ES2351893T3 - Composición polipeptídica hip/pap para su utilización en la regeneración hepática y para la prevención de la insuficiencia hepática. - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica para su utilización en la estimulación de la regeneración hepática in vivo, la protección contra la insuficiencia hepática crónica/aguda o la protección contra la apoptosis de hepatocitos, que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el resto del aminoácido 36 y termina en el resto del aminoácido 175 de la secuencia SEC. ID. nº 1, en combinación con por lo menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la utilización de la proteína asociada a la pancreatitis/hepatocarcinoma-intestino-páncreas humana (HIP/PAP) para estimular la regeneración hepática y también para la prevención de la insuficiencia hepática.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

La insuficiencia hepática se produce en numerosas enfermedades clínicas agudas y crónicas, incluyendo la hepatotoxicidad provocada por medicamentos, infecciones víricas, lesión vascular, enfermedad autoinmunitaria, o traumatismo contuso. Además, los pacientes sometidos a metabolopatía congénita pueden estar en situación de riesgo de desarrollar insuficiencia hepática. Los síntomas de la insuficiencia hepática que aparecen como resultado de estos cuadros clínicos incluyen, por ejemplo, la hepatitis fulminante aguda, hepatitis crónica o cirrosis, y en muchos casos, el restablecimiento de la función normal del hígado es vital para la supervivencia de los pacientes. Por ejemplo, la cirrosis es la séptima causa de muerte y la cuarta causa de muerte relacionada con la enfermedad en personas entre las edades de 25 a 44. (Fuente: American Liver Foundation).

En la hepatopatía aguda, el hígado puede regenerarse después de lesionarse. Si la enfermedad evoluciona más allá de la capacidad del hígado para regenerar nuevas células, el metabolismo de todo el cuerpo resulta gravemente afectado. La pérdida de la función hepática puede producir inestabilidad metabólica combinada con la interrupción de las funciones esenciales del cuerpo (es decir, el suministro de energía, el equilibrio ácido-base y la termorregulación). Si no desaparecen rápidamente, se producen complicaciones tales como la hemorragia incontrolable y septicemia, y los órganos dependientes, como el cerebro y los riñones dejan de funcionar a causa de subproductos tóxicos o porque el hígado no está sintetizando ya nutrientes importantes. Tras grandes lesiones en el hígado, el tejido hepático pierde sus funciones regenerativa y metabólica, y el trasplante de hígado es una estrategia terapéutica utilizada habitualmente. Sin embargo, la aplicación clínica del trasplante de hígado resulta limitada por la disponibilidad de hepatocitos humanos, tejido hepático y el número de las células hepáticas que pueden trasplantarse de forma segura al mismo tiempo. Por otra parte, la latencia antes de la intervención quirúrgica y las complicaciones posquirúrgicas podrían ser críticas para contrarrestar la fase aguda de insuficiencia hepática. Otra estrategia terapéutica consiste en la hepatectomía parcial (extirpación de una parte del hígado). Las indicaciones más típicas de la hepatectomía parcial son el tumor maligno, el carcinoma hepatocelular o las enfermedad proliferativa biliar incluyendo el colangiocarcinoma. Los tumores pueden ser primarios (desarrollados en el hígado) o metastásicos (desarrollado en otro órgano y luego emigrados al hígado). La mayoría de las metástasis hepáticas proceden del colon. Un tumor individual o más de un tumor confinado en el lado izquierdo o derecho del hígado pueden ser ectomizados con éxito con una supervivencia de 5 años hasta de un 60%. Las hepatectomías parciales realizadas en pacientes con enfermedad extrahepática pueden aliviar los síntomas causados por el tumor, pero ofrecen poca mejoría en la supervivencia. Los tumores benignos del hígado (adenoma, y hiperplasia focal nodular) también pueden ser controlados con éxito por hepatectomía parcial. Las hepatectomías parciales se realizan también en personas dispuestas a donar parte de su hígado.

Teniendo en cuenta la importancia del trasplante hepático y de la hepatectomía parcial, se han sugerido varias estrategias para estimular la regeneración hepática y suprimir o limitar la insuficiencia hepática en caso de hepatectomía parcial o de trasplante.

Se cree que la célula hepática es controlada por diversas citocinas estimuladoras del crecimiento e inhibidoras del crecimiento de origen autocrino o paracrino, sin embargo, la función exacta y el mecanismo de acción de estos factores de crecimiento está lejos de ser entendido en su totalidad. Las citocinas son péptidos o proteínas segregados que regulan el metabolismo intermediario de aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos y minerales. Las citocinas son péptidos o proteínas que actúan para mediar la inflamación y están involucrados en la proliferación celular que modula la comunicación intracelular y en la adhesión de células inflamatorias a las paredes de los vasos y a la matriz extracelular. Las citocinas son esenciales para la comunicación entre el hígado y las zonas extrahepáticas y dentro del propio hígado. Las citocinas interactúan con hormonas tales como los glucocorticoides, dando como resultado una compleja red de control mutuo. Muchas citocinas ejercen actividad de crecimiento, además de sus efectos proinflamatorios específicos. El hígado es un importante sitio de síntesis de citocinas y el órgano principal de purificación de varias citocinas. En la hepatopatía, las citocinas están involucradas en la aparición de respuestas inmunitarias intrahepáticas, en la regeneración del hígado y en la transformación fibrótica y cirrótica del hígado.

Se cree además que las células del hígado deben controlarse por varios factores de crecimiento. Los factores de crecimiento son necesarios para regular los episodios de desarrollo o son necesarios para regular la expresión de genes que codifican otras proteínas segregadas que pueden participar en la comunicación intracelular y en la coordinación del desarrollo e incluyen, el factor de crecimiento insulinoide I y II (IGF I y II), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento transformante tipo a y tipo b (TGF-α y TGF-β) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF).

Se ha demostrado que factores de crecimiento tales como TGFα o EGF estimulan la síntesis de ADN in vitro en hepatocitos aislados. Una proteína adicional, llamada factor de crecimiento hepático (HGF) ha demostrado ser un mitógeno para los hepatocitos primarios.

Basándose en estas observaciones, se ha propuesto que estos factores pueden ser importantes mediadores de la regeneración del hígado. En consecuencia, factores de crecimiento como TGFα, EGF o HGF con actividades similares a las del factor de crecimiento se han indicado en el tratamiento de la regeneración del hígado. Sin embargo, se ha sugerido que estas estrategias terapéuticas, estimulan la regeneración hepática y suprimen la insuficiencia hepática, no se ha demostrado su eficacia sin toxicidad ni efectos adversos. Es decir, estos factores de crecimiento favorecen la evolución del tumor (Gang-Hong, et al., 1992 ; Lee, 1992; Horiguchi, et al. 2002).

En consecuencia, sigue existiendo necesidad en esta materia de un procedimiento eficaz que estimule la regeneración del hígado, que proteja contra la insuficiencia hepática, y resulte privado de los efectos tóxico y tumorígeno adversos. Esta necesidad existe en cualquier población de pacientes en los que se ha producido daño hepático. Esta necesidad existe no sólo para los pacientes trasplantados, sino también para los donantes y los pacientes sometidos a hepatectomía parcial. Además, existe necesidad todavía en esta materia de nuevos compuestos terapéuticamente útiles, que estimulen la regeneración hepática.

Además, teniendo en cuenta la escasa disponibilidad de donantes de órganos, el trasplante hepático parcial de donante vivo es reconocido como una medida para superar la falta de órganos, y facilita el trasplante hepático parcial. Sin embargo, el trasplante hepático parcial no puede considerarse como una operación segura para los adultos que representan la mayoría de los pacientes de trasplante debido a que el peso del hígado ectomizable de los donantes suele ser inferior al peso del hígado necesario para los receptores. Por lo tanto existe necesidad de un medio para la regeneración segura y rápida del hígado para pequeños injertos.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un medio para la estimulación de la regeneración hepática después de la hepatectomía parcial. Un objetivo de la presente invención consiste también en proporcionar un fármaco que puede estimular la regeneración del hígado o de crecimiento de hepatocitos después del trasplante del hígado, tal como el trasplante hepático parcial, y también después de la aparición de una enfermedad que produce insuficiencia hepática, tales como cirrosis, hepatitis aguda y hepatitis crónica .

Estos y otros objetivos resultarán evidentes para el experto en la materia.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en el descubrimiento experimental de que HIP/PAP ejerce efectos in vitro sobre hepatocitos en el cultivo primario. Por otra parte, HIP/PAP es una molécula mitógena y antiapoptósica para los hepatocitos, in vivo, durante la insuficiencia hepática y la regeneración hepática. La presente invención, se basa además, en el descubrimiento experimental de que HIP/PAP no presentan efectos adversos en mamíferos.

Un primer objeto de la invención consiste en una composición farmacéutica para estimular la regeneración del hígado in vivo que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con 90% de identidad de aminoácidos estando constituido el polipéptido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el resto de aminoácido 36 y que acaba en el resto de aminoácido 175 de la SEC. ID. nº 1, en combinación con por lo menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para estimular la regeneración del hígado in vivo que comprende una cantidad eficaz de proteína asociada a la pancreatitis/hepatocarcinoma-intestino-páncreas humana (HIP/PAP) de secuencia SEC. ID. nº 1, en combinación con por lo menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica con efectos adversos limitados en la necrosis hepática que comprende:

(i)

una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto hepatotóxico.

(ii)

una cantidad eficaz contra la lesión hepática de un polipéptido definido anteriormente.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Representación esquemática del transgén.

El potenciador (2 kb) y el activador (0,3 kb) de las zonas reguladoras del gen de albúmina de ratón están indicados en líneas de puntos. Los exones II, III, IV, V, VI y los intrones del gen HIP/PAP humano (1,6 kb) están indicados por recuadros negros y líneas de puntos, respectivamente. El fragmento poli A de la hormona de crecimiento bovina (1021-1235 del pcADN 3.1 está indicado por una línea de puntos. El ADN plásmido está indicado por la línea gruesa. Las secuencias de restricción relevantes están indicadas por flechas.

Figura 2. Inmunodetección de la proteína HIP/PAP.

A. Inmunohistoquímica: modificación original x 20, 1 hígado natural, 2 hígado HIP/PAP transgénico, 3 hepatocitos naturales, 4 hepatocitos HIP/PAP.

B. Inmunotransferencia Western hibridada con HIP/PAP y anticuerpos de actina que muestran una banda con el tamaño de 16 kDa y 45 kDa esperado, respectivamente. Banda 1, proteína HIP/PAP purificada (10 ng), bandas 2, 3 y 4 hígado natural; cepas 27 y 24 homocigóticas de hígado transgénico HIP/PAP, respectivamente; banda 5, 6 y 7 hepatocitos HIP/PAP 27 y 24 naturales, después del aislamiento, respectivamente.

Figura 3. Transcurso de tiempo de la regeneración hepática in vivo tras la hepatectomía parcial.

A. Inmunodetección de núcleos positivos a BrU, en hígados naturales (1, 2, 3, 4) y transgénicos HIP/PAP, respectivamente (5, 6, 7 y 8); 1 y 5 24 horas, 2 y 6 36 horas, 3 y 7 46 horas y 4 y 8 55 horas tras hepatectomía.

B. Cada gráfico de recuadro comprende cinco líneas horizontales que representan los 10º, 25º, 50º, 75º percentiles de una variable. Todos los valores de la variable superior al percentil 90º e inferior al percentil 10º están representados independientemente, de modo que los gráficos de recuadro son valiosos para la aclaración de cualquier valor atípico. Ratones naturales (n = 9) y ratones transgénicos HIP/PAP (n = 10) (p = 0,0014).

C. Se midieron los pesos del hígado en ratones normales y no hepatectomizados. Se calculó la relación en peso de hígado/cuerpo y se expresó como porcentaje medio ± SD. No hubo ninguna diferencia en esta relación entre los dos grupos (0,0460 ± 0,0064, n = 12 y 0,0489 ± 0,0035, n = 16 para ratones naturales y transgénicos con HIP/PAP, respectivamente). El porcentaje de recuperación medio del peso de hígado normal (± sd) en ratones naturales (O) y HIP/PAP (■) en varios puntos de tiempo después de la hepatectomía parcial presenta recuperación estimulada en el ratón transgénico con HIP/PAP (se practicó hepatectomía a 5 a 9 ratones en cada tiempo para cada grupo). La diferencia fue estadísticamente significativa a las 48 horas (p < 0,001), 60 horas (p < 0,003) y 96 horas (p < 0,002).

Figura 4. Síntesis de ADN en hepatocitos naturales y transgénicos con HIP/PAP.

A. Inmunodetección de hepatocitos positivos a BrU a las 60 horas, natural (a), HIP/PAP (b) (ampliación original x200). Los valores presentados son la media ± SD de cultivos independientes de 12 ratones de cada genotipo.

B. Transcurso de tiempo de la síntesis del ADN en hepatocitos estimulados por EGF (30 ng.ml-1), natural (O), HIP/PAP (■).

C. Síntesis de ADN en hepatocitos cultivados 60 horas después de colocación en placas: factores de crecimiento (EGF 30 ng.ml-1), HIP/PAP 40 ng.ml-1) se añadieron después del acoplamiento de las células. Se añadió forscolina durante las últimas 16 horas. Los datos de 4 a 20 experimentos se presentaron como media ± SD (□) natural, (■) HIP/PAP.

Figura 5. HIP/PAP inhibe la apoptosis inducida por TNF-α + ActD en hepatocitos primarios cultivados.

A. Reducción de TNF-α en función de la dosis en la viabilidad celular en hepatocitos naturales (□) y transgénicos (■) con HIP/PAP. Los datos presentados son la media ± s.e.m. de cultivos independientes con cuatro replicados de cinco ratones de cada genotipo.

B. Se trataron los hepatocitos como se indicó durante 17 horas, natural (□), HIP/PAP (■). Los histogramas representan los valores medios ± s.e.m. de tres experimentos por separado con cuatro réplicas.

C. Se tiñieron nucleos picnóticos de hepatocitos todavía acoplados con Hoechst 33258 (ampliación x400). Las flechas indican las características de los cuerpos apoptósicos organizados en las características “rosetas” de la apoptosis de hepatocitos provocada por TNF-α, natural (1,3,5) HIP/PAP (2,4,6) cultivos de referencia: sin adición (1 y 2), 2 ng ml-1 de TNF-α + ActD (3 y 4), 20 ng ml-1 TNF-α

+ ActD (5 y 6).

Figura 6. Estimulación de la regeneración hepática en ratones SCID trasplantados con hepatocitos de ratones naturales o transgénicos con HIP/PAP.

A. Evaluación macroscópica de los hígados de ratones SCID, trasplantados con hepatocitos de ratones naturales o transgénicos con HIP/PAP y sacrificados 7 días después de la hepatectomía.

B. Representaciones en casillas de los pesos de hígados de ratones SCID trasplantados con hepatocitos 7 días después de la hepatectomía. Se observó una diferencia significativa (p = 0,0008) entre los SCID trasplantados con hepatocitos naturales frente a los SCID trasplantados con hepatocitos HIP/PAP utilizando la prueba de Mann-Whitney.

Figura 7. Estimulación de la regeneración hepática en ratones SCID mediante la proteína HIP/PAP.

Gráficos de casilla de los pesos del hígado de ratones SCID inyectados por vía intraesplénica 36 horas después de la hepatectomía parcial con las proteínas HIP/PAP (600 ng/ratón) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) (100 µl). Se sacrificaron los ratones 7 días después de la hepatectomía. Se observó una diferencia significativa (p = 0,0022) entre los SCID inyectados con proteína HIP/PAP frente a los SCID inyectados con PBS, utilizando la prueba de Mann-Whitney.

Figura 8. La inyección de proteína HIP/PAP estimula la regeneración hepática en ratones C57.

Se ha comparado el efecto de la proteína HIP/PAP frente a la solución salina inyectada inmediatamente después de la hepatectomía parcial de C57BI6, en el restablecimiento de la masa hepática, la incorporación de BrdU y la mitosis, 46 horas después de la hepatectomía parcial. Se presentan los gráficos de casilla que representan la masa hepática, la incorporación de BrdU y la mitosis. Una prueba de Mann-Whitney se ha realizado, y p < 0,05 se considera estadísticamente significativa.

Figura 9. Análisis estadístico de la población de ratones según BrdU y mitosis.

La distribución es estadísticamente diferente entre los grupos, que están definidos según la media combinada para la incorporación de BrdU y la mitosis 46 horas después de la hepatectomía parcial.

Figura 10. Expresión de citocinas hepáticas en el hígado de ratones trasplantados tras la hepatectomía.

Se ha comparado la expresión de citocinas en el hígado a T0 de PHX (hepatectomía parcial) y después de 46 horas de ratones SCID trasplantados con HIP/PAP frente a hepatocitos de referencia. La metodología de protección de Rnasa permitió comparar en el mismo experimento linfotoxina-β (LTβ), TNF-α y TGF-β en una mezcla de 4 extractos HIP/PAP de hígado de ratones transgénicos bandas a y b; las bandas c y d de ratones SCID a T0 (bandas a y c) y a T46 horas después de PHX (bandas b y d). El análisis densitométrico cuantificó las señales que habían sido normalizadas frente a dos genes constitutivos (L32 y GAPDH). Las concentraciones de ARNm se han medido también en extractos de hígado. El gráfico representa para cada grupo de ratones la media L32 y el contenido de ARNm con GAPDH.

Figura 11. Activación de stat 3 tras la hepatectomía.

Se midió a lo largo del tiempo la acumulación/degradación de fosfo-STAT3 nuclear en ratones transgénicos HIP/PAP frente a ratones C57BI6, durante las primeras 24 horas después de hepatectomía parcial (Figura 11). Se detectó activación tan pronto como 1 hora después de PHX en HIP/PAP pero no en C57BI6 (p = 0,02). Además, la activación de STAT3 volvió a las concentraciones más bajas en ratones HIP/PAP que en ratones C57BI6 (p = 0,04), tan pronto como 12 horas. Los resultados se validaron y se observaron por análisis de inmunotransferencia Western con anticuerpos anti-STAT3 fosforilados.

Figura 12. Los ratones transgénicos HIP/PAP están protegidos contra la insuficiencia hepática aguda provocada por acetaminofeno (APAP).

La supervivencia de ratones transgénicos HIP/PAP hembra (hembras Tg HIP) y ratones transgénicos HIP/PAP machos (machos Tg HIP) tratados con una dosis letal de APAP (acetaminofeno) (1000 mg.kg-1), se ha comparado con la supervivencia de ratones C57BI6 de referencia (machos y hembras CT C57BI6), tratados con APAP o PBS. Una diferencia significativa en la supervivencia se observó entre ratones transgénicos HIP/PAP inyectados con APAP frente a ratones C57BI6 de referencia inyectados con APAP. HIP/PAP tiene además un efecto preventivo contra la intoxicación por APAP.

Figura 13. HIP/PAP no presenta efectos tóxicos durante el seguimiento a largo plazo in vivo.

Ratones HIP/PAP transgénicos (activadores de metaltioneína) se cruzaron con ratones WHV/c-myc en los que la expresión específica del hígado de c-myc dirigida por las secuencias reguladoras de la hepatitis de marmota (WHV) produce cáncer de hígado en todos los animales. Las curvas de supervivencia demostraron que el T50 de ratones bitransgénicos era de 60 semanas (n = 87 ratones) frente a 42 semanas para el T50 de oncoratones WHV/c-myc (n = 39 ratones). Las curvas de supervivencia eran idénticas para ratones transgénicos HIP/PAP y para referencias negativas de la camada. Por tanto, en primer lugar, la toxicidad de la proteína HIP/PAP durante la vida de estos ratones no se ha detectado y el comienzo de HCC se retrasa en los ratones que llevan ambos transgenes, es decir, WHV/c-myc y HIP/PAP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Se ha descubierto según la invención que HIP/PAP ejerce efectos mitógenos y antiapoptósicos in vitro sobre hepatocitos en el cultivo primario. Por otra parte, HIP/PAP es una molécula mitógena y antiapoptósica para los hepatocitos, in vivo durante la insuficiencia hepática y la regeneración hepática.

El gen de la proteína asociada a la pancreatitis/hepatocarcinoma-intestinopáncreas humana (HIP/PAP) se identificó debido a su aumento de expresión del 25% del carcinoma hepatocelular humano utilizando análisis de inmunotransferencia Northern (Lasserre et al., 1992). Se ha demostrado que la proteína HIP/PAP se detecta en pacientes normales en el intestino (células de Paneth y neuroendoctina) y en el páncreas (células acinosas pancreáticas e islotes de Langerhans). La proteína HIP/PAP se detecta también en algunas células hepáticas precursoras potenciales en torno al área de la vena porta del hígado normal (Christa et al., 1999). HIP/PAP se expresa rápidamente durante la fase aguda de la pancreatitis. Actúa también como molécula de adhesión para hepatocitos de rata e interactúa con las proteínas de la matriz extracelular tales como laminina-1 y fibrolectina. Esta proteína contiene un supuesto péptido señal y por tanto pertenece al grupo VII de la familia lectina tipo C, según la clasificación de Drickamer y análisis estructural (Abergel et al., 1999).

Actualmente, se ha descubierto que la regeneración del hígado se estimula, in vivo, en ratones que expresan el gen de HIP/PAP humano, tras la hepatectomía parcial. Además, se ha descubierto según la invención que HIP/PAP ejerce un efecto mitógeno también in vitro en hepatocitos del cultivo primario. En otro aspecto, se ha descubierto también según la invención que HIP/PAP ejerce un efecto antiapoptósico contra la apoptosis inducida por TNF-α combinado con actinomicina D en hepatocitos de cultivo primario. Se ha demostrado también según la invención que los hepatocitos que expresan HIP/PAP de manera recombinante provocan la regeneración del hígado, cuando se inyectan localmente en ratones con hepatectomía parcial. Se ha demostrado que la proteína HIP/PAP cuando se inyecta a ratones a los que se ha sometido a hepatectomía parcial, provoca la regeneración del hígado. Teniendo en cuenta estas observaciones, se ha demostrado que la proteína HIP/PAP proporciona efectos mitógenos y anti-apoptósicos eficaces y protege contra la insuficiencia hepática in vivo, no presenta efectos desfavorables y está particularmente exenta de cualquier efecto carcinógeno, en contraste con los factores de crecimiento conocidos en la materia tales como HGF, TGFα o EGF, descritos anteriormente.

Considerados en conjunto, estos resultados demuestran la importancia terapéutica de HIP/PAP en la regeneración del hígado. Por tanto, estos resultados experimentales han permitido diseñar composiciones farmacéuticas para estimular la regeneración hepática in vivo, que comprende una cantidad eficaz de la proteína (HIP/PAP) asociada al hepatocarcinoma-intestino-páncreas/pancreático humano de secuencia SEC. ID. nº 1, en combinación con un excipiente fisiológicamente aceptable por lo menos.

Un primer objeto de la invención consiste en una composición farmacéutica para estimular la regeneración del hígado in vivo que incluye, después de la insuficiencia hepática crónica/aguda, que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el resto 36 de aminoácido y que acaba en el resto 175 de aminoácidos de la secuencia SEC. ID. nº 1, en combinación con un excipiente fisiológicamente aceptable por lo menos.

La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende un fragmento de polipéptido de HIP/PAP, que es eficaz para la regeneración del hígado. Este polipéptido de secuencia que empieza en el resto 36 de aminoácido y que acaba en el resto 175 de aminoácidos de la SEC. ID. nº 1, consta de una parte biológicamente activa de la proteína HIP/PAP que se ha descrito anteriormente como una secuencia de dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) (Christa et al., 1994).

En una primera forma de realización preferida, la composición farmacéutica de la invención comprende una parte biológicamente activa de HIP/PAP como se describió en la presente memoria, que puede ser aislada de las fuentes celulares o tisulares mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas habituales de purificación de proteínas.

En otra forma de realización preferida de dicha composición farmacéutica la parte biológicamente activa de HIP/PAP es producida por técnicas de ADN recombinante, tales como las descritas en los ejemplos. Según una tercera forma de realización preferida, la parte biológicamente activa de HIP/PAP se sintetiza químicamente utilizando técnicas habituales de síntesis de péptidos.

Una parte de HIP/PAP biológicamente activa aislada o purificada está sustancialmente exenta de material celular o de otras proteínas de contaminación procedentes de la célula o de la fuente tisular de la que procede HIP/PAP, o sustancialmente exenta de precursores químicos cuando se sintetiza químicamente.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, las secuencias se alinean para la comparación óptima. Por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de entre una primera y una segunda secuencia de aminoácidos para la alineación óptima y las secuencias no homogéneas pueden ser despreciadas para su comparación.

Para una óptima comparación, el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, puede conseguirse con CLUSTAL W (versión 1.82) con los siguientes parámetros: (1) MODO CPU = ClustalW mp; (2) ALINEACIÓN = “full”; (3) FORMATO DE SALIDA = “ain w/numbers”; (4) ORDEN DE SALIDA = “aligned”; (5) ALINEACIÓN DE COLOR = “no”; (6) KTUP (word size) = “default”; (7) LONGITUD DE VENTANA = “ default”; (8) TIPO DE PUNTUACIÓN = “percent”; (9) TOPDIAG = “default”; (10) PAIRGAP = “default”; (11) ÁRBOL FILOGENÉTICO/TIPO DE ARBOL = “none”; (12) MATRIZ = ”default”; (13) HUECO ABIERTO = “default”; (14) HUECOS FINALES = “default”; (15) EXTENSIÓN DEL HUECO = “default (16) DISTANCIAS DEL HUECO = “default”; (17) TIPO DE ÁRBOL = “cladogram” y (18) DISTANCIAS HUECO ARBOL = “hide”.

Las partes biológicamente activas de HIP/PAP incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a la secuencia de aminoácidos completa de HIP/PAP de la SEC. ID. nº 1, que incluyen el mismo número de aminoácidos que la HIP/PAP completa, y presentan por lo menos la misma actividad biológica que HIP/PAP.

Las partes biológicamente activas de HIP/PAP incluyen además péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a la secuencia de aminoácidos completa de HIP/PAP de la SEC. ID. nº 1, que incluyen más aminoácidos que la HIP/PAP completa, y presentan por lo menos la misma actividad biológica que HIP/PAP.

“Misma actividad biológica”, tal como se aplica a los péptidos biológicamente activos homólogos a HIP/PAP, hace referencia en la presente memoria a los péptidos que provocan regeneración hepática in vivo del mismo orden de magnitud que la HIP/PAP completa, como un experto en la materia puede determinar fácilmente, por ejemplo, midiendo la incorporación de BrdU por hepatocitos y midiendo el restablecimiento de la masa del hígado como se muestra en el Ejemplo 2.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la parte biológicamente activa de HIP/PAP comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% de identidad con el polipéptido de secuencia que comienza en el resto 36 de aminoácidos y acaba en el resto 175 de aminoácidos de la secuencia SEC. ID. nº 1. Según la invención una primera secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 90% de identidad con una segunda secuencia de aminoácidos comprende por lo menos el 90%, y preferentemente por lo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad en aminoácidos con dicha segunda secuencia de aminoácidos.

Los polipéptidos según la invención comprenden además variantes, tal como la secuencia CRD de diferentes mamíferos, y por ejemplo, de la proteína de la hebra pancreática bovina (BPTP) o la proteína 1 asociada a la pancreatitis (PAP1) de la rata descrita por Orelle, et al.

Además de las variantes alelas naturales de la parte biológicamente activa de las secuencias de HIP/PAP que existen en mamíferos, el experto en la materia apreciará además que pueden introducirse cambios por mutación en la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº 1, conduciendo de este modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de HIP/PAP sin alterar la actividad biológica de HIP/PAP.

Además, pueden introducirse sustituciones de aminoácidos no esenciales en las secuencias correspondientes a HIP/PAP. Un resto de aminoácidos “no esenciales” es un resto de aminoácidos que puede alterarse a partir de la secuencia natural de HIP/PAP sin alterar la actividad biológica, mientras que se necesita un resto de aminoácido “esencial” para la actividad biológica.

Un segundo objeto de la invención consiste en una composición farmacéutica para estimular la regeneración del hígado in vivo, que comprende un polipéptido de secuencia que comienza en el resto 36 de aminoácidos y que acaba en el resto 175 de aminoácidos de la secuencia SEC. ID. nº 1, en combinación con por lo menos un excipiente biológicamente aceptable.

Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica para estimular la regeneración hepática in vivo que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el resto 27 de aminoácidos y que acaba en el resto 175 de aminoácidos de la secuencia SEC. ID. nº 1, en combinación con por lo menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

Un objeto adicional de la invención es una composición farmacéutica según la reivindicación 1 que comprende una cantidad eficaz del polipéptido que consta de la secuencia de aminoácidos que comienza en el resto 27 de aminoácidos y que acaba en el resto 175 de aminoácidos de la secuencia SEC. ID. nº 1, en combinación con por lo menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

Otro objeto de la invención consiste en una composición farmacéutica para estimular la regeneración del hígado in vivo que comprende una cantidad eficaz de la proteína asociada al hepatocarcinoma-intestino-páncreas/pancreático humano (HIP/PAP) combinada con por lo menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

Sin desear estar vinculado a ninguna teoría en particular, se cree que la proteína HIP/PAP completa de secuencia SEC. ID. nº 1, es decir, un polipéptido que comprende la secuencia CDR, un péptido señal y un propéptido, conduce a un plegamiento mejor de dicha proteína, particularmente cuando dicha proteína se produce mediante técnicas de ADN recombinante en células eucarióticas que han sido transfectadas con una casete de expresión que la codifica. A propósito un plegamiento correcto de la HIP/PAP terapéuticamente activa puede conducir a una mejor eficacia biológica para la composición farmacéutica que comprende dicha proteína, para la regeneración del hígado en comparación con una composición que comprende solamente una parte de la proteína.

En una forma de realización preferida, HIP/PAP tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº 1. En otras formas de realización, HIP/PAP es sustancialmente idéntica a la SEC. ID. nº 1 y conserva la misma actividad biológica, para la regeneración hepática, cuando se compara con la proteína de secuencia SEC. ID. nº 1, pero difiere en la secuencia de aminoácidos debido a las variaciones alélicas naturales o a la mutagenia. Según, otra forma de realización HIP/PAP es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 90%, y preferentemente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC. ID. nº 1.

La invención también comprende HIP/PAP híbrida o proteínas de fusión. Tal como se utiliza en la presente memoria, una proteína híbrida o una proteína de fusión comprende los polipéptidos citados anteriormente que están fusionados a un polipéptido sin HIP/PAP. En la proteína de fusión el polipéptido con HIP/PAP y el polipéptido sin HIP/PAP se fusionan entre sí. El polipéptido sin HIP/PAP puede fusionarse al terminal N o al terminal C del polipéptido HIP/PAP.

Por ejemplo, en una forma de realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-HIP/PAP en la que la secuencia HIP/PAP se fusiona al terminal C de la secuencia GST. Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de HIP/PAP recombinante.

En todos los casos las proteínas de fusión de la invención procesan la misma actividad biológica que HIP/PAP de SEC. ID. nº 1.

Dos rutas diferentes desencadenan la regeneración hepática, una produce la replicación de hepatocitos diferenciados o células biliares después de la hepatectomía parcial o la ligadura del conducto biliar (Fausto et al., 1994, Fausto et al., 2000). La segunda ruta degenerativa se desencadena después del daño tóxico, en la necrosis extensa o carcinogénesis, cuando la proliferación de hepatocitos o células biliares se altera o ralentiza por esta lesión (Factor VM, et al., Petersen B, et al., (1998), Akhurst B, et al.). En estas condiciones, se ha propuesto que las células “similares a las madre” proliferan y se diferencian en hepatocitos y células epiteliales biliares, y a continuación repoblan el hígado. En los roedores, las denominadas células ovales representan un comportamiento celular heterogéneo en el que las subpoblaciones bien definidas tienen todavía que aislarse. En los seres humanos, los comportamientos de las células ovales pueden participar en la repoblación del hígado después de la necrosis extensa aguda, y se han identificado además en hepatopatías crónicas (Roskams T, et al., Sell S, et al.). Como se utiliza en la presente memoria, la frase “regeneración del hígado” se refiere al proceso mediante el cual las células “parecidas a las madre” proliferan y se diferencian en hepatocitos y células epiteliales biliares, y a continuación repoblan el hígado así como la replicación de hepatocitos y células epiteliales biliares.

La expresión “cantidades biológicamente activas” se refiere a la cantidad de composición según la presente invención suficiente para tratar enfermedades hepáticas asociadas a un número decreciente de hepatocitos, en el que la regeneración hepática conducida por HIP/PAP puede restablecer la función hepática.

La regeneración hepática conducida por HIP/PAP puede ser útil en varias situaciones tales como cirugía, trasplante, enfermedades y después de la exposición a compuestos hepatóxicos que conduce a la necrosis hepática o a la necrosis hepática parcial.

En primer lugar, las composiciones farmacéuticas según la invención son adecuadas en el tratamiento de insuficiencia hepática aguda y crónica.

La insuficiencia hepática aguda está producida generalmente por una apoptosis/necrosis extensa de hepatocitos, y representa una condición devastadora de origen vírico o tóxico. La insuficiencia hepática aguda es provocada principalmente por la hepatitis vírica (aproximadamente el 70% de los casos), por envenenamiento con fármacos, por ejemplo con acetominofeno durante el intento de suicidio.

La insuficiencia hepática crónica que puede tratarse mediante las composiciones según la invención, puede ser provocada por infecciones del virus de la hepatitis B o C o por alcohol. La hepatitis B crónica, la cirrosis, pero también la hepatopatía grasa no alcohólica (NAFLD). La NAFLD es un término recientemente seleccionado para describir un síndrome clínico y patológico que se extiende en un espectro desde la esteatosis simple a la esteatohepatitis no alcohólica (NASH).

Por consiguiente, las composiciones según la invención son adecuadas en el tratamiento de la insuficiencia hepática, siguientes a enfermedades tales como: hepatitis B, hepatitis C, anomalías del ciclo de urea, hipercolesterolemia familiar, cirrosis inducida por alcohol, enfermedad de almacenamiento de glucógeno, hepatitis autoinmunitaria, hiperoxaluria primaria de tipo I, cirrosis criptogénica, síndrome de Crigler-Najjar de tipo I, cirrosis hepática congénita, enfermedad de Neimann-Pick, cirrosis biliar primaria, amiloidosis familiar, atresia biliar, carcinoma hepatocelular, colangitis esclerosante primaria, hepatoblastoma, síndrome de alagilia, hemangioendotelioma, colestasis familiar, neuroendocrina no carcinoide, insuficiencia hepática inducida por fármacos, tumor de hígado benigno tal como los tumores hepáticos de hiperplasia nodular focal, tales como el carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma, insuficiencia hepática aguda/fulminante, síndrome de Budd-Chiari, insuficiencia de alfa-1-antitripsina, enfermedad de Wilson, hemocromatosis, tirosinemia, protoporfiria y fibrosis quística.

Las composiciones según la invención son adecuadas en el tratamiento de todas las situaciones patológicas de una exposición a compuestos hepatotóxicos.

Numerosos compuestos hepatotóxicos, incluyendo alcohol, virus, tales como VBH, VCH o VIH, hongos, tales como amanita phaloides, parásitos tales como Plasmodium falciparum) o determinados productos terapéuticos, provocan citotoxicidad y necrosis hepática. Entre estos productos terapéuticos, los autores pueden dar a conocer anestésicos, tal como Enflurane, neuropsicotrópicos tales compuesto hidrazidas, anticonvulsionantes tales como ácido valproico, analgésicos tales como Acetaminofen, antimicrobianos tales como Anfotericina B o Penicilina, hormonas tales como acetohexamidas, fármacos cardiovasculares tales como Papaverina, inmunosupresores y antineoplásicos, tales como asparaginasa, fármacos contra la hipertensión, fármacos antiinflamatorios y fármacos varios tales como vitamina A, Oxifenisatina e ión yoduro.

Aunque el mecanismo exacto de la hepatoxicidad es incierto, estos compuestos tienen efectos perjudiciales sobre el metabolismo de los hepatocitos y contribuye a la necrosis de tejido hepático y a la aparición de la insuficiencia hepática.

Especialmente como se muestra en el Ejemplo 9, las composiciones farmacéuticas según la invención son adecuadas en el tratamiento de la insuficiencia hepática producida por acetominofeno, y tienen un efecto preventivo contra la intoxicación por acetominofeno.

Un objeto adicional de la invención consiste en un kit con efecto desfavorable limitado sobre la necrosis que comprende:

(i)

una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto hepatotóxico,

(ii)

una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el 90% de identidad del aminoácido con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que empieza en el resto de aminoácido 36 y que acaba en el resto de aminoácido 175 de la secuencia SEC. ID. nº 1.

La invención también comprende un kit que comprende un fragmento polipeptídico de HIP/PAP, la fracción biológicamente activa de HIP/PAP de la proteína HIP/PAP completa como se definió anteriormente. El compuesto hepatotóxico de la composición puede ser uno de los mencionados anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas según la invención son también adecuadas en el tratamiento de la insuficiencia hepática, sucesiva a la hepatectomía y al trasplante de hígado. La composición farmacéutica según la invención puede administrarse al donante de un trasplante de hígado, al receptor de dicho trasplante, a los pacientes después de una hepatectomía, para prevenir la creación o evolución de la insuficiencia hepática estimulando la regeneración del hígado.

Al estimular la regeneración del hígado, las composiciones de la invención tienen otros efectos beneficiosos. Entre ellos, se pueden mencionar la oportunidad de hacer el trasplante de hígado y el trasplante de hígado parcial con gran eficacia y también la oportunidad de estimular la regeneración del hígado ex vivo, por ejemplo estimular el crecimiento de un trasplante de hígado, las células epiteliales del hígado, las células madre del hígado o las células HIP/PAP genéticamente modificadas antes del trasplante.

Especialmente, las composiciones farmacéuticas según la invención pueden formularse en una forma galénica adecuada para los trasplantes de hígado, preferentemente un medio líquido en el que HIP/PAP se disuelve o se pone en suspensión.

La frase “insuficiencia hepática” se utiliza en la presente memoria en el sentido más amplio, envejecimiento indica cualquier lesión estructural o funcional resultante directa o indirectamente de un número disminuido de células epiteliales del hígado, es decir hepatocitos y células biliares.

La expresión “trasplante de hígado” tiene el significado corriente en la materia envejecimiento incluye el trasplante de hígado parcial y total en el que un hígado de un donante se le practica la hepatectomía total o parcial y se trasplanta parcial o totalmente en un receptor. El trasplante de hígado parcial se clasifica por el modo de operación en trasplante de hígado ortotópico parcial, trasplante de hígado heterotópico parcial, y similares y la presente invención puede aplicarse a cualquiera de ellos. En el trasplante de hígado parcial, un trasplante de hígado o un trasplante de hígado parcial de un donante correspondiente a aproximadamente del 30 al 50% del volumen de hígado normal de un receptor se trasplanta por lo general como un trasplante en el receptor a cuyo hígado se le ha practicado la hepatectomía completamente. Pero la presente invención tiene el efecto de favorecer la regeneración del hígado o el desarrollo de hepatocitos envejecimiento incluso si el trasplante es de aproximadamente el 30% o menos.

El trasplante de hígado parcial es de particular importancia, con respecto a la reducción significativa de donantes de órganos cadavéricos, asociados a un crecimiento exponencial del número de pacientes en listas de espera en todo el mundo y al éxito del trasplante de hígado de donante vivo (LDLT) en recipientes pediátricos. En la práctica, la falta de injertos de hígado cadavéricos o de igual tamaño ha conducido al desarrollo del trasplante de hígados de donante vivo reducido, dividido. Aunque la regeneración sucede rápidamente en el hígado trasplantado, los pacientes que experimentan injertos de hígado de donante vivo reciben una masa hepática mas pequeña que los que reciben un trasplante cadavérico, y recíprocamente en el síndrome de pequeño de tamaño ha aumentado en los últimos años. Los trasplantes de hígado de tamaño pequeño pueden ser definidos por un síndrome clínico reconocido que procede del trasplante de una masa de hígado funcional insuficientemente grande en un receptor designado, y representa el mayor obstáculo de trasplantes del donante vivo en adultos (Heaton, 2003). Un trasplante para la relación en peso corporal del receptor inferior a 0,8 altera el influjo venoso resultante en la hipertensión de la vena porta y mejora las demandas metabólicas en pacientes con una deficiencia de enfermedad clínica. La división de los hígados en trasplantes del lóbulo derecho e izquierdo aumenta los riesgos potenciales de pequeño tamaño en el receptor. Estos puntos se consideran como un factor principal que produce el síndrome de tamaño pequeño, lo que da lugar a la regeneración del hígado alterada y a a la necrosis del injerto pequeño. Ya que la incompatibilidad por tamaño es un obstáculo principal para el adulto vivo, en relación con el trasplante de hígado, la reducción del impacto con SFSS utilizando las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente optimizara la utilización de órganos disponibles y reducirá la morbilidad general y la mortalidad.

Tal como se utiliza en la presente memoria “trasplante de hígado” significa un hígado trasplantado en el receptor mediante la operación de trasplante tal como se describió anteriormente, y también incluye el denominado “trasplante de hígado parcial” correspondiente a un trasplante consistente en la parte del hígado de un donante. El trasplante de hígado significa también la inyección de hepatocitos (genéticamente modificados o estimulados para proliferar o diferenciarse en la vena porta).

Tal como se utiliza en el caso de trasplante de hígado, la frase “regeneración del hígado” significa cambios morfológicos en los que los tejidos de hígado perdidos son sustituidos por el crecimiento de hepatocitos de un trasplante de hígado o de un trasplante de hígado parcial, pero incluye también cambios bioquímicos tales como la mejora, recuperación o normalización de funciones hepática. Los pacientes específicos que han de ser tratados por la composición de la invención incluyen por ejemplo pacientes que recibieron el trasplante de hígado parcial una vez que el hígado ha sido hepatectomizado completamente para tratar la insuficiencia hepática producida por enfermedades hepáticas tales como la hepatitis, la cirrosis hepática o alcohólica, de virus, fármacos o causa desconocida o por cáncer hepático.

Las composiciones farmacéuticas según la invención son también adecuadas en el tratamiento de la insuficiencia hepática que sigue a la reperfusión por isquemia hepática (I/R) que continúa siendo una limitación significativa para tanto la hepatectomía como para el trasplante de hígado, y puede ser responsable de la insuficiencia hepática, de la lesión pulmonar y de la muerte.

Aunque la parte siguiente de la memoria se refiere específicamente a la formulación de las composiciones que comprenden la proteína HIP/PAP, es también adecuada para las composiciones terapéuticas que comprenden fragmentos de polipéptidos o fracciones biológicamente activas de HIP/PAP.

En aras de la presente invención, HIP/PAP puede formularse según los procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por lo que HIP/PAP se combina en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington’s Pharmaceutical Science, 16ª ed.; 1980, Mack publishing Co, editada por Oslo et al.

“Excipiente fisiológicamente aceptable” hace referencia a la carga, diluyente o sustancia sólida o liquida, que puede utilizarse con seguridad en la administración general

o tópica. Dependiendo de la vía específica de administración, una variedad de vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica incluyen cargas, diluyentes hidrótopos, agentes tensioactivos y sustancias de encapsulación, sólidos o líquidos.

Estas composiciones contendrán por lo general una cantidad eficaz de la proteína HIP/PAP, por ejemplo, del orden de aproximadamente 6 µg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, junto con una cantidad adecuada de vehículo para preparar las composiciones farmacéuticamente adecuadas para la administración eficaz al paciente.

HIP/PAP puede administrarse por vía parenteral o por otros métodos que aseguran su suministro al torrente sanguíneo de una forma eficaz. HIP/PAP puede preferentemente administrarse utilizando una vía intrahepática. Las dosis y las concentraciones farmacéuticas deseadas de dichas composiciones farmacéuticas pueden oscilar dependiendo de la utilización específica prevista. Una dosis eficaz típica en experimentos con ratones es de aproximadamente 30 µg/kg. El escalamiento entre especies de las dosis puede realizarse de manera conocida en la materia, p, ej., como se describe en Mordenti et al., Pharmaceut Res. 8, pág. 1351 (1991).

El pH de la formulación depende principalmente del tipo específico y de la concentración de proteína HIP/PAP, pero principalmente varia en cualquier parte desde aproximadamente 3 a aproximadamente 8.

Las composiciones específicamente muy adecuadas para la administración clínica de HIP/PAP incluyen soluciones acuosas estériles o polvos hidratables estériles tales como proteína liofilizada. Por lo general, una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable se utiliza también en la formulación para hacer isotónica la formulación.

La esterilidad se consigue fácilmente mediante filtración estéril a través de membranas (0,2 micras).

La composición farmacéutica de la proteína HIP/PAP se formulará, dosificará y administrará de modo coherente con las buenas prácticas médicas. Los factores para la consideración en este concepto incluyen el trastorno específico que se está tratando, el mamífero concreto que está siendo tratado, la enfermedad clínica del paciente, la causa del trastorno, el punto de administración del agente, el método de administración, la posología de administración y otros factores conocidos por los médicos especialistas.

La “cantidad terapéuticamente eficaz” de la proteína HIP/PAP que ha de administrarse estará controlada por dichas consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para provocar o alternativamente incrementar la regeneración del hígado y prevenir la insuficiencia hepática. Dicha cantidad es inferior preferentemente a la cantidad que es tóxica para el mamífero o hace al mamífero significativamente más sensible a las infecciones.

El término “administración” o “administrada” tal como se utiliza en la presente memoria en referencia a la proteína HIP/PAP se refiere a la administración de la proteína HIP/PAP que sucede antes, a la vez o después de la hepatectomía, o un trasplante de hígado.

Composiciones celulares según la invención

Un objeto de la invención es una composición que comprende dividir hepatocitos en combinación con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos comenzando en el resto 36 de aminoácidos y acabando en el resto 175 de aminoácidos de la secuencia SEC. ID. nº 1.

Otro objeto de la invención es una composición que comprende hepatocitos que han sido transfectados con una casete de expresión que conduce la expresión de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos comenzando en el resto 36 de aminoácidos y acabando en el resto 175 de aminoácidos de la secuencia SEC. ID. nº 1.

Una casete de expresión que dirige la expresión de un polipéptido descrito anteriormente puede obtenerse por ejemplo como se describe en el apartado titulado “ratones transgénicos que expresan HIP/PAP en el hígado”.

Los hepatocitos como los utilizados en la presente memoria, se recogen directamente de un hígado, o se obtienen de células madre y particularmente de células madre de la médula ósea en hepatocitos ha sido descrita por Petersen et al., (1999) y Mitchell et al. El recurso a dichas células madre de la médula ósea puede evitar el recurso a la hepatectomía para obtener cultivos de hepatocitos in vitro.

Otro objeto de la invención es una composición que comprende una cantidad eficaz de células madre de medula ósea en combinación con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene 90% de identidad de aminoácido con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el resto 36 de aminoácidos y que acaba en el resto 175 de aminoácidos de la secuencia SEC. ID. nº 1.

Sin desear estar vinculado por ninguna teoría en particular, se cree que la administración de células madre de la medula ósea tratadas con HIP/PAP a un paciente puede acelerar el proceso de regeneración del hígado.

Las composiciones celulares descritas anteriormente pueden utilizarse para cultivo in vitro a largo plazo de hepatocitos, por ejemplo, para los ensayos celulares in vitro. La disponibilidad de las composiciones celulares anteriores impide un recurso recurrente para la hepatectomía destinado a obtener cultivos de hepatocitos in vitro. La invención comprende además composiciones farmacéuticas para estimular la regeneración del hígado in vivo que comprende una cantidad eficaz de una composición definida en la presente, anteriormente.

En las formas de realización preferidas de la presente invención, el polipéptido de las composiciones mencionadas anteriormente se reemplaza por un fragmento polipeptídico de HIP/PAP, una parte biológicamente activa de HIP/PAP de la proteína HIP/PAP completa definida en la presente memoria.

Procedimiento según la invención

Otro objeto de la invención es un procedimiento para estimular el crecimiento de hepatocitos in vitro que comprende:

a) recolectar hepatocitos

b) cultivar dichos hepatocitos en un medio de cultivo apropiado

c) tratar dichos hepatocitos con una cantidad mitógena de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el resto 36 de aminoácidos y que acaba en el resto 175 de aminoácidos de la secuencia SEC. ID. nº 1.

“Cantidad mitógena” hace referencia a que los hepatocitos se tratarán con una cantidad suficiente del polipéptido definido en la presente memoria antes de provocar crecimiento de hepatocitos cuando se añade en un cultivo de hepatocitos. Generalmente, una “cantidad mitógena” tal como se especificó anteriormente, consiste en una cantidad de dicho polipéptido que provoca proliferación de los hepatocitos cultivados, como puede determinarse fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, mediante incorporación de BrdU como se da a conocer en los ejemplos.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para estimular el crecimiento de hepatocitos in vitro que comprende:

(a)

recolectar hepatocitos;

(b)

cultivar dichos hepatocitos en un medio de cultivo apropiado;

(c)

transfectar dichos hepatocitos con una casete de expresión que conduce la expresión de la proteína HIP/PAP en dichas células hepáticas.

Las etapas (a) a (c) pueden realizarse según las técnicas dadas a conocer en el Ejemplo 5 y en la correspondiente apartado en el apartado “materiales y procedimientos”.

La frase “recolectar hepatocitos”, tal como se utiliza en la presente memoria, significa que los hepatocitos se recogen directamente de un hígado, o significa que se obtienen directamente de células madre y particularmente de células madre que se han diferenciado en hepatocitos. La diferenciación de células madre de la médula ósea en hepatocitos ha sido descrita por Petersen et al., (1999) y Mitchell et al. El recurso a dichas células madre de la médula ósea puede evitar el recurso a la hepatectomía para obtener cultivos de hepatocitos in vitro. Por tanto, otro objeto de la invención es un procedimiento para la estimulación del crecimiento de hepatocitos in vitro que comprende:

(a)

recolectar las células madre de la médula ósea;

(b)

cultivar dichas células madre de la médula ósea en un medio de cultivo apropiado;

(c)

tratar dichas células madre de la médula ósea con una cantidad mitógena de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el aminoácido 36 del resto y acaba en el aminoácido 175 del resto de la secuencia SEC. ID. nº 1.

Sin desear estar vinculado por ninguna teoría en particular, se cree que el tratamiento descrito anteriormente aumenta la capacidad de las células madre de la medula ósea para regenerar el hígado. En las formas de realización preferidas de la presente invención, el polipéptido del procedimiento mencionado anteriormente se reemplaza por un fragmento de polipéptido de HIP/PAP, una parte biológicamente activa de HIP/PAP o la proteína HIP/PAP entera tal como se define en la presente memoria.

Utilización según la invención

Otro objetivo de la presente invención consiste en utilizar un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que empieza en el resto 36 de aminoácidos y que acaba en el resto 175 de aminoácidos de la secuencia SEC. ID. nº 1 en la preparación de una composición farmacéutica para estimular la regeneración hepática in vivo.

Otro objetivo de la invención consiste en utilizar un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que empieza en el resto 36 de aminoácidos y que acaba en el resto 175 de aminoácidos de la secuencia SEC. ID. nº 1 en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención de la implantación o evolución de la insuficiencia hepática en un paciente en situación de riesgo de desarrollar o que ha sido diagnosticado de insuficiencia hepática.

La invención comprende asimismo la utilización de fragmentos de polipéptido de HIP/PAP y fragmentos biológicamente activos de HIP/PAP como se definió anteriormente.

En una forma de realización preferida, la insuficiencia hepática es una consecuencia de una hepatectomía, un trasplante de hígado o hepatitis.

En otro aspecto de la invención, la utilización según la invención se refiere a un paciente en situación de riesgo de desarrollar o que ha sido diagnosticado de insuficiencia hepática producida por una enfermedad comprendida en el grupo constituido por: hepatitis B, hepatitis C, anomalías del ciclo de urea, hipercolesterolemia familiar, cirrosis provocada por alcohol, enfermedad de almacenamiento de glucógeno, hepatitis autoinmunitaria, hiperoxaluria primaria de tipo I, cirrosis criptogénica, síndrome de Crigler-Najjar de tipo I, cirrosis hepática congénita, enfermedad de Neimann-Pick, cirrosis biliar primaria, amiloidosis familiar, atresia biliar, carcinoma hepatocelular, colangitis esclerosante primaria, hepatoblastoma, síndrome de alagilia, hemangioendotelioma, colestasis familiar, neuroendocrina no carcinoide, insuficiencia hepática inducida por fármacos, tumor de hígado benigno tales como los tumores hepáticos de hiperplasia nodular focal, tales como el carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma, insuficiencia hepática aguda/fulminante, síndrome de Budd-Chiari, insuficiencia de alfa-1-antitripsina, enfermedad de Wilson, hemocromatosis, tirosinemia, protoporfiria y fibrosis quística.

Procedimientos según la invención

Otro objeto de la invención es un procedimiento para estimular la regeneración del hígado que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que empieza en el aminoácido 36 del resto y acaba en el aminoácido 175 del resto de la secuencia SEC. ID. nº 1 a un paciente.

En una forma de realización preferida el procedimiento según la invención, comprende un procedimiento que comprende administrar una cantidad eficaz de fragmentos de polipéptidos de HIP/PAP, fracciones biológicamente activas de HIP/PAP de la proteína HIP/PAP completa como se define en la presente memoria.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para el tratamiento de un paciente con un agente terapéutico hepatotóxico eficaz en la prevención o el tratamiento de un trastorno o de estados fisiológicos patológicos, que comprende:

(a) administrar a dicho paciente simultáneamente o en orden opcional, una dosis biológicamente eficaz de dicho agente terapéutico y una cantidad eficaz de manera preventiva de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que empieza en el aminoácido 36 del resto y acaba en el aminoácido 175 del resto de la secuencia SEC. ID. nº 1.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para la prevención de la implantación o evolución de la insuficiencia hepática, consecuencia de una hepatectomía, un trasplante de hígado o una hepatitis que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que empieza en el aminoácido 36 del resto y que acaba en el aminoácido 175 del resto de la secuencia SEC. ID. nº 1.

Según el procedimiento anterior, el polipéptido sea administra antes, durante o después de la hepatectomía o de un trasplante de hígado. El polipéptido puede administrarse también al donante del trasplante de hígado, o al receptor, con objeto de evitar por ejemplo las complicaciones posquirúrgicas. Según el procedimiento anterior, el polipéptido utilizado es un fragmento de HIP/PAP, una fracción biológicamente activa de HIP/PAP o la proteína HIP/PAP completa, tal como se define en la presente memoria.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para estimular la regeneración del hígado en un paciente que comprende:

(a)

recolectar hepatocitos de dicho paciente;

(b)

cultivar dichos hepatocitos en un medio de cultivo apropiado;

(c)

tratar dichos hepatocitos con una cantidad mitógena de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el aminoácido 36 del resto y que acaba en el aminoácido 175 del resto de la secuencia SEC. ID. nº 1 y;

(d)

inyectar dichas células en dicho paciente.

“Cantidad mitógena” significa que los hepatocitos serán tratados con una cantidad suficiente del polipéptido definido en la presente memoria antes de provocar una regeneración del hígado cuando se inyecta en un paciente. Generalmente, “cantidad mitógena”, tal como se especificó anteriormente consiste en una cantidad de dicho polipéptido que provoca la proliferación de los hepatocitos cultivados, como puede determinarse fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo mediante la incorporación de BrdU como se da a conocer en los ejemplos.

Las etapas (a) a (d) puede realizarse según las técnicas dadas a conocer en el Ejemplo 5 y en la correspondiente sección en el apartado “material y procedimientos”. En una forma de realización preferida, el método comprende las etapas adicionales:

(e)

Controlar en dicho paciente la indicación de la insuficiencia hepática, y

(f)

Continuar las inyecciones según la etapa (d) hasta que dicha regeneración del hígado sea suficiente.

Otro objeto de la invención es un procedimiento para estimular la regeneración del hígado en un paciente que comprende:

(a)

recolectar hepatocitos de dicho paciente;

(b)

cultivar dichos hepatocitos en un medio de cultivo apropiado;

(c)

transfectar dichos hepatocitos con una casete de expresión que conduce la expresión de la proteína HIP/PAP en dichas células hepáticas, y

(d)

inyectar dichas células en dicho paciente.

Una casete de expresión que conduce la expresión de un polipéptido tal como se describió anteriormente puede obtenerse por ejemplo, como se describe en el apartado titulado “ratones transgénicos que expresan HIP/PAP en el hígado”.

Un objeto adicional de la invención es un procedimiento para estimular la regeneración del hígado en un paciente que comprende:

(a)

recolectar células madre de la médula ósea de dicho paciente;

(b)

cultivar dichas células madre de la médula ósea en un medio de cultivo apropiado;

(c)

tratar dichas células con una cantidad mitogénica de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el aminoácido 36 del resto y que acaba en el aminoácido 175 del resto de la secuencia SEC. ID. nº 1; y

(d)

inyectar dichas células obtenidas en la etapa (c) en dicho paciente.

La disponibilidad del procedimiento anterior evita un recurso recurrente para la hepatectomía destinado a obtener cultivos de hepatocitos in vitro. Sin desear estar ligado por ninguna teoría en particular, los inventores creen que la administración de células madre de medula ósea tratadas con HIP/PAP a un paciente puede acelerar el proceso de regeneración del hígado.

Las etapas (a) a (d) pueden realizarse según las técnicas dadas a conocer en el ejemplo 5 y en el correspondiente apartado en el apartado “materiales y procedimientos”. En una forma de realización preferida, el método comprende etapas adicionales:

(e)

Controlar en dicho paciente la indicación de la insuficiencia hepática, y

(f)

Continuar las inyecciones según la etapa (e) hasta que dicha regeneración del hígado sea suficiente.

En otra forma de realización, la invención se refiere a un procedimiento para la prevención de la implantación o evolución de la insuficiencia hepática en un paciente en situación de riesgo de desarrollar o que ha sido diagnosticado de hepatitis vírica o autoinmunitaria, o de cirrosis que comprende administrar a dicho paciente una cantidad preventiva para la insuficiencia hepática de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que empieza en el aminoácido 36 del resto y que acaba en el aminoácido 175 del resto de la secuencia SEC. ID. nº 1.

En otra forma de realización preferida del procedimiento anterior, el polipéptido utilizado es un fragmento de HIP/PAP, una fracción biológicamente activa de HIP/PAP de la proteína HIP/PAP completa como se define en la presente memoria.

La invención se refiere también a HIP/PAP, como ingrediente activo de una composición para estimular la regeneración hepática in vivo, que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido que consta de la secuencia de aminoácidos que comienza en el resto del aminoácido 36 y acaba en el resto del aminoácido 175 de la secuencia SEC. ID. nº 1, en combinación con al menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

Se proporcionan a continuación más detalles de la invención en los ejemplos siguientes no limitativos.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Producción y purificación de HIP/PAP

Se produjo HIP/PAP en leche de ratón transgénico que lleva el gen WAP de conejo capaz de dirigir la expresión del gen HIP/PAP en la glándula mamaria, como fue descrito anteriormente por los inventores (Christa et al., 2000).

Se generaron ratones transgénicos portadores del montaje WAP/HIP por microinyección en cigotos de ratón de una célula de cepas híbridas de C57BI/6xCBA. Se identificaron por análisis de ADN de la cola en inmunotransferencia Southern. El ADN de ratón se digirió con Sacl, y los fragmentos generados se separaron en geles de agarosa al 1% y se transfirieron a Nytran 13N. La presencia del transgén fue detectada utilizando un fragmento XhoI de 4,4-kb procedente de una zona corriente arriba del gen WAP de conejo.

Todos los experimentos incluyendo la protección de los animales y condiciones para la manipulación de animales antes del sacrificio, se condujeron según el Ministerio Francés de directivas de Agricultura (fechado el 19 de abril de 1988).

Muestras de leche

Se recogió leche el día 13 después del parto de ratones anestesiados inyectados previamente con 0,05 U de oxitocina para estimular la bajada de la leche. La leche de ratón se diluyó (1/10) en Tris/HCl 10 mM pH 7,5, CaCl2 100 mM y se centrifugó durante 30 min a 40.000 g. Se descartó el sedimento y se centrifugó el sobrenadante otra vez en las mismas condiciones. Se utilizó el sobrenadante o lactosuero inmediatamente para la purificación de HIP/PAP o se mantuvo congelado a 20ºC.

Purificación de la proteína HIP/PAP de leche de ratón transgénico

El lacto suero resultante (véase anteriormente) se acidificó a pH 4,6 mediante adición de ácido acético (1 M) en agitación a 0ºC durante 30 min. El material precipitado se retiró por centrifugación a 110.000 g durante 1 h en un agitador 50.2 Ti de Beckman (Gagny, Francia). El sobrenadante se dializó durante la noche a 4ºC frente a 1 l de tampón de acetato sódico 20 mM pH 4,8, se clarificó por centrifugación a alta velocidad como anteriormente, y se filtró en un filtro Millex de 0,22 µm (Millipore, Guyancourt, Francia) antes de cargar en una columna de intercambio iónico Mono S HR 5/5 previamente equilibrada con tampón de acetato sódico 70 mM pH 4,8. Se descargó flujo a través, y un gradiente de 20 ml de NaCl 0-500 mM en el tampón de operación se inició cuando la absorbancia volvió a la línea de referencia. El caudal de la columna fue de 1 ml.min-1 y se recogieron fracciones de 1 ml. Las fracciones que contenían HIP/PAP se mezclaron, se diluyeron en 5 vol. de tampón de acetato sódico 140 mM a pH 4,0 y se volvieron a aplicar a la columna Mono S HR 5/5 equilibrada con tampón de acetato de sodio 140 mM pH 4,0. Se descargó flujo a través y la columna se reveló con un gradiente de 20 ml oscilando desde 0 a 400 mM de NaCl en tampón de operación. El caudal de la columna fue de 1 ml/min y se recogieron fracciones de 1 ml. Se mezclaron las fracciones que contenían HIP/PAP, se diluyeron en 1 vol. de glicerol y se guardaron a 20ºC.

Las concentraciones de proteína en las muestras se determinaron utilizando el análisis de proteínas de Peterson. Se realizaron geles de poliacrilamida desnaturalizantes en dodecilsulfato sódico (acrilamida al 12,5%, SDS/PAGE) según Laemmli. Se exploraron geles con tinción azul Coomassie y se cuantificaron utilizando un imagemaster.

Animales

Ratones transgénicos que expresan HIP/PAP en el hígado

La zona reguladora del gen 18 de albúmina de ratón se clonó corriente arriba del fragmento génico de HIP/PAP para conducir una expresión génica de HIP/PAP humana especialmente en el hígado tal como se describe en la Figura 1. El montaje Notl/Kpnl linealizado completo se microinyectó en cigotos de ratón monocelulares de cepas híbridas en el Departamento de Experimentación en Transgénesis (Villejuif, Francia). Las estirpes transgénicas homocigóticas 24 y 27 se desarrollaron en fundadores independientes en antecedentes genéticos. Las condiciones de protección de los animales para la manipulación de los animales antes del sacrificio y todos los procedimientos experimentales se garantizaron en línea con el Ministro francés de Directivas de Agricultura (el día 19 de abril de 1988).

Ratones de referencia

Ratones C57BL/6 fueron suministrados por IFFA CREDO (L’Arbresle Francia) y se utilizaron como referencia de ratones transgénicos HIP/PAP.

Receptores de hepatocitos aislados

Se utilizaron ratones con inmunodeficiencia grave combinada (SCID) hembra con seis semanas de vida (IFFA CREDO, L’Arbresle Francia) como receptores de cepas de hepatocitos procedentes de ratones transgénicos machos HIP/PAP o ratones C57BL/6 macho (IFFA CREDO, L’Arbresle Francia), para minimizar cualquier riesgo de rechazo celular.

Hepatectomía parcial e incorporación de BrdU in vivo

La hepatectomía parcial representa el 70% de la masa de hígado total como describen Higgins y Anderson (Higgins et al.) en ratones de dos meses. Los animales recibieron una inyección intraperitoneal de 60 mg de BrdU por kg de peso corporal en NaCl al 0,9% durante 2 horas antes de la disección. Se sacrificaron 24, 36, 46 y 55 horas después de la hepatectomía. Los animales y los hígados se pesaron y se puntuaron los núcleos marcados con BrdU después de la incubación con anticuerpo anti-BrdU (clon Bu 2OA) y se realizó el revelado utilizando un kit universal de peroxidasa de rábano picante LSAB2 (Dako) con por lo menos 20 campos de microscopio de baja ampliación (x10) para cada portaobjetos con hígado (Olympus BX60). Se identificaron más de 1600 núcleos por portaobjetos.

Hepatocitos en cultivo primario

Se aislaron hepatocitos de ratones de 2 a 3 meses, como se describió anteriormente (Klaunig et al., Renton et al.) con Liderase Blendzime. Se purificaron los hepatocitos viables utilizando un método de centrifugación de Percoll de isodensidad a baja velocidad, como describe (Kreamer et al.).

Se volvieron a poner en suspensión las células en medio 199 que contiene penicilina, estreptomicina, fungisona, albúmina de suero bovino (0,1%) y suero de ternero fetal (10%), a densidades de 2 x 105 y 4 x 105 para proliferación y experimentos apoptósicos respectivamente en placas Primarias. Las células se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada y el medio se cambió después del acoplamiento a las placas durante 2 y 3 horas. Después del acoplamiento, se enjuagaron las células una vez y se cultivaron con el mismo medio que no contenía suero y a continuación se expusieron a ActD (0,05 µg.ml-1) más TNF-α a intervalos de concentración desde 0,2 a 40 ng/ml durante 17 a 18 horas, a menos que se especifique de otra manera en las leyendas de las figuras. Para los experimentos de proliferación, el medio se enriqueció con 3,5,3-triyodotironina 5 x 10-8 M, dexametasona 10-7 M, insulina 10 µg/ml, 2 x 10-6 M, 5,5 µg/ml de transferrina, 7 ng/ml de selenio, piruvato 20 mM y 5% de suero de ternero fetal.

Síntesis de ADN en hepatocitos de cultivo primario

Para medir la síntesis de ADN, se añadió BrdU (20 mM) durante las últimas 16 horas antes de la evaluación. Se pesaron los hepatocitos con PBS, se fijaron y se hicieron permeables en solución de ácido acético/etanol 30:70 a -20ºC durante 30 minutos. Se localizó el BrdU incorporado utilizando el kit II de marcaje y detección de BrdU. Se midió la síntesis del ADN replicativo puntuando el porcentaje de células marcadas con BrdU en el campo del microscopio de baja ampliación al menos de 10 para cada muestra (Olympus CK2). Se identificaron por pocillo más de 1000 hepatocitos.

Viabilidad celular y evaluación de la apoptosis en hepatocitos de cultivo primario

Diecisiete horas después de la adición de TNF-α, se fijó la monocapa con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente, se tiñó con Hoechst 33258 (0,5 µg/ml). Las células apoptósicas se examinaron a longitudes de ondas entre 350 y 460 nM utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Olympus BX60 (Olympus America Inc.). La pérdida de viabilidad celular se cuantificó utilizando el ensayo MTT: 30.000 por pocillo en una placa de microvalorador de 96 pocillos se trataron con solución MTT x µl (0,5 mg/ml), recién disuelta en medio durante 1 hora a 37ºC. El medio se aspiró a continuación y se añadieron 100 µl de DMSO para disolver el colorante. Se midió la absorbancia a 570 nm utilizando un lector de microplacas de 96 pocillos Dynex MRX (Dynex, Technologies, Francia). Cada medición se realizó por cuadruplicado, para HIP/PAP y los hepatocitos naturales se distribuyeron en la misma placa. Se calculó el porcentaje de supervivencia celular tomando la lectura de densidad óptica de las células que reciben un tratamiento específico, dividiendo este número por la lectura de D.O. para las células de referencia sin tratar y a continuación multiplicando por 100. La comparación de los resultados con el número de células apoptósicas observadas que utilizan Hoechst 33258 validó la precisión del ensayo MTT.

Aislamiento y trasplante de células hepáticas

Se aislaron hepatocitos de ratones transgénicos machos HIP/PAP y ratones C57BL/6 macho de dos meses, utilizando la Liberase Blenzyme, como describieron anteriormente Klaunig y Renton. Se purificaron los hepatocitos viables utilizando un método de centrifugación Percoll de isodensidad a baja velocidad como describe Kreamer. Se anestesiaron los ratones SCID hembra con xilazina (Bayer, Leverkusen, Alemania) y ketamina (Biomérieux, Lyon, Francia) disuelta en NaCl al 0,9%, los vasos se extrajeron al exterior a través de una incisión pequeña en el flanco izquierdo, y se utilizó una jeringuilla con una aguja de calibre 26 para inyectar 100 µl de suspensión celular (0,75 x 106 hepatocitos viables) en medio de Williams (Gibco/BRL). El receptor SCID se mantuvo durante 30 días para permitir tiempo suficiente para la proliferación y reorganización de hepatocitos del donante en el parénquima del hígado, antes de realizar la hepatectomía parcial.

Evaluación de la regeneración hepática

Los animales recibieron una inyección intraperitoneal de 60 mg kg-1 de BrdU por kg de peso corporal en NaCl al 0,9% durante 2 horas antes de la disección. Se sacrificaron 24, 36, 46 y 55 horas después de la hepatectomía. Los animales y los hígados se pesaron y se puntuaron los núcleos marcados con BrdU después de la incubación con anticuerpo anti-BrdU (clon Bu 20A) y se realizó el revelado utilizando un kit universal de peroxidasa de rábano picante LSAB2 (Dako) con por lo menos 20 campos de microscopio de baja ampliación (x10) para cada portaobjetos con hígado (Olympus BX60). Se identificaron más de 1600 núcleos por portaobjetos.

Inyección de proteína HIP/PAP purificada tras la hepatectomía

Se produjo proteína HIP/PAP recombinante y se purificó tal como se describió anteriormente (Christa et al., 2000) y se diluyó en 6 µg/ml de NaCl al 0,9%. 100 µl de proteína HIP/PAP o de PBS (solución salina tamponada con fosfato) se inyectó en los vasos de ratones con inmunodeficiencia celular grave (SCID) 36 h después de la hepatectomía parcial. Se sacrificaron los animales 8 días después de la hepatectomía parcial.

Detección de células de hígado trasplantadas por análisis RT-RPC

Se extrajo ARN de tejidos de hígado congelado según las instrucciones suministradas en el reactivo TRIZOL (Life Technologies). Se sintetizó ADNc mediante 200 unidades de transcriptasa inversa de leucemia murina de Moloney (Promega) y se cebó con 400 ng de cebadores aleatorios (Invitrogen), procedentes de 1 µg de ARN completo, a 42ºC durante 45 min en presencia de RNasa, 1 x tampón suministrado por la enzima, 40 mmol.l-1 de los cuatro desoxinucleótidos. Se realizó la RPC con 40 ciclos de ampliación de 1 min cada uno a las siguientes temperaturas: 94ºC, 60ºC y 72ºC, en 1/8 de ADNc, utilizando perlas para RCP de TaqTM Ready-To-GoTM pura (Amersham Biosciences). HIP/PAP humano se detectó con los cebadores 19-101. La expresión endógena del gen HIP/PAP/Mo se detectó con cebadores 104/105 que forman la secuencia de ratón publicada de Itoh y Terakoa ().

19 sentido: 5’ cgc ccc ggg atg ctg cct ccc atg gcc ctg 101 antisentido: 5’ cgc gaa tcc gcc cat gat gag ttg cac acc aaa c 3’ 104 sentido: 5’ cgc gga ttc atg ctg cct cca aca gcc tgc t 3’ 105 antisentido: 5’ cgc aag ctt tta acc agt aaa ttt gca gac ata 3’

Análisis de HIP/PAP: análisis de inmunotransferencia Western, inmunohistoquímica y ensayo ELISA

Se produjo proteína HIP/PAP y se purificó a partir de la leche de ratones transgénicos lactantes, tal como se describió anteriormente, y según Christa et al., 2000. Se realizaron análisis de inmunotransferencia Western y de inmunohistoquímica con anticuerpos preferentemente-HIP como se describió anteriormente (Christa et al., 1999). Se analizaron las concentraciones de HIP/PAP en el suero utilizando un ensayo ELISA en sándwich, según las instrucciones del fabricante (Dynabio, LaGaude, Francia).

Activación del factor STAT3 de transcripción

Se estudió la activación del factor de transcripción STAT3 mediante el kit TramsAM (motivo activo) y por análisis de inmunotransferencia Western, realizado como se describió anteriormente (Simon et al., 2003) con anticuerpos completos anti-STAT3 y anti-fosfo STAT3 (Santa Cruz).

Expresión de citocinas hepáticas

Se evaluó la expresión de citocinas hepáticas mediante el ensayo de protección de RNasa como se describió anteriormente (Tralhao JG, 2002)

Intoxicación por APAP

Se intoxicaron ratones transgénicos HIP/PAP C57BI6 con una dosis letal de APAP (1000 mg/kg) como describe Bedda et al., 2003 o Ferret P.J. et al., 2001. Se inyectó por vía intravenosa proteína HIP/PAP recombinante (600 ng o 1200 ng) 1 hora antes de la inyección intraperitoneal de APAP a ratones C57BI6. Se controlaron los animales durante 24 horas y se calculó la supervivencia utilizando el método de Kaplan-Meier.

Análisis estadísticos

Los resultados de los hepatocitos en el cultivo primario se expresaron como media ± SD y se determinó la significación estadística (P < 0,05) utilizando una prueba de Student para datos desemparejados. La regeneración hepática in vivo se representó por los porcentajes de núcleos que incorporan BrdU utilizando la caja y la representación de pelos de la barba, y la significación estadística de la diferencia entre ratones transgénicos HIP/PAP y naturales se determinó mediante la prueba de la U de Mann-Whitney (P < 0,05), debido a que la distribución de los datos no fue normal (Statview 5’, Abacus Concepts, Berkeley, CA).

RESULTADOS

EJEMPLO 1: Caracterización de ratones transgénicos HIP/PAP humanos

El transgén HIP/PAP se expresó específicamente en el hígado, y los ratones que expresan HIP/PAP no desarrollaron tumores hepáticos a los dos años siguientes. El análisis de inmunohistolocalización detectó la proteína HIP/PAP en el hígado de ratones transgénicos a medida que difunden inmunotinción en el interior de hepatocitos, ocupando la mayor parte del citoplasma de los hepatocitos (Figuras 2A, 1 y 2). La tinción fue homogénea y se localizaron zonas positivas en las áreas centrolobular o portal del ácino del hígado. Esta distribución heterogénea refleja probablemente la secreción de HIP/PAP, de este modo los hepatocitos podrían ser positivos o negativos antes o después de la secreción de HIP/PAP respectivamente. La proteína HIP/PAP se segregó en el suero (250 ng/ml a 700 ng/ml) en las estirpes transgénicas homocigóticas 24 y 27, y en el medio de cultivo de hepatocitos primarios (30 a 120 ng/ml por 2.105 células). No se detectó diferencia en la morfología ni en la aploidía entre los hepatocitos que expresan HIP/PAP y los de referencia por examen histológico (los hepatocitos de ratón eran el 80% binucleares después de la adhesión tal como describió anteriormente Leist et al.). Las observaciones de hepatocitos por inmunohistoquímica de HIP/PAP en el cultivo demostraron que más del 50% de los hepatocitos estaban marcados con HIP/PAP (Figuras 2A, 3 y 4). Los análisis de inmunotransferencia Western detectaron HIP/PAP como una proteína de 16 kDa en extractos de hígado y hepatocitos de cultivo primario de ratones transgénicos HIP/PAP (Figura 2B). La proteína HIP/PAP no fue detectada en ratones naturales. La hibridación con actina permitió una estimación exacta de los 50 µg de proteína cargados para hígados y hepatocitos (50 µg corresponden aproximadamente para 50.000 hepatocitos).

EJEMPLO 2 La regeneración del hígado está estimulada en ratones que expresan el gen HIP/PAP humano

Para probar in vivo el efecto de HIP/PAP sobre la proliferación de hepatocitos, se examinó la regeneración hepática provocada por hepatectomía parcial. Las observaciones a baja ampliación (x20) durante los períodos 24, 36, 46 y 55 horas después de la hepatectomía parcial se presentan en la Figura 3A. En los períodos indicados, los porcentajes de células BrdU positivas fueron mayores en los hígados transgénicos con HIP/PAP que en los hígados naturales, a pesar de la baja frecuencia general de los núcleos que habían incorporado BrdU en ambos grupos. Los porcentajes de núcleos que incorporan BrdU fueron significativamente mayores en los ratones transgénicos con HIP/PAP (promedio del 33%; intervalo 20 a 42%) en comparación con los naturales (promedio 18%; intervalo 11 a 27%) (P = 0,0014), 46 horas después de la hepatectomía parcial (Figura 3B).

Para reforzar la hipótesis de que la proteína HIP/PAP puede actuar como factor de crecimiento durante la regeneración del hígado, se demostró el restablecimiento de la masa hepática en ratones naturales y transgénicos a lo largo del tiempo, después de la hepatectomía (Figura 3C). Se midieron los pesos del animal y del hígado en ratones normales no hepatectomizados. La relación hígado/cuerpo en peso se calculó y se expresó como porcentaje medio ± SD. No hubo diferencia en esta relación entre los dos grupos: 0,0460 ± 0,064 n = 12 y 0, 0489 ± 0,0035 n = 16 para ratones naturales y transgénicos con HIP/PAP, respectivamente. La recuperación del hígado fue mayor en los ratones transgénicos con HIP/PAP que en los naturales, y la diferencia fue estadísticamente significativa a las 48 horas (p < 0,001), 60 horas (p < 0, 003) y 96 horas (p < 0,002). A las 120 horas, el peso del hígado se recuperó para el mismo porcentaje tanto en ratones naturales como en ratones transgénicos con HIP/PAP.

EJEMPLO 3 Efecto mitógeno de HIP/PAP en hepatocitos de cultivo primario

Para investigar más la regeneración hepática aumenrada observada in vivo después de la hepatectomía en ratones transgénicos HIP/PAP, se utilizaron cultivos primarios de hepatocitos para evaluar el efecto mitógeno de HIP/PAP. Los hepatocitos procedentes de ratones transgénicos con HIP/PAP y ratones naturales, presentaban síntesis de ADN con dos picos, 60 y 84 horas después de la colocación en placas, cuando se estimulan por EGF (Figuras 4A y B). A las 60 horas, los porcentajes medios de hepatocitos positivos a BrdU fueron 31,7 ± 7% (n = 19) y 16 ± 4% (n =20) en ratones transgénicos y naturales, respectivamente (p < 0,0001). Cuando las células eran estimuladas por HGF la síntesis de ADN fue también mayor en HIP/PAP que en los hepatocitos naturales (41 ± 14% n = 4, frente a 31 ± 11%, n = 4, respectivamente después de 60 horas) aunque la diferencia no alcanzó significación. Cuando los hepatocitos no eran estimulados por el factor de crecimiento, las incorporaciones de BrdU fueron 11% ± 3% (n = 8) y 3% ± 3 (n = 7) en hepatocitos transgénicos y naturales, respectivamente y la diferencia fue estadísticamente significativa (p = 0,00146). HIP/PAP es una proteína segregada y por consiguiente se probó si podía actuar como factor mitógeno paracrino. Cuando la proteína HIP/PAP (40 ng.ml-1) se añadió a los hepatocitos naturales, la síntesis de ADN provocada por EGF aumentó desde 16 ± 4% hasta 24 ± 7% (p = 0,0168; n = 8; Figura 4C). Estos resultados demostraron que HIP/PAP era un factor mitógeno para hepatocitos en el cultivo primario. El efecto mitógeno de HIP/PAP sobre la proliferación de hepatocitos se demostró de este modo tanto in vivo como in vitro.

EJEMPLO 4 Efecto antiapoptósico de HIP/PAP contra la apoptosis provocada por TNF-α + ActD en hepatocitos de cultivo primario

Se examinó a continuación si el efecto mitógeno de HIP/PAP estaba asociado al efecto antiapoptósico de HIP/PAP. Los hepatocitos de rata en los cultivos primarios no eran sensibles a la muerte celular producida por el tratamiento con TNF-α solo. En su lugar, murieron por apoptosis después de la exposición a TNF-α combinado con una dosis baja de ActD (22). La muerte celular de los hepatocitos de ratón se produjo por TNF-α combinado con una dosis de ActD tan baja como 0,05 µg/ml a pesar de que ActD (0,05 µg. ml-1) no producía solo ninguna pérdida de viabilidad (Figura 5B). Se demuestra (Figura 5A) que los hepatocitos que expresan HIP/PAP, resistían la apoptosis producida por TNF-α + ActD después de 16 a 17 horas de tratamiento. La supervivencia celular alcanzó el 75% frente al 43% (p < 0,0001) para 2 ng.ml-1 TNF-α, y 60% frente a 27% para 20 ng.ml-1 de TNF-α (p < 0,0001). La LD50 para TNF-α, fue superior a 40 ng.ml-1 y 1 ng.ml-1 en HIP/PAP y hepatocitos naturales, respectivamente. El pretratamiento de las células con pananticaspasa z-VAD-fmk (50 µM) evitó completamente la muerte de las células provocada por TNF-α, indicando así que este proceso sucede por la apoptosis de hepatocitos. Se examinó además si las células muertas presentaban las propiedades típicas de la apoptosis. Cuando se tiñó con Hoechst 33258, las células no viables presentaban cromatina condensada, núcleos fragmentados y cuerpos apoptósicos, mientras que las células viables no. Las propiedades de los cuerpos apoptósicos se organizaron en “rosetas” características de la apoptosis de hepatocitos provocada por TNF-α (Figura 5C). Cuando la proteína HIP/PAP (40 ng ml-1) se añadía a los hepatocitos naturales la protección frente a 20 ng ml-1 TNF-α + ActD aumentó desde 27% hasta 47% (p < 0,0001). Estos datos demuestran que HIP/PAP anuló parcialmente la apoptosis producida por TNF-α en hepatocitos primarios.

EJEMPLO 5 La regeneración hepática se estimula en ratones mediante hepatocitos aislados de ratones transgénicos con HIP/PAP

Un modelo experimental in vivo se instaló para probar el efecto sobre la regeneración hepática general de expresión de HIP/PAP en una minoría de células hepáticas. El trasplante de células hepáticas de hepatocitos aislado procedentes de ratones transgénicos HIP/PAP y de C57BL/6 se realizó de este modo, y a continuación la extensión de la regeneración hepática tras la hepatectomía parcial de ratones SCID.

Se utilizaron dos estrategias complementarias para evaluar el trasplante células de hígado. En primer lugar, la ventaja de la expresión del transgén con HIP/PAP humano se consideró para controlar el destino de las células hepáticas trasplantadas, utilizando inmunohistoquímica con anticuerpos HIP/PAP. Una estimación semicuantitativa indicó que las células trasplantadas constituían menos del 1/1.000 en los hígados receptores, además, la expresión de HIP/PAP se presentó en un número limitado de células de hígado sin distribución preferencial en las secciones de hígado (área portal o centro tubular). En segundo lugar, se aprovechó de la presencia de la secuencia HIP/PAP humana para llevar a cabo la RT-RCP. La expresión de HIP/PAP humana fue detectada de hecho en el hígado del receptor SCID, antes de la hepatectomía parcial, confirmando de este modo el trasplante de células hepáticas. Además; la expresión de HIP/PAP humana persiste en la sección de hígado obtenida en diferentes períodos después de la hepatectomía. Esto resultados demostraron que las células trasplantadas persistían durante la estimulación de la regeneración del hígado del receptor y conservaban la expresión génica.

Los efectos de la implantación intrahepática de las células de hígado que se refieren a la extensión de la regeneración del hígado después de la hepatectomía parcial se evaluaron a continuación. La evaluación macroscópica del hígado 8 días después de la hepatectomía, presentó un aumento marcado en los ratones receptores de la masa de hígado trasplantados con células hepáticas procedentes de ratones transgénicos HIP/PAP (Figura 6A). Además, estos descubrimientos se confirmaron por mediciones de peso del hígado que fueron significativamente mayores en los ratones receptores trasplantados con células hepáticas procedentes de HIP/PAP transgénicos (Figura 6B). En análisis de incorporación de BrdU realizado 48 h después de la hepatectomía parcial confirmó un aumento marcado en la síntesis celular de ADN durante el trasplante de hepatocitos que expresan HIP/PAP humano. De este modo, el trasplante de 750.000 hepatocitos viables fue suficiente para aumentar la regeneración de hígado. El examen histológico habitual del hígado no puso de manifiesto ningún cambio morfológico obvio.

EJEMPLO 6 La regeneración hepática se simula en ratones mediante administración de HIP/PAP

Se probó si la inyección de HIP/PAP purificada podría tener el mismo efecto como trasplante en la regeneración hepática. Los pesos de los hígados remanentes se compararon 8 días después de la hepatectomía parcial en ratones SCID que habían sido inyectados 36 h después de la hepatectomía parcial con 100 µl de HIP/PAP purificada (600 ng por ratón). Los resultados presentados en la Figura 7 indicaban un aumento del 10% del peso del hígado en los ratones inyectados con HIP/PAP en comparación con el observado en los ratones inyectados con PBS. Esta observación demostró un efecto paracrino mitógeno de la proteína HIP/PAP in vivo.

EJEMPLO 7 La regeneración hepática y la mitosis están estimuladas en los ratones C57BI6 por administración de HIP/PAP

El efecto de la proteína HIP/PAP frente a solución salina inyectada inmediatamente después de hepatectomía parcial de C57BI6, en el restablecimiento de la masa hepática, la incorporación de BrdU y la mitosis, 46 horas después de la hepatectomía parcial, se ha comparado (Figura 8). Un aumento en el restablecimiento de la masa hepática se observó 46 horas después de la hepatectomía parcial, aunque las diferencias no eran estadísticamente significativas (p = 0,08), probablemente porque 46 horas es demasiado pronto para observar un aumento consistente en la masa hepática, sin embargo, existe un

5 aumento en la incorporación de BrdU (p < 0,02) y el número de mitosis (p < 0,04) en los ratones inyectados con HIP/PAP.

Las distribuciones de la incorporación de BrdU y la mitosis eran heterogéneas, tal como se evaluó por las diferencias en medias y medianas en cada grupo de ratones.

10 Utilizando la prueba de la mediana (que es una aplicación de la prueba exacta de Ficher), se ha validado que los ratones inyectados con HIP/PAP representaban un grupo estadísticamente diferente de ratones con NaCl (Tabla I).

TABLA I

15

Núcleos positivos a BrdU (%)

Hepatocitos mitóticos (%)

NaCl

HIP combinados NaCl HIP combinados

n

16 15 31 16 15 31

media

12,669 22,313 17,335 0,525 1,567 1,029

mediana

7,300 23,000 15,800 0,000 0,7200 0,000

Valor P

0,0038 0,0113

Para caracterizar el beneficio de HIP/PAP en la regeneración hepática, el modelo

de la prueba de la mediana se ha utilizado para clasificar los ratones en cuatro grupos

nominales según la mediana combinada para BrdU y la mitosis (Figura 9). Los análisis

20 estadísticos de poblaciones de ratones según BrdU asociada a la mitosis ha demostrado que más ratones inyectados con HIP/PAP fueron positivos tanto para los núcleos de BrdU como para los hepatocitos mitóticos (hígado en fase S/M del ciclo celular) que los ratones inyectados con solución salina (p = 0,01), lo que sugiere que HIP/PAP podría acelerar la evolución de hepatocitos en todo el ciclo celular.

25

EJEMPLO 8 Expresión de citocinas hepáticas y activación del factor de transcripción STAT3 durante el tiempo de regeneración del hígado

30 La regeneración hepática debe ser cebada por TNF-α y citocinas IL-6 para que los hepatocitos empiecen a entrar en la fase G1 del ciclo celular. Bajo el control de IL-6, el factor de transcripción STAT3 se fosforila, activa y se transpone al núcleo. Sin embargo, la persistencia de la expresión de TNF-α/IL-6 y la activación de STAT3 es perjudicial y retarda el tiempo de la regeneración. El efecto de HIP/PAP sobre la expresión de la

35 citocina hepática y sobre la activación de STAT3 se ha investigado. En este contexto, la expresión de la citocina en el hígado a T0 de PHX (hepatectomía parcial) y después de 46 horas de los ratones SCID trasplantados con HIP/PAP frente a hepatocitos de referencia se ha comparado. La metodología de protección de RNasa permitió comparar en el mismo experimento linfotoxina-β(LTβ), TNF-α y TGF-β en una mezcla de cuatro extractos de

40 hígado (Figura 10; bandas A y B de ratones transgénicos con HIP/PAP; bandas C y D ratones SCID) a T0 (bandas a y c) y a las T46 horas después de PXH (bandas b y d). El análisis densitométrico cuantificó las señales que han sido normalizadas frente a dos genes constitutivos (L32 y GAPDH). Los resultados no presentaban ninguna diferencia en la expresión hepática de TGF-β que cuando se realizó el trasplante con HIP/PAP o hepatocitos de referencia: a las 46 horas después de PHX, TGF-β aumentó en la misma medida. Por el contrario, la expresión de LTβ y TNF-α (ambas citocinas pertenecen a la misma familia funcional) se inhibió en los hígados de SCID trasplantados con hepatocitos HIP/PAP. Estos resultados demuestran que HIP/PAP inhibe la expresión hepática de TNFα en el hígado de SCID.

La metodología de protección de RNasa no permitió detectar la expresión de IL6 durante la regeneración hepática del SCID. Sin embargo, la cinética de activación del factor de transcripción STAT3 se ha investigado en ratones transgénicos HIP/PAP y C57BI6. El tiempo de acumulación/degradación de la fosfo-STAT3 nuclear se activó en ratones transgénicos HIP/PAP frente a ratones C57BI6, durante las primeras 24 horas después de PHX (Figura 11). La activación fue detectada tan pronto como en una hora después de THX en HIP/PAP pero no en ratones C57BI6 (p = 0,02). Por otra parte, la activación de STAT3 se volvió a niveles menores en HIP/PAP que en ratones C57BI6 (p = 0,04), tan pronto como 12 horas. Los resultados fueron validados y se observó por análisis de inmunotransferencia Western con anticuerpos anti-STAT3 fosforilados (Figura 11).

EJEMPLO 9 HIP/PAP es un fármaco protector contra la insuficiencia hepática aguda provocada por APAP

La provocación de la insuficiencia hepática aguda humana puede simularse por un modelo animal experimental relevante, consistente en intoxicación con APAP (acetaminofeno). La sobre dosis de APAP conduce a una producción aumentada de NAPQ1, metabolito muy reactivo que elimina la mezcla intracelular de GSH, tiol no proteico tanto con capacidades secuestrante del oxidante como reguladoras redox. Por consiguiente, durante la intoxicación con APAP en los ratones, se generan especies tóxicas de oxígeno reactivo (ROS) conduciendo a insuficiencia hepática aguda. Una sola dosis grande de APAP en el ratón, como en los seres humanos, puede originar la destrucción extensa parenquimatosa centroglobular y la muerte de hepatocitos. La actividad terapéutica de la proteína HIP/PAP en un modelo de ratón de insuficiencia hepática aguda provocada por HIP/PAP se ha investigado. Con este fin, la resistencia de ratones transgénicos HIP/PAP contra una dosis letal de APAP inyectada en ratones naturales se ha probado. La insuficiencia hepática aguda provocada por medicamentos se consiguió en 24 ratones transgénicos HIP/PAP y 24 ratones C57/Bl6 (12 machos y 12 hembras en cada grupo) mediante inyección intraperitoneal de una dosis letal de 1000 mg/ml (APAP1000) diluida en 200 µl de solución salina con tampón fosfato esterilizada.

Los tiempos de supervivencia demostraron que el 80% de ratones transgénicos HIP/PAP (machos o hembras) sobrevivieron durante más de 24 horas, frente al 25% en el grupo de natural referencia. Estos resultados demuestran que la proteína HIP/PAP es un buen candidato para las aplicaciones terapéuticas clínicas dedicadas a prevenir y tratar la insuficiencia hepática, mediante su acción tanto en el estatus regenerativo y vital de las células hepáticas (Figura 12).

Para investigar la protección paracrina preventiva de la proteína HIP/PAP frente a la intoxicación con APAP, se ha inyectado proteína HIP/PAP por inyección intravenosa en la cola de C57BI6 1 hora antes de APAP. Los resultados presentaron una protección preventiva dependiente de la dosis de la proteína HIP/PAP para 600 ng, 4/10 y 2/10 de ratones inyectados con HIP/PAP e inyectados con solución salina sobrevivieron respectivamente; para 1200 ng, 8/10 y 2/10 ratones inyectados con HIP/PAP y ratones inyectados con solución salina sobrevivieron respectivamente.

EJEMPLO 10 La proteína HIP/PAP no presenta efectos tóxicos durante el seguimiento a largo plazo in vivo de ratones transgénicos que expresan HIP/PAP

Cualquier droga capaz de estimular la proliferación de las células hepáticas tiene un potencial para provocar cáncer, de modo que los riesgos de desarrollar HCC deben determinarse antes de cualquier administración. Dos modelos de ratones transgénicos que expresan el gen HIP/PAP humano bajo el activador del gen de albúmina de ratón (dos cepas) o el activador del gen de metaltioneína de ratón (dos cepas) se han desarrollado. Ambos modelos dirigen la expresión de gen HIP/PAP en el hígado y la secreción de la proteína HIP/PAP en la sangre. Ninguno de los ratones que expresan HIP/PAP había desarrollado tumores hepáticos (u otros) después de un período de seguimiento de dos años.

EJEMPLO 11 HIP/PAP retarda el desarrollo de HCC en ratones transgénicos predispuestos

Los efectos de la HIP/PAP en un modelo de carcinogénesis de hígado del seguimiento a largo plazo de ratones bitransgénicos se ha investigado. Se cruzaron ratones transgénicos HIP/PAP (activador metaltioneína) con ratones WHV/c-myc en los que la expresión hepática específica de c-myc conducida por las secuencias reguladoras de la hepatitis de la marmota produce cáncer de hígado en todos los animales (Terradillos et al. (1997)). Las curvas de supervivencia demostraron que los T50 de ratones bitransgénicos eran 60 semanas (n = 87 ratones) frente a 42 semanas pata el T50 de oncoratones WHV/c-myc (n = 39 ratones), que fue la mediana publicada por Terradillos et al. (1997). Las curvas de supervivencia fueron idénticas para ratones transgénicos HIP/PAP y para referencias negativas de la camada. De este modo, en primer lugar, la toxicidad de la proteína HIP/PAP durante la vida de estos ratones no se ha detectado, y en segundo lugar, se ha demostrado que el comienzo de HCC se retarda en los ratones que llevan ambos transgenes, es decir WHV/c-myc y HIP/PAP (Figura 13).

No existen pruebas de toxicidad durante la administración a largo plazo de HIP/PAP. Además, un comienzo retardado de HCC en los ratones transgénicos con cáncer de hígado provocado por c-myc se ha observado.

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-37

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale

5

<120> Composiciones insuficiencia hepática para la regeneración hepática y para la prevención de la

<130> Q087FR -INSERM

10

<140> <141>

<160> 1

15

<170> PatentIn Ver. 2.1

20

<210> 1 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

imagen1

Claims (19)

1. Composición farmacéutica para su utilización en la estimulación de la regeneración hepática in vivo, la protección contra la insuficiencia hepática crónica/aguda

o la protección contra la apoptosis de hepatocitos, que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el resto del aminoácido 36 y termina en el resto del aminoácido 175 de la secuencia SEC. ID. nº 1, en combinación con por lo menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

2.

Composición farmacéutica según la reivindicación 1 que comprende una cantidad eficaz del polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el resto del aminoácido 36 y termina en el resto del aminoácido 175 de la secuencia SEC. ID. nº 1, en combinación con por lo menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

3.

Composición farmacéutica según la reivindicación 1 que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de identidad de aminoácidos con el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el resto del aminoácido 27 y termina en el resto del aminoácido 175 de la secuencia SEC. ID. nº 1, en combinación con por lo menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

4.

Composición farmacéutica según la reivindicación 1 que comprende una cantidad eficaz del polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos que comienza en el resto del aminoácido 27 y termina en el resto del aminoácido 175 de la secuencia SEC. ID. nº 1, en combinación con por lo menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

5.

Composición farmacéutica según la reivindicación 1 que comprende una cantidad eficaz de proteína asociada a la pancreatitis/hepatocarcinoma-intestino-páncreas humana (HIP/PAP) de secuencia SEC. ID. nº 1 en combinación con por lo menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

6.

Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para estimular la regeneración hepática in vivo después de la insuficiencia hepática crónica/aguda.

7.

Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para el tratamiento de los pacientes que han experimentado una hepatectomía parcial.

8. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para el tratamiento de los pacientes que son los sujetos de un trasplante de hígado, una insuficiencia hepática causada por enfermedades hepáticas seleccionadas de entre el grupo constituido por (i) hepatitis aguda y crónica de etiologías tóxicas, medicamentosas, virales, alcohólicas y desconocidas, (ii) intervención quirúrgica y (iii) cáncer hepático.

9.

Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para el tratamiento de pacientes que son los sujetos de una enfermedad comprendida en el grupo constituido por: hepatitis B, hepatitis C, anomalías del ciclo de la urea, hipercolesterolemia familiar, cirrosis provocada por alcohol, enfermedad por almacenamiento de glucógeno, hepatitis autoinmunitaria, hiperoxaluria primaria tipo l, cirrosis criptogénica, síndrome de Crigler-Najjar tipo 1, fibrosis hepática congénita, enfermedad Neimann-Pick, cirrosis biliar primaria, amiloidosis familiar, atresia biliar, carcinoma hepatocelular, colangitis esclerosante primaria, hepatoblastoma, síndrome de Alagille, hemangioendotelioma, colestasis familiar, neuroendocrina no carciniode, insuficiencia hepática provocada por fármacos, tumor hepático benigno tal como la hiperplasia nodular focal, tumores de hígado tales como el carcinoma hepatocelular y el colangiocarcinoma, insuficiencia hepática aguda/fulminante, síndrome de Budd-Chiari, deficiencia en alfa-1-antitripsina, enfermedad de Wilson, hemocromatosis, tirosinemia, protoporfiria, fibrosis quística, hepatopatía grasa no alcohólica (NAFLD) y esteatohepatitis no alcohólica (NASH).

10.

Composición farmacéutica con efectos adversos limitados en la necrosis hepática que comprende:

(i)

una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto hepatotóxico, e

(ii)

una cantidad eficaz de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a

5.

11.

Composición que comprende dividir los hepatocitos en combinación con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

12.

Composición que comprende los hepatocitos que han sido transfectados con un casete de expresión que conduce la expresión de una polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en dichos hepatocitos transfectados.

13.

Composición que comprende una cantidad eficaz de células madre de médula ósea, en combinación con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

14.

Composición farmacéutica para estimular la regeneración hepática in vivo que comprende una cantidad eficaz de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.

15.

Procedimiento para estimular el crecimiento de los hepatocitos in vitro, que comprende:

(a)

recolectar los hepatocitos;

(b)

cultivar dichos hepatocitos en un medio de cultivo apropiado; y

(c)

tratar dichos hepatocitos con una cantidad mitogéna de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 .

16.

Procedimiento para estimular el crecimiento de los hepatocitos in vitro, que comprende:

(a)

recolectar los hepatocitos;

(b)

cultivar dichos hepatocitos en un medio de cultivo apropiado; y

(c)

transfectar dichos hepatocitos con un casete de expresión que conduce la expresión de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en dichos hepatocitos transfectados.

17.

Procedimiento para el tratamiento de células madre de la médula ósea in vitro, que comprende:

(a)

recolectar células madre de la médula ósea;

(b)

cultivar dichas células madre de la médula ósea en un medio de cultivo apropiado; y

(c)

tratar dichas células madre de la médula ósea con una cantidad mitógena de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

18.

Utilización de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para preparar una composición farmacéutica destinada a estimular la regeneración hepática in vivo.