BR112017003947B1

BR112017003947B1 - Método para a determinação da linhagem de uma ou mais sementes únicas de milho

Info

Publication number: BR112017003947B1
Application number: BR112017003947-8A
Authority: BR
Inventors: Justin Andrew Schares; Yue Yun; Chengfeng ZHAO
Original assignee: Pioneer Hi-Bred International, Inc
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2022-11-29
Also published as: US10240211B2; CN106687603A; BR112017003947A2; AR100726A1; EP3186389B1; EP3186389A1; WO2016032588A1; CN106687603A8; US20160060712A1

Abstract

MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DA LINHAGEM. A invenção inclui métodos para obter amostras do tecido materno de sementes, obter material genético a partir do tecido da semente materna e executar uma análise molecular no material genético do tecido da semente materna para determinar a linhagem materna de uma única semente. A invenção também inclui métodos para estabelecer um genótipo materno de consenso a partir dos tecidos da semente materna obtidos a partir de múltiplas sementes, bem como métodos para determinar a linhagem paterna.

Description

Referências remissivas aos pedidos de depósito correlatos

[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido nacional US n° 14/473.074, depositado em sexta-feira, 29 de agosto de 2014, aqui incorporado em sua totalidade, a título de referência.

Antecedentes da invenção

[0002] Uma semente é um embrião encerrado em uma cobertura externa protetora chamada de revestimento das sementes. Nas monocotiledôneas, o revestimento das sementes é fundido com o pericarpo, que é composto de múltiplas camadas de células e contém apenas o código genético materno. Como tal, o tecido do pericarpo pode ser usado para identificar a linhagem materna de uma semente. A linhagem parental pode ser adicionalmente derivada do genótipo do pericarpo em combinação com o genótipo da semente (embrião ou endosperma), que contém as informações genéticas básicas materna e paterna. Determinar a linhagem é importante para a segurança do germoplasma, para assegurar que linhagens parentais proprietárias permaneçam proprietárias.

[0003] Tecidos ou outras estruturas aderentes conectam o pericarpo à parte interna da semente, principalmente, ao tecido endospérmico. Isso, acoplado ao tamanho relativamente pequeno da maioria das sementes, pode dificultar a separação e coleta do pericarpo, ou pelo menos torná-las mais demoradas e trabalhosas. A análise molecular do tecido impuro do pericarpo contaminado com o tecido do interior da semente (por exemplo, endosperma), que contém informações genéticas maternas e paternas, leva à identificação genética ambígua da linhagem materna. Portanto, um método de remoção e purificação eficaz do pericarpo é necessário antes da análise molecular.

[0004] Os processos de remoção do pericarpo foram desenvolvidos e usados na técnica para o processamento de alimentos e análise molecular do pericarpo. Alguns métodos de remoção do pericarpo envolvem a imersão dos grãos de milho em uma solução química (por exemplo, hidróxido de sódio (NaOH) e/ou peróxido de hidrogênio (H2O2)) durante um período de tempo relativamente longo (por exemplo, horas). Tal imersão química demonstrou que enfraquece substancialmente o pericarpo de modo que um método automatizado de separação pode ser usado para separar o pericarpo solto do endosperma. Os métodos permitem que bateladas de um número substancial de grãos sejam processadas. Entretanto, esses processos necessitam de produtos químicos, bem como os custos e manuseio associados a eles. O que é mais importante, os produtos químicos usados combinados com a quantidade significativa de tempo de imersão podem danificar ou, de outro modo, afetar o DNA no pericarpo.

[0005] Para evitar danos ao DNA durante a separação do pericarpo do restante do grão para análise molecular, as metodologias convencionais atuais não incluem maceração química. Em vez disso, os métodos atuais envolvem a tentativa de soltar o pericarpo por imersão dos grãos em água destilada de um dia para o outro em vez de produtos químicos. Após tal imersão, o pericarpo é manualmente cortado ou removido. A imersão em água não é tão eficaz quanto os produtos químicos para soltar o pericarpo.

[0006] Para identificar precisamente a linhagem parental, uma alta produção de DNA é necessária para a análise molecular, como análise genética de todo o genoma. Para se obter DNA suficiente para uma amostra usando-se os métodos da técnica anterior, várias sementes (geralmente da ordem de 10 a 100 ou mais) foram necessárias. A remoção manual do pericarpo de um número suficiente de sementes individuais pode tomar uma, duas ou mais horas de uma pessoa. Além disso, tem sido difícil, senão impossível, remover completamente todo o tecido interno da semente, como o tecido endospérmico, do pericarpo com o método de imersão em água, o que torna difícil obter o nível de pureza necessário ou desejado para uma análise molecular precisa. Além disso, o DNA obtido de várias sementes, particularmente de sementes comerciais, traz um possível risco de contaminação devido à misturação da fonte de sementes. Para evitar essa contaminação e reduzir a força de trabalho, utilizar uma única semente para uma amostra seria desejável para fins de análise molecular.

[0007] Há uma necessidade de melhoria na técnica de remoção de pericarpo, purificação de tecido e coleta de DNA para a análise molecular precisa do tecido do pericarpo. Além disso, há uma necessidade de que a amostra de tecido de pericarpo compreenda o tecido de um conjunto menor de sementes, ou mesmo de uma única semente.

Sumário da invenção

[0008] Neste pedido, o pericarpo pode ser isolado, de modo que fique livre de outros tecidos de sementes, por exemplo, tecidos de endosperma e embrião, para se obter DNA materno puro. A análise da linhagem parental pode ser derivada do genótipo materno em associação com o genótipo da semente/embrião.

[0009] Uma modalidade da invenção permite a determinação da linhagem materna de uma ou mais sementes, coletando o tecido da semente materna a partir de uma ou mais sementes; lavagem do tecido da semente materna; dissociação e homogenização do tecido da semente materna para se obter uma solução homogenizada; centrifugação da solução homogenizada para obter um sobrenadante; e execução de uma análise molecular usando DNA do sobrenadante. Em uma modalidade, o tecido da semente materna é o pericarpo. A etapa de lavagem pode ser feita com solução com 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos. A etapa de lavagem é, de preferência, realizada com uma solução aquosa com cerca de 1% de dodecil sulfato de sódio. A dissociação e homogeneização do tecido do pericarpo pode ser feita usando-se um dissociador de células (como o gentleMACS™, da Miltenyi Biotec). O método pode ainda compreender o uso de amplificação do genoma total antes da análise molecular para se obter uma quantidade de DNA suficiente.

[0010] Outra modalidade da invenção permite a determinação da linhagem materna de uma ou mais sementes coletando-se o tecido da semente materna a partir de uma ou mais sementes; lavagem do tecido da semente materna; dissociação e homogenização do tecido da semente materna para se obter uma solução homogenizada; extração do DNA de células contidas na solução homogenizada; e execução de uma análise molecular do DNA extraído. Em uma modalidade, o tecido da semente materna é o pericarpo. A etapa de lavagem pode ser feita com solução com 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos. A etapa de lavagem é, de preferência, realizada com uma solução aquosa com cerca de 1% de dodecil sulfato de sódio. A etapa de dissociação e homogenização pode ser executada usando um dissociador de células (como gentleMACS™, Miltenyi Biotec). A etapa de extração pode ser executada por meio de partículas magnéticas que se ligam ao DNA ou Extract- N-Amp™. O método pode ainda compreender o uso de amplificação do genoma total antes da análise molecular para se obter uma quantidade de DNA suficiente.

[0011] Uma outra modalidade da invenção permite a determinação da linhagem materna de uma ou mais sementes coletando-se o tecido da semente materna a partir de uma ou mais partículas sementes; lavagem do tecido da semente materna; ruptura do tecido da semente materna em nitrogênio líquido; extração do DNA do tecido da semente materna rompido; e execução de uma análise molecular do DNA extraído. Em uma modalidade, o tecido da semente materna é o pericarpo. A etapa de lavagem pode ser feita com solução com 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos. A etapa de lavagem é, de preferência, realizada com uma solução aquosa com cerca de 1% de dodecil sulfato de sódio. A etapa de extração pode ser executada por meio de partículas magnéticas que se ligam ao DNA ou Extract-N-Amp™. O método pode ainda compreender o uso de amplificação do genoma total antes da análise molecular para se obter uma quantidade de DNA suficiente.

[0012] Uma outra modalidade da invenção permite a determinação da linhagem materna de uma ou mais sementes coletando-se o tecido da semente materna a partir de uma ou mais partículas sementes; lavagem do tecido da semente materna; extração do DNA diretamente do tecido da semente materna lavado; e execução de uma análise molecular do DNA extraído. Em uma modalidade, o tecido da semente materna é o pericarpo. A etapa de lavagem pode ser feita com solução com 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos. A etapa de lavagem é, de preferência, feita com uma solução aquosa de cerca de 1% dodecil sulfato de sódio. A etapa de extração pode ser feita com o uso de Extract-n-Amp™. O método pode ainda compreender o uso de amplificação do genoma total antes da análise molecular para se obter uma quantidade de DNA suficiente.

[0013] Em qualquer das modalidades mencionadas acima, a análise molecular pode ser genotipagem. Quando o tecido da semente materna de mais de uma réplica de semente é coletado, um genótipo de consenso pode ser obtido.

Breve descrição dos desenhos

[0014] A Figura 1 representa as etapas envolvidas no desprendimento do tecido do pericarpo.

[0015] A Figura 2 compara o ensaio de genotipagem ILLUMINA® GOLDENGATE® usando DNA obtido a partir de a) o método de extração de DNA com CTAB convencional com o uso de múltiplas sementes e b) o método de extração de DNA SBEADEX® com o uso de uma semente (com lavagem de tecido) seguido da amplificação do genoma total.

[0016] A Figura 3 demonstra que dados de marcador fluorescente de qualidade podem ser obtidos a partir de um único pericarpo.

[0017] A Figura 4 demonstra o alto grau de similaridade entre o genótipo medido do tecido do pericarpo extraído de uma única semente (cada linhagem) e o genótipo materno conhecido.

Descrição detalhada das modalidades preferenciais

[0018] Uma peça do revestimento externo de um grão de milho, o pericarpo, pode ser removida, de modo a conduzir uma análise molecular da planta parental. Nessa modalidade, os grãos podem ser imersos em água antes que sejam feitos cortes no pericarpo. A parte posterior do grão (mais distante do embrião) pode ser cortada com uma lâmina afiada, conforme mostrado na Figura 1a. De preferência, a lâmina é esterilizada após o primeiro corte antes que a borda externa do grão possa ser cortada com a lâmina afiada, tendo início a partir de uma extremidade do primeiro corte, ao redor da borda do grão e para baixo até a outra extremidade do primeiro corte, conforme mostrado na Figura 1b. Um fórceps esterilizado pode ser usado para desprender o tecido do pericarpo do grão, conforme mostrado na Figura 1c. Embora o corte possa ser feito no lado frontal do grão (mais próximo ao embrião), o corte é, de preferência, feito na parte posterior, para reduzir a possibilidade de que o pericarpo seja contaminado com o tecido do endosperma. Para reduzir ainda mais a possibilidade de contaminação, o tecido do pericarpo pode ser lavado após ser excisado. O pericarpo pode ser colocado na cavidade de um recipiente e a semente a partir da qual o pericarpo foi removido (ou embrião dessa semente) pode ser colocada em uma cavidade correspondente de um recipiente separado. Como será compreendido pelos versados na técnica, há outros métodos comparáveis para isolar o tecido do pericarpo, e, em algumas modalidades da invenção, o DNA do pericarpo pode ser extraído sem remoção do pericarpo.

[0019] O tecido a ser analisado pode ser associado ou correlacionado à sua fonte vegetal viável correspondente, de modo que a fonte vegetal viável correspondente possa ser selecionada com base nos resultados da análise de tecidos. Em algumas modalidades, particularmente, onde o tecido a ser analisado é o pericarpo para os propósitos de determinação da linhagem materna, não é necessária uma fonte vegetal viável correspondente.

Obtenção do material genético para caracterização molecular

[0020] Em uma modalidade, o tecido do pericarpo é coletado e lavado; o tecido é dissociado e homogenizado com o uso do gentleMACS™ obtido junto à Miltenyi Biotec (ou qualquer outro método conhecido pelo versado na técnica para a mesma finalidade); e a solução homogenizada é centrifugada. Descobriu-se que o sobrenadante resultante continha a maior parte do DNA, em comparação com o pélete, e, desse modo, o DNA pode ser usado diretamente na análise molecular ou para executar a amplificação do genoma total seguido por análise molecular.

[0021] Em uma outra modalidade, o tecido do pericarpo é coletado e lavado; o tecido é dissociado e homogenizado com o uso do gentleMACS™ obtido junto à Miltenyi Biotec (ou qualquer outro método conhecido pelo versado na técnica para a mesma finalidade); O DNA é extraído de células contidas na solução homogenizada com o uso de métodos de extração de DNA (como, mas não se limitando, aos métodos SBEADEX® ou Extract-N-Amp™); e o DNA pode ser usado diretamente na análise molecular ou para executar a amplificação do genoma total seguido por análise molecular.

[0022] Em uma outra modalidade, o tecido do pericarpo é coletado e lavado; o tecido é rompido em nitrogênio líquido; O DNA é extraído com o uso de métodos de extração de DNA (como, mas não se limitando, aos métodos SBEADEX® ou Extract-N-Amp™); e o DNA pode ser usado diretamente na análise molecular ou para executar a amplificação do genoma total seguido por análise molecular.

[0023] Em uma outra modalidade, o tecido do pericarpo é coletado e lavado; O DNA é extraído diretamente do tecido lavado com o uso do método Extract-N-Amp™ (ou qualquer outro método conhecido pelo versado na técnica para a mesma finalidade); e o DNA pode ser usado diretamente na análise molecular ou para executar a amplificação do genoma total seguido por análise molecular.

[0024] A lavagem do tecido do pericarpo reduz a possível contaminação do tecido endospérmico. Em qualquer uma das modalidades acima, a lavagem pode ser feita com solução aquosa de 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos.

[0025] Em qualquer uma das modalidades acima, qualquer método de extração de DNA conhecido pelos versados na técnica pode ser usado. Por exemplo, conforme afirmado anteriormente, os métodos SBEADEX® (partículas magnéticas que se ligam ao material genético, que são disponíveis junto à LGC Genomics) ou Extract-N-Amp™ podem ser usados. Em outro exemplo, o material genético pode ser extraído de tecidos com o uso de um método de extração de DNA enzimático, disponível junto à Sigma-Aldrich Enzymatic chamado de Viscozyme L (ver o catálogo de produtos da Sigma Aldrich).

Caracterização molecular do material genético do pericarpo

[0026] A amplificação do genoma total é um método robusto de amplificação de um genoma total, a partir de quantidades de nanogramas de DNA e resultando em quantidades de microgramas dos produtos amplificados. A amplificação do genoma total se tornou um método valioso para a preservação de amostras limitadas de material de estoque precioso, particularmente, ao usar métodos de amplificação de genoma total que foram desenvolvidos para amplificar material a partir de uma única célula. Em algumas modalidades aqui descritas, a amplificação do genoma total pode ser feita antes da análise molecular para obter quantidades suficientes de DNA.

[0027] Qualquer método conhecido pelo versado na técnica pode ser usado para a caracterização molecular do material genético a partir do pericarpo. Exemplos incluem, mas não se limitam, aos kits da REPLI-g da Qiagen e SeqPlex da Sigma-Aldrich.

[0028] Outras caracterizações moleculares úteis podem envolver o sequenciamento de todo ou parte do genoma do pericarpo extraído da semente, ou com o uso de marcadores moleculares e sondas fluorescentes para o genótipo. A análise molecular não precisa se concentrar no genótipo do tecido extraído, mas pode, em vez disso, medir outras propriedades como: o perfil epigenômico, o perfil proteômico, o perfil metabólico, teor de óleo, composição do óleo ou a presença ou ausência de moléculas específicas no tecido.

[0029] Em uma modalidade, um genótipo de consenso pode ser derivado para a linhagem materna levando em consideração os dados genotípicos do tecido do pericarpo a partir de múltiplas sementes (ou múltiplas extrações de tecido da mesma semente ou sementes), sendo cada amostra de tecido uma réplica. Em um experimento de genotipagem que identifica múltiplos nucleotídeos nas múltiplas posições em um genoma, não é incomum que um experimento específico falhe na identificação de um ou mais dos nucleotídeos a serem identificados. Dessa forma, identificações perdidas ou falsas de nucleotídeos para cada posição podem ser observadas em cada uma das amostras. Se a identificação de nucleotídeo de apenas uma amostra estiver disponível para uma posição de nucleotídeo específica, então, essa identificação de nucleotídeo é designada como um dado de consenso para essa posição. Se duas ou mais identificações de nucleotídeos estiverem disponíveis para uma posição de nucleotídeo específica, então, a maioria das identificações de nucleotídeos para essa posição é designada como um dado de consenso dessa posição. Se não houver uma identificação da maioria para uma posição, essa posição é designada como dado faltante do genótipo de consenso.

[0030] Embora os exemplos aqui fornecidos se refiram à obtenção e genotipagem de tecidos de pericarpo de uma monocotiledônea, especificamente de milho, os elementos versados na técnica entenderiam como aplicar os mesmos métodos, ou similares, ao tecido da semente materna de outras monocotiledôneas e dicotiledôneas. Os métodos podem ser adaptados a qualquer planta cuja semente inclui o tecido materno. Por exemplo, a planta pode incluir, mas não se limita, ao milho, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada, painço, cana-de-açúcar ou gramíneas. Adicionalmente, os métodos de genotipagem apresentados na presente invenção podem ser usados para a genotipagem de qualquer tecido vegetal. Os métodos de genotipagem de consenso podem também ser usados para gerar um genótipo de consenso para múltiplas amostras de qualquer material genético obtido a partir de qualquer fonte, sem que se afaste das etapas reveladas.

Exemplo: Genotipagem do pericarpo A. Desprendimento do pericarpo

[0031] Grãos de milho foram imersos durante 60 minutos em água deionizada. Uma lâmina de bisturi foi esterilizada com o uso de um esterilizador com microesferas. O bisturi foi usado para cortar o lado posterior das sementes (na direção contrária ao embrião) próximo às pontas, conforme mostrado na Figura 1a. O bisturi foi novamente esterilizado com o uso de um esterilizador com microesferas e resfriado em água estéril. O bisturi foi, então, usado para cortar ao longo da borda externa do grão, conforme mostrado na Figura 1b. O fórceps foi esterilizado em um esterilizador com microesferas e, então, usado para desprender o pericarpo do grão, conforme mostrado na Figura 1c. O tecido do pericarpo de cada grão foi, então, colocado em tubos de microcentrífuga.

B. Lavagem do pericarpo

[0032] Três soluções diferentes foram testadas. Os melhores resultados foram obtidos com 1% de solução de dodecil sulfato de sódio (SDS), embora resultados adequados foram alcançáveis com o uso de água e etanol. Um método de lavagem alternativo com o uso de ultrassom também forneceu resultados adequados. O protocolo de lavagem usado começou com a adição de 1 ml de solução de lavagem aos tubos de microcentrífuga, que foram colocados em um inversor durante 1 minuto. A solução de lavagem foi removida e substituída por 1 ml de solução de lavagem fresca, então, os tubos para microcentrífuga foram novamente colocados em um inversor, desta vez, durante 4 minutos. O tecido do pericarpo foi, então, removido, enxaguado com água destilada e colocado em um novo tubo para microcentrífuga. O protocolo de sonicação colocou o tecido do pericarpo em um ultrassom durante 1 minuto. O tecido foi, então, removido, enxaguado com água destilada e colocado em um novo tubo para microcentrífuga.

C. Obtenção de DNA

[0033] Cinco métodos de obtenção de DNA foram testados. Os melhores resultados foram obtidos com o protocolo gentleMACS™ com sobrenadante em água ou TE.

[0034] gentleMACS™/sobrenadante em água ou TE: Nesse método, o tecido do pericarpo foi colocado diretamente no rotor de um tubo de gentleMACS™ M. 300 ul de água ou tampão TE foram adicionados ao tubo, que foi então fechado e colocado em uma máquina gentleMACS™. O programa automatizado “Protein_01,01” foi executado. Para os tecidos de pericarpo que não foram completamente dissociados, foi realizada a misturação e execução adicional do programa automatizado. Em seguida, as misturas foram centrifugadas no tubo de GentleMACS™ e transferidas para um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml. O tubo Eppendorf foi então centrifugado a 14.000 rpm durante 2 minutos, e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml para análise molecular. Nenhuma extração do DNA foi necessária nesse método.

[0035] GentleMACS™ / SBEADEX® Nesse método, o tecido do pericarpo foi colocado diretamente no rotor de um tubo M de gentleMACS™. 300 μl de tampão de lise PN SBEADEX® foram adicionados ao tubo, que foi então fechado e colocado em uma máquina gentleMACS™. O programa automatizado “Protein_01,01” foi executado. Para os tecidos de pericarpo que não foram completamente dissociados, foi realizada a misturação e execução adicional do programa automatizado. Em seguida, as misturas foram centrifugadas e incubadas a 65°C durante 1 hora com agitação ocasional. 360 μl de tampão de ligação PN e 30 μl de partículas SBEADEX® foram adicionados a novos tubos Eppendorf de 1,5 ml. Os tubos com o tecido do pericarpo foram centrifugados e o lisado foi transferido para novos tubos. Esses tubos foram então incubados em temperatura ambiente durante 4 minutos, para permitir que o DNA se ligasse às partículas SBEADEX®. Os tubos foram, então, submetidos ao vórtice e, depois, colocados em um suporte magnético para concentrar as microesferas. O tampão de lise foi removido e 600 μl de tampão de lavagem PN1 foram adicionados a cada tubo e as microesferas foram ressuspensas. Os tubos foram colocados em um suporte magnético novamente para concentrar as esferas, e o tampão de lavagem PN1 foi removido. Esse procedimento de lavagem foi repetido com 600 μl de tampão de lavagem PN2 e, então, novamente repetido com 600 μl de água pura. Após essa terceira etapa de lavagem, 40 μl de tampão de eluição PN foram adicionados e os tubos foram incubados a 55°C durante 20 minutos e submetidos a vórtice a cada 3 minutos. Uma placa magnética foi usada para concentrar as microesferas, e o eluato foi transferido para novos tubos e armazenado até a -20°C até a caracterização molecular.

[0036] gentleMACS™/Extract-N-Amp™: Neste método, o tecido do pericarpo foi novamente colocado diretamente sobre o rotor de um tubo M gentleMACS™. 300 μl de água esterilizada foram adicionados ao tubo, que foi então fechado e colocado em uma máquina gentleMACS™. O programa automatizado “Protein_01,01” foi executado. Para os tecidos de pericarpo que não foram completamente dissociados, foi realizada a misturação e execução adicional do programa automatizado. O homogenizado foi transferido para um tubo de 1,5 ml de microcentrífuga e centrifugado a 10,000 rpm durante 1 minuto. O sobrenadante foi removido sem que o pélete do tecido no fundo do tubo fosse tocado. 30 μl de solução de extração/solução de preparação de sementes (kit de PCR de sementes Extract-N-Amp™) foram adicionados e a mistura resultante foi completamente misturada. A mistura foi transferida para tubos de PCR em fileira para uso no termociclador, que foi programado para se manter a 55°C durante 10 minutos, depois, a 95°C durante 3 minutos e, então, para se manter indefinidamente a 4°C. 30 μl de solução B de neutralização foram adicionados.

[0037] Nitrogênio líquido/ SBEADEX®: Maceradores para de tubo de microtubos de 1,5 ml foram colocados em nitrogênio líquido para resfriar. O tecido do pericarpo foi colocado em tubos de microcentrífuga juntamente com os maceradores resfriados e o tubo inteiro foi colocado em nitrogênio líquido. Nitrogênio líquido foi adicionado aos tubos. O tecido do pericarpo foi lentamente e cuidadosamente triturado com o uso do macerador. Os tubos foram ocasionalmente imersos novamente em nitrogênio líquido para manter o tecido frio. Após a trituração, 90 μl de tampão de lise PN foram adicionados a cada tubo, que foram rapidamente brevemente centrifugados e depois incubados a 65°C durante 1 hora. 120 μl de tampão de ligação PN e 10 μl de partículas de SBEADEX® foram adicionadas a novos tubos, e o lisado da etapa de trituração foi adicionado a tubos novos. Esses tubos foram então incubados à temperatura ambiente durante 4 minutos, para permitir que o DNA se ligasse às partículas SBEADEX®. As misturas foram brevemente submetidas ao vórtice e colocadas em um suporte magnético para concentrar as microesferas. O tampão de lise foi removido e 200 μl de tampão de lavagem PN1 foram adicionados a cada tubo e as esferas de vidro foram ressuspensas. Os tubos foram colocados em um suporte magnético novamente para concentrar as esferas, e o tampão de lavagem PN1 foi removido. Esse procedimento de lavagem foi repetido com 200 μl de tampão de lavagem PN2 e, então, novamente repetido com 200 μl de água pura. Após essa terceira etapa de lavagem, 20 μl de tampão de eluição PN foram adicionados e os tubos foram incubados a 55°C durante 10 minutos, e submetidos ao vórtice a cada 3 minutos. Uma placa magnética foi usada para concentrar as esferas de vidro, e o eluato foi transferido para novos tubos e armazenados até a -20°C até a caracterização molecular.

[0038] Extract-N-Amp™: Uma mistura mestre de 18 partes de solução de extração e 2 partes de solução de preparação de sementes foi preparada, e 20 μl da solução foram adicionados ao tecido do pericarpo em tubos de PCR em fileira de 0,2 ml. As misturas foram colocadas em um termociclador configurado a 55°C durante 10 minutos, a 95°C durante 3 minutos e, então, a 4°C indefinidamente. 20,0 μl de solução de neutralização B foram adicionados e a porção líquida da mistura foi transferida para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.

D. Teste molecular

[0039] KIT DE ENSAIO HS DE DSDNA QUBIT®: O reagente QUBIT® foi diluído em tampão QUBIT® em uma razão de 1:200 para fazer uma solução de trabalho. 1 μl dos produtos de PCR da etapa 2B foi transferido para tubos de ensaio QUBIT® de 0,5 ml e 199 μl da solução de trabalho. Os padrões foram produzidos pela adição de 10 a 190 μl de solução de trabalho QUBIT®. Os produtos de PCR e os padrões foram submetidos a vórtice durante 2 a 3 segundos e, em seguida, eles foram rapidamente centrifugados. Os tubos foram, então, incubados à temperatura ambiente durante 2 minutos. Os tubos foram, então, inseridos em um fluorímetro QUBIT® 2.0 e as leituras foram registradas.

[0040] Amplificação de genoma total (Seqplex): O método preferencial para amplificação de genoma total é o método Seqplex que utiliza o kit de amplificação de DNA melhorado Seqplex. Para 1 μl de cada solução de DNA gerada na etapa C foram adicionados 2 μl de tampão de preparação de biblioteca e 11 μl de água pura. A solução foi centrifugada, submetida ao vórtice e centrifugada novamente, incubada em um termociclador a 95°C durante 2 minutos e, em seguida, mantida a 4°C. Após o resfriamento 1 μl de enzima de preparação de biblioteca foi adicionado. A solução foi centrifugada, submetida ao vórtice e centrifugada novamente e, então, incubada em um termociclador a 16°C durante 20 minutos, a 24°C durante 20 minutos, a 37°C durante 20 minutos, a 75°C durante 5 minutos e, em seguida, mantida a 4°C. A solução foi brevemente centrifugada. 15 μl dessa solução foram adicionados à 15 μl de 5x de mistura de amplificação (A5112), 1,5 μl de DNA polimerase para SeqPlex (SP300), 42,5 μl de água esterilizada (W4502) e 1 μl de SYBR Green (S9403), diluído a 1:1000. Essa solução foi misturada completamente, e cada mistura reacional foi dividida em cinco alíquotas de 15 μl em uma placa de 384 poços. O termociclo de amplificação começou com uma desnaturação inicial a 94°C durante 2 minutos, seguida de um número suficiente de ciclos para alcançar o platô em 2 a 3 ciclos (tipicamente cerca de 24 ciclos): desnaturação a 94°C durante 15 segundos, 70°C para hibridização/extensão durante 5 minutos, leitura da fluorescência e repetição. Após a ciclagem, a mistura de reação foi mantida a 70°C durante 30 minutos, então mantida a 4°C. Após o resfriamento, as amostras foram purificadas por purificação de PCR QIAquick.

[0041] Amplificação de genoma total (kit de célula única REPLI- g): O tampão de desnaturação D1 foi preparado pela adição de 3,5 μL de tampão de reconstituição DLB 12,5 de água livre de nuclease. O tampão de neutralização N1 foi preparado através da adição de 4,5 μl de solução de bloqueio e 25,5 μl de água livre de nuclease. 2,5 μl do tampão de desnaturação foram adicionados a cada alíquota de 2,5 μl da solução de DNA preparada na etapa C. Essa solução foi incubada à temperatura ambiente durante 3 minutos. 5,0 μl do tampão de neutralização N1 foram adicionados, e a solução foi submetida ao vórtice e, em seguida, centrifugada brevemente. A mistura mestre foi preparada com 9,0 de água livre de nuclease, 29,0 μl de tampão de reação REPLI-g e de 2,0 μl de DNA polimerase REPLI-g por reação. 40,0 μl dessa mistura mestre foram adicionados à cada solução, que é, então, realizada em um termociclador a 30°C durante 8 horas, depois resfriada a 4°C.

[0042] Os produtos de amplificação de genoma total foram avaliados com o uso do ensaio QUBIT® para determinar a quantidade de DNA.

[0043] Testes de genotipagem. Ambas as análises de marcadores de alta densidade (o chip 3072X ILLUMINA®) e do marcador Taqman foram usadas com êxito para genotipar os materiais genéticos descritos neste exemplo. Os dados demonstrando a eficácia das técnicas anteriormente mencionadas são apresentados nas Figuras 2 a 4. A Figura 2 compara a qualidade dos dados obtidos usando métodos de extração de DNA em relação àqueles obtidos com o uso de amplificação do genoma total. Enquanto ambos os métodos proporcionam resultados aceitáveis, o método de amplificação do genoma total fornece, de preferência, resultados, com cada um dos três haplótipos bem resolvidos. A Figura 3 é um gráfico de dispersão de marcador fluorescente que demonstra que dados do marcador fluorescente de qualidade podem ser obtidos a partir de uma única amostra de tecido do pericarpo. De fato, os métodos da invenção permitem a genotipagem com o uso de muitos marcadores, dezenas ou, potencialmente, centenas, com o uso de um tecido de pericarpo extraído a partir de uma única semente. A Figura 4 demonstra a confiabilidade dos métodos da invenção, devido ao alto grau de similaridade entre o genótipo do tecido medido do tecido do pericarpo extraído de uma única semente extraída (cada linhagem) e o genótipo materno conhecido.

Claims

1. Método para a determinação da linhagem materna de uma ou mais sementes únicas de milho CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) imersão das uma ou mais sementes únicas de milho em água; (b) coleta de tecido do pericarpo das uma ou mais sementes únicas de milho; (c) lavagem do tecido do pericarpo; (d) dissociação e homogeneização do tecido do pericarpo em água ou em tampão Tris-EDTA usando um dissociador de células para obter uma solução homogeneizada; (e) centrifugação da solução homogeneizada obtida na etapa (d) para obter o sobrenadante; e (f) execução de uma análise molecular no material genético no sobrenadante.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de lavagem é executada com solução aquosa de 1% de dodecil sulfato de sódio, água, etanol ou misturas dos mesmos.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de lavagem é realizada com solução aquosa de 1% de dodecil sulfato de sódio.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que amplificação do genoma total é realizada antes de realizar a análise molecular.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a análise molecular é a genotipagem.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que, quando o tecido do pericarpo de mais de uma semente única de milho é coletado, um genótipo de consenso é obtido.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionalmente genotipar a uma ou mais sementes únicas de milho e comparar o genótipo do tecido do pericarpo e o genótipo das uma ou mais sementes únicas de milho para determinar a linhagem paterna.