CN106687603A - 用于果皮基因分型的体系和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括用于从种子获得母本组织样品，从母本种子组织获得遗传物质，并且对来自母本种子组织的遗传物质进行分子分析以确定单个种子的母本谱系的方法。本发明还包括用于从得自多个种子的母本种子组织建立共有母本基因型的方法以及用于确定父本谱系的方法。

Description

用于果皮基因分型的体系和方法
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2014年8月29日提交的美国国家专利申请14/473,074的权益，所述文献全文以引用方式并入本文。
背景技术
种子是包封在称为种皮的保护性外壳中的胚胎植物。在单子叶植物中，种皮与果皮融合，所述果皮由多层细胞组成，并且仅包含来自母体亲本的遗传密码。因此，果皮组织可用于鉴定种子的母本谱系。父本谱系可进一步衍生自与种子(胚或胚乳)基因型组合的果皮基因型，其包含来自母本和父本背景的遗传信息。确定谱系对于确保专有亲本谱系保持专有性的种质安全性是重要的。
组织或其它粘附结构将果皮连接到主要为胚乳组织的种子内部部分。与大多数种子的相对较小尺寸相结合，这可使得果皮的分离和收集困难，或者至少耗时和费力。被携带母本和父本遗传信息的内部种子组织(例如胚乳)污染的不纯果皮组织的分子分析导致母本谱系的遗传鉴定不确定。因此，在分子分析之前需要有效的果皮去除和纯化方法。
已开发出果皮去除方法，并且在本领域中用于食品加工和果皮分子分析。一些果皮去除方法涉及将玉米谷粒在化学溶液(例如氢氧化钠(NaOH)和/或过氧化氢(H2O2))中浸泡相对较长时间(例如几小时)。已经发现，此类化学浸泡使果皮基本上松散，使得可使用自动分离方法将松散的果皮与胚乳分离。所述方法允许处理大批相当数量的谷粒。然而，此类方法需要化学品，以及与它们相关的成本和处理。最重要的是，所用的化学品与大量浸泡时间相结合，可损害或以其它方式影响果皮中的DNA。
为了从谷粒其余部分分离果皮以用于分子分析时避免损伤DNA，当前的常规方法学已不采用化学浸泡。相反，当前的方法涉及尝试通过在蒸馏水中而不是化学品浸泡谷粒过夜，而使果皮松散。此类浸泡后，手工切割或摘下果皮。水浸泡在使果皮松散方面不如化学品有效。
为了准确鉴定亲本谱系，需要高收率的DNA用于分子分析，诸如全基因组遗传分析。为了使用现有技术方法获得一个样品的足够DNA，需要多个种子(通常约10至100左右)。从足量单个种子手动除去果皮，可能需要一、二或更多个人工小时。此外，如果不是不可能，用水浸泡方法从果皮中完全除去所有内部种子组织如胚乳组织是困难的，这使得难以达到精确分子分析所需或所期望的纯度水平。此外，来自多个种子(特别是来自商业种子)的混合DNA由于种子源的混合而带来潜在的污染风险。为了避免此类污染并且减少劳动力，期望一个样品使用单个种子以供分子分析。
为了对果皮组织进行精确的分子分析，需要改进果皮去除、组织纯化和DNA收集领域的技术。此外，需要果皮组织样品包含来自较小种子组或甚至单个种子的组织。
发明内容
在本专利申请中，可分离果皮使得其不含其它种子组织，例如胚乳和胚芽组织，以获得纯的母本DNA。父本谱系分析可源自母本基因型与种子/胚芽基因型的组合。
本发明的一个实施方案允许通过从一个或多个种子收集母本种子组织来确定一个或多个种子的母本谱系；洗涤母本种子组织；解离并且均化母本种子组织以获得匀化溶液；离心所述匀化的溶液以获得上清液；以及使用上清液DNA进行分子分析。在一个实施方案中，母本种子组织是果皮。洗涤步骤可用1％十二烷基硫酸钠溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。洗涤步骤优选用约1％十二烷基硫酸钠的水溶液进行。可使用细胞解离器(诸如gentleMACSTM，Miltenyi Biotec)进行果皮组织的解离和匀化。所述方法还可包括在分子分析之前使用全基因组扩增以获得足够的DNA收率。
本发明的另一个实施方案允许通过从一个或多个种子收集母本种子组织来确定一个或多个种子的母本谱系；洗涤母本种子组织；解离并且均化母本种子组织以获得匀化溶液；从匀化溶液中包含的细胞提取DNA；以及对所提取的DNA进行分子分析。在一个实施方案中，母本种子组织是果皮。洗涤步骤可用1％十二烷基硫酸钠溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。洗涤步骤优选用约1％十二烷基硫酸钠的水溶液进行。解离和匀化步骤可使用细胞解离器(诸如gentleMACSTM，Miltenyi Biotec)进行。提取步骤可使用DNA结合磁性颗粒或Extract-N-AmpTM进行。所述方法还可包括在分子分析之前使用全基因组扩增以获得足够的DNA收率。
本发明的另一个实施方案允许通过从一个或多个种子收集母本种子组织来确定一个或多个种子的母本谱系；洗涤母本种子组织；在液氮中破坏母本种子组织；从被破坏的母本种子组织中提取DNA；以及对所提取的DNA进行分子分析。在一个实施方案中，母本种子组织是果皮。洗涤步骤可用1％十二烷基硫酸钠溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。洗涤步骤优选用约1％十二烷基硫酸钠的水溶液进行。提取步骤可使用DNA结合磁性颗粒或Extract-N-AmpTM进行。所述方法还可包括在分子分析之前使用全基因组扩增以获得足够的DNA收率。
本发明的另一个实施方案允许通过从一个或多个种子收集母本种子组织来确定一个或多个种子的母本谱系；洗涤母本种子组织；直接从洗涤过的母本种子组织中提取DNA；以及对所提取的DNA进行分子分析。在一个实施方案中，母本种子组织是果皮。洗涤步骤可用1％十二烷基硫酸钠溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。洗涤步骤优选用约1％十二烷基硫酸钠的水溶液进行。提取步骤可使用Extract-N-AmpTM进行。所述方法还可包括在分子分析之前使用全基因组扩增以获得足够的DNA收率。
在上述任何实施方案中，分子分析可以是基因分型的。当收集来自多于一个种子复制的母本种子组织时，可获得共有基因型。
附图说明
图1描述了涉及果皮组织剥离的步骤。
图2比较了使用DNA的基因分型测定，所述DNA得自a)使用多个种子的常规CTAB DNA提取方法，和b)使用一个种子(组织洗涤)的DNA提取方法，随后进行全基因组扩增。
图3展示了可从单个果皮获得的优质荧光标记数据。
图4展示了从单个种子(每条线)提取的果皮组织的测量基因型和已知母本基因型之间的高度相似性。
具体实施方式
可切下玉米谷粒的一片外皮，即果皮，以进行亲本植物的分子分析。在该实施方案中，可在切割果皮之前将谷粒浸泡在水中。可用锋利的刀片切割谷粒的背面(离胚芽最远)，如图1a中所示。优选地，在第一切割之后，在谷粒的外边缘可用锋利的刀片切割之前，将刀片灭菌，从第一切割的一端开始，围绕谷粒的边缘，并且向下至第一切割的另一端，如图1b中所示。可使用灭菌镊子从谷粒中剥离果皮组织，如图1c中所示。虽然可在谷粒的前侧(最靠近胚芽)进行切割，但是切割优选在后侧进行，以减少果皮将被胚乳组织污染的可能性。为了进一步降低污染的可能性，可在切除果皮组织后洗涤所述果皮组织。果皮可以放置在容器的孔中，并且可将切除果皮的种子(或来自该种子的胚芽)放置于单独容器的相应孔中。如本领域普通技术人员将理解的，存在用于分离果皮组织的其它可比较的方法，并且在本发明的一些实施方案中，可在不除去果皮的情况下提取果皮DNA。
待分析的组织可与其相应的活体植物来源相关联或相关，使得可基于组织分析的结果选择相应的活体植物来源。在一些实施方案中，特别是当待分析的组织是用于母本谱系测定目的的果皮时，不需要相应的活体植物来源。
获得用于分子表征的遗传物质
在一个实施方案中，收集并且洗涤果皮组织；使用来自Miltenyi Biotec的gentleMACSTM(或本领域普通技术人员已知的用于相同目的的任何其它方法)，将组织解离和匀化；并且将匀化溶液离心。发现与粒料相比，所得上清液包含大部分DNA，因此，DNA可直接用于分子分析，或进行全基因组扩增，随后进行分子分析。
在另一个实施方案中，收集并且洗涤果皮组织；使用来自Miltenyi Biotec的gentleMACSTM(或本领域普通技术人员已知的用于相同目的的任何其它方法)，将组织解离和匀化；使用DNA提取方法(诸如但不限于或Extract-N-AmpTM方法)，从包含于匀化溶液内的细胞提取DNA；并且所述DNA可直接用于分子分析，或进行全基因组扩增，随后进行分子分析。
在另一个实施方案中，收集并且洗涤果皮组织；在液氮中破坏组织；使用DNA提取方法(诸如但不限于或Extract-N-AmpTM方法)提取DNA；并且所述DNA可直接用于分子分析，或进行全基因组扩增，随后进行分子分析。
在另一个实施方案中，收集并且洗涤果皮组织；使用Extract-N-AmpTM方法(或本领域普通技术人员已知的用于相同目的的任何其它方法)直接从洗涤组织中提取DNA；并且所述DNA可直接用于分子分析，或进行全基因组扩增，随后进行分子分析。
果皮组织的洗涤减少了来自胚乳组织的潜在污染。在上文任何实施方案中，可用1％十二烷基硫酸钠水溶液、水、乙醇或它们的混合物进行洗涤。
在上文任何实施方案中，可使用本领域技术人员已知的任何DNA提取方法。例如，如前所述，可使用(结合遗传物质的磁性颗粒，可从LGC Genomics购得)或Extract-N-AmpTM方法。在另一个示例中，可使用购自Sigma-Aldrich Enzymatic的称为Viscozyme L(参见Sigma Aldrich产品目录)的酶促DNA提取方法，从组织中提取遗传物质。
分子表征来自果皮的遗传物质
全基因组扩增是用于整个基因组的稳健扩增方法，从纳克量的DNA开始，并且产生微克量的扩增产物。全基因组扩增已成为保存珍贵储备材料的有限样品的非常有价值方法，特别是当使用已经开发用于从单个细胞扩增材料的全基因组扩增方法时。在本文所述的一些实施方案中，可在分子分析之前进行全基因组扩增以获得足够的DNA收率。
本领域普通技术人员已知的任何方法可用于分子表征来自果皮的遗传物质。示例包括但不限于Qiagen REPLI-g和Sigma-Aldrich SeqPlex试剂盒。
其它可用的分子表征可涉及将从种子提取的果皮的全部或部分基因组测序，或使用分子标记和荧光探针进行基因分型。分子分析不需要关注所提取组织的基因型，而是可测量其它性质，诸如：表观基因组谱、蛋白质组谱、代谢分布、油含量、油组成、或者在组织中存在或不存在特定分子。
在一个实施方案中，可通过考虑来自多个种子的果皮组织的基因型数据(或来自相同的一个或多个种子的组织的多次提取)，产生母本共有基因型，每个单独的组织样本是平行测定的。在鉴定基因组中跨多个位置的多个核苷酸的基因分型实验中，对于任何具体实验而言，无法识别一个或多个待鉴定的核苷酸并不罕见。因此，可为每个样本记录每个位置的缺失或无效的核苷酸鉴定。如果来自仅一个样本的核苷酸鉴定可用于特定核苷酸位置，则该核苷酸鉴定被指定为该位置的共有数据。如果两个或更多个核苷酸鉴定可用于特定核苷酸位置，则该位置的大多数核苷酸同一性被指定为该位置的共有数据。如果对于位置不存在多数识别，则将该位置指定为共有基因型的缺失数据。
尽管本文提供的示例涉及从单子叶植物(特别是玉米)获得果皮组织并且对其进行基因分型，但是本领域普通技术人员将理解如何将相同或相似的方法应用于来自其它单子叶植物和双子叶植物的母本种子组织。所述方法可适用于其种子包括母本组织的任何植物。例如，植物可包括但不限于玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗、或柳枝稷。此外，本文公开的基因分型方法可用于将任何植物组织进行基因分型。共有基因分型方法也可用于对从任何来源获得的任何遗传物质的多个样品产生共有基因型，而不偏离所公开的步骤。
实施例：果皮基因分型
A.果皮剥离
将玉米谷粒在去离子水中浸泡60分钟。使用小珠灭菌器将手术刀刀片消毒。使用手术刀在尖端附近切割种子的背面(远离胚芽)，如图1a中所示。再次使用小珠灭菌器将手术刀灭菌，并且在无菌水中冷却。然后使用手术刀沿着谷粒的外边缘切割，如图1b中所示。将镊子在小珠灭菌器中灭菌，冷却，然后用于从谷粒剥离果皮，如图1c中所示。然后将来自每个谷粒的果皮组织放置于微量离心管中。
B.果皮洗涤
测试三种不同的洗涤溶液。使用1％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液洗涤获得最佳结果，然而使用水和乙醇可获得足够的结果。使用超声处理的另选的洗涤方法也给出了足够的结果。所用的洗涤方案通过向微量离心管中加入1mL洗涤溶液开始，将其置于反相器中1分钟。除去洗涤溶液，并且用1mL新鲜洗涤溶液替换，然后将微量离心管再次置于反相器中，这次4分钟。然后去除果皮组织，用蒸馏水冲洗，并且置于新的微量离心管中。超声处理方案将果皮组织在超声波破碎仪中放置1分钟。然后取出组织，用蒸馏水冲洗，并且置于新的微量离心管中。
C.获得DNA
测试获得DNA的五种方法。使用gentleMACSTM方案，用水或TE上清液实现最佳结果。
gentleMACSTM/水或TE上清液：在该方法中，将果皮组织直接放置于gentleMACSTMM管的转子上。将300μl水或TE缓冲液加入到管中，然后将其密闭并且置于gentleMACSTM仪器中。运行自动化程序“Protein_01.01”。对于未完全解离的果皮组织，进行进一步混合并且运行自动化程序。接着，使混合物在GentleMACSTM管中旋降，并且转移至新的1.5mlEppendorf管中。然后将Eppendorf管以14000rpm离心2分钟，并且将上清液转移至新的1.5ml Eppendorf管中用于分子分析。在该方法中不需要DNA的提取。
GentleMACSTM 在该方法中，将果皮组织直接放置于gentleMACSTM M管的转子上。向管中加入300μL的裂解缓冲液PN，然后将其密闭并且放置于gentleMACSTM仪器中。运行自动化程序“Protein_01.01”。对于未完全解离的果皮组织，进行进一步混合并且运行自动化程序。接着，将混合物离心，并且在65℃下培养1小时，偶尔搅拌。将360μL粘结缓冲液PN和30μL颗粒加入到新的1.5mL Eppendorf管中。将具有果皮组织的管离心，并且将裂解物转移到新管中。然后将这些在室温下培养4分钟，以使DNA结合到颗粒上。接着将管短暂涡旋，然后放置在磁架中以将小珠浓缩。除去裂解缓冲液，并且向每个管中加入600μL洗涤缓冲液PN1，并且使小珠重新悬浮。将管再次放置在磁架中以浓缩小珠，并且除去洗涤缓冲液PN1。使用600μL洗涤缓冲液PN2重复该洗涤过程，然后使用600μL纯水再次重复。在该第三洗涤步骤后，加入40μL洗脱缓冲液PN，并且将管在55℃下培养20分钟，并且每3分钟涡旋振荡。使用磁性板浓缩小珠，并且将洗脱液转移到新管中，然后在-20℃下储存直至分子表征。
gentleMACSTM/Extract-N-AmpTM：在该方法中，将果皮组织再次直接放置在gentleMACSTMM管的转子上。将300μL无菌水加入到管中，然后将其密闭并且放置于gentleMACSTM仪器中。运行自动化程序“Protein_01.01”。对于未完全解离的果皮组织，进行进一步混合并且运行自动化程序。将匀浆转移至1.5mL微量离心管中，并且在10,000rpm下离心1分钟。除去上清液，而不干扰管底部的组织粒料。加入30μL提取溶液/种子制备溶液混合物(Sigma-Aldrich Extract-N-AmpTMSeed PCR试剂盒)，并且将所得混合物充分混合。将所述混合物转移到用于热循环仪上的PCR条管中，其被程序化设定为在55℃下保持10分钟，然后在95℃下保持3分钟，然后无限期保持在4℃下。加入30μL中和溶液B。
液氮/将1.5mL微量离心管杵放置在液氮中冷却。将果皮组织与冷却的管杵一起放置于微量离心管中，并且将整个管放置于液氮中。将液氮加入到管中。使用管杵将果皮组织缓慢并且充分地研磨。将管偶尔浸回到液氮中，以保持组织冷却。研磨后，向每个管中加入90μL裂解缓冲液PN，然后将其短暂离心，接着在65℃下培养1小时。将120μL粘结缓冲液PN和10μL的颗粒加入到新管中，并且将来自研磨步骤的裂解物加入到新管中。然后将这些在室温下培养4分钟，以使DNA结合到颗粒上。然后将混合物短暂涡旋，并且放置在磁架中以浓缩小珠。除去裂解缓冲液，并且向每个管中加入200μL洗涤缓冲液PN1，并且使小珠重新悬浮。将管再次放置在磁架中以浓缩小珠，并且除去洗涤缓冲液PN1。使用200μL洗涤缓冲液PN2重复该洗涤过程，然后使用200μL纯水再次重复。在该第三洗涤步骤后，加入20μL洗脱缓冲液PN，并且将管在55℃下培养10分钟，并且每3分钟涡旋振荡。使用磁性板浓缩小珠，并且将洗脱液转移到新管中，然后在-20℃下储存直至分子表征。
Extract-N-AmpTM：制备18份提取溶液和2份种子制备溶液的主混合物，并且将20μL溶液加入到0.2mL PCR条管内的果皮组织中。将混合物在设定为55℃的热循环仪中放置10分钟，在95℃下放置3分钟，然后无限期地在4℃下放置。加入20.0μL中和溶液B，并且将混合物的液体部分转移到1.5mL的新微量离心管中。
D.分子测试
dsDNA HS检测试剂盒：将试剂以1∶200的比率稀释到缓冲液中以制备工作溶液。将1μL步骤2B的PCR产物转移至测定管和199μL工作溶液中。通过将10μL标准物加入到190μL的工作溶液中，制备标准物。将PCR产物和标准物涡旋2-3秒，然后短暂离心。然后将管在室温下培养2分钟。然后将管插入2.0荧光计中，并且记录读数。
全基因组扩增(Seqplex)：全基因组扩增的优选方法是使用Seqplex增强DNA扩增试剂盒的Seqplex方法。向1μL的步骤C中产生的每种DNA溶液中，加入2μL文库制备缓冲液和11μL纯水。将溶液离心，涡旋，并且再次离心，在95℃热循环仪上培养2分钟，然后保持在4℃。冷却后，加入1μL文库制备酶。将溶液离心，涡旋并且再次离心，然后在16℃热循环仪上培养20分钟，在24℃下培养20分钟，在37℃下培养20分钟，在75℃下培养5分钟，然后保持在4℃下。将溶液短暂离心。将15μL该溶液加入到以1∶1000稀释的15μL的5x扩增混合物(A5112)、1.5μL用于SeqPlex的DNA聚合酶(SP300)、42.5μL无菌水(W4502)和1μL的SYBRGreen(S9403)中。将该溶液充分混合，并且将每种反应混合物在384孔板上分成5份15μL等分试样。扩增热循环开始于94℃下初始变性2分钟，随后进行足够数目的循环以达到2-3个循环进入平台(通常约24个循环)：94℃下变性15秒，70℃下退火/延伸5分钟，读取荧光，重复。循环后，将反应混合物在70℃下保持30分钟，然后保持在4℃。冷却后，通过QIAquickPCR纯化来纯化样品。
全基因组扩增(REPLI-g单细胞试剂盒)：通过加入3.5μL重构缓冲液DLB和12.5μL无核酸酶的水，制备变性缓冲液D1。通过加入4.5μL终止溶液和25.5μL不含核酸酶的水，制备中和缓冲液N1。将2.5μL变性缓冲液加入到步骤C中制得的各2.5μL的DNA溶液等分试样中。将该溶液在室温下培养3分钟。加入5.0μL中和缓冲液N1，并且涡旋该溶液，然后短暂离心。用每份反应9.0μL无核酸酶的水、29.0μL的REPLI-g反应缓冲液和2.0μL的REPLI-g DNA聚合酶，制备主混合物。将40.0μL该主混合物加入到各溶液中，然后将其在30℃热循环仪上运行8小时，然后冷却至4℃。
使用检测来评估全基因组扩增产物，以确定DNA的收率。
基因分型测定。成功使用高密度标记(3072X芯片)和Taqman标记分析，对本实施例中描述的遗传材料进行基因分型。展示前述技术有效性的数据示于图2-4中。图2比较了使用DNA提取方法获得的数据质量与使用全基因组扩增获得的数据质量。虽然两种方法均给出可接受的结果，但是全基因组扩增方法给出了优选的结果，其中三个单倍型中的每一个均被充分解析。图3是荧光标记散布图，展示可从单个果皮组织样品获得优质荧光标记数据。事实上，本发明的方法允许使用许多标记(数十或潜在的数百种)，使用从单个种子提取的果皮组织进行基因分型。由于从单个种子提取的果皮组织的测量基因型(每条线)和已知母本基因型之间的高度相似性，图4展示了本发明方法的可靠性。

Claims (37)

1.一种用于测定一个或多个种子的母本谱系的方法，所述方法包括：
(a)从所述一个或多个种子收集母本种子组织；
(b)洗涤所述母本种子组织；
(c)解离并且均化所述母本种子组织以获得匀化溶液；
(d)将步骤(c)中获得的所述匀化溶液离心以获得上清液；以及
(e)对所述上清液中的遗传物质进行分子分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述母本种子组织是玉米果皮组织。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤步骤使用1％十二烷基硫酸钠水溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤步骤使用1％十二烷基硫酸钠水溶液进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(c)使用gentleMACSTM进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其中全基因组扩增在进行所述分子分析之前进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子分析是基因分型。
8.根据权利要求7所述的方法，其中当收集来自多于一个种子的母本种子组织时，获得共有基因型。
9.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括对所述一个或多个种子进行基因分型，并且比较所述母本种子组织的基因型和所述一个或多个种子的基因型，以确定父本谱系。
10.一种用于测定一个或多个种子的母本谱系的方法，所述方法包括：
(a)从所述一个或多个种子收集母本种子组织；
(b)洗涤所述母本种子组织；
(c)解离并且均化所述母本种子组织以获得匀化溶液；
(d)从所述匀化溶液内包含的细胞提取DNA；以及
(e)对所提取的DNA进行分子分析。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述母本种子组织是玉米果皮。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述洗涤步骤使用1％十二烷基硫酸钠水溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述洗涤步骤使用1％十二烷基硫酸钠水溶液进行。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述步骤(c)使用gentleMACSTM进行。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述提取步骤使用DNA结合磁性颗粒或Extract-N-AmpTM进行。
16.根据权利要求10所述的方法，其中全基因组扩增在进行所述分子分析之前进行。
17.根据权利要求10所述的方法，其中所述分子分析是基因分型。
18.根据权利要求17所述的方法，其中当收集来自多于一个种子的母本种子组织时，获得共有基因型。
19.根据权利要求17所述的方法，所述方法还包括对所述一个或多个种子进行基因分型，并且比较所述母本种子组织的基因型和所述一个或多个种子的基因型，以确定父本谱系。
20.一种用于测定一个或多个种子的母本谱系的方法，所述方法包括：
(a)从所述一个或多个种子收集母本种子组织；
(b)洗涤所述母本种子组织；
(c)在液氮中破坏所述母本种子组织；
(d)从所述被破坏的母本种子组织中提取DNA；以及
(e)对所提取的DNA进行分子分析。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述母本种子组织是玉米果皮。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述洗涤步骤使用1％十二烷基硫酸钠水溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述洗涤步骤使用1％十二烷基硫酸钠水溶液进行。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述提取步骤使用DNA结合磁性颗粒或Extract-N-AmpTM进行。
25.根据权利要求20所述的方法，其中全基因组扩增在进行所述分子分析之前进行。
26.根据权利要求20所述的方法，其中所述分子分析是基因分型。
27.根据权利要求26所述的方法，其中当收集来自多于一个种子的果皮组织时，获得共有基因型。
28.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括对所述一个或多个种子进行基因分型，并且比较所述果皮组织的基因型和所述一个或多个种子的基因型，以确定父本谱系。
29.一种用于测定一个或多个种子的母本谱系的方法，所述方法包括：
(a)从所述一个或多个种子收集母本种子组织；
(b)洗涤所述母本种子组织；
(c)直接从所述洗涤过的母本种子组织中提取DNA；以及
(f)对所提取的DNA进行分子分析。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述母本种子组织是玉米果皮组织。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述洗涤步骤使用1％十二烷基硫酸钠水溶液、水、乙醇或它们的混合物进行。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述洗涤步骤使用1％十二烷基硫酸钠水溶液进行。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述提取步骤使用Extract-N-AmpTM进行。
34.根据权利要求29所述的方法，其中全基因组扩增在进行所述分子分析之前进行。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述分子分析是基因分型。
36.根据权利要求35所述的方法，其中当收集来自多于一个种子的母本种子组织时，获得共有基因型。
37.根据权利要求35所述的方法，所述方法还包括对所述一个或多个种子进行基因分型，并且比较所述母本种子组织的基因型和所述一个或多个种子的基因型，以确定父本谱系。
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