ES2352453T3 - Triazoles útiles como inhibidores de proteínas quinasas. - Google Patents

Triazoles útiles como inhibidores de proteínas quinasas. Download PDF

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Abstract

Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en la fabricación de medicamento para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad o afección seleccionada de trastornos alérgicos, trastornos proliferativos, trastornos autoinmunes, afecciones asociadas con el trasplante de órganos, trastornos inflamatorios, trastornos mediados inmunológicamente o trastornos óseos destructivos; cáncer, enfermedad de Alzheimer, reestenosis, angiogénesis, glomerulonefritis, citomegalovirus, VIH, herpes, psoriasis, aterosclerosis, alopecia, una enfermedad autoinmune, una infección vírica, un trastorno neurodegenerativo, un trastorno asociado con la apoptosis de timocitos o un trastorno proliferativo; trastornos hematopoyéticos, en particular, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia promielocítica aguda (LPA) y leucemia linfocítica aguda (LLA); respuestas inmunes tales como reacciones alérgicas o de hipersensibilidad tipo I, asma, enfermedades autoinmunes tales como rechazo de trasplantes, enfermedad de injerto contra huésped, artritis reumatoide, esclerosis lateral amiotrófica y esclerosis múltiple, trastornos neurodegenerativos tales como esclerosis lateral amiotrófica familiar (ELAF), así como en tumores malignos sólidos y hematológicos tales como leucemias y linfomas; cáncer pancreático, de próstata o de ovario.

Description

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a inhibidores de proteínas quinasas. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención y el uso de las composiciones en la fabricación de un medicamento para tratar diversos trastornos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
A la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos se ha contribuido enormemente en los últimos años por un mejor entendimiento de la estructura de enzimas y otras biomoléculas asociadas con enfermedades. Una clase importante de enzimas que han sido objeto de un estudio exhaustivo son las proteínas quinasas.
Las proteínas quinasas constituyen una gran familia de enzimas estructuralmente relacionadas que son responsables del control de una diversidad de procesos de transducción de señales dentro de la célula. (Véase Hardie, G. y Hanks, S. The Protein Kinase Facts Book, I y II, Academic Press, San Diego, CA: 1995). Se cree que las proteínas quinasas han evolucionado a partir de un gen ancestral común debido a la conservación de su estructura y función catalítica. Casi todas las quinasas contienen un dominio catalítico de 250-300 aminoácidos similar. Las quinasas pueden clasificarse en familias por los sustratos que fosforilan (por ejemplo, proteína-tirosina, proteína-serina/treonina, lípidos, etc.). Se han identificado motivos de secuencia que generalmente corresponden a cada una de estas familias de quinasas (Véase, por ejemplo, Hanks, S. K., Hunter, T., FASEB J. 1995, 9, 576-596; Knighton y col., Science 1991, 253, 407-414; Hiles y col., Cell 1992, 70, 419-429; Kunz y col., Cell 1993, 73, 585-596; Garcia-Bustos y col., EMBO J. 1994, 13, 2352-2361).
En general, las proteínas quinasas median la señalización intracelular efectuando una transferencia de fosforilo de un nucleósido trifosfato a un aceptor proteico que está implicado en una ruta de señalización. Estos acontecimientos de fosforilación actúan como interruptores de encendido/apagado moleculares que pueden modular o regular la función biológica de la proteína diana. Estos acontecimientos de fosforilación se desencadenan en última instancia en respuesta a una diversidad de estímulos extracelulares y de otro tipo. Los ejemplos de dichos estímulos incluyen señales de agresiones ambientales y químicas (por ejemplo, choque osmótico, choque térmico, radiación ultravioleta, endotoxina bacteriana y H2O2), citocinas (por ejemplo, interleucina-1 (IL-1) y factor de necrosis tumoral α (TNF-α)) y factores de crecimiento (por ejemplo, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)). Un estímulo extracelular puede afectar a una o más respuestas celulares relacionadas con el crecimiento celular, migración, diferenciación, secreción de hormonas, activación de factores de transcripción, contracción muscular, metabolismo de la glucosa, control de la síntesis proteica y regulación del ciclo celular.
Muchas enfermedades están asociadas con respuestas celulares anormales desencadenadas por acontecimientos mediados por proteínas quinasas, como se han descrito anteriormente. Estas enfermedades incluyen, pero sin limitación, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades óseas, enfermedades metabólicas, enfermedades neurológicas y neurodegenerativas, cáncer, enfermedades cardiovasculares, alergias y asma, enfermedad de Alzheimer y enfermedades relacionadas con hormonas. Por consiguiente, se ha realizado un esfuerzo sustancial en la química médica para encontrar inhibidores de proteínas quinasas que sean eficaces como agentes terapéuticos.
Una familia de tirosina quinasas receptoras de tipo III, incluyendo Flt3, c-Kit, receptor de PDGF y c-Fms, desempeña un papel importante en el mantenimiento, crecimiento y desarrollo de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas. [Scheijen, B, Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333 y Reilly, JT, British Journal of Haematology, 2002, 116, 744-757]. FLT-3 y c-Kit regulan el mantenimiento de conjuntos de células madre/progenitores tempranos, así como el desarrollo de células linfoides y mieloides maduras [Lyman, S, Jacobsen, S, Blood, 1998, 91, 1101-1134]. Ambos receptores contienen un dominio quinasa intrínseco que se activa tras la dimerización mediada por ligando de los receptores. Tras la activación, el dominio quinasa induce la autofosforilación del receptor, así como la fosforilación de diversas proteínas citoplasmáticas que ayudan a propagar la señal de activación que conduce al crecimiento, la diferenciación y la supervivencia. Algunos de los reguladores aguas abajo de la señalización de receptores de FLT-3 y c-Kit incluyen PLCγ, PI3-quinasa, Grb-2, SHIP y quinasas relacionadas con Src [Scheijen, B, Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333]. Se ha demostrado que ambas tirosina quinasas receptoras desempeñan un papel en una diversidad de tumores malignos hematopoyéticos y no hematopoyéticos. Las mutaciones que inducen la activación independiente de ligando de FLT-3 y c-Kit se han implicado en la leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia linfocítica aguda (LLA), mastocitosis y tumor del estroma gastrointestinal (TEGI). Estas mutaciones incluyen cambios de un solo aminoácido en el domino quinasa o duplicaciones en tándem internas, mutaciones puntuales o deleciones en fase de lectura de la región yuxtamembrana de los receptores. Además de mutaciones activantes, la estimulación dependiente de ligando (autocrina o paracrina) de FLT-3 o c-Kit de tipo silvestre sobreexpresadas puede contribuir al fenotipo maligno [Scheijen, B, Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333].
c-fms codifica el receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF-1R) que se expresa predominantemente en el linaje de monocitos/macrófagos [Dai, XM y col.,
Blood, 2002, 99, 111-120]. El MCSF-1R y su ligando regulan el crecimiento y la diferenciación del linaje de macrófagos. Como los otros miembros de la familia, el MCSF-1R contiene un dominio quinasa intrínseco que se activa tras la dimerización inducida por ligando del receptor. El MCSF-1R también se expresa en células no hematopoyéticas incluyendo células epiteliales de glándula mamaria y neuronas. Las mutaciones en este receptor están potencialmente ligadas a leucemias mieloides, y su expresión está correlacionada con carcinomas de mama, ovario y endometrio metastásicos [Reilly, JT, British Journal of Haematology, 2002, 116, 744757 y Kacinski, BM, Mol. Reprod y Devel., 1997, 46, 71-74]. Otra indicación posible para antagonistas de MCSF-1R es la osteoporosis [Teitelbaum, S, Science 2000, 289, 1504-1508,
El receptor de PDGF (PDGFR) tiene dos subunidades PDGFR-α y PDGFR-β, que pueden formar homo-o heterodímeros tras la unión del ligando. Existen varios ligandos de PDGF: AB, BB, CC y DD. El PDGFR se expresa en células madre tempranas, mastocitos, células mieloides, células mesenquimatosas y células musculares lisas [Scheijen, B, Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333]. Sólo el PDGFR-β se ha implicado en leucemias mieloides — habitualmente como un compañero de translocación con Tel, proteína de interacción con huntingtina (HIP1) o Rabaptina 5. Recientemente se demostró que existen mutaciones de activación en el dominio quinasa de PDGFR-α en tumores del estroma gastrointestinal (TEGI) [Heinrich, MC y col., Sciencexpress, 2003].
Son quinasas dependientes de ciclina (CDK) serina/treonina proteínas quinasas que consisten en un lóbulo amino-terminal rico en lámina β y un lóbulo carboxi-terminal más grande que es en gran medida α-helicoidal. Las CDK presentan los 11 subdominios compartidos por todas las proteínas quinasas y varían en masa molécula de 33 a 44 kD. Esta familia de quinasas, que incluye a CDK1, CKD2, CDK4, y CDK6, requieren la fosforilación en el resto correspondiente al Thr160 de CDK2 para ser totalmente activas [Meijer, L., Drug Resistance Updates 2000, 3, 83-88].
Cada complejo de CDK se forma a partir de una subunidad de ciclina reguladora (por ejemplo, ciclina A, B1, B2, D1, D2, D3 y E) y una subunidad quinasa catalítica (por ejemplo, CDK1, CDK2, CDK4, CDK5 y CDK6). Cada pareja de quinasa/ciclina diferente funciona regulando las fases diferentes y específicas del ciclo celular conocidas como fases G1, S, G2 y M [Nigg, E., Nature Reviews 2001, 2, 21-32; Flatt, P., Pietenpol, J., Drug Metabolism Reviews 2000, 32, 283-305].
Las CDK se han implicado en trastornos de la proliferación celular, particularmente en el cáncer. La proliferación celular es el resultado de la desregulación directa o indirecta del ciclo de división celular, y las CDK desempeñan un papel crítico en la regulación de las diversas fases de este ciclo. Por ejemplo, la sobreexpresión de ciclina D1 se asocia comúnmente con numerosos cánceres humanos, incluyendo carcinomas de mama, colon, hepatocelular y gliomas [Flatt, P., Pietenpol, J., Drug Metabolism Reviews 2000, 32, 283-305]. El complejo de DK2/ciclina E desempeña un papel clave en la progresión desde las fases tempranas G1 a S del ciclo celular, y la sobreexpresión de la ciclina E se ha asociado con diversos tumores sólidos. Por lo tanto, los inhibidores de las ciclinas D1, E o sus CDK asociadas son dianas útiles para la terapia del cáncer [Kaubisch, A., Schwartz, G., The Cancer Journal 2000, 6, 192212].
Las CDK, especialmente CDK2, también desempeñan un papel en la apoptosis y el desarrollo de células T. La CDK2 se ha identificado como un regulador clave de la apoptosis de timocitos [Williams, O., y col, European Journal of Immunology 2000, 709-713]. La estimulación de la actividad quinasa de CDK2 se asocia con la progresión de la apoptosis en timocitos, en respuesta a estímulos específicos. La inhibición de la actividad quinasa de CDK2 bloquea esta apoptosis, dando como resultado la protección de timocitos.
Además de regular el ciclo celular y la apoptosis, las CDK están directamente implicadas en el proceso de transcripción. Numerosos virus requieren CDK para su proceso de replicación. Los ejemplos en los que inhibidores de CDK impiden la replicación viral incluyen citomegalovirus humano, virus herpes y virus varicela-zóster [Meijer, L., Drug Resistance Updates 2000, 3, 83-88].
La inhibición de CDK también es útil para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer. El aspecto de los Filamentos Helicoidales Emparejados (PHF), asociados con la enfermedad de Alzheimer, está causado por la hiperfosforilación de la proteína Tau por CDK5/p25 [Meijer, L., Drug Resistance Updates, 2000 3, 83-88].
Otra familia de quinasas de interés particular es la familia de quinasas de Src. Estas quinasas están implicadas en el cáncer, la disfunción del sistema inmune y las enfermedades de la remodelación ósea. Para revisiones generales, véase Thomas y Brugge, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1997, 13, 513; Lawrence y Niu, Pharmacol. Ther. 1998, 77, 81; Tatosyan y Mizenina, Biochemistry (Moscú) 2000, 65, 49; Boschelli y col., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717, (2000).
Los miembros de la familia de Src incluyen las ocho quinasas siguientes en mamíferos: Src, Fyn, Yes, Fgr, Lyn, Hck, Lck y Blk. Éstas son proteínas quinasas no receptoras que varían en masa molecular de 52 a 62 kD. Todas se caracterizan por una organización estructural común que está compuesta por seis dominios funcionales diferentes: dominio de homología de Src 4 (SH4), un dominio único, dominio SH3, domino SH2, un dominio catalítico (SH1) y una región reguladora C-terminal. Tatosyan y col. Biochemistry (Moscú) 2000, 65, 49-58.
Basándose en los estudios publicados, las Src quinasas se consideran como dianas terapéuticas potenciales para diversas enfermedades humanas. Los ratones deficientes en Src desarrollan osteopetrosis, o acumulación ósea, debido a una resorción ósea reducida por los osteoclastos. Esto sugiere que la osteoporosis resultante de una resorción ósea anormalmente alta puede tratarse inhibiendo la Src. Soriano y col., Cell 1992, 69, 551 y Soriano y col., Cell 1991, 64, 693.
La supresión de la destrucción de hueso artrítico se ha conseguido mediante la sobreexpresión de CSK en sinoviocitos y osteoclastos reumatoides. Takayanagi y col., J. Clin. Invset. 1999, 104, 137. La CSK, o Src quinasa C-terminal, fosforila y por lo tanto inhibe la actividad catalítica de Src. Esto implica que la inhibición de Src puede prevenir la destrucción articular que es característica en pacientes que padecen artritis reumatoide. Boschelli y col., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717.
La Src también desempeña un papel en la replicación del virus de la hepatitis B. El factor de transcripción codificad por virus HBx activa la Src en una etapa necesaria para la propagación del virus. Klein y col., EMBO J. 1999, 18, 5019, y Klein y col., Mol. Cell. Biol. 1997, 17, 6427.
Varios estudios han ligado la expresión de Src a cánceres tales como cáncer de colon, mama, hepático y pancreático, ciertas leucemias y linfomas de células B. Talamonti y col., J. Clin. Invest. 1993, 91, 53; Lutz y col., Biochem. Biophys. Res. 1998 243, 503; Rosen y col., J. Biol. Chem. 1986, 261, 13754; Bolen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84, 2251; Masaki y col, Hepatology 1998, 27, 1257; Biscardi y col., Adv. Cancer Res. 1999, 76, 61; Lynch y col., Leukemia, 1993, 7, 1416. Además, se ha demostrado que la Src antisentido expresada en células tumorales de ovario y colon inhibe el crecimiento tumoral. Wiener y col., Clin. Cancer Res., 1999, 5, 2164; Staley y col., Cell Growth Diff., 1997, 8, 269.
Otras quinasas de la familia de Src también son dianas terapéuticas potenciales. La Lck desempeña un papel en la señalización de células T. Los ratones que carecen del gen de Lck tienen una escasa capacidad para desarrollar timocitos. La función de Lck como activador positivo de la señalización de células T sugiere que los inhibidores de Lck pueden ser útiles para tratar una enfermedad autoinmune tal como la artritis reumatoide. Molina y col., Nature, 1992, 357, 161. Se ha identificado a Hck, Fgr y Lyn como mediadores importantes de la señalización de integrinas en leucocitos mieloides. Lowell y col., J. Leukoc. Biol., 1999, 65, 313. Por lo tanto, la inhibición de estos mediadores de quinasas puede ser útil para tratar la inflamación. Boschelli y col., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717.
Syk es una tirosina quinasa que desempeña un papel crítico en la desgranulación de mastocitos y la activación de eosinófilos mediada por FcεRI. Por consiguiente, la Syk quinasa está implicada en diversos trastornos alérgicos, en particular en el asma. Se ha demostrado que Syk se une a la cadena gamma fosforilada del receptor FcεRI por dominios SH2 N-terminales y es esencial para la señalización aguas abajo [Taylor y col, Mol. Cell. Biol. 1995, 15, 4149].
Se ha propuesto la inhibición de la apoptosis de eosinófilos como mecanismo clave para el desarrollo de eosinofilia sanguínea y tisular en el asma. La IL-5 y el GM-CSF están reguladas positivamente en el asma y se propone que causan la eosinofilia sanguínea y tisular por inhibición de la apoptosis de eosinófilos. La inhibición de la apoptosis de eosinófilos se ha propuesto como un mecanismo clave para el desarrollo de eosinofilia sanguínea y tisular en el asma. Se ha descrito que la Syk quinasa es necesaria para la prevención de la apoptosis de eosinófilos por citocinas (usando antisentido) [Yousefi y col, J Exp Med 1996, 183, 1407].
El papel de Syk en la respuesta dependiente e independiente de FcγR en macrófagos derivados de médula ósea se ha determinado usando quimeras de ratones irradiados reconstituidas con hepatocitos fetales de embriones Syk -/-. Los macrófagos deficientes en Syk presentaban una fagocitosis inducida por FcγR defectuosa, pero mostraban una fagocitosis normal en respuesta al complemento [Kiefer y col, Mol Cell Biol 1998, 18, 4209]. Se ha descrito también que el antisentido de Syk aerosolizado suprime la expresión de Syk y la liberación de mediadores a partir de macrófagos [Stenton y col, J Immunology 2000, 164, 3790].
Las Janus quinasas (JAK) son una familia de tirosina quinasas que consisten en JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. Las JAK desempeñan un papel crítico en la señalización de citocinas. Los sustratos aguas abajo de la familia de quinasas de JAK incluyen las proteínas transductoras de señales y activadoras de la transcripción (STAT). La señalización de JAK/STAT se ha implicado en la mediación de muchas respuestas inmunes anormales tales como alergias, asma, enfermedades autoinmunes tales como rechazo de trasplantes, artritis reumatoide, esclerosis lateral amiotrófica y esclerosis múltiple, así como en tumores malignos sólidos y hematológicos tales como leucemias y linfomas. La intervención farmacéutica en la ruta de JAK/STAT se ha revisado [Frank Mol. Med. 5, 432-456 (1999) y Seidel, y col, Oncogene 19, 2645-2656 (2000)].
JAK1, JAK2 y TYK2 se expresan de forma ubicua, mientras que JAK3 se expresa predominantemente en células hematopoyéticas. JAK3 se une exclusivamente a la cadena gamma del receptor de citocinas común (γc) y se activa por IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15. De hecho, se ha demostrado que la proliferación y supervivencia de mastocitos murinos inducida por IL-4 e IL-9 es dependiente de la señalización de JAK3 y γc [Suzuki y col, Blood 96, 21722180 (2000)].
El entrecruzamiento de los receptores de inmunoglobulina (Ig) E de alta afinidad de mastocitos sensibilizados conduce a una liberación de mediadores proinflamatorios, incluyendo varias citocinas vasoactivas que dan como resultado reacciones alérgicas agudas o de hipersensibilidad inmediata (tipo I) [Gordon y col, Nature 346, 274-276 (1990) y Galli, N. Engl. J. Med., 328, 257-265 (1993)]. Se ha establecido un papel crucial para JAK3 en las respuestas de mastocitos mediadas por receptor de IgE in vitro e in vivo [Malaviya, y col, Biochem. Biophys. Res. Commun. 257, 807-813 (1999)]. Además, también se ha descrito la prevención de las reacciones de hipersensibilidad de tipo I, incluyendo la anafilaxia, mediadas por la activación de mastocitos a través de la inhibición de JAK3 [Malaviya y col, J. Biol. Chem. 274,27028-27038 (1999)]. Dirigirse a mastocitos con inhibidores de JAK3 moduló la desgranulación de mastocitos in vitro y evitó reacciones anafilácticas mediadas por receptor de IgE/antígeno in vivo.
Un estudio reciente describió la dirección con éxito de JAK3 para la supresión inmune y la aceptación de aloinjertos. El estudio demostró una supervivencia dependiente de la dosis del aloinjerto de corazón de Buffalo en destinatarias Wistar Furth tras la administración de inhibidores de JAK3, indicando la posibilidad de regular las respuestas inmunes no deseadas en la enfermedad de injerto contra huésped [Kirken, Transpl. Proc. 33, 3268-3270 (2001)].
La fosforilación de STAT mediada por IL-4 se ha implicado como el mecanismo involucrado en las fases tempranas y tardías de la artritis reumatoide (AR). La regulación positiva de citocinas proinflamatorias en membrana sinovial y líquido sinovial de AR es una característica de la enfermedad. Se ha demostrado que la activación mediada por IL-4 de la ruta de IL-4/STAT está mediada por las Janus quinasas (JAK 1 y 3) y que las JAK quinasas asociadas a IL-4 se expresan en la membrana sinovial de la AR [Muller-Ladner, y col, J. Immunol. 164, 3894-3901 (2000)].
Las esclerosis lateral amiotrófica familiar (ELAF) es un trastorno neurodegenerativo mortal que afecta a aproximadamente el 10% de los pacientes de ELA. Los índices de supervivencia de ratones con ELAF se aumentaron tras el tratamiento con un inhibidor específico de JAK3. Esto sugirió que JAK3 desempeña un papel en la ELAF [Trieu, y col, Biochem. Biophys. Res. Commun. 267, 22-25 (2000)].
Las proteínas transductoras de señales y activadoras de la transcripción (STAT) se activan, entre otras, por las quinasas de la familia de JAK. Resultados de un estudio reciente sugirieron la posibilidad de intervención en la ruta de señalización de JAK/STAT mediante la dirección de quinasas de la familia de JAK con inhibidores específicos para el tratamiento de la leucemia [Sudbeck, y col, Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582 (1999)]. Se demostró que compuestos específicos de JAK3 inhibían el crecimiento clonogénico de las líneas celulares que expresan JAK3 DAUDI, RAMOS, LC1;19, NALM-6, MOLT-3 y HL-60.
En modelos animales, proteínas de fusión de TEL/JAK2 han inducido trastornos mieloproliferativos y, en líneas celulares hematopoyéticas, la introducción de TEL/JAK2 dio como resultado la activación de STAT1, STAT3, STAT5 y el crecimiento independiente de citocinas [Schwaller, y col, EMBO J. 17, 5321-5333 (1998)].
La inhibición de JAK 3 y TYK 2 anuló la fosforilación de tirosina de STAT3 e inhibió el crecimiento celular de la micosis fungoide, una forma cutánea de linfoma de células T. Estos resultados implicaron a quinasas de la familia de JAK en la ruta de JAK/STAT activada de forma constitutiva, que están presentes en la micosis fungoide [Nielsen, y col, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6764-6769 (1997)]. De forma similar, se demostró que STAT3, STAT5, JAK1 y JAK2 estaban constitutivamente activadas en el linfoma de células T en ratón, caracterizado inicialmente por una sobreexpresión de LCK, implicando por lo tanto además a la ruta de JAK/STAT en el crecimiento celular anormal [Yu, y col, J. Immunol. 159, 5206-5210 (1997)]. Además, la activación de STAT3 mediada por IL-6 se bloqueó mediante un inhibidor de JAK, conduciendo a la sensibilización de células de mieloma a la apoptosis [Catlett-Falcone, y col, Immunity 10, 105-115 (1999)].
Una familia de quinasas de interés es la proteína serina/treonina quinasa formadora de superenrollamientos asociados a Rho (ROCK), que se cree que es un efector de la GTPasa Rho pequeña relacionada con Ras. La familia ROCK incluye p160ROCK (ROCK-1) (Ishizaki y col., EMBO J. 1996, 15, 1885-1893) y ROKα/Rho-quinasa/ROCK-II (Leung y col., J. Biol. Chem. 1995, 270, 29051-29054; Matsui y col., EMBO J. 1996, 15, 2208-2216; Nakagawa y col., FEBS Lett. 1996, 392, 189-193), proteína quinasa PKN (Amano y col., Science 1996, 271, 648650; Watanabe y col., Science 1996, 271, 645-648) y citron y citron quinasa (Madaule y col. Nature, 1998, 394, 491-494; Madaule y col., FEBS Lett. 1995, 377, 243-248). Se ha demostrado que la familia de quinasas ROCK está implicada en una diversidad de funciones incluyendo la formación inducida por Rho de fibras de tensión de actina y adhesiones focales (Leung y col., Mol. Cell Biol. 1996, 16, 5313-5327; Amano y col., Science, 1997, 275, 13081311; Ishizaki y col., FEBS Lett. 1997, 404, 118-124) y en la regulación negativa de la miosina fosfatasa (Kimura y col., Science, 1996, 273, 245-248), la activación de plaquetas (Klages y col., J. Cell. Biol., 1999, 144, 745-754), la contracción del músculo liso aórtico por diversos estímulos (Fu y col., FEBS Lett., 1998, 440, 183-187); las respuestas inducidas por trombina de células musculares lisas aórticas (Seasholtz y col., Cir. Res., 1999, 84, 1186-1193), la hipertrofia de cardiomiocitos (Kuwahara y col., FEBS Lett., 1999, 452, 314-318), la contracción del músculo liso bronquial (Yoshii y col., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1999, 20, 1190-1200), la contracción del músculo liso y la reorganización citoesquelética de células no musculares (Fukata y col., Trends en Pharm. Sci 2001, 22, 32-39), la activación de canales aniónicos regulados por volumen (Nilius y col., J. Physiol., 1999, 516, 67-74), la retracción de neuritas (Hirose y col., J. Cell. Biol., 1998, 141, 1625-1636), la quimiotaxis de neutrófilos (Niggli, FEBS Lett., 1999, 445, 69-72), la cicatrización de heridas (Nobes y Hall, J. Cell. Biol., 1999, 144, 1235-1244), la invasión tumoral (Itoh y col., Nat. Med., 1999, 5, 221-225) y la transformación celular (Sahai y col., Curr. Biol., 1999, 9, 136-145). Más específicamente, se ha implicado a ROCK en diversas enfermedades y trastornos incluyendo hipertensión (Satoh y col., J. Clin. Invest. 1994, 94, 1397-1403; Mukai y col., FASEB J. 2001, 15, 1062-1064; Uehata y col., Nature 1997, 389, 990-994; Masumoto y col., Hypertension, 2001, 38, 1307-1310), vasoespasmo cerebral (Sato y col., Circ. Res. 2000, 87, 195-200; Miyagi y col., J. Neurosurg. 2000, 93, 471-476; Tachibana y col., Acta Neurochir (Wien) 1999, 141, 13-19), vasoespasmo coronario (Shimokawa y col., Jpn. Cir. J. 2000, 64, 1-12; Kandabashi y col., Circulation 2000, 101, 1319-1323; Katsumata y col., Circulation 1997, 96, 4357-4363; Shimokawa y col., Cardiovasc. Res. 2001, 51, 169-177; Utsunomiya y col., J. Pharmacol. 2001, 134, 1724-1730; Masumoto y col., Circulation 2002, 105, 1545-1547), asma bronquial (Chiba y col., Comp. Biochem. Physiol. C Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1995, 11, 351-357; Chiba y col., Br. J. Pharmacol. 1999, 127, 597-600; Chiba y col., Br. J. Pharmacol. 2001, 133, 886-890; Iizuka y col., Eur. J. Pharmacol. 2000, 406, 273-279), parto prematuro (Niro y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997, 230, 356-359; Tahara y col., Endocrinology 2002, 143, 920-929; Kupittayanant y col., Pflugers Arch. 2001, 443, 112-114), disfunción eréctil (Chitaley y col., Nat. Med. 2001, 7, 119-122; Mills y col., J. Appl. Physiol. 2001, 91, 1269-1273), glaucoma (Honjo y col., Arch. Ophtalmol. 2001, 1171-1178; Rao y col., Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 2001, 42, 10291037), proliferación de células musculares lisas vasculares (Shimokawa y col., Cardiovasc. Res. 2001, 51, 169-177; Morishige y col., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2001, 21, 548-554; Eto y col., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000, 278, H1744-H1750; Sawada y col., Circulation 2000, 101, 2030-2023; Shibata y col., Circulation 2001, 103, 284-289), hipertrofia miocárdica (Hoshijima y col., J. Biol. Chem. 1998, 273, 7725-77230; Sah y col., J. Biol. Chem. 1996, 271, 31185-31190; Kuwahara y col., FEBS Lett.1999, 452, 314-318; Yanazume y col., J. Biol. Chem. 2002, 277, 8618-8625), malignoma (Itoh y col., Nat. Med. 1999, 5, 221-225; Genda y col., Hepatology 1999, 30, 1027-1036; Somlyo y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 269, 652-659), lesión inducida por isquemia/reperfusión (Ikeda y col., J. of Surgical Res. 2003, 109, 155-160; Miznuma y col. Transplantation 2003, 75, 579-586), disfunción endotelial (Hernandez-Perera y col., Circ. Res. 2000, 87, 616-622; Laufs y col., J. Biol. Chem. 1998, 273, 24266-24271; Eto y col., Circ. Res. 2001, 89, 583-590), enfermedad de Crohn y colitis (Segain y col. Gastroenterology 2003, 124(5), 1180-1187), extensión de neuritas (Fournier y col. J. Neurosci. 2003, 23, 1416-1423), enfermedad de Raynaud (Shimokawa y col. J. Cardiovasc. Pharmacol. 2002, 39, 319-327) y aterosclerosis (Retzer y col. FEBS Lett. 2000, 466, 70-74; Ishibashi y col. Biochim. Biophys. Acta 2002, 1590, 123-130). Por consiguiente, el desarrollo de inhibidores de ROCK quinasas sería útil como agentes terapéuticos para el tratamiento de trastornos implicados en la ruta de ROCK quinasas.
La ERK2 (quinasa regulada por señales extracelulares) es un miembro de la familia de proteínas activadas por mitógeno (MAP) 1 quinasas de mamífero. Las (MAP)1 quinasas son serina/treonina quinasas que median rutas de transducción de señales intracelulares (Cobb y Goldsmith, J Biol. Chem., 1995, 270, 14843; Davis, Mol. Reprod. Dev. 1995, 42, 459) y se activan por mitógenos y factores de crecimiento (Bokemeyer y col., Kidney Int. 1996, 49, 1187). Los miembros de la familia de MAP quinasas comparten similitud de secuencia y dominios estructurales conservados y, además de ERK2, incluyen las JNK (quinasa Jun N-terminal) y p38 quinasas. Las JNK y p38 quinasas se activan en respuesta a las citocinas proinflamatorias TNF-alfa e interleucina-1, y por agresiones celulares tales como choque térmico, hiperosmolaridad, radiación ultravioleta, lipopolisacáridos e inhibidores de la síntesis de proteínas (Derijard y col., Cell 1994, 76, 1025; Han y col., Science 1994, 265, 808; Raingeaud y col., J Biol. Chem. 1995, 270, 7420; Shapiro y Dinarello, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 12230). Por el contrario, las ERK se activan por mitógenos y factores de crecimiento (Bokemeyer y col., Kidney Int. 1996, 49, 1187).
La ERK2 es una proteína quinasa ampliamente distribuida que alcanza una actividad máxima cuando tanto el Thr183 como el Tyr185 se fosforilan por la MAP quinasa aguas arriba, MEK1 (Anderson y col., Nature 1990, 343, 651; Crews y col., Science 1992, 258, 478). Tras la activación, la ERK2 fosforila muchas proteínas reguladoras, incluyendo las proteínas quinasas Rsk90 (Bjorbaek y col., J. Biol. Chem. 1995, 270, 18848) y MAPKAP2 (Rouse y col., Cell 1994, 78, 1027) y factores de transcripción tales como ATF2 (Raingeaud y col., Mol. Cell Biol. 1996, 16, 1247), Elk-1 (Raingeaud y col., Mol. Cell Biol 1996, 16, 1247), c-Fos (Chen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 10952) y c-Myc (Oliver y col., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1995, 210, 162). La ERK2 también es una diana aguas debajo de las rutas dependientes de Ras/Raf (Moodie y col., Science 1993, 260, 1658) y puede ayudar a transmitir las señales de estas proteínas potencialmente oncogénicas. Se ha demostrado que la ERK2 desempeña un papel en el control de crecimiento negativo de células de cáncer de mama (Frey y Mulder, Cancer Res. 1993, 57, 628) y se ha descrito la hiperexpresión de ERK2 en cáncer de mama humano (Sivaraman y col., J Clin. Invest. 1997, 99, 1478). La ERK2 activada también se ha implicado en la proliferación de células musculares lisas de las vías respiratorias estimulada por endotelina, sugiriendo un papel para esta quinasa en el asma (Whelchel y col., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1997, 16, 589).
La glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3) es una serina/treonina proteína quinasa compuesta por isoformas α y β que están cada una codificadas por distintos genes [Coghlan y col., Chemistry y Biology 2000, 7, 793-803; y Kim y Kimmel, Curr. Opinion Genetics Dev., 2000 10, 508-514]. La GSK-3 se ha implicado en diversas enfermedades incluyendo diabetes, enfermedad de Alzheimer, trastornos del SNC, tales como trastorno maniaco-depresivo y enfermedades neurodegenerativas, e hipertrofia de cardiomiocitos [Solicitudes PCT Nº: WO 99/65897 y WO 00/38675; y Haq y col., J. Cell Biol. 2000, 151, 117-130]. Estas enfermedades están asociadas con el funcionamiento anormal de ciertas rutas de señalización celular en las que la GSK-3 desempeña un papel. Se ha descubierto que la GSK-3 fosforila y modula la actividad de varias proteínas reguladoras. Estas proteínas incluyen la glucógeno sintasa, que es la enzima limitante de la velocidad necesaria para la síntesis de glucógeno, la proteína asociada a microtúbulos Tau, el factor de transcripción génica β-catenina, el factor de inicio de la traducción e1F2B, así como la ATP citrato liasa, axina, factor de choque térmico-1, c-Jun, cmyc, c-myb, CREB y CEPBα. Estas diversas dianas proteicas implican a GSK-3 en muchos aspectos del metabolismo, la proliferación, la diferenciación y el desarrollo celular.
En una ruta mediada por GSK-3 que es relevante para el tratamiento de la diabetes de tipo II, la señalización inducida por insulina conduce a la captación de glucosa celular y a la síntesis de glucógeno. A lo largo de esta ruta, la GSK-3 es un regulador negativo de la señal inducida por insulina. Normalmente, la presencia de insulina causa la inhibición de la fosforilación y desactivación de la glucógeno sintasa mediada por GSK-3. La inhibición de GSK-3 conduce a una síntesis de glucógeno y una captación de glucosa aumentadas [Klein y col., PNAS 1996, 93, 8455-8459; Cross y col., Biochem. J. 1994, 303, 21-26); Cohen, Biochem. Soc. Trans. 1993, 21, 555-567; y Massillon y col., Biochem J. 1994, 299, 123-128]. Sin embargo, en un paciente diabético, en el que la respuesta a la insulina está alterada, la síntesis de glucógeno y la captación de glucosa no pueden aumentar a pesar de la presencia de niveles de insulina en sangre relativamente altos. Esto conduce a niveles de glucosa en sangre anormalmente elevados con efectos agudos y a largo plazo que pueden dar como resultado en última instancia una enfermedad cardiovascular, insuficiencia renal y ceguera. En dichos pacientes, no se produce la inhibición inducida por insulina normal de la GSK-3. Se ha descrito también que en pacientes con diabetes de tipo II, la GSK-3 está sobreexpresada [véase la Solicitud PCT: WO 00/38675]. Por lo tanto, los inhibidores terapéuticos de GSK-3 son potencialmente útiles para tratar a pacientes diabéticos que padecen una respuesta alterada a la insulina.
La actividad de GSK-3 también está asociada con la enfermedad de Alzheimer. Esta enfermedad se caracteriza por el bien conocido péptido β-amiloide y la formación de ovillos neurofibrilares intracelulares. Los péptidos Aβ proceden de la proteína precursora de amiloide (APP) por proteolisis secuencial, catalizada por la aspartilo proteasa BACE2, seguida de escisión de γ-secretasa dependiente de presenilina. Se ha demostrado que los anticuerpos contra placas de β-amiloide pueden ralentizar el deterioro cognitivo en pacientes con enfermedad de Alzheimer (Hock y col., Neuron, 2003, 38, 547-554) y, por lo tanto, otras estrategias de disminución de los niveles de β-amiloide (por ejemplo, el desarrollo de agentes capaces de inhibir el péptido β-amiloide) serían útiles en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, y otros trastornos psicóticos y neurodegenerativos. Además, los ovillos neurofibrilares contienen proteína Tau hiperfosforilada, en los que la Tau está fosforilada en sitios anormales y, por lo tanto, los agentes capaces de inhibir la hiperfosforilación de la proteína Tau serían útiles en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos y psicóticos.
Se sabe que la GSK-3 fosforila estos sitios anormales en modelos celulares y animales. Además, se ha demostrado que la inhibición de GSK-3 evita la hiperfosforilación de Tau en células [Lovestone y col., Current Biology 1994, 4, 1077-86; y Brownlees y col., Neuroreport 1997, 8, 3251-55]. Por lo tanto, la actividad de GSK-3 promueve la generación de los ovillos neurofibrilares y la progresión de la enfermedad de Alzheimer.
Se ha demostrado también que la GSK-3 facilita el procesamiento de APP y que un inhibidor de GSK-3 (litio) inhibe la generación de péptidos Aβ a través de la inhibición de GSK-3 (Phiel y col. Nature 2003, 423, 435-439). Por lo tanto, el desarrollo de inhibidores de GSK-3 sería útil para la reducción de la formación de placas amiloides y ovillos neurofibrilares, los distintivos patológicos de la Enfermedad de Alzheimer, y también sería útil para el tratamiento de otros trastornos psicóticos y neurodegenerativos.
Otros sustrato de GSK-3 es la β-catenina, que se degrada después de la fosforilación por GSK-3. Se han descrito niveles reducidos de β-catenina en pacientes esquizofrénicos y también se han asociado con otras enfermedades relacionadas con un aumento de la muerte de células neuronales [Zhong y col., Nature 1998, 395, 698-702; Takashima y col., PNAS 1993, 90, 7789-93; y Pei y col., J. Neuropathol. Exp 1997, 56, 70-78].
La actividad de GSK-3 también está asociada con el ictus [Wang y col., Brain Res 2000, 859, 381-5; Sasaki y col., Neurol Res 2001, 23, 588-92; Hashimoto y col., J. Biol. Chem 2002, 277, 32985-32991].
La subfamilia de quinasas de AGC fosforila sus sustratos en restos de serina y treonina y participa en una diversidad de procesos de señalización bien conocidos incluyendo, pero sin limitación, la señalización del AMP cíclico, la respuesta a la insulina, la protección frente a la apoptosis, la señalización del diacilglicerol y el control de la traducción de proteínas (Peterson y col., Curr. Biol. 1999, 9, R521). Esta subfamilia incluye a PKA, PKB (c-Akt), PKC, PRK1, 2, p70S6K y PDK.
La AKT (también conocida como PKB o Rac-PK beta), una serina/treonina proteína quinasa, se ha demostrado que está sobreexpresada en varios tipos de cáncer y es un mediador de funciones celulares normales [(Khwaja, A., Nature 1999, 401, 33-34); (Yuan, Z. Q., y col., Oncogene 2000, 19, 2324-2330); (Namikawa, K., y col., J Neurosci. 2000, 20, 28752886,)]. La AKT comprende un dominio de homología de pleckstrina N-terminal (PH), un domino quinasa y una región de “cola” C-terminal. Se han descrito hasta ahora tres isoformas de la AKT quinasa humana (AKT-1, 2 y 3) [(Cheng, J. Q., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 9267-9271); (Brodbeck, D. y col., J. Biol. Chem. 1999, 274, 9133-9136)]. El dominio PH se une a 3-fosfoinosítidos que se sintetizan por la fosfatidil inositol 3-quinasa (PI3K) tras la estimulación por factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento nervioso (NGF) y factor de crecimiento tipo insulina (IGF-1) [(Kulik y col., Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 1595-1606,); (Hemmings, B. A., Science, 1997, 275, 628-630)]. La unión de lípidos al dominio PH promueve la translocación de AKT a la membrana plasmática y facilita la fosforilación por otras proteínas quinasas que contienen dominios PH, PDK1 en Thr308, Thr309 y Thr305 para las isoformas de AKT 1, 2 y 3, respectivamente. Una segunda quinasa, todavía desconocida, es necesaria para la fosforilación de Ser473, Ser474 o Ser472 en las colas C-terminales de AKT-1, 2 y 3, respectivamente, para dar una enzima AKT totalmente activada.
Una vez localizada en la membrana, la AKT media varias funciones dentro de la célula incluyendo los efectos metabólicos de la insulina (Calera, M. R. y col., J. Biol. Chem. 1998, 273, 7201-7204), la inducción de diferenciación y/o proliferación, la síntesis de proteína y respuestas a agresiones (Alessi, D. R. y col., Curr. Opin. Genet. Dev. 1998, 8, 55-62).
Las manifestaciones de una regulación de AKT alterada aparecen tanto en lesiones como en enfermedades, siendo su papel más importante en el cáncer. La primera consideración de la AKT fue en asociación con carcinomas ováricos humanos, en los que se descubrió que la expresión de AKT estaba amplificada en el 15% de los casos (Cheng, J. Q. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.1992, 89, 9267-9271). También se ha descubierto que está sobreexpresada en el 12% de los cánceres pancreáticos (Cheng, J. Q. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996, 93, 3636-3641). Se demostró que la AKT-2 estaba sobreexpresada en el 12% de los carcinomas ováricos y que la amplificación de AKT era especialmente frecuente en el 50% de los tumores no diferenciados, sugiriendo que la AKT también puede estar asociada con agresividad tumoral (Bellacosa, y col., Int. J. Cancer 1995, 64, 280-285).
Se ha demostrado que la PKA (también conocida como proteína quinasa dependiente de AMPc) regula muchas funciones vitales incluyendo el metabolismo energético, la transcripción génica, la proliferación, la diferenciación, la función reproductora, la secreción, la actividad neuronal, la memoria, la contractilidad y la motilidad (Beebe, S. J., Semin. Cancer Biol. 1994, 5, 285-294). La PKA es una holoenzima tetramérica que contiene dos unidades catalíticas unidas a una subunidad reguladora homodimérica (que actúa inhibiendo las subunidades catalíticas). Tras la unión de AMPc (activación enzimática), las subunidades catalíticas se disocian de las subunidades reguladoras para dar la serina/treonina quinasa activa (McKnight, G. S. y col., Recent Prog. Honn. Res. 1988, 44, págs. 307). Se han descrito hasta la fecha tres isoformas de la subunidad catalítica (C-α, C-β y C-γ) (Beebe, S. J. y col., J. Biol. Chem. 1992, 267, 25505-25512), siendo la subunidad C-α la más ampliamente estudiada, principalmente debido a su elevada expresión en melanomas primarios y metastásicos (Becker,
D. y col., Oncogene 1990, 5, 1133). Hasta la fecha, las estrategias para modular la actividad de la subunidad C-α implican el uso de anticuerpos, moléculas que bloquean la actividad de PKA dirigiéndose a dímeros reguladores y expresión de oligonucleótidos antisentido.
Las proteínas quinasas ribosómicas p70S6K-1 y 2 también son miembros de la subfamilia de proteínas quinasas de AGC y catalizan la fosforilación y posterior activación de la proteína ribosómica S6, que se ha implicado en la regulación positiva de la traducción de ARNm que codifican los componentes del aparato sintético proteico. Estos ARNm contienen un tracto de oligopirimidina en su sitio de inicio de la transcripción 5’, denominado 5”TOP, que se ha demostrado que es esencial para su regulación a nivel de traducción (Volarevic, S. y col., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001, 65, 101-186). La fosforilación de S6 dependiente de p70S6K se estimula en respuesta a una diversidad de hormonas y factores de crecimiento, principalmente por la ruta de PI3K (Coffer, P. J. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun, 1994 198, 780-786), que pueden estar bajo la regulación de mTOR, puesto que la rapamicina actúa inhibiendo la actividad de p70S6K y bloquea la síntesis de proteína, especialmente como resultado de una regulación negativa de la traducción de estos ARNm que codifican proteínas ribosómicas (Kuo, C. J. y col., Nature 1992, 358, 70-73).
In vitro, la PDK1 cataliza la fosforilación de Thr252 en el bucle de activación del dominio catalítico de p70, que es indispensable para la actividad de p70 (Alessi, D. R., Curr. Biol., 1998, 8, 69-81). El uso de rapamicina y estudios de deleción génica de dp70S6K de Drosophila y p70S6K1 de ratón han establecido el papel central que desempeña p70 en la señalización tanto del crecimiento como de la proliferación celular.
La proteína quinasa 1 dependiente de 3-fosfoinosítido (PDK1) desempeña un papel clave en la regulación de la actividad de varias quinasas que pertenecen a la subfamilia de proteínas quinasas de AGC (Alessi, D. y col., Biochem. Soc. Trans 2001, 29, 1). Éstas incluyen isoformas de proteína quinasa B (PKB, también conocida como AKT), quinasa S6 ribosómica p70 (S6K) (Avruch, J. y col., Prog. Mol. Subcell. Biol. 2001, 26, 115) y quinasa S6 ribosómica p90 (Frödin, M. y col., EMBO J. 2000, 19, 2924-2934). La señalización mediada por PDK1 se activa en respuesta a la insulina y a factores de crecimiento, y como consecuencia de la unión de la célula a la matriz extracelular (señalización de integrina). Una vez activadas estas enzimas median muchos acontecimientos celulares diversos por fosforilación de proteínas reguladoras clave que desempeñan papeles importantes en el control de procesos tales como la supervivencia, crecimiento y proliferación celular, y la regulación de la glucosa [(Lawlor, M. A. y col., J. Cell Sci. 2001, 114, 2903-2910), (Lawlor, M. A. y col., EMBO J. 2002, 21, 3728-3738)]. La PDK1 es una proteína de 556 aminoácidos con un dominio catalítico N-terminal y un domino de homología de pleckstrina C-terminal (PH), que activa sus sustratos fosforilando estas quinasas en su bucle de activación (Belham, C. y col., Curr. Biol. 1999, 9, R93-R96). Muchos cánceres humanos, incluyendo el de próstata y el pulmonar no microcítico (PNM), tienen una función de la ruta de señalización de PDK1 elevada como resultado de varios acontecimientos genéticos diferentes tales como mutaciones PATEN o sobreexpresión de ciertas proteínas reguladoras clave [(Graff, J. R., Expert Opin. Ther. Targets 2002, 6, 103-113), (Brognard, J., y col., Cancer Res. 2001, 61, 3986-3997)]. La inhibición de PDK1 como mecanismo potencial para tratar el cáncer se demostró por transfección de una línea celular de cáncer humano negativa para PTEN (U87MG) con oligonucleótidos antisentido dirigidos contra PDK1. La disminución resultante en los niveles de proteína PDK1 condujo a una reducción en la proliferación y supervivencia celular (Flynn, P., y col., Curr. Biol. 2000, 10, 1439-1442). Por consiguiente, el diseño de inhibidores del sitio de unión a ATP de PDK1 ofrece, entre otros tratamientos, una diana atractiva para la quimioterapia del cáncer.
La diversa variedad de genotipos de células cancerosas se ha atribuido a la manifestación de las seis alteraciones esenciales siguientes en la fisiología celular: autosuficiencia en la señalización de crecimiento, evasión de la apoptosis, insensibilidad a la señalización inhibidora del crecimiento, potencial replicativo ilimitado, angiogénesis sostenida e invasión tisular que conduce a metástasis (Hanahan, D. y col., Cell 2000, 100, 57-70). La PDK1 es un mediador crítico de la ruta de señalización de PI3K que regula una multitud de funciones celulares incluyendo el crecimiento, la proliferación y la supervivencia. Por consiguiente, la inhibición de esta ruta podría afectar a cuatro o más de los seis requisitos que definen la progresión del cáncer. Como tal, se espera que un inhibidor de PDK1 tenga un efecto sobre el crecimiento de una variedad muy amplia de cánceres humanos.
En concreto, los niveles aumentados de la actividad de la ruta de PI3K se han asociado directamente con el desarrollo de varios cánceres humanos, la progresión a un estado resistente a tratamiento agresivo (resistencia adquirida a quimioterapias) y un mal pronóstico. Esta actividad aumentada se ha atribuido a una serie de acontecimientos clave incluyendo una actividad disminuida de reguladores negativos de la ruta, tales como la fosfatasa PTEN, mutaciones activantes de reguladores positivos de la ruta, tales como Ras, y sobreexpresión de componentes de la propia ruta, tales como PKB, incluyendo los ejemplos: cerebro (gliomas), mama, colon, cabeza y cuello, riñón, pulmón, hígado, melanoma, ovario, pancreático, de próstata, sarcoma, tiroideo [(Teng, D. H. y col., Cancer Res., 1997 57, 5221-5225), (Brognard,
J. y col., Cancer Res., 2001, 61, 3986-3997), (Cheng, J. Q. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, 93, 3636-3641), (Int. J. Cancer 1995, 64, 280), (Graff, J. R., Expert Opin. Ther. Targets 2002, 6, 103-113), (Am. J. Pathol. 2001, 159, 431)].
Además, se ha demostrado que una disminución en la función de la ruta a través de anulación génica, reducción de la expresión génica, estudios negativos dominantes e inhibidores de bajo peso molecular de la ruta, revierte muchos de los fenotipos cancerosos in vitro (algunos estudios también han demostrado un efecto similar in vivo), tal como bloquear la proliferación, reducir la viabilidad y sensibilizar a las células cancerosas a quimioterapias conocidas en una serie de líneas celulares, que representan los cánceres siguientes: pancreático [(Cheng, J. Q. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, 93, 3636-3641), (Neoplasia 2001, 3, 278)], pulmonar [(Brognard, J. y col., Cancer Res. 2001, 61, 3986-3997), (Neoplasia 2001, 3, 278)], ovárico [(Hayakawa, J. y col., Cancer Res. 2000, 60, 5988-5994), (Neoplasia 2001, 3, 278)], de mama (Mol. Cancer Ther. 2002, 1, 707), de colon [(Neoplasia 2001, 3, 278), (Arico, S. y col., J. Biol. Chem. 2002, 277, 27613-27621)], cervical (Neoplasia 2001, 3, 278), de próstata [(Endocriniology 2001, 142, 4795), (Thakkar, H. y col. J. Biol. Chem. 2001, 276, 38361-38369), (Chen, X. y col., Oncogene 2001, 20, 6073-6083)] y cerebral (glioblastomas) [(Flynn, P. y col., Curr. Biol. 2000, 10, 1439-1442)].
Por consiguiente, existe la gran necesidad de desarrollar inhibidores de las proteínas quinasas FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK, que son útiles en el tratamiento de diversas enfermedades o afecciones asociadas con la activación de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK, dados particularmente los tratamientos inadecuados actualmente disponibles para la mayoría de estos trastornos. SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Se ha descubierto a hora que los compuestos de la presente invención, y composiciones farmacéuticamente aceptables de los mismos, son eficaces como inhibidores de quinasas. En ciertas realizaciones, estos compuestos son eficaces como inhibidores de las proteínas quinasas PLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK. En otras
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20
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30
17
realizaciones, estos compuestos son eficaces como inhibidores de proteínas quinasas FLT-3 y/o c-KIT. Estos compuestos tienen la fórmula general A, definida más restrictivamente en las reivindicaciones:
imagen1
en la que R1, R3, R4, R5, R6 y R7 son como se describen a continuación.
Estos compuestos y composiciones farmacéuticas de los mismos son útiles para tratar o prevenir una diversidad de trastornos, incluyendo, pero sin limitación, cardiopatía, diabetes, enfermedad de Alzheimer, trastornos de inmunodeficiencia, enfermedades inflamatorias, hipertensión, enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunes, trastornos óseos destructivos tales como osteoporosis, trastornos proliferativos, enfermedades infecciosas, enfermedades mediadas inmunológicamente y enfermedades víricas. Las composiciones también son útiles en procedimientos para prevenir la muerte celular y la hiperplasia y, por lo tanto, pueden usarse para tratar o prevenir la isquemia/reperfusión en el ictus, ataques cardiacos e hipoxia orgánica. Las composiciones también son útiles en procedimientos para prevenir la agregación plaquetaria inducida por trombina. Las composiciones son especialmente útiles para trastornos tales como leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia promielocítica aguda (LPA), artritis reumatoide, asma, artrosis, isquemia, cáncer ((incluyendo, pero sin limitación, cáncer de ovario, cáncer de mama y cáncer endometrial), hepatopatía incluyendo isquemia hepática, cardiopatía tal como infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca congestiva, afecciones inmunes patológicas que implican la activación de células T y trastornos neurodegenerativos. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los compuestos de la presente invención incluyen los descritos en general anteriormente y se ilustran adicionalmente mediante las clases, subclases y especies desveladas en le presente documento. Como se usan en el presente documento, las siguientes definiciones serán aplicables a menos que se indique otra cosa. Para los fines de la presente invención, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75ª Ed. Además, se describen los principios generales de la química orgánica en “Organic Chemistry”, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, y “March’s Advanced Organic Chemistry”, 5ª Ed., Ed.: Smith, M. B. y March, J., John Wiley & Sons, Nueva York: 2001, cuyo contenido completo
se incorpora en el presente documento por referencia.
Como se describe en el presente documento, los compuestos de la invención pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, tales como los ilustrados anteriormente de forma general, o como se ejemplifica por las clases, subclases y especies particulares de la invención. Se apreciará que la frase "opcionalmente sustituido" se usa indistintamente con la frase "sustituido o sin sustituir". En general, el término "sustituido", esté o no precedido del término "opcionalmente", se refiere al reemplazo de radicales hidrógeno en una estructura dada con el radical de un sustituyente especificado. A menos que se indique otra cosa, un grupo opcionalmente sustituido puede tener un sustituyente en cada posición sustituible del grupo, y cuando más de una posición en cualquier estructura dada puede estar sustituida con más de un sustituyente seleccionado entre un grupo especificado, el sustituyente puede ser igual o diferente en cada posición. Las combinaciones de sustituyentes previstas por la presente invención son preferentemente las que dan como resultado la formación de compuestos estables o químicamente factibles. El término "estable", como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos que no se alteran sustancialmente cuando se someten a condiciones que permiten su producción, detección y, preferentemente, su recuperación, purificación y uso para uno o más de los propósitos desvelados en el presente documento. En algunas realizaciones, un compuesto estable o químicamente factible es uno que no se altera sustancialmente cuando se mantiene a una temperatura de 40ºC o menos, en ausencia de humedad u otras condiciones reactivas, durante al menos una semana.
El término "alifático" o "grupo alifático", como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena de hidrocarburo lineal (es decir, sin ramificar) o ramificada, sustituida o sin sustituir, que está completamente saturada o que contiene una o más unidades de insaturación, o un hidrocarburo monocíclico o hidrocarburo bicíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático (también denominado en el presente documento "carbociclo", "cicloalifático" o "cicloalquilo"), que tiene un solo punto de unión con el resto de la molécula. A menos que se especifique otra cosa, los grupos alifáticos contienen 1-20 átomos de carbono alifáticos. En algunas realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-10 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-8 átomos de carbono alifáticos. Aún en otras realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-6 átomos de carbono alifáticos, y todavía en otras realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-4 átomos de carbono alifáticos. En algunas realizaciones, "cicloalifático" (o "carbociclo" o "cicloalquilo") se refiere a un hidrocarburo C3-C8 monocíclico o a un hidrocarburo C8-C12 bicíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático, que tiene un solo punto de unión con el resto de la molécula, y en el que cualquier anillo individual en dicho sistema de anillos bicíclico tiene 3-7 miembros. Los grupos alifáticos adecuados incluyen, pero sin limitación, grupos alquilo, alquenilo y alquinilo sustituidos o sin sustituir, lineales o ramificados, e híbridos de los mismos, tales como (cicloalquil)alquilo, (cicloalquenil)alquilo o (cicloalquil)alquenilo.
El término "heteroalifáitco", como se usa en el presente documento, se refiere a grupos alifáticos en los que de uno a dos átomos de carbono están independientemente reemplazados por uno o más de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio. Los grupos heteroalifáticos pueden estar sustituidos o sin sustituir, ser ramificados o no ramificados, cíclicos o acíclicos, e incluyen grupos "heterociclo", "heterociclilo", "heterocicloalifático" o "heterocíclicos".
El término "heterociclo", "heterociclilo", "heterocicloalifático" o "heterocíclico", como se usa en el presente documento, se refiere a sistemas de anillos monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos, no aromáticos, en los que uno o más miembros del anillo son un heteroátomo seleccionado independientemente. En algunas realizaciones, el grupo "heterociclo", "heterociclilo", "heterocicloalifático" o "heterocíclico" tiene de tres a catorce miembros de anillo, en el que uno o más miembros es un heteroátomo seleccionado independientemente entre oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo, y cada anillo del sistema contiene de 3 a 7 miembros de anillo.
El término "heteroátomo" se refiere a uno o más de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio (incluyendo cualquier forma oxidada de nitrógeno, azufre, fósforo o silicio; la forma cuaternizada de cualquier nitrógeno básico; o un nitrógeno sustituible de un anillo heterocíclico, por ejemplo N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo) o NR+ (como en pirrolidinilo N-sustituido)).
El término "insaturado", como se usa en el presente documento, significa que un resto tiene una o más unidades de insaturación.
El término "alcoxi" o "tioalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo, como se ha definido previamente, unido a la cadena de carbono principal a través de un átomo de oxígeno ("alcoxi") o azufre ("tioalquilo").
Las expresiones "haloalquilo", "haloalquenilo" y "haloalcoxi" se refieren a alquilo, alquenilo o alcoxi, como puede ser el caso, sustituido con uno o más átomos de halógeno. El término "halógeno" se refiere a F, Cl, Br o I.
El término "arilo", usado solo o como parte de un resto mayor, como en "aralquilo", "aralcoxi" o "ariloxialquilo", se refiere a sistemas de anillos monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos que tienen un total de cinco a ocho miembros de anillo, en los que al menos un anillo del sistema es aromático y en los que cada anillo del sistema contiene de 3 a 7 miembros de anillo.
El término "arilo" puede usarse indistintamente con el término "anillo arilo". El término "arilo" también se refiere a sistemas de anillos heteroarilo, como se define a continuación en el presente documento.
El término "heteroarilo", usado solo o como parte de un resto mayor, como en "heteroaralquilo" o "heteroarilalcoxi", se refiere a sistemas de anillos monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos que tienen un total de cinco a catorce miembros de anillo, en los que al menos un anillo del sistema es aromático, al menos un anillo del sistema contiene uno o más heteroátomos, y en los que cada anillo del sistema contiene de 3 a 7 miembros de anillo. El término "heteroarilo" puede usarse indistintamente con el término "anillo heteroarilo" o el término "heteroaromático".
Un grupo arilo (incluyendo aralquilo, aralcoxi, ariloxialquilo y similares) o heteroarilo (incluyendo heteroaralquilo y heteroarilalcoxi y similares) puede contener uno o más sustituyentes y, por lo tanto, puede estar "opcionalmente sustituido". A menos que se haya definido otra cosa anteriormente y en el presente documento, los sustituyentes adecuados en el átomo de carbono insaturado de un grupo arilo o heteroarilo se seleccionan generalmente entre halógeno; -R°; -OR°; -SR°; fenilo (Ph) opcionalmente sustituido con R°; -O(Ph) opcionalmente sustituido con R°; -(CH2)1-2(Ph), opcionalmente sustituido con R°; -CH=CH(Ph), opcionalmente sustituido con R°; -NO2; -CN; -N(R°)2; -NR°C(O)R°; -NR°C(S)R°; -NR°C(O)N(R°)2; NR°C(S)N(R°)2; -NR°CO2R°; -NR°NR°C(O)R°; -NR°NR°C(O)N(R°)2; -NR°NR°CO2R°; -C(O)C(O)R°; -C(O)CH2C(O)R°; -CO2R°; -C(O)R°; -C(S)R°; -C(O)N(R°)2; -C(S)N(R°)2; -OC(O)N(R°)2; OC(O)R°; -C(O)N(OR°)R°; -C(NOR°)R°; -S(O)2R°; -S(O)3R°; -SO2N(R°)2; -S(O)R°; -NR°SO2N(R°)2; -NR°SO2R°; -N(OR°)R°; -C(=NH)-N(R°)2; -P(O)2R°; -PO(R°)2; -OPO(R°)2; -(CH2)0-2NHC(O)R°; fenilo (Ph) opcionalmente sustituido con R°; -O(Ph) opcionalmente sustituido con R°; -(CH2)1-2(Ph), opcionalmente sustituido con R°; o -CH=CH(Ph), opcionalmente sustituido con R°; en los que cada aparición independiente de R° se selecciona entre hidrógeno, alifático C1-6 opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo o heterocíclico de 5-6 miembros, sin sustituir, fenilo, -O(Ph) o -CH2(Ph), o, no obstante de la definición anterior, dos apariciones independientes de R°, en el mismo sustituyente o en sustituyentes diferentes, tomados junto con el átomo o átomos a los que está unido cada grupo R°, forman un anillo monocíclico o bicíclico, de 3-12 miembros, saturado, parcialmente insaturado o totalmente insaturado, opcionalmente sustituido que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno o azufre.
Los sustituyentes opcionales sobre el grupo alifático de R° se seleccionan entre NH2, NH(alifático C1-4), N(alifático C1-4)2, halógeno, alifático C1-4, OH, O(alifático C1-4), NO2, CN, CO2H, CO2(alifático C1-4), O(haloalifático C1-4) o haloalifático C1-4, en los que cada uno de los grupos alifáticos C1-4 anteriores de R°está sin sustituir.
Un grupo alifático o heteroalifático, o un anillo heterocíclico no aromático puede contener uno o más sustituyentes y, por lo tanto, puede estar "opcionalmente sustituido". A menos que se haya definido otra cosa anteriormente y en el presente documento, los sustituyentes adecuados en el carbono saturado de un grupo alifático o heteroalifático, o de un anillo heterocíclico no aromático, se seleccionan entre los indicados anteriormente para el carbono insaturado de un grupo arilo o heteroarilo y además incluyen los siguientes: =O, =S, =NNHR*, =NN(R*)2, =NNHC(O)R*, =NNHCO2(alquilo), =NNHSO2(alquilo) o =NR*, en los que cada R* se selecciona independientemente entre hidrógeno o un grupo alifático C1-6 opcionalmente sustituido.
A menos que se haya definido otra cosa anteriormente y en el presente documento, los sustituyentes opcionales en el nitrógeno de un anillo heterocíclico no aromático se seleccionan generalmente entre -R+, -N(R+)2, -C(O)R+, -CO2R+, -C(O)C(O)R+, -C(O)CH2C(O)R+, -SO2R+, -SO2N(R+)2, -C(=S)N(R+1)2, -C(=NH)-N(R+)2, o NR+SO2R+; en los que R+ es hidrógeno, un alifático C1-6 opcionalmente sustituido, fenilo opcionalmente sustituido, -O(Ph) opcionalmente sustituido, -CH2(Ph) opcionalmente sustituido, -(CH2)1-2(Ph) opcionalmente sustituido; -CH=CH(Ph) opcionalmente sustituido; o un anillo heteroarilo o heterocíclico de 5-6 miembros, sin sustituir, que tiene de uno a cuatro heteroátomos seleccionados independientemente entre oxígeno, nitrógeno o azufre, o, no obstante de la definición anterior, dos apariciones independientes de R+, en el mismo sustituyente o en sustituyentes diferentes, tomados junto con el átomo o átomos a los que está unido cada grupo R+, forman un anillo monocíclico o bicíclico, saturado, parcialmente insaturado o totalmente insaturado, de 3-12 miembros, opcionalmente sustituido, que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno o azufre.
Los sustituyentes opcionales sobre el grupo alifático o el anillo fenilo de R+ se seleccionan entre -NH2, -NH(alifático C1-4), -N(alifático C1-4)2, halógeno, alifático C1-4, -OH, O(alifático C1-4), -NO2, -CN, -CO2H, -CO2(alifático C1-4), -O(haloalifático C1-4), o halo(alifático C14), en los que cada uno de los grupos alifáticos C1-4 anteriores de R+ está sin sustituir.
En el caso de sustituciones heterociclilo, los sustituyentes pueden estar unidos a posiciones sustituibles, tanto en el átomo de carbono como en el heteroátomo. Por ejemplo, si la estructura sustituida descrita era un anillo de piperazina y el sustituyente era CH3, el compuesto descrito podría ser
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Una realización de la invención se refiere a un compuesto de fórmula II:
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en la que
5 X es N; Y es NR°u O; n es 0; m es 0; p es 0;
10 R1 es -N(H)R2; R2 es hidrógeno; R3 es 2-piridilo; R5 es hidrógeno o -CN; en la que
15 cada aparición independiente de R°se selecciona entre hidrógeno, alifático C1-6 opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo o heterocíclico de 5-7 miembros, sin sustituir, fenilo, -O(Ph) o CH2(Ph), o, no obstante de la definición anterior, dos apariciones independientes de R°, en el mismo sustituyente o en sustituyentes diferentes, tomados junto con el átomo o átomos a los que está unido cada grupo R°, forman un anillo heterociclilo, arilo o heteroarilo de 5-8
20 miembros o un anillo cicloalquilo de 3-8 miembros que tiene 0-3 heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno o azufre; un grupo alifático de R°está opcionalmente sustituido con NH2, NH(alifático C1-4), N(alifático C14)2, halógeno, alifático C1-4, OH, O(alifático C1-4), NO2, CN, CO2H, CO2(alifático C1-4), O(haloalifático C1-4) o halo(alifático C1-4), en los que cada uno de estos grupos alifáticos C1-4
25 anteriores está sin sustituir; cada R* se selecciona independientemente entre hidrógeno o un alifático C1-6 opcionalmente sustituido con NH2, NH(alifático C1-4), N(alifático C1-4)2, halógeno, alifático C1-4, OH, O(alifático C1-4), NO2, CN, CO2H, CO2(alifático C1-4), O(haloalifático C1-4) o halo(alifático C1-4), en los que cada uno de estos grupos alifáticos C1-4 anteriores está sin sustituir; R es hidrógeno o un grupo alifático C1-6, opcionalmente sustituido con =O, =S, -NH2, NH(alifático C1-4), N(alifático C1-4)2, halógeno, alifático C1-4, OH, O(alifático C1-4), NO2, CN, CO2H, CO2(alifático C1-4), O(haloalifático
5 C1-4) o halo(alifático C1-4), en los que cada uno de estos grupos alifáticos C1-4 anteriores está sin sustituir; en la que cada aparición independiente de R° se selecciona entre hidrógeno, alifático C1-6 opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo o heterocíclico de 5-6 miembros, sin sustituir, (con la condición de que un átomo de nitrógeno en el anillo heterocíclico esté opcionalmente
10 sustituido con -R+ o -C(O)R+, en los que R+ es (alquilo C1-6), preferentemente (alquilo C1-4)), fenilo, -O(Ph) o -CH2(Ph), o, no obstante de la definición anterior, dos apariciones independientes de R°, en el mismo sustituyente o en sustituyentes diferentes, tomados junto con el átomo o átomos a los que está unido cada grupo R°, forman un anillo heterociclilo, arilo
o heteroarilo de 5-8 miembros o un anillo cicloalquilo de 3-8 miembros que tiene 0-3
15 heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno o azufre. X e Y y los átomos a los que están unidos forman un anillo de seis miembros, preferentemente con 2 heteroátomos, y más preferentemente con 1 heteroátomo
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Una realización se representa por la Fórmula I-b:
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Otra realización se representa por la Fórmula I-c:
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Otras realizaciones se representan por los compuestos 1-1 y 1-2:
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Otras realizaciones se representan por los compuestos 1-3 y 1-4:
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Otras realizaciones de fórmula II se representan por los siguientes compuestos:
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Como se ha analizado anteriormente, la presente invención proporciona compuestos que son inhibidores de proteínas quinasas y, por lo tanto, los presentes compuestos son útiles para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones incluyendo, pero sin limitación, un trastorno proliferativo, un trastorno cardiaco, un trastorno neurodegenerativo, trastornos psicóticos, un trastorno autoinmune, una afección asociada con el trasplante de órganos, un trastorno inflamatorio, un trastorno mediado inmunológicamente, una enfermedad vírica o un trastorno óseo. En realizaciones preferidas, los compuestos son útiles para el tratamiento de alergia, asma, diabetes, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, demencia asociada con SIDA, esclerosis lateral amiotrófica (LMA, enfermedad de Lou Gehrig), esclerosis múltiple (EM), esquizofrenia, hipertrofia de cardiomiocitos, isquemia/reperfusión (por ejemplo, ictus), calvicie, cáncer, hepatomegalia, enfermedad cardiovascular incluyendo cardiomegalia, fibrosis quística, enfermedad vírica, enfermedades autoinmunes, aterosclerosis, reestenosis, psoriasis, inflamación, hipertensión, angina de pecho, contracción cerebrovascular, trastorno de la circulación periférica, nacimiento prematuro, arteriosclerosis, vasoespasmo (vasoespasmo cerebral, vasoespasmo coronario) retinopatía, disfunción eréctil (DE), SIDA, osteoporosis, enfermedad de Crohn y colitis, extensión de neuritas y enfermedad de Raynaud. En realizaciones preferidas, la enfermedad, afección o trastorno es aterosclerosis, hipertensión, disfunción eréctil (DE), isquemia/reperfusión (por ejemplo, ictus) o vasoespasmo (vasoespasmo cerebral y vasoespasmo coronario).
Por consiguiente, en otro aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticamente aceptables en las que estas composiciones comprenden cualquiera de los compuestos como se describen en el presente documento y, opcionalmente, comprenden un vehículo, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, estas composiciones comprenden además opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales.
También se apreciará que determinados compuestos de la presente invención pueden existir en forma libre para el tratamiento, o cuando sea apropiado, como un derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos. De acuerdo con la presente invención, un derivado farmacéuticamente aceptable incluye, pero sin limitación, profármacos, sales, ésteres, sales de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro aducto o derivado que tras la administración a un paciente que lo necesite sea capaz de proporcionar, directa o indirectamente, un compuesto como se describe de otro modo en el presente documento, o un metabolito o resto del mismo. Como se usa en el presente documento, la expresión “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellas sales que, dentro del ámbito del buen juicio médico, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin una toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similar excesiva, y se corresponden con una relación riesgo/beneficio razonable. Una “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a cualquier sal no tóxica o sal de un éster de un compuesto de la presente invención que, tras su administración a un destinatario, es capaz de proporcionar, directa o indirectamente, un compuesto de la presente invención o un metabolito o resto del mismo inhibidoramente activo. Como se usa en el presente documento, la expresión “metabolito o resto del mimos inhibidoramente activo” se refiere a que un metabolito o resto del mismo es también un inhibidor de una FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK.
Se conocen bien en la técnica sales farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, S. M. Berge y col., describen sales farmacéuticamente aceptables en detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, incorporado en el presente documento por referencia. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la presente invención incluyen las derivadas de bases y ácidos orgánicos e inorgánicos adecuados. Son ejemplos de sales de adición de ácido no tóxicas farmacéuticamente aceptables las sales de un grupo amino formadas con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico, o con ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico, o mediante el uso de otros procedimientos usados en la técnica, tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2hidroxietanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen metales alcalinos, metales alcalinotérreos, sales de amonio y N+(alquilo C1-4)4. La presente invención también prevé la cuaternización de cualquier grupo que contiene nitrógeno básico de los compuestos desvelados en el presente documento. Pueden obtenerse productos dispersables o solubles en aceite o agua mediante dicha cuaternización. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen, cuando es apropiado, amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes de amina formados usando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato,
nitrato, sulfonato de alquilo inferior y aril sulfonato.
Como se ha descrito anteriormente, las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención comprenden además un vehículo, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable que, como se usa en el presente documento, incluye cualquiera de y todos los disolventes, diluyentes y otros vehículos líquidos, adyuvantes de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según sea apropiado para la forma de dosificación particular deseada. Remington’s Pharmaceutical Sciences, Sexta Edición, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) desvela diversos vehículos usados en la formulación de composiciones farmacéuticamente aceptables y técnicas conocidas para la preparación de las mismas. Excepto en la medida en que cualquier medio de vehículo convencional sea incompatible con los compuestos de la invención, tal como produciendo cualquier efecto biológico no deseable o interaccionando de otro modo de una forma perjudicial con cualquier otro componente o componentes de la composición farmacéuticamente aceptable, su uso se contempla como dentro del ámbito de la presente invención. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas tales como albúmina sérica human, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico o sorbato de potasio, mezclas de glicéricos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, grasa de lana, azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetil celulosa sódica, etil celulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón; aceite de cártamo; aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles; tales como un propilenglicol o polietilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua apirógena; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico y soluciones tamponadas con fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos tales como lauril sulfato sódico y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de revestimiento, agentes edulcorantes, saporíferos y perfumantes, conservantes y antioxidantes, también pueden estar presentes en la composición, de acuerdo
con el juicio del experto en formulación.
En otro aspecto más, se proporciona un compuesto o una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un compuesto para su uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de un trastorno proliferativo, un trastorno cardiaco, un trastorno neurodegenerativo, un trastorno psicótico, un trastorno autoinmune, una afección asociada con el trasplante de órganos, un trastorno inflamatorio, un trastorno mediado inmunológicamente, una enfermedad vírica o un trastorno óseo. En ciertas realizaciones de la presente invención una “cantidad eficaz” del compuesto o composición farmacéuticamente aceptable es esa cantidad eficaz para tratar o disminuir la gravedad de un trastorno proliferativo, un trastorno cardiaco, un trastorno neurodegenerativo, un trastorno psicótico, un trastorno autoinmune, una afección asociada con el trasplante de órganos, un trastorno inflamatorio, un trastorno mediado inmunológicamente, una enfermedad vírica o un trastorno óseo. Los compuestos y composiciones de acuerdo con el procedimiento de la presente invención pueden administrarse usando cualquier cantidad y cualquier vía de administración eficaz para tratar o disminuir la gravedad de un trastorno proliferativo, un trastorno cardiaco, un trastorno neurodegenerativo, un trastorno autoinmune, una afección asociada con el trasplante de órganos, un trastorno inflamatorio, un trastorno mediado inmunológicamente, una enfermedad vírica o un trastorno óseo. La cantidad exacta necesaria variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad y estado general del sujeto, la gravedad de la infección, el agente particular, su modo de administración y similares. Los compuestos de la invención se formulan preferentemente en forma unitaria de dosificación para la facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. La expresión “forma unitaria de dosificación”, como se usa en el presente documento, se refiere a una unidad físicamente separada de agente apropiada para el paciente a tratar. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invención lo decidirá el médico adjunto dentro del ámbito del buen juicio médico. El nivel de dosis eficaz específico para cualquier paciente u organismo particular dependerá de una diversidad de factores incluyendo el trastorno a tratar y la gravedad de trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el momento de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o de forma coincidente con el compuesto específico empleado, y factores similares bien conocidos en la técnica médica. El término “paciente”, como se usa en el presente documento, se refiere a un animal, preferentemente un mamífero, y más preferentemente un ser humano.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden
administrarse a seres humanos y otros animales por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como mediante polvos, pomadas o gotas), por vía bucal, como una pulverización oral o nasal o similar, dependiendo de la gravedad de la infección a tratar. En ciertas realizaciones, los compuestos de la invención pueden administrarse por vía oral o parenteral a niveles de dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg y, preferentemente, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal de sujeto al día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado.
Las formas de dosificación líquida para administración oral incluyen, pero sin limitación, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Aparte de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saporíferos y perfumantes.
Pueden formularse preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, de acuerdo con la técnica conocida usando agentes humectantes o dispersantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles como medio disolvente o de suspensión. Para este fin puede emplearse cualquier aceite no volátil suave incluyendo mono-o diglicéridos sintéticos. Además, se usan ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de inyectables.
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro que retenga las bacterias, o por incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes del uso.
Para prolongar el efecto de un compuesto de la presente invención, con frecuencia es deseable ralentizar la absorción del compuesto desde la inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede conseguirse mediante el uso de una suspensión líquida de material amorfo o cristalino con escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorción del compuesto depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, se logra una absorción retardada de un compuesto administrado por vía parenteral por disolución o suspensión del compuesto en un vehículo oleoso. Se preparan formas de liberación prolongada inyectables formando matrices microencapsuladas del compuesto en polímeros biodegradables tales como polilactidapoliglicolida. Dependiendo de la proporción de compuesto respecto a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, la velocidad de liberación de compuesto puede controlarse. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). También se preparan formulaciones inyectables de liberación prolongada por retención del compuesto en liposomas o microemulsiones que sean compatibles con tejidos corporales.
Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferentemente supositorios que pueden prepararse mezclando los compuestos de la presente invención con excipientes o vehículos no irritantes adecuados, tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorio que sea sólida a temperatura ambiente pero líquida a temperatura corporal y, por lo tanto, se funda en el recto o cavidad vaginal y libere el compuesto activo.
Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En dichas formas de dosificación sólidas, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente o vehículo inerte farmacéuticamente aceptable, tal como citrato sódico o fosfato dicálcico y/o a) cargas o diluyentes tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes disgregantes tales como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato sódico, e) agentes retardantes de la disolución, tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como arcilla de bentonita y caolín e i) lubricantes tales como talco, estearato cálcico, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato sódico y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma de dosificación también puede comprender agentes tamponantes.
También pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos pueden prepararse con revestimientos y carcasas tales como revestimientos entéricos y otros revestimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y también pueden ser de una composición que libere el ingrediente o ingredientes activos solamente, o preferentemente, en cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente de una forma retardada. Los ejemplos de composiciones de embebimiento que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras. También pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Los compuestos activos también pueden estar en forma microencapsulada con uno o más excipientes como se ha indicado anteriormente. Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos pueden preparase con revestimientos y carcasas tales como revestimientos entéricos, revestimientos de control de la liberación y otros revestimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. En dichas formas de dosificación sólida, el compuesto activo puede mezclarse con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas de dosificación también pueden comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales distintas de diluentes inertes, por ejemplo, lubricantes de fabricación de comprimidos y otros adyuvantes de la fabricación de comprimidos, tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes, y también pueden ser de una composición que libere el ingrediente o ingredientes activos solamente, o preferentemente, en una parte determinada del tracto intestinal, opcionalmente de una forma retardada. Los ejemplos de composiciones de embebimiento que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de la presente invención incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, pulverizaciones, inhaladores o parches. El componente activo se mezcla en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o tampón necesario que pueda ser necesario. También se contemplan como dentro del ámbito de la presente invención formulaciones oftálmicas, gotas óticas y colirios. Además, la presente invención contempla el uso de parches transdérmicos que tienen la ventaja añadida de proporcionar una administración controlada de un compuesto al cuerpo. Dichas formas de dosificación pueden prepararse por disolución o dispensación del compuesto en el medio apropiado. También pueden usarse potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando el compuesto en una matriz polimérica o gel.
Como se ha descrito en general anteriormente, los compuestos de la invención son útiles como inhibidores de proteínas quinasas. En una realización, los compuestos y composiciones de la invención son inhibidores de una o más de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK y, por lo tanto, sin desear quedar ligado a teoría particular alguna, los compuestos y composiciones son particularmente útiles para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad, afección o trastorno en la que la activación de una o más de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK están implicadas en la enfermedad, afección o trastorno. Cuando la activación de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK están implicadas en una enfermedad, afección o trastorno particular, la enfermedad, afección o trastorno también puede denominarse “enfermedad mediada por FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p7pS6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK2" o síntoma de enfermedad. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos
o composiciones para su uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de una enfermedad, afección o trastorno, en la que la activación de una o más de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK están implicadas en la patología.
La actividad de un compuesto utilizado en la presente invención como inhibidor de FLT3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK, puede ensayarse in vitro, in vivo
o en una línea celular. Los ensayos in vitro incluyen ensayos que determinan la inhibición de la actividad de fosforilación o actividad ATPasa de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK activada. Ensayos in vitro alternativos cuantifican la capacidad del inhibidor para unirse a FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK. La unión del
inhibidor puede medirse por radiomarcaje del inhibidor antes de la unión, aislamiento del complejo de inhibidor/FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK o SYK y determinación de la cantidad de radiomarcador unido. Como alternativa, puede determinarse la unión del inhibidor realizando un experimento de competición en el que se incuban nuevos inhibidores con FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK unidas a radioligandos conocidos.
En una realización, la invención proporciona un compuesto de fórmulas I, II o III que inhibe selectivamente FLT-3 y/o c-KIT. En una realización adicional, la invención proporciona un compuesto de fórmula I que inhibe selectivamente FLT-3 y/o c-KIT. Como se usa en el presente documento, la expresión “inhibe selectivamente” se refiere a que un compuesto inhibe FLT-3 y/o c-KIT con una Ki o CI50 que es al menos dos veces inferior a la de una o más quinasas diferentes, tales como Aurora-2, FMS, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK-3, JNK, KDR, MET, SRC, ROCK y/o SYK. En una realización adicional, un compuesto que inhibe selectivamente FLT-3 y/o c-KIT es uno que inhibe FLT-3 y/o c-KIT con una Ki o CI50 que es al menos cinco veces inferior o al menos diez veces inferior a la de una o más quinasas diferentes, tales como Aurora-2, FMS, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK-3, JNK, KDR, MET, SRC, ROCK y/o SYK.
La expresión “inhibe de forma medible”, como se usa en el presente documento, se refiere a un cambio medible en la actividad de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK entre una muestra que comprende dicha composición y una quinasa FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK y una muestra equivalente que comprende una quinasa FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK en ausencia de dicha composición.
La expresión “enfermedad mediada por FLT-3”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sepa que una quinasa de la familia de FLT-3 desempeña un papel. Dichas afecciones incluyen, sin limitación, trastornos hematopoyéticos, en particular, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia promielocítica aguda (LPA) y leucemia linfocítica aguda (LLA).
De acuerdo con otra realización, la invención proporciona una composición de acuerdo
con la presente invención, para su uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de un trastorno o afección mediada por FMS en un paciente.
La expresión “enfermedad mediada por FMS”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sepa que una quinasa de la familia de FMS desempeña un papel. Dichas afecciones incluyen, sin limitación, cáncer (incluyendo, pero sin limitación, cáncer de ovario, endometrial y mama), trastornos inflamatorios e hipertensión.
De acuerdo con otra realización, la invención proporciona una composición de acuerdo con la presente invención, para su uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de una enfermedad o afección mediada por c-KIT en un paciente.
La expresión “enfermedad mediada por c-KIT”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sepa que una quinasa de la familia de c-KIT desempeña un papel. Dichas afecciones incluyen, sin limitación, LMA, leucemia mielógena crónica (LMC), mastocitosis, linfoma anaplásico de células grandes, LLA, tumor del estroma gastrointestinal (TEGI), linfoma de células T, carcinoma adenoide quístico, angiosarcoma, carcinoma endometrial, carcinoma pulmonar microcítico, cáncer de próstata, cáncer de ovario, carcinoma de mama, carcinoma tiroideo, melanoma maligno, carcinoma de colon y glioblastoma.
De acuerdo con otra realización, la invención proporciona una composición de acuerdo con la presente invención, para su uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de una enfermedad o afección mediada por CDK-2 en un paciente.
La expresión “enfermedad mediada por CDK-2”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sepa que CDK-2 desempeña un papel. Por consiguiente, estos compuestos son útiles para tratar enfermedades o afecciones que se sabe que están afectadas por la actividad de la CDK-2 quinasa. Dichas enfermedades o afecciones incluyen cáncer, enfermedad de Alzheimer, reestenosis, angiogénesis, glomerulonefritis, citomegalovirus, VIH, herpes, psoriasis, aterosclerosis, alopecia y enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide, infecciones víricas, trastornos neurodegenerativos, trastornos asociados con la apoptosis de timocitos o trastornos proliferativos resultantes de la desregulación del ciclo celular, especialmente la progresión de la fase G1 a S.
De acuerdo con otra realización, la invención proporciona una composición de acuerdo con la presente invención, para su uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de una enfermedad o afección mediada por GSK-3 en un paciente.
De acuerdo con otra realización, la invención proporciona una composición de acuerdo
con la presente invención, para su uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de una enfermedad o afección mediada por Src en un paciente.
La expresión “enfermedad mediada por Src”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que la Src quinasa desempeña un papel. Dichas enfermedades o afecciones incluyen, sin limitación, cánceres tales como cáncer de colon, de mama, hepático y pancreático, enfermedades autoinmunes tales como rechazo de trasplantes, alergias, artritis reumatoide, leucemia, enfermedades de la remodelación ósea tales como osteoporosis y enfermedades víricas tales como infección por hepatitis B.
De acuerdo con otra realización, la invención proporciona una composición de acuerdo con la presente invención, para su uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de una enfermedad o afección mediada por Syk en un paciente.
La expresión “enfermedad mediada por Syk” o “afección mediada por Syk”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sepa que la proteína quinasa Syk desempeña un papel. Dichas afecciones incluyen, sin limitación, trastornos alérgicos, especialmente asma.
La expresión “enfermedad mediada por JAK”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sepa que una quinasa de la familia JAK desempeña un papel. Dichas afecciones incluyen, sin limitación, respuestas inmunes tales como reacciones alérgicas o de hipersensibilidad de tipo I, asma, enfermedades autoinmunes tales como rechazo de trasplantes, enfermedad de injerto contra huésped, artritis reumatoide, esclerosis lateral amiotrófica y esclerosis múltiple, trastornos neurodegenerativos tales como esclerosis lateral amiotrófica familiar (ELAF), así como en tumores malignos sólidos y hematológicos tales como leucemias y linfomas.
La expresión “afección mediada por PDK1” o “enfermedad”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sepa que PDK1 desempeña un papel. La expresión “afección mediada por PDK1” o “enfermedad” también se refiere a aquellas enfermedades o afecciones que se alivian por tratamiento con un inhibidor de PDK1. Las enfermedades o afecciones mediadas por PDK1 incluyen, pero sin limitación, trastornos proliferativos y cáncer. Preferentemente, dicho cáncer se selecciona de cáncer pancreático, de próstata o de ovario.
La expresión “afección mediada por PKA” o “enfermedad”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sepa que PKA desempeña un papel. La expresión “afección mediada por PKA” o “enfermedad” también se refiere a aquellas enfermedades o afecciones que se alivian por tratamiento con un inhibidor de PKA. Las enfermedades o afecciones mediadas por PKA incluyen, pero sin limitación, trastornos proliferativos y cáncer.
La expresión “afección mediada por p70S6K” o “enfermedad”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sepa que p70S6K desempeña un papel. La expresión “afección mediada por p70S6K” o·"enfermedad" también se refiere a aquellas enfermedades o afecciones que se alivian por tratamiento con un inhibidor de p70S6K. Las enfermedades o afecciones mediadas por p70S6K incluyen, pero sin limitación, trastornos proliferativos tales como cáncer y esclerosis tuberosa.
La expresión “enfermedad mediada por GSK-3”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección o enfermedad perjudicial en la que se sepa que GSK-3 desempeña un papel. Dichas enfermedades o afecciones incluyen, sin limitación, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas, neurológicas y neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson y trastornos del movimiento de los ganglios basales, corea, distonía, enfermedad de Wilson, enfermedad de Pick, degeneración del lóbulo frontal, parálisis supranuclear progresiva (PSP), enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, patología de tau y degeneración corticobasal (DCB)), trastornos psicóticos (por ejemplo, esquizofrenia, demencia asociada con SIDA, depresión, trastorno bipolar y trastornos de ansiedad), enfermedades cardiovasculares, alergia, asma, diabetes, esclerosis lateral amiotrófica (LMA, enfermedad de Lou Gehrig), esclerosis múltiple (EM), hipertrofia de cardiomiocitos, isquemia/reperfusión, ictus y calvicie.
La expresión “afección mediada por ROCK” o “enfermedad”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sepa que ROCK desempeña un papel. La expresión “afección mediada por ROCK” o “enfermedad” también se refiere a aquellas enfermedades o afecciones que se alivian por tratamiento con un inhibidor de ROCK. Dichas afecciones incluyen, sin limitación, hipertensión, angina de pecho, contracción cerebrovascular, asma, trastorno de la circulación periférica, nacimiento prematuro, cáncer, disfunción eréctil, arteriosclerosis, espasmo (vasoespasmo cerebral y vasoespasmo coronario), retinopatía (por ejemplo, glaucoma), trastornos inflamatorios, trastornos autoinmunes, SIDA, osteoporosis, hipertrofia miocárdica, lesión inducida por isquemia/reperfusión y disfunción endotelial.
En otras realizaciones, la invención se refiere a una composición que comprende un compuesto de fórmula II, para su uso en el aumento de la síntesis de glucógeno y/o la disminución de los niveles de glucosa en sangre en un paciente que lo necesite. Este uso es especialmente útil para pacientes diabéticos.
En otra realización más, la invención se refiere a una composición que comprende un compuesto de fórmula II, para su uso en la inhibición de la producción de proteína Tau hiperfosforilada en un paciente que lo necesite. Este uso es especialmente útil para detener o ralentizar la progresión de la enfermedad de Alzheimer.
En otras realizaciones más, la invención se refiere a una composición que comprende un compuesto de fórmula II, para su uso en la inhibición de la fosforilación de β-catenina en un paciente que lo necesite. Este uso es especialmente útil para tratar la esquizofrenia.
Se apreciará también que los compuestos y composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden emplearse en terapia de combinación, es decir, los compuestos y composiciones farmacéuticamente aceptables pueden administrarse de forma concurrente con, antes de, o posteriormente a uno o más productos terapéuticos o procedimientos médicos deseados diferentes. La combinación particular de terapias (productos terapéuticos o procedimientos) a emplear en un régimen de combinación tendrá en cuenta la compatibilidad de los productos terapéuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado a conseguir. También se apreciará que las terapias empleadas pueden conseguir el efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un compuesto de la invención puede administrarse de forma concurrente con otro agente usado para tratar el mismo trastorno) o pueden conseguir efectos diferentes (por ejemplo, el control de cualquier efecto adverso). Como se usan en el presente documento, los agentes terapéuticos adicionales que se administran normalmente para tratar o prevenir una enfermedad o afección particular se conocen como “apropiados para la enfermedad o afección a tratar”.
Por ejemplo, los agentes quimioterápicos u otros agentes antiproliferativos pueden combinarse con los compuestos de la presente invención para tratar enfermedades proliferativas y cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos conocidos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, otras terapias o agentes anticancerosos que pueden usarse en combinación con los agentes anticancerosos de la presente invención que incluyen cirugía, radioterapia (en sólo unos pocos ejemplos, radiación gamma, radioterapia con haz de neutrones, radioterapia con haz de electrones, terapia de protones, braquiterapia e isótopos radiactivos sistémicos, para nombrar algunos), terapia endocrina, modificadores de la respuesta biológica (interferones, interleucinas y factor de necrosis tumoral (TNF), para nombrar algunos), hipertermia y crioterapia, agentes para atenuar cualquier efecto adverso (por ejemplo, antieméticos) y otros fármacos quimioterápicos autorizados incluyendo, pero sin limitación, fármacos alquilantes (mecloretamina, clorambucilo, ciclofosfamida, melfalán, ifosfamida), antimetabolitos (metotrexato), antagonistas de purina y antagonistas de pirimidina (6-Mercaptopurina, 5-Fluorouracilo, Citarabilo, Gemcitabina), venenos del huso (Vinblastina, Vincristina, Vinorelbina, Paclitaxel), podofilotoxinas (Etopósido, Irinotecán, Topotecán), antibióticos (Doxorubicina, Bleomicina, Mitomicina), nitrosoureas (Carmustina, Lomustina), iones inorgánicos (Cisplatino, Carboplatino), enzimas (Asparaginasa) y hormonas (Tamoxifeno, Leuprolida, Flutamida y Megestrol), Gleevec™, adriamicina, dexametasona y ciclofosfamida. Para una discusión más completa de terapias contra el cáncer véase The Merck Manual, Decimoséptima Ed. 1999, cuyo contenido completo se incorpora por la presente por referencia.
Otros ejemplos de agentes con los que pueden combinarse también los inhibidores de la presente invención incluyen, sin limitación, tratamientos para la enfermedad de Alzheimer tales como Aricept® y Excelon®; tratamientos para la enfermedad de Parkinson tales como LDOPA/carbidopa, entacapona, ropinrol, pramipexol, bromocriptina, pergolida, trihexefendilo y amantadina; agentes para tratar la Esclerosis Múltiple (EM) tales como interferón beta (por ejemplo, Avonex® y Rebif®), Copaxone® y mitoxantrona; tratamientos para el asma tales como albuterol y Singular®; agentes para tratar la esquizofrenia tales como ziprexa, risperdal, seroquel y haloperidol; agentes antiinflamatorios tales como corticosteroides, bloqueantes de TNF, IL-1 RA, azatioprina, ciclofosfamida y sulfasalazina; agentes inmunomoduladores e inmunosupresores tales como ciclosporina, tacrólimo, rapamicina, micofenolato de mofetilo, interferones, corticosteroides, ciclofosfamida, azatioprina y sulfasalazina; factores neurotróficos tales como inhibidores de la acetilcolinesterasa, inhibidores de la MAO, interferones, anticonvulsivantes, bloqueantes de canales iónicos, riluzol y agentes anti-parkinsonianos; agentes para tratar enfermedades cardiovasculares tales como beta-bloqueantes, inhibidores de la ACE, diuréticos, nitratos, bloqueantes de los canales de calcio y estatinas; agentes para tratar la enfermedad hepática tales como corticosteroides, colestiramina, interferones y agentes antivirales; agentes para tratar trastornos sanguíneos tales como corticosteroides, agentes antileucémicos y factores de crecimiento; y agentes para tratar trastornos de inmunodeficiencia tales como gammaglobulina.
La cantidad de agente terapéutico adicional presente en las composiciones de la presente invención no será más que la cantidad que se administraría normalmente en una composición que comprende ese agente terapéutico como el único agente activo. Preferentemente, la cantidad de agente terapéutico adicional en las composiciones desveladas actualmente variará de aproximadamente el 50% al 100% de la cantidad normalmente presente en una composición que comprende ese agente como el único agente terapéuticamente activo.
Los compuestos de la presente invención o composiciones farmacéuticamente aceptables de los mismos también pueden incorporarse en composiciones para revestir dispositivos médicos implantables tales como prótesis, válvulas artificiales, injertos vasculares, endoprótesis y catéteres. Por consiguiente, la presente invención, en otro aspecto, incluye una composición para revestir un dispositivo implantable que comprende un compuesto de la presente invención, como se ha descrito en general anteriormente, y en clases y subclases del presente documento, y un vehículo adecuado para revestir dicho dispositivo implantable. En otro aspecto más, la presente invención incluye un dispositivo implantable revestido con una composición que comprende un compuesto de la presente invención, como se ha descrito en general anteriormente, y en clases y subclases del presente documento, y un vehículo adecuado para revestir dicho dispositivo implantable.
Se han usado endoprótesis vasculares, por ejemplo, para superar la reestenosis (reestrechamiento de la pared del vaso después de una lesión). Sin embargo, los pacientes que usan endoprótesis y otros dispositivos implantables presentan riesgo de formación de coágulos
o activación de plaquetas. Estos efectos no deseados pueden prevenirse o mitigarse por prerevestimiento del dispositivo con una composición farmacéuticamente aceptable que comprenda un inhibidor de quinasa. Se describen revestimientos adecuados y la preparación general de dispositivos implantables revestidos en las Patentes de Estados Unidos 6.099.562; 5.886.026; y 5.304.121. Los revestimientos son típicamente materiales poliméricos biocompatibles, tales como un polímero de hidrogel, polimetildisiloxano, policaprolactona, polietilenglicol, ácido poliláctico, acetato de etilenvinilo y mezclas de los mismos. Los revestimientos pueden cubrirse opcionalmente además mediante un revestimiento superior adecuado de fluorosilicona, polisacáridos, polietilenglicol, fosfolípidos o combinaciones de los mismos para conferir características de liberación controlada a la composición.
Otro aspecto de la invención se refiere a la inhibición de la actividad de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK en una muestra biológica o un paciente, comprendiendo dicho procedimiento administrar al paciente, o poner en contacto dicha muestra biológica con un compuesto de fórmula I, II o III o una composición que comprende dicho compuesto. La expresión “muestra biológica”, como se usa en el presente documento, incluye, sin limitación, cultivos celulares o extractos de los mismos; material biopsiado obtenido de un mamífero o extractos del mismos; y sangre, saliva, orina, heces, semen, lágrimas u otros fluidos corporales o extractos de los mismos.
La inhibición de la actividad quinasa de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia de proteínas quinasas de AGC (por ejemplo, PKA, PDK, p70S6K-1 y 2 y PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK y/o SYK en una muestra biológica es útil para una diversidad de fines que son conocidos por el experto en la materia. Los ejemplos de dichos fines incluyen, pero sin limitación, transfusión sanguínea, trasplante de órganos, almacenamiento de muestras biológicas y ensayos biológicos.
EJEMPLOS Los compuestos de fórmula general I se prepararon de acuerdo con el procedimiento general que se muestra a continuación en los Ejemplos 1 y 2:
Ejemplo 1: N3-[4-(4-Morfolin-4-il-ciclohexil)-fenil]-1-piridin-2-il-1H-[1,2,4]triazol-3,5diamina
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Procedimiento A de HPLC: Col.: Lighting 3 um, 2,1 x 50 mm Gradiente: de 100% de B (TFA al 0,1%/MeCN al 1,0%/agua) a 100% de D (TFA al 0,1%/MeCN) durante 4 min. Mantenido a 100% de D hasta 5,6 min, Yendo hasta 100% de B durante 0,4 min, mantenido durante 1 min. Caudal: 0,8 ml/min
Síntesis de 4-ciano-4-(4-nitrofenil)heptanodioato de dimetilo (2);
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15 A una solución de 2-(4-nitrofenil)acetonitrilo (1) (50,12 g, 0,31 mol) en CH3CN (1 l) a TA en una atmósfera de N2 se le añadió Triton-B/MeOH al 40% (14,5 ml, 0,03 mol), dando una solución de color púrpura oscura. La mezcla se calentó a reflujo, después (durante ~2,5 h) se añadió acrilato de metilo (160 ml, 1,78 mol) y el calentamiento a reflujo se continuó durante 4 h. La reacción se enfrió y se evaporó, y después se diluyó con EtOAc y se acidificó con HCl 2 N.
20 Las fases se separaron, la fase acuosa se extrajo de nuevo con EtOAc y los extractos orgánicos combinados se lavaron con una solución saturada de NaCl, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se evaporaron. La purificación por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (1 l), eluyendo con 1:2 de EtOAc:hexanos proporcionó 2 en forma de un aceite de color amarillo (88,96 g, 86%).
25 RMN 1H (500 MHz, dmso-d6) 8,31 (d, 2H), 7,78 (d, 2H), 3,52 (s, 6H), 2,4 (m, 6H), 2,05 (m, 2H)
ppm. EM-AIF: 333,1 (M-H). HPLC (procedimiento A): 3,484 min.
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A una solución de 2 (88,96 g, 0,27 mol) en DME (1 l) a TA en una atmósfera de N2 se le añadió (cuidadosamente) NaH (al 60% en aceite mineral, 31,92 g, 0,80 mol) para dar una solución de color violeta oscuro. La reacción se calentó a reflujo durante 4 h, se enfrió, se interrumpió cuidadosamente con H2O, se acidificó con HCl 2 N y se extrajo con 2 x EtOAc. Los
10 extractos orgánicos combinados se lavaron con una solución saturada de NaCl, se secaron sobre una mezcla de carbón vegetal activado y Na2SO4, se filtraron a través de Celite y se evaporaron, dando el producto en bruto 3 en forma de un sólido de color pardo (83,42 g, >100%). RMN 1H (500 MHz, dmso-d6) 12,1 (s, 1H), 8,31 (d, 2H), 7,88 (d, 2H), 3,75 (s, 3H), 2,86 (cuadruplete AB, 2H), 2,65 (m. 1H), 2,6 (m, 1H), 2,4 (m, 1H), 2,35 (m, 1H) ppm.
15 EM-AIF: 301,1 (M-H). HPLC (procedimiento A): 3,729 min. Síntesis de 1-(4-nitrofenil)-4-oxociclohexanocarbonitrilo
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El compuesto 3 en bruto (0,27 mol), NaCl (80 g, 1,37 mol) y agua (80 ml) se calentaron
20 en DMSO (1,2 l) a 150-160ºC durante 3 h. El disolvente se retiró por destilación y el residuo se diluyó con H2O y se extrajo con 3 x EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con HCl 2 N, 3 x H2O y solución de NaCl, se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron. La purificación por cromatografía ultrarrápida (1 l de SiO2) eluyendo con 1:3 y después con 1:2 de EtOAc:hexanos proporcionó el producto puro 4 en forma de un sólido de color blanquecino
25 (36,47 g, rendimiento del 56%), así como un producto muy ligeramente impuro 4 en forma de un sólido de color verdoso (14,33 g, rendimiento del 22%).
RMN 1H (500 MHz, dmso-d6) 8,31 (d, 2H), 7,92 (d, 2H), 2,74 (m, 2H), 2,5 (m, 6H) ppm. EM-AIF: 243,2 (M-H). HPLC (Procedimiento A): 3,121 min.
Síntesis de 4-morfolino-1-(4-nitrofenil)ciclohexanocarbonitrilo (5a)
imagen2
A una solución de 1-(4-nitrofenil)-4-oxociclohexanocarbonitrilo (45,8 g, 187 mmol) en THF anhidro (560 ml) a TA se le añadió morfolina (17,2 ml, 197 mmol). La solución se agitó durante 45 min y después se puso en un baño de agua a TA. Se añadió en porciones triacetoxiborohidruro sódico (55,5 g, 260 mmol) durante 10 min. Después de 2,5 h, el disolvente
10 se retiró al vacío y la mezcla se disolvió en EtOAc (400 ml) y se extrajo con NaOH 2 N (3 x 75 ml). Después, se burbujeó gas HCl a través de la fase orgánica, dando un precipitado que se filtró, se lavó con EtOAc (2 x) y Et2O (3 x). El sólido se secó al vacío a 40ºC durante 18 h, dando una mezcla de isómeros (5a y 5c, 54,9 g, rendimiento del 84%). Purificación del isómero 5a (necesaria para la preparación del ejemplo 2; no necesaria
15 para la preparación del ejemplo 1): Una mezcla de 5a y 5b (79,4 g) se disolvió en CH2Cl2 (200 ml) y se aplicó a SiO2 (2 l) que se había cargado en un embudo de vidrio sinterizado de 3 l. La elución se realizó con 13 l de 1:1 de acetato de etilo:hexanos en matraces de 1 l para obtener una mezcla de 5a y 5b (19,77 g, recuperación del 25%) en forma de un sólido de color amarillo pálido. El isómero puro
20 5a se obtuvo por elución adicional con 8 l de 5:95 de metanol:CH2Cl2 para proporcionar 57 g (recuperación del 72%). 5a: RMN 1H (500 MHz, dmso-d6) 8,28 (d, 2H), 7,84 (d, 2H), 3,59 (m, 4H), 2,52 (m, 4H), 2,40 (tt, 1H), 2,18 (d, 2H), 2,02 (m, 4H), 1,60 (m, 2H) ppm. EM-AIF 316,1 (M+H). HPLC (procedimiento B) 2,537 min (100%).
25 5b: RMN 1H (500 MHz, dmso-d6) 8,30 (d, 2H), 7,82 (d, 2H), 3,59 (m, 4H), 2,38 (m, 4H), 2,28 (d, 2H), 2,26 (m, 1H), 1,94 (m, 4H), 1,74 (m, 2H) ppm. EM-AIF 316,1 (M+H). HPLC: 2,449 min (100%).
Síntesis de trans-y cis-4-(4-morfolin-4-il-ciclohexil)-fenilamina (6a y 6b)
imagen1
(Referencias: S. B. Christensen y col., J. Med. Chem., 1998, 41, 821-835; y J. A. Marshall, y col., J. Org. Chem., 1977, 42, 3309-3311)
Un matraz de fondo redondo de 3 bocas y de 2 l equipado con un agitador mecánico situado en la parte superior, adaptador Claisen con embudo de adición (1 l) y condensador de hielo seco se secó a la llama en una atmósfera de nitrógeno y se dejó enfriar. El condensador se cargó con hielo seco/2-propanol y el matraz se enfrió a -78ºC con hielo seco/2-propanol mientras permanecía a presión positiva de nitrógeno. Se condensó gas amoniaco (1 l) mientras permanecía en una atmósfera de nitrógeno. Después, la solución se cargó con 26,6 g (1,16 mol) de metal sodio. Después de 30 min, se añadió gota a gota una solución de 30 g (0,0951 mol) de 4-morfolino-1-(4-nitrofenil)ciclohexanocarbonitrilo en THF anhidro (300, ml) mediante un embudo de adición durante 10 minutos. Después de que se completara la adición, se usaron 50 ml de THF para aclarar el embudo de cualquier 4-morfolino-1-(4nitrofenil)ciclohexanocarbonitrilo residual y la reacción se dejó calentar a -33ºC y se agitó durante 5 horas. La reacción se interrumpió mediante la adición gota a gota de NH4Cl/NH4OH (9/1, 100 ml) mientras permanecía a presión positiva de nitrógeno. Se añadieron agua (200 ml) y después EtOAc (350 ml) y se dejó que el amoniaco se evaporara mientras se agitaba durante una noche. La suspensión resultante se filtró a través de celite y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 200 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida (evaporador rotatorio) para dar una mezcla ~5:1 de 6a:6b en forma de un sólido de color amarillo pálido después del secado al vacío a TA. (23,87 g, rendimiento del 96,4%) RMN 1H (500 MHz, dmso-d6) Para 6a: 6,84 (d, 2H), 6,46 (d, 2H), 3,55 (m, 4H), 2,48 (m, 4H), 2,25 (tt, 1H), 2,22 (tt, 1H), 1,88 (d, 2H), 1,78 (d, 2H), 1,34 (m, 4H) ppm; Picos discernibles para 6b: 6,86 (d, 2H), 6,49 (d, 2H), 3,60 (m, 4H), 2,37 (m, 4H) ppm. EM-AIF 261,2 (M+H).
Síntesis de (Z)-3-(4-(4-morfolinociclohexil)fenil)-2-fenilisour
imagen1
Una mezcla de cis-y trans-4-(4-morfolin-4-il-ciclohexil)-fenilamina 6b y 6a (20,28 g, 77,9 mmol) y cianocarbonimidato de difenilo (20,44 g, 85,6 mmol) en dioxano (350 ml) se agitó en 5 una atmósfera de N2 durante 4 días. La reacción se evaporó, después se diluyó con agua y se extrajo con 5 porciones (200 ml) de CH2Cl2. La fase orgánica combinada se lavó con NaHCO3 y se evaporó a sequedad para proporcionar un aceite viscoso de color pardo oscuro. La trituración con Et2O (300 ml) dio un sólido de color castaño, que se lavó adicionalmente con 2 porciones de Et2O (150 ml), proporcionando el producto 7a en forma de un sólido de color
10 castaño (21,70 g, 69%). RMN 1H (500 MHz, dmso-d6) 10,7 (s a, 1H), 7,44 (t, 2H), 7,35 (d, 2H), 7,25 (m, 5H), 3,57 (m, 4H), 2,51 (m, 4H), 2,44 (tt, 1H), 2,30 (m, 1H), 1,92 (d, 2H), 1,85 (d, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,34 (m, 2H) ppm. CL/EM (CH3CN al 5-45%) 405,1 (M+H), 403,2 (M-H), tR = 3,4 min. HPLC: 2,798 min.
15 Síntesis de N3-[4-(4-Morfolin-4-il-ciclohexil)-fenil]-1-piridin-2-il-1H-[1,2,4]triazol-3,5diamina
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Una solución de (Z)-3-(4-(4-morfolinociclohexil)fenil)-2-fenilisourea 7a (7,00 g, 17,3 mmol) y 2-piridil-hidrazina (2,27 g, 20,8 mmol) se calentó a reflujo en isopropanol (100 ml) 20 durante 2 días. La reacción se enfrió, se filtró y el sólido resultante se lavó con etanol. El precipitado se recristalizó en dioxano y los cristales se filtraron, se suspendieron en metanol
con agitación durante 1 h, se evaporaron y se secaron a 60ºC a alto vacío durante 3 d. Esto proporcionó I-3 puro (4,88 g, rendimiento del 67%) en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (500 MHz, dmso-d6) 8,92 (s, 1H), 8,40 (m, 1H), 7,97 (m, 1H), 7,68 (d, 1H), 7,63 (s, 2H), 7,51 (d, 2H), 7,20 (m, 1H), 7,09 (d, 2H), 3,57 (m, 4H), 2,50 (m, 4H), 2,37 (tt, 1H), 2,26 (tt, 2H), 1,91 (d, 2H), 1,84 (d, 2H), 1,43 (m, 2H), 1,33 (m, 2H) ppm. CL/EM (CH3CN al 5-95%) 420,0 (M+H), tR = 3,1 min. HPLC: 2,602 min
Síntesis de N3-[4-(4-morfolin-4-il-ciclohexil)-fenil]-1-piridin-2-il-1H-[1,2,4]triazol-3,5
imagen4
El Ejemplo 1 (128,0 g, 0,305 mol) se suspendió en dioxano (1,5 l) y se calentó a 6070ºC. Se añadió gota a gota ácido metanosulfónico (19,8 ml, 0,305 mol) durante 10 min. La agitación se continuó durante 1 h a 60-70ºC y 3 h a temperatura ambiente. El sólido se filtró y se lavó con Et2O, después se suspendió 4 veces en metanol y se evaporó antes de secarse a
15 alto vacío a 50-60ºC durante 20 h. Este procedimiento de suspensión/evaporación/secado se repitió una vez más con metanol y después una vez más con etanol en un intenso fallido de liberar a la sal de las trazas de dioxano. El sólido se suspendió en agua (1 l) y se calentó a reflujo durante 15 min y después se usó una centrífuga para separar el sólido del agua. La centrifugación se repitió dos veces más. El sólido húmedo se diluyó con etanol, se evaporó y se
20 secó a 45-50ºC a alto vacío, proporcionando I-3, sal mesilato (129,95 g) en forma de un sólido de color blanco. El producto final contenía (según el análisis por RMN) dioxano al 0,3%. RMN 1H (500 MHz, dmso-d6) 9,51 (s a, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,41 (m, 1H), 7,99 (m, 1H), 7,69 (d, 1H), 7,64 (s, 2H), 7,54 (d, 2H), 7,21 (m, 1H), 7,11 (d, 2H), 4,02 (d, 2H), 3,72 (t, 2H), 3,44 (d, 2H), 3,28 (m, 1H), 3,14 (m, 2H), 2,46 (m, 1H), 2,34 (s, 3H), 2,19 (m, 2H), 1,95 (m, 2H), 1,53 (m,
25 4H) ppm. CL/EM (CH3CN al 5-95%) 420,1 (M+H), tR = 3,2 min. HPLC: 2,593 min.
Ejemplo 2: 1-(4-(5-Amino-1-(piridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-ilamino)fenil-4morfolinociclohexano carbonitrilo
imagen1
Síntesis de (Z)-1-ciano-3-(4-((1S,4S)-1-ciano-4-morfolinociclohexil)fenil)-2fenilisourea (6)
imagen1
El intermedio 5a se preparó como se ha descrito en el Ejemplo 1, se pusieron trans-4
morfolino-1-(4-nitrofenil)ciclohexanocarbonitrilo (20 g, 63,5 mmol) y catalizador de Pd al 10%-C
(750 mg) en 250 ml de etanol en una atmósfera de hidrógeno (262,00 kPa (38 psi)) en un
10 agitador Parr durante 2 horas. Se añadió diclorometano, 200 ml, para disolver el producto y el catalizador se retiró por filtración. Los disolventes se evaporaron, proporcionando trans-1-(4amino-fenil)-4-morfolin-4-il-ciclohexanocarbonitrilo (18,1 g, 63,5 mmol) en forma de un sólido de color amarillo-castaño puro que se usó sin purificación adicional. RMN CDCl3: 7,25 (m, 2H), 6,70 (m, 2H), 3,7 (m, 6H), 2,65 (m, 4H), 2,35 (m, 1H), 2,25 (m, 2H),
15 2,05 (m, 2H), 1,85 (m, 4H), AIF-EM m+1, 286,0 HPLC: procedimiento CH3CN al 10-90%: 2,488 min 100% Una solución del trans-1-(4-amino-fenil)-4-morfolin-4-il-ciclohexano carbonitrilo proporcionado (18,1 g, 63,5 mmol) y cianocarbonimidato de difenilo (18,1 g, 76,2 mmol) se agitó en 1,4-dioxano (140 ml) a TA durante 24 h. Se añadió agua destilada (200 ml) para
20 proporcionar un precipitado de color blanco que se filtró y se lavó con agua (100 ml), una solución saturada de bicarbonato sódico (150 ml) y agua (200 ml). El sólido se secó en un desecador al vacío durante una noche, dando el compuesto del título 6 (21,1 g, rendimiento del 78%). RMN 1H (DMSO, 500 MHz) 7,55 (m, 4H), 7,45 (m, 2H), 7,3 (m, 3H), 3,6 (m, 4H), 2,45 (m, 4H), 2,37 (t, 1H), 2,15 (d, 2H), 2,0 (d, 2H), 1,9 (t, 2H), 1,6 (m, 2H)]
25 EM+ 430,18, EM-428,13, tR de HPLC = 4,652 min (condiciones acetonitrilo al 10-90% durante 7,5 min.
Síntesis de 1-(4-(5-amino-1-(piridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-ilamino)fenil-4morfolinociclohexano carbonitrilo
imagen1
5 Se añadió 1-(4-(5-amino-1-(piridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-ilamino)fenil-4morfolinociclohexano carbonitrilo, (73 g, 0,164 mol), a dioxano (1 l) y la mezcla se calentó a 6070ºC. Se añadió gota a gota ácido metanosulfónico, (15,8 g, 0,164 mol), durante 10 min. El baño de calentamiento se retiró y la suspensión se dejó en agitación durante 3 horas. Se añadió isopropano (200 ml) y la mezcla se filtró. La sal se lavó con isopropanol, (50 ml),
10 seguido de éter dietílico (200 ml). El sólido se suspendió en metanol al 10%-diclorometano (500 ml) y se agitó durante 18 horas. Se añadió isopropanol (100 ml) y el sólido se filtró y después se lavó con éter, obteniendo la sal mesilato pura (I-4, sal mesilato) en forma de un sólido de color blanco (81 g, rendimiento del 91%). RMN: DMSO-d6: 9,70 (s a, 1H), 9,25 (s, 1H), 8,40 (s, 1H), 7,95 (m, 1H), 7,65 (m, 3H), 7,40 (m, 2H), 7,20 (m, 1H), 4,06 (m, 2H), 3,75 (m, 2H), 3,55 (m,
15 2H), 3,50 (s a, 1H), 3,35 (m, 1H), 3,15 (m, 2H), 2,32 (m, 7H), 1,90 (m, 2H), 1,80 (m, 2H). AIF EM m+1 445,2 CL-EM m+1: 445,3 1,88 min procedimiento CH3CN al 10-90% HPLC: procedimiento CH3CN al 10-90%: 4,2 min 100% Los compuestos de fórmulas I, II y II pueden prepararse por un experto en la materia por
20 procedimientos sustancialmente similares a los descritos en el presente documento. Ejemplo 3: Datos Analíticos Se han preparado una diversidad de otros compuestos de Fórmula I por procedimientos sustancialmente similares a los descritos en el presente documento. Los datos de caracterización representativos para estos compuestos se resumen en la Tabla 1 que se
25 muestra a continuación e incluye los datos de HPLC, CL/EM (observado), tiempo de retención (TR) y RMN 1H. Los números de los compuestos corresponden a los números de los compuestos proporcionados en el presente documento.
Nº de comp.
CL/EM TR RMN 1H
I-1
420,10 3,10 (500 MHz, dmso-d6) 9,01 (s, 1H), 8,41 (m, 1H), 7,97 (m, 1H), 7,68 (d, 1H), 7,65 (s, 2H), 7,59 (d, 2H), 7,23 (d, 2H), 7,21 (m, 1H), 3,98 (d, 2H), 3,68 (t, 2H), 3,49 (d, 2H), 3,32 (m, 1H), 3,04 (m, 2H), 2,85 (m, 1H), 2,11 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,75 (m, 4H) ppm
I-2
445,00 3,20 (500 MHz, dmso-d6) 9,21 (s, 1H), 8,41 )m, 1H), 7,98 (m, 1H), 7,73 (d, 1H), 7,67 (m, 4H), 7,39 (d, 2H), 7,21 (m, 1H), 3,58 (m, 4H), 2,38 (m, 4H), 2,25 (m, 3H), 1,89 (m, 4H), 1,72 (m, 2H) ppm
I-5
484,00 3,20 (dmso-d6, 500 MHz) 9,24 (s, 1H), 8,42 (m, 1H), 7,98 (m, 1H), 7,71 (d, 1H), 7,67 (m, 4H), 7,40 (d, 2H), 7,22 (m, 1H), 3,53 (m, 2H), 3,28 (m, 1H), 3,16 (m, 2H), 2,99 (m, 2H), 2,66 (d, 2H), 2,28 (m, 4H), 1,91 (m, 3H), 1,78 (m, 2H), 0,54 (m, 2H), 0,45 (m, 2H) ppm
I-6
486,20 2,05 DMSO-d6: 8,90 (s, 1H), 8,40 (m, 1H), 7,98 (m, 1H), 7,75 (m, 1H), 7,65 (s, 2H), 7,50 (m, 2H), 7,20 (m, 1H), 7,10 (m, 2H), 4,02 (s, 2H), 4,50 (m, 2H), 4,40 (m, 2H), 2,60 (m, 1H), 2,45 (m, 4H), 2,22 (s, 1H), 2,1,85 (m, 4H), 1,50 (m, 4H).
I-7
459,10 3,10 (500 MHz, dmso-d6) 9,00 (s, 1H), 8,41 (m, 1H), 7,97 (m, 1H), 7,68 (d, 1H), 7,65 (s, 2H), 7,58 (d, 2H), 7,22 (m, 3H), 3,50 (m, 2H), 3,30 (m, 1H), 3,08 (m, 2H), 2,98 (m, 2H), 2,85 (m, 1H), 2,63 (m, 2H), 2,12 (m, 2H), 1,8 (m, 7H), 0,50 (m, 2H), 0,39 (m, 2H) ppm
I-8
419,20 1,54 DMSO-d6: 8,95 (s, 1H), 8,40 (m, 1H), 7,95 (m, 1H), 7,68 (m, 1H), 7,60 (s a, 2H), 7,55 (m, 2H), 7,20 (m, 1H), 7,10 (m, 2H), 5,1 (s muy a, 1H), 2,85 (m, 4H), 4,60 (m, 1H), 2,50 (m, 4H), 2,20 (m, 1H), 1,90 (m, 2H), 1,80 (m, 2H), 1,45 (m, 4H).
I-9
459,10 3,10 (500 MHz, dmso-d6) 8,98 (s, 1H), 8,40 (m, 1H), 7,97 (m, 1H), 7,68 (d, 1H), 7,64 (s, 2H), 7,53 (d, 2H), 7,19 (m, 1H), 7,09 (d, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,26 (m, 1H), 3,10 (m, 2H), 2,99 (m, 2H), 2,63 (m, 3H), 2,15 (m, 2H), 1,93 (d, 2H), 1,81 (m, 1H), 1,50 (m, 4H), 0,50 (m, 2H), 0,39 (m, 2H) ppm
I-10
447,20 1,74 MeOH-d4: 8,40 (m, 1H), 7,90 (m, 1H), 7,75 (m, 1H), 7,50 (m, 2H), 7,15 (m, 3H), 3,5-2,5 (m, 10H), 2,0 (m, 4H), 1,70 (m, 4H), 1,30 (t,3H).
(cont.)
Nº de comp.
CL/EM TR RMN 1H
I-11
418,00 2,20 (500 MHz, dmso-d6) 8,98 (s, 1H), 8,42-8,39 (m, 1H), 8,00-7,93 (m, 1H), 7,73-7,59 (m, 3H), 7,56 (d, 2H), 7,24-7,16 (m, 1H), 7,11 (d, 2H), 3,40 (d, 2H), 3,29-3,17 (m, 1H), 3,05-2,91 (m, 2H), 2,45 (m, 1H), 2,11 (m, 2H), 1,93 (d, 2H), 1,85 (d, 2H), 1,76-1,34 (m, 8H) ppm
I-12
483,00 3,10 (500 MHz, dmso-d6) 8,93 (s, 1H), 7,94 (d, 2H), 7,79 (d, 2H), 7,48 (d, 2H), 7,08 (d, 2H), 6,73 (s, 2H), 3,44 (m, 2H), 3,25 (m, 2H), 3,05 (m, 2H), 2,98 (m, 1H), 2,58 (m, 2H), 2,42 (m, 1H), 2,15 (m, 2H), 1,92 (m, 2H), 1,75 (m, 1H), 1,53 (m, 4H), 0,47 (m, 2H), 0,35 (m, 2H) ppm
I-13
561,10 2,00 DMSO-d6: 10,60 (s a, 1H); 9,10 (s a, 1H); 8,38 (d, 1H); 7,80-8,20 (s a, 2H); 7,48 (d, 2H); 7,30 (m, 2H); 6,62 (m, 1H); 3,30-4,10 (m, 15H); 3,00 (m, 2H); 2,78 (m, 1H); 2,20 (m, 2H); 1,62-1,98 (m, 11H)
I-14
586,10 2,00 DMSO-d6: 9,35 (s, 1H); 9,20 (s a, 1H); 8,35 (d, 1H); 7,78 (s a, 2H); 7,70 (d, 2H); 7,48 (d, 2H); 6,62 (d, 1H); 3,50-4,00 (m, 10H); 3,40-3,50 (m, 5H); 3,00 (m, 2H); 2,72 (m, 2H); 1,75-2,15 (m, 9H); 1,52 (m, 2H)
I-15
586,10 2,00 DMSO-d6: 9,73 (s a, 1H); 9,28 (s, 1H); 8,35 (d, 1H); 7,76 (s a, 2H); 7,62 (d, 2H); 7,35 (d, 2H); 6,62 (d, 1H); 3,55-4,08 (m, 10H); 3,25-3,55 (m, 5H); 3,15 (m, 2H); 2,32 (m; 4H); 1,75-2,15 (m, 9H)
I-16
561,10 2,10 DMSO-d6: 9,60 (s a, 1H); 9,05 (s, 1H); 8,35 (d, 1H); 7,78 (s a, 2H); 7,50 (d, 2H); 7,08 (d, 2H); 6,60 (d, 1H); 3,50-4,10 (m, 11H); 3,45 (m, 4H); 3,25 (m, 1H); 3,15 (m, 2H); 2,12 (m, 2H); 1,70-2,00 (m, 7H); 1,50 (m, 4H)
Ejemplo 4: Inhibición de FLT-3
Se exploraron compuestos para determinar su capacidad para inhibir la actividad de
5 FLT-3 usando un ensayo de unión con filtro radiométrico. Este ensayo controla la incorporación de 33P en un sustrato de poli(Glu, Tyr) 4:1 (pE4Y). Las reacciones se llevaron a cabo en una solución que contenía HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, DTT 1 mM, BSA al 0,01% y DMSO al 2,5%. Las concentraciones de sustrato finales en el ensayo eran de ATP 90 µM y pE4Y 0,5 mg/ml (ambos de Sigma Chemicals, St Louis, MO). La concentración final de
10 compuestos es generalmente de entre 0,01 y 5 µM. Típicamente, se realizó una valoración de 12 puntos preparando diluciones seriadas de solución madre de compuesto de ensayo en
DMSO 10 mM. Las reacciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente.
Se prepararon dos soluciones de ensayo. La Solución 1 contiene HEPES 100 mM (pH 7,5), MuCl 10 mM, NaCl 25 mM, pE4Y 1 mg/ml y ATP 180 µM (que contiene 0,3 µCi de [γ-33P]ATP para cada reacción). La Solución 2 contiene HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, DTT 2 mM, BSA al 0,02% y FLT-3 3 nM. El ensayo se procesó en una placa de 96 pocillos mezclando 50 µl de cada de Solución 1 y 2,5 ml de los compuestos de ensayo. La reacción se inició con la Solución 2. Después de la incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente, la reacción se interrumpió con 50 µl de TCA al 20% que contenía 0,4 mM de ATP. Todo el volumen de reacción se transfirió después a una placa con filtro y se lavó con TCA al 5% mediante un Harvester9600 de TOMTEC (Hamden, CT). La cantidad de incorporación de 33P en pE4y se analizó mediante un Contador de Escintilación en Microplaca TopCount de Packard (Meriden, CT). Los datos se ajustaron usando el programa informático Prism para dar una CI50 o Ki.
Los compuestos de la invención son eficaces para la inhibición de FLT-3.
Ejemplo 5: Inhibición de c-KIT
Se exploraron compuestos para determinar su capacidad para inhibir la actividad de c-KIT usando un ensayo de unión con filtro radiométrico. Este ensayo controla la incorporación de 33P en un sustrato de poli(Glu, Tyr) 4:1 (pE4Y). Las reacciones se llevaron a cabo en una solución que contenía HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, DTT 1 mM, BSA al 0,01% y DMSO al 2,5%. Las concentraciones de sustrato finales en el ensayo eran de ATP 700 µM y pE4Y 0,5 mg/ml (ambos de Sigma Chemicals, St Louis, MO). La concentración final de compuestos es generalmente de entre 0,01 y 5 µM. Típicamente, se realizó una valoración de 12 puntos preparando diluciones seriadas de solución madre de compuesto de ensayo en DMSO 10 mM. Las reacciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente.
Se prepararon dos soluciones de ensayo. La Solución 1 contiene HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, pE4Y 1 mg/ml y ATP 1,4 mM (que contiene 0,5 µCi de [γ-33P]ATP para cada reacción). La Solución 2 contiene HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, DTT 2 mM, BSA al 0,02% y c-KIT 25 nM. El ensayo se procesó en una placa de 96 pocillos mezclando 33 µl de la Solución 1 y 1,65 µl de los compuestos de ensayo. La reacción se inició con 33 µl de Solución 2. Después de la incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente, la reacción se interrumpió con 50 µl de TCA al 10% que contenía 0,2 mM de ATP. Todo el volumen de reacción se transfirió después a una placa con filtro y se lavó con TCA al 5% mediante un Harvester9600 de TOMTEC (Hamden, CT). La cantidad de incorporación de 33P en pE4y se analizó mediante un Contador de Escintilación en Microplaca TopCount de Packard (Meriden, CT). Los datos se ajustaron usando el programa informático
Prism para dar una CI50 o Ki. Los compuestos de la invención son eficaces para la inhibición de c-KIT.
Ejemplo 6: Inhibición de GSK-3
Se exploraron compuestos para determinar su capacidad para inhibir la actividad de GSK-3β (AA 1-420) usando un sistema enzimático acoplado convencional (Fox y col. (1998) Protein Sci. 7, 2249). Las reacciones se llevaron a cabo en una solución que contenía HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, NADH 300 µM, DTT 1 mM y DMSO al 1,5%. Las concentraciones de sustrato finales en el ensayo eran de ATP 20 µM (Sigma Chemicals, St Louis, MO) y péptido 300 µM (American Peptide, Sunnyvale, CA). Las reacciones se llevaron a cabo a 30ºC y GSK-3β 20 nM. Las concentraciones finales de los componentes del sistema enzimático acoplado eran de fosfoenolpiruvato 2,5 mM, NADH 300 µM, piruvato quinasa 30 µg/ml y lactato deshidrogenasa 10 µg/ml.
Se preparó una solución madre de tampón de ensayo que contenía todos los reactivos enumerados anteriormente con la excepción del ATP y el compuesto de ensayo de interés. La solución madre de tampón de ensayo (175 µl) se incubó en una placa de 96 pocillos con 5 µl del compuesto de ensayo de interés a concentraciones finales que abarcaban de 0,002 µMa 30 µM a 30ºC durante 10 min. Típicamente, se realizó una valoración de 12 puntos preparando diluciones seriadas (a partir de soluciones madre de compuesto 10 mM) con DMSO de los compuestos de ensayo en placas hijas. La reacción se inició por adición de 20 µl de ATP (concentración final 20 µM). Se obtuvieron las velocidades de reacción usando un lector de placas Spectramax de Molecular Devices (Sunnyvale, CA) durante 10 min a 30ºC. Los valores de Ki se determinaron a partir de los datos de velocidad en función de la concentración de inhibidor.
Los compuestos de la invención son eficaces para la inhibición de GSK-3.
Ejemplo 7: Inhibición de CDK-2
Se exploraron compuestos para determinar su capacidad para inhibir CDK-2/Ciclina A usando un ensayo enzimático acoplado convencional (Fox y col. (1998) Protein Sci. 7, 2249). Las reacciones se llevaron a cabo en HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, DTT 1 mM y DMSO al 1,5%. Las concentraciones de sustrato finales en el ensayo eran de ATP 100 µM (Sigma Chemicals) y péptido 100 µM (American Peptide, Sunnyvale, CA). Los ensayos se llevaron a cabo a 30ºC y CDK-2/Ciclina A 25 nM. Las concentraciones finales de los componentes del sistema enzimático acoplado eran de fosfoenolpiruvato 2,5 mM, NADH 350 µM, piruvato quinasa 30 µg/ml y lactato deshidrogenasa 10 µg/ml.
Se preparó una solución madre de tampón de ensayo que contenía todos los reactivos enumerados anteriormente con la excepción de la CDK-2/Ciclina A, el DTT y el compuesto de ensayo de interés. Se pusieron 56 µl de la reacción de ensayo en una placa de 384 pocillos, seguido de la adición de 1 µl de solución madre en DMSO 2 mM que contenía el compuesto de ensayo (concentración de compuesto final 30 µM). La placa se preincubó durante ∼10 minutos a 30ºC y la reacción se inició por adición de 10 µl de enzima (concentración final 25 nM). Se obtuvieron las velocidades de reacción usando un lector de placas Ultramark de BioRad (Hercules, CA) durante un tiempo de lectura de 5 minutos a 30ºC. Se determinaron los valores de Ki de acuerdo con procedimientos convencionales.
Los compuestos de la invención son eficaces para la inhibición de CDK-2.
Ejemplo 8: Inhibición de SRC
Los compuestos se evaluaron como inhibidores de la Src quinasa humana usando un ensayo basado en radiactividad o un ensayo espectrofotométrico.
Ensayo de Inhibición de Src A: Ensayo basado en Radioactividad
Los compuestos se ensayaron como inhibidores de la Src quinasa humana recombinante de longitud completa (de Upstate Biotechnology, nº cat. 14-117) expresada y purificada a partir de células de baculovirus. La actividad de la Src quinasa se controló siguiendo la incorporación de 33P de ATP en la tirosina de un sustrato polimérico de poli Glu-Tyr aleatorio de composición Glu:Tyr = 4:1 (Sigma, nº cat. P-0275). Los siguientes son las concentraciones finales de los componentes de ensayo: HEPES 0,05 M, pH 7,6, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, BSA 0,25 mg/ml ATP 10 µM (1-2 µCi de 33P-ATP por reacción), poli Glu-Tyr 5 mg/ml y 1-2 unidades de Src quinasa humana recombinante. En un ensayo típico, todos los componentes de reacción con la excepción del ATP se premezclaron y se dividieron en alícuotas en pocillos de placas de ensayo. Se añadieron inhibidores disueltos en DMSO a los pocillos para dar una concentración final de DMSO del 2,5%. La placa de ensayo se incubó a 30ºC durante 10 min antes de iniciar la reacción con 33P-ATP. Después de 20 min de reacción, las reacciones se inactivaron con 150 µl de ácido tricloroacético al 10% (TCA) que contenía Na3PO4, 20 mM. Las muestras inactivadas se transfirieron después a una placa con filtro de 96 pocillos (Whatman, UNI-Filter GF/F Glass Fiber Filter, nº cat. 7700-3310) instalada en un colector al vacío de placas con filtro. Las placas con filtro se lavaron cuatro veces con TCA al 10% que contenía Na3PO4 20 mM y después 4 veces con metanol. Después se añadieron 200 µl del líquido de escintilación a cada pocillo. Las placas se sellaron y la cantidad de radiactividad asociada con los filtros se cuantificó en un contador de escintilación TopCount. La radiactividad incorporada se representó en función de la concentración de inhibidor. Los datos se ajustaron a un modelo de cinética de inhibición competitiva para dar la Ki para el compuesto.
Ensayo de Inhibición de Src B: Ensayo Espectrofotométrico
El ADP producido a partir de ATP por la fosforilación catalizada por Src quinasa recombinante humana del sustrato poli Glu-Tyr se cuantificó usando un ensayo enzimático acoplado (Fox y col (1998) Protein Sci 7, 2249). En este ensayo, se oxidó una molécula de NADH a NAD por cada molécula de ADP producida en la reacción de la quinasa. La desaparición de NADH se sigue convenientemente a 340 nm.
Los siguiente son las concentraciones finales de los componentes de ensayo: HEPES 0,025 M, pH 7,6, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, poli Glu-Tyr 0,25 mg/ml y 25 nM de Src quinasa humana recombinante. Las concentraciones finales de los componentes del sistema enzimático acoplado son de fosfoenolpiruvato 2,5 mM, NADH 200 µM, piruvato quinasa 30 µg/ml y lactato deshidrogenasa 10 µg/ml.
En un ensayo típico, todos los componentes de reacción con la excepción del ATP se premezclaron y se dividieron en alícuotas en pocillos de placas de ensayo. Se añadieron inhibidores disueltos en DMSO a los pocillos para dar una concentración final de DMSO del 2,5%. La placa de ensayo se incubó a 30ºC durante 10 min antes de iniciar la reacción con ATP 100 µM. El cambio de absorbancia a 340 nm con el tiempo, la velocidad de la reacción, se controlaron en un lector de placas de Molecular Devices. Los datos de velocidad en función de la concentración de inhibidor se ajustaron a un modelo de cinética de inhibición competitiva para dar la Ki para el compuesto.
Los compuestos de la invención son eficaces para inhibición de SRC.
Ejemplo 9: Inhibición de SYK
Se exploraron compuestos para determinar su capacidad para inhibir SYK usando un ensayo enzimático acoplado convencional (Fox y col. (1998) Protein Sci. 7, 2249). Las reacciones se llevaron a cabo en HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, DTT 1 mM y DMSO al 1,5%. Las concentraciones de sustrato finales en el ensayo eran de ATP 200 µM (Sigma Chemicals, Co) y péptido poli Gly-Tyr 4 µM (Sigma Chemicals, Co). Los ensayos se llevaron a cabo a 30ºC y SYK 200 nM. Las concentraciones finales de los componentes del sistema enzimático acoplado eran de fosfoenolpiruvato 2,5 mM, NADH 300 µM, piruvato quinasa 30 µg/ml y lactato deshidrogenasa 10 µg/ml.
Se preparó una solución madre de tampón de ensayo que contenía todos los reactivos enumerados anteriormente con la excepción de Syk, DTT y el compuesto de ensayo de interés. Se pusieron 56 µl de la reacción de ensayo en una placa de 96 pocillos, seguido de la adición de 1 µl de solución madre en DMSO 2 mM que contenía el compuesto de ensayo (concentración de compuesto final 30 µM). La placa se preincubó durante ∼10 minutos a 30ºC y la reacción se inició por adición de 10 µl de enzima (concentración final de 25 nM). Se obtuvieron las velocidades de reacción usando un lector de placas Ultramark de BioRad (Hercules, CA) durante un tiempo de lectura de 5 minutos a 30ºC y se determinaron los valores
de Ki de acuerdo con procedimientos convencionales. Los compuestos de la invención son eficaces para la inhibición de SYK.
Ejemplo 10: Inhibición de FMS
Se exploraron compuestos para determinar su capacidad para inhibir la actividad de FMS usando un ensayo de unión con filtro radiométrico. Este ensayo controla la incorporación de 33P en un sustrato de poli(Glu, Tyr) 4:1 (pE4Y). Las reacciones se llevaron a cabo en una solución que contenía HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, DTT 1 mM, BSA al 0,01% y DMSO al 2,5%. Las concentraciones de sustrato finales en el ensayo eran de ATP 90 µM y pE4Y 0,5 mg/ml (ambos de Sigma Chemicals, St Louis, MO). La concentración final de compuestos es generalmente de entre 0,01 y 5 µM. Típicamente, se realizó una valoración de 12 puntos preparando diluciones seriadas de solución madre de compuesto de ensayo en DMSO 10 mM. Las reacciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente.
Se prepararon dos soluciones de ensayo. La Solución 1 contiene HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, pE4Y 1 mg/ml y ATP 180 µM (que contiene 0,3 µCi de [γ-33P]ATP para cada reacción). La Solución 2 contiene HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, DTT 2 mM, BSA al 0,02% y FMS 3 nM. El ensayo se procesó en una placa de 96 pocillos mezclando 50 µl de cada de Solución 1 y 2,5 ml de los compuestos de ensayo. La reacción se inició con las soluciones. Después de la incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente, la reacción se interrumpió con 50 µl de TCA al 20% que contenía 0,4 mM de ATP. Todo el volumen de reacción se transfirió después a una placa con filtro y se lavó con TCA al 5% mediante un Harvester9600 de TOMTEC (Hamden, CT). La cantidad de incorporación de 33P en pE4y se analizó mediante un Contador de Escintilación en Microplaca TopCount de Packard (Meriden, CT). Los datos se ajustaron usando el programa informático Prism para dar una CI50 o Ki.
Los compuestos de la invención son eficaces para la inhibición de FMS.
Ejemplo 11: Ensayo de Inhibición de Rock
Se exploraron compuestos para determinar su capacidad para inhibir la actividad de ROCK I (AA 6-553) usando un sistema enzimático acoplado convencional (Fox y col. (1998) Protein Sci. 7, 2249). Las reacciones se llevaron a cabo en una solución que contenía HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, DTT 2 mM y DMSO al 1,5%. Las concentraciones de sustrato finales en el ensayo eran de ATP 45 µM (Sigma Chemicals, St Louis, MO) y péptido 200 µM (American Peptide, Sunnyvale, CA). Las reacciones se llevaron a cabo a 30ºC y ROCK I 45 nM. Las concentraciones finales de los componentes del sistema enzimático acoplado eran de fosfoenolpiruvato 2,5 mM, NADH 350 µM, piruvato quinasa 30 µg/ml y lactato deshidrogenasa 10 µg/ml.
Se descubrió que determinados compuestos de la invención inhibían ROCK.
Ejemplo 12: Ensayo de Inhibición de JAK3
Se ensayó la inhibición por compuesto de JAK mediante el procedimiento descrito por
G. R. Brown, y col, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, vol. 10, págs. 575-579 de la forma siguiente. En placas Maxisorb, previamente revestidas a 4ºC con Poli (Glu, Ala, Tyr) 6:3:1 y después lavadas con solución salina tamponada con fosfato al 0,05% y Tween (PBST), se añadió ATP 2 µM, MgCl2 5 mM y una solución de compuesto en DMSO. La reacción se inició con enzima JAK y las placas se incubaron durante 60 minutos a 30ºC. Después las placas se lavaron con PBST, se añadieron 100 µl de anticuerpo 4G10 conjugado con HRP y la placa se incubó durante 90 minutos a 30ºC. La placa se lavó de nuevo con PBST, se añadieron 100 µl de solución TMB y las placas se incubaron durante otros 30 minutos a 30ºC. Se añadió ácido sulfúrico (10 µl de 1 M) para detener la reacción y la placa se leyó a 450 nm para obtener las densidades ópticas para el análisis para determinar los valores de Ki.
Los compuestos de la invención son eficaces para la inhibición de JAK-3.
Ejemplo 13: Ensayo de Inhibición de PDK-1
Se exploraron compuestos para determinar su capacidad para inhibir PDK-1 usando un ensayo de incorporación de fosfato radiactivo (Pitt y Lee, J. Biomol. Screen., (1996) 1, 47). Los ensayos se llevaron a cabo en una mezcla de HEPES 100 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, NaCl 25 mM, DTT 2 mM. Las concentraciones de sustrato finales en el ensayo eran de ATP 40 µM (Sigma Chemicals) y péptido 65 µM (PDKtide, Upstate Lake Placid, NY). Los ensayos se llevaron a cabo a 30ºC y PDK-1 25 nM en presencia de -27,5 nCi/µl de [γ-32P]ATP (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Reino Unido). Se preparó una solución madre de tampón de ensayo que contenía todos los reactivos enumerados anteriormente con la excepción del ATP y el compuesto de ensayo de interés. Se pusieron 15 µl de la solución madre en una placa de 96 pocillos, seguido de la adición de 1 µl de solución madre en DMSO 0,5 mM que contenía el compuesto de ensayo (concentración de compuesto final 25 µM, concentración final de DMSO al 5%). La placa se preincubó durante aproximadamente 10 minutos a 30ºC y la reacción se inició por adición de 4 µl de ATP (concentración final 40 µM).
La reacción se interrumpió después de 10 minutos por adición de 100 µl de ácido fosfórico 100 mM, Tween-20 al 0,01%. Se pretrató una placa de 96 pocillos de fosfocelulosa (Millipore, nº cat. MAPHNOB50) con 100 µl de ácido fosfórico 100 mM, Tween-20 al 0,01% antes de la adición de la mezcla de reacción (100 µl). Las manchas se dejaron en remojo durante al menos 5 minutos antes de las etapas de lavado (4 x 200 µl de ácido fosfórico 100 mM, Tween-20 al 0,01%). Después del secado, se añadieron 20 µl de cóctel de escintilación líquida Optiphase ’SuperMix’ (Perkin Elmer) al pocillo antes del recuento de escintilación (Contador de Escintilación Líquida 1450 Microbeta, Wallac).
Los compuestos que mostraban una inhibición superior al 50% frente a los pocillos de
patrón que contenían la mezcla de ensayo y DMSO sin compuesto de ensayo se valoraron
para determinar los valores de CI50.
Los compuestos de la invención son eficaces para la inhibición de PDK-1.

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de fórmula (II):
    imagen1
    5 en la que X es N; Y es NR°u O; n es 0; m es 0;
    10 p es 0; R1 es -N(H)R2; R2 es hidrógeno; R3 es 2-piridilo; R5 es hidrógeno o -CN;
    15 en la que cada aparición independiente de R° se selecciona entre hidrógeno, alifático C1-6 opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo o heterocíclico de 5-6 miembros, sin sustituir (con la condición de que un átomo de nitrógeno en el anillo heterocíclico esté opcionalmente sustituido con -R+ o -C(O)R+, en los que R+ es (alquilo C1-6), preferentemente (alquilo C1-4), fenilo, -O(Ph) o -CH2(Ph), o, no obstante de la definición anterior, dos apariciones
    20 independientes de R°, en el mismo sustituyente o en sustituyentes diferentes, tomados junto con el átomo o átomos a los que está unido cada grupo R°, forman un anillo heterociclilo, arilo
    o heteroarilo de 5-8 miembros o un anillo cicloalquilo de 3-8 miembros que tiene 0-3 heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno o azufre; en la que cada aparición independiente de R° se selecciona entre hidrógeno, alifático C1-6
    25 opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo o heterocíclico de 5-6 miembros, sin sustituir, fenilo, -O(Ph) o -CH2(Ph), o, no obstante de la definición anterior, dos apariciones independientes de R°, en el mismo sustituyente o en sustituyentes diferentes, tomados junto con el átomo o átomos a los que está unido cada grupo R°, forman un anillo heterociclilo, arilo
    o heteroarilo de 5-8 miembros o un anillo cicloalquilo de 3-8 miembros que tiene 0-3 30 heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno o azufre; el grupo alifático de R° está opcionalmente sustituido con NH2, NH(alifático C1-4), N(alifático C1-4)2, halógeno, alifático C1-4, OH, O(alifático C1-4), NO2, CN, CO(2H, CO2(alifático C1-4), O(haloalifático C1-4) o halo(alifático C1-4), en los que cada uno de los grupos alifáticos C1-4 anteriores está sin sustituir;
    5 cada R* se selecciona independientemente entre hidrógeno o un alifático C1-6 opcionalmente sustituido con NH2, NH(alifático C1-4), N(alifático C1-4)2, halógeno, alifático C1-4, OH, O(alifático C1-4), NO2, CN, CO2H, CO2(alifático C1-4), O(haloalifático C1-4) o halo(alifático C1-4), en los que cada uno de los grupos alifáticos C1-4 anteriores está sin sustituir; y R es hidrógeno o un grupo alifático C1-6, opcionalmente sustituido con =O, =S, -NH2,
    10 NH(alifático C1-4), N(alifático C1-4)2, halógeno, alifático C1-4, OH, O(alifático C1-4), NO2, CN, CO2H, CO2(alifático C1-4), O(haloalifático C1-4) o halo(alifático C1-4), en los que cada uno de los grupos alifáticos C1-4 anteriores está sin sustituir.
  2. 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la fórmula (I-b) o (I-c):
    imagen2
    en las que dicho compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en:
    imagen1
    imagen1
  3. 3.
    Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionándose dicho compuesto entre el grupo que consiste en:
  4. 4.
    Una composición farmacéutica que comprende:
    un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  5. 5.
    La composición de la reivindicación 4, que comprende además un agente terapéutico adicional seleccionado de un agente quimioterápico o antiproliferativo, un tratamiento para la Enfermedad de Alzheimer, un tratamiento para la Enfermedad de Parkinson, un agente para tratar la esclerosis múltiple (EM), un tratamiento para el asma, un agente para tratar la esquizofrenia, un agente antiinflamatorio, un agente inmunomodulador o inmunosupresor, un factor neurotrófico, un agente para tratar una enfermedad cardiovascular, un agente para tratar trastornos óseos destructivos, un agente para tratar una enfermedad hepática, un agente para tratar una trastorno sanguíneo o un agente para tratar un trastorno de inmunodeficiencia.
  6. 6.
    Un procedimiento in vitro de inhibición de la actividad quinasa de FLT-3 en una muestra
    imagen3
    biológica, que comprende la etapa de poner en contacto dicha muestra biológica con:
    a) una composición de acuerdo con la reivindicación 4; o
    b) un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una sal
    farmacéuticamente aceptable del mismo.
  7. 7.
    Una composición de acuerdo con la reivindicación 4, o un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la inhibición de la actividad quinasa de FLT-3 en un paciente.
  8. 8.
    Una composición de acuerdo con la reivindicación 4; o un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en el tratamiento o disminución de la gravedad de una enfermedad o afección seleccionada de trastornos alérgicos, trastornos proliferativos, trastornos autoinmunes, afecciones asociadas con el trasplante de órganos, trastornos inflamatorios, trastornos mediados inmunológicamente o trastornos óseos destructivos.
  9. 9.
    Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una composición de acuerdo con la reivindicación 4, para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, para su uso de forma concurrente con, antes de o posteriormente a un agente terapéutico adicional seleccionado de un agente quimioterápico o antiproliferativo, un tratamiento para la Enfermedad de Alzheimer, un tratamiento para la Enfermedad de Parkinson, un agente para
    tratar la esclerosis múltiple (EM), un tratamiento para el asma, un agente para tratar la esquizofrenia, un agente antiinflamatorio, un agente inmunomodulador o inmunosupresor, un factor neurotrófico, un agente para tratar una enfermedad cardiovascular, un agente para tratar trastornos óseos destructivos, un agente para tratar una enfermedad hepática, un agente para tratar una trastorno sanguíneo o un agente para tratar un trastorno de inmunodeficiencia.
  10. 10.
    Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una composición de acuerdo con la reivindicación 4, para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la enfermedad se selecciona de cáncer, enfermedad de Alzheimer, reestenosis, angiogénesis, glomerulonefritis, citomegalovirus, VIH, herpes, psoriasis, aterosclerosis, alopecia, una enfermedad autoinmune, una infección vírica, un trastorno neurodegenerativo, un trastorno asociado con la apoptosis de timocitos o un trastorno proliferativo; trastornos hematopoyéticos, en particular, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia promielocítica aguda (LPA) y leucemia linfocítica aguda (LLA); respuestas inmunes tales como reacciones alérgicas o de hipersensibilidad tipo I, asma, enfermedades autoinmunes tales como rechazo de trasplantes, enfermedad de injerto contra huésped, artritis reumatoide, esclerosis lateral amiotrófica y esclerosis múltiple, trastornos neurodegenerativos tales como esclerosis lateral amiotrófica familiar (ELAF), así como en tumores malignos sólidos y hematológicos tales como leucemias y linfomas; en el que el cáncer es cáncer pancreático, de próstata o de ovario.
  11. 11.
    Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en la fabricación de medicamento para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad o afección seleccionada de trastornos alérgicos, trastornos proliferativos, trastornos autoinmunes, afecciones asociadas con el trasplante de órganos, trastornos inflamatorios, trastornos mediados inmunológicamente o trastornos óseos destructivos; cáncer, enfermedad de Alzheimer, reestenosis, angiogénesis, glomerulonefritis, citomegalovirus, VIH, herpes, psoriasis, aterosclerosis, alopecia, una enfermedad autoinmune, una infección vírica, un trastorno neurodegenerativo, un trastorno asociado con la apoptosis de timocitos o un trastorno proliferativo; trastornos hematopoyéticos, en particular, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia promielocítica aguda (LPA) y leucemia linfocítica aguda (LLA); respuestas inmunes tales como reacciones alérgicas o de hipersensibilidad tipo I, asma, enfermedades autoinmunes tales como rechazo de trasplantes, enfermedad de injerto contra
    huésped, artritis reumatoide, esclerosis lateral amiotrófica y esclerosis múltiple, trastornos neurodegenerativos tales como esclerosis lateral amiotrófica familiar (ELAF), así como en tumores malignos sólidos y hematológicos tales como leucemias y linfomas; cáncer pancreático, de próstata o de ovario.
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