PT1811998E - Triazóis úteis como inibidores de proteína quinases - Google Patents

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PT1811998E
PT1811998E PT05815914T PT05815914T PT1811998E PT 1811998 E PT1811998 E PT 1811998E PT 05815914 T PT05815914 T PT 05815914T PT 05815914 T PT05815914 T PT 05815914T PT 1811998 E PT1811998 E PT 1811998E
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Robert J Davies
Michael J Arnost
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Vertex Pharma
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Description

1
DESCRIÇÃO "TRIAZÓIS ÚTEIS COMO INIBIDORES DE PROTEÍNA QUINASES"
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a inibidores de proteína quinases. A invenção também proporciona composições farmacêuticas que compreendem os compostos da invenção e a utilização das composições no fabrico de um medicamento para tratar várias patoloqias.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A procura de novos aqentes terapêuticos tem sido grandemente ajudada em anos recentes por um melhor entendimento da estrutura de enzimas e outras biomoléculas associadas a doenças. Uma importante classe de enzimas que tem sido objecto de estudo extensivo é a das proteína quinases.
As proteína quinases constituem uma grande família de enzimas estruturalmente relacionadas que são responsáveis pelo controlo de uma variedade de processos de transdução de sinais dentro da célula. (Veja-se, Hardie, G. e Hanks, S. The Protein Kinase Facts Book, I e II, Academic Press, San Diego, CA: 1995) . Acredita-se que as proteína quinases evoluíram a partir de um gene ancestral comum devido à conservação da sua estrutura e função catalítica. Quase todas as quinases contêm um domínio catalítico similar de 250-300 aminoácidos. As quinases podem ser categorizadas em famílias de acordo com os substratos que fosforilam (por exemplo, proteína-tirosina, proteína-serina/treonina, lípidos, etc.). Têm sido identificados motivos na sequência 2 que geralmente correspondem a cada uma destas famílias de quinase (Veja-se, por exemplo, Hanks, S.K., Hunter, T., FASEB J. 1995, 9, 576-596; Knighton et ai., Science 1991, 253, 407-414; Hiles et al., Cell 1992, 70, 419-429; Kunz et al., Cell 1993, 73, 585-596; Garcia-Bustos et al., EMBO J. 1994, 13, 2352-2361) .
Em geral, as proteína quinases funcionam como mediadoras da sinalização intracelular ao efectuarem uma transferência de fosforilo de um nucleósido trifosfato para uma proteína aceitadora que está envolvida numa via de sinalização. Estes eventos de fosforilação agem como interruptores on/off moleculares que podem modular ou regular a função biológica da proteína alvo. Estes eventos de fosforilação são basicamente desencadeados em resposta a uma variedade de estímulos extracelulares e outros. Exemplos de tais estímulos incluem sinais de stress ambiental e químico (por exemplo, choque osmótico, choque térmico , radiação ultravioleta, endotoxina bacteriana e h2o2), citocinas (por exemplo, interleucina -1 (IL-1) e factor de necrose de tumor α (TNF-α)), e factores de crescimento (por exemplo, factor estimulante de colónia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), e factor de crescimento de fibroblasto (FGF)). Um estímulo extracelular pode afectar uma ou mais respostas celulares relacionadas com o crescimento celular, migração, diferenciação, secreção de hormonas, activação de factores de transcrição, contracção muscular, metabolismo da glicose, controlo da síntese proteica e regulação do ciclo celular.
Muitas doenças estão associadas a respostas celulares anormais desencadeadas por eventos mediados pela proteína quinase, como descrito anteriormente. Estas doenças 3 incluem, mas não limitam-se a, doenças autoimunes, doenças inflamatórias, doenças ósseas, doenças metabólicas, doenças neurológicas e neurodegenerativas, cancro, doenças cardiovasculares, alergias e asma, doença de Alzheimer, e doenças relacionadas com hormonas. Por conseguinte, tem havido um substancial esforço em química médica para encontrar inibidores de proteína quinase que sejam eficazes como agentes terapêuticos.
Uma família de receptores de tipo III de tirosina quinases incluindo Flt3, c-Kit, receptor de PDGF e c-Fms desempenham um importante papel na manutenção, crescimento e desenvolvimento de células hematopoiéticas e não hematopoiéticas. [Scheijen, B, Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333 e Reilly, JT, British Journal of Haematology, 2002, 116, 744-757], FLT-3 e c-Kit regulam a manutenção de pools de células estaminais/progenitores precoces, bem como o desenvolvimento de células mielóides e linfóides maturas [Lyman, S, Jacobsen, S, Blood, 1998, 91, 1101-1134]. Ambos os receptores contêm um domínio de quinase intrínseco que é activado após a dimerização dos receptores mediada por ligandos. Após a activação, o domínio quinase induz a autofosforilação do receptor, assim como a fosforilação de várias proteínas citoplasmáticas que ajudam a propagar o sinal de activação levando a crescimento, diferenciação e sobrevivência. Alguns dos reguladores a jusante da sinalização do receptor de FLT-3 e c-Kit incluem PLCy, PI3-quinase, Grb-2, SHIP e quinases relacionadas com Src [Scheijen, B, Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333]. Estudos mostraram que ambos os receptores tirosina quinases desempenham um papel numa variedade de malignidades hematopoiéticas e não hematopoiéticas. Mutações que induzem 4 activação independente de ligando de FLT-3 e c-Kit têm sido implicadas em leucemia mielógena aguda (AML), leucemia linfocitica aguda (ALL), mastocitose e tumor estromal gastrointestinal (GIST). Estas mutações incluem mudanças de aminoácidos individuais no dominio quinase ou duplicações em tandem internas, mutações pontuais ou deleções in frame da região justamembranar dos receptores. Além de activar mutações, a estimulação dependente de ligando (autócrina ou parácrina) da sobre-expressão de FLT-3 ou c-Kit de tipo selvagem podem contribuir para o fenótipo de malignidade [Scheijen, B, Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333]. c-fms codifica o receptor de factor de estimulo de colónia de macrófagos (M-CSF-1R) que é expresso predominantemente na linhagem monócitos/macrófago [Dai, XM et al., Blood, 2002, 99, 111-120]. MCSF-lR e seu ligando regulam o crescimento e a diferenciação da linhagem de macrófagos. Como os outros membros da família, MCSF-lR contém um domínio de quinase intrínseco que é activado após dimerização do receptor induzida por ligando. MCSF-lR é também expresso em células hematopoiéticas incluindo neurónios e células epiteliais de glândula mamária. Mutações neste receptor estão potencialmente ligadas a leucemias mielóides e sua expressão é correlacionada com carcinomas do endométrio, do ovário, da mama metastásicos [Reilly, JT, British Journal of Haematology, 2002, 116, 744-757 e Kacinski, BM, Mol. Reprod and Devei., 1997, 46, 71-74]. Outra possível indicação para antagonistas de MCSF-lR é osteoporose [TeitelbaA, S, Science 2000, 289, 1504-1508. O receptor de PDGF (PDGFR) tem duas subunidades PDGFR-α e PDGFR-β, que podem formar homo ou heterodímeros após a 5 ligação do ligando. Existem vários ligandos de PDGF: AB, BB, CC e DD. PDGFR é expresso em células estaminais precoces, mastócitos, células mielóides, células mesenquimais e células do músculo liso [Scheijen, B, Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333]. Somente PDGFR-β foi implicada em leucemias mielóides usualmente como um parceiro de translocação com Tel, proteína interactiva Huntingtin (HIP1) ou RabaptinS. Recentemente estudos mostraram que mutações de activação no domínio PDGFR-a quinase estão em tumores estromais gastrointestinais (GIST) [Heinrich, MC et al.r Sciencexpress, 2003]
Quinases dependentes de ciclina (CDKs) são serina/treonina proteína quinases que compreendem um lobo amino-terminal rico em folha-β e um lobo carboxi-terminal maior que é em grande parte de α-hélice. As CDKs apresentam os 11 subdomínios compartidos por todas as proteína quinases e varia em massa molecular desde 33 até 44 kD. Esta família de quinases, que inclui CDKl, CKD2, CDK4, e CDK6, requer fosforilação no resíduo que corresponde a CDK2 Thrl60 a fim de ser totalmente activa [Meijer, L., Drug Resistance Updates 2000, 3, 83-88].
Cada complexo CDK é formado a partir de uma subunidade de ciclina reguladora (por exemplo, ciclina A, Bl, B2, Dl, D2, D3, e E) e uma subunidade de quinase catalítica (por exemplo, CDKl, CDK2, CDK4, CDK5, e CDK6). Cada par quinase/ciclina diferente funciona para regular as diferentes e específicas fases do ciclo celular conhecidas como as fases Gl, S, G2, e M [Nigg, E., Nature Reviews 2001, 2, 21-32; Flatt, P., Pietenpol, J., Drug Metabolism Reviews 2000, 32, 283-305] . 6
As CDKs têm sido implicadas em transtornos de proliferação celular, particularmente em cancro. A proliferação celular é um resultado da desregulação directa ou indirecta do ciclo de divisão celular e as CDKs desempenham um papel critico na regulação das várias fases deste ciclo. Por exemplo, a sobreexpressão de ciclina Dl é comummente associada a numerosos cancros humanos incluindo gliomas e carcinomas de mama, cólon, hepatocelular [Flatt, P., Pietenpol, J., Drug Metabolism Reviews 2000, 32, 283-305]. O complexo CDK2/ciclina E desempenha um papel chave na progressão desde as fases Gi precoce até S do ciclo celular e a sobreexpressão de ciclina E tem sido associada a vários tumores sólidos. Portanto, inibidores de ciclinas Dl, E, ou suas CDKs associadas são alvos úteis para terapêutica de cancro [Kaubisch, A., Schwartz, G., The Câncer Journal 2000, 6, 192-212]. CDKs, especialmente CDK2, também desempenham um papel na apoptose e desenvolvimento de célula T. CDK2 foi identificada como um regulador chave de apoptose de timócito [Williams, O., et al, European Journal of Immunology 2000, 709-713]. O estimulo de actividade quinase de CDK2 é associado com a progressão de apoptose em timócitos, em resposta a estímulos específicos. A inibição de actividade quinase de CDK2 bloqueia esta apoptose resultando na protecção de timócitos.
Além da regulação do ciclo celular e apoptose, as CDKs estão directamente envolvidas no processo de transcrição. Numerosos vírus requerem CDKs para seu processo de replicação. Exemplos em que inibidores de CDK restringem replicação virai incluem citomegalovírus humanos, vírus do 7 herpes, e vírus da varicela-zoster [Meijer, L., Drug Resistance Updates 2000, 3, 83-88]. A inibição de CDK é também útil para o tratamento de transtornos neurodegenerativos, tais como doença de Alzheimer. O surgimento de filamentos helicoidais pareados (PHF), associados com doença de Alzheimer, é causado pela hiperfosforilação da proteína Tau por CDK5/p25 [Meijer, L., Drug Resistance Updates, 2000 3, 83-88].
Outra família quinase de particular interesse é a família Src de quinases. Estas quinases estão implicadas em cancro, disfunção do sistema imune e doenças de remodelação óssea. Para revisões gerais, veja-se Thomas e Brugge, Annu.
Rev. Cell Dev. Biol. 1997, 13, 513; Lawrence e Niu, Pharmacol. Ther. 1998, 77, 81; Tatosyan e Mizenina, Biochemistry (Moscovo) 2000, 65, 49; Boschelli et al.,
Drugs of the Future 2000, 25(7), 717, (2000).
Membros da família Src incluem as seguintes oito quinases em mamíferos: Src, Fyn, Yes, Fgr, Lyn, Hck, Lck, e Blk. Estas são proteína quinases não receptoras que variam em massa molecular desde 52 até 62 kD. Todas são caracterizadas por uma organização estrutural comum que é compreendida de seis domínios funcionais distintos: domínio de homologia de Src 4 (SH4), um domínio único, domínio SH3, domínio SH2, um domínio catalítico (SHl), e uma região reguladora C-terminal. Tatosyan et al. Biochemistry (Moscovo) 2000, 65, 49-58:
Baseado nos estudos publicados, as Src quinases são consideradas como alvos terapêuticos potenciais para várias doenças humanas. Ratinhos que são deficientes em Src desenvolvem osteopetrose, ou acumulação óssea, por causa de uma redução da reabsorção óssea pelos osteoclastos. Isto sugere que a osteoporose resultante de reabsorção óssea anormalmente alta pode ser tratada pela inibição de Src. Soriano et al., Cell 1992, 69, 551 e Soriano et al., Cell 1991, 64, 693. A supressão de destruição óssea artrítica tem sido conseguida pela sobreexpressão de CSK em osteoclastos de sinoviócitos reumatóides. Takayanagi et al., J. Clin. Invset. 1999, 104, 137. CSK, ou Src quinase C-terminal, fosforila e deste modo inibe actividade catalítica de Src. Isto implica que a inibição de Src pode prevenir a destruição de articulações que é característica em pacientes sofrendo de artrite reumatóide. Boschelli et al., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717.
Src também desempenha um papel na replicação do vírus da hepatite B. O factor de transcrição HBx codificado viralmente activa Src numa etapa requerida para a propagação do vírus. Klein et al., EMBO J. 1999, 18, 5019, e Klein et al., Mol. Cell. Biol. 1997, 17, 6427.
Numerosos estudos têm ligado a expressão de Src a cancros tais como cancro de cólon, mama, hepático e pancreático, certas leucemias de células B e linfornas. Talamonti et al., J. Clin. Invest. 1993, 91, 53; Lutz et al., Biochem. Biophys . Res. 1998 243, 503; Rosen et al., J.
Biol. Chem. 1986, 261, 13754; Bolen et al., Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 1987, 84, 2251; Masaki et al, Hepatology 1998, 27, 1257; Biscardi et al., Adv. Câncer Res. 1999, 76, 61; Lynch et al., Leukemia, 1993, 7, 1416. Além disso, estudos mostraram que Src antisense expressa em células tumorais de ovário e cólon inibe o crescimento tumoral. Wiener et al., Clin. Câncer Res., 1999, 5, 2164; Staley et al., Cell Growth Diff., 1997, 8, 269. 9
Outras quinases da família Src também são alvos terapêuticos potenciais. Lck desempenha um papel em sinalização de células T. Ratinhos que carecem do gene Lck têm uma pobre habilidade para desenvolver timócitos. A função de Lck como um activador positivo de sinalização de células T sugere que inibidores de Lck podem ser úteis para tratar doença autoimune tal como artrite reumatóide. Molina et al., Nature, 1992, 357, 161. Hck, Fgr e Lyn foram identificados como mediadores importantes de sinalização de integrina em leucócitos mielóides. Lowell et al., J. Leukoc. Biol., 1999, 65, 313. A inibição destes mediadores de quinase, portanto, pode ser útil para tratar inflamação. Boschelli et al., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717.
Syk é uma tirosina quinase que desempenha um papel crítico em desgranulação de mastócitos mediada por FcsRl e activação de eosinófilo. Por conseguinte, Syk quinase está implicada em vários transtornos alérgicos, em particular asma. Foi mostrado que Syk se liga à cadeia gama fosforilada do receptor FcsRi via domínios SH2 N-terminais e é essencial para sinalização a jusante [Tailor et al, Mol. Cell. Biol. 1995, 15, 4149]. A inibição de apoptose de eosinófilos tem sido proposta como mecanismo chave para o desenvolvimento de eosinofilia de sangue e tecido em asma. IL-5 e GM-CSF são regulados para cima em asma e são propostos como causadores de eosinofilia de sangue e tecido pela inibição de apoptose de eosinófilos. A inibição de apoptose de eosinófilos foi proposta como um mecanismo chave para o desenvolvimento de eosinofilia de sangue e tecido em asma. Foi reportado que Syk quinase é requerida para a prevenção de apoptose de 10 eosinófilos por citocinas (utilizando antisenso) [Yousefi et al, J Exp Med 1996, 183, 1407]. O papel de Syk em reposta dependente e independente de FcyR em macrófagos derivados de medula óssea foi determinado pela utilização de quimeras de ratinho irradiadas reconstituídas com células de fígado fetais de embriões Syk -/-. Macrófagos deficientes em Syk foram defeituosos em fagocitose induzida por FcyR, mas apresentaram fagocitose normal em resposta a complemento [Kiefer et al, Mol Cell Biol 1998, 18, 4209] . Também foi reportado que Syk antisenso aerosolizado suprime a expressão de Syk e libertação de mediador de macrófagos [Stenton et al, J Immunology 2000, 164, 3790].
As Janus quinases (JAK) são uma família de tirosina quinases que consistem em JAK1, JAK2, JAK3 e TYK2. As JAKs desempenham um papel crítico em sinalização de citocina. Os substratos a jusante da família JAK de quinases incluem as proteínas transdutor de sinal e activador de transcrição (STAT). A sinalização de JAK/STAT foi implicada na mediação de muitas respostas imunes anormais tais como alergias, asma, doenças autoimunes tais como rejeição a transplante, artrite reumatóide, esclerose lateral amiotrófica e esclerose múltipla, assim como em malignidades hematológicas e sólidas, tais como leucemias e linfomas. A intervenção farmacêutica na via JAK/STAT foi revisada [Frank Mol. Med. 5, 432-456 (1999) & Seidel, et al, Oncogene 19, 2645-2656 (2000)] . JAKl, JAK2, e TYK2 são expressas de maneira ubíqua, enquanto que JAK3 é predominantemente expressa em células hematopoiéticas. JAK3 se liga exclusivamente à cadeia gama (yc) do receptor de citocina comum e é activada por IL-2, 11 IL-4, IL-7, IL-9, e IL-15. A proliferação e sobrevivência de mastócitos murinos induzida por IL-4 e IL-9, de facto, têm mostrado ser dependente da sinalização de JAK3 e yc [Suzuki et al, Blood 96, 2172-2180 (2000)]. A ligação cruzada de receptores E de imunoglobulina (Ig) de alta afinidade de mastócitos sensibilizados leva a uma libertação de mediadores pró-inflamatórios, incluindo numerosas citocinas vasoactivas resultando em reacções de hipersensibilidade agudas alérgicas, ou imediatas (tipo I) [Gordon et al, Nature 346, 274-276 (1990) & Galli, N. Engl. J. Med., 328, 257-265 (1993)]. Um papel crucial para JAK3 em respostas de mastócitos mediada por receptor IgE in vitro e in vivo foi estabelecida [Malaviya, et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 257, 807-813 (1999)]. Além disso, a prevenção de reacções de hipersensibilidade de tipo I, incluindo anafilaxia, mediada por activação de mastócitos através da inibição de JAK3 também foi reportada [Malaviya et al, J. Biol. Chem. 274,27028-27038 (1999)]. A selecção como alvo de mastócitos com inibidores de JAK3 modulou a desgranulação de mastócitos in vitro e preveniu reacções anafiláticas mediada por receptor de IgE/antígeno in vivo.
Um estudo recente descreveu a selecção como alvo bem sucedida de JAK3 para supressão imune e aceitação de aloenxerto. O estudo demonstrou uma sobrevivência dependente da dose de aloenxerto de coração de búfalo em recipientes Wistar Furth após a administração de inibidores de JAK3 indicando a possibilidade de regular respostas imunes não desejadas em doença de enxerto versus hospedeiro [Kirken, Transpl. Proc. 33, 3268-3270 (2001)]. A fosforilação de STAT mediada por IL-4 foi implicada como o mecanismo envolvido em fases precoces e tardias de 12 artrite reumatóide (RA). A regulação para cima de citocinas pró-inflamatórias em fluido sinovial e sinóvia de RA e é uma caracteristica da doença. Foi demonstrado que a activação mediada por IL-4 da via IL-4/STAT é mediada através de Janus Quinases (JAK 1 & 3) e que JAK quinases associadas a IL-4 são expressas na sinóvia de RA [Muller-Ladner, et al, J. Immunol. 164, 3894-3901 (2000)]. A esclerose lateral amiotrófica familiar (PALS) é um transtorno neurodegenerativo fatal que afecta aproximadamente 10% dos pacientes de ALS. As taxas de sobrevivência de ratinhos com fals foram aumentadas após tratamento com um inibidor especifico de JAK3. Isto sugere que JAK3 desempenha um papel em FALS [Trieu, et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 261, 22-25 (2000)].
Proteinas transdutoras de sinal e activadoras de transcrição (STAT) são activadas, entre outros, pelas quinases da familia JAK. Resultados de um estudo recente sugeriram a possibilidade de intervenção na via de sinalização JAK/STAT pela selecção como alvo de quinases da familia JAK com inibidores específicos para o tratamento de leucemia [Sudbeck, et al, Clin. Câncer Res. 5, 1569-1582 (1999)]. Compostos específicos de JAK3 mostraram inibir o crescimento clonogénico de linhas celulares que expressam JAK3 DAUDI, RAMOS, LC1;19, NALM-6, MOLT-3 e HL-60.
Em modelos animais, proteínas de fusão TEL/JAK2 induziram transtornos mieloproliferativos e em linhas de células hematopoiéticas, a introdução de TEL/JAK2 resultou na activação de STATl, STAT3, STAT5, e crescimento independente de citocina [Schwaller, et al, EMBO J. 17,5321-5333 (1998)]. 13 A inibição de JAK 3 e TYK 2 suprimiu a fosforilação de tirosina de STAT3, e inibiu o crescimento celular de micose fungóide, uma forma de linfoma cutâneo de células T. Estes resultados implicaram quinases da família JAK na via JAK/STAT activada constitutivamente que está presente em micose fungóide [Nielsen, et al, Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 94, 6764-6769 (1997)]. De maneira similar, STAT3, STAT5, JAKl e JAK2 demonstraram ser activados constitutivamente em linfoma de célula T em ratinho caracterizado inicialmente por sobreexpressão de LCK, implicando assim adicionalmente a via JAK/STAT em crescimento celular anormal [Yu, et al, J. Immunol. 159, 5206-5210 (1997)]. Além disso, a activação de STAT3 mediada por IL-6 foi bloqueada por um inibidor de JAK, levando a sensibilização de células de mieloma a apoptose [Catlett-Falcone, et al, Immunity 10, 105-115 (1999)].
Uma família quinase de interesse é proteína formadora de dupla espiral associada a Rho serina/treonina quinase (ROCK), que acredita-se que seja um efector de GTPase Rho pequena relacionada a Ras. A família ROCK inclui pl60ROCK (ROCK-1) . (Ishizaki et al., EMBO J. 1996, 15, 1885-1893) e ROKa/Rho-quinase/ROCK-II (Leung et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 29051-29054; Matsui et al., EMBO J. 1996, 15, 2208-2216; Nakagawa et al., FEBS Lett. 1996, 392, 189-193), proteína quinase PKN (Amano et al., Science 1996, 271, 648-650; Watanabe et al., Science 1996, 271, 645-648), e citron e citron quinase (Madaule et al. Nature, 1998, 394, 491-494; Madaule et al., FEBS Lett. 1995, 377, 243-248). A família ROCK de quinases tem mostrado estar envolvida numa variedade de funções incluindo a formação induzida por Rho de fibras de actina de stress e adesões focais (Leung et 14 al., Mol. Cell Biol. 1996, 16, 5313-5327; Amano et ai., Science, 1997, 275, 1308-1311; Ishizaki et al., FEBS Lett. 1997, 404, 118-124) e em regulação para baixo de miosina fosfatase (Kimura et al., Science, 1996, 273, 245-248), activação de plaquetas (Klages et al., J. Cell. Biol., 1999, 144, 745-754), contracção do músculo liso aórtico por meio de vários estímulos (Fu et al., FEBS Lett., 1998, 440, 183-187); respostas induzidas por trombina de células do músculo liso aórtico (Seasholtz et al., Cir. Res., 1999, 84, 1186-1193), hipertrofia de cardiomiócitos (Kuwahara et al., FEBS Lett., 1999, 452, 314-318), contracção do músculo liso bronquial (Yoshii et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1999, 20, 1190-1200), contracção do músculo liso e reorganização citoesquelética de células não musculares (Fukata et al., Trends in Pharm. Sei 2001, 22, 32-39), activação de canais de aniões regulados por volume (Nilius et al., J. Physiol., 1999, 516, 67-74), retraeção de neurite (Hirose et al., J. Cell. Biol., 1998, 141, 1625-1636), quimiotaxia de neutrófilos (Niggli, FEBS Lett., 1999, 445, 69-72), cura de feridas (Nobes e Hall, J. Cell. Biol., 1999, 144, 1235-1244), invasão de tumor (Itoh et al., Nat. Med., 1999, 5, 221-225) e transformação celular (Sahai et al., Curr. Biol., 1999, 9, 136-145). Mais especificamente, ROCK foi implicada em várias doenças e transtornos incluindo hipertensão (Satoh et al., J. Clin. Invest. 1994, 94, 1397-1403; Mukai et al., FASEB J. 2001, 15, 1062-1064; Uehata et al., Nature 1997, 389, 990-994;
Masumoto et al., Hypertension, 2001, 38, 1307-1310), vasoespasmo cerebral (Sato et al., Circ. Res. 2000, 87, 195-200; Miyagi et al., J. Neurosurg. 2000, 93, 471-476;
Tachibana et al., Acta Neurochir (Wien) 1999, 141, 13-19), 15 vasoespasmo coronário (Shimokawa et al., Jpn. Cir. J. 2000, 64, 1-12; Kandabashi et al., Circulation 2000, 101, 1319-1323; Katsumata et al., Circulation 1997, 96, 4357-4363; Shimokawa et al., Cardiovasc. Res. 2001, 51, 169-177; Utsunomiya et al., J. Pharmacol. 2001, 134, 1724-1730; Masumoto et al., Circulation 2002, 105, 1545-1547), asma brônquica (Chiba et al., Comp. Biochem. Physiol. C Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1995, 11, 351-357; Chiba et al., Br. J. Pharmacol. 1999, 127, 597-600; Chiba et al., Br. J. Pharmacol. 2001, 133, 886-890; Iizuka et al., Eur. J. Pharmacol. 2000, 406, 273-279), parto prematuro (Niro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997, 230, 356-359; Tahara et al., Endocrinology 2002, 143, 920-929; Kupittayanant et al., Pflugers Arch. 2001, 443, 112-114), disfunção eréctil (Chitaley et al., Nat. Med. 2001, 7, 119-122; Mills et al., J. Appl. Physiol. 2001, 91, 1269-1273), glaucoma (Honjo et al., Arch. Oftalmol. 2001, 1171-1178; Rao et al., Invest. Oftalmol. Vis. Sei. 2001, 42, 1029-1037), proliferação celular do músculo liso vascular (Shimokawa et al., Cardiovasc. Res. 2001, 51, 169-177; Morishige et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2001, 21, 548-554; Eto et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000, 278, H1744-H1750; Sawada et al., Circulation 2000, 101, 2030-2023; Shibata et al., Circulation 2001, 103, 284-289), hipertrofia do miocárdio (Hoshijima et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 7725-77230; Sah et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 31185-31190; Kuwahara et al., FEBS Lett.1999, 452, 314-318; Yanazume et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 8618-8625), malignoma (Itoh et al., Nat. Med. 1999, 5, 221-225; Genda et al., Hepatology 1999, 30, 1027-1036; Somlyo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 16 269, 652-659), lesão induzida por isquemia/reperfusão (Ikeda et al., J. of Surgical Res. 2003, 109, 155-160; Miznuma et al. Transplantation 2003, 75, 579-586), disfunção endotelial (Hernandez-Perera et ai., Circ. Res. 2000, 87, 616-622; Laufs et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 24266-24271; Eto et al., Circ. Res. 2001, 89, 583-590), doença de Crohn e colite (Segain et al. Gastroenterology 2003, 124(5), 1180-1187), excrescência de neurite (Fournier et al. J. Neurosci. 2003, 23, 1416-1423), doença de Raynaud (Shimokawa et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 2002, 39, 319— 327), e aterosclerose (Retzer et al. febs Lett. 2000, 466, 70-74; Ishibashi et al. Biochim. Biophys. Acta 2002, 1590, 123-130). Por conseguinte, o desenvolvimento de inibidores de ROCK quinase seria útil como agentes terapêuticos para o tratamento de transtornos implicados na via de ROCK quinase. ERK2 (quinase regulada por sinal extracelular) é um membro da familia proteína quinase activada por mitógenos (MAP) 1 de mamíferos. (MAP)l quinases são serina/treonina quinases que actuam como mediadores nas vias de transdução de sinal intracelular (Cobb e Goldsmith, J Biol. Chem., 1995, 270, 14843; Davis, Mol. Reprod. Dev. 1995, 42, 459) e são activadas por mitógenos e factores de crescimento (Bokemeyer et al.. Kidney Int. 1996, 49, 1187). Membros da família MAP quinase compartem similaridade de sequência e domínios estruturais conservados, e, além de ERK2, incluem a JNK (Jun N-terminal quinase), e p38 quinases. JNKs e p38 quinases são activadas em resposta às citocinas pró-inflamatórias TNF-alfa e interleucina-1, e por stress celular tais como choque térmico, hiperosmolaridade, radiação ultravioleta, lipopolissacarídeos e inibidores da 17 síntese proteica (Derijard et al., Cell 1994, 76, 1025; Han et al., Science 1994, 265, 808; Raingeaud et al., J Biol. Chem. 1995, 270, 7420; Shapiro e Dinarello, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1995, 92, 12230). Ao contrário, ERKs são activadas por mitógenos e factores de crescimento (Bokemeyer et al., Kidney Int. 1996, 49, 1187). ERK2 é uma proteína quinase amplamente distribuída que alcança actividade máxima quando tanto Thrl83 como Tyrl85 são fosforilados pela MAP quinase quinase a montante, MEKl (Anderson et al., Nature 1990, 343, 651; Crews et al., Science 1992, 258, 478) . Após activação, ERK2 fosforila muitas proteínas reguladoras, incluindo as proteína quinases Rsk90 (Bjorbaek et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 18848) e MAPKAP2 (Rouse et al., Cell 1994, 78, 1027), e factores de transcrição, tais como ATF2 (Raingeaud et al.,
Mol. Cell Biol. 1996, 16, 1247), Elk-1 (Raingeaud et al., Mol. Cell Biol 1996, 16, 1247), c-Fos (Chen et al., Proc. Natl. . Acad . Sei. USA 1993, 90, 10952), e c-Myc (Oliver et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1995, 210, 162). ERK2 é também um alvo a jusante das vias dependentes de Ras/Raf (Moodie et al., Science 1993, 260, 1658) e pode ajudar a transmitir os sinais destas proteínas potencialmente oncogénicas. Estudos mostraram que a ERK2 desempenha um papel no controlo negativo de crescimento de células de cancro de mama (Frey e Mulder, Câncer Res. 1993, 57, 628) e que ocorre hiperexpressão de ERK2 em cancro de mama humano (Sivaraman et al., J Clin. Invest. 1997, 99, 1478). ERK2 activadas também têm sido implicadas na proliferação de células do músculo liso das vias respiratórias estimuladas por endotelina, sugerindo um papel para esta quinase em 18 asma (Whelchel et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1997, 16, 589).
Glicogénio sintase quinase-3 (GSK-3) é uma serina/treonina proteína quinase compreendida de isoformas (X e β que são cada uma codificadas por genes distintos [Coghlan et al., Chemistry & Biology 2000, 7, 793-803; e Kim e Kimmel, Curr. Opinion Genetics Dev., 2000 10, 508-514]. GSK-3 foi implicada em várias doenças incluindo diabetes, doença de Alzheimer, transtornos do SNC tais como transtorno maníaco-depressivo e doenças neurodegenerativas, e hipertrofia de cardiomiócitos [Depósitos de PCT N°. : WO 99/65897 e WO 00/38675; e Haq et al., J. Cell Biol. 2000, 151, 117-130]. Estas doenças estão associadas com a operação anormal de certas vias de sinalização celular em que GSK-3 desempenha um papel. Encontrou-se que GSK-3 fosforila e modula a actividade de numerosas proteínas reguladoras. Estas proteínas incluem glicogénio sintase, que é a enzima que limita a velocidade necessária para a síntese de glicogénio, a proteína associada a microtúbulo Tau, o factor de transcrição génica (3-catenina, o factor de iniciação de tradução elF2B, assim como ATP citrato liase, axina, factor de choque térmico-1, c-Jun, c-myc, c-myb, CREB, e CEPBa. Estes diversos alvos de proteína implicam GSK-3 em muitos aspectos do metabolismo, proliferação, diferenciação, e desenvolvimento celular.
Numa via mediada por GSK-3 que é relevante para o tratamento de diabetes tipo II, a sinalização induzida por insulina leva a captação celular de glicose e síntese de glicogénio. Ao longo desta via, GSK-3 é um regulador negativo do sinal induzido por insulina. Normalmente, a presença de insulina causa a inibição de fosforilação 19 mediada por GSK-3 e desactivação de glicogénio sintase. A inibição de GSK-3 leva a síntese de glicogénio e captação de glicose aumentados [Klein et ai., PNAS 1996, 93, 8455-8459; Cross et ai., Biochem. J. 1994, 303, 21-26); Cohen, Biochem. Soc. Trans. 1993, 21, 555-567; e Massillon et ai., Biochem J. 1994, 299, 123-128] . Contudo, num paciente diabético, em quem a resposta a insulina está danificada, a síntese de glicogénio e a captação de glicose falham em aumentar apesar da presença de níveis sanguíneos relativamente altos de insulina. Isto leva a níveis sanguíneos anormalmente altos de glicose com efeitos agudos e de longa duração que podem em última instância resultar em doença cardiovascular, falência renal e cegueira. Em tais pacientes, a inibição induzida por insulina normal de GSK-3 falha em se produzir. Também tem sido reportado que em pacientes com diabetes tipo II, a GSK-3 é sobreexpressada [veja-se, depósito de PCT: WO 00/38675] . Inibidores terapêuticos de GSK-3, portanto, são potencialmente úteis para tratar pacientes diabéticos sofrendo de uma resposta a insulina danificada. A actividade GSK-3 é também associada com doença de Alzheimer. Esta doença é caracterizada pelo bem conhecido péptido β-amilóide e a formação de emaranhados neurofibrilares intracelulares. Péptidos Αβ sao derivados da proteína precursora de amilóide (APP) por proteólise sequencial, catalizada pela aspartil protease BACE2, seguido por clivagem de γ-secretase dependente de presenilina. Foi demonstrado que anticorpos contra placas β-amilóides podem diminuir a velocidade do declínio cognitivo em pacientes com doença de Alzheimer (Hock et al., Neuron, 2003, 38, 547-554), e assim outras estratégias 20 de diminuição β-amilóide (por exemplo, o desenvolvimento de agentes capazes de inibição de péptido β-amilóide) seria útil no tratamento de doença de Alzheimer e outros transtornos psicóticos e neurodegenerativos. Adicionalmente, os emaranhados neurofibrilares contêm proteína Tau hiperfosforilada, em que Tau é fosforilada em sítios anormais, e assim agentes capazes de inibição da hiperfosforilação da proteína Tau seriam úteis no tratamento de doença de Alzheimer e outros transtornos psicóticos e neurodegenerativos. GSK-3 é conhecida por fosforilar estes sítios anormais em modelos animais e células. Além disso, a inibição de GSK-3 mostrou prevenir a hiperfosforilação de Tau em células [Lovestone et al., Current Biology 1994, 4, 1077-86; e Brownlees et al., Neuroreport 1997, 8, 3251-55]. Portanto, a actividade de GSK-3 promove a geração dos emaranhados neurofibrilares e a progressão de doença de Alzheimer. Foi mostrado também que GSK-3 facilita o processamento de APP e que um inibidor de GSK-3 (lítio) inibe a geração de péptidos Αβ através da inibição de GSK-3 (Phiel et al. Nature 2003, 423, 435-439). Assim, o desenvolvimento de inibidores de GSK-3 seria útil para a redução da formação de placas amilóides e emaranhados neurofibrilares, os distintivos patológicos de doença de Alzheimer, e também seriam úteis para o tratamento de outros transtornos psicóticos e neurodegenerativos.
Outro substrato de GSK-3 é β-catenina, que é degradada após a fosforilação por GSK-3. Níveis reduzidos de β-catenina têm sido reportados em pacientes esquizofrénicos e também têm sido associados com outras 21 doenças relacionadas com o aumento de morte celular neuronal [Zhong et al., Nature 1998, 395, 698-702; Takashima et al., PNAS 1993, 90, 7789-93; e Pei et al., J. Neuropathol. Exp 1997, 56, 70-78]. A actividade de GSK-3 é também associada com acidente vascular cerebral [Wang et al., Brain Res 2000, 859, 381-5; Sasaki et al., Neurol Res 2001, 23, 588-92; Hashimoto et al., J. Biol. Chem 2002, 277, 32985-32991]. A subfamilia AGC de quinases fosforilam seus substratos em residuos de serina e treonina e participam numa variedade de processos de sinalização bem conhecidos, incluindo, mas não limitado a sinalização de AMP ciclico, a resposta a insulina, protecção contra apoptose, sinalização de diacilglicerol, e controlo de tradução de proteinas (Peterson et al., Curr. Biol. 1999, 9, R521). Esta subfamilia inclui PKA, PKB (c-Akt), PKC, PRK1,2, p70s6K, e PDK. AKT (também conhecido como PKB ou Rac-PK beta), uma serina/treonina proteína quinase, tem mostrado ser sobreexpressa em vários tipos de cancro e é uma mediadora de funções celulares normais [(Khwaja, A ., Nature 1999, 401, 33-34) ; (Yuan, Z, .Q., et al., Oncogene 2000, 19, 2324- 2330); (Namikawa, K., et al., J Neurosci. 2000, 20, 2875- 2886,)]. AKT compreende um domínio de homologia a pleckstrin (PH) N-terminal, um domínio quinase e uma região de "cauda" C-terminal. Três isoformas de AKT quinase humana (AKT-1, -2 e -3) foram reportadas até aqui [ (Cheng, J.Q., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1992, 89, 9267-9271); (Brodbeck, D. et al., J. Biol. Chem. 1999, 274, 9133-9136)]. O domínio PH liga 3-fosfoinositídeos, que são sintetizados por fosfatidil inositol 3-quinase (PI3K) após estímulo por 22 factores de crescimento tais como factor de crescimento derivados de plaquetas (PDGF), factor de crescimento de nervos (NGF) e factor crescimento similar a insulina (IGF-1) [(Kulik et ãl., Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 1595-1606,); (Hemmings, B.A., Science, 1997, 275, 628-630)]. A ligação de lipidos ao domínio PH promove a translocação de AKT à membrana plasmática e facilita a fosforilação por outras proteína quinases contendo domínio PH, PDKl at Thr308, Thr309, e Thr305 para as isoformas 1, 2 e 3 de AKT, respectivamente. Uma segunda, como de ainda desconhecida, quinase é requerida para a fosforilação de Ser473, Ser474 ou Ser472 nas caudas C-terminais de AKT-1, -2 e -3 respectivamente, a fim de render uma enzima AKT totalmente activada.
Uma vez localizada à membrana, AKT media várias funções dentro da célula incluindo os efeitos metabólicos de insulina (Calera, M.R. et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 7201-7204) indução de diferenciação e/ou proliferação, síntese de proteína e respostas a stress (Alessi, D.R. et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 1998, 8, 55-62,).
Manifestações de regulação de AKT alterada aparecem tanto em lesão como doença, o papel mais importante sendo em cancro. A primeira história de AKT estava em associação com carcinomas de ovário humano onde a expressão de AKT encontrou-se que é amplificada em 15% dos casos (Cheng, J.Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1992, 89, 9267-9271) . Também encontrou-se que é sobreexpressa em 12% de cancros pancreáticos (Cheng, J. Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1996, 93, 3636-3641). Foi demonstrado que AKT-2 foi sobreexpressa em 12% de carcinomas de ovário e que a amplificação de AKT foi especialmente frequente em 23 50% de tumores indiferenciados, sugerindo que AKT também está associado coma agressividade do tumor (Bellacosa, et al.r Int. J. Câncer 1995, 64, 280-285).
Foi mostrado que PKA (também conhecida como proteína quinase dependente de cAMP) regula muitas funções vitais incluindo metabolismo de energia, transcrição génica, proliferação, diferenciação, função reprodutiva, secreção, actividade neuronal, memória, contractilidade e mobilidade (Beebe, S.J., Semin. Câncer Biol. 1994, 5, 285-294). PKA é uma holoenzima tetramérica, que contém duas subunidades catalíticas unidas a uma subunidade reguladora homodimérica (que age para inibir as subunidades catalíticas). Na ligação de cAMP (activação de enzima), as subunidades catalíticas dissociam das subunidades reguladoras para proporcionar a serina/treonina quinase activa (McKnight, G.S. et al., Recent Prog. Honn. Res. 1988, 44, pp. 307).
Três isoformas da subunidade catalítica (C-OC, C-β e C-γ) foram reportadas até agora (Beebe, S.J. et al., J. Biol. Chem. 1992, 267, 25505-25512) com a subunidade C-(X sendo a mais extensivamente estudada, primariamente por causa da sua expressão elevada em melanomas primários e metastásicos (Becker, D. et al., Oncogene 1990, 5, 1133). Até agora, estratégias para modular a actividade da subunidade C-a envolvem a utilização de anticorpos, moléculas que bloqueiam a actividade de PKA seleccionando como alvo dímeros reguladores e expressão de oligonucleotídeos antisense.
As proteína quinases ribossomais p70s6K-l e -2 também são membros da subfamília AGC de proteína quinases e catalizam a fosforilação e subsequente activação da proteína ribossomal S6, que foi implicada na regulação 24 positiva traducional de ARNm que codificam os componentes do aparelho de síntese proteica. Estes ARNm contêm um trato oligopirimidino em seu sítio de iniciação da transcrição 5', denominado um 5"T0P, que tem mostrado ser essencial na sua regulação ao nível traducional (Volarevic, S. et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001, 65, 101-186). A fosforilação de S6 dependente de p70S6K é estimulada em resposta a uma variedade de hormonas e factores de crescimento primariamente através da via de PI3K (Coffer, P.J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 1994 198, 780-786), que pode estar sob a regulação de mTOR, já que a rapamicina age para inibir a actividade de p70s6K e bloqueia a síntese proteica, especificamente em resultado da regulação negativa da tradução destes ARNm que codificam proteínas ribossomais (Kuo, C.J. et al., Nature 1992, 358, 70-73) . PDKl In vitro cataliza a fosforilação de Thr252 na ansa de activação do domínio catalítico p70, que é indispensável para a actividade de p70 (Alessi, D.R., Curr. Biol., 1998, 8, 69-81). A utilização de rapamicina e estudos de deleção génica de dp70S6K de Drosophila e p70s6Kl de ratinho estabeleceram o papel central que p70 desempenha tanto em crescimento celular como em sinalização de proliferação. A proteína quinase-1 dependente de 3-fosfoinositídeo (PDKl) desempenha um papel chave em regular a actividade de numerosas quinases pertencentes à subfamília AGC de proteína quinases (Alessi, D. et al., Biochem. Soc. Trans 2001, 29, 1). Estas incluem isoformas de proteína quinase B (PKB, também conhecida como AKT), p70 ribossomal S6 quinase (S6K) (Avruch, J. et al., Prog. Mol. Subcell. Biol. 2001, 25 26, 115), e p90 ribossomal S6 quinase (Frõdin, M. et al., EMBO J. 2000, 19, 2924-2934). A sinalização mediada por PDKl é activada em resposta a insulina e factores de crescimento e como um consequência da ligação da célula à matriz extracelular (sinalização de integrina). Uma vez activadas estas enzimas mediam muitos eventos celulares diversos pela fosforilação de proteínas reguladoras chave que desempenham importantes papéis no controle de processos tais como sobrevivência celular, crescimento, proliferação e regulação da glicose [ (Lawlor, M.A. et al., J. Cell Sei. 2001, 114, 2903-2910), (Lawlor, M.A. et al., EMBO J. 2002, 21, 3728-3738)]. PDKl é uma proteína de 556 aminoácidos, com um domínio catalítico N-terminal e um domínio de homologia de pleckstrin (PH) C-terminal, que activa seus substratos fosforilando estas quinases na sua alça de activação (Belham, C. et ai., Curr. Biol. 1999, 9, R93-R96). Muitos cancros humanos incluindo próstata e NSCL têm elevada função de via de sinalização PDKl resultando de numerosos eventos genéticos distintos tais como mutações PATEN ou sobreexpressão de certas proteínas reguladoras chave [(Graff, J.R., Expert Opin. Ther. Targets 2002, 6, 103-113), (Brognard, J., et al., Câncer Res. 2001, 61, 3986-3997)]. A inibição de PDKl como um mecanismo potencial para tratar cancro foi demonstrada por transfecção de uma linha celular de cancro humano PTEN negativo (U87MG) com oligonucleótidos antisenso dirigidos contra PDKl. A diminuição resultante nos níveis de proteína PDKl levou a uma redução em proliferação e sobrevivência celular (Flynn, P., et al., Curr. Biol. 2000, 10, 1439-1442). Consequentemente o desenho de inibidores de sítio de 26 ligação a ATP de PDK1 oferece, entre outros tratamentos, um alvo atractivo para quimioterapia de cancro. 0 alcance diverso de genótipos de células de cancro tem sido atribuído à manifestação das seguintes seis alterações essenciais em fisiologia celular: auto-suficiência em sinalização de crescimento, evasão de apoptose, insensibilidade a sinalização inibidora de crescimento, potencial replicativo ilimitado, angiogénese sustentada, e invasão de tecido levando a metástase (Hanahan, D. et al., Cell 2000, 100, 57-70). PDKl é um mediador critico da via de sinalização de PI3K, que regula um grande número de funções celulares incluindo crescimento, proliferação e sobrevivência. Consequentemente, a inibição desta poderia afectar quatro ou mais dos seis requisitos que definem a progressão do cancro. Como tal é antecipado que um inibidor PDKl terá um efeito sobre o crescimento de uma faixa muito ampla de cancros humanos.
Especificamente, níveis aumentados de actividade de via de PI3K têm sido directamente associados com o desenvolvimento de numerosos cancros humanos, progressão a um estado refractário agressivo (resistência adquirida a quimioterapias) e mal prognóstico. Esta actividade aumentada tem sido atribuída a uma série de eventos chave incluindo actividade diminuída de reguladores de via negativa tais como a fosfatase PTEN, activando mutações de reguladores via positiva tais como Ras, e sobreexpressão de componentes da própria via, tais como PKB, exemplos incluem: cérebro (gliomas), mama, cólon, cabeça e pescoço, rim, pulmão, fígado, melanoma, ovário, pancreático, próstata, sarcoma, tiróide [(Teng, D.H. et al., Câncer 27
Res., 1997 57, 5221-5225), (Brognard, J. et al., Câncer Res., 2001 , 61, 3986-3997), (Cheng, J.Q. et al., Proc. Natl. Acad . Sei . 1996, 93, 3636-3641), (Int J. Câncer 1995, 64, 280) , (Graff, J.R, ., Expert Opin. Ther. Targets 2002, 6, 103-113), (Am. J. Pathol. 2001, 159, 431)].
Adicionalmente, a função diminuída de vias através de inactivaçao génica, silenciamento génico, estudos negativos dominantes, e moléculas de baixo peso moleculares que actuam como inibidoras da via foi demonstrado que reverte muitos dos fenótipos de cancro in vitro (alguns estudos também demonstraram um efeito similar in vivo) tais como bloqueio de proliferação, redução de viabilidade e sensibilização de células de cancro a quimioterapias conhecidas numa série de linhas celulares, representando os seguintes cancros: pancreático [(Cheng, J.Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 1996, 93, 3636-3641), (Neoplasia 2001, 3, 278)], pulmão [ (Brognard, J. et al., Câncer Res. 2001, 61, 3986-3997), (Neoplasia 2001, 3, 278)], ovário [ (Hayakawa, J. et al., Câncer Res. 2000, 60, 5988-5994), (Neoplasia 2001, 3, 278)], mama (Mol. Câncer Ther. 2002, 1, 707), cólon [(Neoplasia 2001, 3, 278), (Arico, S. et al., J.
Biol. Chem. 2002, 277, 27613-27621)], colo de útero (Neoplasia 2001, 3, 278), próstata [ (Endocriniology 2001, 142, 4795), (Thakkar, H. et al. J. Biol. Chem. 2001, 276, 38361-38369) , (Chen, X. et al., Oncogene 2001, 20, 6073- 6083)] e cérebro (glioblastomas) [ (Flynn, P. et al., Curr.
Biol. 2000, 10, 1439-1442)] .
Por conseguinte, existe uma grande necessidade de desenvolver inibidores de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB) , CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK 28 proteína quinases que sejam úteis no tratamento de várias doenças ou afecções associadas com a activação de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e-2, e PKB) , CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK, particularmente dados os tratamentos inadequados actualmente disponíveis para a maioria destes transtornos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Descobriu-se agora que compostos desta invenção, e composições farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, são eficazes como inibidores de quinases. Em certas concretizações, estes compostos são eficazes como inibidores de PLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamilia AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e-2, e PKB). CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK proteína quinases. Noutras concretizações, estes compostos são eficazes como inibidores de FLT-3 e/ou c-KIT proteína quinases. Estes compostos têm a fórmula geral A, definida mais restritivamente nas reivindicações:
em que R1, R3, R4, R5, R6, e R7 são como descrito a seguir.
Estes compostos e composições farmacêuticas dos mesmos são úteis para tratar ou prevenir uma variedade de transtornos, incluindo, mas não limitados a, doença cardíaca, diabetes, doença de Alzheimer, transtornos de 29 imunodeficiência, doenças inflamatórias, hipertensão, doenças alérgicas, doenças autoimunes, transtornos de destruição dos ossos tais como osteoporose, transtornos proliferativos, doenças infecciosas, doenças mediadas imunologicamente, e doenças virais. As composições são também úteis em procedimentos para prevenir morte celular e hiperplasia e, portanto, podem ser utilizados para tratar ou prevenir reperfusão/isquemia em acidente vascular cerebral, ataques cardíacos, e hipoxia de órgãos. As composições são também úteis em procedimentos para prevenir agregação de plaquetas induzida por trombina. As composições são especialmente úteis para transtornos, tais como leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mielóide aguda (AML), leucemia promielocitica aguda (APL), artrite reumatóide, asma, osteoartrite, isquemia, cancro (incluindo, mas não limitado a, cancro de ovário, cancro de mama e cancro de endométrio), doença do figado incluindo isquemia hepática, doença cardíaca, tal como enfarto do miocárdio e insuficiência cardíaca congestiva, afecções imunes patológicas envolvendo activação de célula T, e transtornos neurodegenerativos. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Compostos desta invenção incluem aqueles descritos geralmente anteriormente, e são ilustrados adicionalmente pelas classes, subclasses, e espécies reveladas no presente documento. Como utilizadas no presente documento, as seguintes definições devem ser aplicadas a menos que se indique de outra forma. Para os propósitos desta invenção, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Periódica de Elementos, versão CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75a Ed. Adicionalmente, princípios 30 gerais de química orgânica são descritos em "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, e "March's Advanced Organic Chemistry", 5a Ed., Ed.: Smith, M.B. e March, J., John Wiley & Sons, Nova Iorque: 2001, a totalidade do conteúdo dos quais são pela presente incorporados como referência.
Como descrito no presente documento, os compostos da invenção podem opcionalmente ser substituídos com um ou mais substituintes, tais como são ilustrados geralmente anteriormente, ou como exemplificados pelas particulares classes, subclasses, e espécies da invenção. Será apreciado que a frase "opcionalmente substituído" é utilizado de maneira intercambiável com a frase "substituído ou não substituído". Em geral, o termo "substituído", se precedido pelo termo "opcionalmente" ou não, refere-se à substituição de radicais hidrogénio numa dada estrutura com o radical de um substituinte especificado. A menos que se indique de outra forma, um grupo opcionalmente substituído pode ter um substituinte em cada posição substituível do grupo, e quando mais de uma posição em qualquer estrutura dada pode ser substituída com mais de um substituinte seleccionado de um grupo especificado, o substituinte pode ser ou igual ou diferente em cada posição. As combinações de substituintes previstas por esta invenção são preferentemente aquelas que resultam na formação de compostos estáveis ou quimicamente possíveis. O termo "estável", como utilizado no presente documento, refere-se a compostos que não são substancialmente alterados quando submetidos a condições para permitir sua produção, detecção, e preferentemente sua recuperação, purificação, e utilização para um ou mais dos propósitos revelados no presente documento. Em algumas 31 concretizações, um composto estável ou composto quimicamente possível é um que não é substancialmente alterado quando mantido a uma temperatura de 40°C ou menos, na ausência de humidade ou outras condições quimicamente reactivas, durante pelo menos uma semana. 0 termo "alifático" ou "grupo alifático", como utilizado no presente documento, significa uma cadeia de hidrocarboneto de cadeia linear (isto é, não ramificada) ou ramificada, substituída ou não substituída que é completamente saturada ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, ou um hidrocarboneto monocíclico ou hidrocarboneto bicíclico que é completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, mas que não é aromático (também referido no presente documento como "carbociclo" "cicloalifático" ou "cicloalquilo"), que tem um único ponto de ligação ao resto da molécula. A menos que se indique de outra forma, grupos alifáticos contêm 1-20 átomos de carbono alifático. Em algumas concretizações, grupos alifáticos contêm 1-10 átomos de carbono alifático. Noutras concretizações, grupos alifáticos contêm 1-8 átomos de carbono alifático. Em ainda outras concretizações, grupos alifáticos contêm 1-6 átomos de carbono alifático, e em ademais outras concretizações grupos alifáticos contêm 1-4 átomos de carbono alifático. Em algumas concretizações, "cicloalifático" (ou "carbociclo" ou "cicloalquilo") refere-se a um hidrocarboneto C3-C8 monocíclico ou hidrocarboneto C8-Ci2 bicíclico que é completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, mas que não é aromático, que tem um único ponto de ligação ao resto da molécula em que qualquer anel individual em dito sistema de anel bicíclico tem 3-7 membros. Grupos alifáticos 32 adequados incluem, mas não limitam-se a, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo lineares ou ramificados, substituídos ou não substituídos e híbridos dos mesmos, tais como (cicloalquil)alquilo, (cicloalquenil)alquilo ou (cicloalquil)alquenilo. 0 termo "heteroalifático", como utilizado no presente documento, significa grupos alifáticos em que um ou dois átomos de carbono são independentemente substituídos por um ou mais de oxigénio, enxofre, azoto, fósforo, ou silício. Grupos heteroalifáticos podem ser substituídos ou não substituídos, ramificados ou não ramificados, cíclicos ou acíclicos, e incluem grupos "heterociclo", "heterociclilo", "heterocicloalifático", ou "heterocíclico". 0 termo "heterociclo", "heterociclilo", "heterocicloalifático", ou "heterocíclico" como utilizados no presente documento significa sistemas de anel não aromático, monocíclico, bicíclico, ou tricíclico nos quais um ou mais membros do anel são um heteroátomo independentemente seleccionado. Em algumas concretizações, o grupo "heterociclo", "heterociclilo", "heterocicloalifático", ou "heterocíclico" tem de três a catorze membros do anel nos quais um ou mais membros do anel é um heteroátomo seleccionado independentemente de oxigénio, enxofre, azoto, ou fósforo, e cada anel no sistema contém 3 a 7 membros do anel. 0 termo "heteroátomo" significa um ou mais de oxigénio, enxofre, azoto, fósforo, ou silício (incluindo, qualquer forma oxidada de azoto, enxofre, fósforo, ou silício; a forma quaternizada de qualquer azoto básico ou; um azoto substituível de um anel heterocíclico, por exemplo N (como em 3,4-dihidro-2f?-pirrolilo), NH (como em 33 pirrolidinilo) ou NR+ (como em pirrolidinilo N-substituído)). 0 termo "insaturado", como utilizado no presente documento, significa que uma porção tem uma ou mais unidades de insaturação. 0 termo "alcoxi", ou "tioalquilo", como utilizados no presente documento, refere-se a um grupo alquilo, como previamente definido, ligado a cadeia de carbono principal através de um átomo de oxigénio ("alcoxi") ou enxofre ("tioalquilo") . 0 termos "haloalquilo", "haloalquenilo" e "haloalcoxi" significa alquilo, alquenilo ou alcoxi, que conforme o caso podem ser substituídos com um ou mais átomos de halogéneo. 0 termo "halogéneo" significa F, Cl, Br, ou I. 0 termo "arilo" utilizado só ou como parte de uma porção maior como em "aralquilo", "aralcoxi", ou "ariloxialquil", refere-se a sistemas de anel monociclico, biciclico, e triciclico tendo um total de cinco a catorze membros do anel, em que pelo menos um anel no sistema é aromático e em que cada anel no sistema contém 3 a 7 membros do anel. 0 termo "arilo" pode ser utilizado de maneira intercambiável com o termo "anel arilo". 0 termo "arilo" também refere-se a sistemas de anel heteroarilo como definido no presente documento a seguir. 0 termo "heteroarilo", utilizado só ou como parte de uma porção maior como em "heteroaralquilo" ou "heteroarilalcoxi", refere-se a sistemas de anel monociclico, biciclico e triciclico tendo um total de cinco a catorze membros do anel, em que pelo menos um anel no sistema é aromático, pelo menos um anel no sistema contém 34 um ou mais heteroátomos, e em que cada anel no sistema contém 3 a 7 membros do anel. 0 termo "heteroarilo" pode ser utilizado de maneira intercambiável com o termo " anel heteroarilo " ou o termo "heteroaromático".
Um grupo arilo (incluindo aralquilo, aralcoxi, ariloxialquilo e similar) ou heteroarilo (incluindo heteroaralquilo e heteroarilalcoxi e similar) pode conter um ou mais substituintes e assim podem ser "opcionalmente substituídos". A menos que de outra forma definido anteriormente e no presente documento, substituintes adequados no átomo de carbono insaturado de um grupo arilo ou heteroarilo são geralmente seleccionados de halogéneo; -R°; -0R°; -SR°; fenilo (Ph) opcionalmente substituído com R°; -O(Ph) opcionalmente substituído com R°; - (CH2) 1-2 (Ph), opcionalmente substituído com R°; -CH=CH(Ph), opcionalmente substituído com R°; -N02; -CN; - N(R°)2; -NR°C(0)R°; NR°C(S)R°; -NR°C (0)N(R°)2; -NR°C (S) N (R° ) 2; -NR°C02R°; NR°NR°C(0)R°; -NR°NR°C(0)N (R°)2; -NR°NR°C02R° ; C (0) C (0) R°; -C(0)CH2C(0)R°; -C02R°; -C(0)R°; -C(S)R°; - C(0)N(R°)2; -C(S)N(R°)2; -0C (0) N(R°)2; -0C(0)R°; C (0) N (0R°) R°; -C(N0R°)R°; -S(0)2R°; -S(0)3R°; -S02N(R°)2; -S (0) R° ; -NR°S02N (R° ) 2; -NR°S02R°; -N(0R°)R°; -C (=NH)-N (R° ) 2; -P (0) 2R°; -PO (R°) 2; -0P0 (R°) 2; - (CH2) 0-2NHC (0) R°; fenilo (Ph) opcionalmente substituído com R°; -0 (Ph) opcionalmente substituído com R°; - (CH2) i_2 (Ph) , opcionalmente substituído com R°; ou -CH=CH(Ph), opcionalmente substituído com R°; em que cada ocorrência independente de R° é seleccionada de hidrogénio, Ci-6 alifático opcionalmente substituído, um anel heterocíclico ou heteroarilo de 5-6 membros não substituído, fenilo, -O(Ph), ou -CH2 (Ph) , ou, apesar da definição anterior, duas ocorrências independentes de R°, 35 no mesmo substituinte ou diferentes substituintes, tomadas junto com o(s) átomo (s) ao(s) qual (quais) cada grupo R° está ligado, formam um anel monociclico ou biciclico opcionalmente substituído de 3-12 membros saturado, parcialmente insaturado ou totalmente insaturado tendo 0-4 heteroátomos seleccionados independentemente de azoto, oxigénio, ou enxofre.
Substituintes opcionais no grupo alifático de R° são seleccionados de NH2, NH (Ci_4alifático), N (Ci_4alifático) 2, halogéneo, Ci_4alifático, OH, O (Ci_4alifático) , N02, CN, C02H, C02 (Ci-4alif ático), 0(haloCi^4 alifático), ou haloCi-4alifático, em que cada um dos anteriores grupos Ci_4 alifáticos de R° é não substituído.
Um grupo alifático ou heteroalifático, ou um anel heterocíclico não aromático pode conter um ou mais substituintes e assim podem ser "opcionalmente substituído". A menos que de outra forma definido anteriormente e no presente documento, substituintes adequados no carbono saturado de um grupo alifático ou heteroalifático, ou de um anel heterocíclico não aromático são seleccionados de aqueles listados anteriormente para o carbono insaturado de um grupo arilo ou heteroarilo e adicionalmente incluem os seguintes: =0, =S, =NNHR*, =NN(R*)2, =NNHC(0)R*, =NNHC02(alquilo), =NNHS02(alquilo), ou =NR*, onde cada R* é seleccionado independentemente de hidrogénio ou um grupo Ci_6 alifático opcionalmente substituído. A menos que de outra forma definido anteriormente e no presente documento, substituintes opcionais no azoto de um anel heterocíclico não aromático são geralmente seleccionados de -R+, -N(R+)2, -C(0)R+, -C02r+, -C(0)C(0)R+, 36 -C(0)CH2C(0)R+, -S02R+, -S02N(R+)2, -C (=S)N (R+1) 2, -C (=NH) - N(R+)2, ou -NR+S02R+; em que R+ é hidrogénio, um Ci_6 alifático opcionalmente substituído, fenilo opcionalmente substituído, -O(Ph) opcionalmente substituído, -CH2 (Ph) opcionalmente substituído, - (CH2) i-2 (Ph) opcionalmente substituído; -CH=CH(Ph) opcionalmente substituído; ou um anel heterocíclico ou heteroarilo de 5-6 membros não substituído tendo um a quatro heteroátomos seleccionados independentemente de oxigénio, azoto, ou enxofre, ou, apesar da definição anterior, duas ocorrências independentes de R+, no mesmo substituinte ou diferentes substituintes, tomadas junto com o(s) átomo(s) ao(s) qual(quais) cada R+ grupo está ligado, formam um anel monocíclico ou bicíclico opcionalmente substituído de 3-12 membros saturado, parcialmente insaturado ou totalmente insaturado tendo 0-4 heteroátomos seleccionados independentemente de azoto, oxigénio, ou enxofre.
Substituintes opcionais no grupo alifático ou o anel fenilo de R+ são seleccionados de -nh2, -nh(Ci_4 alifático), -N (Ci_4 alifático) 2, halogéneo, Ci_4 alifático, -0H,-0(Ci-4 alifático), -N02, -CN, -C02H, -C02 (C2-4 alifático), -O (halo-Ci_4 alifático), ou halo (Ci-4 alifático), em que cada um dos anteriores grupos Ci-4 alifáticos de R+ é não substituído.
No caso de uma substituição de heterociclilo, substituintes podem ser ligados a posições substituíveis tanto no átomo de carbono como no heteroátomo. Por exemplo, se a estrutura substituída descrita fosse um anel piperazina e o substituinte fosse CH3, o composto descrito poderia ser ou 37
ou
CH*
Uma concretização da invenção refere-se a um composto de fórmula II: 7.
(Π) em que X é N; Y é NR°, ou 0; n é 0; m é 0; p é 0; R1 é -N (H) R2; R2 é hidrogénio; R3 é 2-piridilo; R5 é hidrogénio, ou -CN; em que cada ocorrência independente de R° é seleccionada de hidrogénio, Ci_6 alifático opcionalmente substituído, um anel heterocíclico ou heteroarilo de 5-6 membros não substituído, fenilo, -O(Ph), ou -CH2(Ph), ou, apesar da definição anterior, duas ocorrências independentes de R°, no mesmo substituinte ou diferentes substituintes, tomadas junto com o(s) átomo (s) ao(s) qual (quais) cada grupo R° está ligado, formam um anel heteroarilo, arilo ou heterociclilo de 5-8 membros ou um anel cicloalquilo de 3-8 38 membros tendo 0-3 heteroátomos seleccionados independentemente de azoto, oxigénio, ou enxofre; um grupo alifático de R° é opcionalmente substituído com NH2, NH (Ci-4 alifático), N(Ci-4 alifático) 2, halogéneo, C1-4 alifático, OH, 0(Ci_4 alifático), N02, CN, C02H, C02(Ci_4 alifático), O(halo-Ci_4 alifático), ou halo(C4-4 alifático), em que cada um destes grupos Ci_4 alifático anteriores é não substituído; cada R* é seleccionado independentemente de hidrogénio ou um C1-6 alifático opcionalmente substituído com NH2, NH(Ci-4 alifático), N(Ci-4 alifático) 2, halogéneo, C4-4 alifático, OH, 0(Ci-4 alifático), N02, CN, C02H, C02(Ci-4 alifático), O(halo-Ci_4 alifático), ou halo(Ci_4 alifático), em que cada um destes grupos C4_4 alifático anteriores é não substituído; R é hidrogénio ou um grupo Ci_6 alifático, opcionalmente substituído com =0, =S, -NH2, NH(C4-4 alifático), N(Ci_4 alifático) 2, halogéneo, C4_4 alifático, OH, 0 (Ci-4 alifático), no2, CN, C02H, C02(Ci-4 alifático), 0 (halo-Ci_4 alifático), ou halo(Ci-4 alifático), em que cada um destes grupos C4_4 alifático anteriores é não substituído; em que cada ocorrência independente de R° é seleccionada de hidrogénio, Ci_6 alifático opcionalmente substituído, um anel heterocíclico ou heteroarilo de 5-6 membros não substituído (contanto que um átomo de azoto no anel heterocíclico seja opcionalmente substituído com -R+ ou -C(0)R+, em que R+ é (alquiloCi-6), preferentemente (alquiloCi_4) ), fenilo, -0 (Ph) , ou -CH2(Ph), ou, apesar da definição anterior, duas ocorrências independentes de R°, no mesmo substituinte ou diferentes substituintes, tomadas 39 junto com o(s) átomo (s) ao(s) qual (quais) cada grupo R° está ligado, formam um anel heteroarilo, arilo ou heterociclilo de 5-8 membros ou um anel cicloalquilo de 3-8 membros tendo 0-3 heteroátomos seleccionados independentemente de azoto, oxigénio, ou enxofre. X e Y e os átomos ao qual estão ligados formam um anel de seis membros, preferentemente com 2 heteroátomos, e mais preferentemente com 1 heteroátomo
Uma concretização é representada pela Fórmula I-b:
Outra concretização é representada pela Fórmula I-c:
Outras concretizações são representadas pelos compostos 1-1 e 1-2: 40
Outras concretizações são representadas pelos compostos 1-3 e 1-4:
Outras concretizações de fórmula II são representadas pelos seguintes compostos: 41
42
Como discutido anteriormente, a presente invenção proporciona compostos que são inibidores de proteina 43 quinases, e assim os presentes compostos são úteis para o tratamento de doenças, transtornos, e afecções incluindo, mas não limitado a um transtorno proliferativo, um transtorno cardiaco, um transtorno neurodegenerativo, transtornos psicóticos, um transtorno autoimune, uma afecção associada com o transplante de órgãos, um transtorno inflamatório, um transtorno mediado imunologicamente, uma doença virai, ou um transtorno ósseo. Em concretizações preferidas, os compostos são úteis para o tratamento de alergia, asma, diabetes, doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson, demência associada a SIDA, esclerose lateral amiotrófica (AML, Lou Gehrig's doença), esclerose múltipla (MS), esquizofrenia, hipertrofia de cardiomiócitos, reperfusão/isquemia (por exemplo, acidente vascular cerebral), calvície, cancro, hepatomegalia, doença cardiovascular incluindo cardiomegalia, fibrose cística, doença virai, doenças autoimunes, aterosclerose, reestenose, psoríase, inflamação, hipertensão, angina de peito, contracção cerebrovascular, transtorno de circulação periférica, parto prematuro, arteriosclerose, vasoespasmo (vasoespasmo cerebral, vasoespasmo coronário), retinopatia, disfunção eréctil (ED), SIDA, osteoporose, doença de Crohn e colite, excrescência de neurite, e doença de Raynaud. Em concretizações preferidas, a doença, afecção, ou transtorno é aterosclerose, hipertensão, disfunção eréctil (ED), reperfusão/isquemia (por exemplo, acidente vascular cerebral), ou vasoespasmo (vasoespasmo cerebral e vasoespasmo coronário).
Por conseguinte, noutro aspecto da presente invenção, composições farmaceuticamente aceitáveis são 44 proporcionadas, em que estas composições compreendem quaisquer dos compostos como descrito no presente documento, e opcionalmente compreendem um portador, adjuvante ou veiculo farmaceuticamente aceitável. Em certas concretizações, estas composições opcionalmente compreendem adicionalmente um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
Também será apreciado que certos compostos da presente invenção podem existir em forma livre para 0 tratamento, ou onde apropriado, como um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo. De acordo com a presente invenção, um derivado farmaceuticamente aceitável inclui, mas não é limitado a, pró-fármacos, sais, ésteres, sais de tais ésteres, ou quaisquer outros adutos ou derivado farmaceuticamente aceitáveis que após a administração a um paciente em necessidade é capaz de proporcionar, directamente ou indirectamente, um composto como de outra forma descrito no presente documento, ou um metabólito ou resíduo do mesmo. Como utilizado no presente documento, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a aqueles sais que são, dentro do âmbito do juízo médico sensato, adequados para utilização em contacto com os tecidos de seres humanos e animais inferiores sem toxicidade indevida, irritação, resposta alérgica e similares, e são comensurados com uma razão risco/benefício razoável. Um "sal farmaceuticamente aceitável" significa qualquer sal não tóxico ou sal de um éster de um composto desta invenção que, após a administração a um recipiente, é capaz de proporcionar, ou directamente ou indirectamente, um composto desta invenção ou um metabólito inibitoriamente activo ou resíduo do mesmo. Como utilizado no presente documento, o termo " metabólito inibitoriamente activo ou 45 resíduo do mesmo" significa que um metabólito ou resíduo do mesmo é também um inibidor de um FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70S6K-l e -2, e PKB) , CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK.
Sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, S. M. Berge et al., descrevem sais farmaceuticamente aceitáveis em detalhe em J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, incorporado no presente documento por referência. Sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta invenção incluem aqueles derivados de ácidos e bases orgânicos e inorgânicos adequados. Exemplos de sais de adição de ácido não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis são sais de um grupo amino formado com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico ou com ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malónico ou pela utilização de outros procedimentos utilizados na técnica tais como permuta iónica. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canforssulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, hidroiodeto, 2-hidroxi-etanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, 46 pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenossulfonato, undecanoato, valerato, e similares. Sais derivados de bases apropriadas incluem sais de metais alcalinos, metais alcalinos terrosos, amónio e N+ (alquiloCi-4) 4. Esta invenção também prevê a quaternização de quaisquer grupos contendo azoto básico dos compostos revelados no presente documento. Produtos dispersáveis ou solúveis em água ou óleo podem ser obtidos por tal quaternização. Sais de metais alcalinos ou alcalinos terrosos representativos incluem sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio, e similares. Sais farmaceuticamente aceitáveis adicionais incluem, quando apropriado, amónio não tóxico, amónio quaternário, e catiões amina formados utilizando contraiões tais como haleto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquilo inferior e sulfonato de arilo.
Como descrito anteriormente, as composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção compreendem adicionalmente um portador, adjuvante, ou veiculo farmaceuticamente aceitável, que, como utilizados no presente documento, inclui todos e quaisquer solventes, diluentes, ou outros ajudantes de suspensão, dispersão ou veiculo líquidos, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espessantes ou emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubrificantes e similares, conforme seja adequado à forma farmacêutica particular desejada. Remington's Pharmaceutical Sciences, Décimo sexta Edição, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) revela vários portadores utilizados na formulação de composições farmaceuticamente aceitáveis e técnicas conhecidas para a preparação dos mesmos. Excepto 47 na medida em que qualquer portador convencional seja incompatível com os compostos da invenção, tais como produzindo qualquer efeito biológico indesejável ou interagindo de outro modo de uma maneira deletéria com qualquer outro (s) componente(s) da composição farmaceuticamente aceitável, sua utilização é contemplada para estar dentro do âmbito desta invenção. Alguns exemplos de materiais que podem servir como portadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não limitam-se a, permutadores iónicos, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina sérica humana, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, ou sorbato de potássio, misturas de glicérido parciais de ácidos gordos vegetais saturados, água, sais ou electrólitos, tais como sulfato de pviamina, hidrogenofosfato de dissódio, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloco de polietileno- polioxipropileno, gordura de lã, açúcares tais como lactose, glicose e sacarose; amidos tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; adraganto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes tais como manteiga de cacau e ceras de supositório; óleos tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão; óleo de açafrão; óleo de gergelim; azeite de oliva; óleo de milho e óleo de soja; glicóis; tais um propilenoglicol ou polietilenoglicol; ésteres tais como oleato de etilo e laurato de etilo; ágar; agentes tamponantes tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de 48 alumínio; ácido algínico; água livre de pirogénio; solução salina isotónica; solução de Ringer; álcool etílico, e soluções de tampão fosfato, assim como outros lubrificantes compatíveis não tóxicos tais como laurilssulfato de sódio e estearato de magnésio, assim como agentes colorantes, agentes de libertação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, aromatizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na composição, de acordo com o juízo do formulador.
Em ademais outro aspecto, um composto, ou uma composição farmaceuticamente aceitável que compreende um composto para utilização no tratamento ou diminuição da gravidade de um transtorno proliferativo, um transtorno cardíaco, um transtorno neurodegenerativo, um transtorno psicótico, um transtorno autoimune, uma afecção associada com o transplante de órgãos, um transtorno inflamatório, um transtorno mediado imunologicamente, uma doença virai, ou um transtorno ósseo é proporcionado. Em certas concretizações da presente invenção uma "quantidade eficaz" do composto ou da composição farmaceuticamente aceitável é aquela quantidade eficaz para tratar ou diminuir a gravidade de um transtorno proliferativo, um transtorno cardíaco, um transtorno neurodegenerativo, um transtorno psicótico, um transtorno autoimune, uma afecção associada com o transplante de órgãos, um transtorno inflamatório, um transtorno mediado imunologicamente, uma doença virai, ou um transtorno ósseo. Os compostos e composições, de acordo com o método da presente invenção, podem ser administrados utilizando qualquer quantidade e qualquer via de administração eficaz para tratar ou diminuir a gravidade de um transtorno proliferativo, um transtorno cardíaco, um 49 transtorno neurodegenerativo, um transtorno autoimune, uma afecção associada com o transplante de órgãos, um transtorno inflamatório, um transtorno mediado imunologicamente, uma doença virai, ou um transtorno ósseo. A quantidade exacta requerida variará de sujeito a sujeito, dependendo da espécie, idade, e condição geral do sujeito, a gravidade da infecção, o agente particular, seu modo de administração, e similares. Os compostos da invenção são preferentemente formulados em forma farmacêutica unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A expressão "forma farmacêutica unitária" como utilizada no presente documento refere-se a uma unidade fisicamente diferenciada de agente apropriado para o paciente a ser tratado. Se entenderá, contudo, que a utilização diária total dos compostos e composições da presente invenção será decidida pelo médico responsável dentro do âmbito de juizo médico sensato. 0 nivel de dose eficaz especifico para qualquer paciente ou organismo particular dependerá de uma variedade de factores incluindo o transtorno a ser tratado e a gravidade do transtorno; a actividade do composto específico empregado; a composição especifica empregada; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, via de administração, e taxa de excreção do composto especifico empregado; a duração do tratamento; fármacos utilizados em combinação ou concomitante com o composto especifico empregado, e factores similares bem conhecidos na técnica médica. 0 termo "paciente", como utilizado no presente documento, significa um animal, preferentemente um mamífero, e mais preferentemente um ser humano. 50
As composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção podem ser administradas a seres humanos e outros animais por via oral, rectal, parentérica, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como por meio de pós, pomadas, ou gotas), bucal, como uma pulverização oral ou nasal, ou similar, dependendo da gravidade da infecção a ser tratada. Em certas concretizações, os compostos da invenção podem ser administrados por via oral ou parentérica em níveis de dosagem de aproximadamente 0,01 mg/kg s aproximadamente 50 mg/kg e preferentemente desde aproximadamente 1 mg/kg até aproximadamente 25 mg/kg, de peso corporal do sujeito por dia, uma ou mais vezes ao dia, para obter o efeito terapêutico desejado.
Formas farmacêuticas líquidas para administração oral incluem, mas não limitam-se a, emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além dos compostos activos, as formas farmacêuticas líquidas podem conter diluentes inertes comummente utilizados na técnica tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsionantes tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, álcool benzílico, benzoato de benzilo, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, dimetilformamida, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, amendoim, milho, gérmen, oliva, rícino, e gergelim), glicerol, álcool tetrahidrofurfurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácido gordo de sorbitano, e misturas dos mesmos. Além de diluentes inertes, as composições orais também podem incluir adjuvantes tais como agentes humectantes, agentes 51 de suspensão e emulsionantes, agentes adoçantes, aromatizantes de perfumantes.
Preparações injectáveis, por exemplo, suspensões oleaginosas ou aquosas injectáveis estéreis podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida utilizando agentes humectantes ou de dispersão adequados e agentes de suspensão. A preparação injectável estéril também pode ser uma solução, suspensão ou emulsão injectável estéril num diluente ou solvente aceitável parentérico não tóxico, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer, U.S.P. e solução isotónica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos ou estéreis são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito qualquer óleo fixo insosso pode ser empregado incluindo mono ou diglicéridos sintéticos. Além disso, ácidos gordos tais como ácido oleico são utilizados na preparação de injectáveis.
As formulações injectáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por meio de filtração através de um filtro que retém bactérias, ou incorporando agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injectável estéril antes de utilização. A fim de prolongar o efeito de um composto da presente invenção, é frequentemente desejável diminuir a velocidade da absorção do composto a partir de injecção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser conseguido pela utilização de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com pobre solubilidade em água. A taxa de absorção do composto então depende da sua taxa de 52 dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e forma cristalina. De modo alternativo, a absorção retardada de uma forma do composto administrado por via parentérica é conseguida dissolvendo ou suspendendo o composto num veiculo oleoso. Formas injectáveis de depósito são feitas pela formação de matrizes microencapsuladas do composto em polímeros biodegradáveis tais como polilactídeo-poliglicolídeo. Dependendo da razão de composto para polímero e a natureza do polímero particular empregado, a taxa de libertação do composto pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli (ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injectáveis de depósito também são preparadas encapsulando o composto em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com tecidos do corpo.
Composições para administração rectal ou vaginal são preferentemente supositórios que podem ser preparados pela mistura dos compostos desta invenção com portadores ou excipientes não irritantes adequados, tais como manteiga de cacau, polietilenoglicol ou uma cera de supositório, que são sólidos a temperatura ambiente, mas líquidos a temperatura do corpo e, portanto, derretem na cavidade do recto ou da vagina e libertam o composto activo.
Formas farmacêuticas sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós, e grânulos. Em tais formas farmacêuticas sólidas, o composto activo é misturado com pelo menos um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável inerte, tal como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio e/ou a) recheios ou cargas tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol, e ácido silícico, b) aglutinantes tais como, por exemplo, 53 carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarose, e goma arábica, c) humectantes tais como glicerol, d) agentes desintegrantes tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicatos, e carbonato de sódio, e) agentes retardantes de dissolução tais como parafina, f) aceleradores de absorção tais como compostos de amónio quaternário, g) agentes humectantes tais como, por exemplo, álcool cetilico e monoestearato de glicerol, h) absorventes tais como caulino e argila bentonite, e i) lubrificantes tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicóis sólidos, laurilsulfato de sódio, e misturas dos mesmos. No caso de cápsulas, comprimidos e pilulas, a forma farmacêutica também pode compreender agentes tamponantes.
Composições sólidas de um tipo similar também podem ser empregadas como recheios em cápsulas de gelatina de recheio mole e duro utilizando tais excipientes como lactose ou açúcar de leite, assim como polietilenoglicóis de alto peso molecular e similares. As formas farmacêuticas sólidas de comprimidos, drageias, cápsulas, pílulas, e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e envoltórios tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Podem opcionalmente conter agentes opacificantes e também podem ser de uma composição que liberta o(s) ingrediente(s) activo(s) somente, ou preferentemente, em certa parte do tracto intestinal, opcionalmente, numa maneira retardada. Exemplos de composições de recobrimento que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras. Composições 54 sólidas de um tipo similar também podem ser empregadas como recheios em cápsulas de gelatina de recheio mole e duro utilizando tais excipientes como lactose ou açúcar de leite, assim como poletilenglicóis de alto peso molecular e similares.
Os compostos activos também podem estar em forma microencapsulada com um ou mais excipientes como notado anteriormente. As formas farmacêuticas sólidas de comprimidos, drageias, cápsulas, pululas, e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e envoltórios tais como revestimentos entéricos, revestimentos de controlo de libertação e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Em tais formas farmacêuticas sólidas o composto activo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte tal como sacarose, lactose ou amido. Tais formas farmacêuticas também podem compreender, como é prática normal, substâncias adicionais diferentes de diluentes inertes, por exemplo, lubrificantes para a preparação de comprimidos e outros auxiliares para a preparação de comprimidos tais como estearato de magnésio e celulose microcristalina. No caso de cápsulas, comprimidos e pululas, as formas farmacêuticas também podem compreender agentes tamponantes. Podem opcionalmente conter agentes opacificantes e também podem ser de uma composição que liberta o(s) ingrediente(s) activo(s) somente, ou preferentemente, em certa parte do tracto intestinal, opcionalmente, numa maneira retardada. Exemplos de composições de recobrimento que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras.
Formas farmacêuticas para administração tópica ou transdérmica de um composto desta invenção incluem pomadas, 55 pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, pulverizações, inalantes ou pensos. 0 componente activo é misturado sob condições estéreis com um portador farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes ou tampões necessários conforme possam ser requeridos. Formulação oftálmica, gotas para o ouvido, e gotas para os olhos são também contempladas como estando dentro do âmbito desta invenção. Adicionalmente, a presente invenção contempla a utilização de pensos transdérmicos, que têm a vantagem adicional de proporcionar a distribuição controlada de um composto ao corpo. Tais formas farmacêuticas podem ser feitas pela dissolução ou dispensação do composto no meio apropriado. Melhoradores de absorção também podem ser utilizados para aumentar o fluxo do composto através da pele. A taxa pode ser controlada ou proporcionando uma membrana de controlo de taxa ou dispersando o composto num gel ou matriz de polímero.
Como descrito geralmente anteriormente, os compostos da invenção são úteis como inibidores de proteína quinases. Numa concretização, os compostos e composições da invenção são inibidores de uma ou mais de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamílias AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB) , CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK, e assim, sem desejar estar ligado a qualquer teoria particular, os compostos e composições são particularmente úteis para tratar ou diminuir a gravidade de uma doença, afecção, ou transtorno onde a activação de um ou mais de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e - 2, e PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK está implicada na doença, afecção, ou transtorno. Quando a activação de FLT-3, FMS, 56 c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB) , CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK está implicada numa doença, afecção, ou transtorno particular, a doença, afecção, ou transtorno também podem ser referidos como "doença mediada por FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p7ps6K-l e - 2, e PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK" ou sintoma de doença. Por conseguinte, noutro aspecto, a presente invenção proporciona compostos ou composições para utilização no tratamento ou diminuição da gravidade de uma doença, afecção, ou transtorno onde a activação ou um ou mais de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK está implicada no estado patológico. A actividade de um composto utilizado nesta invenção como um inibidor de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K- 1 e -2, e PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK, pode ser ensaiada in vitro, in vivo ou numa linha celular. Ensaios in vitro incluem ensaios que determinam a inibição de ou a actividade de fosforilação ou a actividade de ATPase de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK activados. Ensaios in vitro alternativos quantificam a habilidade do inibidor de se ligar a FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK. A ligação do inibidor pode ser medida por meio de radiomarcação do inibidor antes da ligação, isolando o complexo inibidor/ FLT-3, FMS, c- 57 KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB) , CDK, GSK, SRC, ROCK, ou SYK e determinando a quantidade de radiomarcador ligado. De modo alternativo, a ligação do inibidor pode ser determinada executando um experimento de competição onde novos inibidores são incubados com FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK unidos a radioligandos conhecidos.
Numa concretização, a invenção proporciona um composto de fórmulas I, II ou III que selectivamente inibem FLT-3 e/ou c-KIT. Numa concretização adicional, a invenção proporciona um composto de fórmula I que selectivamente inibe FLT-3 e/ou c-KIT. Como utilizado no presente documento, o termo "selectivamente inibe" significa que um composto inibe FLT-3 e/ou c-KIT com um Ki ou CI50 que é pelo menos duas vezes menor que para uma ou mais outras quinases, tais como Aurora-2, FMS, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB), CDK, GSK-3, JNK, KDR, MET, SRC, ROCK e/ou SYK. Numa concretização adicional, um composto que selectivamente inibe FLT-3 e/ou c-KIT é um que inibe FLT-3 e/ou c-KIT com um Ki ou CI50 que é pelo menos cinco vezes menor ou pelo menos dez vezes menor que para uma ou mais outras quinases, tais como Aurora-2, FMS, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB), CDK, GSK-3, JNK, KDR, MET, SRC, ROCK e/ou SYK.
O termo "inibir de forma mensurável", como utilizado no presente documento significa uma mudança mensurável em actividade de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC 58 de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK entre uma amostra que compreende dita composição e uma FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK quinase e uma amostra equivalente que compreende FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK quinase na ausência de dita composição. 0 termo "doença mediada por FLT-3", como utilizado no presente documento siqnifica qualquer doença ou outra afecção deletéria em que uma família FLT-3 de quinase é conhecida por desempenhar um papel. Tais afecções incluem, sem limitação, transtornos hematopoiéticos, em particular, leucemia mielógena aguda (AML), leucemia promielocítica aguda (APL), e leucemia linfocítica aguda (ALL).
De acordo com outra concretização, a invenção proporciona uma composição de acordo com a presente invenção, para utilização no tratamento ou diminuição da gravidade de uma afecção ou doença mediada por FMS num paciente. 0 termo "doença mediada por FMS", como utilizado no presente documento significa qualquer doença ou outra afecção deletéria em que uma família FMS de quinase é conhecida por desempenhar um papel. Tais afecções incluem, sem limitação, cancro (incluindo, mas não limitado a, cancro de ovário, endométrio, e mama), transtornos inflamatórios, e hipertensão.
De acordo com outra concretização, a invenção proporciona uma composição de acordo com a presente invenção, para utilização no tratamento ou diminuição da 59 gravidade de uma afecção ou doença mediada por c-KIT num paciente. 0 termo "doença mediada por c-KIT", como utilizado no presente documento significa qualquer doença ou outra afecção deletéria em que uma família c-KIT de quinase é conhecida por desempenhar um papel. Tais afecções incluem, sem limitação, AML, leucemia mielógena crónica (CML), mastocitose, linfoma anaplásico de grandes células, ALL, tumor estromal gastrointestinal (GIST), linfoma de células T, carcinoma adenoide cístico, angiosarcoma, carcinoma endométrio, carcinoma de pulmão de células pequenas, cancro de próstata, cancro de ovário, carcinoma de mama, carcinoma de tiróide, melanoma maligno, carcinoma de cólon, e glioblastoma.
De acordo com outra concretização, a invenção proporciona uma composição de acordo com a presente invenção, para utilização no tratamento ou diminuição da gravidade de uma afecção ou doença mediada por CDK-2 num paciente. 0 termo "doença mediada por CDK-2", como utilizado no presente documento significa qualquer doença ou outra afecção deletéria em que CDK-2 é conhecida por desempenhar um papel. Por conseguinte, estes compostos são úteis para tratar doenças ou afecções que são conhecidas por serem afectadas pela actividade de CDK-2 quinase. Tais doenças ou afecções incluem cancro, doença de Alzheimer, reestenose, angiogénese, glomerulonefrite, citomegalovírus, VIH, herpes, psoríase, aterosclerose, alopecia, e doenças autoimunes tais como artrite reumatóide, infecções virais, transtornos neurodegenerativos, transtornos associados com apoptose de timócito, ou transtornos proliferativos 60 resultando da desregulação do ciclo celular, especialmente da progressão da fase Gi a S.
De acordo com outra concretização, a invenção proporciona uma composição de acordo com a presente invenção, para utilização no tratamento ou diminuição da gravidade de uma afecção ou doença mediada por GSK-3 num paciente.
De acordo com outra concretização, a invenção proporciona uma composição de acordo com a presente invenção, para utilização no tratamento ou diminuição da gravidade de uma afecção ou doença mediada por Src num paciente. O termo "doença mediada por Src" como utilizado no presente documento significa qualquer doença ou outra afecção deletéria em que Src quinase desempenha um papel. Tais doenças ou afecções incluem, sem limitação, cancros tais como cancro de cólon, mama, hepático e pancreático, doenças autoimunes tais como rejeição a transplante, alergias, artrite reumatóide, leucemia, doenças de remodelação óssea tais como osteoporose e doenças virais tais como infecção por hepatite B.
De acordo com outra concretização, a invenção proporciona uma composição de acordo com a presente invenção, para utilização no tratamento ou diminuição da gravidade de uma afecção ou doença mediada por Syk num paciente. O termo "doença mediada por Syk" ou "afecção mediada por Syk", como utilizado no presente documento, significa qualquer doença ou outra afecção deletéria em que Syk proteína quinase é conhecida por desempenhar um papel. 61
Tais afecções incluem, sem limitação, transtornos alérgicos, especialmente asma. 0 termo "doença mediada por JAK", como utilizado no presente documento significa qualquer doença ou outra afecção deletéria em que uma família JAK de quinase é conhecida por desempenhar um papel. Tais afecções incluem, sem limitação, respostas imunes tais como reacções de hipersensibilidade de tipo I ou alérgicas, asma, doenças autoimunes tais como rejeição a transplante, doença de enxerto versus hospedeiro, artrite reumatóide, esclerose lateral amiotrófica, e esclerose múltipla, transtornos neurodegenerativos tais como esclerose lateral amiotrófica familiar (FALS), assim como em malignidades hematológicas e sólidas tais como leucemias e linfomas. 0 termo "afecção mediada por PDKl" ou "doença", como utilizado no presente documento, significa qualquer doença ou outra afecção deletéria em que PDKl é conhecida por desempenhar um papel. 0 termo "afecção mediada por PDKl" ou "doença" também significa aquelas doenças ou afecções que são aliviadas por tratamento com um inibidor de PDKl. Afecções ou doenças mediadas por PDKl incluem, mas não limitam-se a, transtornos proliferativos, e cancro. Preferentemente, dito cancro é seleccionado de cancro pancreático, de próstata ou ovário. 0 termo "afecção mediada por PKA" ou "doença", como utilizado no presente documento, significa qualquer doença ou outra afecção deletéria em que PKA é conhecida por desempenhar um papel. 0 termo "afecção mediada por PKA" ou "doença" também significa aquelas doenças ou afecções que são aliviadas por tratamento com um inibidor de PKA. 62
Afecções ou doenças mediadas por PKA incluem, mas não limitam-se a, transtornos proliferativos e cancro. 0 termo "afecção mediada por p70s6K" ou "doença", como utilizado no presente documento, significa qualquer doença ou outra afecção deletéria em que p70s6K é conhecida por desempenhar um papel. 0 termo "afecção mediada por p70S6K" ou "doença" também significa aquelas doenças ou afecções que são aliviadas por tratamento com um inibidor de p70s6K. Afecções ou doenças mediadas por p70s6K incluem, mas não limitam-se a, transtornos proliferativos, tais como cancro e esclerose tuberosa. 0 termo "doença mediada por GSK-3" como utilizado no presente documento, significa qualquer doença ou outra afecção deletéria ou doença em que GSK-3 é conhecida por desempenhar um papel. Tais doenças ou afecções incluem, sem limitação, doenças autoimunes, doenças inflamatórias, doenças metabólicas, neurológicas e neurodegenerativas (por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de Parkinson e transtornos de movimento pelos gânglios basais, coreia, distonia, doença de Wilson, doença de Pick, degeneração do lobo frontal, paralisia supranuclear progressiva (PSP), doença de Creutzfeldt-Jakob, taupatologia e degeneração corticobasal (CBD)), transtornos psicóticos (por exemplo, esquizofrenia, demência associada a SIDA, depressão, transtorno bipolar, e transtornos de ansiedade), doenças cardiovasculares, alergia, asma, diabetes, esclerose lateral amiotrófica (AML, doença de Lou Gehrig), esclerose múltipla (MS), hipertrofia de cardiomiócitos, reperfusão/isquemia, acidente vascular cerebral, e calvicie. 63 0 termo "afecção mediada por ROCK" ou "doença", como utilizado no presente documento, significa qualquer doença ou outra afecção deletéria em que ROCK é conhecida por desempenhar um papel. 0 termo "afecção mediada por ROCK" ou "doença" também significa aquelas doenças ou afecções que são aliviadas por tratamento com um inibidor de ROCK. Tais afecções incluem, sem limitação, hipertensão, angina de peito, contracção cerebrovascular, asma, transtorno de circulação periférica, parto prematuro, cancro, disfunção eréctil, arteriosclerose, espasmo (vasoespasmo cerebral e vasoespasmo coronário), retinopatia (por exemplo, glaucoma), transtornos inflamatórios, transtornos autoimunes, SIDA, osteoporose, hipertrofia do miocárdio, lesão induzida por isquemia/reperfusão, e disfunção endotelial.
Noutras concretizações, a invenção refere-se a uma composição que compreende um composto de fórmula II, para utilização em melhora da sintese de glicogénio e/ou diminuição dos niveis sanguíneos de glicose num paciente em necessidade do mesmo. Esta utilização é especialmente útil para pacientes diabéticos.
Em ademais outra concretização, a invenção refere-se a uma composição que compreende um composto de fórmula II, para utilização na inibição da produção de proteina Tau hiperfosforilada num paciente em necessidade do mesmo. Esta utilização é especialmente útil em atrasar ou diminuir a velocidade da progressão de doença de Alzheimer.
Em ainda outras concretizações, a invenção refere-se a uma composição que compreende um composto de fórmula II, para utilização na inibição da fosforilação de β-catenina 64 num paciente em necessidade do mesmo. Esta utilização é especialmente útil para tratar esquizofrenia.
Também será apreciado que os compostos e composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser empregados em terapêuticas de combinação, isto é, os compostos e composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser administrados concorrentemente com, antes de, ou subsequente a, um ou mais outros procedimentos médicos ou terapêuticos desejados. A combinação particular de terapêuticas (terapêuticas ou procedimentos) para empregar num regime de combinação terá em consideração a compatibilidade das terapêuticas e/ou procedimentos desejados e o efeito terapêutico desejado a ser conseguido. Também será apreciado que as terapêuticas empregadas podem conseguir um efeito desejado para o mesmo transtorno (por exemplo, um composto inventivo pode ser administrado concorrentemente com outro agente utilizado para tratar o mesmo transtorno), ou podem conseguir diferentes efeitos (por exemplo, controlo de quaisquer efeitos adversos). Como utilizado no presente documento, agentes terapêuticos adicionais que são normalmente administrados para tratar ou prevenir uma doença, ou afecção, particular são conhecidos como "apropriado para a doença, ou afecção, a ser tratada".
Por exemplo, agentes quimioterápicos ou outros agentes anti-proliferativos podem ser combinados com os compostos desta invenção para tratar doenças proliferativas e cancro. Exemplos de agentes quimioterápicos conhecidos incluem, mas não limitam-se a, por exemplo, outras terapêuticas ou agentes anticancro que podem ser utilizados em combinação com os agentes anticancro inventivos da presente invenção incluem cirurgia, radioterapia (em ainda 65 alguns exemplos, radiação gama, radioterapia com feixe de neutrões, radioterapia com feixe de electrões, terapêutica de protões, braquiterapia, e isótopos radioactivos sistémicos, para nomear alguns), terapêutica endócrina, modificadores de resposta biológica (interferóns, interleucinas, e factor de necrose de tumor (TNF) para nomear alguns), hipertermia e crioterapia, agentes para atenuar efeitos adversos (por exemplo, antiemético), e outros fármacos quimioterápicos aprovados, incluindo, mas não limitado a, fármacos alquilantes (mecloretamina, clorambucil, ciclofosfamida, Melfalano, ifosfamida), antimetabólitos (Metotrexato), antagonistas de purina e antagonistas de pirimidina (6-mercaptopurina, 5-fluorouracilo, citarabila, gemcitabina), antimitóticos (vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel), podofilotoxinas (etopósido, irinotecano, topotecano), antibióticos (doxorubicina, bleomicina, mitomicina), nitrosoureias (carmustinz, lomustina), iões inorgânicos (cisplatina, carboplatina), enzimas (asparaginase), e hormonas (tamoxifeno, leuprolide, flutamida, e megestrol), Gleevec™, adriamicina, dexametasona, e ciclofosfamida. Para uma discussão mais abrangente de terapêuticas de cancro veja-se The Merck Manual, Décima sétima Ed. 1999, a totalidade do conteúdo do qual é pela presente incorporado como referência.
Outros exemplos de agentes que os inibidores desta invenção também podem ser combinados com incluem, sem limitação: tratamentos para doença de Alzheimer tais como Aricept® e Excelon®; tratamentos para doença de Parkinson tais como L-DOPA/carbidopa, entacapona, ropinirol, pramipexol, bromocriptina, pergolide, trihexefendilo, e 66 amantadina; agentes para tratar esclerose múltipla (MS) tais como beta interferón (por exemplo, Avonex® e Rebif®), Copaxone®, e mitoxantrona; tratamentos para asma tais como albuterol e Singular®; agentes para tratar esquizofrenia tais como zyprexa, risperdal, seroquel, e haloperidol; agentes anti-inflamatórios tais como corticosteróides, bloqueadores de TNF, IL-1 RA, azatioprina, ciclofosfamida, e sulfasalazina; agentes imunomoduladores e imunossupresores tais como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina, micofenolato mofetil, interferóns, corticosteroides, ciclofosfamida, azatioprina, e sulfasalazina; factores neurotróficos tais como inibidores de acetilcolinesterase, inibidores de MAO, interferóns, anticonvulsivos, bloqueadores do canal de iões, riluzol, e agentes anti-Parkinsonianos; agentes para tratar doença cardiovascular tais como beta-bloqueadores, inibidores de ACE, diuréticos, nitratos, bloqueadores do canal de cálcio, e estatinas; agentes para tratar doença do fígado tais como corticosteróides, colestiramina, interferóns, e agentes anti-virais; agentes para tratar transtornos do sangue tais como corticosteróides, agentes antileucêmicos, e factores de crescimento; e agentes para tratar transtornos de imunodeficiência tais como gamaglobulina. A quantidade de agente terapêutico adicional presente nas composições desta invenção será de não mais do que a quantidade que normalmente seria administrada numa composição que compreende aquele agente terapêutico como o único agente activo. Preferentemente a quantidade de agente terapêutico adicional nas composições presentemente revelada variará desde aproximadamente 50% até 100% da quantidade normalmente presente numa composição que 67 compreende que agente como o único agente terapeuticamente activo.
Os compostos desta invenção ou composições farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos também podem ser incorporados em composições para revestir dispositivos médicos implantáveis, tais como próteses, válvulas artificiais, enxertos vasculares, endopróteses e cateteres. Por conseguinte, a presente invenção, noutro aspecto, inclui uma composição para revestir um dispositivo implantável que compreende um composto da presente invenção como descrito geralmente anteriormente, e em classes e subclasses no presente documento, e um portador adequado para revestir dito dispositivo implantável. Em ainda outro aspecto, a presente invenção inclui um dispositivo implantável revestido com uma composição que compreende um composto da presente invenção como descrito geralmente anteriormente, e em classes e subclasses no presente documento, e um portador adequado para revestir dito dispositivo implantável.
Endopróteses vasculares, por exemplo, têm sido utilizadas para superar reestenose (re-estreitamento da parede do vaso após lesão). Contudo, pacientes utilizando endopróteses ou outros dispositivos implantáveis correm o risco da formação de coágulos ou activação de plaquetas. Estes efeitos indesejáveis podem ser prevenidos ou mitigados pelo pré-revestimento do dispositivo com uma composição farmaceuticamente aceitável que compreende um inibidor de quinase. Revestimentos adequados e a preparação geral de dispositivos implantáveis revestidos são descritos nas patentes dos E.U.A. 6.099.562; 5.886.026; e 5.304.121. Os revestimentos são tipicamente materiais poliméricos 68 biocompatíveis tais como um polímero de hidrogel, polimetildisiloxano, policaprolactona, polietilenoglicol, ácido poliláctico, vinilacetato de etileno, e misturas dos mesmos. Os revestimentos opcionalmente podem ser adicionalmente revestidos por um revestimento final adequado de fluorosilicone, polisacáridos, polietilenoglicol, fosfolípidos ou combinações dos mesmos para conferir características de libertação controlada na composição.
Outro aspecto da invenção refere-se a inibição de actividade de flt-3, fms, c-kit, pdgfr, jak, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK numa amostra biológica ou num paciente, cujo método compreende administrar ao paciente, ou pôr em contacto dita amostra biológica com um composto de fórmula I, II ou III ou uma composição que compreende dito composto. 0 termo "amostra biológica", como utilizado no presente documento, inclui sem limitação, culturas celulares ou extractos das mesmas; material de biopsia obtido de um mamífero ou extractos do mesmo; e sangue, saliva, urina, fezes, sémen, lágrimas, ou outros fluidos corporais ou extractos dos mesmos. A inibição de actividade de FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, subfamília AGC de proteína quinases (por exemplo, PKA, PDK, p70s6K-l e -2, e PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK, e/ou SYK quinase numa amostra biológica é útil para uma variedade de propósitos que são conhecidos por um perito na especialidade. Exemplos de tais propósitos incluem, mas não limitam-se a, transfusão sanguínea, transplante de órgãos, armazenamento de amostras biológicas, e ensaios biológicos. 69
EXEMPLOS
Compostos de fórmula geral I foram preparados de acordo com o procedimento geral como segue nos Exemplos 1 e 2:
Exemplo 1: W3-[4-(4-Morfolin-4-il-ciclohexil)-fenil]-l-piridin-2-il-lH- [1,2,4]triazol-3,5-diamina
HPLC Método A:
Mel: Iluminação 3 um, 2,1 x 50 mm
Gradiente: de 100% de B (TFA a 0,1%/MeCN a 1,0%/água) a 100% de D (TFA a 0,1%/MeCN) ao longo de 4 min. Manter @ 100% de D a 5,6 min, ir a 100% de B ao longo de 0,4 min, manter durante 1 min.
Taxa de fluxo: 0,8 mL/min Síntese de 4-ciano-4-(4-nitrofenil)heptanodioato de dimetilo (2);
^CO2M0 Triton-B CH3CN, refluxo, 5h 98% A uma solução de 2-(4-nitrofenil)acetonitrilo (1) (50,12 g, 0,31 mole) em CH3CN (1 L) a TA sob N2 foi 70
adicionado Triton-B/40% MeOH (14,5 mL, 0,03 mole) para dar uma solução púrpura escura. A mistura foi aquecida então a refluxo (ao longo de - 2,5 h), acrilato de metilo (160 mL, 1,78 mole) foi adicionado e o refluxo continuou durante 4 h. A reacção foi arrefecida e evaporada, diluida então com EtOAc e acidificada com HC1 2 N. As camadas foram separadas, a aquosa foi extraída de volta com EtOAc, as orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de NaCl, secas sobre Na2S04, filtradas e evaporadas. A purificação por meio de cromatografia flash em sílica gel (1 L), eluída com 1:2 EtOAc:hexanos proporcionou 2 como um óleo amarelo (88,96 g, 86%). 1H-RMN (500 MHz, dmso-d6) 8,31 (d, 2H) , 7,78 (d, 2H) , 3,52 (s, 6H) , 2,4 (m, 6H), 2,05 (m, 2H) ppm. EM-AIF: 333,1 (M-H). HPLC (método A): 3,484 min. Síntese de 5-ciano-5-(4-nitrofenil)-2- oxociclohexanocarboxilato de metilo (3)
A uma solução de 2 (88,96 g, 0,27 mole) em DME (1 L) a TA sob N2 foi adicionado (cuidadosamente) NaH (60% em óleo mineral, 31,92 g, 0,80 mole) para dar uma solução violeta escura. A reacção foi aquecida a refluxo durante 4 h, foi arrefecida e extinta cuidadosamente com h20, acidificada com HC1 2 N e extraída com 2 x EtOAc. As orgânicas combinadas foram lavadas com solução saturada de 71
NaCl, secas sobre um mistura de carvão activado e Na2S04, filtradas através de Celite e evaporadas para dar o produto bruto 2 como um sólido castanho (83,42 g, >100%). 1H-RMN (500 MHz, dmso-dg) 12,1 (s, 1H), 8,31 (d, 2H), 7,88 (d, 2H) , 3,75 (s, 3H), 2,86 (AB quarteto, 2H), 2,65 (m, 1H), 2,6 (m, 1H), 2,4 (m, 1H), 2,35 (m, 1H) ppm. EM-AIF: 301,1 (M-H). HPLC (método A): 3,729 min.
Sintese de 1-(4-nitrofenil)-4- oxociclohexanocarbonitrilo
2 bruto (0,27 mole), NaCl (80 g, 1,37 mole) e água (80 mL) foram aquecidos em DMSO (1,2 L) a 150-160°C durante 3 h. O solvente foi retirado por meio de destilação, o residuo foi diluído com H20 e extraído com 3xEtOAc. As orgânicas combinadas foram lavadas com HC1 2 N, 3xH20, solução de NaCl, e secas sobre Na2S04 e evaporadas. A purificação por meio de cromatografia flash (1 L de Si02) eluída com 1:3, então 1:2 EtOAc:hexanos proporcionou produto puro _4 como um sólido esbranquiçado (36, 47 g, 56% de rendimento), assim como produto muito levemente impuro A_ como um sólido esverdeado (14,33 g, 22% de rendimento). ^-RMN (500 MHz, dmso-d6) 8,31 (d, 2H), 7,92 (d, 2H), 2,74 (m, 2H), 2,5 (m, 6H) ppm. EM-AIF: 243,2 (M-H). HPLC (Método A): 3,121 min. 72 Síntese de 4-morfolino-l-(4- nitrofenil)ciclohexanocarbonitrilo (5a)
5b A uma solução de 1-(4-nitrofenil)-4-oxociclohexanocarbonitrilo (45,8 g, 187 mmol) em THF anidro (560 mL) a TA foi adicionado morfolino (17,2 mL, 197 mmol). A solução foi agitada durante 45 min, colocada então num banho de água a TA. Triacetoxiborohidreto de sódio (55,5 g, 260 mmol) foi adicionado porção a porção ao longo de 10 min. Após 2,5 h, o solvente foi retirado a vácuo, a mistura dissolvida em EtOAc (400 mL) e extraída com NaOH 2 N (3 x 75 mL) . Gás HC1 foi então borbulhado através da fase orgânica para dar um precipitado que foi filtrado, lavado com EtOAc (2x) e Et20 (3x). O sólido foi seco sob vácuo a 40°C durante 18 h para dar um mistura de isómeros (5a e 5c, 54,9 g, 84% de rendimento).
Purificação de isómero 5a (necessário para preparação de exemplo 2; não necessário para preparação de exemplo 1) :
Uma mistura de 5a e 5b (79,4 g) foi dissolvida em CH2C12 (200 mL) e aplicada em Si02 (2 L) que foi carregada num funil de frita de vidro de 3 L. A eluição foi com 13 L de acetato de etilo : hexanos 1:1 em balões de 1 L para obter uma mistura de 5a e 5b (19,77 g, 25% de recuperação) como um sólido amarelo pálido. O isómero puro .5a foi obtido 73 por eluição adicional com 8 L de metanol : CH2CI2 5:95 para proporcionar 57 g (72% de recuperação). 5a: 1H-RMN (500 MHz, dmso-d6) 8,28 (d, 2H), 7, 84 (d, 2H), 3,59 (m, 4H) , 2,52 (m, 4H) , 2,40 (tt, 1H), 2, 18 (d, 2H), 2,02 (m, 4H) , 1,60 (m, 2H) ppm. EM- -AIF 316 ,1 (M+H). HPLC (método B) 2,537 min (100%) • 5b: XH-RMN (500 MHz, dmso-d6) 8, 30 (d, 2H), 7, 82 (d, 2H) , 3,59 (m, 4H) , 2,38 (m, 4H) , 2,28 (d, 2H) , 2,26 (m, 1H) , 1,94 (m, 4H) , 1,74 (m, 2H) ppm. EM-AIF 316,1 (M+H) . HPLC: 2, 449 min (100%) . Síntese de trans- e cis-4-(4-morfolin-4-il-ciclohexil)-fenilamina (6a e 6b)
(Referências: S. B. Christensen et al, J. Med. Chem., 1998, 41, 821-835; e J. A. Marshall, et al, J. Org. Chem., 1977, 42, 3309-3311)
Um balão de fundo redondo de 3 tubuladuras de 2 L equipado com agitador suspenso mecânico, adaptador Claisen com funil de adição (1 L) e condensador de gelo seco foi seco por meio de chama sob azoto e deixado para arrefecer. O condensador foi carregado com gelo seco/ 2-propanol e o balão arrefecido até -78 com gelo seco/ 2-propanol enquanto estava sob pressão positiva de azoto. Gás amoníaco (1 L) 74 foi condensado enquanto estava sob azoto. A solução foi então carregada com 26,6 g (1,16 mole) de metal sódio. Após 30 min, uma solução de 30 g (0,0951 mole) de 4-morfolino-1-(4-nitrofenil)ciclohexanocarbonitrilo em THF anidro (300 mL) foi adicionada gota a gota via funil de adição ao longo de 10 minutos. Após completar a adição, 50 mL de THF foram utilizados para enxaguar o funil de qualquer 4-morfolino-1-(4-nitrofenil)ciclohexanocarbonitrilo residual e a reacção deixada para amornar até -33 e para agitar durante 5 horas. A reacção foi extinta por adição gota a gota de NH4CI/NH4OH (9/1, 100 mL) enquanto estava sob pressão positiva de azoto. Água (200 mL) em seguida EtOAc (350 mL) foi adicionado e o amoníaco deixado para evaporar enquanto agitava durante a noite. A suspensão resultante foi filtrada através de celite e a camada aquosa extraída com EtOAc (3 x 200 mL) . As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre MgS04, filtradas e concentradas sob pressão reduzida (rotovap) para dar uma mistura de _6a : 6b ~ 5:1 como um sólido amarelo pálido após secagem a vácuo a TA. (23,87 g, 96,4% de rendimento) . 1H-RMN (500 MHz, dmso-dê) Para 6a: 6,84 (d, 2H), 6,46 (d, 2H), 3,55 (m, 4H), 2,48 (m, 4 H) , 2,25 (tt, 1H), 2,22 (tt, 1H) , (d, 2H) , 1,78 (d, 2H) , 1,34 (m, 4H) ppm; Picos discerníveis para 6b: 6,86 (d, 2H), 6,49 (d, 2H) , 3,60 (m, 4H) , 2,37 (m, 4H) ppm. EM-AIF 261,2 (M+H). Síntese de (Z)-3-(4-(4-morfolinociclohexil)fenil)-2-fenilisouréia 75
Uma mistura de eis- e trans-4-(4-morfolin-4-il-ciclohexil)-fenilamina 6b e 6a (20,28 g, 77,9 mmol) difenilcianocarbonimidato (20,44 g, 85,6 mmol) em dioxano (350 mL) foi agitada sob N2 durante 4 dias. A reacção foi evaporada, diluida em seguida com água e extraída com 5 porções (200 mL) de CH2C12. A fase orgânica combinada foi lavada com NaHCCb e evaporada até secura para proporcionar um óleo viscoso castanho-escuro. A trituração com Et20 (300 mL) deu um sólido de cor ocre, que foi lavado adicionalmente com 2 porções de Et20 (150 mL) para proporcionar o produto 7a como um sólido de cor ocre (21,70 g, 69%). ^-RMN (500 MHz, dmso-d6) 10,7 (sl, 1H) , 7,44 (t, 2H) , 7,35 (d, 2H) , 7,25 (m, 5H) , 3,57 (m, 4H) , (m, 4H) , 2.44 (tt, 1H), 2,30 (m, 1H) , 1,92 (d, 2H) , 1,85 (d, 2H) , 1.45 (m, 2H), 1,34 (m, 2H) ppm. CL/EM (5-45% CH3CN) 405,1 (M+H), 403,2 (M-H), tR= 3,4 min. HPLC: 2,798 min. Síntese de N3-[4-(4-Morfolin-4-il-ciclohexil)-fenil]-l-piridin-2-il-lH-[1,2,4]triazol-3,5-diamina 76
Uma solução de (Z)-3-(4-(4-morfolinociclohexil)fenil)-2-fenilisouréia 7a (7,00 g, 17,3 mmol) e 2-piridil-hidrazina (2,27 g, 20,8 mmol) foi submetida a refluxo em isopropanol (100 mL) durante 2 dias. A reacção foi arrefecida, filtrada e o sólido resultante foi lavado com etanol. O precipitado foi recristalizado do dioxano, os cristais foram filtrados, suspensos em metanol com agitação durante 1 h, evaporados e secos a 60°C sob alto vácuo durante 3 d. Isto proporcionou 1-3 puro (4,88 g, 67% de rendimento) como um sólido branco. 1H-RMN (500 MHz, dmso-dê) 8,92 (s, 1H) , 8,40 (m, 1H) , 7,97 (m, 1H) , 7,68 (d, 1H) , 7, 63 (s, 2H) , 7,51 (d, 2H), 7,20 (m, 1H) , 7,09 (d, 2H) , 3, 57 (m, 4H) , 2,50 (m, 4H) , 2,37 (tt, 1H) , 2,26 (tt, 2H) , 1/ 91 (d, 2H) , 1,84 (d, 2H), 1,43 (m, 2H) , 1, 33 (m, 2H) ppm. CL/EM (5- -95% CH3CN) 420,0 (M+H), tR =3,1 min. HPLC: 2,602 min. Síntese de W3-[4-(4-morfolin-4-il-ciclohexil)-fenil] -l-piridin-2-il-lií- [1,2,4] triazol-3,5-diamina, sal mesilato 77
Exemplo 1 (128,0 g, 0,305 mole) foi suspenso em dioxano (1,5 L) e aquecido a 60-70°C. Ácido metanosulfónico (19,8 mL, 0,305 mole) foi adicionado gota a gota ao longo de 10 min. Agitação continuou durante lha 60-70°C e 3 h a temperatura ambiente. O sólido foi filtrado e lavado com Et20, então 4 vezes suspenso em metanol e evaporado antes de secar sob alto vácuo a 50-60°C durante 20 h. Este procedimento de suspensão/evaporação/secagem foi repetido uma vez mais com metanol, em seguida uma vez com etanol numa tentativa fracassada de livrar o sal de traços de dioxano. 0 sólido suspendido em água (1 L) e submetido a refluxo durante 15 min, então uma centrífuga foi utilizada para separar o sólido da água. A centrifugação foi repetida duas vezes mais. O sólido húmido foi diluído com etanol, evaporado e seco a 45-50°C sob vácuo para proporcionar 1-3, sal mesilato (129,95 g) como um sólido branco. O produto final contém (por RMN) 0,3% de dioxano. 1H-RMN ( 500 MHZ, dmso-d6) 9, 51 (sl, 1H), co CD CO (s, 1H), 8,41 (m, 1H) , 7,99 (m, 1H), 7, 69 (d, 1H) , 7, 64 (s, 2H) , 7, 54 (d, 2H) , 7,21 (m, 1H), 7,11 (d, 2H) , 4,02 (d, 2H) , 3,72 (t, 2H) , 3,44 (d, 2H), 3,28 (m, 1H), 3, 14 (m, 2H) , 2,46 (m, 1H) , 2,34 (s, 3H) , 2,19 (m, 2H) , 1, 95 (m, 2H) , 1,53 (m, 4H) ppm. CL/EM (5-95% de CH3CN) 420,1 (M+H), tR= 3,2 min. HPLC: 2,593 min. 78
Exemplo 2: 1-(4-(5-Amino-l-(piridin-2-il)-1H- 1,2,4-triazol-3-ilamino)fenil-4-morfolinociclohexano-carbonitrilo
Síntese de (Z)-l-ciano-3-(4-((ls,4s)-l-ciano-4-morfolinociclohexil) fenil)-2-fenilisouréia (6) o2n-
CN 5a f~\ Y_/° 1. Pd/C, H2, EtOH, quantitativo 2. (PhO)2C=N-CN dioxano, 2h, 78%
0 intermediário 5a foi preparado como descrito no Exemplo 1. Trans-4-morfolino-l-(4-nitrofenil)ciclohexano-carbonitrilo, (20 g, 63,5 mmol) , e catalisador Pd a 10%-C (750 mg) em 250 mL de etanol foram colocados sob hidrogénio (38 psi num agitador de Parr durante 2 horas. Diclorometano, 200 mL, foi adicionado para dissolver o produto e o catalisador foi retirado por meio de filtração. Os solventes foram evaporados para se obter trans-l-(4-amino-fenil)-4-morfolin-4-il-ciclohexanocarbonitrilo (18,1 g, 63,5 mmol) como um sólido de cor amarelo-ocre que foi utilizado sem purificação adicional. 79 RMN CDC13: 7 ,25 (m, 2H) , 6,70 (m, 2H) , 3,7 (m, 6H) , 2, 65, (m, 4H), 2, 35, (m, 1H), 2,25, (m, 2H) , 2,05 (m, 2H) , 1, 85 (m, 4H), AIF EM m+1, 286, 0 HPLC : método 10- -90% de CH3CN: 2, CO co min 100%
Uma solução do trans-1-(4-amino-fenil)-4-morfolin-4-il-ciclohexano-carbonitrilo propiciado (18,1 g, 63,5 mmol) e cianocarbonimidato de difenilo (18,1 g, 76,2 mmol) foi agitada em 1,4-dioxano (140 mL) a TA durante 24 h. Água destilada (200 mL) foi adicionada para propiciar um precipitado branco que foi filtrado e lavado com água (100 mL), solução saturada de bicarbonato de sódio (150 mL), e água (200 mL) . O sólido foi seco num dessecador sob vácuo durante a noite, para dar o composto do titulo 6 (21,1 g, 78% de rendimento). ^-RMN (DMSO, 500 MHz) 7,55 (m, 4H), 7,45 (m, 2H) , 7,3 (m, 3H) , 3,6 (m, 4H) , 2,45 (m, 4H) , 2,37 (t, 1H), 2,15 (d, 2H), 2,0 (d, 2H) , 1,9 (t, 2H) , 1,6 (m, 2H) ] EM+ 430,18, EM- 428,13, HPLC tR= 4,652 min (condições 10-90% de acetonitrilo ao longo de 7,5 min. Síntese de 1- (4-(5-Amino-l-(piridin-2-il)-1H-1,2,4-triazol-3-ilanu.no)fenil-4-morfolinociclohexano-carbonitrilo
1. 2-Hidrazinopiridina IPA, refluxo 18h, 93% 2. Ácido metanosulfónico 91%
1-(4-(5-amino-l-(piridin-2-il)-1H-1, 2, 4-triazol-3-ilamino)fenil-4-morfolinociclohexano-carbonitrilo, (73 g, 0,164 mole), foi adicionado a dioxano (1 L) e a mistura 80 amornada até 60-70°C. Ácido metanosulfónico, (15,8 g, 0,164 mole) foi adicionado gota a gota ao longo de 10 min. O banho de aquecimento foi retirado e a suspensão deixada para agitar durante 3 horas. Isopropanol (200 mL) foi adicionado e a mistura filtrada. O sal foi lavado com isopropanol, (50 mL), seguido por dietil éter (200 mL) . O sólido foi suspenso em metanol a 10%-diclorometano (500 mL) e agitado durante 18 horas. Isopropanol (100 mL) foi adicionado e o sólido filtrado, então lavado com éter para obter sal mesilato puro (1-4, sal mesilato) como um sólido branco (81 g, 91% de rendimento). RMN: DMSO-d6: 9,70 (sl, 1H), 9,25 (s, 1H), 8,40 (s, 1H) , 7,95 (m, 1H) , 7,65 (m, 3H) 7, 40 (m, 2H), 7,20 (m, 1H), 4 / , 06 (m, 2H), 3, 75 (m, 2H) 3, 55 (m, 2H), 3,50 (sl, 1H), 3, 35 (m, 1H) , 3,15 (m, 2H) 2, 32 (m, 7H) , 1,9 (m, 2H) , 1, 80 (m, 2H) . AIF EM m+1 445,2 CL-EM m+1: 445,3 1,88 min método 10-90% de CH3CN HPLC: método 10-90% de CH3CN : 4,2 min 100%
Os compostos de fórmulas I, li e li podem ser preparados por métodos substancialmente similares a aqueles descritos no presente documento por um perito na especialidade de nível médio.
Exemplo 3: Dados analíticos Uma variedade de outros compostos de Fórmula I foi preparada por métodos substancialmente similares a aqueles descritos no presente documento. Dados de caracterização representativos para estes compostos são resumidos na Tabela 1 abaixo e incluem dados de HPLC, CL/EM (observado), tempo retenção (TR) e XH RMN. Números de compostos correspondem aos números de compostos proporcionados no presente documento. 81
Quadro 1
Cmpt # CL/EM TR 1H RMN 1-1 420,10 3, 10 (500 MHz, dmso-d6) 9,01 (s, 1H), 8,41 (m, 1H), 7,97 (m, 1H), 7,68 (d, 1H), 7,65 (s, 2H), 7,59 (d, 2H) , 7,23 (d, 2H), 7,21 (m, 1H), 3,98 (d, 2H), 3,68 (t, 2H) , 3,49 (d, 2H) , 3,32 (m, 1H), 3,04 (m, 2H), 2,85 (m, 1H), 2,11 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,75 (m, 4H) ppm 1-2 445,00 3, 20 (500 MHz, dmso-d6) 9,21 (s, 1H), 8,41 )m, 1H), 7,98 (m, 1H), 7,73 (d, 1H), 7,67 (m, 4H), 7,39 (d, 2H), 7,21 (m, 1H), 3,58 (m, 4H), 2,38 (m, 4H), 2,25 (m, 3H), 1,89 (m, 4H), 1,72 (m, 2H) ppm 82 (cont)
Cmpt # CL/EM TR 1H RMN (dmso-d6, 500 MHz) 9,24 (s, 1H), 8,42 (m, 1H), 7,98 (m, 1H), 7,71 (d, 1H) , 7,67 (m, 4H) , 7,40 (d, 2H) , 7, 22 (m, 1H) , 3, 53 (m, 2H), 3,28 (m, 1H), I -5 484, 00 3, 20 3,16 (m, 2H) , 2,99 (m, 2H) , 2,66 (d, 2H) , 2, 28 (m, 4H) , 1, 91 (m, 3H) , 1,78 (m, 2H), 0,54 (m, 2H) , 0,45 (m, 2H) ppm DMSO -d6 : 8, 90 (s, 1H), 8,40 (m, 1H), 7,98 (m, 1H), 7,75 (m, 1H), 7,65 (s, 2H) , 7, 50 (m, 2H) , 7, 20 (m, I -6 486, 20 2, 05 1H) , 7, 10 (m, 2H) , 4,02 (s, 2H), 4,50 (m, 2H) , 4,40 (m, 2H) , 2,60 (m, 1H) , 2, 45 (m, 4H) , (500 MHz, dmso -d6) 9, 00 (s, 1H), 8,41 (m, 1H), 7,97 (m, 1H), 7,68 (d, 1H) , 7,65 (s, 2H) , 7,58 (d, 2 H) , 7, 22 (m, 3H) , 3, 50 (m, 2H), 3,30 (m, 1H), I -7 459, 10 3, 10 3, 08 (m, 2H) , 2,98 (m, 2H) , 2, 85 (m, 1H) , 2, 63 (m, 2H) , 2, 12 (m, 2H) , 1,8 (m, 7H), 0,50 (m, 2H), 0,39 (m, 2H) ppm DMSO -d6 : 8, 95 (s, 1H), 8,40 (m, 1H), 7,95 (m, 1H), 7,68 (m, 1H), 7,60 (sl, 2H) , 7,55 (m, 2H) , 7,20 I -S 419, 20 1, 54 (m, 1H) , 7, 10 (m, 2H) , 5,1 (sml,1H), 2,85 (m, 4H), 4,60 (m, 1H), 2,50 (m, 4H) , 2, 20 (m, 1H) , 1,90 (m, 2H) , 1, 80 (m, 2H) , 1,45 (m, 4H) . (500 MHz, dmsc -d6) 8,98 (s, 1H), 8,40 (m, 1H), 7,97 (m, 1H), 7,68 (d, 1H) , 7,64 (s, 2H) , 7,53 (d, 2H) , 7, 19 (m, 1H) , 7,09 (d, 2H), 3,45 (m, 2H) , I -9 459, 10 3, 10 3,26 (m, 1H), 3, 10 (m, 2H) , 2, 99 (m, 2H) , 2, 63 (m, 3H) , 2, 15 (m, 2H) , 1,93 (d, 2H) , 1,81 (m, 1H), 1,50 (m, 4H), 0,50 (m, 2H) , 0,39 (m, 2H) ppm MeOH -d4 : 8, 40 (m, 1H), 7,90 (m, 1H), 7,75 (m, 1H), I- 10 447, 20 1, 74 7,50 (m, 2H) , 7,15 (m, 3H) , 3, 5-2,5 (m, 10H), 2, 0 (m, 4H) , 1, 70 (m, 4H), 1,30 (t, 3H) . (500 MHz, dmso -d6) 8,98 (s, 1H), 8,42 -8,39 (m, 1H) , 8, 00 -7,93 (m, 1H) , 7,73-7,59 (m, 3H) , 7,56 I- 11 418, 00 2, 20 (d, 2H) , 7, 24- 7, 16 (m, 1H) , 7,11 (d, 2H) , 3,40 (d, 2H) , 3, 29 -3, 17 (m, 1H) , 3,05-2,91 (m, 2H) , 2,45 83 (m, 1,76 1H) , -1, 34 2, 11 (m, (m, 2H), 1,93 8H) ppm (d, 2H), 1,85 (d, 2H), (500 MHz, dmsc -d6) 8,93 (s, 1H), 7,94 (d, 2H) , 7,79 (d, 2H) , 7,48 (d, 2H), 7, 08 (d, 2H), 6, 73 (s, 2H) , 3, 44 (m, 2H), 3,25 (m, 2H) , 3,05 (m, 2H) , 1-12 483, 00 3, 10 2,98 (m, 1H), 2,58 (m, 2H) , 2, 42 (m, 1H) , 2, 15 (m, 2H) , 1, 92 (m, 2H), 1,75 (m, 1H), 1,53 (m, 4H), 0,47 (m, 2H) , 0,35 (m, 2H) ppm DMSO -d6: 10,60 (sl, 1H); 9,10 (sl , 1H); 8, 38 (d r 1H) ; 7, 80 -8,20 (sl, 2H); 7,48 (d, 2H); 7,30 (m, 1-13 561, 10 2, 00 2 H) ; 6, 62 (m, 1H); 3,30-4,10 (m, 15H); 3,00 (m, 2 H) ; 2, 78 (m, 1H); 2,20 (m, 2H) ; 1,62-1,98 (m, 11H) DMSO -d6: 9, 35 (s, 1H); 9,20 (sl, 1H) ; 8,35 (d, 1H) ; 7, 78 (sl, 2H); 7,70 (d, 2 H) ; 7,48 (d, 2 H) ; 1-14 586, 10 2, 00 6, 62 (d, 1H); 3,50-4,00 (m, 10H) ; 3,40-3,50 (m, 5H) ; 3, 00 (m, 2H); 2,72 (m, 2H) ; 1,75-2,15 (m, 9H) ; 1, 52 (m, 2H) DMSO -d6 : 9, 73 (sl, 1H); 9,28 (s, 1H) ; 8,35 (d, 1H) ; 7, 76 (sl, 2H); 7,62 (d, 2H) ; 7,35 (d, 2H) ; 1-15 586, 10 2, 00 6, 62 (d, 1H); 3,55-4,08 (m, 10H) ; 3,25-3,55 (m, 5H) ; 3, 15 (m, 2H); 2,32 (m; 4H) ; 1,75-2,15 (m, 9H) DMSO -d6 : 9, 60 (sl, 1H); 9,05 (s, 1H); 8,35 (d, 1H) ; 7, 78 (sl, 2H); 7,50 (d, 2H) ; 7,08 (d, 2H) ; 1-16 561, 10 2, 10 6, 60 (d, 1H); 3,50-4,10 (m, 11H) ; 3,45 (m, 4H) ; 3,25 (m, 1H); 3,15 (m, 2H); 2, 12 (m, 2H); 1, 70- 2,00 (m, 7 H) ; 1,50 (m, 4H)
Exemplo 4: Inibição de FLT-3
Compostos foram seleccionados por sua habilidade para inibir a actividade de FLT-3 utilizando um ensaio de ligação-filtro radiométrico. Este ensaio monitoriza a incorporação de 33P num substrato poli(Glu, Tyr) 4:1 (pE4Y). As reacções foram levadas a cabo numa solução contendo 100 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de MgCl2, 25 mM de 84
NaCl, 1 mM de DTT, BSA a 0,01% e DMSO a 2,5%. As concentrações finais de substrato no ensaio foram 90 μΜ de ATP e 0,5 mg/mL de pE4Y (ambos de Sigma Chemicals, St Louis, MO) . A concentração final de compostos está geralmente entre 0,01 e 5 μΜ. Tipicamente, uma titulação de 12 pontos foi conduzida preparando diluições seriadas a partir de solução mãe em 10 mM de DMSO de composto de teste. As reacções foram levadas a cabo à temperatura ambiente.
Duas soluções de ensaio foram preparadas. A solução 1 contém 100 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de MuCl, 25 mM de NaCl, 1 mg/ml de pE4Y e ATP 180 μΜ (contendo 0,3 μθί de [γ-33ρ] ATP para cada reacção). A solução 2 contém 100 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, 2 mM de DTT, 0,02% de BSA e 3 nM de FLT-3. O ensaio foi executado numa placa de 96 poços misturando 50 μΐ cada de Solução 1 e 2,5 mL dos compostos de teste. A reacção foi iniciada com Solução 2. Após incubação durante 20 minutos a temperatura ambiente, a reacção foi interrompida com 50 μΐ de TCA a 20% contendo 0,4 mM de ATP. A totalidade do volume de reacção foi então transferida a uma placa de filtro e lavada com TCA a 5% por um Harvester9600 de TOMTEC (Hamden, CT) . A quantidade de incorporação de 33P em pE4y foi analisada por um contador de cintilação em microplaca Packard TopCount (Meriden, CT) . Os dados foram ajustados utilizando software Prism para obter um CI50 ou Ki.
Os compostos da invenção são eficazes para a inibição de FLT-3.
Exemplo 5: Inibição de c-KIT 85
Compostos foram seleccionados por sua capacidade para inibir actividade de c-KIT utilizando um ensaio de ligação-filtro radiométrico. Este ensaio monitoriza a incorporação de 33P num substrato poli(Glu, Tyr) 4:1 (pE4Y). As reacções foram levadas a cabo numa solução contendo 100 mM de HEPES (pH 1,5), 10 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, 1 mM de DTT, BSA a 0,01% e DMSO a 2,5%. As concentrações finais de substrato no ensaio foram 700 μΜ de ATP e 0,5 mg/mL de pE4Y (ambos de Sigma Chemicals, St Louis, MO) . A concentração final de compostos está geralmente entre 0,01 e 5 μΜ. Tipicamente, uma titulação de 12 pontos foi conduzida preparando diluições seriadas a partir de solução mãe em 10 mM de DMSO de composto de teste. As reacções foram levadas a cabo a temperatura ambiente.
Duas soluções de ensaio foram preparadas. A solução 1 contém 100 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, 1 mg/ml de pE4Y e 1,4 mM de ATP (contendo 0,5 μCi de [γ-33ρ] ATP para cada reacção). A solução 2 contém 100 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, 2 mM de DTT, 0,02% de BSA e 25 nM de c-KIT. O ensaio foi executado numa placa de 96 poços misturando 33 μΐ de Solução 1 e 1,65 μΐ dos compostos de teste. A reacção foi iniciada com 33 μι de Solução 2. Após incubação durante 20 minutos a temperatura ambiente, a reacção foi interrompida com 50 μΐ de TCA a 10% contendo 0,2 mM de ATP. A totalidade do volume de reacção foi então transferida a uma placa de filtro e lavada com TCA a 5% por um Harvester9600 de TOMTEC (Hamden, CT) . A quantidade de incorporação de 33P em pE4y foi analisada por um contador de cintilação de microplaca Packard TopCount 86 (Meriden, CT). Os dados foram ajustados utilizando software Prism para obter um CI50 ou Ki.
Os compostos da invenção são eficazes para a inibição de c-kit.
Exemplo 6: Inibição de GSK-3
Compostos foram seleccionados por sua habilidade para inibir actividade de GSK-3p (AA 1-420) utilizando um sistema de enzima acoplada padrão (Fox et al. (1998) Protein Sei. 7, 2249). As reacções foram levadas a cabo numa solução contendo 100 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de
MgCl2, 25 mM de NaCl, 300 μΜ de NADH, 1 mM de DTT e DMSO a 1,5%. As concentrações finais de substrato no ensaio foram 20 μΜ de ATP (Sigma Chemicals, St Louis, MO) e 300 μΜ de péptidos (American Peptide, Sunnyvale, CA) . As reacções foram levadas a cabo a 30°C e 20 nM de ΰ3Κ-3β. As concentrações finais dos componentes do sistema de enzima acoplada foram 2,5 mM de fosfoenolpiruvato, 300 μΜ de NADH, 30 μg/ml de piruvato quinase e 10 μρ/ιηΐ de lactato desidrogenase.
Uma solução mãe de tampão de ensaio foi preparada contendo a totalidade dos reagentes listados acima com a excepção de ATP e o composto de teste de interesse. A solução mãe de tampão de ensaio (175 μΐι) foi incubada numa placa de 96 poços com 5 μΐ do composto de teste de interesse a concentrações finais compreendidas entre 0,002 μΜ e 30 μΜ a 30°C durante 10 min. Tipicamente, uma titulação de 12 pontos foi conduzida preparando diluições seriadas (a partir de 10 mM de soluções mãe de compostos) com DMSO dos compostos de teste em placas filhas. A reacção foi iniciada pela adição de 20 μΐ de ATP (concentração 87 final 20 μΜ). As taxas de reacção foram obtidas utilizando um leitor de placas Spectramax de Molecular Devices (Sunnyvale, CA) ao longo de 10 min a 30°C. Os valores K± foram determinados a partir dos dados de taxa como uma função da concentração de inibidor.
Os compostos da invenção são eficazes para a inibição de GSK-3.
Exemplo 7: Inibição de CDK-2
Compostos foram seleccionados pela sua capacidade para inibir CDK-2/Ciclina A utilizando um ensaio de enzima acoplada padrão (Fox et al (1998) Protein Sei 7, 2249). As reacções foram levadas a cabo em 100 mM de HEPES pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, 1 mM de DTT e DMSO a 1,5%. As concentrações finais de substrato no ensaio foram 100 μΜ de atp (Sigma Chemicals) e 100 μΜ de péptidos (American Peptide, Sunnyvale, CA). Os ensaios foram levados a cabo a 30°C e 25 nM de CDK-2/Ciclina A. As concentrações finais dos componentes do sistema de enzima acoplada foram 2,5 mM de fosfoenolpiruvato, 350 μΜ de NADH, 30 μg/ml de piruvato quinase e 10 μρ/ιηΐ de lactato desidrogenase.
Uma solução mãe de tampão de ensaio foi preparada contendo a totalidade dos reagentes listados anteriormente, com a excepção de CDK-2/Ciclina A, DTT e o composto de teste de interesse. 56 μΐ da reacção de teste foram colocaddos numa placa de 384 poços seguida pela adição de 1 μΐ de solução mãe de 2 mM de DMSO contendo o composto de teste (concentração final do composto 30 μΜ) . A placa foi pré-incubada durante ~10 minutos a 30°C e a reacção iniciada pela adição de 10 μΐ de enzima (concentração final 25 nM) . As taxas de reacção foram obtidas utilizando um leitor de placa BioRad Ultramark (Hercules, CA) ao longo de um tempo de leitura de 5 minutos a 30°C. Os valores de Ki foram determinados de acordo com métodos padrão.
Os compostos da invenção são eficazes para a inibição de CDK-2.
Exemplo 8: Inibição de SRC
Os compostos são avaliados como inibidores de Src quinase humana utilizando ou um ensaio baseado em radioactividade ou ensaio espectrofotométrico.
Ensaio de Inibição de Src A: Ensaio baseado em radioactividade
Os compostos são ensaiados como inibidores de Src quinase humana recombinante de comprimento total (de
Upstate Biotechnology, n° de cat. 14-117) expressa e purificada de células de baculovírus. A actividade de Src quinase é monitorizada seguindo a incorporação de 33P de ATP em tirosina de um substrato de polímero poli Glu-Tyr randómico de composição, Glu:Tyr = 4:1 (Sigma, n° de cat. P-0275) . Os seguintes são as concentrações finais dos componentes do ensaio: 0,05 M de HEPES, pH 7,6, 10 mM de
MgCl2, 2 mM de DTT, 0,25 mg/ml de BSA, 10 μΜ de ATP (1-2 μθί de 33P-ATP por reacção), 5 mg/ml de poli Glu-Tyr, e 1-2 unidades de Src quinase humana recombinante. Num ensaio típico, todos os componentes da reacção com a excepção de ATP são pré-misturados e divididos em alíquotas em poços de placa de ensaio. inibidores dissolvidos em DMSO são adicionados aos poços para dar uma concentração final de DMSO de 2,5%. A placa de ensaio é incubada a 30°C durante 10 min antes de iniciar a reacção com 33P-ATP. Após 20 min de reacção, as reacções são extintas com 150 μΐ de ácido tricloroacético (TCA) a 10% contendo 20 mM de Na3P04. As 89 amostras extintas são então transferidas para uma placa de filtro de 96 poços (Whatman, filtro de fibra de vidro UNI-Filter GF/F, n.° de cat. 7700-3310) instalado num colector de placa de filtro a vácuo. As placas de filtro são lavadas quatro vezes com TCA a 10% contendo 20 mM de Na3P04 e então 4 vezes com metanol. 200 μΐ de fluido de cintilação é então adicionado a cada poço. As placas foram seladas e a quantidade de radioactividade associada com os filtros é quantificada num contador de cintilação TopCount. A radioactividade incorporada é representada num gráfico como uma função da concentração de inibidor. Os dados são ajustados a um modelo cinético de inibição competitiva para obter ο K± para o composto.
Ensaio de Inibição de Src B: Ensaio espectrofotométrico O ADP produzido a partir do ATP pela fosforilação catalizada por Src quinase humana recombinante de substrato poli Glu-Tyr é quantificada utilizando um ensaio de enzima acoplada (Fox et al (1998) Protein Sei 7, 2249) . Neste ensaio uma molécula de NADH é oxidada a NAD para cada molécula de ADP produzida na reacção da quinase. O desaparecimento de NADH é convenientemente seguida a 340 nm.
As concentrações finais dos componentes do ensaio são as seguintes: 0, 025 M de HEPES, pH 7,6, 10 mM de MgCl2, 2 mM de DTT, 0,25 mg/ml de poli Glu-Tyr, e 25 nM de Src quinase humana recombinante. As concentrações finais dos componentes do sistema de enzima acoplada são 2,5 mM de fosfoenolpiruvato, 200 μΜ de NADH, 30 μρ/πιΐ de piruvato quinase e 10 μρ/ιηΐ de lactato desidrogenase. 90
Num ensaio típico, todos os componentes da reacção com a excepção de ATP são pré-misturados e divididos em alíquotas em poços de placa de ensaio. Inibidores dissolvidos em DMSO são adicionados aos poços para dar uma concentração final de DMSO de 2,5%. A placa de ensaio é incubada a 30°C durante 10 min antes de iniciar a reacção com 100 μΜ de ATP. A mudança de absorvância a 340 nm com tempo, a taxa da reacção, é monitorizada num leitor de placa de Molecular Devices. Os dados de taxa como uma função da concentração de inibidor são ajustados ao modelo cinético de inibição competitiva para obter o K± para o composto.
Os compostos da invenção são eficazes para a inibição de SRC.
Exemplo 9: Inibição de SYK
Compostos foram seleccionados pela sua capacidade para inibir Syk utilizando um ensaio de enzima acoplada padrão (Fox et al (1998) Protein Sei 7, 2249). As reacções foram levadas a cabo em 100 mM de HEPES pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, 1 mM de DTT e DMSO a 1,5%. As concentrações finais de substrato no ensaio foram 200 μΜ de ATP (Sigma Chemical Co.) e 4 μΜ de péptido poli Gly-Tyr (Sigma Chemical Co.). Os ensaios foram levados a cabo a 30°C e 200 nM de Syk. As concentrações finais dos componentes do sistema de enzima acoplada foram 2,5 mM de fosfoenolpiruvato, 300 μΜ de NADH, 30 μρ/πιΐ de piruvato quinase e 10 μg/ml de lactato desidrogenase.
Uma solução mãe de tampão de ensaio foi preparada contendo a totalidade dos reagentes listados anteriormente, com a excepção de Syk, DTT e o composto de teste de 91 interesse. 56 μΐ da reacção de teste foram colocados numa placa de 96 poços seguido pela adição de 1 μΐ de 2 mM de solução mãe de DMSO contendo o composto de teste (concentração final do composto 30 μΜ) . A placa foi pré-incubada durante ~10 minutos a 30°C e a reacção iniciada pela adição de 10 μΐ de enzima (concentração final 25 nM) . As taxas de reacção foram obtidas utilizando um leitor de placa BioRad Ultramark (Hercules, CA) ao longo de um tempo de leitura de 5 minutos a 30°C, e valores Ki foram determinados de acordo com métodos padrão.
Os compostos da invenção são eficazes para a inibição de SYK.
Exemplo 10: Inibição de FMS
Compostos foram seleccionados por sua habilidade para inibir a actividade de FMS utilizando um ensaio de ligação-filtro radiométrico. Este ensaio monitoriza a incorporação de 33P num substrato poli(Glu, Tyr) 4:1 (pE4Y). As reacções foram levadas a cabo numa solução contendo 100 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, 1 mM de DTT, BSA a 0,01% e DMSO a 2,5%. As concentrações finais de substrato no ensaio foram 90 μΜ de ATP e 0,5 mg/mL de pE4Y (ambos de Sigma Chemicals, St Louis, MO) . A concentração final de compostos está geralmente entre 0,01 e 5 μΜ. Tipicamente, uma titulação de 12 pontos foi conduzida preparando diluições seriais a partir de 10 mM de solução mãe de DMSO de composto de teste. As reacções foram levadas a cabo a temperatura ambiente.
Duas soluções de ensaio foram preparadas. A solução 1 contém 100 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, 1 mg/ml de pE4Y e 180 μΜ de atp (contendo 0,3 μci de 92 [γ_33ρ ] ΑΤΡ para cada reacçao). A solução 2 contém 100 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, 2 mM de DTT, BSA a 0,02% e 3 nM de FMS. O ensaio foi executado numa placa de 96 poços misturando 50 μΐ cada de Solução 1 e 2,5 mL dos compostos de teste. A reacção foi iniciada com soluções após incubação durante 20 minutos a temperatura ambiente, a reacção foi interrompida com 50 μΐϋ de TCA a 20% contendo 0,4 mM de ATP. A totalidade do volume de reacção foi então transferida a uma placa de filtro e lavada com TCA a 5% por um Harvester9600 de TOMTEC (Hamden, CT) . A quantidade de incorporação de 33P em pE4y foi analisada por um contador de cintilação de microplaca Packard TopCount (Meriden, CT) . Os dados foram ajustados utilizando software Prism para obter um CI50 ou κ±.
Os compostos da invenção são eficazes para a inibição de FMS.
Exemplo 11: Ensaio de Inibição de Rock
Compostos foram seleccionados por sua habilidade para inibir actividade de ROCK I (AA 6-553) utilizando um sistema de enzima acoplada padrão (Fox et al. (1998) Protein Sei. 7, 2249). As reacções foram levadas a cabo numa solução contendo 100 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, 2 mM de DTT e DMSO a 1,5%. As concentrações finais de substrato no ensaio foram 45 μΜ de ATP (Sigma Chemicals, St Louis, MO) e 200 μΜ de péptidos (American Peptide, Sunnyvale, CA). As reacções foram levadas a cabo a 30°C e 45 nM de ROCK I. As concentrações finais dos componentes do sistema de enzima acoplada foram 2,5 mM de fosfoenolpiruvato, 350 μΜ de NADH, 30 μρ/ιηΐ de piruvato quinase e 10 μρ/ιηΐ de lactato desidrogenase. 93
Descobriu-se que certos compostos da invenção inibem ROCK.
Exemplo 12: Ensaio de Inibição de JAK3
A inibição de composto de JAK foi ensaiada pelo método descrito por G. R. Brown, et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, vol. 10, pp 575-579 na seguinte maneira. Em placas Maxisorb, previamente revestidas a 4°C com Poli (Glu, Ala, Tyr) 6:3:1 então lavada com solução salina tamponada com fosfato a 0,05% e Tween (PBST), foram adicionados 2 μΜ de ATP, 5 mM de MgCl2, e uma solução de composto em DMSO. A reacção foi iniciada com enzima JAK e as placas incubadas durante 60 minutos a 30°C. As placas foram então lavadas com PBST, 100 μΡ de anticorpo 4G10 conjugado com HRP foram adicionados, e a placa incubada durante 90 minutos a 30°C. A placa foi lavada de novo com PBST, 100 μρ de solução de TMB são adicionados, e a placas foram incubadas durante outros 30 minutos a 30°C. Ácido sulfúrico (100 μΡ de 1 M) foi adicionado para interromper a reacção e a placa é lida a 450 nm para obter as densidades ópticas para análises para determinar os valores de Kj,.
Os compostos da invenção são eficazes para a inibição de jak-3.
Exemplo 13: Ensaio de Inibição de PDK-1
Compostos foram seleccionados por sua habilidade para inibir PDK-1 utilizando um ensaio de incorporação de fosfato radioactivo (Pitt e Lee, J. Biomol. Screen., (1996) 1, 47). Os ensaios foram levados a cabo numa mistura de 100 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, 2 mM de DTT. As concentrações finais de substrato no ensaio foram 40 μΜ de ATP (Sigma Chemicals) e 65 μΜ de péptidos 94 (PDKtide, Upstato, Lake Placid, NY). Os ensaios foram levados a cabo a 30°C e 25 nM de PDK-1 na presença de -27,5 nCi/ μΐ de [γ-32Ρ]ΑΤΡ (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK) . Uma solução mãe de tampão de ensaio foi preparada contendo a totalidade dos reagentes listados anteriormente, com a excepção de ATP, e o composto de teste de interesse. 15 μΐ da solução mãe foram colocados numa placa de 96 poços seguido pela adição de 1 μΐ de 0,5 mM de solução mãe de DMSO contendo o composto de teste (concentração final do composto 25 μΜ, concentração final de DMSO 5%). A placa foi pré-incubada durante aproximadamente 10 minutos a 30°C e a reacção iniciada pela adição de 4 μΐ ATP (concentração final 40 μΜ). A reacção foi interrompida após 10 minutos pela adição de 100 μΐ de 100 mM de ácido fosfórico, Tween-20 a 0,01%. Uma placa de 96 poços de fosfocelulose (Millipore, N.° de cat. MAPHNOB50) foi pré-tratada com 100 μΐ de 100 mM de ácido fosfórico, Tween-20 a 0,01% antes da adição da mistura de reacção (100 μΐ^ . Os pontos foram deixados para impregnar durante pelo menos 5 minutos, antes da etapa de lavagem (4 x 200 μι de 100 mM de ácido fosfórico, Tween-20 a 0,01%). Após secagem, 20 μΐ de cocktail de liquido de cintilação Optifase 'SuperMix' (Perkin Elmer) foram adicionados ao poço antes da contagem de cintilação (Contador de cintilação liquida 1450 Microbeta, Wallac).
Compostos apresentaram mais que 50% de inibição versus poços padrão contendo a mistura de ensaio e DMSO sem composto de teste foi titulado para determinar os valores de CI50. 95
Os compostos da invenção são eficazes para a inibição de PDK-1. 96
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • WO 9965897 A [0037] · US 5886026 A [0122] • WO 0038675 A [0037] [0038] · US 5304121 A [0122] • US 6099562 A [0122]
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Lisboa, 17/12/2010

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de fórmula (II):
em que X é N; Y é NR°, ou 0; n é 0; m é 0; p é 0; R1 é -N(H)R2; R2 é hidrogénio; R3 é 2-piridilo; R5 é hidrogénio ou -CN; em que cada ocorrência independente de R° é seleccionada a partir de hidrogénio, Ci_6 alifático opcionalmente substituído, um anel heterocíclico ou heteroarilo de 5-6 membros não substituído (desde que um átomo de azoto no anel heterocíclico seja opcionalmente substituído com -R+ ou -C(0)R+, em que R+ é (alquilo Ci_6), preferentemente (alquilo Ci-4) , fenilo, -O(Ph), ou -CH2 (Ph) , ou, não obstante a definição anterior, duas ocorrências independentes de R°, no mesmo substituinte ou em substituintes diferentes, tomadas junto com o(s) átomo(s) ao(s) qual(quais) cada grupo R° está ligado, formam um anel heteroarilo, arilo ou heterociclilo de 5-8 membros ou um 2 anel cicloalquilo de 3-8 membros tendo 0-3 heteroátomos seleccionados independentemente a partir de azoto, oxigénio, ou enxofre; em que cada ocorrência independente de R° é seleccionada a partir de hidrogénio, Ci_6 alifático opcionalmente substituído, um anel heterocíclico ou heteroarilo de 5-6 membros não substituído, fenilo, -O(Ph), ou -CH2(Ph), ou, não obstante a definição anterior, duas ocorrências independentes de R°, no mesmo substituinte ou diferentes substituintes, tomadas junto com o(s) átomo(s) ao(s) qual (quais) cada grupo R° está ligado, formam um anel heteroarilo, arilo ou heterociclilo de 5-8 membros ou um anel cicloalquilo de 3-8 membros tendo 0-3 heteroátomos seleccionados independentemente a partir de azoto, oxigénio, ou enxofre; o grupo alifático de R° é opcionalmente substituído com NH2, NH(Ci_4 alifático), N(Ci-4 alifático) 2, halogéneo, Ci_4 alifático, OH, O (Ci_4 alifático), N02, CN, CO(2H, C02(Ci_4 alifático), O(halo-Ci_4 alifático), ou halo(Ci-4 alifático), em que cada um destes grupos C1-4 alifático anteriores é não substituído; cada R* é seleccionado independentemente a partir de hidrogénio ou um Ci-6 alifático opcionalmente substituído com NH2, NH(Ci_4 alifático), N(Ci-4 alifático) 2, halogéneo, C1-4 alifático, OH, 0(Ci-4 alifático), N02, CN, C02H, C02 (C1-4 alifático), O(halo-Ci_4 alifático), ou halo (C1-4 alifático), em que cada um destes grupos C1-4 alifático anteriores é não substituído; e R é hidrogénio ou um grupo Ci-6 alifático, opcionalmente substituído com =0, =S, - NH2, NH(Ci_4 alifático), N (C1-4 alifático) 2, halogéneo, C4_4 alifático, OH, 0(C4-4 alifático), N02, CN, C02H, C02(C4-4 alifático), 3 0(halo-Ci-4 alifático), ou halo(Ci_4 alifático), em que cada um destes grupos C1-4 alifático anteriores é não substituído.
2. Um composto de acordo com a reivindicação 1, tendo a fórmula (I-b) ou (I-c):
em que o dito composto é seleccionado do grupo que consiste em:
3. Um composto de acordo com a reivindicação 1, em que o dito composto é seleccionado do grupo que consiste em: 4
4. Uma composição farmacêutica que compreende: um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um suporte, adjuvante ou veiculo farmaceuticamente aceitável.
5. A composição de acordo com a reivindicação 4, que compreende ainda um agente terapêutico adicional seleccionado a partir de um agente quimioterápico ou 5 antiproliferativo, um tratamento para a doença de Alzheimer, um tratamento para a doença de Parkinson, um agente para tratar a esclerose múltipla (MS), um tratamento para a asma, um agente para tratar a esquizofrenia, um agente anti-inflamatório, um agente imunomodulador ou imunosupressor, um factor neurotrófico, um agente para tratar uma doença cardiovascular, um agente para tratar doenças ósseas destrutivas, um agente para tratar uma doença hepática, um agente para tratar uma doença do sangue, ou um agente para tratar um distúrbio de imunodeficiência.
6. Um método in vitro de inibição da actividade de FLT-3 quinase numa amostra biológica, que compreende a etapa de pôr em contacto a dita amostra biológica com: a) uma composição de acordo com a reivindicação 4; ou b) um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
7. Uma composição de acordo com a reivindicação 4, ou um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para utilização na inibição da actividade de FLT-3 quinase num paciente.
8. Uma composição de acordo com a reivindicação 4; ou um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, para utilização no tratamento ou diminuição da gravidade de uma doença ou patologia seleccionada a partir de distúrbios alérgicos, distúrbios proliferativos, distúrbios 6 autoimunes, patologias associadas ao transplante de órgãos, distúrbios inflamatórios, distúrbios mediados imunologicamente, ou doenças ósseas destrutivas.
9. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, ou uma composição de acordo com a reivindicação 4, para utilização de acordo com a reivindicação 8, para ser utilizado ao mesmo tempo, antes ou depois do que um agente terapêutico adicional seleccionado a partir de um agente quimioterápico ou antiproliferativo, um tratamento para a doença de Alzheimer, um tratamento para a doença de Parkinson, um agente para tratar a esclerose múltipla (MS), um tratamento para a asma, um agente para tratar a esquizofrenia, um agente anti-inflamatório, um agente imunomodulador ou imunosupressor, um factor neurotrófico, um agente para tratar uma doença cardiovascular, um agente para tratar doenças ósseas destrutivas, um agente para tratar de doença hepática, um agente para tratar uma doença do sangue, ou um agente para tratar um distúrbio de imunodeficiência.
10. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, ou uma composição de acordo com a reivindicação 4, para utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a doença é seleccionada a partir de cancro, doença de Alzheimer, reestenose, angiogénese, glomerulonefrite, citomegalovírus, VIH, herpes, psoriase, aterosclerose, alopecia, uma doença autoimune, uma infecção virai, um distúrbio neurodegenerativo, um distúrbio associado à apoptose de timócitos, ou um distúrbio proliferativo; distúrbios hematopoiéticos, em particular, 7 leucemia mielógena aguda (AML), leucemia promielocitica aguda (APL), e leucemia linfocitica aguda (ALL); respostas imunes tais como reacções de hipersensibilidade de tipo I ou alérgicas, asma, doenças autoimunes tais como rejeição de transplante, doença de enxerto versus hospedeiro, artrite reumatóide, esclerose lateral amiotrófica, e esclerose múltipla, distúrbios neurodegenerativos tais como esclerose lateral amiotrófica familiar (FALS), assim como em malignidades hematológicas e sólidas tais como leucemias e linfornas; em que o cancro é cancro pancreático, da próstata ou do ovário.
11. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, ou uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-5, no fabrico de um medicamento para tratar ou diminuir a gravidade de uma doença ou patologia seleccionada a partir de distúrbios alérgicos, distúrbios proliferativos, distúrbios autoimunes, patologias associadas ao transplante de órgãos, distúrbios inflamatórios, distúrbios mediados imunologicamente ou doenças ósseas destrutivas; cancro, doença de Alzheimer, reestenose, angiogénese, glomerulonefrite, citomegalovirus, VIH, herpes, psoriase, aterosclerose, alopecia, uma doença autoimune, uma infecção virai, um distúrbio neurodegenerativo, um distúrbio associado à apoptose de timócitos, ou um distúrbio proliferativo; distúrbios hematopoiéticos, em particular, leucemia mielógena aguda (AML), leucemia promielocitica aguda (APL), e leucemia linfocitica aguda (ALL); respostas imunes tais como reacções de hipersensibilidade de tipo I ou alérgicas, asma, doenças autoimunes tais como rejeição de transplante, doença de enxerto versus hospedeiro, artrite reumatóide, esclerose lateral amiotrófica, e esclerose múltipla, distúrbios neurodegenerativos tais como esclerose lateral amiotrófica familiar (FALS), assim como em malignidades hematológicas e sólidas tais como leucemias e linfornas; cancro pancreático, da próstata ou do ovário. Lisboa 17/12/2010
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