ES2352080T3 - Procedimiento para la producción de proteina recombinante. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de producción de proteína recombinante que usa los mohos koji recombinantes que se obtienen introduciendo el producto obtenido por ligadura de un gen que codifica una proteína de interés aguas debajo de un promotor de un gen que codifica cualquier enzima seleccionado del grupo constituido por glucoamilasa, α-amilasa estable a ácidos, αamilasa y proteasa ácida, en mohos koji blancos o mohos koji negros como huésped, o usando los mohos koji recombinantes que se obtienen introduciendo el producto obtenido por ligadura de un gen que codifica una proteína de interés aguas abajo de un promotor de un gen que codifica cualquier enzima seleccionado del grupo constituido por glucoamilasa, α-amilasa, Βglucanasa y proteasa ácida, en mohos koji amarillos como huésped, que comprende: cultivo de mohos koji recombinantes en un medio líquido que contiene el material de partida de cultivo compuesto por cebada y/o trigo, cuya superficie se encuentra completa o parcialmente cubierta con cascarilla, procurando que queden excluidos productos triturados; y recogida de la proteína recombinante del producto de cultivo.

Description

1

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de proteína recombinante, y de forma más particular, a un procedimiento de producción de proteína recombinante que usa mohos koji como huésped. Técnica anterior

El koji se ha usado como fuentes de enzima en la producción de alimentos y bebidas fermentadas desde hace mucho tiempo. Cuando se usa koji para la producción de alimentos y bebidas fermentadas, se ha usado convencionalmente el koji sólido que se obtiene mediante cultivo de mohos koji sobre la superficie de cereales y similares. El koji sólido se obtiene mediante un procedimiento de producción tradicional. Sin embargo, el procedimiento es un modo de cultivo especial, es decir, cultivo en sólido, que no es adecuado para producción a gran escala.

Por otro lado, el koji líquido que es un producto de cultivo de mohos koji obtenidos mediante cultivo en líquido de mohos koji, puede controlar el cultivo fácilmente, y constituye un modo de cultivo adecuado para producción eficiente.

No obstante es bien conocido que el moho koji líquido no proporciona suficiente actividad de enzima requerida para la producción de alimentos y bebidas fermentadas, de modo que hay pocos ejemplos en los que se use el koji líquido para la producción real (véanse documentos no patentes 1 a 4).

Los mohos koji proliferan fácilmente, por tanto se pueden preparar medios a bajo coste, sin que se requieran equipos de cultivo especiales, de modo que el coste para el cultivo es bajo. Los mohos koji se han usado para la producción de alimentos y bebidas fermentadas desde hace mucho tiempo ya que son reconocidos como un huésped seguro. Por tanto, se ha intentado convencionalmente incorporar un gen derivado de mohos koji o de los otros organismos usando los mohos koji como huésped para expresar fuertemente los genes con lo que se producen productos derivados de los genes, es decir, proteínas recombinantes (véase el documento no patente 5).

Se ha descrito también un ejemplo exitoso de producción de proteína recombinante con altos rendimientos mediante cultivo en sólido con salvado de trigo (véase el documento no patente 6). Sin embargo la producción se llevó a cabo en un modo de cultivo especial, es decir, cultivo en sólido, de modo que no es adecuado para la producción a gran escala.

Por otro lado se ha pensado que el cultivo en líquido proporciona inherentemente pocas proteínas fuera de las células como se describe anteriormente, y por tanto no es adecuado para la producción en masa de proteína recombinante.

Documento no patente 1: Hata Y. y col.: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997).

Documento no patente 2: Hata Y. y col.: Gene, 207, 127 – 134 (1998)

Documento no patente 3: Ishida H. y col.: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307 (1988).

Documento no patente 4: Ishida H. y col.: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000).

Documento no patente 5: R. J. Gouka, y col., Appl. Microbiol. Biotechnol., 47, 1-11 (1997)

Documento no patente 6: K. Tsuchiya, y col., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 895-899 (1994)

Divulgación de la invención

Problemas a ser resueltos con la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de producción en masa de proteína recombinante con el procedimiento de cultivo en líquido usando mohos koji como huésped, que se ha creído convencionalmente que no es adecuado para la producción de proteína recombinante debido a las razones anteriormente citadas.

Medios para resolver los problemas

Los inventores de la presente invención ya han propuesto procedimientos de producción de koji líquido que presentan suficiente actividades de enzima (véanse las solicitudes de patente japonesa números 2004-350661, 2004-352320, 2004-352324, 2004-378453 y 2005290648, y JP-A-2003-265165). Estos procedimientos usan como un medio el material de partida cuya superficie está completa o parcialmente cubierta al menos con cascarillas para evitar la liberación de nutrientes desde el material de partida al sistema de cultivo, y de este modo se obtienen las actividades de enzimas requeridas, en particular, enzimas amilolíticas, enzimas celulolíticas y enzimas proteolíticas. De acuerdo con los procedimientos se obtiene actividades de enzima mayores que las obtenidas con cultivo en líquido usando como material de partida cebada perlada o arroz perlado que es un material de partida del soju. Ejemplos de los mohos koji comprenden mohos koji blancos, mohos koji negros, mohos koji amarillos y mohos koji rojos.

Se supone que los procedimientos anteriormente citados de producción de koji líquido aumenta los niveles de transcripción de genes que codifican las enzimas afectadas por la represión de catabolito debido a concentraciones de nutrientes tales como sacáridos y aminoácidos, y de este modo se generan los productos (es decir, enzimas de interés) derivados de los genes que son producidos y secretados fuera de las células de mohos koji.

Un gen que codifica una proteína de interés se liga aguas abajo del promotor de un gen que codifica el enzima afectado por la represión del catabolito debido a las concentraciones de nutrientes tales como sacáridos y aminoácidos, creando de este modo mohos koji recombinantes que presentan incorporado en su interior el producto ligado, cultivando los mohos koji recombinantes de acuerdo con los procedimientos anteriormente citados de producción de koji líquido, y por tanto se produce la proteína recombinante de interés en altos rendimientos.

Factor importante adicional en la producción de proteína recombinante es que la proteína recombinante traducida es transportada apropiadamente fuera de las células del huésped. Incluso si los niveles de transcripción sencillamente aumentan, se pueden acumular frecuentemente proteínas recombinantes traducidas en una célula, o se descomponen con enzimas inherentemente secretadas por el huésped. Además no se produce una proteína que se pliega de forma apropiada y que tiene actividad equivalente a la de una proteína natural a menos que la proteína recombinante se vea sometida a modificación requerida durante el transporte de la misma fuera de las células del huésped.

Al mismo tiempo es muy posible producir y secretar mayor número de proteínas recombinantes con la técnica de producción de koji líquido que se describió anteriormente con uso de mohos koji como huésped. Se puede obtener también una proteína recombinante pretendida con altos rendimientos con lo que se puede producir fuera de los mohos koji huésped, como una proteína de fusión de la proteína recombinante con el enzima que se produce inherentemente y secreta por lo mohos koji huésped, y la proteína de fusión contenida en un sobrenadante de cultivo es escindida en el punto de ligadura de la misma con proteasa dirigida al sitio.

En base a los hallazgos anteriormente citados la presente invención se completa como sigue.

Por tanto, la presente invención de acuerdo con la reivindicación 1, proporciona un procedimiento de producción de proteína recombinante usando los mohos koji recombinantes que se obtienen mediante transformación de mohos koji como huésped comprendiendo: cultivo de los mohos koji recombinantes en un medio líquido que contiene como material de partida de cultivo al menos uno seleccionado del grupo constituido por cereal cuya superficie se encuentra completa o parcialmente cubierta al menos con cascarillas, la semilla y/o el tubérculo cuya superficie se cubre con envolturas y el amaranto y/o la quinoa sin pretratamiento tal como molienda o trituración; y se recoge la proteína recombinante del producto de cultivo.

La presente invención, de acuerdo con la reivindicación 2, proporciona el procedimiento de producción de proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en la que los mohos koji recombinantes se obtienen de modo que un gen que codifica una proteína de interés es ligada aguas abajo del promotor de un gen que codifica el enzima afectado por la represión del catabolito debido a concentraciones de nutrientes tales como sacáridos y aminoácidos, con lo que se obtiene un producto ligado, y se introduce el producto ligado en

mohos koji como huésped.

La presente invención, de acuerdo con la reivindicación 3, proporciona el procedimiento de producción de proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el promotor es un promotor de un gen que codifica una enzima cualquiera seleccionado del grupo constituido por enzimas amilolíticos, enzimas celulolíticos y enzimas proteolíticos.

Efectos de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento de producción en masa de proteína recombinante mediante procedimiento de cultivo en líquido con mohos koji como huésped. Los mohos koji proliferan fácilmente de modo que se pueden preparar los medios a bajo coste, y no se requieren equipos de cultivo especiales. Los mohos koji se han usado para la producción de alimentos y bebidas fermentadas desde hace mucho tiempo, por lo que se trata de huéspedes seguros.

Además el cultivo líquido de mohos koji se puede controlar más estrictamente en comparación con el cultivo en sólido, por lo que es adecuado para producción eficiente.

Además se puede seleccionar una variedad de formas de producción usando diversos materiales de partida y cepas de moho koji, y se produce en masa una proteína recombinante de interés de forma eficiente y estable.

Mejor forma de realización para llevar a cabo la invención

En lo sucesivo, la presente invención se describirá de forma detallada.

Un medio líquido que se va a usar en la presente invención contiene al menos un material de partida para cultivo seleccionado del grupo constituido por cereal cuya superficie está completa o parcialmente cubierta al menos con cascarillas, la semilla y/o el tubérculo cuya superficie está cubierta con envolturas, y el amaranto y/o la quinoa sin pretratamiento tal como molienda o trituración.

En la presente invención ejemplos del cereal que se van a usar como material de partida para cultivo comprenden cebada, arroz, trigo, alforfón, mijo de corral, mijo cola de zorro, mijo, kaoliang, maíz y similares. Los materiales de partida para cultivo necesitan ser de forma tal que la superficie se encuentre completa o parcialmente cubierta al menos con cascarillas. Se puede usar un material no perlado o que presente igual o más de la relación de perlado a la que se ha perlado, de forma tal que las cascarillas son retenidas al menos en la superficie de los granos, y se pueden usar también arroz bruto, cebada bruta y similares. En el caso de arroz se puede usar arroz bruto, arroz con todas las cáscaras y arroz con una parte de las cáscaras.

Cuando el material de partida para cultivo es cebada, se puede usar el material no perlado con una relación de perlado del 100%. De forma alternativa, con la condición de que la relación de perlado del material no perlado se defina como 100%, el material que presenta una relación de perlado no inferior al valor determinado por la resta de la relación de cascarilla de cebada (en general de 7 a 8%) de la relación de perlado del material no perlado (100%) es decir, aproximadamente 92% a 93%.

El término “relación de perlado” se refiere a la relación que queda de cereales una vez que los cereales se han perlado. Por ejemplo, el término “porcentaje de perlado de 90%” significa que se elimina el 10% de las cascarillas o similares en la porción de capa superficial de un cereal. En la presente invención el término “cebada bruta” comprende desde cebada no perlada a cebada perlada que presenta cascarillas que quedan en la superficie del grano, es decir, el material que presenta una relación de perlado de 90% o más. El término “cascarilla” se refiere a la parte exterior que cubre la superficie de una partícula de cereal.

En la presente invención ejemplos de la haba y del tubérculo que se van a usar como material de partida para cultivo comprenden haba de soja, haba roja, boniato y similares. Estos materiales de partida para cultivo se someten únicamente a eliminación de tierra en sus cascarillas, pero no se someten a procesos tales como corte, trituración y similares, y se usan para la preparación del medio líquido completamente cubierto con las cascarillas.

En la presente invención pueden tratarse semillas y tubérculos como material de partida para cultivo con calor o congelación manteniendo sus cascarillas.

En la presente invención, “amaranto” que se usa como material de partida para cultivo es un término genérico de plantas que pertenecen al género Amaranthus de la familia Amaranthaceae. Entre los cereales, el amaranto presenta alto contenido en proteína y el contenido de lisina, que es uno de los aminoácidos, es igual al de la semilla de soja. Además el amaranto es un cereal muy nutritivo que contiene grandes cantidades de calcio, hierro y fibras en comparación con arroz perlado. Los países de origen son zonas específicas de países de Sudamérica y América Central, India, Himalaya y Nepal. Por otro lado la quinoa es una hierba anual de la familia Agatha, que se cultiva principalmente en las tierras altas tal como los Andes localizados en la parte sur de Perú y la parte oeste de Bolivia. La quinoa es rica en minerales, vitaminas, proteínas y fibras dietéticas.

El amaranto y la quinoa que se usan como material de partida para cultivo se pueden usar solos o en combinación. Estos materiales de partida se pueden usar directamente para la preparación del medio líquido sin ser sometidos a pre-tratamiento tal como molienda o trituración.

Uno de los materiales de partida para cultivo anteriormente citados o una combinación de dos o más de los mismos se usa para la preparación del medio líquido como se describe a continuación. Los materiales de partida para cultivo anteriormente citados se mezclan con agua para preparar un medio líquido. La relación de mezcla del material de partida se puede ajustar en una extensión tal que se genere de forma selectiva una proteína recombinante de interés y se acumule en el producto para cultivo de moho koji.

Por ejemplo, cuando se use cebada como material de partida para cultivo se prepara el medio líquido añadiendo de 1 a 20% (peso/volumen) de cebada a agua. Cuando se usa cebada no perlada el medio líquido se prepara con la adición más preferiblemente de 8 a 10% (en peso/volumen). Cuando se usa cebada perlada al 95% como material de partida, se prepara el medio líquido con la adición más preferiblemente de 1 a 4% (en peso/volumen).

A continuación, cuando se usa arroz no perlado del cual se eliminaron las cáscaras como material de partida para cultivo, se prepara el medio líquido preferiblemente con adición de 1 a 20%, preferiblemente de 5 a 13%, o más preferiblemente de 8 a 10% (todos los valores se encuentran en peso/volumen) de arroz no perlado a agua.

Cuando se usa semilla como material de partida para cultivo, el medio líquido se prepara con adición de 1 a 10% de semilla a agua, preferiblemente con adición de 8 a 10% de la semilla de soja o de 1 a 2% (todos los valores se encuentran en peso/volumen) de semilla roja a agua. Cuando se usa tubérculo como material de partida para cultivo, se prepara el medio líquido con adición de 1 a 10% (en peso/volumen) de tubérculo a agua.

Cuando se usa amaranto como material de partida para cultivo, el medio líquido se prepara con adición de 1,5 a 15%, preferiblemente de 2 a 10%, o más preferiblemente de 2 a 8% (todos los valores se encuentran en peso/volumen) de amaranto a agua. Cuando se usa quinoa como material de partida para cultivo, el medio líquido se prepara añadiendo de 1,5 a 7%, preferiblemente de 2 a 6%, o más preferiblemente de 2 a 4% (todos los valores se encuentran en peso/volumen) de quinoa a agua.

Las cantidades de los materiales de partida para cultivo que se van a usar para la mezcla se pueden seleccionar de forma apropiada debido a que las cantidades óptimas varían en función de los grados de perlado o del tipo de materiales de partida para cultivo que se van a usar, de la cepa de mohos koji como huésped que se va a usar, del promotor que se va a usar, de la proteína recombinante que se va a producir y similares.

Cuando la cantidad del material de partida para cultivo que se va a usar es mayor que el límite superior, la viscosidad del líquido de cultivo aumenta y el suministro de oxígeno o aire requerido para cultivo aeróbico de mohos koji recombinantes comienza a ser insuficiente. Esta reducción del contenido en oxígeno en el producto de cultivo, restringe el progreso del cultivo y no es preferido. Por otro lado cuando la cantidad del material de partida que se va a usar es menor que el límite inferior, no se produce el enzima recombinante de interés en gran cantidad.

Los almidones comprendidos en el material de partida para cultivo se pueden gelatinizar preliminarmente antes del cultivo. La gelatinización de almidones se puede llevar a cabo de acuerdo, pero no particularmente limitado a esto, con cualquiera de los procedimientos convencionales que comprende un procedimiento con vapor, un procedimiento de tostado y similares. Los almidones se pueden gelatinizar en la etapa de esterilización del medio líquido como se describe posteriormente cuando se calientan a la temperatura de gelación o superior con la esterilización con altas temperaturas y altas presiones.

Además del material para cultivo anteriormente citado, se añaden de forma deseable sustancias orgánicas, sales inorgánicas, y similares como fuentes de nutrientes al medio líquido que se va a usar en la presente invención.

Por ejemplo cuando se usan como huéspedes mohos koji blancos tales como Aspergillus kawachii o mohos koji negros tales como Aspergillus awamori y Aspergillus niger, se usa preferiblemente una sal nitrato y una sal fosfato en combinación, o más preferiblemente, se usa una sal sulfato en combinación además de los anteriores. Ejemplos de la sal nitrato comprenden nitrato de sodio y nitrato de potasio, siendo particularmente preferido el nitrato de potasio. Ejemplos de la sal fosfato comprenden dihidrogenofosfato de potasio y fosfato de amonio, siendo particularmente preferido dihidrogenofosfato de potasio. Ejemplos de la sal sulfato comprenden sulfato de magnesio heptahidratado, sulfato de hierro heptahidratado y sulfato de amonio, siendo particularmente preferibles sulfato de magnesio heptahidratado y sulfato de hierro heptahidratado. Se pueden usar en combinación dos o más de los mismos.

Se ajustan concentraciones de las sales inorgánicas en medio líquido cuando se usan los mohos koji blancos o los mohos koji negros en la extensión tal que se genere selectivamente una proteína recombinante de interés y se acumule en el producto de cultivo de moho koji. De forma específica, la concentración de la sal nitrato es de 0,1 a 2,0%, preferiblemente de 0,2% a 1,5%, la concentración de la sal fosfato es de 0,05 a 1,0%, preferiblemente de 0,1 a 0,5%, y la concentración de la sal sulfato es de 0,01 a 0,5%, preferiblemente de 0,02 a 0,1% (todos los valores se encuentran en peso/volumen).

Cuando se usan mohos koji amarillos tales como Aspergillus oryzae y Aspergillus sojae, se usan preferiblemente una sal nitrato, una sal fosfato y una sal sulfato conjuntamente en el medio líquido. Ejemplos de la sal nitrato comprenden nitrato de sodio y nitrato de potasio, siendo particularmente preferible nitrato de sodio. Ejemplos de la sal fosfato comprenden dihidrogenofosfato de potasio y fosfato de amonio, siendo particularmente preferible dihidrogenofosfato de potasio. Ejemplos de la sal sulfato comprenden sulfato de magnesio heptahidratado, sulfato de hierro heptahidratado y sulfato de amonio, siendo particularmente preferibles sulfato de magnesio heptahidratado y sulfato de hierro heptahidratado. Se pueden usar dos o más de estas sales inorgánicas en combinación.

Se ajustan concentraciones de las sales inorgánicas en medio líquido cuando se usan

mohos koji amarillos en la extensión tal que se genere selectivamente una proteína recombinante de interés y se acumule en el producto de cultivo de moho koji. De forma específica, la concentración de la sal nitrato es de 0,1 a 2,0%, preferiblemente de 0,2 a 1,5%, la concentración de la sal fosfato es de 0,05 a 1,0%, preferiblemente de 0,1 a 0,5%, y la concentración de la sal sulfato es de 0,01 a 0,5%, preferiblemente de 0,02 a 0,1% (todos los valores se encuentran en peso/volumen).

Se pueden añadir de forma apropiada sustancias orgánicas y sales inorgánicas excepto las sales inorgánicas anteriormente citadas como fuentes de nutrientes al medio líquido de la presente invención. Tales aditivos no se ven particularmente limitados en tanto se usen en general para cultivo de mohos koji. Ejemplos de la sustancia orgánica comprenden salvado de arroz, gluten de trigo, licor de maceración de maíz, torta de semilla de soja y semilla de soja desgrasada. Ejemplos de sales inorgánicas comprenden compuestos solubles en agua tales como una sal de amonio, una sal de potasio, una sal de calcio y una sal de magnesio. Se pueden usar simultáneamente dos o más sustancias orgánicas y/o sales inorgánicas. Las cantidades de adición de las mismas no se ven limitadas particularmente en tanto se promueva la proliferación del moho koji recombinante. La cantidad de adición de la sustancia orgánica es preferiblemente de 0,1 a 5% aproximadamente (en peso/volumen) y la cantidad de adición de las sales inorgánicas es preferiblemente de 0,1 a 1% aproximadamente (en peso/volumen).

La adición de estas fuentes de nutrientes en una cantidad mayor que el límite superior no es preferible debido al que se inhibe el crecimiento de los mohos koji recombinantes. Tampoco es preferible una cantidad menor que el límite inferior debido a que no se produce en masa una proteína recombinante de interés.

El medio líquido así obtenido se puede someter a tratamiento de esterilización en caso de necesidad y los procedimientos de tratamiento no se ven particularmente limitados. Por ejemplo, este puede ser procedimiento de esterilización a alta temperatura y a alta presión llevado a cabo a una temperatura de 121º C durante 15 minutos.

El medio líquido esterilizado se enfría hasta una temperatura de cultivo y luego se inoculan los mohos de koji recombinantes en el medio líquido.

Los mohos koji recombinantes que se van a usar en la presente invención es el material obtenido mediante transformación de mohos koji como huésped, y el material se puede cultivar con el medio líquido anteriormente citado mediante el procedimiento de cultivo descrito anteriormente. Los mohos koji que se usan como huésped pueden ser el material que produce los enzimas afectados por la represión del catabolito debida a las concentraciones de nutrientes tales como sacáridos y aminoácidos. Ejemplos de los mismos comprenden mohos koji blancos tales como Aspergillus kawachii, mohos koji negros tales como Aspergillus

awamori y Aspergillus niger, y mohos koji amarillos tales como Aspergillus oryzae y Aspergillus sojae.

Los mohos koji recombinantes de la presente invención se obtienen mediante ligadura de un gen que codifica una proteína de interés aguas abajo de un promotor, e introducción del producto ligado en mohos koji como huésped. Se puede usar cualquier promotor en la presente invención en tanto exprese el gen aguas abajo en los mohos koji como huésped, y es preferible el promotor del enzima que se produzca en altos rendimientos fuera de las células de los mohos koji. Es más preferible usar un promotor de un gen que codifica el enzima afectado por la represión del catabolito debida a las concentraciones de nutrientes tales como sacáridos y aminoácidos. Ejemplos específicos de los mismos comprenden promotores de los genes que codifican enzimas amilolíticos tales como glucoamilasa (GlaA o GlaB) y α-amilasa (AmyB), enzimas celulolíticas tales como glucanasa (Egia) y enzimas proteolíticas tales como proteasa ácida (PepA).

En la presente invención los mohos koji recombinantes se cultivan usando el material de partida para cultivo anteriormente citado, de modo que la descomposición de nutrientes tales como sacáridos y aminoácidos en el material de partida requiere mucho tiempo, y se restringe la tasa de liberación de nutrientes en el sistema de cultivo. De acuerdo con lo anterior se activa el promotor de un gen que codifica el enzima afectado por la represión del catabolito debida a las concentraciones de estos nutrientes, aumentando el nivel de transcripción de un gen que codifica una proteína de interés que existe aguas abajo del promotor con lo que se produce en masa la proteína recombinante de interés.

En la presente invención el gen que codifica una proteína de interés puede ser el material que se puede expresar en moho koji como huésped, y puede ser un ADNc o un ADN cromosomal. En la presente invención el término “proteína” comprende glicoproteínas. El gen que codifica una proteína de interés no se ve limitado a genes derivados de mohos koji. Los genes derivados de otras especies de organismos se pueden usar también en tanto los genes sean adecuados para la producción de proteínas recombinantes usando mohos koji como huésped.

Además del promotor y del gen que codifica una proteína de interés, se puede introducir opcionalmente en mohos koji recombinantes de la presente invención un producto ligado que presenta terminador, marcador de selección y similares ligados en su interior. El terminador puede ser el material que funciona en los mohos koji como huésped, y es preferible usar un terminado del enzima que se produzca en grandes rendimientos fuera de las células de los mohos koji.

En la presente invención la transformación de los mohos koji como huésped se puede

llevar a cabo mediante un procedimiento típico tal como el procedimiento de introducción de un vector plásmido en un protoplasto del huésped en presencia de PEG (Unkles, y col., Mol. Gen. Genet., 218, 99-204 (1989)).

Se puede usar cualquier plásmido para el vector en tanto sea adecuado para los mohos de koji huésped. Por ejemplo, el plásmido se puede crear usando pPTRIDNA, pPTRIIDNA (TAKARA BIO INC.) y similares en función de los fines. Sin embargo el plásmido no se limita a estos.

Con el fin de introducir un gen que codifica la proteína de interés anteriormente citada en el vector anteriormente citado, se puede usar un procedimiento bien conocido. Uno de los procedimientos comprende, escisión de un gen purificado que codifica la proteína de interés con un enzima de restricción apropiado, inserción del gen escindido en el sitio de enzima de restricción o el sitio de multiclonación de un ADN vector apropiado, ligando de este modo el gen escindido con el vector.

Los mohos koji transformados como se describieron anteriormente se cultivan usando un medio de selección apropiado. Después de esto se aísla una colonia resultante para obtener los mohos koji recombinantes en los que se incorpora un gen que codifica una proteína de interés.

Se pueden usar los mohos koji recombinantes así obtenidos para el cultivo de cepa simple, o para el cultivo mixto con dos o más cepas homólogas o heterogéneas. Se permite usar bien en forma de esporas o bien de micelas obtenidas en pre-cultivo. Sin embargo se usan preferiblemente las micelas debido a que se requiere periodos más cortos de tiempo para la fase de crecimiento logarítmica. La cantidad de los mohos koji recombinantes que se van a inocular en el medio líquido no se ve particularmente limitada, pero el número de las esporas puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 x 104 a 1 x 106 por ml del medio líquido. Para las micelas se inocula preferiblemente aproximadamente de 0,1 a 10% del líquido de precultivo.

La temperatura del cultivo de los mohos de koji recombinantes puede establecerse preferiblemente en 25 a 45º C, o más preferiblemente de 30 a 40º C, pero no se limita particularmente en tanto el crecimiento no se vea afectado de forma adversa. Si la temperatura de cultivo es baja, este tiende a contaminarse con microbios infecciosos ya que el crecimiento de los mohos koji recombinantes comienza a ralentizarse.

Cuando se usan como huésped mohos koji amarillos se mejora la actividad del enzima controlando la temperatura del cultivo de acuerdo con la fase de crecimiento de los mohos koji amarillos. De forma específica, la temperatura de cultivo se puede mantener de 25 a 35º C, preferiblemente de 28 a 33º C durante la fase proliferativa de las células, que comienza al inicio del cultivo y finaliza después de 12 a 36 horas desde el inicio, y durante la fase de producción de enzima subsiguiente, de 35 a 45º C, preferiblemente de 37 a 42º C.

El equipo de cultivo puede ser cualquiera de los que sean capaces de llevar a cabo el cultivo en líquido. Los mohos koji se tienen que cultivar aeróbicamente, de modo que el cultivo se debería llevar a cabo en condiciones aeróbicas en las que se suministra oxígeno o aire al medio. Además, es preferible agitar el medio durante el cultivo de modo que el material de partida, oxígeno, y los mohos koji recombinantes sean distribuidos de forma uniforme en el equipo durante el cultivo. Las condiciones de agitación y la cantidad de aireación puede ser arbitraria en tanto el entorno del cultivo se mantenga en condiciones aerobias, y puede ser apropiado seleccionar en función del equipo de cultivo, la viscosidad del medio y similares.

Los mohos koji recombinantes se cultivan mediante el procedimiento de cultivo anteriormente citado para producir una proteína recombinante de interés con gran rendimiento en el producto de cultivo.

En la presente invención la proteína recombinante se recoge luego del producto de cultivo de moho koji resultante. Se puede usar cualquier técnica bien conocida para el procedimiento de recogida de la proteína recombinante. Por ejemplo, se adopta el procedimiento de filtrar, centrifugar o similar el producto de cultivo para obtener un sobrenadante del cultivo, y concentrar opcionalmente el sobrenadante del cultivo, purificarse o similar usando una resina de absorción, electroforesis o similar. Ejemplos

A continuación, la presente invención se describirá con mayor detalle mediante ejemplos y similares. Sin embargo, la presente invención no se ve limitada con los mismos.

Ejemplo 1 (procedimiento de producción de proteína recombinante con uso de mohos koji amarillos como huésped)

(Preparación del medio)

La composición del medio líquido para mohos koji amarillos fue como sigue: 2,0% de cebada perlada al 98% (Starling, producida en Australia), 1,2% de nitrato de sodio, 0,8% de cloruro de potasio, 0,4% de dihidrogenofosfato de potasio, 0,2% de sulfato de magnesio heptahidratado y 0,08% de sulfato de hierro heptahidratado (todos los valores se encuentran en peso/volumen).

Para el control se usó el medio DPY (que contiene 2% de dextrina, 1% de polipeptona, 0,5% de extracto de levadura, 0,5% de dihidrogenofosfato de potasio y 0,05% de sulfato de magnesio (todos los valores se encuentran en peso/volumen)).

Se dispuso 20 ml de cada uno de los medios en un matraz cónico con deflectores de

100 ml, respectivamente, y se esteriliza con autoclave a 121º C durante 15 minutos.

(Moho koji recombinante)

Se usó como mohos koji recombinantes el niaD 300-Der fI que se ha registrado con el número de acceso FERM BP-10667 en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón (nombre y dirección anteriores: Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón) el 30 de Julio de 1997 y que se ha transferido al depósito internacional desde el depósito original el 28 de Agosto de 2006. Se obtuvo el moho koji recombinante niaD 300-Der fI de acuerdo con un procedimiento descrito en el documento JP-A11-75840, usando como huésped una cepa mutante de asimilación de nitrato niaD 300 de Aspergillus oryzae incorporando a esta Der fI E(-1)K, es decir, un fragmento de ADN obtenido mediante alteración de un codón de ácido glutámico en el terminal 3’ en un codón de lisina en pro-secuencia de ADNc de la glicoproteína Der fI, que es un alérgeno principal presente en Dermatophagoides farinae (véase, H. Shoji, y col., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61(10), 16681673, 1997).

En el ADN de niaD 300-Der FI, un promotor de glaA derivado de Aspergillus oryzae es ligado aguas arriba del ADN de Der fI E(-1)K y un terminador amyB derivado de Aspergillus oryzae es ligado aguas abajo del ADN de Der fI E(-1)K.

(Cultivo de mohos koji recombinantes)

Se inocularon aproximadamente 106 conidios del moho koji recombinante obtenido niaD 300-Der fI con 20 ml de cada uno de los medios obtenidos como se describió anteriormente, respectivamente, y se cultivan con agitación a 30º C y 100 rpm durante 24 horas.

(Purificación de proteína recombinante Der fI E(-1)K)

Después de completarse el cultivo en líquido cada uno de los líquidos de cultivo se centrifugó a 3.000 x g y 4º C durante 10 minutos. Se añadió directamente endoglicosidasa Hf (Biolabs Company) en una concentración de 10 unidades/ml al sobrenadante de cultivo y se dejó reaccionar mientras se mantenía a 37º C durante 3 horas, para llevar a cabo de este modo el recorte de cadenas de sacáridos. Se pasó el líquido de reacción resultante a través de una columna de intercambio de aniones fuerte (nombre comercial: QMA, Waters Corporation) que se había equilibrado con solución de tampón fosfato 20 mM (pH 6,0) para absorber α-amilasa, una gran cantidad de la misma está presente en el líquido de reacción. Se añadió lisil endopeptidasa (Wako Pure Chemical Industries Inc.) a la fracción que había pasado sin ser absorbida por la columna de QMA de modo que la concentración final es de 10 µg/mol para escindir la secuencia de Der fIE(-1)Kpro. Después de esto se dializó el resultante frente a Tris-HCl 50 mM (pH 9,0) durante la noche a 4º C.

El concentrado así obtenido se cargó directamente en una columna DEAE-Sephacel (Amersham Bio-Sciences K.K.) que se había equilibrado con Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), y luego se lavó con Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) en una cantidad de 3 veces la de la columna. Subsiguientemente, la proteína recombinante madura Der fI E(-1)K que se había absorbido en la columna se eluyó usando gradiente de concentración de NaCl. Se detectó una fracción que contiene la proteína recombinante madura Der fI E(-1)K por análisis Western usando anticuerpo anti-Der fI para recoger fracciones que presentan alta pureza, y se usaron como una muestra purificada. La pureza de la muestra purificada se confirmó que es 90% o más por electroforesis en gel de sulfato de dodecilo-poliacrilamida (SDS-PAGE).

Se sometió la muestra purificada a un análisis cuantitativo de proteína usando kit de reactivo de ensayo de proteína BCA (Pierce Biotechnology, Inc.).

(Resultados) Rendimiento de proteína recombinante Der fI E(-1)K

Cuando se usó el medio DPY se obtuvo aproximadamente 8 mg de la proteína recombinante madura Der fI E(-)K por l del medio. Cuando se usó el medio líquido para mohos koji amarillos, se obtuvo aproximadamente 24 mg de la proteína recombinante madura Der fI E(-1)K por l del medio.

De esta manera se ha encontrado que de acuerdo con la presente invención se produjo una proteína recombinante en una cantidad de tres veces en una medida como la producida por el procedimiento de uso del medio DPY convencional.

La proteína recombinante Der fI E(-1)K presentaba una cadena de sacárido diferente de la de Der fI natural. Sin embargo, la proteína recombinante Der fI E(-1)K mostró la capacidad de unión a IgE y la irritación de la piel que eran equivalentes a los de la Der fI natural. Así pues, se usa la proteína recombinante como una alternativa a la Der fI natural para la preparación de anticuerpo, tratamiento de alergia y similares.

Ejemplo experimental 1 (medida de actividades del promotor de diversos genes de enzimas en mohos koji blancos para soju)

Con el fin de confirmar que promotores de diversos genes de enzima en mohos koji blancos se pueden usar para la presente invención, se midieron niveles de expresión de tales promotores con el siguiente procedimiento.

<Cepa que se va a usar> Aspergillus kawachii NBRC4308

<Condiciones de cultivo> La composición del medio fue como sigue: 2,0% de cebada perlada al 98% (Starling, producida en Australia), 0,2% de nitrato de sodio y 0,3% de dihidrogenofosfato de potasio (todos los valores están en peso/volumen). Se dispuso 100 ml del medio en un matraz cónico con deflectores de 500 ml, y se esterilizó con autoclave a 121º C durante 15 minutos. Se inocularon aproximadamente 106 conidios de Aspergillus kawachii NBRC4308 a 100 ml del medio obtenido como se describió anteriormente, y se cultivó con agitación a 37º C y 100 rpm durante 18 horas.

Para el control comparativo se llevó a cabo el cultivo con la misma composición del medio y condiciones de cultivo que se describieron anteriormente excepto que se usó cebada perlada al 65% o producto triturado de cebada perlada al 98% (ambos eran de Stirling, producidos en Australia) en el medio en lugar de la cebada perlada al 98%.

<Preparación de ARN completo> Una vez se completó el cultivo se recogieron rápidamente las células y se trituraron bien en presencia de nitrógeno líquido. A partir de las células de moho koji trituradas se preparó ARN completo usando un kit de extracción de ARN completo (es decir, mini kit RNeasy Plant, fabricado por QIAGEN) de acuerdo con su protocolo.

<Preparación de ADNc> A partir del ARN completo resultante se sintetizó ADNc usando un kit de archivo de ADNc de alta capacidad (fabricado por Applied Biosystems) de acuerdo con su protocolo.

<PCR a tiempo real cuantitativa> Se llevó a cabo PCR (reacción en cadena de la polimerasa) a tiempo de real cuantitativa usando el ADNc resultante como templado y usando los cebadores diseñados en base a las secuencias base de los genes del enzima de interés como se describió anteriormente, cuantificando así los niveles de expresión de los genes del enzima. Los cebadores usados en la PCR a tiempo real cuantitativa se diseñaron cada uno usando el software Primer Express (fabricado por Applied Biosystems). Las secuencias de cebador se representan específicamente como se describe a continuación. Se usó el gen H2A que codifica histona como el patrón interno para el procedimiento de cuantificación comparativa.

Se llevaron a cabo PCR y detección de señal usando SYBR Green PCR Master Mix (fabricado por Applied Biosystems) como reactivo para la PCR a tiempo real cuantitativa, de acuerdo con un protocolo anexo. La PCR y la detección de señal se llevaron a cabo usando ABI PRISM 7700 (fabricado por Applied Biosystems).

<Genes y secuencias de cebador que se usaron>

(1) Glucoamilasa gla-1 (derivado de Aspergillus kawachii, número de acceso a banco de genes D00427). Cebador directo: 1589-ccagctcgacctatagcagcat (Nº ID SEC: 1 en el listado de

secuencias).

Cebador inverso: 1761-aagtctgatggcgacgagct (Nº ID SEC: 2)

Se diseñó el par de los cebadores de modo que amplifica el fragmento de ADN

constituido de las bases 1.589 a 1.780 del gla-1 citado anteriormente (número de acceso al banco de genes D00427).

(2) α-amilasa asaA estable a ácido (derivado de Aspergillus kawachii, número de

acceso al banco de genes AB008370). Cebador directo: 994-cggcacggcagatgatc (Nº ID SEC: 3) Cebador inverso: 1044-gaatgtacctcatggtcgacgtc (Nº ID SEC: 4)

5 Se diseñó el par de cebadores de modo que amplifiquen el fragmento de ADN constituido por las bases 994 a 1.066 del asaA citado anteriormente (número de acceso al banco de genes AB008370).

(3) α-amilasa amyA (derivado de Aspergillus kawachii, número de acceso al banco de genes AB109452).

10 Cebador directo: 1874-acactcctgggcacattcg (Nº ID SEC: 5) Cebador inverso: 1989-ttacaccaacgacatagccct (Nº ID SEC: 6) Se diseñó el par de cebadores de modo que amplifica el fragmento de ADN constituido

por las bases 1.874 a 2.009 del amyA citado anteriormente (número de acceso al banco de genes AB109452). 15 (4) Histona H2A (derivado de Aspergillus niger, número de acceso al banco de genes

Y15320) Cebador directo: 289-actgaacaagctcctgggtca (Nº ID SEC: 7) Cebador inverso: 322-ccagggtggtgtcctcccc (Nº ID SEC: 8) Se diseñó el par de cebadores de modo que amplifica el fragmento de ADN constituido

20 por las bases 289 a 340 del H2A anteriormente citado (número de acceso al banco de genes Y15320).

<Resultados> Se cuantificaron niveles de expresión de los genes de enzima respectivos como valores relativos a un nivel de expresión de la histona H2A. La tabla 1 muestra los resultados. En los diagramas experimentales (la presente invención) en la que se usó cebada

25 perlada al 98%, los niveles de expresión de los genes respectivos aumentaron en comparación con los de los diagramas de control. Por tanto, se puso de manifiesto que los promotores de estos genes de enzima se usaron de forma efectiva en el procedimiento de producción de proteína recombinante de la presente invención. Tabla 1

Material de partida usado

Nivel de expresión

gla-1

La presente invención (cebada perlada al 98%) 8,49

Control 1 (producto triturado de cebada perlada al 98%)

3,95

Control 2 (cebada perlada al 65%)

2,35

asaA

La presente invención (cebada perlada al 98%) 2,89

Control 1 (producto triturado de cebada perlada 98%)

al 1,99

Control 2 (cebada perlada al 65%)

1,05

La presente invención (cebada perlada al 98%)

23,86

amyA

Control 1 (producto triturado de cebada perlada 98%) al 17,65

Control 2 (cebada perlada al 65%)

14,59

Ejemplo experimental 2 (medida de actividades del promotor de genes de enzima en mohos de koji negros para soju) Con el fin de confirmar que los promotores de diversos genes de enzimas en mohos de 5 koji negros se pueden usar para la presente invención, se midieron niveles de expresión de tales promotores con el siguiente procedimiento.

Esto es, se cultivó Aspergillus awamori NBRC4388 con el mismo procedimiento que en el ejemplo experimental 1. Después de esto se extrajo ARN completo de las células obtenidas tras completarse el cultivo de igual forma que en el ejemplo experimental 1, y se sintetizó

10 ADNc. Además se cuantificaron niveles de expresión de los genes de enzima de interés como se describe a continuación usando el ADNc resultante como templado de igual forma que en el ejemplo experimental 1. Las secuencias de cebador usadas en PCR a tiempo real cuantitativa eran como se describe a continuación. <Secuencias de genes y cebador que se usaron>

15 (1) α-amilasa amyA (la misma amyA que se describe en el ejemplo experimental 1) Se usó el mismo par de cebadores (Nº ID SEC: 5 y 6) que en el ejemplo experimental 1.

(2)

Proteasa ácida pepA (derivada de Aspergillus awamori, número de acceso al banco de genes M34454) Cebador directo: 793-ttttgggactggcctttagct (Nº ID SEC: 9 en el listado de secuencias) 20 Cebador inverso: 900-ttcttcgacaccgtcaagtcc (Nº ID SEC: 10)

El par de cebadores se diseñó de forma que amplifica el fragmento de ADN constituido por las bases 793 a 920 del pepA anteriormente citado (número de acceso al banco de genes: M34454).

(3)

Histona H2A (la misma H2A que se describe en el ejemplo experimental 1) 25 El mismo par de cebadores (Nº ID SEC: 7 y 8) que se usó en el ejemplo experimental 1.

<Resultados> Se cuantificaron niveles de expresión de los genes de enzima respectivos como valores relativos a un nivel de expresión de la histona H2A. La tabla 2 muestra los resultados. En los diagramas experimentales (la presente invención) en la que se usó cebada perlada al 98%, los niveles de expresión de los genes respectivos aumentaron en comparación con los de los diagramas de control. Por tanto, se puso de manifiesto que los promotores de estos genes de enzima se usaron de forma efectiva en el procedimiento de producción de proteína recombinante de la presente invención. Tabla 2

Material de partida usado

Nivel de expresión

amyA

La presente invención (cebada perlada al 98%) 19,1

Control 1 (producto triturado de cebada perlada al 98%)

0,1

Control 2 (cebada perlada al 65%)

0,3

La presente invención (cebada perlada al 98%)

2,4

pepA

Control 1 (producto triturado de cebada perlada al 98%) 0,7

Control 2 (cebada perlada al 65%)

1,5

Ejemplo experimental 3 (medida de actividades del promotor de genes de enzima en mohos koji amarillos para sake)

10 Con el fin de confirmar que promotores de diversos genes de enzima en mohos koji amarillos se pueden usar para la presente invención, se midieron niveles de expresión de tales promotores con el siguiente procedimiento. <Cepa que se va a usar> Aspergillus oryzae NRIB40 <Condiciones de cultivo> La composición del medio fue como sigue: 2,0% de cebada

15 perlada al 98% (Starling, producida en Australia), 1,2% de nitrato de sodio, 0,8% de cloruro de potasio, 0,4% de dihidrogenofosfato de potasio, 0,2% de sulfato de magnesio heptahidratado y 0,08% de sulfato de hierro heptahidratado (todos los valores están en peso/volumen). Se dispuso 100 ml del medio en un matraz cónico con deflectores de 500 ml, y se esterilizó con autoclave a 121º C durante 15 minutos. Se inocularon aproximadamente 106 conidios de

20 Aspergillus oryzae NIB40 a 100 ml del medio obtenido como se describió anteriormente, y se cultivó con agitación a 30º C y 100 rpm durante 42 horas. Para el control comparativo se llevó a cabo el cultivo con la misma composición del medio y condiciones de cultivo que se describieron anteriormente excepto que se usó cebada perlada al 65% o producto triturado de cebada perlada al 98% (ambos eran de Stirling,

25 producidos en Australia) en lugar de la cebada perlada al 98%.

Después de esto se extrajo ARN completo de las células obtenidas tras completarse el cultivo de igual forma que en el ejemplo experimental 1, y se sintetizó ADNc. Además se cuantificaron niveles de expresión de los genes de enzima de interés como se describe a continuación usando el ADNc resultante como templado de igual forma que en el ejemplo experimental 1. Las secuencias de los cebadores usadas en PCR a tiempo real cuantitativa eran como se describe a continuación.

Se usó el gen H4 que codifica la histona como el patrón interno para el procedimiento de cuantificación comparativa.

<Secuencias de genes y cebador que se usaron>

(1) Glucoamilasa glaA (derivada de Aspergillus oryzae, número de acceso al banco de genes D01035) Cebador directo: 1247-cgtgcagatcgtccaaacct (Nº ID SEC: 11 en el listado de

secuencias)

Cebador inverso: 1357-acttctcacggccaacaacc (Nº ID SEC: 12)

Se diseñó el par de cebadores para amplificar el fragmento de ADN compuesto por las

bases 1247 a 1376 del glaA anteriormente citado (número de acceso al banco de genes D01035).

(2) α-amilasa amyA (derivada de Aspergillus oryzae, número de acceso al banco de genes AB021876)

Cebador directo: 21762-cactcctgggcacattcgt (Nº ID SEC: 13)

Cebador inverso: 21875-gttacaccaacgacatagccctc (Nº ID SEC: 14)

Se diseñó el par de cebadores de forma que amplifica el fragmento de ADN constituido

por las bases 21.762 y 21.897 del amyA anteriormente citado (número de acceso al banco de genes AB021876).

(3) β-glucanasa celB (derivado de Aspergillus oryzae, número de acceso al banco de genes D83732)

Cebador directo: 1137-caaactgggaatgccacaaa (Nº ID SEC: 15)

Cebador inverso: 1187-tgaagacggagagaactattccatg (Nº ID SEC: 16)

Se diseñó el par de cebadores para amplificar el fragmento de ADN constituido por las

bases 1.137 a 1.211 del celB anteriormente citado (número de acceso al banco de genes D83732).

(4) Proteasa ácida pepA (derivada de Aspergillus oryzae, número de acceso al banco de

genes D13894) Cebador directo: 897-cgctagcaagattagcgatcagt (Nº ID SEC: 17) Cebador inverso: 958-gctttcagctcgatcaacactg (Nº ID SEC: 18)

Se diseñó el par de cebadores para amplificar el fragmento de ADN constituido por las bases 897 a 979 del pepA anteriormente citado (número de acceso al banco de genes D13894).

(5) Histona H4 (derivado de Aspergillus oryzae, número de acceso al banco de genes

5 AB033943) Cebador directo: 110-cgtgacaacatccagggtatca (Nº ID SEC: 19) Cebador inverso: 171-tcaagcgtatctctgccatga (Nº ID SEC: 20) Se diseñó el par de cebadores para amplificar el fragmento de ADN constituido por las

bases 110 a 191 del H4 anteriormente citado (número de acceso al banco de genes 10 AB033943).

<Resultados> Se cuantificaron niveles de expresión de los genes de enzima respectivos como valores relativos a un nivel de expresión de la histona H4. La tabla 3 muestra los resultados. En los diagramas experimentales (la presente invención) en la que se usó cebada perlada al 98%, los niveles de expresión de los genes respectivos aumentaron en comparación

15 con los de los diagramas de control. Por tanto, se puso de manifiesto que los promotores de estos genes de enzima se usaron de forma efectiva en el procedimiento de producción de proteína recombinante de la presente invención. Tabla 3

Material de partida usado

Nivel de expresión

glaA

La presente invención (cebada perlada al 98%) 0,31

Control 1 (producto triturado de cebada perlada 98%)

al 0,04

Control 2 (cebada perlada al 65%)

0,10

La presente invención (cebada perlada al 98%)

21,0

amyA

Control 1 (producto triturado de cebada perlada 98%) al 3,3

Control 2 (cebada perlada al 65%)

9,3

La presente invención (cebada perlada al 98%)

0,018

celB

Control 1 (producto triturado de cebada perlada 98%) al 0,003

Control 2 (cebada perlada al 65%)

0,006

La presente invención (cebada perlada al 98%)

0,15

pepA

Control 1 (producto triturado de cebada perlada 98%) al 0,07

Control 2 (cebada perlada al 65%)

0,05

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento de proteína recombinante de producción en masa mediante uso de moho koji como huésped. Los mohos koji se cultivan en medios económicos, y no requieren equipos de cultivo especiales, de modo que se produce la proteína deseada a bajo coste. Además, los moho koji se han usado para la producción de alimentos y bebidas fermentadas desde hace mucho tiempo, y son muy seguros como huésped, y las proteínas recombinantes resultantes se pueden usar para diversos fines.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Asahi Breweries, LTD

<120> Procedimiento de producción de proteína recombinante

<130> P181680Y

<150> JP2005-297732

<151> 2005-10-12

<150> JP2006-080477

<151> 2006-03-23

<160> 20

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 22

<212> ADN

<213> Aspergillus kawachii

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 20

<212> ADN

<213> Aspergillus kawachii

<400> 2 <210> 3

imagen1

<211> 17

<212> ADN

<213> Aspergillus kawachii

<400> 3

imagen1

<210> 4

<211> 23

<212> ADN

<213> Aspergillus kawachii

<400> 4

imagen1

<210> 5

<211> 19

<212> ADN

<213> Aspergillus kawachii

<400> 5

imagen1

<210> 6

<211> 21

<212> ADN

<213> Aspergillus kawachii

<400> 6

imagen1

<210> 7

<211> 21

<212> ADN

<213> Aspergillus niger

<400> 7 <210> 8

imagen1

<211> 19

<212> ADN

<213> Aspergillus niger

<400> 8

imagen1

<210> 9

<211> 21

<212> ADN

<213> Aspergillus awamorii

<400> 9

imagen1

<210> 10

<211> 21

<212> ADN

<213> Aspergillus awamorii

<400> 10

imagen1

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<400> 11

imagen1

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<400> 12 <210> 13

imagen1

<211> 19

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<400> 13

imagen1

<210> 14

<211> 23

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<400> 14

imagen1

<210> 15

<211> 20

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<400> 15

imagen1

<210> 16

<211> 25

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<400> 16

imagen1

<210> 17

<211> 23

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<400> 17

imagen1

<210> 18

<211> 22

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<400> 18

imagen1

<210> 19

<211> 22 10 <212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

<400> 19

imagen1

15 <210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> Aspergillus oryzae

imagen2

25

30

Claims (3)

1. Un procedimiento de producción de proteína recombinante que usa los mohos koji recombinantes que se obtienen introduciendo el producto obtenido por ligadura de un gen que codifica una proteína de interés aguas debajo de un promotor de un gen que codifica cualquier enzima seleccionado del grupo constituido por glucoamilasa, α-amilasa estable a ácidos, αamilasa y proteasa ácida, en mohos koji blancos o mohos koji negros como huésped, o usando los mohos koji recombinantes que se obtienen introduciendo el producto obtenido por ligadura de un gen que codifica una proteína de interés aguas abajo de un promotor de un gen que codifica cualquier enzima seleccionado del grupo constituido por glucoamilasa, α-amilasa, βglucanasa y proteasa ácida, en mohos koji amarillos como huésped, que comprende:

cultivo de mohos koji recombinantes en un medio líquido que contiene el material de partida de cultivo compuesto por cebada y/o trigo, cuya superficie se encuentra completa o parcialmente cubierta con cascarilla, procurando que queden excluidos productos triturados; y

recogida de la proteína recombinante del producto de cultivo.

2.

El procedimiento de producción de la proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cebada y/o trigo cuya superficie se encuentra completa o parcialmente cubierta con cascarillas es cebada perlada que presenta una relación de perlado no inferior a 93%.

3.

El procedimiento de producción de proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el material de partida de cultivo se compone de cebada cuya superficie se encuentra completa o parcialmente cubierta con cascarillas, procurando que queden excluidos productos triturados.