的步骤；从所述脱落的细胞材料获得DNA；进行所述DNA的分子分析；以及使所述一个或多个植物胚中的至少一个发芽。该方法的进一步延伸包括确定所述胚是否发芽和生长，或是否基于胚的基因型而丢弃它，作为育种过程的一部分。还提供了使用包含在琼脂之中或之上的胚脱落细胞材料对胚进行基因分型的方法，和分析来源于小孢子的植物胚组织的方法。

Description

用于将植物材料基因分型的体系和方法
相关专利申请的交叉引用
本发明申请要求2014年8月29日提交的美国国家专利申请14/473,114的权益，所述文献全文以引用方式并入本文。
背景技术
遗传、生化或表型分析所使用的现有传统种子分析法需要至少取出并且加工种子的一部分。在取出一些种子组织时，可能需要满足各种目标。这些目标可包括以下目标的一项或多项：
(a)如果需要，在收集种子组织后保持种子的活力。
(b)获得至少最小所需量的组织，而不影响活力。
(c)从种子上的特定位置获得组织，通常需要将种子定向在特定位置的能力。
(d)为了效率目的，维持特定的吞吐量水平。
(e)减少或几乎消除污染。
(f)允许跟踪分离的组织及其与获得组织的种子的相关性。
传统种子测试技术并未充分解决这些需求，从而对资金和劳动力资源造成压力，因此说明需要改善现有技术水平。当前方法的吞吐量相对较低、存在相当大的交叉污染风险，并且因依赖于显著的手工处理、定向和从种子上除去组织而倾向于不一致。这可影响从种子取得的组织的类型和种子发芽的可能性。需要消除当前方法在移除种子组织各个部分之间进行清洁所需的资源。还需要减少或最小化通过携带或其它原因测试的独特组织部分之间的交叉污染，或任何其它组织的任何来源的任何污染。此外，需要更高的可靠性和准确性。
此外，上面示出的一些目标可能是冲突的，甚至是对立的。例如，获得可用量的组织，同时保持种子活力，需要取一些种子组织，但不是太多。此外，高吞吐量方法涉及快速操作，但是可能伴随精确度的降低和污染的风险增加，使得所述方法必须比技术上所可能的更慢地进行以克服所述限制。因此，这些多个目标存在于本领域中，并且没有被当前可用的方法和装置令人满意地解决或平衡。在本领域中需要克服上述类型的问题，使得实现最大数目的目标。
发明内容
本发明包括用于分析植物材料，同时保持植物材料活力(即形成植物的能力)的方法。所述方法可包括以下步骤：从一个或多个植物胚(或从来源于小孢子的植物胚组织)收集脱落的细胞材料；从脱落的细胞材料获得遗传物质如DNA；以及进行遗传物质的分子分析。所述方法还可包括使所述一个或多个植物胚中的至少一个发芽。胚可从种子获得，或可通过体细胞或配子(小孢子)胚形成而来源于其它组织。在一个实施方案中，通过在非破坏性培养基如水或其它水性溶液中搅动胚，从胚收集脱落的细胞材料。搅拌可以通过本领域普通技术人员已知的任何方式进行。
在另一个实施方案中，通过获得与植物胚接触的琼脂的一部分来收集植物胚的脱落的细胞材料，其中所述部分包含植物胚的脱落的细胞材料。可将部分琼脂放置于基本上由水或TE组成的非破坏性培养基中，并且可使用本领域普通技术人员已知的任何方法进行搅拌。所述方法还可包括从琼脂除去胚，并且使用本文提供的方法储存胚或将胚转移至发芽培养基。植物胚可为单倍体胚，并且琼脂可包含染色体加倍剂，如但不限于秋水仙碱。因此，植物胚可变成双倍单倍体。在另一个实施方案中，可使用滤纸代替琼脂。
在上述任何方法中，可通过将所收集的脱落的细胞材料暴露于冷却，然后加热，接着搅拌，从脱落的细胞材料获得DNA；可重复所述步骤。在其它实施方案中，可通过加热脱落的细胞材料并且搅拌，从脱落的细胞材料获得DNA；可重复所述步骤。在其它实施方案中，可通过用酶培养脱落的细胞材料获得DNA；所述酶可为L，一种包含宽泛范围的糖酶的多酶复合物，包括阿拉伯糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、和木聚糖酶。(参见Sigma Aldrich产品目录)。在其它实施方案中，可使用DNA提取技术获得DNA，如但不限于使用结合遗传物质的磁性颗粒或本领域普通技术人员已知的任何方法。
方法包括从胚(或来源于小孢子的胚组织)的脱落细胞材料获得遗传物质，并且对遗传物质进行分子分析，同时保持胚发芽的能力。分子分析可为基因分型，其可通过以下方式发生：单核苷酸多态性检测、限制性片段长度多态性识别、随机扩增多态性检测、扩增片段长度多态性检测、聚合酶链式反应、DNA测序、全基因组测序、等位基因特异性寡核苷酸探针、或者DNA与DNA微阵列或小珠的杂合。可在分子分析之前进行全基因组扩增。在其它实施方案中，一个或多个步骤可以是自动的。
在一些实施方案中，可通过将胚或胚组织悬浮在由一种或多种油的基质包围的水性溶液中，来储存胚。优选地，一种或多种油中的至少一种具有大于水性溶液的密度。胚或胚组织的储存可在从胚或胚组织收集脱落的细胞材料之前或之后发生。在一些方面，可将抗微生物剂和/或最小生长培养基加入到水性溶液中。在其它方面，胚或胚组织可在冷却(优选4℃)和/或黑暗条件下储存以防止过早发芽。在一些实施方案中，可转移胚或胚组织以连续储存。在其它实施方案中，可将胚转移至发芽培养基中，并且可使一个或多个胚发芽。在其它实施方案中，可除去水性溶液的等分试样，可从等分试样中的细胞材料获得遗传物质，并且遗传物质可用于分子分析(例如对储存的胚进行基因分型)。分子分析可为基因分型，其可通过以下方式发生：单核苷酸多态性检测、限制性片段长度多态性识别、随机扩增多态性检测、扩增片段长度多态性检测、聚合酶链式反应、DNA测序、全基因组测序、等位基因特异性寡核苷酸探针、或者DNA与DNA微阵列或小珠的杂合。在其它实施方案中，上述步骤中的一个或多个可以是自动的。
方法包括获得胚DNA(无论所述获得胚DNA是否包括提取)，以保存胚发芽和长成植物的能力的方式储存从中提取DNA的胚，使用胚DNA对胚进行基因分型，以及确定是否使胚发芽和生长(即选择)或基于其基因型丢弃胚(即反选择)。基于其基因型选择发芽和生长的胚可长成植物并且表型，用于育种，或用于扩增相同基因型的种子。在优选的实施方案中，所述方法的一个或多个步骤可以是自动的。
一个实施方案允许通过从一个或多个种子收集母本种子组织来确定一个或多个种子的母系谱系；洗涤母本种子组织；解离并且均化母本种子组织以获得均化溶液；离心所述均化的溶液以获得上清液；并且使用上清液DNA进行分子分析。在一个实施方案中，母本种子组织是果皮。洗涤步骤可用1％十二烷基硫酸钠溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。洗涤步骤优选用约1％十二烷基硫酸钠的水溶液进行。解离并且破碎果皮组织可使用细胞解离器(例如gentleMACSTM，Miltenyi Biotech)进行。所述方法还可包括在分子分析之前使用全基因组扩增以获得足够的DNA产量。
另一个实施方案允许通过从一个或多个种子收集母本种子组织来确定一个或多个种子的母系谱系；洗涤母本种子组织；解离并且均化母本种子组织以获得均化溶液；从均化溶液中包含的细胞提取DNA；并且对所提取的DNA进行分子分析。在一个实施方案中，母本种子组织是果皮。洗涤步骤可用1％十二烷基硫酸钠溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。洗涤步骤优选用约1％十二烷基硫酸钠的水溶液进行。解离和均化步骤可使用细胞解离器(例如gentleMACSTM，Miltenyi Biotech)进行。提取步骤可使用DNA结合磁性颗粒或Extract-N-AmpTM进行。所述方法还可包括在分子分析之前使用全基因组扩增以获得足够的DNA产量。
另一个实施方案允许通过从一个或多个种子收集母本种子组织来确定一个或多个种子的母系谱系；洗涤母本种子组织；在液氮中破坏母本种子组织；从破碎的母本种子组织中提取DNA；并且对所提取的DNA进行分子分析。在一个实施方案中，母本种子组织是果皮。洗涤步骤可用1％十二烷基硫酸钠溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。洗涤步骤优选用约1％十二烷基硫酸钠的水溶液进行。提取步骤可使用DNA结合磁性颗粒或Extract-N-AmpTM进行。所述方法还可包括在分子分析之前使用全基因组扩增以获得足够的DNA产量。
另一个实施方案允许通过从一个或多个种子收集母本种子组织来确定一个或多个种子的母系谱系；洗涤母本种子组织；直接从经洗涤的母本种子组织中提取DNA；并且对所提取的DNA进行分子分析。在一个实施方案中，母本种子组织是果皮。洗涤步骤可用1％十二烷基硫酸钠溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。洗涤步骤优选用约1％十二烷基硫酸钠的水溶液进行。提取步骤可使用Extract-N-AmpTM进行。所述方法还可包括在分子分析之前使用全基因组扩增以获得足够的DNA产量。
在上述任何实施方案中，分子分析可以是基因分型的。当收集来自多于一个种子复制的母本种子组织时，可获得共有基因型。
附图说明
在图1至11中，上下颠倒的三角形代表具有一个纯合状态的样品；右侧向上的三角形表示具有另一个纯合状态的样品；指向左边的三角形代表杂合对照；圆圈表示缺失或阴性对照数据；并且菱形代表不可量化的调用。沿着与任一轴平行的线的点簇越紧密，所测试的方法的变化越小。
图1示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示四种不同培养体积(10μL、20μL、50μL和75μL)的每一种中的三种不同的处理(仅培养；培养并且敲击；以及培养、敲击和旋转)。
图2示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示50μL培养体积中的一种处理(培养、敲击和旋转)。
图3示出了使用从冷-热休克、热休克、用L培养、或使用方法的DNA提取获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示50μL培养体积中的三种不同的处理(仅培养；培养并且敲击；以及培养、敲击和旋转)。
图4示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示50μL培养体积中的一种处理(培养、敲击和旋转)。
图5示出了使用从冷-热休克、用L培养、或使用方法的DNA提取获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示50μL培养体积中的三种不同的处理(仅培养；培养并且敲击；以及培养、敲击和旋转)。
图6示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示50μL培养体积中的一种处理(培养、敲击和旋转)。
图7示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示150μL培养体积中的三种处理(仅培养；培养并且敲击；以及培养、敲击和旋转)。
图8示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示150μL培养体积中的一种处理(培养、敲击和旋转)。
图9示出了使用通过在脱落的细胞材料的所有随后洗涤中进行冷-热休克处理或者不进行处理而获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示三种处理(仅培养；培养并且敲击；以及培养、敲击和旋转)和两种培养体积(50μL和100μL)。
图10示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示50μL培养体积中的一种处理(培养、敲击和旋转)。
图11示出了使用通过冷-热休克处理和为在基因分型前获得足够DNA产量的全基因组扩增(使用REPLI-g单细胞试剂盒)而获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示10μL培养体积中的四种处理(仅培养；以速度3涡旋5秒；以速度10涡旋5秒；以及以速度10涡旋30秒)。
图12示出了第一玉米品系的胚发芽结果，其中使用本文提供的方法储存胚。
图13示出了第二玉米品系的胚发芽结果，其中使用本文提供的方法储存胚。
图14示出了涉及果皮组织剥离的步骤。
图15比较了使用DNA的基因分型测定，所述DNA得自a)使用多个种子的常规CTAB DNA提取方法，和b)使用一个种子(组织洗涤)的DNA提取方法，随后进行全基因组扩增。
图16展示了可从单个果皮获得的优质荧光标记数据。
图17展示了从单个种子(每条线)提取的果皮组织的测得的基因型和已知母本基因型之间的高度相似性。
具体实施方式
胚或胚组织的基因分型允许在植物发育早期分子表征，允许比其它方法如表型或植物基因分型早数周或数月，进行期望基因型的选择。因此，资源可更早聚焦于具有发育成所需植物的最大概率的胚。用于遗传表征胚组织的技术可大幅增强分子育种程序，并且通过允许育种者仅培育具有所需基因的植物来消除大量的精力和资源。此外，在不阻碍其发芽能力的情况下可靠地遗传表征胚的能力可显着减少植物两代之间所需的时间量。
植物育种程序中的非破坏性基因分型可能需要一个或多个以下步骤：
1.将活体植物来源与其它植物材料分离；
2.保存活体植物来源；
3.获得对应于多种活体植物来源的遗传物质，同时保持多种活体植物来源的活力；
4.获得用于分子表征的遗传物质；
5.分子表征来自多种活体植物来源的遗传物质；
6.基于分子表征选择一种或多种活体植物来源；以及
7.培育所选择的活体植物来源。
活体植物来源可为例如种子、植物胚、植物组织、或整株植物。最典型地，活体植物来源能够长成植物，但不是一定的。遗传物质可以是粗制的，即与植物组织的其它部分混合，包括纤维素和蛋白质材料，或者它可以是纯化的(例如通过本领域普通技术人员已知的DNA提取方法)。遗传物质可直接取自活体植物来源，或者其可取自其它植物材料。保存步骤可包括以保持长成植物的能力的方式保持活体植物来源。保存步骤可包括以防止发芽的方式保持活体植物来源。分子表征步骤可涉及基因分型、基因测序、RNA测序、限制性片段长度多态性标记检测、单核苷酸多态性检测、全基因组扩增、特异性蛋白质检测、油含量测量、蛋白质含量测量、或可用作选择或拒绝特定活体植物来源的基础的任何其它分子分析。生长步骤可涉及培育植物的任何手段，包括在田地或温室中种植、水栽培育、空气培育、或培育植物的任何其它方法。在一些实施方案中，植物生长至成熟并且产生花粉和/或种子。在一些实施方案中，一个或多个步骤是自动的。
分离活体植物来源.
在涉及玉米的一个实施方案中，将玉米籽粒的顶盖切下，同时使它们仍附着到玉米芯。玉米籽粒的顶盖通常是距胚最远的籽粒部分，其更靠近附着到玉米芯的籽粒的尖端。然后可使用例如小刮刀或任何其它适宜的装置，移除每个胚。在一个实施方案中，使用机械手顶盖切片机(一种机械手操纵的刮刀)和用于精确切割和胚移除控制的机器视觉平台，将该过程自动化。
在另一个实施方案中，可在胚除去之前从玉米芯中除去玉米籽粒。然后可以相同的方式定向籽粒，例如通过将籽粒漂浮在水中或溶液中。然后可固定籽粒，同时保持它们的取向，例如通过将它们排入具有多个孔的容器中，每个孔保留定向的籽粒。然后可除去籽粒的尖端小块，优选足够小以避免损害胚。接着可通过从籽粒顶盖侧面轻轻挤压籽粒来提取胚。
在胚移除后，可将每个胚放置在具有多个孔的容器中，其中记录每个孔中每个胚的位置，与在随后步骤中获得的遗传物质的位置相关联或联系。
保存活体植物来源
当活体植物来源是种子时，就进行分子分析所需的时间量而言，保存种子通常不需要特别小心。然而，当活体植物来源是胚时，应特别注意保持活性。胚可储存在多孔板中，其中每个孔对应于其中放置待测试的提取组织的孔。
在一个优选的方法中，将胚悬浮在由一种或多种油的基质包围的水性溶液中。具有小于水的密度的油将覆盖水性溶液中的一个或多个胚，而具有大于水的密度的油将支撑水性溶液中的一个或多个胚。在一些实施方案中，将一个或多个植物胚悬浮在由两种或更多种油的基质包围的水性溶液中，其中两种或更多种油中至少一种的密度大于水性溶液，并且两种或更多种油中至少一种的密度小于水性溶液，此外其中水性溶液被比密度高于水性溶液的油和密度低于水性溶液的油包围。胚的储存可在从胚收集细胞材料之前或之后、授粉后的任何时间(如果胚直接从种子获得)发生。在一些实施方案中，可向水性溶液中加入抗微生物剂和/或最小生长培养基。在一些实施方案中，胚可在冷却和/或黑暗条件下储存以防止过早发芽。在优选的实施方案中，将胚在约4℃的温度下储存。在一些实施方案中，可将胚转移以连续储存。在其它实施方案中，可将胚转移至发芽培养基中，并且可使胚发芽。在优选的实施方案中，可除去水性溶液的等分试样；遗传物质可从等分试样中的细胞材料获得；并且可使用遗传物质以进行分子分析(例如对储存的胚进行基因分型)。
可用于该方法的高密度油包括但不限于具有12种化合物的全氟化合物(例如DuPont的较低粘度油)。可用于该方法的低密度油包括但不限于苯基甲基聚硅氧烷。本领域普通技术人员已知的其它无毒油可替代这些化合物使用或与这些化合物组合使用。
获得细胞材料.
细胞材料是指在活体植物来源分离之后余下的任何植物材料。细胞材料可包括胚和/或胚乳材料，并且可涉及一个细胞、多个细胞或细胞组织。如果需要亲本植物的遗传信息，可从果皮获得遗传物质。
在一个实施方案中，细胞材料来自一个或多个植物胚，其中所述一个或多个植物胚直接从种子(即合子胚形成)获得，或可通过体细胞或配子(小孢子)胚形成而“来源于其它组织”。体细胞胚形成涉及由体细胞(即营养或非配子细胞)(即从分离的体细胞外植体)产生的胚形成，而配子胚形成涉及由配子细胞(即小孢子)产生的胚形成。由于体细胞和配子细胞不是天然胚形成的，因此必须将此类细胞诱导为胚形成的。胚形成细胞的转化可通过外部刺激如生长素、细胞分裂素、pH偏移、生长调节剂和重金属离子实现(Yeung，1995，于：Thorpe TA(编辑)In Vitro Embryogenesis in Plants(第205-249页；Dodeman等人(1997)J.Exp.Bot.48：1493-1509中)。脱落的细胞材料可通过在胚处于非破坏性培养基如水或其它水性溶液中的同时搅动胚，而从胚组织收集。非破坏性培养基是允许胚保持其活性(即其生长成正常植物的能力)的任何培养基。搅拌可以通过本领域普通技术人员已知的任何方式进行。
在另一个实施方案中，细胞材料存在于与植物胚接触的琼脂之中或之上。可将部分琼脂放置于基本上由水或TE缓冲剂组成的非破坏性培养基中，并且可使用本领域普通技术人员已知的任何方式进行搅拌。所述方法还可包括从琼脂除去植物胚，并且使用本文提供的方法储存植物胚或将所述胚转移至发芽培养基。植物胚可为单倍体胚，并且琼脂可包括染色体加倍剂，如但不限于秋水仙碱。因此，植物胚可变成双倍单倍体。类似地，细胞材料也可以存在于与胚接触的滤纸上。因此，在另一个实施方案中，可使用滤纸代替琼脂。本领域普通技术人员知道，DNA可以从滤纸上收集的植物样品获得。
在另一个实施方案中，当使用刮刀(或用于切除一片盾片的任何其它工具或装置)从种子中移除胚时，可随后将刮刀浸入一个容器内的孔中，所述孔对应于容纳所述胚的第二容器内的孔。优选地，将刮刀浸入包含水性溶液的孔中。当使用刮刀移除胚时，使足量的胚乳组织保留在刮刀上(即脱落的细胞材料)，并且在胚提取后，所述刮刀不需要接触从其中移除胚的籽粒。所述刮刀可在胚被移除之后立即浸入包含水性溶液的孔中。如果使用相同的刮刀除去多个胚和/或胚乳组织，则优选在每次使用之间清洁，以除去可能导致污染的任何脱落的细胞材料。
在另一个实施方案中，可任选用例如水或培养基洗涤一个或多个胚，以除去附着到所述胚的任何胚乳。然后可将经洗涤的一个或多个胚浸入新鲜水或其它水性溶液中，并且搅拌以从一个或多个胚中将少量胚细胞移除到新鲜水或其它水溶液中(即脱落的细胞材料)。然后可将一个或多个胚转移到具有多个孔的容器，并且可将包含少量胚细胞的一些或全部新鲜水或水性溶液转移到具有多个孔的单独容器内的相关孔。
在一个实施方案中，可使用本领域已知的任何方法切除小片盾片，包括用刀片或激光切割。优选地，盾片足够小以便不损害胚活性。然后可将胚和相应的盾片置于具有孔的独立容器中，其中胚容器内包含所述胚的孔和盾片容器内包含相应盾片的孔是相关的，使得从盾片获得的任何信息与从其获得盾片组织的胚相关。
在另一个不一定需要胚提取或其它活体植物来源分离的实施方案中，可切下玉米籽粒的一片外皮，即果皮，以进行亲本植物的分子分析。在该实施方案中，可在切割果皮之前将籽粒浸泡在水中。可用锋利的刀片切割籽粒的背面(离胚最远)，如图14a中所示。优选地，在第一切割之后，在籽粒的外边缘可用尖锐刀片切割之前，将刀片灭菌，从第一切割的一端开始，围绕籽粒的边缘，并且向下至第一切割的另一端，如图14b中所示。可使用灭菌镊子从籽粒中剥离果皮组织，如图14c中所示。虽然可在籽粒的前侧(最靠近胚)进行切割，但是切割优选在后侧进行，以减少果皮将被胚乳组织污染的可能性。为了进一步降低污染的可能性，可在切除果皮组织后洗涤所述果皮组织。果皮可以放置在容器的孔中，并且可将切除果皮的种子(或来自该种子的胚)放置于单独容器的相应孔中。如本领域普通技术人员将理解的，存在用于分离果皮组织的其它可比较的方法，并且在本发明的一些实施方案中，可在不除去果皮的情况下提取果皮DNA。
待分析的组织优选与其相应的活体植物来源相关联或相关，使得可基于组织分析的结果选择相应的活体植物来源。
获得用于分子表征的遗传物质
为了对遗传物质进行分析，必须将其从细胞中除去，以便其可用于分子分析。这可能涉及物理处理如暴露于冷却-加热或仅加热、用酶培养或甚至DNA提取技术(然而重要的是要注意，提取不是获得用于分子分析的DNA的必要步骤)。基本上，破坏组织并且破碎开放细胞，从而释放可用于分子表征的DNA的任何过程可用于本文提供的方法中。
在一些实施方案中，可通过将所收集的脱落的细胞材料暴露于冷却-加热或加热，搅拌混合物，并且任选重复，从脱落的细胞材料获得DNA。在其它实施方案中，可通过用酶培养脱落的细胞材料获得DNA；所述酶可为L，一种包含宽泛范围的糖酶的多酶复合物，包括阿拉伯糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、和木聚糖酶。(参见SigmaAldrich产品目录)。在其它实施方案中，获得DNA可包括提取DNA，例如通过使用结合遗传物质的磁性颗粒或本领域普通技术人员已知的任何方法。然而，提取对于获得DNA不是必需的。
在涉及母本种子组织例如果皮组织的其它实施方案中，可使用细胞解离器(例如gentleMACSTM，Miltenyi Biotech)解离组织，任选随后进行DNA提取。在另一个实施方案中，可在DNA提取之前在液氮中破坏母本种子组织。在另一个实施方案中，可直接从经洗涤的母本种子组织中提取DNA(例如使用Extract-N-AmpTM)。
分子表征来自多个活体植物来源的遗传物质
在从胚组织获得的DNA的产量不足以用于某些分子分析(例如高密度基因分型)的情况下，可使用全基因组扩增技术。Qiagen试剂盒、Sigma-Aldrich SeqPlex试剂盒或本领域普通技术人员已知的任何其它技术可用于扩增来自胚组织的DNA。
其它可用的分子表征可涉及对从种子提取的组织的全部或部分基因组测序，或使用分子标记和荧光探针进行基因分型。分子表征不需要关注所提取组织的基因型，而是可测量其它性质，例如油含量、油组成、蛋白质含量、或组织中存在或不存在特定分子。
在优选的实施方案中，将遗传物质放置于包含双层油的多孔板的孔中，一层的密度大于水，并且一层的密度小于水。多个孔包含多种不同遗传物质。将荧光标记探针加入到遗传物质中，并且在多孔板中进行热循环以造成探针扩增和杂合。照射孔，并且从标记物检测荧光以产生基因型数据。另选地，遗传物质可在多孔板中全部或部分测序。
基于分子表征选择一种或多种活体植物来源
在分子育种程序中，基于它们的基因型选择植物或潜在植物以参与后代。通常，这涉及确定植物是否遗传了由遗传标记指示的一个或多个期望的性状，可基于基因分型来确定其存在或不存在。植物育种人员选择具有所需性状的那些植物以参与进一步育种、近交、或作为通过单倍体倍增技术产生近交系的过程的一部分。
培育所选择的活体植物来源。
基于存在由它们基因型确定的期望性状而选择的那些植物可生长成成熟植物，以获得单倍体材料，产生双单倍体近交系，与其自身一起育种以产生近交系，或与其它植物一起育种以改善种质并使其多样化。
在一个实施方案中，可通过考虑来自从一个或多个种子获得的多个组织样品的基因型数据，产生共有基因型，每个组织样品是平行测定的。鉴定基因组中跨多个位置的多个核苷酸的基因分型实验中，对于任何具体实验而言，无法鉴定一个或多个待鉴定的核苷酸并不罕见。因此，可为每个样本记录每个缺失位置的缺失核苷酸鉴定。如果来自仅一个样品的核苷酸鉴定可用于特定核苷酸位置，则该核苷酸鉴定被指定为该位置的共有数据。如果两个或更多个核苷酸鉴定可用于特定核苷酸位置，则该位置的大多数核苷酸鉴定被指定为该位置的共有数据。如果对于位置不存在多数鉴定，则将该位置指定为共有基因型的缺失数据。尽管本文提供的示例涉及从单子叶植物(特别是玉米)获得并且基因分型组织，但是本领域普通技术人员将理解如何将相同或相似的方法应用于其它单子叶植物和双子叶植物；所述方法可适用于任何植物。此外，本文公开的基因分型方法可用于将任何植物组织进行基因分型。共有基因分型方法也可用于对从任何来源获得的任何遗传物质的多个样品产生共有基因型，而不偏离所公开的步骤。
实施例1：胚基因分型
A.收集胚材料：
使用2mL无菌水将胚洗涤3次。使胚在包含10μL、20μL、50μL、75μL或150μL无菌水的管中培养10分钟、20分钟或过夜。发现用任何稀释体积可获得足够的基因分型数据，并且10分钟是足够的培养时间。用于洗涤和培养胚的所有方案与下述所有三种组织收集方法一起使用。
方法1：通过轻敲10次搅拌包含胚的管，然后在台式离心机中旋降5秒。然后从每个管中取出水用于分析。发现该方法对基因分型获得了最好的结果。
方法2：使用2mL无菌水将胚洗涤3次。使胚在包含50μL无菌水的管中培养10分钟。然后从管中取出水用于分析。
方法3：使用2mL无菌水将胚洗涤3次。使胚在包含50μL无菌水的管中培养10分钟。通过轻拍10次，搅拌包含胚的管。然后从每个管中取出水用于分析。
B.获得DNA的方法：
冷-热休克：
将使用上述所有三种方法获得的胚材料在-80℃冷冻机中放置20分钟；然后在100℃的热循环仪上放置10分钟，并且用移液管上下吸取混合。将该过程重复共两轮。将所得混合物在-20℃下储存。发现使用该方法获得的DNA达到基因分型的最佳结果。
仅热休克：
将胚组织在100℃热循环仪上放置10分钟，并且用移液管上下吸取混合。将该过程重复共两轮。将混合物在-20℃下储存。
酶促方法：
将来自前述步骤的混合物在95℃烘箱中培养，以蒸去剩余的水。加入18.0μL的PBS溶液和2.0μL稀释的L(可从Sigma-Aldrich商购获得；以1∶200稀释的PBS溶液，pH 7.4；总体积20μL)，并且将所述混合物在37℃下培养2小时。加入2.0μL量的稀释的蛋白酶K(可从Sigma-Aldrich商购获得；以1∶20稀释的PBS溶液，pH 7.4)，并且将所述混合物在55℃下培养50分钟，然后在95℃下加热10分钟。将所述混合物在-20℃下储存。
DNA提取：
将来自实施例1B方法的混合物在95℃烘箱中培养，以蒸去剩余的水。将45μL裂解缓冲液PN(LGC Genomics)加入到每个混合物中，然后将其短暂离心，并且在65℃下培养1小时。向新管中加入60μL结合缓冲液PN、5μL颗粒(结合遗传物质的磁性颗粒，其可从LGC Genomics商购获得)，然后加入裂解物混合物，接着将其在室温下培养4分钟，以允许DNA与颗粒的结合，短暂涡旋并且放置于磁架中以浓缩小珠。除去裂解缓冲液，并且加入100μL洗涤缓冲液PN1(LGC Genomics)以使小珠重新悬浮。使用100μL洗涤缓冲液PN2(LGCGenomics)，然后用100μL纯水洗涤，来重复洗涤。加入10μL洗脱缓冲液PN，并且将混合物在55℃下培养10分钟，每3分钟涡旋振荡。使用磁性板浓缩小珠，并且将洗脱液转移到新管，并且在-20℃下储存。
C.全基因组扩增
当需要全基因组扩增时，遵循以下方案，使用单细胞试剂盒(可从Qiagen商购获得)。进行全基因组扩增以实现更高的DNA产量，并且促进高密度标记组的检测。
将2.5μL模板DNA与2.5μL缓冲液D1(可从Qiagen商购获得；总体积5.0μL)，并且在室温下培养3分钟。加入5.0μL缓冲液N1(可从Qiagen商购获得；总体积10.0μL)，并且将混合物涡旋并且短暂离心。每次反应使用包含9.0μL无核酸酶水、29.0μL反应缓冲液(可从Qiagen商购获得)和2.0μLDNA聚合酶(可从Qiagen商购购得)的主混合物，得到50.0μL总体积。采用30℃，将混合物在热循环仪上运行8小时，之后在4℃下运行。使用测定(可从Life Technologies商购获得)进行DNA定量。DNA产物直接用于基因分型步骤。
D.分子分析
标记物分析
采用分析(可从Life Technologies商购获得)进行标记物分析。将DNA稀释至20ng/μL的目标浓度。将包含DNA的384板加载到LC480实时PCR热循环仪中，并且使用以下程序运行：预培养：1个循环(95℃下5分钟)；扩增：45个循环，(-95℃下30秒，-60℃下45秒(单次采集)，-72℃下1分钟(单次采集)；冷却：1个循环，(-72℃下10分钟，-40℃下30秒)。使用Roche LC480软件(可从Roche Diagnostics商购获得)读取调用。
结果
上述方法均给出可接受的基因分型结果。基因型数据示于图1-11中，其包括来自本实施例中所公开方法的所有排列的数据。图1示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示四种不同培养体积(10μL、20μL、50μL和75μL)的每一种中的三种不同的处理(仅培养；培养并且敲击；以及培养、敲击和旋转)。图2示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示50μL培养体积中的一种处理(培养、敲击和旋转)。图3示出了使用从冷-热休克、热休克、用L培养、或使用方法的DNA提取获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示50μL培养体积中的三种不同的处理(仅培养；培养并且敲击；以及培养、敲击和旋转)。图4示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示50μL培养体积中的一种处理(培养、敲击和旋转)。图5示出了使用从冷-热休克、用L培养、或使用方法的DNA提取获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示50μL培养体积中的三种不同的处理(仅培养；培养并且敲击；以及培养、敲击和旋转)。图6示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示50μL培养体积中的一种处理(培养、敲击和旋转)。图7示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示三种处理(仅培养；培养并且敲击；以及培养、敲击和旋转)。图8示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示150μL培养体积中的一种处理(培养、敲击和旋转)。一个纯合调用是不正确的。图9示出了使用通过在脱落的细胞材料的所有随后洗涤中进行冷-热休克处理或者不进行处理而获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示三种处理(仅培养；培养并且敲击；以及培养、敲击和旋转)和两种培养体积(50μL和100μL)。图10示出了使用通过冷-热休克处理获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示50μL培养体积中的一种处理(培养、敲击和旋转)。图11示出了使用通过冷-热休克处理和为在基因分型前获得足够DNA产量的全基因组扩增(使用REPLI-g单细胞试剂盒)而获得的DNA，来自一种标记物的基因分型数据。数据表示10μL培养体积中的四种处理(仅培养；以速度3涡旋5秒；以速度10涡旋5秒；以及以速度10涡旋30秒)。
实施例2：胚储存
选择两系玉米种质用于测试油基质中延长胚储存对发芽率的影响。在放置于它们各自储存条件之前，用手分离来自各系的胚。将所有胚铺展在发芽培养基上，以评定受控生长室中的发芽率。将各系的6个胚立即铺在未经任何储存的发芽培养基上，以作为在受控生长室中发芽的对照。分离各系的七十二(72)个胚，并且在每个胚的专用储存管中，在三个储存条件下均匀分配：
储存条件1：将24个胚放置于由具有显着不同密度的两层油包围的50μL水性溶液中，一层密度显著大于水，而一层密度显著小于水。
储存条件2：将24个胚放置于具有添加的抗微生物剂的50uL水性溶液小滴中，由条件1的两种油包围。
储存条件3：将24个胚放置于具有添加的抗微生物剂的50uL最小生长培养基小滴中，由条件1的两种油包围。
在实验期间，将所有试管放置在4摄氏度的黑暗冷藏机中。在四(4)个时间点，从它们储存条件中取出各系的6个胚，并且铺在受控生长室中的发芽培养基上，以评定发芽率。时间点如下：
时间点1：放置储存后15分钟。
时间点2：放置储存后1天。
时间点3：放置储存后5天。
时间点4：放置储存后10天。
然后监测胚发芽率以确定最佳储存条件。这些测试的结果示于图12和13中(两种不同品系的玉米的结果)。发现，三种储存方法的每一种中的发芽率均优异。
实施例3：果皮基因分型
A.果皮剥离
将玉米籽粒从玉米芯除去，并且在去离子水中浸泡60分钟。使用小珠灭菌器将手术刀刀片消毒。使用手术刀在尖端附近切割种子的背面(远离胚)，如图14a中所示。再次使用小珠灭菌器将手术刀灭菌，并且在无菌水中冷却。然后使用手术刀沿着籽粒的外边缘切割，如图14b中所示。将镊子在小珠灭菌器中灭菌，冷却，然后用于从籽粒剥离果皮，如图14c中所示。然后将来自每个籽粒的果皮组织放置于微量离心管中。
B.果皮洗涤
测试三种不同的洗涤溶液。使用1％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液洗涤获得最佳结果，然而使用水和乙醇可获得足够的结果。使用超声处理的另选的洗涤方法也给出了足够的结果。所用的洗涤方案通过向微量离心管中加入1mL洗涤溶液开始，将其置于反相器中1分钟。除去洗涤溶液，并且用1mL新鲜洗涤溶液替换，然后将微量离心管再次置于反相器中，这次4分钟。然后除去果皮组织，用蒸馏水冲洗，并且置于新的微量离心管中。超声处理方案将果皮组织在超声波破碎仪中放置1分钟。然后取出组织，用蒸馏水冲洗，并且置于新鲜的微量离心管中。
C.获得DNA
测试获得DNA的五种方法。使用gentleMACSTM方案，用水或TE上清液实现最佳结果。
gentleMACSTM/水或TE上清液：在该方法中，将果皮组织直接放置于gentleMACSTMM管的转子上。将300μl水或TE缓冲液加入到管中，然后将其密闭并且置于gentleMACSTM仪器中。运行自动化程序“Protein_01.01”。对于未完全解离的果皮组织，进行进一步混合并且运行自动化程序。接着，使混合物在GentleMACSTM管中旋降，并且转移至新的1.5mLEppendorf管。然后将Eppendorf管以14000rpm离心2分钟，并且将上清液转移至新鲜的1.5mL Eppendorf管用于分子分析。在该方法中不需要DNA的提取。
GentleMACSTM 在该方法中，将果皮组织直接放置于gentleMACSTM M管的转子上。向管中加入300μL的裂解缓冲液PN，然后将其密闭并且放置于gentleMACSTM仪器中。运行自动化程序“Protein_01.01”。对于未完全解离的果皮组织，进行进一步混合并且运行自动化程序。接着，将混合物离心，并且在65℃下培养1小时，偶尔搅拌。将360μL粘结缓冲液PN和30μL颗粒加入到新鲜的1.5mL Eppendorf管中。将具有果皮组织的管离心，并且将裂解物转移到新试管。然后将这些在室温下培养4分钟，以使DNA结合到颗粒。接着将管短暂涡旋，然后放置在磁架中以将小珠浓缩。除去裂解缓冲液，并且向每个管中加入600μL洗涤缓冲液PN1，并且使小珠重新悬浮。将管再次放置在磁架中以浓缩小珠，并且除去洗涤缓冲液PN1。使用600μL洗涤缓冲液PN2重复该洗涤程序，然后使用600μL纯水再次重复。在该第三洗涤步骤后，加入40μL洗脱缓冲液PN，并且将管在55℃下培养20分钟，并且每3分钟涡旋振荡。使用磁性板浓缩小珠，并且将洗脱液转移到新试管中，然后在-20℃下储存直至分子表征。
gentleMACSTM/Extract-N-AmpTM：在该方法中，将果皮组织再次直接放置在gentleMACSTMM管的转子上。将300μL无菌水加入到管中，然后将其密闭并且放置于gentleMACSTM仪器中。运行自动化程序“Protein_01.01”。对于未完全解离的果皮组织，进行进一步混合并且运行自动化程序。将匀浆转移至1.5mL微量离心管，并且在10,000rpm下离心1分钟。除去上清液，而不干扰管底部处的组织粒料。加入30μL提取溶液/种子制备溶液混合物(Sigma-Aldrich Extract-N-AmpTMSeed PCR试剂盒)，并且将所得混合物充分混合。将所述混合物转移到用于热循环仪上的PCR条管中，其被程序化设定为在55℃下保持10分钟，然后在95℃下保持3分钟，然后无限期保持在4℃下。加入30μL中和溶液B。
液氮将1.5mL微量离心管杵放置在液氮中冷却。将果皮组织与冷却的管杵一起放置于微量离心管中，并且将整个管放置于液氮中。将液氮加入到管中。使用管杵将果皮组织缓慢并且充分地研磨。将管偶尔浸回到液氮中，以保持组织冷却。研磨后，向每个管中加入90μL裂解缓冲液PN，然后将其短暂离心，接着在65℃下培养1小时。将120μL粘结缓冲液PN和10μL的颗粒加入到新试管中，并且将来自研磨步骤的裂解物加入到新试管中。然后将这些在室温下培养4分钟，以使DNA结合到颗粒。然后将混合物短暂涡旋，并且放置在磁架中以浓缩小珠。除去裂解缓冲液，并且向每个管中加入200μL洗涤缓冲液PN1，并且使小珠重新悬浮。将管再次放置在磁架中以浓缩小珠，并且除去洗涤缓冲液PN1。使用200μL洗涤缓冲液PN2重复该洗涤程序，然后使用200μL纯水再次重复。在该第三洗涤步骤后，加入20μL洗脱缓冲液PN，并且将管在55℃下培养10分钟，并且每3分钟涡旋振荡。使用磁性板浓缩小珠，并且将洗脱液转移到新试管中，然后在-20℃下储存直至分子表征。
Extract-N-AmpTM：制备18份提取溶液和2份种子制备溶液的主混合物，并且将20μL溶液加入到0.2mL PCR条管内的果皮组织中。将混合物在设定为55℃的热循环仪中放置10分钟，在95℃下放置3分钟，然后无限期地在4℃下放置。加入20.0μL中和溶液B，并且将混合物的液体部分转移到1.5mL的新微量离心管中。
D.分子测试
dsDNA HS检测试剂盒：将试剂以1∶200的比率稀释到缓冲液中以制备工作溶液。将1μL步骤2B的PCR产物转移至0.5mL测定管和199μL工作溶液中。通过将10μL标准物加入到190μL的工作溶液中，制备标准物。将PCR产物和标准物涡旋2-3秒，然后短暂离心。然后将试管在室温下培养2分钟。然后将管插入2.0荧光计中，并且记录读数。
全基因组扩增(Seqplex)：全基因组扩增的优选方法是使用Seqplex增强DNA扩增试剂盒的Seqplex方法。向1μL的步骤C中产生的每种DNA溶液中，加入2μL文库制备缓冲液和11μL纯水。将溶液离心，涡旋，并且再次离心，在95℃热循环仪上培养2分钟，然后保持在4℃。冷却后，加入1μL文库制备酶。将溶液离心，涡旋并且再次离心，然后在16℃热循环仪上培养20分钟，在24℃下培养20分钟，在37℃下培养20分钟，在75℃下培养5分钟，然后保持在4℃下。将溶液短暂离心。将15μL该溶液加入到以1∶1000稀释的15μL的5x扩增混合物(A5112)、1.5μL用于SeqPlex的DNA聚合酶(SP300)、42.5μL无菌水(W4502)和1μL的SYBRGreen(S9403)中。将该溶液充分混合，并且将每个反应混合物在384孔板上分成5份15μL等分试样。扩增热循环开始于94℃下初始变性2分钟，随后进行足够数目的循环以达到2-3个循环进入平台(通常约24个循环)：94℃下变性15秒，70℃下退火/延伸5分钟，读取荧光，重复。循环后，将反应混合物在70℃下保持30分钟，然后保持在4℃。冷却后，通过PCR纯化来纯化样品。
全基因组扩增(REPLI-g单细胞试剂盒)：通过加入3.5μL重构缓冲液DLB和12.5μL无核酸酶的水，制备变性缓冲液D1。通过加入4.5μL终止溶液和25.5μL不含核酸酶的水，制备中和缓冲液N1。将2.5μL变性缓冲液加入到步骤C中制得的各2.5μL的DNA溶液等分试样中。将该溶液在室温下培养3分钟。加入5.0μL中和缓冲液N1，并且涡旋该溶液，然后短暂离心。用每份反应9.0μL无核酸酶的水、29.0μL的REPLI-g反应缓冲液和2.0μL的REPLI-g DNA聚合酶，制备主混合物。将40.0μL该主混合物加入到各溶液中，然后将其在30℃热循环仪上运行8小时，然后冷却至4℃。
使用检测来评定全基因组扩增产物，以确定DNA的产量。
基因分型测定：成功使用高密度标记(3072X芯片)和标记物分析，对本实施例中描述的遗传材料进行基因分型。展示前述技术有效性的数据示于图2-4中。图15比较了使用DNA提取方法获得的数据质量与使用全基因组扩增获得的数据质量。虽然两种方法均给出可接受的结果，但是全基因组扩增方法给出了优选的结果，其中三个单倍型中的每一个均被充分解析。图16是荧光标记散布图，展示可从单个果皮组织样品获得优质荧光标记数据。事实上，本发明的方法允许使用许多标记物(数十或潜在的数百种)，使用从单个种子提取的果皮组织进行基因分型。由于从单个种子提取的果皮组织的测得的基因型(每条线)和已知母本基因型之间的高度相似性，图17展示了本发明方法的可靠性。
实施例4：使用琼脂培养基基因分型
分离胚，并且在秋水仙碱琼脂培养基上培养以用于倍增处理。24小时后，二倍体胚呈现紫色；并且单倍体胚呈现白色。然后将白色胚转移至平板以继续生长。使用灭菌的刮刀，从最初的24小时倍增板，自胚正下方舀出一部分琼脂培养基(略大于胚本身)。将部分琼脂转移到包含60μL无菌TE缓冲液的2.0mL管中。将管在室温下培养10分钟，以最高速度涡旋5秒，并且在台式离心机中离心10秒。将约60μL的液体转移到PCR条管中。将PCR条管在-80℃冷冻机中放置20分钟，然后在100℃的热循环仪中放置10分钟，随后保持在4℃下。将所述管涡旋，并且再一次重复冷-热休克处理。成功地使用标记物分析，对从双倍单倍体胚的脱落的细胞材料获得的遗传物质进行基因分型，其中脱落的细胞材料得自琼脂培养基。结果与使用热点DNA提取方法，从双倍单倍体胚的胚组织获得的基因分型调用相当。使用包含在琼脂培养基之内或之上的脱落细胞材料对双倍单倍体胚进行基因分型是成功的。
实施例5：发芽和成熟测试
使用四种搅拌处理(敲击、置于线性振动、涡旋、和使用气动式活塞)以及不搅拌中的一种，从包含于非破坏性培养基中的双倍单倍体胚中收集脱落的细胞材料。然后评定由其获得脱落的细胞材料的双倍单倍体胚的发芽和成熟能力。使胚在培养基上发芽11天，然后转移到温室中以继续生长和成熟，以证实收集方法对长期植物发育不造成任何不利的影响。植物是自花授粉的，并且观察到双倍单倍体表型，例如籽粒着色和植物高度。收集植物和自花授粉穗的图像。还使用叶片打孔器，从每个植物收集叶组织。从双倍单倍体胚的脱落的细胞材料获得的基因型数据对应于从叶片组织获得的基因型数据。因此，从双倍单倍体胚发育的植物正常发芽和成熟，没有出现由于胚搅动释放脱落的细胞材料而产生的不利影响。
实施例6：小孢子来源的胚组织的基因分型
使用灭菌的刮刀，将来源于小孢子的胚组织从生长板转移至包含40μL无菌TE缓冲液的1.5mL管中。使小孢子衍生的胚组织在室温下培养30分钟。在一组实验中，将管放置在气动式活塞臂上，其使小孢子衍生的胚组织横向运动。在另一组实验中，将管以高速涡旋10秒。搅拌后，将试管在台式离心机中离心10秒，将～40μL液体转移至PCR条管。将包含非破坏性培养基的管在-80℃冷冻机中放置20分钟，然后在100℃热循环仪中放置10分钟，接着保持在4℃下。将管涡旋，然后重复冷-热冲击搅拌循环。使用四种标记物进行基因分型，其显示从小孢子衍生的胚组织获得的脱落的细胞材料可成功地用于基因分型。

Claims (24)

1.一种分析一个或多个植物胚的方法，所述方法包括：
(a)通过在非破坏性培养基中搅拌一个或多个植物胚来从所述一个或多个植物胚收集脱落的细胞材料；
(b)从所述脱落的细胞材料获得DNA；以及
(c)对步骤(b)中获得的所述DNA进行分子分析。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括(d)使所述一个或多个植物胚中的至少一个发芽成植物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过将所收集的脱落的细胞材料暴露于冷却，然后加热，接着搅拌，来获得所述DNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其中将所述冷却、加热和搅拌步骤重复。
5.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在步骤(a)之前或之后，储存所述一个或多个植物胚。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子分析是基因分型。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括基于基因型来选择一个或多个植物胚。
8.根据权利要求7所述的方法，其中导致选择一个或多个植物胚的任何所述步骤是自动化的。
9.一种分析植物胚的方法，所述方法包括：
a.获得与植物胚接触的琼脂的一部分，其中所述部分包含所述植物胚的脱落的细胞材料；
b.从所述植物胚的所述脱落的细胞材料获得遗传物质；以及
c.对从所述植物胚的所述脱落的细胞材料获得的所述遗传物质进行分子分析。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述琼脂包含染色体加倍剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述染色体加倍剂为秋水仙碱。
12.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括使所述植物胚发芽成植物。
13.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括将所述胚从所述琼脂中取出，并且储存所述胚。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述分子分析是基因分型。
15.根据权利要求14所述的方法，所述方法还包括基于基因分型来选择植物胚。
16.根据权利要求15所述的方法，其中导致所述选择的任何所述步骤是自动化的。
17.一种分析植物胚组织的方法，所述方法包括：
(a)通过在非破坏性培养基中搅拌植物胚组织来从所述植物胚组织收集脱落的细胞材料；
(b)从所收集的脱落的细胞材料获得DNA；以及
(c)对步骤(b)中获得的所述DNA进行分子分析。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述胚组织来源于小孢子。
19.根据权利要求17所述的方法，所述方法还包括(d)从所述植物胚组织获得植物。
20.根据权利要求17所述的方法，其中通过将所收集的脱落的细胞材料暴露于冷却，然后加热，接着搅拌，来获得所述DNA。
21.根据权利要求20所述的方法，其中将所述冷却、加热和搅拌步骤重复。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述分子分析是基因分型。
23.根据权利要求22所述的方法，所述方法还包括基于基因型来选择植物胚组织。
24.根据权利要求23所述的方法，其中导致选择植物胚组织的任何所述步骤是自动化的。
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