ES2367267T3

ES2367267T3 - Ciclopropil-(2,3-dimetilbencil)amida del ácido 7-(4-(2-(2,6-dicloro-4-metilfenoxi)etoxi)fenil)-3,9-diazabiciclo(3.3.1)non-6-eno-6-carboxílico como inhibidor de renina para el tratamiento de la hipertensión.

Info

Publication number: ES2367267T3
Application number: ES06710758T
Authority: ES
Inventors: Olivier Bezencon; Daniel Bur; Walter Fischli; Lubos Remen; Sylvia Richard-Bildstein; Thierry Sifferlen; Thomas Weller
Original assignee: Actelion Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Actelion Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2005-01-28
Filing date: 2006-01-26
Publication date: 2011-10-31
Anticipated expiration: 2026-01-26
Also published as: CA2595986A1; AU2006208992A1; CR9268A; WO2006079988A1; US7915259B2; ZA200705752B; US20080161313A1; CN101107248A; TW200637861A; MA29267B1; KR20080001707A; MX2007009004A; EP1846407B1; IL184885A0; NI200700189A; NO20074303L; RU2007132438A; ATE514697T1; JP2008528478A; JP4111533B1

Abstract

Un compuesto de la formula (I') denominado ciclopropil-(2,3-dimetilbencil)amida de acido (1R, 5S)-7-{4-[2-(2,6- dicloro-4-metilfenoxi)etoxi]fenil}-3,9-diazabiciclo[3.3.1]non-6-eno-6-carboxilico **Fórmula** y sus sales y complejos de solventes.

Description

La invención se refiere a nuevos compuestos de la fórmula (I’). La invención también se refiere a aspectos relacionados que incluyen composiciones farmacéuticas que contienen al menos un compuesto de la fórmula (I’) siendo dicho compuesto útil como inhibidor de renina en eventos cardiovasculares e insuficiencia renal.

En el sistema renina-angiotensina (RAS), la angiotensina II (Ang II) biológicamente activa se genera a través de un mecanismo de dos pasos. La enzima altamente específica renina escinde el angiotensinógeno a angiotensina I (Ang I), que luego es procesado a Ang II a través de una enzima convertidora de angiotensina (ACE), menos específica. Se sabe que Ang II actúa al menos sobre dos subtipos de receptor denominados AT1 y AT2. Mientras que, en apariencia, AT1 parece transmitir la mayoría de las funciones conocidas de Ang II, aún se desconoce el papel de AT2.

La modulación de RAS representa un importante avance en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Se ha aceptado que los inhibidores de ACE y los bloqueadores de AT1 sirven para el tratamiento de hipertensión (Waeber

B. et al., “The renin-angiotensin system: role in experimental and human hypertension”, en Birkenhager W. H., Reid

J. L. (eds): Hypertension, Amsterdam, Elsevier Science Publishing Co, 1986, 489-519; Weber M. A., Am. J. Hypertens., 1992, 5, 247S). Además, se usan los inhibidores de ACE para la protección renal (Rosenberg M. E. et al., Kidney International, 1994, 45, 403; Breyer J. A. et al., Kidney International, 1994, 45, S156), en la prevención de insuficiencia cardíaca congestiva (Vaughan D. E. et al., Cardiovasc. Res., 1994, 28, 159; Fouad-Tarazi F. et al., Am.

J. Med., 1988, 84 (Suppl. 3A), 83) e infarto de miocardio (Pfeffer M. A. et al., N. Engl. J. Med., 1992, 327, 669).

El fundamento para desarrollar los inhibidores de renina es la especificidad de la renina (Kleinert H. D., Cardiovasc. Drugs, 1995, 9, 645). El único sustrato conocido de la renina es el angiotensinógeno, que sólo puede ser procesado (en condiciones fisiológicas) por la renina. En contraste, ACE también puede escindir la bradiquinina, además de Ang I y puede ser superada por la quimasa, una serina proteasa (Husain A., J. Hypertens., 1993, 11, 1155). En consecuencia, en los pacientes la inhibición de ACE conduce a la acumulación de bradiquinina, lo cual produce tos (5-20%) y edema angioneurótico que puede poner en peligro la vida (0,1-0,2%) (Israili Z. H. et al., Annals of Internal Medicine, 1992, 117, 234). La quimasa no es inhibida por los inhibidores de ACE. En consecuencia, la formación de Ang II aún es posible en pacientes tratados con inhibidores de ACE. Por otra parte, el bloqueo del receptor AT1 (p. ej. por losartano) expone en exceso otros subtipos de receptor AT (p. ej. AT2) a Ang II, cuya concentración aumenta significativamente con el bloqueo de receptores AT1. En síntesis, se espera que los inhibidores de renina muestren un perfil farmacéutico diferente que los inhibidores de ACE y los bloqueadores de AT1, respecto de la eficacia en el bloqueo de RAS y en los aspectos de seguridad.

Sólo hay limitada experiencia clínica (Azizi M. et al., J. Hypertens., 1994, 12, 419; Neutel J. M. et al., Am. Heart, 1991, 122, 1094) con los inhibidores de renina, por su insuficiente actividad oral debido al carácter peptidomimético (Kleinert H. D., Cardiovasc. Drugs, 1995, 9, 645). Se ha detenido el desarrollo clínico de varios compuestos por este problema, junto con el alto costo de los productos. Sólo se han realizado estudios clínicos con un compuesto que contiene cuatro centros quirales (Rahuel J. et al., Chem. Biol., 2000, 7, 493; Mealy N. E., Drugs of the Future, 2001, 26, 1139). En consecuencia, se requieren inhibidores de renina con buena biodisponibilidad oral y larga duración de acción. Recientemente se describieron los primeros inhibidores de renina no peptídicos, que muestran elevada actividad in vitro (Oefner C. et al., Chem. Biol., 1999, 6, 127; solicitud de patente WO 97/09311; Märki H. P. et al., Il Farmaco, 2001, 56, 21). Sin embargo, se desconoce el estado de desarrollo de estos compuestos. Los documentos WO 03/093267 A1 y WO 2004/105762 A1 describen derivados 3,9-diazabiciclo[3.3.1]non-6-eno y su uso ocmo inhibidores de renina e inhibidores de aspártico proteasas, respectivamente.

La presente invención se refiere a un inhibidor de renina de naturaleza no peptídica y bajo peso molecular. Se describe el inhibidor de renina con actividad por vía oral de la fórmula (I’) que tiene prolongada duración de acción y que es activo en indicaciones más allá de la regulación de la presión arterial, en donde se puede activar el sistema tisular de renina-quimasa conducente a funciones locales fisiopatológicamente alteradas, tales como remodelación renal, cardíaca y vascular, ateroesclerosis, y posiblemente restenosis.

En particular, la presente invención se refiere a un nuevo compuesto de la fórmula estructural (I’): ciclopropil-(2,3dimetilbencil)amida del ácido (1R, 5S)-7-{4-[2-(2,6-dicloro-4-metilfenoxi)etoxi]fenil}-3,9-diazabiciclo[3.3.1]non-6-eno6-carboxílico;

Cl

imagen1 Cl

O imagen1

(I')

O

imagen1 N H H

N H

N

H.

en la que, en esta descripción, se use la forma plural para compuestos, sales, composiciones farmacéuticas, enfermedades y similares, también se pretende significar un solo compuesto, sal, o similares.

Cualquier referencia a un compuesto de la fórmula (I’) se debe entender como referida también a las sales 5 (especialmente las sales farmacéuticamente aceptables) y complejos de disolventes (incluidos hidratos) de dicho compuesto.

La expresión sales farmacéuticamente aceptables abarca las sales con ácidos inorgánicos o ácidos orgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido cítrico, ácido fórmico, ácido acético, ácido maleico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido benzoico, ácido palmoico, 10 ácido esteárico, ácido metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, y similares que no son tóxicos para organismos vivos. Se prefiere especialmente la sal del ácido bis-metanosulfónico. Para otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables, se puede referir a "Salt selection for basic drugs", Int. J. Pharm. (1986), 33, 201-217. Los compuestos de la fórmula (I) contienen dos átomos de carbono asimétricos interdependientes con la estereoquímica relativa (1R*, 5S*) y se pueden preparar en la forma de los enantiómeros ópticamente puros de 15 ciclopropil-(2,3-dimetilbencil)amida del ácido (1R, 5S)-7-{4-[2-(2,6-dicloro-4-metilfenoxi)etoxi]fenil}-3,9diazabiciclo[3.3.1]non-6-eno-6-carboxílico (es decir, se prefiere el compuesto de la fórmula (I’)) y ciclopropil-(2,3dimetilbencil)amida del ácido (1S, 5R)-7-{4-[2-(2,6-dicloro-4-metilfenoxi)etoxi]fenil}-3,9-diazabiciclo[3.3.1]non-6-eno6-carboxílico, o como mezcla de los dos enantiómeros, tal como un racemato. Las mezclas se pueden separar de una manera conocida per se, es decir por cromatografía en columna, cromatografía en capa fina, HPLC o

20 cristalización. También es posible una resolución del racemato en el compuesto final o cualquier intermediario químico, al usar una sustancia enantioméricamente pura portadora de un resto ácido. Por ejemplo, es posible dicha resolución al usar ácido tartárico con el compuesto 1 en el Esquema 1.

El compuesto de la fórmula (I’) es útil para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades asociadas con la desregulación del sistema renina-angiotensina, en particular enfermedades tales como o relacionadas con 25 hipertensión, insuficiencia cardíaca congestiva, hipertensión pulmonar, insuficiencia renal, isquemia renal, falla renal, fibrosis renal, insuficiencia cardíaca, hipertrofia cardíaca, fibrosis cardíaca, isquemia de miocardio, cardiomiopatía, glomerulonefritis, cólico renal, complicaciones resultantes de diabetes, tales como nefropatía, vasculopatía y neuropatía, glaucoma, elevada presión intraocular, aterosclerosis, reestenosis post angioplastia, complicaciones posteriores a cirugía vascular o cardíaca, disfunción eréctil, hiperaldosteronismo, fibrosis pulmonar, esclerodermia,

30 ansiedad, trastornos de la cognición, complicaciones de tratamientos con agentes inmunosupresores y otras enfermedades relacionadas con el sistema renina-angiotensina.

El compuesto de la fórmula (I’) es especialmente útil para el tratamiento y/o la profilaxis de hipertensión, insuficiencia cardíaca congestiva, hipertensión pulmonar, insuficiencia renal, isquemia renal, falla renal, fibrosis renal, insuficiencia cardíaca, hipertrofia cardíaca, fibrosis cardíaca, isquemia de miocardio, cardiomiopatía, complicaciones

35 resultantes de diabetes, tales como nefropatía, vasculopatía y neuropatía.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la fórmula (I’) y un material portador farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas se pueden usar para el tratamiento y/o profilaxis de las enfermedades antes mencionadas. Las composiciones farmacéuticas se pueden usar para administración enteral, parenteral o tópica. Se pueden administrar, por ejemplo, por vía peroral, p. 40 ej. en la forma de comprimidos, comprimidos recubiertos, grageas, cápsulas de gelatina dura y blanda, soluciones, emulsiones o suspensiones, por vía rectal, p. ej. en la forma de supositorios, por vía parenteral, p. ej. en la forma de

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45

soluciones para inyección o soluciones para infusión, o tópicamente, p. ej. en la forma de ungüentos, cremas o aceites.

La invención también se refiere al uso de un compuesto de la fórmula (I’) para la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento y/o la profilaxis de las enfermedades antes mencionadas.

La producción de las composiciones farmacéuticas se puede realizar de una manera que será conocida por cualquier persona con experiencia en la técnica (ver, por ejemplo, Mark Gibson, editor, Pharmaceutical Preformulation and Formulation, IHS Health Group, Englewood, CO, EE. UU., 2001; Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20ª Edición, Philadelphia College of Pharmacy and Science) al proveer los compuestos descritos de la fórmula (I’) o sus sales por adición de ácidos farmacéuticamente aceptables, opcionalmente en combinación con otras sustancias terapéuticamente valiosas, en una forma de administración galénica junto con materiales portadores sólidos o líquidos adecuados, no tóxicos, inertes, terapéuticamente compatibles y, si se desea, los coadyuvantes farmacéuticos habituales.

Los materiales portadores adecuados no sólo son materiales portadores inorgánicos, sino también materiales portadores orgánicos. En consecuencia, se pueden usar, por ejemplo, lactosa, almidón de maíz o sus derivados, talco, ácido esteárico o sus sales como materiales portadores para comprimidos, comprimidos recubiertos, grageas y cápsulas de gelatina dura. Los materiales portadores adecuados para las cápsulas de gelatina blanda son, por ejemplo, aceites vegetales, ceras, grasas y polioles semisólidos y líquidos (según la naturaleza del ingrediente activo, sin embargo, no se requieren portadores en el caso de cápsulas de gelatina blanda). Los materiales portadores adecuados para la producción de soluciones y jarabes son, por ejemplo, agua, polioles, sacarosa, azúcar invertido y similares. Los materiales portadores adecuados para inyecciones son, por ejemplo, agua, alcoholes, polioles, gliceroles y aceites vegetales. Los materiales portadores adecuados para supositorios son, por ejemplo, aceites naturales o endurecidos, ceras, grasas y polioles semilíquidos o líquidos. Los materiales portadores adecuados para preparaciones tópicas son glicéridos, glicéridos semisintéticos y sintéticos, aceites hidrogenados, ceras líquidas, parafinas líquidas, alcoholes grasos líquidos, esteroles, polietilenglicoles y derivados de celulosa.

Los estabilizantes, conservantes, agentes humectantes y emulsionantes, agentes mejoradores de consistencia, agentes mejoradores de sabor, sales para variar la presión osmótica, sustancias tamponadoras, solubilizantes, colorantes y agentes enmascaradores y antioxidantes habituales se tienen en consideración como coadyuvantes farmacéuticos.

Las formas de dosificación del compuesto de la fórmula (I’) pueden variar dentro de amplios límites, según la enfermedad que se desea controlar, la edad y la condición individual del paciente y el modo de administración, y obviamente se debe ajustar a los requerimientos individuales de cada caso en particular.

En una forma de realización preferida, esta cantidad comprende entre 2 mg y 1000 mg por día.

En una forma de realización de particular preferencia, esta cantidad comprende entre 1 mg y 500 mg por día.

En una forma de realización de más particular preferencia, esta cantidad comprende entre 5 mg y 200 mg por día.

El compuesto de la fórmula (I’) o las composiciones farmacéuticas antes mencionadas también son útiles en combinación con otros compuestos farmacológicamente activos tales como inhibidores de ACE, inhibidores de endopeptidasa neutra, antagonistas de receptor de angiotensina II, antagonistas de receptores de endotelina, vasodilatadores, antagonistas de calcio, activadores de potasio, diuréticos, simpaticolíticos, antagonistas betaadrenérgicos, antagonistas alfa-adrenérgicos y/u otros fármacos con beneficios para la prevención o el tratamiento de las enfermedades antes mencionadas, tales como antagonistas de aldosterona, inhibidores de 11-betahidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 y activadores de guanilato ciclasa soluble.

El compuesto de la fórmula (I’) se puede fabricar por los métodos destacados más adelante, por el método descrito en el ejemplo o mediante métodos análogos.

La síntesis del compuesto de la fórmula (I’) descrita de esta manera es una de las posibles síntesis entre muchas otras alternativas. Otras vías de síntesis y metodologías serán aparentes para la persona experta en el arte.

El derivado biciclononano 1 (Esquema 1) se puede preparar como racemato, tal como se describió con anterioridad (documento WO 2003/093267). La preparación del triflato de vinilo 2 procede con el uso de hidruro de sodio y Nfenil-bis(trifluorometanosulfonimida). Un acoplamiento de Negishi entre el sistema bicíclico 2 y el derivado bromofenilo 6 conduce a diazabicicloneno 3. Se prepara el derivado bromofenilo 6 en tres etapas a partir de 4bromofenol, por alquilación con 2-bromoetanol (→ compuesto 4), luego una conversión del grupo hidroxilo en yodo (→ compuesto 5), y por último la formación de un éter arilo al compuesto 6. Luego se transprotege el biciclononeno 3 a biciclononeno 7. La saponificación de éster etílico en condiciones fuertemente básicas conduce a una mezcla de los derivados de ácido carboxílico 8 y 9.

Esquema 1

imagen1

La mezcla de compuestos 8 y 9 no se separa y se usa directamente en el paso de acoplamiento de la amida con el derivado amina 11, que se prepara en un paso mediante aminación reductora (Esquema 2). Se obtiene el producto de acoplamiento de la amida 10. La escisión de ambos grupos protectores de Boc conduce a un compuesto de la fórmula general (I).

Esquema 2

imagen1

Síntesis enantioselectiva:

Los compuestos de la presente invención contienen dos centros quirales que, sin embargo, no son independientes

5 entre sí. Los métodos de síntesis presentados hasta el momento conducen a un racemato. El racemato se puede separar en el compuesto de la fórmula (I’) y su enantiómero mediante una columna quiral por HPLC. Además, se pueden preparar selectivamente el enantiómero de la fórmula (I’) a partir de un derivado meso-biciclononano, tal como el compuesto 12 (Esquema 3), mediante una acilación enantioselectiva (Majewski M., Lasny R., J. Org. Chem., 1995, 60, 5825), como la descrita en el documento WO 2003/093267. Otra alternativa sería una resolución del

10 racemato mediante un derivado quiral de ácido orgánico.

5

10

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20

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30

Esquema 3

imagen2

O

CH3O2C

Boc

N

imagen1

12 13

El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la presente invención con mayor detalle.

Ejemplo

Comentarios generales:

El compuesto se caracteriza al menos por LC-MS y 1H-RMN. Sólo se proveen en la presente los datos por LC-MS (columna Zorbax SB-AQ, 5 µm, 4,6 x 50 mm; eluyente A: 0,04% de ácido trifluoroacético en agua; eluyente B: acetonitrilo; gradiente 5% → 100% de eluyente B durante 1,5 min, flujo de 1 ml/min)

Abreviaturas (tal como se usan en la presente memoria)

ACE: Enzima convertidora de angiotensina

Ang: Angiotensina

ac.: acuoso

Boc: ter-butiloxicarbonilo

BSA: Albúmina sérica bovina

BuLi: n-Butil-litio

DIPEA: Diisopropiletilamina

DMAP: 4-N,N-dimetilaminopiridina

DMSO: Dimetilsulfóxido

EDC.HCl Clorhidrato de etil-N,N-dimetilaminopropilcarbodiimida EIA Inmunoensayo enzimático ES+ Electropulverización, ionización positiva Et Etilo EtOAc Acetato de etilo EtOH Etanol FC Cromatografía flash h hora(s) HOBt Hidroxibenzotriazol HPLC Cromatografía líquida de alto rendimiento LC-MS Cromatografía líquida por espectrometría de masa min minuto(s) MeOH Metanol org. orgánico Ph Fenilo Rf Índice de retención (en TLC)

5

10

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50

ta temperatura ambiente

sat. saturado

sol. Solución

Tf Trifluorometilsulfonilo

THF Tetrahidrofurano

TLC Cromatografía en capa fina

tR tiempo de retención

Éster 6-etílico de éster 3-terc-butílico de ácido (rac.)-(1R*, 5S*)-9-metil-7-trifluorometanosulfoniloxi-3,9diazabiciclo-[3.3.1]non-6-eno-3,6-dicarboxílico (2)

Se disolvió el compuesto 1 (documento WO 2003/093267, 99,58 g, 305 mmol) en THF seco (1450 ml) en atmósfera de nitrógeno y se enfrió la mezcla a 0 °C. Se agregó NaH (16,64 g; dispersión al 55% en aceite mineral, 381 mmol) en porciones de 2 g durante un período de 35 min, mientras se mantuvo la temperatura entre 0 y 4 °C. Se observó la evolución de un gas. Tras la adición se agitó la mezcla de reacción durante 75 min a 0 a 4 °C. Luego s e agregó Tf2NPh (128,6 g, 360 mmol) como sólido durante 5 min. La mezcla de reacción se tornó marrón. Se retiró el baño refrigerante y se agitó la mezcla de reacción durante el fin de semana a ta. Se volcó la mezcla de reacción sobre 1 L de hielo/agua y se eliminó el THF a presión reducida. Se extrajo la fase de agua remanente con EtOAc (3 x 500 ml). Las capas org. combinadas se lavaron con agua (500 ml) y salmuera (500 ml). Luego se secó la fase org. sobre MgSO4, se filtró, y los solventes se evaporaron a presión reducida. Al residuo marrón crudo (174 g), se agregaron 50 ml de pentano y la mezcla se agitó a 4 °C durante l a noche. El precipitado se eliminó por filtración y se lavó con hexano frío (70 ml) y una mezcla fría de hexano/éter dietílico (4:1, 100 ml). Se obtuvieron así 84 g de producto que contenía algo de TfNHPh. Este material se filtró sobre gel de sílice (75 g). El TfNHPh se eliminó por lavado con heptano. Luego se lavó el producto del título con EtOAc (3 veces 1 L) para dar, después de evaporación a presión reducida, el producto del título en tres fracciones: a) 44,45 g de cristales blanquecinos, b) 27,98 g de pequeños cristales marrones y c) 15 g de un aceite amarillo que contiene el producto y TfNHPh. Después de 2 días, el TfNHPh contenido en las fracciones c) había cristalizado. Se filtró para obtener 9,43 g del producto como aceite marrón.

Tratamiento de los licores madre:

Los licores madres combinados obtenidos como se describió con anterioridad se concentraron al vacío. El residuo de aceite marrón (75 g) se purificó por FC (1500 g de gel de sílice) con un gradiente de (EtOAc/heptano 1-9 → EtOAc). Luego se lavó la columna con EtOAc/MeOH 9:1. Se aisló el compuesto del título como 25,44 g de un sólido blanquecino como producto puro. LC-MS: tR = 0,87 min; ES+: 459,24.

Éster 6-etílico del éster 3-terc-butílico del ácido (rac.)-(1R*, 5S*)-7-{4-[2-(2,6-dicloro-4-metilfenoxi)etoxi]fenil}9-metil-3,9-diazabiciclo[3.3.1]non-6-eno-3,6-dicarboxílico (3)

Una sol. de compuesto 6 (49,8 g, 132 mmol) en THF (1,10 L) en nitrógeno se enfrió a -78 °C. Se agregó BuLi (1,6 M en hexano, 88,0 ml, 143 mmol). Después de 1 h se agregó ZnCl2 (1 M en THF, 198 ml, 198 mmol). La mezcla se dejó entibiar hasta ta. Se agregó el compuesto 2 (55,0 g, 112 mmol) en THF (100 ml) y luego Pd(PPh3)4 (3,47 g, 3,00 mmol). La mezcla se calentó a reflujo durante 1 h, y se dejó enfriar hasta ta. La mezcla se diluyó con EtOAc y se lavó con NaOH 1 M (1x) ac. Los extractos org. se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y se eliminaron los solventes con presión reducida. La purificación del residuo por FC (MeOH/CH2Cl2 1:49 → 1:24 → 3:47 → 4:45) dio como resultado el producto del título (47,3 g, 79%). LC-MS: tR = 0,95 min; ES+: 605,34.

2-(4-Bromofenoxi)etanol (4)

A una sol. de 4-bromofenol (40 g, 231 mmol) en EtOH (140 ml) se agregó NaOH (10,2 g, 254 mmol). La mezcla obtenida se agitó a 70 °C durante 30 min hasta diso lver toda la cantidad de NaOH. Se agregó una sol. de 2bromoetanol (17,3 ml, 231 mmol) en EtOH (40 ml) gota a gota a 70°C. La sol. rápidamente se tornó lechos a. La mezcla se calentó a reflujo durante la noche. Los solventes se extrajeron con presión reducida, y el residuo se disolvió en EtOAc. La mezcla se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró, y se eliminaron los solventes con presión reducida. La purificación del crudo por FC (EtOAc/heptano 1:5 → 1:4 → 1:3 → 1:2 → EtOAc) dio como resultado el compuesto del título (39,2 g, 78%) como aceite marrón pálido que cristalizó cuando se colocó a –18 °C. Rf = 0,3 en (EtOAc/heptano 1:1).

1-Bromo-4-(2-yodoetoxi)benceno (5)

A una sol. de compuesto 4 (39,2 g, 181 mmol) en tolueno seco (500 ml) se agregó imidazol (61,5 g, 903 mmol), PPh3 (90 g, 343 mmol) y yodo (87,1 g, 343 mmol). Esta mezcla se agitó a 60 °C durante 2 h. La mezcla se fil tró sobre

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Celite, y el filtrado se concentró a presión reducida. La purificación del residuo por FC (EtOAc/heptano 1:5 → 1:4 →

1:3 → 1:2 → 1:1) dio como resultado el compuesto del título (39,9 g, 67%).

Compuesto 6

En un matraz de 500 ml de 3 bocas equipado con un agitador mecánico y un condensador de reflujo, se mezclaron el compuesto 5 (39,9 g, 122 mmol) y 2,6-dicloro-p-cresol (21,6 g, 122 mmol) en acetona seca (1200 ml). A esta mezcla se agregó K2CO3 (16,86 g, 122 mmol), y la suspensión obtenida se calentó a reflujo durante 20 h. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida, el residuo se disolvió con EtOAc y esta fase org. se lavó con agua (2 x) y salmuera (1 x). La capa org. se secó con MgSO4, se filtró y se concentró con presión reducida. La purificación del residuo con un corto FC (EtOAc/heptano 1:9) dio como resultado el compuesto del título (44,4 g, 96%).

Éster 6-etílico del éster 3,9-di-terc-butílico del ácido (rac.)-(1R*, 5S*)-7-{4-[2-(2,6-dicloro-4metilfenoxi)etoxi]fenil}-3,9-diazabiciclo[3.3.1]non-6-eno-3,6,9-tricarboxílico (7)

El compuesto 3 (57,3 g, 94,6 mmol) se disolvió en 1,2-dicloroetano seco (1,00 L). Se agregaron NaHCO3 (80,4 g, 946 mmol) y 1-cloroetilcloroformiato (103 ml, 946 mmol), y la suspensión se calentó a 80 °C durante 3 h. La mezcla de reacción se dejó enfriar a ta. La mezcla se filtró y el filtrado se evaporó con presión reducida. El residuo se secó durante 15 min con alto vacío. Luego se diluyó el producto en MeOH (900 ml), y la mezcla se calentó a 60 °C durante 30 min. La mezcla de reacción se dejó enfriar a ta, y se eliminaron los solventes con presión reducida. El residuo se secó con alto vacío durante 1 h. El residuo se disolvió en CH2Cl2 (1,00 L), y la sol. se enfrió a 0 °C. Se agregaron DIPEA (97,2 ml, 567 mmol) y Boc2O (62,0 g, 283 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 30 min, luego a ta durante 30 min. La mezcla de reacción se diluyó con CH2Cl2 (110 ml). La capa org. se lavó con HCl ac. 1 M (2 x 300 ml), y NaHCO3 ac. sat. (300 ml). La capa org. se secó con MgSO4, se filtró, y los solventes se evaporaron con presión reducida. La purificación del residuo por FC (EtOAc/heptano 1:5 → 1:38 → 1:1 → EtOAc) dio como resultado el compuesto del título (47,9 g, 73%). LC-MS: tR = 1,22 min; ES+: 691,37.

Mezcla de éster 3,9-di-terc-butílico de ácido (rac.)-(1R*, 5S*)-7-{4-[2-(2,6-dicloro-4-metilfenoxi)etoxi]-fenil}-3,9diazabiciclo[3.3.1]non-6-eno-3,6,9-tricarboxílico (8) y éster 3,9-di-terc-butílico de ácido (rac.)-(1R*, 5S*)-7-{4[2-(2,6-dicloro-4-metilfenoxi)-etoxi]fenil}-3,9-diazabiciclo[3.3.1]non-7-en-3,6,9-tricarboxílico (9)

Una mezcla de compuesto 7 (47,8 g, 69,1 mmol) en NaOH ac. 1 M (350 ml) y EtOH (700 ml) se agitó a 80 °C durante la noche. La mezcla se evaporó parcialmente en presión reducida, y se agregó EtOAc (500 ml). La fase ac. se acidificó con HCl ac. 3 M, y se extrajo la mezcla. Se separó la capa org., se secó sobre MgSO4, se filtró, y los solventes se extrajeron con presión reducida. El residuo se secó con alto vacío, para obtener una mezcla 1:1 de los compuestos 8 y 9 que se usó sin purificación (50,2 g, de rendimiento cuantitativo). LC-MS: tR = 1,12 y 1,14 min; ES+: 663,33.

Éster di-terc-butílico de ácido (rac.)-(1R*, 5S*)-6-[ciclopropil-(2,3-dimetilbencil)carbamoil]-7-{4-[2-(2,6-dicloro4-metilfenoxi)etoxi]fenil}-3,9-diazabiciclo[3.3.1]non-6-eno-3,9-dicarboxílico (10)

Una mezcla de compuestos 8 y 9 (14,6 g, 22,0 mmol), compuesto 11 (9,64 g, 55 mmol), EDC.HCl (12,7 g, 66,0 mmol), HOBt (3,72 g, 27,5 mmol), DMAP (672 mg, 5,50 mmol) y DIPEA (15,1 ml, 88 mmol) en CH2Cl2 (300 ml) se agitó a ta durante 4 días. Dos veces se agregó EDC.HCl (2,10 g, 10,6 mmol) y compuesto 11 (3,85 g, 22,0 mmol). La mezcla se diluyó con más CH2Cl2, y se lavó con HCl ac. 1 M (3 x), y NaHCO3 ac. sat. (2x). La capa org. se secó sobre MgSO4, se filtró, y se extrajeron los solventes con presión reducida. La purificación por FC produjo el compuesto del título (13,8 g, 76%). LC-MS: tR = 1,20 min; ES+: 820,53.

Ciclopropil-(2,3-dimetilbencil)amina (11)

Una mezcla de 2,3-diclorobenzaldehído (68,9 g, 514 mmol) y ciclopropilamina (72 ml, 1,02 mol) en MeOH seco (1300 ml) se agitó a ta durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió a 0 °C, y se agregó NaBH4 (25,3 g, 668 mmol). La mezcla de reacción se volvió a agitar a ta durante la noche. Se agregó hielo a la mezcla de reacción, y los solventes se evaporaron con presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc, y se lavó con NaOH ac. 1 M. La capa ac. se extrajo con EtOAc (3x). Los extractos org. combinados se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y se eliminaron los solventes con presión reducida. La purificación del residuo por FC (EtOAc / heptano 9:1 → 1:1) dio como resultado el compuesto del título (78,4 g, 87%). LC-MS: tR = 0,84 min; ES+: 176,13.

Compuesto (I): ciclo-propil-(2,3-dimetilbencil)amida de ácido (rac.)-(1R*, 5S*)-7-{4-[2-(2,6-dicloro-4metilfenoxi)-etoxi]fenil}-3,9-diazabiciclo[3.3.1]-non-6-eno-6-carboxílico

Una sol. de compuesto 10 (13,8 g, 16,9 mmol) en CH2Cl2 (120 ml) se enfrió a 0 °C. Se agregó HCl (4 M en dioxano, 120 ml). La mezcla se agitó durante 1 h a 0 °C, luego 2 h a ta. Los solventes se extrajeron con presión reducida, y el residuo se secó con alto vacío. El residuo se diluyó con CH2Cl2, y se lavó con NaOH ac. 1 M hasta que la capa aq. se mantuvo básica. Los extractos org. se secaron con MgSO4, se filtraron, y los solventes se extrajeron con presión reducida. La purificación del residuo por FC (MeOH/CH2Cl2 5:95 → 10:90 → 20:80 con 1% Et3N todo el tiempo) dio como resultado el compuesto del título (9,45 g, 90%). LC-MS: tR = 0,87 min; ES+: 620,40.

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Compuesto (I’): ciclopropil-(2,3-dimetilbencil)amida de ácido (1R, 5S)-7-{4-[2-(2,6-dicloro-4-metilfenoxi)etoxi]fenil}-3,9-diazabiciclo[3.3.1]non-6-eno-6-carboxílico

El compuesto (I) (9,45 g, 15,2 mmol) se purificó en una columna Regis Whelk 01, 50 x 250 mm en condiciones isocráticas (25% de EtOH, 0,1% de dietilamina, 75% de hexano) y un flujo de 100 ml/min. El compuesto deseado se obtuvo como primer enantiómero (tR = 17,85 min). Después de evaporar los solventes con presión reducida, el residuo se secó con alto vacío. El residuo se disolvió en CH2Cl2, y se lavó con K2CO3 ac. al 10%. Los extractos org. se secaron con MgSO4, se filtraron, y se extrajeron los solventes con presión reducida. Al secar el residuo con alto vacío se obtuvo el compuesto del título (3,40 g).

Ensayos biológicos

1. Inmunoensayo enzimático (EIA) para estimar la acumulación de Ang I y la inhibición de renina 1.1 Preparación de conjugado de Ang I-BSA

Se disolvieron 1,3 mg (1 µmol) de Ang I [1-10 (Bachem, H-1680)] y 17 mg (0,26 µmol) de BSA (Fluka, 05475) en 4 ml de tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4, y luego se agregaron gota a gota 2 ml de una dilución 1:100 de glutaraldehído en H2O (Sigma G-5882). La mezcla se incubó durante la noche a 4 °C, luego se dializó contra 2 litros de 0,9% de NaCl, dos veces durante 4 h a ta, seguido de diálisis contra 2 litros de PBS 1X durante la noche a ta. La solución luego se filtró con un filtro de jeringa, 0,45 µm (Nalgene, Nº de cat. 194-2545). El conjugado se puede almacenar en tubos de polipropileno en azida sódica al 0,05% a 4 °C durante al menos 12 meses.

1.2 Preparación de MTP recubierto por BSA-Ang I

Se incubaron placas de microtitulación (MPT384, MaxiSorpTM, Nunc) durante la noche a 4 °C con 80 µl de conjug ado de Ang I (1-10)/BSA, diluido 1:100.000 en PBS 1X en un vaso de precipitados de teflón (la dilución exacta depende del lote de conjugado), se vació, se llenó con 90 µl de solución bloqueante [0,5% BSA (Sigma A-2153) en PBS 1X, 0,02% NaN3], y se incubó durante al menos 2 h a ta, o durante la noche a 4 °C. Se recubrieron 96 pocill os de MTP (MaxiSorpTM, Nunc) con 200 µl de conjugado y se bloquearon con 250 µl de solución bloqueante como la anterior, salvo en que la solución bloqueante contenía 3% de BSA. Las placas se pueden almacenar en solución bloqueante a 4 °C durante 1 mes.

1.3 Ang I-EIA en MTP de 384 pocillos

La MTP recubierta con Ang I (1-10)/BSA se lavó 3 veces con tampón de lavado (PBS 1X, 0,01% Tween 20) y se llenó con 75 µl de solución primaria de anticuerpo (antisuero anti-Ang I, prediluido 1:10 en suero de caballo), diluido a una concentración final de 1:100.000 en tampón de ensayo (PBS 1X, EDTA 1mM, BSA al 0,1%, pH 7,4). Se añadieron 5 µl de la reacción de renina (o estándares en tampón de ensayo) (ver más adelante) a la solución de anticuerpo primario, y las placas se incubaron durante la noche a 4 °C. Después de la incubación se la varon las placas 3 veces con tampón de lavado y se incubaron con anticuerpo secundario [anti IgG de conejo, ligado a peroxidasa de rábano (Amersham Bioscience, NA 934V), diluido 1:2.000 en tampón de lavado] durante 2 h a ta. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado y luego se incubaron durante 1 h a ta con solución sustrato [1,89 mM ABTS (2,2'-azino-di-(3-etil-benztiazolinsulfonato)] (Roche Diagnostics, 102 946) y H2O2 2,36 mM [30%, (Fluka, 95300] en tampón sustrato (acetato de sodio 0,1 M, fosfato de hidrógeno 0,05 M y sodio, pH 4,2). La DO de la placa se leyó a 405 nm en un lector de microplaca (FLUOStar Optima de BMG). La producción de Ang I durante la reacción de renina se cuantificó por comparación de la DO de la muestra con la DO de una curva estándar de Ang I(1-10), medida en paralelo.

2. Ensayo de inhibición primaria de renina: IC50 en buffer, MTP de 384 cavidades

El ensayo de renina se adaptó de un ensayo descrito con anterioridad (Fischli W. et al., Hypertension, 1991, 18:2231) y consiste en dos pasos: en el primer paso, se incuba renina recombinante humana con su sustrato (sustrato comercial de tetradecapéptido de renina humana) para crear el producto Angiotensina I (Ang I). En el segundo paso, la Ang I acumulada se mide mediante un ensayo inmunológico (inmunoensayo enzimático, EIA). La descripción detallada de este ensayo se encuentra más adelante. El EIA es muy sensible y adecuado para las mediciones de la actividad de renina en tampón o en plasma. Debido a la baja concentración de renina usada en este ensayo (2 fmol por tubo de ensayo o 10 pM), es posible medir afinidades de inhibidor en este ensayo primario hasta una baja concentración pM.

2.1 Metodología

Se premezclaron renina recombinante humana (3 pg/µl) en tampón de ensayo (PBS 1X, 1 mM EDTA, 0,1% BSA, pH 7,4), sustrato de tetradecapéptido humano (1-14) (Bachem, M-1120) [5 µM en HCl 10 mM], sulfato de hidroxiquinolina (Fluka, 55100) [30 mM en H2O] y tampón de ensayo a 4 °C con una proporción de 100:30:10:145. Se transfirieron 47,5 µl por pocillo de esta premezcla a placas de polipropileno (MTP384, Nunc). Los compuestos de prueba se disolvieron y diluyeron en DMSO al 100% y se agregaron 2,5 µl a la premezcla, luego se incubaron a 37 °C durante 3 h. Al final del período de incubación, se transfirieron 5 µl de la mezcla de reacción de renina (o

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estándares en tampón de ensayo) a ensayos de EIA (tal como se describió con anterioridad) y se cuantificó el Ang I producido por la renina. El porcentaje de inhibición de renina (disminución de Ang I) se calculó para cada concentración del compuesto y se determinó la concentración de inhibición de renina que inhibía la actividad de enzima en un 50% (IC50).

El compuesto de la fórmula (I’) muestra un valor de IC50 de 0,3 nM.

Mediciones hemodinámicas (método por telemetría)

Animales – Ratas hembra dobles transgénicas con renina humana y angiotensinógeno humano se adquirieron de RCC Ltd, Füllingsdorf, Suiza. Todos los animales se mantuvieron en idénticas condiciones y tenían libre acceso a alimento normal en pellet para ratas y agua. Las ratas se trataron inicialmente con enalapril (1 mg/kg/día) durante 2 meses. Después de aproximadamente dos semanas siguientes al cese de tratamiento con enalapril, las ratas transgénicas dobles se tornan hipertensas y alcanzan presiones arteriales medias en el rango de 160-170 mmHg.

Implantación del transmisor – Las ratas se anestesian con una mezcla de 90 mg/kg de cetamina-HCl (Ketavet, Parke-Davis, Berlín, RFA) y 10 mg/kg de xilazina (Rompun, Bayer, Leverkusen, RFA) i.p. Se implantó el transmisor de presión en condiciones asépticas en la cavidad peritoneal con el catéter sensor colocado en la aorta descendente por debajo de las arterias renales, dirigido corriente arriba. El transmisor se suturó a la musculatura abdominal y se cerró la piel.

Sistema de telemetría – Las unidades de telemetría se adquirieron de Data Sciences (St. Paul, MN). El sensor implantado consiste en un catéter lleno de fluido (0,7 mm de diámetro, 8 cm de largo; modelo TA11PA-C40) conectado a un transductor de presión altamente estable de baja conductancia con calibre de tensión, que midió la presión arterial absoluta respecto del vacío, y un transmisor de frecuencia de radio. La punta del catéter se llenó con un gel viscoso que impide el reflujo de la sangre y se recubrió con una película antitrombogénica para inhibir la formación de trombos. Los implantes (longitud = 2,5 cm, diámetro = 1,2 cm) pesaban 9 g y tenían una duración típica de batería de 6 meses. Una plataforma receptora (RPC-1, Data Sciences) conectaba la señal de radio a la entrada digitalizada que se enviaba a una computadora personal especial (Compaq, deskpro). Se calibraron las presiones arteriales con la entrada de referencia de presión ambiental (APR-1, Data Sciences). Se expresó la presión arterial sistólica, media y diastólica en milímetros de mercurio (mmHg).

Mediciones hemodinámicas – A las ratas transgénicas dobles con transmisores de presión implantados se les administró por cebadura oral vehículo o 10 mg/kg de la sustancia de prueba (n = 6 por grupo) y se monitoreó continuamente la presión arterial media. El efecto de la sustancia de prueba se expresa como máxima disminución de presión arterial media (MAP) en el grupo tratado frente al grupo control.

El compuesto de la fórmula (I’) era activo en este modelo animal. Condujo a una disminución de la presión arterial de 30 mmHg en una dosis oral única de 10 mg/kg, y una disminución de presión arterial de 17 mmHg con una única dosis oral de 3 mg/kg.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la fórmula (I’) denominado ciclopropil-(2,3-dimetilbencil)amida de ácido (1R, 5S)-7-{4-[2-(2,6dicloro-4-metilfenoxi)etoxi]fenil}-3,9-diazabiciclo[3.3.1]non-6-eno-6-carboxílico

Cl

(I')

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H

5 y sus sales y complejos de solventes.
2.

Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y un material portador farmacéuticamente aceptable.
3.

Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, o una composición de acuerdo con la reivindicación 2, para su uso como medicamento.

10 4. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades seleccionadas de hipertensión, insuficiencia cardíaca congestiva, hipertensión pulmonar, insuficiencia renal, isquemia renal, fallo renal, fibrosis renal, insuficiencia cardíaca, hipertrofia cardíaca, fibrosis cardíaca, isquemia de miocardio, cardiomiopatía, glomerulonefritis, cólico renal, complicaciones resultantes de diabetes, tales como

15 nefropatía, vasculopatía y neuropatía, glaucoma, elevada presión intraocular, ateroesclerosis, restenosis posangioplastia, complicaciones posteriores a cirugía vascular o cardíaca, disfunción eréctil, hiperaldosteronismo, fibrosis pulmonar, esclerodermia, ansiedad, trastornos de la cognición, complicaciones de tratamientos con agentes inmunosupresores y otras enfermedades relacionadas con el sistema renina-angiotensina.