BR112017003935B1 - Método para analisar um ou mais embriões vegetais, método de analisar tecido embrionário vegetal - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA ANALISAR UM OU MAIS EMBRIÕES VEGETAIS, MÉTODO DE ANALISAR TECIDO EMBRIONÁRIO VEGETAL. A presente invenção refere-se a métodos para obter material genético a partir de embriões vegetais enquanto preservando a viabilidade dos mesmos, bem como métodos para realizar uma análise molecular dos embriões vegetais, particularmente com pequenas quantidades de material genético. Os métodos podem incluir as etapas de coleta de material celular expelido de um ou mais embriões vegetais; obter DNA a partir do material celular expelido; realizar uma análise molecular do DNA; e germinar ao menos um dos ditos ou mais embriões vegetais. Uma extensão adicional deste método inclui determinar a favor da germinação e desenvolvimento do embrião ou do descarte do embrião com base em seu genótipo como parte de um processo de melhoramento genético. A invenção também fornece métodos para genotipagem de embriões usando material celular expelido contido em ou no ágar e métodos para analisar o tecido embrionário vegetal derivado de microesferas.

Description

Referências remissivas aos pedidos de depósito correlatos

[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido nacional US n° 14/473.114, depositado em sexta-feira, 29 de agosto de 2014, aqui incorporado em sua totalidade, a título de referência.

Antecedentes

[0002] Os presentes métodos de análise de sementes convencionais usados em genética, bioquímica ou em análise fenotípica incluem pelo menos uma parte das sementes a serem removidas e processadas. Ao remover parte do tecido da semente, vários objetivos precisam ser satisfeitos. Esses podem incluir um ou mais dos seguintes objetivos: (a) manter a viabilidade da semente após a coleta do tecido da semente, se necessário. (b) obter pelo menos uma quantidade mínima necessária do tecido, sem afetar a viabilidade. (c) obter tecido de um local específico na semente, frequentemente exigindo a capacidade de orientar a semente em uma posição específica. (d) manter um determinado nível de produtividade, por motivos de eficiência. (e) reduzir ou praticamente eliminar a contaminação. (f) permitir o rastreamento de tecidos separados e a correlação deles com as sementes, das quais os tecidos foram obtidos.

[0003] As tecnologias de teste de grãos convencionais não abordam esses requisitos suficientemente, resultando em pressões de trabalho e recursos, e dessa forma, ilustram a necessidade de aprimoramento no estado da técnica. Os métodos atuais são de produtividade relativamente baixa, têm risco substancial de contaminação cruzada e tendem a ser inconsistentes por depender de um tratamento e orientação significantemente manuais e remoção do tecido da semente. Isso pode atingir o tipo de tecido extraído da semente e a probabilidade de a semente germinar. Há uma necessidade de eliminar os recursos que os métodos atuais exigem para limpeza entre a remoção das porções individuais do tecido da semente. Há também uma necessidade de reduzir ou minimizar a contaminação cruzada entre porções específicas do tecido a ser testado por reaproveitamento ou outros motivos, ou qualquer contaminação de qualquer fonte de qualquer outro tecido. Além disso, há uma necessidade para mais confiabilidade e precisão.

[0004] Além do mais, alguns dos objetivos apresentados acima podem ser conflitantes e até antagônicos. Por exemplo, obter uma quantidade útil de tecido ao mesmo tempo que mantendo a viabilidade da semente exige que se extraia um pouco de tecido da semente, mas não muito. Além de que, metodologias de alta produtividade envolvem operações rápidas, porém que podem ser acompanhadas por quedas na precisão e risco maior de contaminação, de forma que os métodos precisam ser feitos mais lentamente do que é tecnicamente possível para superar as limitações. Esses objetivos múltiplos, portanto, existem na técnica e não são satisfatoriamente tratados ou equilibrados pelos métodos e aparelhos atualmente disponíveis. Existe uma necessidade na técnica para superar os tipos acima descritos de problemas para que o número máximo de objetivos seja atingido.

Sumário

[0005] A invenção inclui métodos para analisar material vegetal, ao mesmo tempo que preservando a viabilidade do material vegetal (isto é, capacidade para formar uma planta). O método pode incluir as etapas de coleta de material celular expelido de um ou mais embriões vegetais (ou de tecido embrionário vegetal derivado de microesferas); obter material genético como DNA do material celular expelido; e executar uma análise molecular do material genético. Os métodos podem incluir, também, a germinação de ao menos um ou mais embriões vegetais. Um embrião pode ser obtido a partir de um grão ou poder ser derivado de outros tecidos por meio de embriogênese (microesfera) somática ou gamética. Em uma modalidade, o material celular expelido é coletado de um embrião agitando o embrião em um meio não destrutivo como água ou outra solução aquosa. A agitação pode ocorrer por quaisquer meios conhecidos pelo versado na técnica.

[0006] Em uma outra modalidade, o material celular expelido de um embrião vegetal é coletado pela obtenção de uma porção de ágar em contato com um embrião vegetal, sendo que a dita porção compreende material celular expelido do embrião vegetal. A porção de ágar pode ser colocada em um meio não destrutivo que consiste essencialmente em água ou TE, e a agitação pode ser aplicada usando qualquer meio conhecido pelo versado na técnica. Os métodos podem incluir, também, a remoção do embrião do ágar e guardar o embrião usando métodos aqui fornecidos ou transferir o embrião para meio de germinação. O embrião vegetal pode ser um embrião haploide, e o ágar pode incluir um agente de duplicação de cromossomo como, mas não se limitando a, colchicina. Como tal, o embrião vegetal pode se tornar um haploide duplo. Em uma outra modalidade, papel filtro pode ser usado em vez do ágar.

[0007] Em qualquer um dos métodos acima, pode-se obter DNA do material celular expelido expondo o material celular expelido coletado ao frio e depois ao calor, seguido de agitação; as etapas podem ser repetidas. Em outras modalidades, o DNA pode ser obtido a partir do material celular expelido pelo aquecimento do material celular expelido e agitação; as etapas podem ser repetidas. Em outras modalidades, o DNA pode ser obtido pela incubação do material celular expelido com uma enzima; a enzima pode ser VISCOZYME® L, um complexo multienzimático contendo uma ampla faixa de carboidrases, incluindo a arabanase, celulase, β-glucanase, hemicelulase e xilanase. (Ver o catálogo de produtos da Sigma Aldrich). Em ainda outras modalidades, o DNA pode ser obtido usando técnicas de extração de DNA, como, mas não se limitando ao uso de partículas magnéticas que se ligam ao material genético ou qualquer método conhecido pelo versado na técnica.

[0008] Métodos incluem a obtenção de material genético a partir de material celular expelido de embriões (ou tecido embrionário derivado de microesferas) e a realização de uma análise molecular do material genético enquanto preservando a capacidade dos embriões de germinar. A análise molecular pode ser genotipagem, que pode ocorrer por meio de: detecção de polimorfismo de nucleotídeo único, identificação de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição, detecção polimórfica aleatória amplificada, detecção de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado, reação em cadeia de polimerase, sequenciamento de DNA, sequenciamento de genoma inteiro, sondas de oligonucleotídeo específicas de alelo ou hibridização de DNA para micromatrizes ou esferas de DNA. A amplificação do genoma inteiro pode ser feita antes da análise molecular. Em outras modalidades, uma ou mais das etapas pode ser automatizada.

[0009] Em algumas modalidades, os embriões podem ser armazenados suspendendo os embriões ou o tecido embrionário em uma solução aquosa, circundados por uma matriz de um ou mais óleos. De preferência, pelo menos um dentre esses um ou mais óleos tem uma densidade maior do que a da solução aquosa. O armazenamento dos embriões ou do tecido embrionário pode ocorrer antes ou depois da coleta do material celular expelido do embrião ou tecido embrionário. Em alguns aspectos, os agentes antimicrobianos e/ou um meio de crescimento mínimo pode ser adicionado à solução aquosa. Em outros aspectos, os embriões ou o tecido embrionário podem ser armazenados em condições a frio (de preferência, a 4°C) e/ou em ambiente escuro, para evitar a germinação prematura. Em algumas modalidades, os embriões ou o tecido embrionário pode ser transferido para o armazenamento prolongado. Em outras modalidades, os embriões podem ser transferidos para meio de germinação, e um ou mais dos embriões podem ser germinados. Em ainda outras modalidades, uma alíquota da solução aquosa pode ser removida, material genético pode ser obtido a partir do material celular na alíquota e o material genético pode ser usado para análise molecular (por exemplo, para genotipar os embriões armazenados). A análise molecular pode ser genotipagem, que pode ocorrer por meio de: detecção de polimorfismo de nucleotídeo único, identificação de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição, detecção polimórfica aleatória amplificada, detecção de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado, reação em cadeia de polimerase, sequenciamento de DNA, sequenciamento de genoma inteiro, sondas de oligonucleotídeo específicas de alelo ou hibridização de DNA para micromatrizes ou esferas de DNA. Em outras modalidades, uma ou mais das etapas descritas acima podem ser automatizadas.

[0010] Métodos incluem a obtenção de DNA embrionário (quer a dita obtenção do DNA embrionário inclua extração quer não), armazenamento do embrião do qual o DNA foi extraído de uma maneira que preserve a capacidade do embrião de germinar e se transformar em uma planta, genotipagem do embrião usando o DNA embrionário, e determinar a favor da germinação e desenvolvimento do embrião (isto é, selecionando) ou do descarte do embrião com base em seu genótipo (isto é, contra- selecionar). Um embrião selecionado para germinar e crescer com base em seu genótipo pode se transformar em uma planta e ser fenotipada, usada para melhoramento genético ou usada produzir grande quantidade de grãos do mesmo genótipo. Em modalidades preferenciais, uma ou mais etapas do método pode ser automatizada.

[0011] Uma modalidade permite a determinação da linhagem materna de uma ou mais sementes, coletando o tecido da semente materna a partir de uma ou mais sementes; lavagem do tecido da semente materna; dissociação e homogenização do tecido da semente materna para se obter uma solução homogenizada; centrifugação da solução homogenizada para obter um sobrenadante; e execução de uma análise molecular usando DNA do sobrenadante. Em uma modalidade, o tecido da semente materna é o pericarpo. A etapa de lavagem pode ser feita com solução com 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos. A etapa de lavagem é, de preferência, feita com uma solução aquosa de cerca de 1% dodecil sulfato de sódio. A dissociação e ruptura do tecido do pericarpo pode ser feita usando-se um dissociador de células (como o gentleMACS™, Miltenyi Biotech). O método pode ainda compreender o uso de amplificação do genoma total antes da análise molecular para se obter uma quantidade de DNA suficiente.

[0012] Uma outra modalidade permite a determinação da linhagem materna de uma ou mais sementes, coletando o tecido da semente materna a partir de uma ou mais sementes; lavagem do tecido da semente materna; dissociação e homogenização do tecido da semente materna para se obter uma solução homogenizada; extração do DNA de células contidas na solução homogenizada; e execução de uma análise molecular do DNA extraído. Em uma modalidade, o tecido da semente materna é o pericarpo. A etapa de lavagem pode ser feita com solução com 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos. A etapa de lavagem é, de preferência, feita com uma solução aquosa de cerca de 1% dodecil sulfato de sódio. A etapa de dissociação e homogenização pode ser executada usando um dissociador de células (como gentleMACS™, Miltenyi Biotech). A etapa de extração pode ser executada por meio de partículas magnéticas que se ligam ao DNA ou Extract-N-Amp™. O método pode ainda compreender o uso de amplificação do genoma total antes da análise molecular para se obter uma quantidade de DNA suficiente.

[0013] Uma outra modalidade permite a determinação da linhagem materna de uma ou mais sementes, coletando o tecido da semente materna a partir de uma ou mais sementes; lavagem do tecido da semente materna; ruptura do tecido da semente materna em nitrogênio líquido; extração do DNA do tecido da semente materna rompido; e execução de uma análise molecular do DNA extraído. Em uma modalidade, o tecido da semente materna é o pericarpo. A etapa de lavagem pode ser feita com solução com 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos. A etapa de lavagem é, de preferência, feita com uma solução aquosa de cerca de 1% dodecil sulfato de sódio. A etapa de extração pode ser executada por meio de partículas magnéticas que se ligam ao DNA ou Extract-N-Amp™. O método pode ainda compreender o uso de amplificação do genoma total antes da análise molecular para se obter uma quantidade de DNA suficiente.

[0014] Uma outra modalidade permite a determinação da linhagem materna de uma ou mais sementes, coletando o tecido da semente materna a partir de uma ou mais sementes; lavagem do tecido da semente materna; extração do DNA diretamente do tecido da semente materna lavado; e execução de uma análise molecular do DNA extraído. Em uma modalidade, o tecido da semente materna é o pericarpo. A etapa de lavagem pode ser feita com solução com 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos. A etapa de lavagem é, de preferência, feita com uma solução aquosa de cerca de 1% dodecil sulfato de sódio. A etapa de extração pode ser feita com o uso de Extract-n-Amp™. O método pode ainda compreender o uso de amplificação do genoma total antes da análise molecular para se obter uma quantidade de DNA suficiente.

[0015] Em qualquer das modalidades mencionadas acima, a análise molecular pode ser genotipagem. Quando o tecido da semente materna de mais de uma réplica de semente é coletado, um genótipo de consenso pode ser obtido.

Breve descrição dos desenhos

[0016] Nas Figuras 1 a 11, triângulos invertidos representam amostras tendo um estado homozigótico; triângulos voltados para cima representam amostras tendo o outro estado homozigótico; triângulos que apontam em direção ao lado esquerdo representam o controle heterozigoto; círculos representam dados de controle em falta ou negativos; e diamantes representam calos não quantificáveis. Quanto mais justo o agrupamento de pontos ao longo de uma linha paralela a um ou outro eixo, menor a variação existente com o método sendo testado.

[0017] A Figura 1 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam três tratamentos diferentes (incubado apenas; incubado e batido; e incubado, batido e decantado) em cada um dos quatro volumes de incubação diferentes (10 μL, 20 μL, 50 μL, e 75 μL).

[0018] A Figura 2 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam um único tratamento (incubado, batido e decantado) em um volume de incubação de 50 μL.

[0019] A Figura 3 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido a partir do choque frio-calor, choque térmico, incubação com VISCOZYME® L, ou extração de DNA usando o método SBEADEX®. Os dados representam três tratamentos diferentes (incubado apenas; incubado e batido; e incubado, batido e decantado, em um volume de incubação de 50 μL.

[0020] A Figura 4 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam um único tratamento (incubado, batido e decantado) em um volume de incubação de 50 μL.

[0021] A Figura 5 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido a partir do choque frio-calor, incubação com VISCOZYME® L, ou extração de DNA usando o método SBEADEX®. Os dados representam três tratamentos diferentes (incubado apenas; incubado e batido; e incubado, batido e decantado, em um volume de incubação de 50 μL.

[0022] A Figura 6 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam um único tratamento (incubado, batido e decantado) em um volume de incubação de 50 μL.

[0023] A Figura 7 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam três tratamentos (incubado apenas; incubado e batido; e incubado, batido e decantado, em um volume de incubação de 150 μL.

[0024] A Figura 8 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam um único tratamento (incubado, batido e decantado) em um volume de incubação de 150 μL.

[0025] A Figura 9 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor ou sem nenhum tratamento após a lavagem do material celular expelido. Os dados representam três tratamentos (incubado apenas; incubado e batido; e incubado, batido e decantado, e dois volumes de incubação (50 μL e 100 μL).

[0026] A Figura 10 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam um único tratamento (incubado, batido e decantado) em um volume de incubação de 50 μL.

[0027] A Figura 11 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor e amplificação de genoma inteiro (usando o kit de célula única REPLI-g) para obter rendimento suficiente de DNA antes de genotipar. Os dados representam quatro tratamentos (incubado apenas; vórtice em velocidade 3 por 5 segundos; vórtice em velocidade 10 por 5 segundos; e vórtice em velocidade 10 por 30 segundos) em um volume de incubação de 10 μL.

[0028] A Figura 12 representa resultados de germinação para embriões de uma primeira linha de milho, sendo que os embriões foram armazenados usando métodos aqui fornecidos.

[0029] A Figura 13 representa resultados de germinação para embriões de uma segunda linha de milho, sendo que os embriões foram armazenados usando métodos aqui fornecidos.

[0030] A Figura 14 representa as etapas envolvidas no desprendimento do tecido do pericarpo.

[0031] A Figura 15 compara o ensaio de genotipagem ILLUMINA® GOLDENGATE® usando DNA obtido a partir de a) o método de extração de DNA com CTAB convencional com o uso de múltiplas sementes e b) o método de extração de DNA SBEADEX® com o uso de uma semente (com lavagem de tecido) seguido da amplificação do genoma total.

[0032] A Figura 16 demonstra que dados de marcador fluorescente de qualidade podem ser obtidos a partir de um único pericarpo.

[0033] A Figura 17 demonstra o alto grau de similaridade entre o genótipo medido do tecido do pericarpo extraído de uma única semente (cada linhagem) e o genótipo materno conhecido.

Descrição detalhada das modalidades preferenciais

[0034] A genotipagem de embriões ou de tecido embrionário permite a caracterização molecular preliminar no desenvolvimento de plantas, permitindo que seleções de um genótipo desejado sejam feitas semanas ou meses mais cedo que outros métodos como com fenotipagem ou genotipagem de plantas. Consequentemente, pode-se concentrar recursos antes em embriões que têm a maior probabilidade de se transformar em plantas desejáveis. As técnicas para caracterizar geneticamente tecido embrionário podem melhorar bastante um programa de melhoramento genético molecular e eliminar uma grande quantidade de esforço e recursos possibilitando que os produtores cultivem apenas plantas com a genética desejada. Além disso, a capacidade de caracterizar geneticamente com segurança um embrião sem impedir sua capacidade de germinar pode reduzir substancialmente a quantidade de tempo exigido entre gerações de plantas.

[0035] Genotipagem não destrutiva em um programa de melhoramento genético da planta pode exigir uma ou mais das medidas etapas: 1. Separação de fontes vegetais viáveis de outros materiais vegetais; 2. Preservação das fontes vegetais viáveis; 3. Obtenção de material genético correspondendo a múltiplas fontes vegetais viáveis ao mesmo tempo que mantendo a viabilidade das múltiplas fontes vegetais viáveis; 4. Obtenção do material genético para caracterização molecular; 5. Caracterização molecular do material genético a partir de múltiplas fontes vegetais viáveis; 6. Seleção de uma ou mais fontes vegetais viáveis com base em caracterizações moleculares; e 7. Cultivo das fontes vegetais viáveis escolhidas.

[0036] As fontes vegetais viáveis podem ser grãos, embriões vegetais, tecido vegetal ou plantas inteiras, por exemplo. Mais tipicamente, as fontes vegetais viáveis são capazes de se desenvolverem em plantas, embora não necessariamente. O material genético pode ser bruto, isto é, misturado com outras porções de tecido vegetal, inclusive materiais celulósicos e de proteína, ou pode ser purificado (como, por exemplo, por métodos de extração de DNA conhecido pelo versado na técnica). O material genético pode ser extraído diretamente das fontes vegetais viáveis, ou pode ser extraído de outro material vegetal. A etapa de preservação pode incluir manter as fontes vegetais viáveis de uma maneira que preserve a capacidade de se transformar em uma planta. A etapa de preservação pode incluir manter as fontes vegetais viáveis de uma maneira que evite a germinação. A etapa de caracterização molecular pode envolver genotipagem, sequenciamento genético, sequenciamento de RNA, detecção do marcador de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição, detecção de polimorfismo de nucleotídeo único, amplificação de genoma inteiro, detecção de proteína específica, mensuração do teor de óleo, mensuração do teor de proteína, ou qualquer outra análise molecular que possa servir como uma base para selecionar ou rejeitar fontes vegetais viáveis específicas. A etapa de cultivo pode envolver qualquer meio de cultivo de plantas, inclusive plantio em um campo ou em uma estufa, plantio hidrofilicamente, plantio aéreo ou qualquer outro método de cultivar uma planta. Em algumas modalidades, a planta é cultivada até amadurecer e produz pólen e/ou grãos. Em outras modalidades, uma ou mais das etapas é automatizada.

Separando fontes vegetais viáveis.

[0037] Em uma modalidade envolvendo milho, as extremidades dos grãos de milho são cortadas enquanto ainda estão presas ao sabugo de milho. As extremidades dos grãos de milho são tipicamente a parte mais distante do grão a partir do embrião, que é mais próxima à ponta do grão, que é preso ao sabugo. Cada embrião pode, então, ser removido, por exemplo, usando uma espátula pequena ou qualquer outro dispositivo apropriado. Em uma modalidade, esse processo é automatizado usando um cortador robotizado de extremidades, uma espátula manipulada de forma robótica, e uma plataforma de visão mecânica para controle de corte preciso e remoção de embrião.

[0038] Em uma outra modalidade, grãos de milho podem ser removidos do sabugo antes da remoção do embrião. Os grãos podem, então, ser orientados da mesma maneira, por exemplo, flutuando os grãos em água ou em uma solução. Os grãos podem, então, ser imobilizados, ao mesmo tempo que preservando suas orientações, por exemplo, drenando-os em um recipiente com múltiplas cavidades, cada cavidade possuindo um grão orientado. Pedaços pequenos das pontas dos grãos podem, então, ser removidos, de preferência pequenos o suficiente para evitar dano aos embriões. Os embriões podem, então, ser extraídos comprimindo suavemente os grãos dos lados das extremidades dos grãos.

[0039] Após a remoção do embrião, cada embrião pode ser colocado em um recipiente com múltiplas cavidades, sendo que o local de cada embrião em cada cavidade é registrado, associado ou correlacionado com o local do material genético obtido em uma etapa subsequente.

Preservação das fontes vegetais viáveis

[0040] Quando as fontes vegetais viáveis são sementes, a preservação de sementes pela quantidade de tempo exigido para realizar uma análise molecular tipicamente não exige nenhum cuidado específico. Quando as fontes vegetais viáveis são embriões, no entretanto, cuidados especiais devem ser tomados para preservar a viabilidade. Embriões podem ser armazenados em uma placa de múltiplas cavidades, onde cada cavidade correspondente a uma cavidade na qual o tecido extraído a ser testado é colocado.

[0041] Em um método preferencial, os embriões são suspensos em uma solução aquosa, circundada por uma matriz de um ou mais óleos. Óleo com uma densidade inferior à da água cobrirá o(s) embrião/embriões na solução aquosa, enquanto o óleo que tem uma densidade maior que a água irá sustentar o(s) embrião/embriões na solução aquosa. Em algumas modalidades, o um ou mais embriões vegetais é/são suspenso(s) em uma solução aquosa, circundada por uma matriz de dois ou mais óleos, sendo que pelo menos um dos dois ou mais óleos é mais denso que a solução aquosa e pelo menos um dos dois ou mais óleos é menos denso do que a solução aquosa, adicionalmente sendo que a solução aquosa é circundada pelo óleo, que é mais denso do que a solução, e o óleo, o qual é menos denso que a solução aquosa. O armazenamento de embriões pode ocorrer antes ou depois da coleta de material celular do embrião, a qualquer momento após a polinização se o embrião foi obtido diretamente a partir de um grão. Em algumas modalidades, os agentes antimicrobianos e/ou meios de crescimento mínimos podem ser adicionados à solução aquosa. Em algumas modalidades, os embriões podem ser armazenados em condições de frio e/ou escuro para evitar a germinação prematura. Em uma modalidade preferencial, os embriões são armazenados a uma temperatura de cerca de 4°C. Em algumas modalidades, os embriões podem ser transferidos para fins de armazenamento prolongado. Em outras modalidades, os embriões podem ser transferidos para o meio de germinação, e os embriões podem ser germinados. Em uma modalidade preferencial, uma alíquota da solução aquosa pode ser removida; material genético pode ser obtido a partir do material celular na alíquota; e o material genético pode ser usado para análise molecular (por exemplo, para genotipar os embriões armazenados).

[0042] O óleo de alta densidade que pode ser usado neste método inclui, mas não se limita, aos compostos perflúor com 12 compostos (por exemplo, os óleos KRYTOX® de baixa viscosidade da DuPont). O óleo de baixa densidade que pode ser usado nesse método inclui, mas não se limita, ao fenilmetilpolissiloxano. Outros óleos não tóxicos conhecidos dos versados na técnica podem ser usados em vez de ou juntamente com estes compostos.

Obtenção de material celular.

[0043] Material celular refere-se a qualquer material vegetal restante após a separação de fontes vegetais viáveis. O material celular pode incluir material de embrião e/ou endosperma e pode referir-se a uma célula, células múltiplas ou tecido celular. Caso se deseje informações genéticas para a planta parental, material genético pode ser obtido do pericarpo.

[0044] Em uma modalidade, o material celular é de um ou mais embriões vegetais, sendo que o um ou mais embriões vegetais são obtidos diretamente de um grão (isto é embriogênese zigótica) ou podem ser “derivados de outros tecidos” por meio de embriogênese somática ou gamética (microesfera). Embriogênese somática refere-se a embriogênese decorrente de células somáticas (isto é, células vegetativas ou não gaméticas), a saber, de explantes somáticos isolados decorrentes de células gaméticas (isto é, microesferas). Uma vez que células somáticas e gaméticas não são naturalmente embrionárias, tais células precisam ser induzidas a se tornar embrionárias. Pode-se obter a conversão para células embrionárias por meio de estímulos externos como auxina, citoquinina, alterações de pH, reguladores de crescimento e íons de metais pesados (Yeung, 1995 In: Thorpe TA (ed) In Vitro Embryogenesis in Plants (páginas 205-249; Dodeman et al. (1997) J. Exp. Bot. 48:1493-1509. O material celular expelido pode ser coletado de tecido embrionário agitando o embrião enquanto este está em um meio não destrutivo como água ou outra solução aquosa. O meio não destrutivo é qualquer meio que possibilita ao embrião manter sua viabilidade (isto é, sua capacidade de se desenvolver em uma planta normal). A agitação pode ocorrer por quaisquer meios conhecidos pelo versado na técnica.

[0045] Em uma outra modalidade, o material celular está presente em ou no ágar que está em contato com o embrião vegetal. A porção de ágar pode ser colocada em um meio não destrutivo que consiste essencialmente em água ou buffer TE, e a agitação pode ser aplicada usando qualquer meio conhecido pelo versado na técnica. Os métodos podem incluir, também, a remoção do embrião vegetal do ágar e guardar o embrião vegetal usando métodos aqui fornecidos ou transferir o embrião para meio de germinação. O embrião vegetal pode ser um embrião haploide, e o ágar pode incluir um agente de duplicação de cromossomo como, mas não se limitando a, colchicina. Como tal, o embrião vegetal pode se tornar um haploide duplo. De modo similar, o material celular pode também estar presente em papel filtro sobre o qual o embrião está em contato. Dessa forma, em uma outra modalidade, papel filtro pode ser usado em vez do ágar. O versado na técnica sabe que pode-se obter DNA a partir de amostras de plantas coletadas em papel filtro.

[0046] Em uma outra modalidade, quando uma espátula (ou qualquer outro implemento ou dispositivo utilizado para excisar uma peça de escutelo) é usada para remover o embrião de um grão, a espátula pode, então, ser imersa em uma cavidade em um recipiente que corresponde a uma cavidade em um segundo recipiente que aloja o embrião. De preferência, a espátula é imersa em uma cavidade contendo uma solução aquosa. Quando a espátula é usada para remover o embrião, quantidades suficientes de tecido do endosperma permanece na espátula (isto é, material celular expelido), e a espátula não precisa entrar em contato com o grão do qual o embrião foi removido após a extração do embrião. A espátula pode ser imersa na cavidade contendo solução aquosa imediatamente após o embrião ser removido. Se a mesma espátula for usada para a remoção de múltiplos embriões e/ou tecido do endosperma, está será, de preferência, limpa entre cada uso para remover qualquer material celular expelido que poderia levar à contaminação.

[0047] Em uma outra modalidade, o(s) embrião(ões) pode opcionalmente ser lavado, por exemplo com água ou meio de cultura, para remover qualquer endosperma fixo ao embrião. O(s) embrião(ões) lavado(s) pode, então, ser submerso em água doce ou outra solução aquosa e agitado para remover um pequeno número de células embrionárias do(s) embrião(ões) na água doce ou outra solução aquosa (isto é, material celular expelido). O(s) embrião(ões) pode, então, ser transferido para um recipiente com múltiplas cavidades, e parte ou toda a água doce ou solução aquosa contendo o pequeno número de células embrionárias pode ser transferida para uma cavidade correlacionada em um recipiente separado com múltiplas cavidades.

[0048] Em uma modalidade, um pedaço pequeno do escutelo pode ser excisado usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo cortar com uma lâmina ou um laser. De preferência, a peça do escutelo é pequena o suficiente para não comprometer a viabilidade do embrião. O embrião e a peça correspondente de escutelo podem, então, ser colocadas em recipientes separados com cavidades, nos quais a cavidade contendo o embrião no recipiente de embrião e a cavidade contendo o escutelo correspondente no recipiente de cutelo são correlacionadas de tal forma que qualquer informação obtida do escutelo é associada ao embrião do qual o tecido de escutelo foi obtido.

[0049] Em uma outra modalidade não exigindo necessariamente a extração de embrião ou outra separação de fontes vegetais viáveis, uma peça do revestimento externo de um grão de milho, o pericarpo, pode ser excisada, de modo a realizar uma análise molecular da planta parental. Nessa modalidade, os grãos podem ser imersos em água antes que sejam feitos cortes no pericarpo. A parte posterior do grão (mais distante do embrião) pode ser cortada com uma lâmina afiada, conforme mostrado na Figura 14a. De preferência, a lâmina é esterilizada após o primeiro corte antes que a borda externa do grão possa ser cortada com a lâmina afiada, tendo início a partir de uma extremidade do primeiro corte, ao redor da borda do grão e para baixo até a outra extremidade do primeiro corte, conforme mostrado na Figura 14b. Um fórceps esterilizado pode ser usado para desprender o tecido do pericarpo do grão, conforme mostrado na Figura 14c. Embora o corte possa ser feito no lado frontal do grão (mais próximo ao embrião), o corte é, de preferência, feito na parte posterior, para reduzir a possibilidade de que o pericarpo seja contaminado com o tecido do endosperma. Para reduzir ainda mais a possibilidade de contaminação, o tecido do pericarpo pode ser lavado após ser excisado. O pericarpo pode ser colocado na cavidade de um recipiente e a semente a partir da qual o pericarpo foi removido (ou embrião dessa semente) pode ser colocada em uma cavidade correspondente de um recipiente separado. Como será compreendido pelos versados na técnica, há outros métodos comparáveis para isolar o tecido do pericarpo, e, em algumas modalidades da invenção, o DNA do pericarpo pode ser extraído sem remoção do pericarpo.

[0050] O tecido a ser analisado é, de preferência, associado ou correlacionado à sua fonte vegetal viável correspondente, de modo que a fonte vegetal viável correspondente pode ser selecionada com base nos resultados da análise de tecidos.

Obtenção do material genético para caracterização molecular

[0051] A fim de que o material genético seja analisado, ele deve ser isento de células, de modo a ser acessível para análise molecular. Isto pode envolver tratamentos físicos, como exposição ao frio-ao calor ou apenas ao calor, incubação com enzimas ou até mesmo técnicas de extração de DNA (embora seja importante notar que a extração não é uma etapa necessária para a obtenção de DNA por análise molecular). Essencialmente, qualquer processo que rompe o tecido e quebra as células abertas, liberando, assim, o DNA, que pode ser usado para caracterização molecular, pode ser usado nos métodos aqui fornecidos.

[0052] Em algumas modalidades, o DNA pode ser obtido a partir do material celular expelido por exposição do material celular expelido coletado ao frio-ao calor ou ao calor, agitação da mistura e, opcionalmente, por repetição. Em outras modalidades, o DNA pode ser obtido pela incubação do material celular coletado com uma enzima; a enzima pode ser VISCOZYME® L, um complexo multienzimático contendo uma ampla faixa de carboidrases, incluindo a arabanase, celulase, β-glucanase, hemicelulase e xilanase. (Ver o catálogo de produtos da Sigma Aldrich). Em ainda outras modalidades, a obtenção de DNA pode compreender a extração de DNA, como mediante o uso de partículas magnéticas que se ligam ao material genético ou qualquer método conhecido pelo versado na técnica. Entretanto, não é necessária a extração para obter o DNA.

[0053] Em outras modalidades envolvendo tecido da semente materna como tecido do pericarpo, o tecido pode ser dissociado usando um dissociador de células (como gentleMACS™, Miltenyi Biotech), opcionalmente seguido por extração de DNA. Em uma outra modalidade, o tecido da semente materna pode ser rompido em nitrogênio líquido antes da extração de DNA. Em ainda outra modalidade, o DNA pode ser extraído diretamente de tecido da semente materna lavado (por exemplo, com o uso de Extract-N- Amp™).

Caracterização molecular do material genético a partir de múltiplas fontes vegetais viáveis

[0054] Nos casos em que o rendimento do DNA obtido a partir de tecido embrionário não é suficiente para algumas análises moleculares (por exemplo, genotipagem de alta densidade), as técnicas de amplificação de genoma inteiro podem ser usadas. O kit REPLI-g® da Qiagen, o kit SeqPlex da Sigma-Aldrich ou qualquer outra técnica conhecida pelo versado na técnica pode ser usado para amplificar DNA a partir do tecido embrionário.

[0055] Outras caracterizações moleculares úteis podem envolver o sequenciamento total ou parcial do genoma do tecido extraído da semente, ou com o uso de marcadores moleculares e sondas fluorescentes para genotipagem. A caracterização molecular não precisa focar no genótipo do tecido extraído, mas em vez disso, ela pode medir outras propriedades, como o teor de óleo, a composição de óleo, o teor de proteína ou a presença ou ausência de moléculas particulares no tecido.

[0056] Em uma modalidade preferencial, o material genético é colocado em uma cavidade de uma placa com múltiplas cavidades contendo uma bicamada de óleo, uma camada tendo uma densidade maior do que a água e uma camada com uma densidade menor do que a água. Múltiplas cavidades contêm vários materiais genéticos diferentes. As sondas marcadas fluorescentemente são adicionadas aos materiais genéticos, e a termociclagem para causar a amplificação e a hibridização das sondas é realizada em uma placa de múltiplas cavidades. As cavidades são irradiadas e a fluorescência é detectada a partir dos marcadores para gerar os dados genotípicos. Alternativamente, o material genético pode ser sequenciado, em parte ou totalmente, em uma placa de múltiplas cavidades.

Seleção de uma ou mais fontes vegetais viáveis com base em caracterizações moleculares

[0057] Em um programa de melhoramento genético molecular, as plantas ou plantas em potencial são selecionadas para participar nas gerações subsequentes, com base nos seus genótipos. Tipicamente, isto envolve determinar se a planta herdou uma ou mais características desejáveis indicadas por marcadores genéticos, cuja presença ou ausência pode ser determinada com base na genotipagem. Os melhoristas de plantas selecionam aquelas plantas que têm as características desejadas para participar no melhoramento genético adicional, para realizar cruzamentos puros ou como parte de um processo para criar linhagens puras por meio de técnicas de duplicação de haploides.

Cultivo das fontes vegetais viáveis escolhidas.

[0058] As plantas que são selecionadas com base na presença de características desejáveis, como determinado pelo seu genótipo, podem se desenvolver em plantas maduras, para obter material haploide para criar uma linhagem pura haploide dupla, para gerar consigo mesma ou para gerar com outras plantas e diversificar o germoplasma.

[0059] Em uma modalidade, um genótipo de consenso pode ser derivado considerando dados genotípicos de múltiplas espécimes de tecido obtidas a partir de uma ou mais sementes, cada espécime de tecido sendo uma réplica. Em um experimento de genotipagem que identifica múltiplos nucleotídeos nas múltiplas posições em um genoma, não é incomum que um experimento específico falhe na identificação de um ou mais dos nucleotídeos a serem identificados. Dessa forma, identificações perdidas de nucleotídeos para cada posição perdida podem ser observadas em cada uma das espécimes. Se a identificação de nucleotídeo de apenas uma amostra estiver disponível para uma posição de nucleotídeo específica, então, essa identificação de nucleotídeo é designada como um dado de consenso para essa posição. Se duas ou mais identificações de nucleotídeos estiverem disponíveis para uma posição de nucleotídeo específica, então, a maioria das identificações de nucleotídeos para essa posição é designada como um dado de consenso dessa posição. Se não houver uma identificação da maioria para uma posição, essa posição é designada como dado faltante do genótipo de consenso. Embora os exemplos aqui fornecidos se refiram à obtenção e genotipagem de tecidos de uma monocotiledônea, especificamente de milho, os elementos versados na técnica entenderiam como aplicar os mesmos métodos, ou similares, às outras monocotiledôneas e dicotiledôneas; os métodos podem ser adaptados a qualquer planta. Adicionalmente, os métodos de genotipagem apresentados na presente invenção podem ser usados para a genotipagem de qualquer tecido vegetal. Os métodos de genotipagem de consenso podem também ser usados para gerar um genótipo de consenso para múltiplas espécimes de qualquer material genético obtido a partir de qualquer fonte, sem que se afaste das etapas reveladas. Exemplo 1: Genotipagem de embrião

A. Coleta do material embrionário:

[0060] Os embriões foram lavados 3 vezes usando 2 ml de água estéril. Os embriões foram incubados em um tubo contendo 10 μL, 20 μL, 50 μL, 75 μL ou 150 μL de água estéril durante 10 minutos, 20 minutos ou de um dia para o outro. Verificou-se que os dados de genotipagem adequados podem ser obtidos com qualquer um dos volumes de diluição, e que 10 minutos era um tempo de incubação suficiente. Todos os protocolos de lavagem e incubação dos embriões foram usados com todos os três métodos de coleta de tecido descritos a seguir.

[0061] Método 1: Os tubos contendo os embriões foram agitados batendo levemente 10 vezes e foram, em seguida, decantados por centrifugação em uma centrífuga de bancada durante 5 segundos. A água foi, em seguida, removida de cada tubo para análise. Verificou-se que este método alcançou os melhores resultados para a genotipagem.

[0062] Método 2: Os embriões foram lavados 3 vezes usando 2 mL de água estéril. Os embriões foram incubados em um tubo contendo 50 μL de água estéril durante 10 minutos. A água foi, em seguida, removida do tubo para análise.

[0063] Método 3: Os embriões foram lavados 3 vezes usando 2 mL de água estéril. Os embriões foram incubados em um tubo contendo 50 μL de água estéril durante 10 minutos. Os tubos contendo os embriões foram agitados batendo levemente 10 vezes nos mesmos. A água foi, em seguida, removida de cada tubo para análise.

B. Métodos para obter DNA: Choque frio-calor:

[0064] O material embrionário obtido usando todos os três métodos descritos acima foi colocado em um congelador a - 80°C durante 20 min; ele foi, em seguida, colocado em um termociclador a 100°C durante 10 min, e pipetado para cima e para baixo para misturar. Ao todo, o processo foi repetido duas vezes. As misturas resultantes foram armazenadas a -20°C. Verificou-se que os melhores resultados para a genotipagem foram obtidos a partir do DNA obtido usando esse método.

Apenas choque térmico:

[0065] Os tecidos embrionários foram colocados em um termociclador durante 10 min a 100°C e pipetados para cima e para baixo para misturar. Ao todo, o processo foi repetido duas vezes. As misturas foram armazenadas a -20°C.

Método enzimático:

[0066] As misturas da etapa anterior foram incubadas em uma estufa a 95°C para remover por evaporação a água restante. 18,0 μL de solução de PBS e 2,0 μL de VISCOZYME® L diluída (disponível comercialmente junto à Sigma-Aldrich; diluído 1:200 em solução de PBS, em pH 7,4; vol. total: 20 μL) foram adicionados, e as misturas foram incubadas a 37°C durante 2 horas. Uma quantidade de 2,0 μL de proteinase k diluída (disponível comercialmente junto à Sigma-Aldrich; diluída 1:20 em solução de PBS, pH 7,4) foi adicionada, e as misturas foram incubadas a 55°C durante 50 minutos, em seguida, ela foi aquecida até 95°C durante 10 min. As misturas foram armazenadas a - 20°C.

Extração de DNA:

[0067] As misturas dos métodos do exemplo 1 B foram incubadas em uma estufa a 95°C para remover por evaporação a água restante. 45 μL de tampão de lise (LGC Genomics) foram adicionados a cada mistura, que foi, então, brevemente centrifugada e incubada durante 1 hora a 65°C. Foi adicionado aos novos tubos 60 μL de tampão de ligação PN, 5 μL de partículas SBEADEX® (partículas magnéticas que se ligam ao material genético, que estão disponíveis comercialmente junto à LGC Genomics) seguido por misturas de lisado, que foram, em seguida, incubadas em temperatura ambiente durante 4 minutos para permitir a ligação de DNA às partículas, submetidos brevemente ao vórtice e colocados em uma prateleira magnética para concentrar as esferas. O tampão de lise foi removido e 100 mL de tampão de lavagem PN1 (LGC Genomics) foi adicionado para ressuspender as esferas. A lavagem foi repetida com o uso de 100 μL de tampão de lavagem PN2 (LGC Genomics) seguido por uma lavagem com 100 μL de água pura. 10 μL de tampão de eluição PN foram adicionados, e as misturas foram incubadas a 55°C durante 10 minutos, sob vórtice a cada 3 minutos. O suporte magnético foi usado para concentrar as esferas e o eluído foi transferido para tubos novos e armazenado a - 20°C.

C. Amplificação do genoma completo

[0068] Quando a amplificação do genoma completo é necessária, o seguinte protocolo foi seguido utilizando o kit de célula única REPLI-g® (disponível comercialmente junto à Qiagen). A amplificação do genoma completo foi realizada para obter um maior rendimento de DNA e para facilitar a detecção dos conjuntos de marcadores de alta densidade.

[0069] 2,5 μL de DNA molde foram combinados com 2,5 μL de tampão D1 (disponível comercialmente junto à Qiagen; volume total 5,0 μL) e incubados em temperatura ambiente durante 3 minutos. 5,0 μL de tampão N1 (disponível comercialmente junto à Qiagen; volume total 10,0 μL) foram adicionados, e as misturas foram submetidas ao vórtice e brevemente centrifugadas. Uma mistura mestre contendo 9,0 μL de nuclease isenta de água, 29,0 μL de tampão reacional REPLI-g® (disponível comercialmente junto à Qiagen) e 2,0 μL de DNA polimerase REPLI-g® (disponível comercialmente junto à Qiagen) foi usada por reação para produzir 50,0 μL de volume total. As misturas foram executadas em um termociclador usando 30°C durante 8 horas e, posteriormente, 4°C. A quantificação do DNA foi realizada usando um ensaio QUBIT® (comercialmente disponível junto à Life Technologies). O produto de DNA foi usado diretamente na etapa de genotipagem.

D. Análise molecular Análise do marcador TAQMAN®

[0070] A análise do marcador foi realizada utilizando os ensaios TAQMAN® (comercialmente disponíveis junto à Life Technologies). O DNA foi diluído até uma concentração alvo de 20 ng/μL. Uma placa de 384 cavidades contendo o DNA foi carregada em um termociclador de PCR em tempo real LC480 e analisada usando o seguinte programa: pré-incubação: 1 ciclo (95°C por 5 minutos); amplificação: 45 ciclos, (-95°C durante 30 segundos, -60°C durante 45 segundos (captura única), -72°C durante 1 minuto (captura única); resfriamento: 1 ciclo, (-72°C durante 10 minutos, -40°C durante 30 segundos). Os calos foram lidos usando o software LIGHTCYCLER® LC480 da Roche (disponível comercialmente junto à Roche Diagnostics).

Resultados

[0071] Todos os métodos anteriormente mencionados produziram resultados de genotipagem aceitáveis. Dados genotípicos mostrados nas Figuras 1-11, que incluem dados de todas as permutações dos métodos apresentados neste exemplo. A Figura 1 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam três tratamentos diferentes (incubado apenas; incubado e batido; e incubado, batido e decantado) em cada um dos quatro volumes de incubação diferentes (10 μL, 20 μL, 50 μL, e 75 μL) . A Figura 2 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam um único tratamento (incubado, batido e decantado) em um volume de incubação de 50 μL. A Figura 3 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido a partir do choque frio-calor, choque térmico, incubação com VISCOZYME® L, ou extração de DNA usando o método SBEADEX®. Os dados representam três tratamentos diferentes (incubado apenas; incubado e batido; e incubado, batido e decantado, em um volume de incubação de 50 μL. A Figura 4 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam um único tratamento (incubado, batido e decantado) em um volume de incubação de 50 μL. A Figura 5 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido a partir do choque frio-calor, incubação com VISCOZYME® L, ou extração de DNA usando o método SBEADEX®. Os dados representam três tratamentos diferentes (incubado apenas; incubado e batido; e incubado, batido e decantado, em um volume de incubação de 50 μL. A Figura 6 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam um único tratamento (incubado, batido e decantado) em um volume de incubação de 50 μL. A Figura 7 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio- calor. Os dados representam três tratamentos (incubado apenas; incubado e batido; e incubado, batido e decantado, em um volume de incubação de 150 μL. A Figura 8 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam um único tratamento (incubado, batido e decantado) em um volume de incubação de 150 μL. Um dos calos homozigóticos era incorreto. A Figura 9 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor ou sem nenhum tratamento após a lavagem do material celular expelido. Os dados representam três tratamentos (incubado apenas; incubado e batido; e incubado, batido e decantado, e dois volumes de incubação (50 μL e 100 μL) . A Figura 10 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor. Os dados representam um único tratamento (incubado, batido e decantado) em um volume de incubação de 50 μL. A Figura 11 representa dados genotípicos de um marcador usando DNA obtido com o tratamento de choque frio-calor e amplificação de genoma inteiro (usando o kit de célula única REPLI-g) para obter rendimento suficiente de DNA antes de genotipar. Os dados representam quatro tratamentos (incubado apenas; vórtice em velocidade 3 por 5 segundos; vórtice em velocidade 10 por 5 segundos; e vórtice em velocidade 10 por 30 segundos) em um volume de incubação de 10 μL. Exemplo 2: Armazenamento de embrião

[0072] Duas linhas de germoplasma de milho foram selecionadas para testar os impactos do armazenamento de embrião prolongado em uma matriz oleosa sobre as taxas de germinação. Embriões de cada linhagem foram isolados com a mão antes de serem colocados em suas respectivas condições de armazenamento. Todos os embriões foram plaqueados em meio de germinação, para avaliar as taxas de germinação em uma câmara de crescimento controlado. Seis embriões de cada linhagem foram imediatamente plaqueados em meio de germinação, sem qualquer exposição ao armazenamento para agir como um controle para a germinação em uma câmara de crescimento controlado. Setenta e dois (72) embriões de cada linhagem foram isolados e divididos uniformemente em três condições de armazenamento, com um tubo de armazenamento dedicado para cada embrião:

[0073] Condição de armazenamento 1: 24 embriões foram colocados em 50 μL de uma solução aquosa, circundados por duas camadas de óleo com densidades significativamente diferentes, uma com uma densidade significativamente maior do que a água e uma com uma densidade significativamente menor do que a da água.

[0074] Condição de armazenamento 2: 24 embriões foram colocados em uma gota de solução aquosa de 50 μL com um agente antimicrobiano adicionado, e circundados pelos dois óleos da condição 1.

[0075] Condição de armazenamento 3: 24 embriões foram colocados em uma gota de meio de crescimento mínimo de 50 μL com um agente antimicrobiano adicionado, e circundados pelos dois óleos da condição 1.

[0076] Todos os tubos foram colocados em um refrigerador a 4 graus centígrados, durante a duração do experimento. Depois de quatro (4) pontos de tempo, 6 embriões de cada linhagem foram removidos das suas condições de armazenamento e foram plaqueados em meio de germinação em uma câmara de crescimento controlada para avaliar as taxas de germinação. Os pontos no tempo foram os seguintes: Ponto de tempo 1: 15 minutos após colocação no armazenamento. Ponto de tempo 2: 1 dia após a colocação em armazenamento. Ponto de tempo 3: 5 dias após a colocação em armazenamento. Ponto de tempo 4: 10 dias após a colocação em armazenamento.

[0077] As taxas de germinação do embrião foram, em seguida, monitoradas para determinar as condições ideais de armazenamento. Os resultados desses testes são mostrados nas Figuras 12 e 13 (resultados para duas linhagens diferentes de milho). Verificou-se que as taxas de germinação foram excelentes em cada um dos três métodos de armazenamento. Exemplo 3: Genotipagem do pericarpo

A. Desprendimento do pericarpo

[0078] Grãos de milho foram retirados do sabugo e imersos durante 60 minutos em água deionizada. Uma lâmina de bisturi foi esterilizada usando um esterilizador com microesferas. O bisturi foi usado para cortar o lado posterior das sementes (na direção contrária ao embrião) próximo às pontas, conforme mostrado na Figura 14a. O bisturi foi esterilizado outra vez usando um esterilizador com microesferas e resfriado em água estéril. O bisturi foi, então, usado para cortar ao longo da borda externa do grão, conforme mostrado na Figura 14b. Fórceps foram esterilizados em um esterilizador com microesferas, resfriados e, então, usados para desprender o pericarpo do grão, conforme mostrado na Figura 14c. O tecido do pericarpo de cada grão foi, então, colocado em tubos de microcentrífuga.

B. Lavagem do pericarpo

[0079] Três soluções diferentes foram testadas. Os melhores resultados foram obtidos com 1% de solução de dodecil sulfato de sódio (SDS), embora resultados adequados foram alcançáveis com o uso de água e etanol. Um método de lavagem alternativo com o uso de ultrassom também forneceu resultados adequados. O protocolo de lavagem usado começou com a adição de 1 ml de solução de lavagem aos tubos de microcentrífuga, que foram colocados em um inversor durante 1 minuto. A solução de lavagem foi removida e substituída por 1 ml de solução de lavagem fresca, então, os tubos para microcentrífuga foram novamente colocados em um inversor, desta vez, durante 4 minutos. O tecido do pericarpo foi, então, removido, enxaguado com água destilada e colocado em um novo tubo para microcentrífuga. O protocolo de sonicação colocou o tecido do pericarpo em um ultrassom durante 1 minuto. O tecido foi, então, removido, enxaguado com água destilada e colocado em um novo tubo para microcentrífuga.

C. Obtenção de DNA

[0080] Cinco métodos de obtenção de DNA foram testados. Os melhores resultados foram obtidos com o protocolo gentleMACS™ com sobrenadante em água ou TE.

[0081] gentleMACS™/sobrenadante em água ou TE: Nesse método, o tecido do pericarpo foi colocado diretamente no rotor de um tubo de gentleMACS™ M. 300 ul de água ou tampão TE foram adicionados ao tubo, que foi então fechado e colocado em uma máquina gentleMACS™. O programa automatizado “Protein_01.01” foi executado. Para os tecidos de pericarpo que não foram completamente dissociados, foi realizada a misturação e execução adicional do programa automatizado. Em seguida, as misturas foram centrifugadas no tubo de GentleMACS™ e transferidas para um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml. O tubo Eppendorf foi então centrifugado a 14.000 rpm durante 2 minutos, e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml para análise molecular. Nenhuma extração do DNA foi necessária nesse método.

[0082] GentleMACS™ / SBEADEX® Nesse método, o tecido do pericarpo foi colocado diretamente no rotor de um tubo M de gentleMACS™. 300 μl de tampão de lise PN SBEADEX® foram adicionados ao tubo, que foi então fechado e colocado em uma máquina gentleMACS™. O programa automatizado “Protein_01.01” foi executado. Para os tecidos de pericarpo que não foram completamente dissociados, foi realizada a misturação e execução adicional do programa automatizado. Em seguida, as misturas foram centrifugadas e incubadas a 65°C durante 1 hora com agitação ocasional. 360 μl de tampão de ligação PN e 30 μl de partículas SBEADEX® foram adicionados a novos tubos Eppendorf de 1,5 ml. Os tubos com o tecido do pericarpo foram centrifugados e o lisado foi transferido para novos tubos. Esses tubos foram então incubados à temperatura ambiente durante 4 minutos, para permitir que o DNA se ligasse às partículas SBEADEX®. As misturas foram, então, brevemente submetidas ao vórtice e, então, colocadas em um suporte magnético para concentrar as microesferas. O tampão de lise foi removido e 600 μl de tampão de lavagem PN1 foram adicionados a cada tubo e as esferas de vidro foram ressuspensas. Os tubos foram colocados em um suporte magnético novamente para concentrar as esferas, e o tampão de lavagem PN1 foi removido. Esse procedimento de lavagem foi repetido com 600 μl de tampão de lavagem PN2 e, então, novamente repetido com 600 μl de água pura. Após essa terceira etapa de lavagem, 40 μl de tampão de eluição PN foram adicionados e os tubos foram incubados a 55°C durante 20 minutos, e submetidos ao vórtice a cada 3 minutos. Uma placa magnética foi usada para concentrar as microesferas, e o eluato foi transferido para novos tubos e, então, armazenados a -20°C até a caracterização molecular.

[0083] gentleMACS™/Extract-N-Amp™: Neste método, o tecido do pericarpo foi novamente colocado diretamente sobre o rotor de um tubo M gentleMACS™. 300 μl de água esterilizada foram adicionados ao tubo, que foi então fechado e colocado em uma máquina gentleMACS™. O programa automatizado “Protein_01.01” foi executado. Para os tecidos de pericarpo que não foram completamente dissociados, foi realizada a misturação e execução adicional do programa automatizado. O homogenizado foi transferido para um tubo de 1,5 ml de microcentrífuga e centrifugado a 10.000 rpm durante 1 minuto. O sobrenadante foi removido sem que o pélete do tecido no fundo do tubo fosse tocado. 30 μl de solução de extração/solução de preparação de sementes (kit de PCR de sementes Extract-N-Amp™) foram adicionados e a mistura resultante foi completamente misturada. A mistura foi transferida para tubos de PCR em fileira para uso no termociclador, que foi programado para se manter a 55°C durante 10 minutos, depois, a 95°C durante 3 minutos e, então, para se manter indefinidamente a 4°C. 30 μl de solução B de neutralização foram adicionados.

[0084] Nitrogênio líquido/ SBEADEX®: Maceradores para de tubo de microtubos de 1,5 ml foram colocados em nitrogênio líquido para resfriar. O tecido do pericarpo foi colocado em tubos de microcentrífuga juntamente com os maceradores resfriados e o tubo inteiro foi colocado em nitrogênio líquido. Nitrogênio líquido foi adicionado aos tubos. O tecido do pericarpo foi lentamente e cuidadosamente triturado com o uso do macerador. Os tubos foram ocasionalmente imersos novamente em nitrogênio líquido para manter o tecido frio. Após a trituração, 90 μl de tampão de lise PN foram adicionados a cada tubo, que foram rapidamente brevemente centrifugados e depois incubados a 65°C durante 1 hora. 120 μl de tampão de ligação PN e 10 μl de partículas de SBEADEX® foram adicionadas a novos tubos, e o lisado da etapa de trituração foi adicionado a tubos novos. Esses tubos foram então incubados à temperatura ambiente durante 4 minutos, para permitir que o DNA se ligasse às partículas SBEADEX®. As misturas foram brevemente submetidas ao vórtice e colocadas em um suporte magnético para concentrar as microesferas. O tampão de lise foi removido e 200 μl de tampão de lavagem PN1 foram adicionados a cada tubo e as esferas de vidro foram ressuspensas. Os tubos foram colocados em um suporte magnético novamente para concentrar as esferas, e o tampão de lavagem PN1 foi removido. Esse procedimento de lavagem foi repetido com 200 μl de tampão de lavagem PN2 e, então, novamente repetido com 200 μl de água pura. Após essa terceira etapa de lavagem, 20 μl de tampão de eluição PN foram adicionados e os tubos foram incubados a 55°C durante 10 minutos, e submetidos ao vórtice a cada 3 minutos. Uma placa magnética foi usada para concentrar as microesferas, e o eluato foi transferido para novos tubos e, então, armazenados a -20°C até a caracterização molecular.

[0085] Extract-N-Amp™: Uma mistura mestre de 18 partes de solução de extração e 2 partes de solução de preparação de sementes foi preparada, e 20 μl da solução foram adicionados ao tecido do pericarpo em tubos de PCR em fileira de 0,2 ml. As misturas foram colocadas em um termociclador configurado a 55°C durante 10 minutos, a 95°C durante 3 minutos e, então, a 4°C indefinidamente. 20 μl de solução de neutralização B foram adicionados e a porção líquida da mistura foi transferida para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.

D. Teste molecular

[0086] KIT DE ENSAIO HS DE DSDNA QUBIT®: O reagente QUBIT® foi diluído em tampão QUBIT® em uma razão de 1:200 para fazer uma solução de trabalho. 1 μl dos produtos de PCR da etapa 2B foi transferido para tubos de ensaio QUBIT® de 0,5 ml e 199 μl da solução de trabalho. Os padrões foram produzidos pela adição de 10 a 190 μl de solução de trabalho QUBIT®. Os produtos de PCR e os padrões foram submetidos a vórtice durante 2 a 3 segundos e, em seguida, eles foram rapidamente centrifugados. Os tubos foram, então, incubados à temperatura ambiente durante 2 minutos. Os tubos foram, então, inseridos em um fluorímetro QUBIT® 2.0 e as leituras foram registradas.

[0087] Amplificação de genoma total (Seqplex): O método preferencial para amplificação de genoma total é o método Seqplex que utiliza o kit de amplificação de DNA melhorado Seqplex. Para 1 μl de cada solução de DNA gerada na etapa C foram adicionados 2 μl de tampão de preparação de biblioteca e 11 μl de água pura. A solução foi centrifugada, submetida ao vórtice e centrifugada novamente, incubada em um termociclador a 95°C durante 2 minutos e, em seguida, mantida a 4°C. Após o resfriamento 1 μl de enzima de preparação de biblioteca foi adicionado. A solução foi centrifugada, submetida ao vórtice e centrifugada novamente e, então, incubada em um termociclador a 16°C durante 20 minutos, a 24°C durante 20 minutos, a 37°C durante 20 minutos, a 75°C durante 5 minutos e, em seguida, mantida a 4°C. A solução foi brevemente centrifugada. 15 μl dessa solução foram adicionados à 15 μl de 5x de mistura de amplificação (A5112), 1,5 μl de DNA polimerase para SeqPlex (SP300), 42,5 μl de água esterilizada (W4502) e 1 μl de SYBR Green (S9403), diluído a 1:1000. Essa solução foi misturada completamente, e cada mistura reacional foi dividida em cinco alíquotas de 15 μl em uma placa de 384 poços. O termociclo de amplificação começou com uma desnaturação inicial a 94°C durante 2 minutos, seguida de um número suficiente de ciclos para alcançar o platô em 2 a 3 ciclos (tipicamente cerca de 24 ciclos): desnaturação a 94°C durante 15 segundos, 70°C para hibridização/extensão durante 5 minutos, leitura da fluorescência e repetição. Após a ciclagem, a mistura de reação foi mantida a 70°C durante 30 minutos, então mantida a 4°C. Após o resfriamento, as amostras foram purificadas por purificação de PCR QIAQUICK®.

[0088] Amplificação de genoma total (kit de célula única REPLI- g): O tampão de desnaturação D1 foi preparado pela adição de 3,5 μL de tampão de reconstituição DLB 12,5 de água livre de nuclease. O tampão de neutralização N1 foi preparado através da adição de 4,5 μl de solução de bloqueio e 25,5 μl de água livre de nuclease. 2,5 μl do tampão de desnaturação foram adicionados a cada alíquota de 2,5 μl da solução de DNA preparada na etapa C. Essa solução foi incubada à temperatura ambiente durante 3 minutos. 5,0 μl do tampão de neutralização N1 foram adicionados, e a solução foi submetida ao vórtice e, em seguida, centrifugada brevemente. A mistura mestre foi preparada com 9,0 de água livre de nuclease, 29,0 μl de tampão de reação REPLI-g e de 2,0 μl de DNA polimerase REPLI-g por reação. 40,0 μl dessa mistura mestre foram adicionados à cada solução, que é, então, realizada em um termociclador a 30°C durante 8 horas, depois resfriada a 4°C.

[0089] Os produtos de amplificação de genoma total foram avaliados com o uso do ensaio QUBIT® para determinar a quantidade de DNA.

[0090] Testes de genotipagem. Ambas as análises de marcadores de alta densidade (o chip 3072X ILLUMINA®) e do marcador TAQMAN® foram usadas com êxito para genotipar os materiais genéticos descritos neste exemplo. Os dados demonstrando a eficácia das técnicas anteriormente mencionadas são apresentados nas Figuras 2 a 4. A Figura 15 compara a qualidade dos dados obtidos usando métodos de extração de DNA em relação àqueles obtidos com o uso de amplificação do genoma total. Enquanto ambos os métodos proporcionam resultados aceitáveis, o método de amplificação do genoma total fornece, de preferência, resultados, com cada um dos três haplótipos bem resolvidos. A Figura 16 é um gráfico de dispersão de marcador fluorescente que demonstra que dados do marcador fluorescente de qualidade podem ser obtidos a partir de uma única amostra de tecido do pericarpo. De fato, os métodos da invenção permitem a genotipagem com o uso de muitos marcadores, dezenas ou, potencialmente, centenas, com o uso de um tecido de pericarpo extraído a partir de uma única semente. A Figura 17 demonstra a confiabilidade dos métodos da invenção, devido ao alto grau de similaridade entre o genótipo do tecido medido do tecido do pericarpo extraído de uma única semente extraída (cada linhagem) e o genótipo materno conhecido. Exemplo 4: Genotipagem com o uso de meio de ágar

[0091] Os embriões foram isolados e cultivados em meio de ágar com colchicina para duplicação de tratamento. Após 24 horas, embriões diploides apresentavam cor púrpura; e embriões haploides apresentavam cor branca. Os embriões brancos foram, então, transferidos para placas para continuar o crescimento. Usando uma espátula esterilizada, uma porção do meio de ágar (ligeiramente maior que o próprio embrião) foi recolhida diretamente abaixo do embrião da placa dupla inicial de 24 horas. A porção de ágar foi transferida para um tubo de 2,0 ml contendo 60 μL de buffer TE estéril. O tubo foi incubado durante 10 minutos em temperatura ambiente, submetido ao vórtice na mais alta velocidade durante 5 segundos, e centrifugado durante 10 segundos em uma centrífuga de bancada. Aproximadamente 60 μL de líquido foi transferido para um tubo de PCR em fileira. Os tubos de PCR em fileira foram colocados em um congelador a -80°C durante 20 minutos e, então, colocados em um termociclador a 100°C durante 10 minutos e em seguida mantidos a 4°C. Os tubos foram submetidos a vórtice, e o tratamento de choque frio-calor foi repetido uma segunda vez. A análise do marcador TAQMAN® foi usada com êxito para genotipar material genético obtido a partir de material celular expelido dos embriões haploides duplicados, nos quais o material celular expelido foi obtido do meio de ágar. Os resultados foram comparáveis aos calos de genotipagem obtidos do tecido embrionário do embrião haploide duplo com o método principal de extração de DNA. A genotipagem do embrião haploide duplo usando material celular expelido contido no interior ou em um meio de ágar obteve êxito. Exemplo 5: Teste de germinação e maturação

[0092] Os materiais celulares expelidos foram coletados de embriões haploides duplicados contidos no interior de um meio não destrutivo usando um dos quatro tratamentos de agitação (batimento, exposição a vibrações lineares, vortexação e uso de pistão pneumático) bem como sem nenhuma agitação. Os embriões haploides duplicados dos quais se obteve o material celular expelido foram então avaliados para observar as capacidades de germinação e de maturação. Os embriões foram germinados em meio durante 11 dias, e foram então transferidos para a estufa para continuar o crescimento e maturação, a fim de confirmar que os métodos de coleta não causaram quaisquer efeitos adversos sobre o desenvolvimento a longo prazo da planta. As plantas foram autopolinizadas, e duplicados os fenótipos haploide, por exemplo, coloração do grão e altura da planta, foram observadas. As imagens das plantas e espigas autopolinizadas foram coletadas. O tecido foliar foi também coletado de cada planta usando um perfurador foliar. Os dados genotípicos obtidos do material celular expelido dos embriões haploides duplicados corresponderam aos dados genotípicos obtidos do tecido foliar. Dessa forma, as plantas que se desenvolveram a partir dos embriões haploides duplicados germinaram e maturaram normalmente, sem aparecimento de efeitos adversos decorrentes da agitação dos embriões para liberar o material celular expelido. Exemplo 6: Genotipagem de tecido embrionário derivado de microesferas

[0093] O tecido embrionário derivado de microesferas foi transferido de uma placa de crescimento para um tubo de 1,5 ml contendo 40 μL de buffer TE estéril usando uma espátula esterilizada. O tecido embrionário derivado de microesferas foi incubado durante 30 minutos em temperatura ambiente. Em um conjunto de experimentos, os tubos foram colocados em um braço do pistão pneumático, que sujeitou o tecido embrionário derivado de microesferas a movimento lateral. Em um outro conjunto de experimentos, os tubos foram submetidos a vórtice em altas velocidades durante 10 segundos. Após agitação, os tubos foram então centrifugados durante 10 segundos em uma centrífuga de bancada, e ~40 μL de líquido foi transferido para um tubo de PCR em fileira. Os tubos contendo o meio não destrutivo foram colocados em um congelador a -80°C durante 20 minutos e, então, colocados em um termociclador a 100°C durante 10 minutos e em seguida mantidos a 4°C. Os tubos foram submetidos a vórtice, e a agitação de choque frio-calor foi repetida. Quatro marcadores foram usados para genotipagem, mostrando que o material celular expelido obtido de tecido embrionário derivado de microesferas poderia ser usado com êxito para genotipagem.

Claims (24)

1. Método para analisar um ou mais embriões vegetais, sendo o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) coletar material celular expelido de um ou mais embriões vegetais agitando um ou mais embriões vegetais em um meio não destrutivo, em que o material celular expelido foi obtido pela agitação do recipiente sem a adição de químicos que induziriam a lise celular, e em que o tecido embrionário foi removido do recipiente, e o material celular expelido e o meio não destrutivo foram mantidos no recipiente; (b) obter DNA a partir do material celular expelido no meio não destrutivo consistindo essencialmente de uma solução aquosa; e (c) realizar uma análise molecular do DNA obtido na etapa (b).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente a germinação de ao menos um ou mais embriões vegetais em uma planta.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o DNA é obtido expondo o material celular expelido coletado ao frio e depois ao calor, seguido de agitação.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que as ditas etapas de frio, calor e agitação são repetidas.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente armazenar um ou mais embriões vegetais antes ou depois da etapa (a).

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a análise molecular é a genotipagem.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, sendo o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente selecionar um ou mais embriões vegetais com base em genótipo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que qualquer uma das etapas resultantes na seleção de um ou mais embriões vegetais é automatizada.

9. Método de analisar um embrião vegetal, sendo o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a. obter uma porção de ágar em contato com um embrião vegetal, sendo que a dita porção compreende material celular expelido do dito embrião vegetal; b. obter material genético do material celular expelido do embrião vegetal; e c. realizar uma análise molecular do material genético obtido do dito material celular expelido do embrião vegetal.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito ágar compreende um agente de duplicação de cromossomo.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito agente de duplicação de cromossomo é colchicina.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9, sendo o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente a germinação do dito embrião vegetal em uma planta.

13. Método, de acordo com a reivindicação 9, sendo o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente a remoção do embrião do ágar e armazenamento do embrião.

14. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a análise molecular é a genotipagem.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, sendo o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente selecionar um embrião vegetal com base em genotipagem.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que qualquer uma das etapas resultantes na dita seleção é automatizada.

17. Método de analisar tecido embrionário vegetal, sendo o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) coletar material celular expelido de tecido embrionário vegetal agitando o tecido embrionário vegetal em um meio não destrutivo, em que o material celular expelido foi obtido pela agitação do recipiente sem a adição de químicos que induziriam a lise celular, e em que o tecido embrionário foi removido do recipiente, e o material celular expelido e o meio não destrutivo foram mantidos no recipiente; (b) obter DNA a partir do material celular expelido no meio não destrutivo consistindo essencialmente de uma solução aquosa; e (c) realizar uma análise molecular do DNA obtido na etapa (b).

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito tecido embrionário é derivado de uma microesfera.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, sendo o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente derivar uma planta do tecido embrionário vegetal.

20. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o DNA é obtido expondo o material celular expelido coletado ao frio e depois ao calor, seguido de agitação.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que as ditas etapas de frio, calor e agitação são repetidas.

22. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a análise molecular é a genotipagem.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, sendo o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente selecionar tecido embrionário vegetal com base em genótipo.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que qualquer uma das etapas resultantes na seleção do tecido embrionário vegetal é automatizada.

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