CN1835764B - 用于肝再生和预防肝衰竭的hip/pap多肽组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明基于HIP/PAP对原代培养肝细胞具有体外促有丝分裂作用和抗细胞凋亡作用的实验发现。而且，在肝衰竭和肝再生期间，HIP/PAP是肝细胞的体内促有丝分裂分子和抗细胞凋亡分子。本发明还基于HIP/PAP的施用在哺乳动物中没有有害效应的实验发现。本发明涉及包括慢性/急性肝衰竭后用于体内刺激肝再生的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂相组合的有效量的多肽，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
Description
发明领域
本发明涉及人类肝癌-肠-胰腺/胰相关蛋白质(HIP/PAP)用于刺激肝再生和预防肝衰竭的用途。
领域背景
肝衰竭发生于大量急性和慢性临床疾病，包括药物引起的肝毒性、病毒感染、血管损伤、自身免疫病或钝伤。另外，患有先天性代谢缺陷的患者也有发展成肝衰竭的危险。作为这些临床疾病的结果而发生的肝衰竭症状包括例如爆发性急性肝炎、慢性肝炎或肝硬化，并且在许多情况下，正常肝功能的恢复对于患者存活是至关重要的。例如，在年龄在25-44之间的人群中，肝硬化是第七位死亡原因并且是第四位的与死亡原因相关的疾病(来源：美国肝脏基金会(American Liver Foundation))。
在急性肝疾病中，肝脏在受到损伤后能够再生。如果疾病进展超过了肝脏再生新细胞的能力，则机体整个新陈代谢将受到严重影响。肝功能损失可能导致与基本机体功能(即能量供应、酸碱平衡和体温调节)结合在一起的代谢不稳定性。如果不迅速逆转这种情况，将发生诸如不受控制出血和脓毒病的并发症，并且由于毒性副产物或者因为肝不再合成重要的营养物，依赖器官如脑和肾将停止行使功能。大量肝细胞损伤之后，肝组织失去其再生和代谢功能，并且肝移植成为通常使用的治疗策略。然而，肝移植的临床应用受到人肝细胞、肝组织的可得性和能够在同时安全移植的肝细胞的数量的限制。而且，手术前和手术后并发症的潜伏期对于抵抗肝衰竭急性期可能是关键的。另一个治疗策略在于肝切除(去除部分肝)。肝切除的最典型适应症是恶性肿瘤、肝细胞癌或者包括胆管癌的增生性胆疾病。肿瘤可以是原发性的(发生于肝)或者转移的(发生于其它器官，然后转移至 肝)。大多数肝转移来自于结肠。单一肿瘤或者限于肝左侧或右侧的一个以上肿瘤能够被成功切除，且5年存活率高达60％。对患有肝外疾病的患者进行肝切除可以缓解由肿瘤引起的症状，但在存活方面改善很小。肝良性肿瘤(腺瘤和局灶性结节性增生)也能够通过适当肝切除得到成功处理。也可以对愿意捐赠其部分肝的人进行肝切除。
考虑到肝移植和肝切除的重要性，已经提出了几种策略以便在肝切除或肝移植情况下刺激肝再生并抑制或限制肝衰竭。
相信可以通过自分泌和旁分泌来源的各种生长刺激和生长抑制细胞因子控制肝细胞，然而，这些生长因子的确切作用和作用机制还远没有全部理解。细胞因子是分泌的肽或蛋白质，它们调节氨基酸、蛋白质、糖类、脂类和矿物质的中间代谢。细胞因子包括对介导炎症反应起作用的肽或蛋白质，并且它们参与调节细胞增殖的细胞内通讯和将炎症细胞粘附于血管壁和细胞外基质。细胞因子对于肝和肝外位点之间以及肝自身内部的通讯是必要的。细胞因子与激素如糖皮质激素相互作用，导致形成相互控制的复杂网络。许多细胞因子除了具有其特异性促炎症反应效应外还行使生长活性。肝是细胞因子合成的重要位点和几种细胞因子的主要清除器官。在肝疾病中，细胞因子参与肝内免疫反应的起始、肝再生和肝纤维化和肝硬化形成。
相信肝细胞也受到多种生长因子的控制。生长因子对于调节发育事件是必需的或者对于调节编码其它分泌蛋白质的基因表达是必需的，这些分泌蛋白质可能参与细胞内通讯和协调发育并且包括胰岛素样生长因子-I和II(IGF I和II)、表皮生长因子(EGF)、a型和b型转化生长因子(TGF-α和TGF-β)、血小板来源生长因子(PDGF)。
已经显示，在体外(in vitro)可以通过生长因子如TGF-α或EGF来刺激分离肝细胞中的DNA合成。已经显示，命名为肝细胞生长因子(HGF)的另一种蛋白质是原代肝细胞的促细胞分裂源。
基于这些发现，已经提出这些因子可能是肝再生重要的介导物。因此，已经表明在肝再生的治疗中生长因子如TGFα、EGF或HGF具有生长因 子样活性。然而，建议刺激肝再生并抑制肝衰竭的这些治疗策略还没有验证其具有功效而不具有毒性和有害效应。也就是说，这些生长因子促进肿瘤进程(Gang-Hong等，1992；Lee，1992；Horiguchi等，2002)。
因此，在本领域中仍然需要这样一种有效的方法，该方法应该可以刺激肝再生、预防肝衰竭并去除有害的毒性和致肿瘤发生作用。该需要存在于已经诱发肝损伤的任何患者群体中。该需要不仅存在于移植患者并且还存在于捐赠者和已进行肝切除的患者。另外，在本领域中还需要新的在治疗上有用的可刺激肝再生的化合物。
另外，考虑到供者器官的难以获得性，活供者部分肝移植被认为是克服器官缺乏的措施，并且有助于部分肝移植。然而，由于供者可切除的肝重量通常小于受者必需肝重量，所以对于代表绝大多数移植患者的成年人而言，部分肝移植不能认为是安全手术。因此需要一种小移植物安全且快速肝再生的方法。
因此，本发明的目标是提供在部分肝切除后刺激肝再生的方法。本发明的目标还在于提供在肝移植(诸如部分肝移植)之后以及诱发肝衰竭的疾病(如肝硬化、急性肝炎和慢性肝炎)发生之后能够促进肝再生或肝细胞生长的药物。
对于本领域的普通技术人员而言这些目标和更多目标将是显而易见的。
发明简述
本发明基于HIP/PAP在体外对原代培养物中肝细胞具有促有丝分裂和抗凋亡作用的实验发现。而且，HIP/PAP是肝衰竭和肝再生期间肝细胞的体内(in vivo)促有丝分裂分子和抗凋亡分子。本发明还基于HIP/PAP在哺乳动物中不具有有害效应的实验发现。
本发明的第一个目标在于用于体内刺激肝再生的药物组合物，其中所述的药物组合物包含与至少一种生理可接受赋形剂相组合的有效量的多肽，该多肽含有与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于 氨基酸残基175的氨基酸序列所组成的多肽具有90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
另一方面，本发明涉及用于体内刺激肝再生的药物组合物，其中所述的药物组合物包含与至少一种生理可接受赋形剂相组合的有效量的序列SEQ ID NO 1人肝癌-肠-胰腺/胰相关蛋白质(HIP/PAP)。
本发明还涉及对肝坏死具有有限有害效应的药物组合物，其中所述药物组合物包含：
(i)治疗有效量的肝毒性化合物，
(ii)肝损伤有效量的如上所定义的多肽。
附图简述
图1.转基因图示
小鼠白蛋白基因调控区的增强子(2kb)和启动子(0.3kb)用虚线表示。人HIP/PAP基因(1.6kb)的外显子II、III、IV、V及VI和内含子分别用黑盒和虚线表示。牛生长激素polyA片段(1021-1235)pcDNA 3.1用虚线表示。质粒DNA用实线表示。有关限制性酶切位点用箭头标明。
图2.HIP/PAP蛋白质的免疫检测。
A.免疫组织化学：原放大倍数×20，1：野生型肝，2：HIP/PAP转基因肝，3：野生型肝细胞，4：HIP/PAP肝细胞。
B.用HIP/PAP和肌动蛋白抗体杂交的Western印迹，分别显示预期大小为16kDa和45kDa的带。泳道1：纯化的HIP/PAP蛋白质(10ng)，泳道2、3和4：分别为野生型肝、HIP/PAP转基因肝27和24号纯合系，泳道5、6和7：分别为分离后的野生型、HIP/PAP 27和24号肝细胞。
图3.部分肝切除术后体内肝再生的时间过程
A.在野生型(1、2、3、4)和HIP/PAP转基因肝(5、6、7、8)中BrU阳性细胞核的免疫检测；1和5：肝切除术后24小时，2和6：肝切除术后36小时，3和7：肝切除术后46小时，4和8：肝切除术后55小时。
B.包含五个水平线的箱图，其显示了变量的第10、第25、第50、第 75百分位数。对于超过第90百分位数和低于第10百分位数的变量的所有数值分别划分，以致于箱图在突出离群值上是有价值的。野生型小鼠(n＝9)，且HIP/PAP转基因小鼠(n＝10)(p＝0.0014)。
C.在正常非肝切除小鼠中测量的肝重量。计算了肝重/体重比率并表示为平均百分数±SD。在两组之间该比率没有差异(对于野生型和HIP/PAP转基因小鼠分别为0.0460±0.0064，n＝12和0.0489±0.0035，n＝16)。部分肝切除术后不同时间点的野生型(○)和HIP/PAP(■)小鼠正常肝重恢复的平均百分数(±sd)显示在HIP/PAP转基因小鼠存在刺激恢复(对于每一组的每个时间点有5-9只小鼠进行肝切除)。在48小时(p＜0.001)、60小时(p＜0.003)和96小时(p＜0.002)时差异具有统计学意义。
图4.野生型和HIP/PAP转基因肝细胞中的DNA合成
A.60小时时BrU阳性肝细胞的免疫检测，野生型(a)，HIP/PAP(b)(原放大倍数×200)。所显示数值是来自每种基因型12只小鼠的独立培养物的平均值±SD。
B.EGF(30ng.ml-1)刺激的肝细胞内DNA合成的时间过程。野生型(○)，HIP/PAP(■)。
C.平板接种60小时后所培养肝细胞内的DNA合成：在细胞贴壁后加入生长因子(EGF 30ng ml-1，HIP/PAP 40ng ml-1)。在最后16小时内加入毛喉素(Forskolin)。来自4-20次实验的数据表示为平均值±SD。(□)野生型，(■)HIP/PAP。
图5.HIP/PAP抑制培养的原代肝细胞中TNF-α+ActD诱导的凋亡
A.在野生型(□)和HIP/PAP(■)转基因肝细胞中细胞生存力的TNF-α剂量依赖性降低。数据表示为来自每种基因型五只小鼠的四次重复试验的独立培养物的平均值±s.e.m。
B.如所指出，将肝细胞处理17小时。野生型(□)，HIP/PAP(■)。直方图代表三个独立试验的四次重复的平均值±s.e.m。
C.使用Hoechst 33258染色仍然贴壁的肝细胞的固缩核(放大倍数×400)。箭头指出通过TNF-α诱导的肝细胞凋亡的凋亡小体特征，凋亡小 体组织成了“玫瑰花结”特征。野生型(1、3、5)，HIP/PAP(2、4、6)，对照培养物：不添加(1和2)，TNF-α 2ng ml-1+ActD(3和4)，TNF-α 20ngml-1+ActD(5和6)。
图6.用来自野生型或HIP/PAP转基因小鼠的肝细胞移植的SCID小鼠内肝再生的刺激
A.目视评价用来自野生型或HIP/PAP转基因小鼠肝细胞进行移植并在肝切除术后7天处死的SCID小鼠的肝。
B.在肝切除术后7天，肝细胞移植的SCID小鼠肝重箱图。通过使用Mann-Whitney检验，发现野生型肝细胞移植的SCID小鼠相对HIP/PAP肝细胞移植的SCID小鼠之间具有显著性差异(p＝0.0008)。
图7.通过HIP/PAP蛋白质对SCID小鼠中肝再生的刺激
在行部分肝切除术后36小时脾内注射HIP/PAP蛋白质(600ng/小鼠)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)(100μL)的SCID小鼠肝重的箱图。在肝切除术后7天处死小鼠。通过使用Mann-Whitney检验，发现注射HIP/PAP蛋白质的SCID小鼠相对注射PBS的SCID小鼠间具有显著性差异(p＝0.0022)。
图8.在C57小鼠中注射HIP/PAP蛋白质刺激肝再生
已经比较了向部分肝切除后C57BI6小鼠立即注射HIP/PAP蛋白质相对盐水对部分肝切除后46小时肝质量恢复、BrdU掺入和有丝分裂的作用。显示为代表肝质量、BrdU掺入和有丝分裂的箱图。已经进行了Mann-Whitney检验，并且认为p＜0.05具有统计学意义。
图9.根据BrdU和有丝分裂对小鼠种群进行的统计分析
各组之间的分布具有统计学差异，这是根据部分肝切除术后46小时BrdU掺入和有丝分裂的组合的中位数确定的。
图10.在肝切除术后移植小鼠肝内的肝细胞因子表达
已经比较了用HIP/PAP肝细胞相对对照肝细胞移植的SCID小鼠中在PHX(部分肝切除术)的T0时刻和46小时后肝脏内细胞因子的表达。核糖核酸酶保护方法允许在同一实验中比较4种肝提取物组中淋巴毒素-β(LT-β)、TNF-α和TGF-β。其中4种肝提取物为T0时刻(泳道a和c)和 PHX后T46小时(泳道b和d)HIP/PAP转基因小鼠(泳道a和b)和SCID小鼠(泳道c和d)的提取物。密度测量分析定量信号，该信号已经相对两种看家基因(L32和GAPDH)进行了标准化。还测量了肝提取物中的mRNA水平。图表表示各组小鼠的L32和GAPDH mRNA含量的平均值。
图11.肝切除术后Stat 3活化
在部分肝切除术后的第一个24小时内测量了HIP/PAP转基因小鼠相对C57BI6小鼠中核内磷酸化STAT3的积累/降解时间过程(图11)。PHX后1小时，在HIP/PAP小鼠而不是在C57BI6小鼠中立即检测到活化作用(p＝0.02)。而且，一旦达到12小时，HIP/PAP小鼠中STAT3活化降低到比C57BI6小鼠中更低的水平(p＝0.04)。通过使用抗磷酸化STAT3抗体的western印迹分析对结果进行了验证且显现出来。
图12.HIP/PAP转基因小鼠可抵抗醋氨酚(APAP)诱导的急性肝衰竭
已经将通过致死剂量APAP(醋氨酚)(1000mg.kg-1)处理的雌性HIP/PAP转基因小鼠(Tg HIP雌性)和雄性HIP/PAP转基因小鼠(Tg HIP雄性)的存活率和通过APAP或PBS处理的C57BI6对照小鼠(CT C57BI6雄性和雌性)的存活率进行了比较。在用APAP注射的HIP/PAP转基因小鼠相对用APAP注射的C57BI6对照小鼠之间观察到存活率的显著性差异。HIP/PAP还具有针对APAP中毒的预防作用。
图13.在体内长期追踪观察期间HIP/PAP表现为无毒性效应
将HIP/PAP转基因小鼠(金属硫蛋白启动子)与WHV/c-myc小鼠杂交，在WHV/c-myc小鼠中，由旱獭肝炎(WHV)调控序列驱动的c-myc肝特异性表达在所有动物中引起肝癌。存活率曲线显示：WHV/c-myc肿瘤易感小鼠T50为42周(n＝39只小鼠)，双转基因小鼠的T50为60周(n＝87只小鼠)。对于HIP/PAP转基因小鼠和同窝幼仔的阴性对照小鼠，存活率曲线是相同的。因此，首先，在这些小鼠的寿命内还没有检测到HIP/PAP蛋白质的毒性并且在携带两个基因(即WHV/c-myc和HIP/PAP)的小鼠中延缓了HCC的发病。
发明详述
根据本发明，发明者已经发现HIP/PAP在体外对原代培养物中的肝细胞具有促有丝分裂和抗细胞凋亡作用。而且，在肝衰竭和肝再生期间，HIP/PAP在体内对于肝细胞是促有丝分裂分子和抗细胞凋亡分子。
由于其在25％人肝细胞癌中增加的表达，通过Northern印迹分析鉴定了人肝癌-肠-胰腺/胰相关蛋白质(HIP/PAP)基因(Lasserre等，1992)。已经显示在正常受试者的肠(帕内特细胞和神经内分泌细胞)和胰腺(腺泡胰腺细胞和郎格汉岛)内检测到HIP/PAP蛋白质。在正常肝入口区周围的一些潜在祖肝细胞中也检测到HIP/PAP蛋白质(Christa等，1999)。在胰腺炎急性期期间HIP/PAP快速过表达。对于大鼠肝细胞它还可以作为粘附分子起作用并且与细胞外基质蛋白质如层粘连蛋白-1和纤连蛋白相互作用。根据Drickamer分类和结构分析，该蛋白质包含假定信号肽，并且因此属于C-型凝集素家族VII组(Abergel等，1999)。
目前，发明者已经发现在表达人HIP/PAP基因的小鼠中，肝切除术后刺激了体内肝再生。另外，根据本发明已经发现HIP/PAP在体外原代培养肝细胞中也具有促有丝分裂作用。另一方面，根据本发明还已经发现在原代培养肝细胞中HIP/PAP具有抵抗TNF-α结合放线菌素D诱导的细胞凋亡的抗细胞凋亡作用。根据本发明还已经显示，当重组表达HIP/PAP的肝细胞局部注射入部分肝切除的小鼠时诱导肝再生。发明者已经显示，当HIP/PAP蛋白质注射入已经进行行部分肝切除术的小鼠时诱导肝再生。考虑到这些观察，发明者已经显示，与本领域已知的生长因子如上面所述的HGF、TGF-α或EGF形成对比，HIP/PAP蛋白质在体内提供有效的促有丝分裂和抗细胞凋亡作用并预防肝衰竭，HIP/PAP蛋白质不具有有害效应并且特别是避免任何致癌作用。
综合在一起，这些结果证明了HIP/PAP在肝再生中的治疗重要性。因此，这些实验结果已经允许发明者设计用于体内刺激肝再生的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂相组合的有效量的序列SEQ ID NO 1的人肝癌-肠-胰腺/胰相关蛋白质(HIP/PAP)。
本发明的第一个目标在于用于包括慢性/急性肝衰竭之后体内刺激肝再生的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂相组合的有效量多肽，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本发明还涉及包含对于肝再生有效的HIP/PAP多肽片段的药物组合物。序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的该多肽序列包括HIP/PAP蛋白质的生物活性部分，该部分先前已经描述为糖识别域(CRD)序列(Christa等，1994)。
在第一个优选实施方案中，本发明药物组合物包含上述HIP/PAP的生物活性部分，通过使用标准蛋白质纯化技术的适当纯化方案能够从细胞或组织来源分离该活性部分。
在所述药物组合物的另一个优选实施方案中，通过重组DNA技术(如实施例中所描述)产生HIP/PAP的生物活性部分。根据第三个优选实施方案，使用标准肽合成技术化学合成HIP/PAP的生物活性部分。
所分离或纯化的HIP/PAP的生物活性部分基本上不含来自HIP/PAP所来源细胞或组织中的细胞材料或其它污染蛋白质，或者基本上不含化学前体(在化学合成情况下)。
为了确定两条氨基酸序列同一性的百分数，为了最佳比较的目标将序列进行比对。例如，为了最佳比对将缺口引入第一条和第二条氨基酸序列之一或两者中，并且为了比较的目标忽略了非同源序列。
为了最佳比较目标，使用CLUSTAL W(版本1.82)采用以下参数能够获得两条氨基酸序列同一性的百分数：参数为(1)CPU模式＝ClustalW mp；(2)比对＝《全部》；(3)输出格式＝《aln w/数字》；(4)输出次序＝《排列的》；(5)颜色比对＝《否》；(6)KTUP(字大小)＝《默认》；(7)窗口长度＝《默认》；(8)分值类型＝《百分数》；(9)TOPDIAG＝《默认》；(10)PAIRGAP＝《默认》；(11)系统发生树/树类型＝《无》；(12)矩阵＝《默认》；(13)缺口开口＝《默认》；(14)缺口结束END GAPS＝《默认》；(15)缺口延伸＝《默认》； (16)缺口距离＝《默认》；(17)树类型＝《进化树》；(18)树GRAP距离＝《隐藏》。
HIP/PAP的生物活性部分包括包含与SEQ ID NO 1的HIP/PAP全长氨基酸序列充分同源的氨基酸序列的肽，其包括与全长HIP/PAP相同数目标氨基酸并且显示出至少与HIP/PAP相同的生物活性。
HIP/PAP的生物活性部分还包括包含与SEQ ID NO 1的HIP/PAP全长氨基酸序列充分同源的氨基酸序列的肽，其包括比全长HIP/PAP更多的氨基酸并且显示出至少与HIP/PAP相同的生物活性。
对于“相同生物活性”，如应用于与HIP/PAP同源的生物活性肽，此处意思是指以与全长HIP/PAP相同级别体内诱导肝再生的肽，这是本领域每个技术人员通过例如测量肝细胞BrdU掺入和肝质量恢复(如在实施例2中所示)容易确定的。
如文中所使用，HIP/PAP的生物活性部分包括含有与序列SEQ ID NO1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的序列的多肽具有90％同一性的氨基酸序列的多肽。根据本发明，与第二氨基酸序列具有至少90％同一性的第一氨基酸序列包含与所述第二氨基酸序列至少90％，并且优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸。
根据本发明的多肽还包含变体，例如来自不同哺乳动物的CRD序列，并且例如Orelle等所述的牛胰线蛋白(BPTP)或来自大鼠的胰相关蛋白质1(PAP1)。
除了在哺乳动物中存在的HIP/PAP序列生物活性部分的天然存在等位基因变体以外，本领域的技术人员还将意识到：可以通过突变将变化引入SEQ ID NO 1的核苷酸序列中，由此导致HIP/PAP氨基酸序列的改变而不改变HIP/PAP的生物活性。
另外，在相应于HIP/PAP的序列中可以进行非必需氨基酸的替换。“非必需”氨基酸残基是能够改变HIP/PAP野生型序列而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所必需的。
本发明的第二个目标在于用于体内刺激肝再生的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂相组合的多肽，所述多肽为序列SEQ ID NO1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的序列。
本发明的另一个目标是用于体内刺激肝再生的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂相组合的有效量多肽，所述多肽包含与由SEQID NO 1中起始于氨基酸残基27并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本发明的另一个目标在于按照权利要求1的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂相组合的有效量多肽，其中所述多肽由SEQ IDNO 1中起始于氨基酸残基27并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成。
本发明的另一个目标在于用于体内刺激肝再生的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂相组合的有效量的人肝癌-肠-胰腺/胰相关蛋白质(HIP/PAP)。
不希望束缚于任何特定理论，发明者相信序列SEQ ID NO 1的完整的HIP/PAP蛋白质《即包含CRD序列、信号肽和前肽的多肽)导致所述蛋白质的最佳折叠，特别是当通过DNA重组技术在已经用编码其的表达盒转染的真核细胞中产生所述蛋白质时。顺便提及，与仅包含部分蛋白质的组合物相比较，治疗活性HIP/PAP的正确折叠对于包含所述蛋白质的药物组合物而言可以导致在肝再生方面的最佳生物效率。
在优选的实施方案中，HIP/PAP具有SEQ ID NO 1中所显示的氨基酸序列。在其它实施方案中，当与序列SEQ ID NO 1的蛋白质相比较时，HIP/PAP基本上与SEQ ID NO 1相同并且对于肝再生保留有相同生物活性，而氨基酸序列的不同归因于天然等位基因变异或突变作用。因此，在另一个实施方案中，HIP/PAP是包含与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少大约90％，并且优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性氨基酸序列的蛋白质。
本发明还包括HIP/PAP嵌合或融合蛋白质。如文中所使用，嵌合蛋白质或融合蛋白质包含上面所引用的与非HIP/PAP多肽融合的多肽。在融合 蛋白质中，HIP/PAP多肽和非HIP/PAP多肽彼此融合。非HIP/PAP多肽可以与HIP/PAP多肽的N末端或C末端融合。
例如，在一个实施方案中，融合蛋白质是HIP／PAP序列与GST序列的C末端融合的GST-HIP／PAP融合蛋白质。此类融合蛋白质可以易于重组HIP／PAP的纯化。
在所有情况下，本发明的融合蛋白质拥有与SEQ ID NO1的HIP／PAP相同的生物活性。
有两种不同的途径可以引发肝再生，一种是导致部分肝切除术或胆道结扎后分化肝细胞或胆细胞的复制(Fausto等，1994，Fausto等，2000)。第二个再生途径是中毒性损伤后、大块坏死或癌发生时所引发的，这时肝细胞或胆细胞的增殖由于损伤而受到破坏或减慢(Factor VM等，Petersen B等，(1998)，Akhurst B等)。在这些情况下，已经提出“干细胞样”细胞增殖并分化成肝细胞和胆上皮细胞并且重新构筑形成肝。在啮齿类中，所谓的卵形细胞代表异质细胞区，其中明确定义的亚群仍然必需进行分离。在人类中，卵形细胞区可能参与急性大块坏死后肝脏的重新构筑，并且在慢性肝疾病中也已经进行了鉴定(Roskams T等，Sell S等)。如文中所使用，短语“肝再生”涉及“干细胞样”细胞增殖并分化成肝细胞和胆上皮细胞且重新构筑肝脏的过程以及肝细胞和胆细胞的复制。
术语“生物活性量”涉及本发明组合物足以治疗与肝细胞数量减少相关的肝疾病的量，其中由HIP／PAP导致的肝再生能够恢复肝功能。
由HIP／PAP导致的肝再生在几种情况下是有用的，例如外科手术、移植、疾病，以及暴露于导致肝坏死或部分肝坏死的肝毒性化合物之后。
首先，本发明的药物组合物适于治疗急性和慢性肝衰竭。
急性肝衰竭通常由肝细胞大块细胞凋亡／坏死引起，并且代表源于病毒或毒性的破坏性状况。急性肝衰竭主要是由病毒性肝炎(大约70％的病例)、药物中毒(例如试图自杀期间使用的醋氨酚)引起的。
本发明的组合物能够治疗的慢性肝衰竭可以是由乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染或者酒精引起的。不但有慢性乙型肝炎、肝硬化还有非酒精 性脂肪肝疾病(NAFLD)。NAFLD是最近选择用于描述临床和病理综合征的术语，它涵盖了从简单的脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
因此，本发明的组合物适于治疗如下疾病导致的肝衰竭，例如乙型肝炎、丙型肝炎、尿素循环不良、家族性高胆固醇血症、酒精诱导的肝硬化、糖原贮积病、自身免疫性肝炎，、I型原发性尿草酸盐过多、原因不明的肝硬化、I型克．纳综合征、先天性肝纤维化、尼曼病、原发性胆汁性肝硬化、家族性淀粉样变、胆道闭锁、肝细胞癌、原发性硬化性胆管炎、肝母细胞瘤、阿拉日耶综合征、血管内皮瘤、家族性胆汁郁积、Non-Carciniodneuro-endocrine、药物诱导的肝衰竭、良性肝肿瘤例如灶性结节性增生、肝肿瘤如肝细胞癌和胆管癌、急性/暴发性肝衰竭、巴-希综合征、αl抗胰蛋白酶缺乏症、威尔逊病、血色素沉着病、酪氨酸血症、原卟啉症和囊性纤维化。
本发明的组合物适于治疗由于暴露于肝毒性化合物所造成的所有病理情况。
包括乙醇、病毒如HBV、HCV或HIV、蕈如 
amanite、寄生虫如恶性疟原虫(Plasmodium Falciparum)或者某些治疗剂在内的许多肝毒性化合物诱导细胞毒性和肝坏死。在这些治疗剂中，可以包括麻醉剂如安氟烷、神经精神药物如酰肼类、抗惊厥药如丙戊酸、镇痛药如醋氨酚、抗菌剂如两性霉素B或青霉素、激素类如醋磺己脲、心血管药物如罂粟碱、免疫抑制剂和抗瘤药如天冬酰胺酶、抗高血压药物、消炎药和杂项药物如维生素A、酚丁、碘离子。
尽管肝毒性的确切机制不清楚，但这些化合物对肝细胞代谢具有有害效应并且促进肝组织坏死和肝衰竭的出现。
特别地，如实施例9所示本发明的药物组合物适于治疗醋氨酚引起的肝衰竭且对醋氨酚中毒具有预防作用。
本发明进一步的目标在于对肝坏死具有有限有害影响的试剂盒(kit)，其包含：
(i)治疗有效量的肝毒性化合物，
(ii)有效量的多肽，该多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本发明还包括包含如上所定义的HIP/PAP多肽片段、HIP/PAP的生物活性部分或完整的HIP/PAP蛋白质的试剂盒。组合物的肝毒性化合物可以是上面所列举的那些化合物之一。
本发明的药物组合物还适于治疗肝切除和肝移植所引起的肝衰竭。本发明的药物组合物可以施用于肝移植供者、此种移植受者、肝切除后患者以预防通过刺激肝再生所引起的肝衰竭的产生和发展。
通过刺激肝再生，本发明的组合物具有其它有利作用。在这些有利作用中，可以引出的是其可以实现高效肝移植和部分肝移植的可能性和先体外后体内(ex vivo)刺激肝再生的可能性，例如在移植前刺激肝移植物、肝上皮细胞、肝干细胞或者经HIP/PAP遗传修饰细胞的生长。
特别地，本发明的药物组合物可以配制成适于肝移植物保存的草药剂型(galenic form)，优选HIP/PAP溶解或悬浮其中的液体培养基。
短语“肝衰竭”在文中以最广意义使用并指直接或间接源自肝上皮细胞(即肝细胞和胆细胞)数量减少的任何结构或功能损伤。
术语“肝移植”具有本领域的普通含义并包括部分或全部肝移植，其中供者的肝被部分或全部切除并且部分或全部移植给受者。根据手术模式可以将部分肝移植分为正位部分肝移植、异位部分肝移植等等，并且本发明可以应用于它们其中的任意一种。在部分肝移植中，一般将来自供者的对应于受者正常肝体积的大约30-50％的肝移植物或部分肝移植物作为移植物移植给肝脏已被全部切除的受者。但是即使移植物为大约30％或更小，本发明仍然具有促进肝再生或肝细胞生长的作用。
考虑到尸体器官供者明显短缺以及全世界等待移植的患者数量的指数增加以及活体肝移植(LDLT)在儿童受者中的成功，部分肝移植特别重要。实际上，尸体或大小匹配肝移植物的缺乏已经导致产生了减体积、劈离式活体肝移植的发展。尽管在移植物中很快出现再生，但是经历活体肝移植 的患者所接受的肝量要比接受尸体移植患者的小，并且在近些年逐步引发了小肝综合征的争论。小尺寸肝移植物可以通过公认的源自不足够大功能量肝的移植的临床综合征定义，并且代表着成人活体移植的最大障碍(Heaton，2003)。移植物与受者体重的比率小于0.8可削弱静脉流入，在临床状况差的患者体内导致门静脉高血和增强的代谢需求。将肝劈成右叶和左叶移植物会在受者内增加小尺寸的潜在危险。这些要点被认为是引发小肝综合征的主要因素，其引起肝再生受损和小移植物坏死。由于尺寸不匹配是成人活体相关肝移植的主要障碍，所以通过使用上述药物组合物降低SFSS影响将优化可得器官的使用并降低整体发病率和死亡率。
如文中所使用，“肝移植物”意思是通过上述移植手术移植入受者的肝，并且还包括对应于由供者部分肝组成的所谓“部分肝移植物”。肝移植意思还指将肝细胞(经遗传修饰或刺激增殖或分化的肝细胞)注射入门静脉。
如在肝移植情况中所使用，术语“肝再生”意思是指损失的肝组织由肝移植物或部分肝移植物的肝细胞生长所代替而发生的形态变化，而且还包括生物化学变化例如肝功能的改善、恢复或正常化。通过本发明组合物治疗的特定受试者包括例如为了治疗由肝脏疾病(例如肝炎；酒精、病毒、药物或未知原因引起的肝硬化或者肝癌)导致的肝衰竭已经全部切除肝脏后接受部分肝移植物的患者。
本发明的药物组合物还适于治疗肝脏缺血-再灌注(I/R)引起的肝衰竭，肝脏缺血-再灌注仍然是肝切除和肝移植两者的明显限制，并且可能造成肝衰竭、肺损伤和死亡。
尽管本说明书以下部分特别涉及包含HIP/PAP蛋白质的组合物配方，但其也适用于包含HIP/PAP多肽片段或生物活性部分的治疗性组合物。
为了本发明的目标，按照已知方法能够将HIP/PAP按配方制备药用组合物，由此HIP/PAP与可药用载体组合成混合物。适宜载体及其配方描述于Oslo等编的Remington′s Pharmaceutical Science(第16版；1980，Mack出版公司)。
“生理可接受赋形剂”意思是指固体或液体充填剂、稀释剂或物质，它们可以安全地用于全身或局部施用。取决于所施用的特定路线，本领域众所周知的多种可药用载体包括固体或液体充填剂、稀释剂、助溶剂、表面活性剂和包封物质。
这些组合物一般包含有效量HIP/PAP蛋白质(例如从大约6μg/ml至大约10mg/ml)并与适量载体一起制备成适于有效施用于患者的可药用组合物。
HIP/PAP可以通过肠胃外方式施用或者通过其它保证将其以有效形式递送至血流的方法施用。HIP/PAP优选地可以利用肝内途径施用。此类药物组合物的剂量和预期药物浓度依赖于所预想的特定用途而变化。在小鼠实验中，一般有效剂量为大约30μg/kg。以本领域已知的方式(如在Mordenti等，Pharmaceut Res 8第1351页(1991)中所公开)可以进行剂量的种间尺度确定。
制剂的pH主要取决于HIP/PAP蛋白质的特定类型和浓度，但无论何处pH范围优选在大约3至大约8范围内。
特别适用于HIP/PAP临床施用的组合物包括无菌水溶液或无菌的可水合粉末如冷冻干燥的蛋白质。一般而言，为了使制剂为等渗性的还可以在制剂中使用适量可药用盐。
通过经过膜(0.2微米)的无菌过滤容易地实现无菌。
HIP/PAP蛋白质药物组合物将以与良好医疗实践相一致的方式进行配制、给药和施用。在该情况下考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、各个患者的临床状况、病因、试剂的递送部位、施用方法、施用方案以及医疗从业者已知的因素。
欲施用HIP/PAP蛋白质的治疗“有效量”将通过此类考虑来控制，并且是诱导或者备选地促进肝再生并预防肝衰竭所必需的最小量。此量优选低于对哺乳动物具有毒性或者使哺乳动物对感染明显更加敏感的量。
如文中关于HIP/PAP蛋白质所使用的术语“施用”或“被施用”是指在肝切除或肝移植之前、之中或者之后进行的HIP/PAP蛋白质的施用。
根据本发明的细胞组合物
本发明的目标是包含与多肽相组合的分裂肝细胞的组合物，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本发明的另一个目标是包含已经用驱动多肽表达的表达盒转染的肝细胞的组合物，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
例如，如在标题为“在肝脏中表达HIP/PAP的转基因小鼠”部分中所描述可以获得上述的驱动多肽表达的表达盒。
如文中所使用的肝细胞是直接从肝脏收集得到的，或者从干细胞并且具体而言是已经分化为肝细胞的骨髓干细胞获得。Petersen等(1999)和Mitchell等已经报道了骨髓干细胞向肝细胞的分化。依靠此类骨髓干细胞能够避免为了获得体外肝细胞培养物而对肝切除术的依赖。
本发明的另一个目标是包含与多肽相组合的有效量骨髓干细胞的组合物，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
不希望被任何特定理论所束缚，发明者相信将用HIP/PAP处理的骨髓干细胞施用于患者可以加速肝再生过程。
上述细胞组合物可以用于例如为了体外细胞分析的目标而进行的肝细胞长期体外培养。上面细胞组合物的可得性避免了为了得到体外肝细胞培养物而对肝切除术的再次依赖。本发明还包含用于体内刺激肝再生的药物组合物，其包含有效量的上面所定义组合物。
在本发明优选的实施方案中，来自上面所述组合物的多肽由本说明书中所定义的HIP/PAP多肽片段、HIP/PAP的生物活性部分或完整的HIP/PAP蛋白质所替代。
根据本发明的过程
本发明的另一个目标是体外刺激肝细胞生长的过程，其包括：
(a)收集肝细胞；
(b)在适当培养基中培养所述肝细胞；
(c)用促有丝分裂量的多肽处理所述肝细胞，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
通过“促有丝分裂量”意思是指当加入到肝细胞培养物中诱导肝细胞生长之前，使用足够量的文中所定义多肽处理肝细胞。通常，如上面所指定的“促有丝分裂量”由能诱导所培养肝细胞增殖的所述多肽的量组成，该量可以由本领域技术人员通过例如实施例中所公开的BrdU掺入法容易地确定。
本发明的另一个目标是体外刺激肝细胞生长的过程，其包括：
(a)收集肝细胞；
(b)在适当培养基中培养所述肝细胞；
(c)用驱动HIP/PAP蛋白质在所述肝细胞内表达的转染所述肝细胞。
根据公开于实施例5中的技术并根据“材料和方法”部分中的相应部分可以助于进行步骤(a)-(c)。
如文中所使用，术语“收集肝细胞”意思是指直接从肝脏收集肝细胞，或者是指或者从干细胞并且具体而言是已经分化为肝细胞的骨髓干细胞获得。Petersen等(1999)和Mitchell等已经报道了骨髓干细胞向肝细胞的分化。依靠此类骨髓干细胞能够避免为了获得体外肝细胞培养物而对肝切除术的依赖。因此，本发明的另一个目标是体外刺激肝细胞生长的过程，其包括：
(a)收集骨髓干细胞；
(b)在适当培养基中培养所述骨髓干细胞；
(c)用促有丝分裂量的多肽处理所述骨髓干细胞，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
不希望被任何特定理论所束缚，发明者相信上述处理可增强骨髓干细胞再生成肝脏的能力。在本发明的优选实施方案中，来自上面所述过程的多肽由本说明书中所定义的HIP/PAP多肽片段、HIP/PAP的生物活性部分或完整的HIP/PAP蛋白质所替代。
根据本发明的用途
本发明的另一个目标在于多肽在制造用于体内刺激肝再生的药物组合物中的用途，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本发明的另一个目标在于多肽在制造用于在处于发展成肝衰竭危险中或已诊断为肝衰竭的患者体内预防肝衰竭产生或发展的药物组合物中的用途，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本发明还包含如上所定义的来自HIP/PAP的多肽片段和HIP/PAP的生物活性部分的用途。
在优选的实施方案中，肝衰竭是肝切除、肝移植或肝炎的结果。
在本发明的另一方面，本发明的用途涉及处于发展成肝衰竭危险中或已诊断为肝衰竭的患者的用途，其中所述肝衰竭由选自下列疾病中的一种疾病引起的：乙型肝炎、丙型肝炎、尿素循环不良、家族性高胆固醇血症、酒精诱导的肝硬化、糖原贮积病、自身免疫性肝炎，、I型原发性尿草酸盐过多、原因不明的肝硬化、I型克-纳综合征、先天性肝纤维化、尼曼病、原发性胆汁性肝硬化、家族性淀粉样变、胆道闭锁、肝细胞癌、原发性硬化性胆管炎、肝母细胞瘤、阿拉日耶综合征、血管内皮瘤、家族性胆汁郁积、Non-Carciniod neuro-endocrine、药物诱导的肝衰竭、良性肝肿瘤例如灶性结节性增生、肝肿瘤如肝细胞癌和胆管癌、急性/暴发性肝衰竭、巴-希综合征、α1抗胰蛋白酶缺乏症、威尔逊病、血色素沉着病、酪氨酸血症、原卟啉症和囊性纤维化。
根据本发明的方法
本发明的另一个目标是刺激肝再生的方法，其包括向患者施用有效量的多肽，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，本发明的方法包括这样一种方法，即其包括施用有效量的本说明书中所定义的来自HIP/PAP的多肽片段、HIP/PAP的生物活性部分或完整的HIP/PAP蛋白质。
本发明的另一个目标是使用对于预防或治疗疾病或病理生理状况有效的肝毒性治疗剂治疗患者的方法，其包括：
(a)同时或者以任选顺序将生物有效剂量的所述治疗剂和预防有效量的多肽施用于所述患者，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本发明的另一个目标是用于预防作为肝切除、肝移植或肝炎的结果的肝衰竭形成或发展的方法，其包括将有效量的多肽施用于患者，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
根据上面的方法，在肝切除或肝移植之前、之中或之后施用多肽。为了避免如手术后并发症，也可以将多肽施用于肝移植的供者或者受着。根据上面的方法，所使用的多肽是如本说明书中所定义的HIP/PAP的片段、HIP/PAP的生物活性部分或完整的HIP/PAP蛋白质。
本发明的另一个目标是在患者体内刺激肝再生的方法，其包括：
(a)从所述患者收集肝细胞；
(b)在适当培养基中培养所述肝细胞；
(c)使用促有丝分裂量的多肽处理所述肝细胞，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列；和
(d)将所述细胞注射入所述患者。
通过“促有丝分裂量”意思是指当注射入患者诱导肝细胞生长之前，使用足够量的文中所定义多肽处理肝细胞。通常，如上面所指定的“促有丝分裂量”由能诱导所培养肝细胞增殖的所述多肽的量组成，该量可以由本领域技术人员通过例如实施例中所公开的BrdU掺入法容易地确定。
根据公开于实施例5中的技术并根据“材料和方法”部分中的相应部分可以助于进行步骤(a)-(c)。
根据公开于实施例5中的技术并根据“材料和方法”部分中的相应部分能够有助于进行步骤(a)-(d)。在优选的实施方案中，该方法包括额外步骤：
(e)监测所述患者的肝衰竭的指征，和
(f)按照步骤(d)持续注射直到所述肝再生足够。
本发明的另一个目标是在患者体内刺激肝再生的方法，其包括：
(a)从所述患者收集肝细胞；
(b)在适当培养基中培养所述肝细胞；
(c)使用驱动HIP/PAP蛋白质在所述肝细胞内表达的表达盒转染所述肝细胞；和
(d)将所述细胞注射入所述患者。
例如，如在标题为“在肝脏中表达HIP/PAP的转基因小鼠”部分中所描述可以获得上述的驱动多肽表达的表达盒。
本发明的另一个目标是在患者体内刺激肝再生的方法，其包括：
(a)从所述患者收集骨髓干细胞；
(b)在适当培养基中培养所述骨髓干细胞；
(c)使用促有丝分裂量的多肽处理所述肝细胞，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列；
(d)将在步骤(c)得到的细胞注射入所述患者。
上述方法的可用性避免为了获得体外肝细胞培养物而对肝切除术的再 次依赖。不希望被任何特定理论所束缚，发明者相信将用HIP/PAP处理的骨髓干细胞施用于患者可以加速肝再生过程。
根据公开于实施例5中的技术并根据“材料和方法”部分中的相应部分可以助于进行步骤(a)-(d)。在优选的实施方案中，该方法包括额外步骤：
(e)监测所述患者的肝衰竭的指征，和
(f)按照步骤(e)持续注射直到所述肝再生足够。
在另一个实施方案中，本发明涉及在处于发展成肝衰竭危险中或已诊断为病毒性肝炎或自身免疫性肝炎或者肝硬化的患者体内预防肝衰竭产生或发展的方法，其包括向所述患者施用肝衰竭预防量的多肽，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
在上面方法的另一个实施方案中，所使用的多肽是如本说明书中所定义的HIP/PAP的片段、HIP/PAP的生物活性部分或完整的HIP/PAP蛋白质。
本发明还涉及作为用于体内刺激肝再生的组合物活性成分的HIP/PAP，其中所述组合物包含与至少一种生理可接受赋形剂相组合的有效量的多肽，其中所述多肽包含与由序列SEQ ID NO 1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽具有90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
本发明的进一步细节在以下非限制性实施例中图解说明。
材料和方法
HIP/PAP的产生和纯化：
如发明者先前所描述，HIP/PAP产生于转基因小鼠的乳汁中，其中转基因小鼠携带有能够驱动HIP/PAP基因在乳腺中表达的兔WAP基因(Christa等，2000)。
通过显微注射入C57BI/6xCBA杂交系的单细胞小鼠受精卵产生了携带WAP/HIP构建体的转基因小鼠。通过Southern印迹上的尾部DNA分 析鉴定这些小鼠。用SacI消化小鼠DNA，并且将所产生片段在1％琼脂糖凝胶上分离并转移至Nytran 13N。利用来自兔WAP基因上游区域的4.4-kbXhoI片段检测转基因的存在。
按照法国农业部指导方针(颁布于1988年4月19日)开展全部实验，包括处死之前用于动物处理的动物福利和条件。
-乳汁样品
在分娩后13天从麻醉小鼠收集乳汁，为了刺激射乳预先给小鼠注射0.05 U催产素。将小鼠乳汁稀释(1/10)于10mM Tris/HCl pH 7.5，100mMCaCl2，并在40 000g离心30分钟。弃去沉淀并将上清液在相同条件下再次离心。上清液或乳清立即用于HIP/PAP纯化或在20℃保持冰冻。
-从转基因小鼠乳汁中纯化HIP/PAP蛋白质
通过在0℃搅拌30分钟加入乙酸(1M)将所得到的抗乳血清(见上)酸化至pH 4.6。通过在Beckman 50.2 Ti转子(Gagny，法国)上以110 000g离心1小时去除沉淀物质。将上清液用1L的20mM醋酸钠缓冲液pH4.8在4℃透析过夜，通过如上的高速离心使其澄清并在Millex 0.22μm滤膜(Millipore，Guyancourt，法国)上过滤，然后加载到预先用70mM醋酸钠缓冲液pH 4.8平衡的Mono S HR5/5阳离子交换柱上。弃除流出液，并且当吸光度返回至基线时开始使用工作液中0-500mM NaCl的20mL梯度。柱流速为1mL/分钟并且收集1mL的级分。混合含HIP/PAP的级分，稀释于5倍体积的pH 4.0的140mM醋酸钠缓冲液中并重新应用于使用140mM醋酸钠缓冲液pH 4.0平衡的Mono S HR5/5柱。弃除流出液并使用工作缓冲液中范围为0-400mM NaCl的20mL梯度洗脱柱。柱流速为1mL/分钟并且收集1mL的级分。混合含HIP/PAP的级分，稀释于1倍体积的甘油中并贮于20℃。
使用Peterson蛋白质测定法测定样品中的蛋白质浓度。按照Laemmli的方法进行十二烷基硫酸钠变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(12.5％丙烯酰胺，SDS/PAGE)。使用imagemaster扫描并定量考马斯亮蓝染色的凝胶。
动物
-在肝脏中表达HIP/PAP的转基因小鼠
如图1中所述，将小鼠白蛋白基因18的调控区克隆入HIP/PAP基因片段上游以驱动人HIP/PAP基因在肝脏中特异性表达。在转基因部门(Villejuif，法国)进行的实验中，将完整的NotI/KpnI线性化构建体显微注射入杂交系的单一细胞的小鼠受精卵中。从遗传背景独立的建立者培育得到24和27个纯合转基因品系。处死之前用于动物处理的动物福利、条件和全部实验操作保证与法国农业部指导方针相一致(颁布于1988年4月19日)。
-对照小鼠
C57BL/6小鼠由IFFA CREDO(L′Arbresle，法国)提供并用作HIP/PAP转基因小鼠的对照。
-所分离肝细胞的受者
为了使任何的细胞排异反应危险最小化，6周龄雌性重症联合免疫缺陷综合症(SCID)小鼠(IFFA-CREDO，L′Arbresle，法国)用作从雄性HIP/PAP转基因小鼠或雄性C57BL/6小鼠(IFFA-CREDO，L′Arbresle，法国)所分离的肝细胞的受者。
部分肝切除术和体内BrdU掺入
如Higgins和Anderson(Higgins等)所描述，肝切除代表2月龄小鼠中总肝脏质量的70％。在切除前2小时对动物进行单次腹腔内注射溶于0.9％NaCl的BrdU(60mg/kg体重)。在肝切除术后24、36、46和55小时处死动物。对动物和肝脏进行称重并且在用抗BrdU抗体(克隆Bu 2OA)孵育之后计数BrdU标记的细胞核，并且利用Universal LSAB2辣根过氧化物酶试剂盒(Dako)进行显色，对于每张肝脏切片观察至少20个低放大倍数(×10)显微镜视野(Olympus BX60)。对于每张切片筛查1600个以上的细胞核。
原代培养的肝细胞
如先前所描述(Klaunig等，Renton等)，使用酶Liberase Blendzyme从2-3月龄的小鼠分离原代小鼠肝细胞。如Kreamer等所描述，使用低速 等密度珀可(Percoll)离心法纯化存活肝细胞。在Primaria板中将细胞以2×105和4×105(分别对于增殖实验和细胞凋亡实验)的密度重悬于含有青霉素、链霉素、两性酶素、牛血清白蛋白(0.1％)和胎牛血清(10％)的199培养基中。将细胞维持于37℃潮湿环境中并且当细胞贴附于板2和3小时后更换培养基。贴壁后，洗涤细胞一次并使用不含血清的相同培养基培养细胞，并且然后将细胞暴露于ActD(0.05μg/ml)和浓度范围为0.2-40ng/ml的TNF-α中17-18小时，除非在图例中另外指定。对于增殖实验，向培养基添加5×10-8M 3，5，3′-三碘甲腺原氨酸、10-7 M地塞米松、10μg/ml胰岛素、2×10-6M、5.5μg/ml转铁蛋白、7ng/ml硒、20mM丙酮酸盐和5％胎牛血清。
原代培养肝细胞的DNA合成
为了测量DNA合成，在评价之前的最后16小时加入BrdU(20mM)。肝细胞用PBS洗涤、固定并于-20℃在30∶70乙酸/乙醇溶液透化30分钟。使用BrdU标记和检测试剂盒II定位所掺入BrdU。通过对每个样品计数至少10个低放大倍数显微镜视野(Olympus CK2)中BrdU标记细胞的百分数测量复制DNA合成。每孔筛查1000个以上肝细胞。
原代培养肝细胞的细胞存活率和细胞凋亡评价
加入TNF-α17小时后，用4％多聚甲醛于室温下固定单细胞层20分钟，并用Hoechst 33258(0.5μg/ml)染色。使用Olympus BX60倒置荧光显微镜(Olympus America Inc.)在350和460nm波长之间检查凋亡细胞。使用MTT测定法定量细胞存活率的损失：用新鲜溶于培养基的xμl(0.5mg/ml)MTT溶液于37℃下处理96孔微孔滴定板中每孔30,000个细胞1小时。然后吸出培养基并加入100μl DMSO以溶解染料。使用Dynex MRX96孔微量培养板阅读仪(Dynex Technologies，法国)在570nm处测量吸光度。对于放置于同一块板上的HIP/PAP和野生型肝细胞，每次测量重复进行四次。通过接受特定处理的细胞的光密度读数除以未处理对照细胞的OD值读数然后乘以100来计算细胞存活的百分数。将结果与使用Hoechst33258观察到的凋亡细胞数相比较验证MTT测定法的精确性。
肝细胞分离和移植
如先前Klaunig和Renton所描述，使用酶Liberase Blendzyme，从两月龄雄性HIP/PAP转基因小鼠和雄性C57BL/6小鼠分离肝细胞。如Kreamer所描述，使用低速等密度珀可离心法纯化活的肝细胞。用溶于0.9％NaCl的甲苯噻嗪(Bayer，Leverkusen，德国)和氯胺酮(Biomérieux，Lyon，法国)将雌性SCID小鼠麻醉，穿过小的左侧切口将脾脏移至腹外，并且使用带有26-gauge针头的注射器注射悬于Williams培养基(Gibco/BRL)中的100μl细胞悬液(0.75×106个活的肝细胞)。进行部分肝切除术前，将受者SCID小鼠养30天以便有足够时间使得供者肝细胞增殖并再组织成肝实质。
肝再生的评价
在切除之前2小时，动物接受一次腹膜内注射60mg/kg体重的溶于0.9％NaCl的BrdU。在肝切除术后24、36、46和55小时处死动物。将动物和肝脏称重并且在用抗BrdU抗体(克隆Bu 20A)孵育之后计数BrdU标记的细胞核，并且使用Universal LSAB2辣根过氧化物酶试剂盒(Dako)进行显示，对于每张肝脏切片观察至少20个低放大倍数(×10)显微镜视野(Olympus BX60)。每张切片筛查1600个以上细胞核。
肝切除术后HIP/PAP纯化蛋白质注射
如先前所描述(Christa等，2000)产生并纯化重组HIP/PAP蛋白质，并将其以6μg/ml稀释于0.9％NaCl。在部分肝切除术后36小时，将100μlHIP/PAP蛋白质或PBS(磷酸缓冲盐)注射入重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠脾脏。部分肝切除术后8天处死动物。
通过RT-PCR分析检测移植的肝细胞
按照TRIZOL试剂(Life Technologies)提供的说明书从冰冻肝脏组织提取RNA。在10 U Rnasin、随酶提供的1×缓冲液、40mmol l-1四种脱氧核苷酸存在下，通过200单位莫洛尼鼠白血病逆转录酶(Promega)并以400ng随机引物(Invitrogen)引发，于42℃反应45分钟从1μg总RNA合成CDNA。通过使用纯的TaqTM Ready-To-GoTM PCR珠(Amersham Biosciences)，在温度94℃、60℃和72℃下各1分钟进行40轮扩增循环从1/8 cDNA中开展PCR。使用引物19/101检测人HIP/PAP转基因的表达。使用来自Itoh和Terakoa的小鼠公开序列的104/105引物检测内源性HIP/PAP/Mo基因的表达。
19正义：5′cgc ccc ggg atg ctg cct ccc atg gcc ctg
101反义：5′cgc gaa tcc gcc cat gat gag ttg cac acc aaa c 3′
104正义：5′cgc gga ttc atg ctg cct cca aca gcc tgc t 3′
105反义：5′cgc aag ctt tta acc agt aaa ttt gca gac ata 3′
HIP/PAP测定法：western印迹分析、免疫组织化学和ELISA测试
如上面所描述并按照Christa等，2000的方法从泌乳的转基因小鼠的乳汁中产生并纯化HIP/PAP蛋白质。如先前所描述(Christa等，1999)，使用pre-HIP抗体进行Western印迹分析和免疫组织化学。按照制造商的说明书(Dynabio，La Gaude，法国)使用夹心ELISA测试分析血清HIP/PAP水平。
转录因子STAT3的活化
通过TramsAM试剂盒(活性基序)并通过如先前所述开展的Western印迹分析(Simon等，2003)，使用总的抗STAT3抗体和抗磷酸化STAT3抗体(Santa Cruz)研究转录因子STAT3的活化。
肝脏细胞因子表达
通过如先前所述的RNA酶保护测定法(Tralhao JG，2002)评价肝脏细胞因子的表达。
APAP中毒
如Bedda等，2003或Ferret P.J.等，2001所描述，通过致死剂量APAP(1000mg/kg)使HIP/PAP转基因小鼠和C57BI6小鼠中毒。在向C57BI6小鼠腹膜内注射APAP之前1小时，将重组HIP/PAP蛋白质(600ng或1200ng)静脉注射入小鼠。监测动物24小时，并且利用Kaplan-Meier方法计算存活率。
统计学分析
原代培养肝细胞的结果表示为平均值±SD，并使用非配对Student′s检验确定统计显著性(P＜0.05)。由于数据分布不是正态分布，所以利用使用箱框和细线表示法通过掺入BrdU的细胞核的百分数表示体内肝再生，并且通过Mann-Whitney U检验(P＜0.05)确定HIP/PAP转基因小鼠和野生型小鼠之间差异的统计学显著性(Statview 5′，Abacus Concepts，Berkeley，CA)。
结果
实施例1：人HIP/PAP转基因小鼠的特征
HIP/PAP转基因特异表达于肝脏，并且在接着的两年之后表达HIP/PAP的小鼠没有形成肝脏肿瘤。免疫组织学定位分析检测转基因小鼠肝脏中HIP/PAP蛋白质为弥散性肝细胞内免疫染色，其占据了肝细胞的绝大部分细胞质(图2A，1和2)。染色是异质的并且阳性区域或者定位于小叶中心或者定位于肝腺泡的门管区。该种异质分布可能反映了HIP/PAP的分泌作用，因此在HIP/PAP分泌之前或之后肝细胞分别是阳性的或阴性的。HIP/PAP蛋白质分泌到纯合子转基因系24和27的血清中(250ng/ml-700ng/ml)，并且分泌到原代肝细胞的培养基中(对于每2×105个细胞为30-120ng/ml)。通过组织学检查检测到表达HIP/PAP肝细胞和对照肝细胞之间在形态学和倍数性没有差异(如先前Leist等所描述，贴壁后80％的小鼠肝细胞是双核的)。对培养的肝细胞的HIP/PAP免疫组织化学观察显示50％以上的肝细胞是HIP/PAP标记的(图2A、3和4)。对来自HIP/PAP转基因小鼠肝脏提取物和原代培养肝细胞的Western印迹分析检测到HIP/PAP为16 kDa的蛋白质(图2B)。在野生型小鼠中未检测到HIP/PAP蛋白质。肌动蛋白杂交允许精确估算对于肝脏和肝细胞所加载的50μg蛋白质(50μg对应于大约50,000个肝细胞)。
实施例2：在表达人HIP/PAP基因的小鼠中刺激肝再生
为了测试体内HIP/PAP对肝细胞增殖的效应，检测了通过部分肝切除术所诱导的肝再生。在部分肝切除术后24、36、46和55小时的低放大倍数(×20)图显示于图3A。在所指定的时间，HIP/PAP转基因肝脏中的阳性 BrdU细胞百分数高于野生型肝脏，尽管两组中掺入BrdU的细胞核的整体频率低。部分肝切除术46小时后，HIP/PAP转基因小鼠中掺入BrdU的核的百分数(中位数33％，范围20-42％)显著高于野生型小鼠(中位数18％；范围11-27％)(P＝0.0014)(图3B)。为了补充在肝再生期间HIP/PAP蛋白质可以作为生长因子起作用这一假说，在肝切除术后确立了野生型小鼠和转基因小鼠中肝质量恢复的时间过程(图3C)。测量正常的非肝切除小鼠的动物重量和肝脏重量。计算肝重/体重比率并表示为平均百分±SD。两组之间该比率没有差异：对于野生型小鼠和HIP/PAP转基因小鼠分别为0.0460±0.0064，n＝12和0.0489±0.0035，n＝16。在HIP/PAP转基因小鼠中肝脏恢复比在野生型小鼠中的更高，并且在48小时(p＜0.001)、60小时(p＜0.003)和96小时(p＜0.002)差异具有统计学意义。在120小时时，在野生型小鼠和HIP/PAP转基因小鼠中肝脏重量均恢复至同一百分数。
实施例3：HIP/PAP在原代培养肝细胞中的促有丝分裂作用
为了进一步研究在HIP/PAP转基因小鼠肝切除术后在体内所观察到的增强肝再生作用，使用原代培养肝细胞来评价HIP/PAP的促有丝分裂作用。当用EGF刺激时，在平板接种后60和84小时，来源于HIP/PAP转基因小鼠和野生型小鼠的肝细胞呈现出两个DNA合成高峰(图4A和B)。在60小时时，在转基因小鼠和野生型小鼠中BrdU阳性肝细胞的平均百分数分别为31±7％(n＝19)和16±4％(n＝20)(p＜0.0001)。当用HGF刺激细胞时，尽管差异未达到显著水平，但是HIP/PAP肝细胞中的DNA合成也高于野生型肝细胞(在60小时后分别为41±14％，n＝4对31±11％，n＝4)。当不用生长因子刺激肝细胞时，在转基因肝细胞和野生型肝细胞中BrdU掺入分别为11％±3(n＝8)和6％±3(n＝7)，并且差异具有统计学意义(p＝0.0146)。HIP/PAP是分泌蛋白质，并且因此测试了HIP/PAP蛋白质是否可以作为旁分泌促有丝分裂因子起作用。当HIP/PAP蛋白质(40ng.ml-1)加入到野生型肝细胞时，EGF诱导的DNA合成从16±4％增加至24±7％(p＝0.0168；n＝8；图4C)。这些结果显示HIP/PAP是原代培养肝细胞的促有丝分裂因子。因此在体内和体外都证明了HIP/PAP对肝细胞增殖的促有 丝分裂作用。
实施例4：HIP/PAP在原代培养肝细胞中抵抗TNF-α+ActD所诱导细胞凋亡的抗细胞凋亡作用
接下来检测了HIP/PAP促有丝分裂作用是否与HIP/PAP抗细胞凋亡作用相关。原代培养的大鼠肝细胞对于TNF-α单独处理引起的细胞死亡不敏感。相反，暴露于TNF-α和低剂量ActD组合后，它们通过细胞凋亡而死亡(22)。小鼠肝细胞的细胞死亡可以由TNF-α和剂量低至0.05μg/ml的ActD组合诱导，尽管ActD(0.05μgml-1)单独不能诱导生活力的任何损失(图5B)。已经显示(图5A)表达HIP/PAP的肝细胞抵抗TNF-α+ActD处理16-17小时后所诱导的细胞凋亡。对于2ng ml-1 TNF-α细胞存活率达到75％对43％(p＜0.0001)，并且对于20ng ml-1TNF-α细胞存活率达到60％对27％(p＜0.0001)。在HIP/PAP和野生型肝细胞中TNF-α的LD50分别超过40ng ml-1和1ng ml-1。使用泛caspase抑制剂z-VAD-fmk(50μM)预处理细胞完全防止了TNF-α诱导的细胞死亡，因此表明该过程通过肝细胞的细胞凋亡而发生。还检查了濒死细胞是否呈现细胞凋亡的典型特征。当使用Hoechst 33258染色时，非存活细胞表现出凝集的染色质、片段化细胞核和凋亡小体，而活细胞不表现出这些特征。通过TNF-α诱导的肝细胞凋亡的凋亡小体特征为组织成“玫瑰花结”(图5C)。当将HIP/PAP蛋白质(40ng ml-1)加入到野生型肝细胞时，抗20ng ml-1 TNF-α+ActD的保护作用从27％增加至47％(p＜0.0001)。这些数据证明在原代肝细胞中HIP/PAP部分地消除了TNF-α所诱导的细胞凋亡。
实施例5：通过从HIP/PAP转基因小鼠分离的肝细胞在小鼠内刺激肝再生
为了测试在少数肝脏细胞中的HIP/PAP表达对整个肝再生的作用，建立了体内实验模型。因此开展了从HIP/PAP转基因小鼠和C57BL/6小鼠所分离肝细胞的肝细胞移植，并且然后在SCID受者小鼠中测试部分肝切除术后肝再生的程度。
使用两种互补的方法评价肝细胞移植。第一，人HIP/PAP转基因表达的优点在于可以通过使用HIP/PAP抗体的免疫组织化学方法监测移植肝 细胞的命运。半定量测定表明移植的细胞仅构成受者肝脏的1/1000以下。而且，显示HIP/PAP表达于在肝脏切片中并不优先分布的有限数量的肝细胞中(门管区或小叶中心区)。第二，利用人HIP/PAP序列的存在以进行RT-PCR。部分肝切除术之前，确实在受者SCID肝脏中检测到人HIP/PAP的表达，因此证实了肝细胞移植。而且，在肝切除术后不同时间的肝切片中，人HIP/PAP持续表达。这些结果证明了移植的细胞持续刺激受者肝再生并保持基因表达。
然后评价了肝细胞的肝内植入关于在部分肝切除术后肝再生程度的作用。对部分肝切除术后8天的肝脏的目视评价显示用来自转基因HIP/PAP小鼠的肝细胞移植的受者小鼠中肝脏质量显著增加(图6A)。而且，通过肝脏重量测量也证实了这些发现，那就是用来自转基因HIP/PAP小鼠的肝细胞移植的受者小鼠中肝脏质量显著更高(图6B)。在部分肝切除术后48小时进行的BrdU掺入分析确实证实了当移植表达人HIP/PAP的肝细胞时细胞内DNA合成显著增加。因此750 000个活肝细胞的移植足以增加肝再生。对肝脏的标准组织学检查没有显示出任何明显的形态学改变。
实施例6：通过施用HIP/PAP在小鼠体内刺激肝再生
测试了注射纯化HIP/PAP是否与移植一样对肝再生具有作用。比较了部分肝切除术后8天SCID小鼠中剩余肝脏的重量，其中SCID小鼠已经在部分肝切除术后36小时注射了100μl纯化HIP/PAP(每只小鼠600ng)。图7中显示的结果表明，与注射PBS的小鼠相比注射HIP/PAP的小鼠中肝脏重量增加10％。该观察证明了HIP/PAP蛋白质的体内促有丝分裂的旁分泌作用。
实施例7：通过施用HIP/PAP在C57BI6小鼠中刺激肝再生和有丝分裂
已经比较了在C57BI6部分肝切除术后立即注射HIP/PAP蛋白质对立即注射盐水对部分肝切除术后46小时的肝质量恢复、BrdU掺入和有丝分裂的作用(图8)。部分肝切除术后46小时观察到肝脏质量恢复增加，尽管可能由于46小时在时间上太早而不能观察到肝脏质量的一致增加而导致该差异没有统计学意义(p＝0.08)。无论如何，在HIP/PAP注射小鼠中存在 BrdU掺入(p＜0.02)和有丝分裂数量(p＜0.04)的增加。
如通过每组小鼠平均数和中位数间的差异所估计，BrdU掺入和有丝分裂的分布是异质的。通过使用中位数检验(其是Ficher精确检验的应用)，已经验证了注射HIP/PAP的小鼠代表了与注射NaCl的小鼠具有统计学差异的一组小鼠(表1)
表1
为了描绘HIP/PAP对肝再生的益处，已经使用中位数检验模型用来根据BrdU和有丝分裂的组合中位数将小鼠分成四个名义上的组(图9)。根据与有丝分裂相关的BrdU，对小鼠种群的统计学分析已经显示与盐水注射小鼠相比更多的HIP/PAP注射小鼠对于BrdU细胞核和有丝分裂肝细胞(处于细胞周期的S/M期的肝脏)都是阳性的(p＝0.01)，这表明HIP/PAP能够通过细胞周期加速肝细胞进程。
实施例8：肝再生时间过程期间肝脏细胞因子的表达和STAT3转录因子的活化
为了使肝细胞起始进入细胞周期的G1期，必须通过TNF-α和IL-6细胞因子引发肝再生。在IL-6控制下，STAT3转录因子被磷酸化活化并转位至细胞核。然而，TNF-α/IL6表达和STAT3活化的持续性是有害的并且延迟再生的时间过程。已经研究了HIP/PAP对肝脏细胞因子表达和STAT3活化的影响。在本上下文中，已经比较了用HIP/PAP肝细胞对用 对照肝细胞移植的SCID小鼠在PHX(部分肝切除术)的T0和46小时后肝脏中的细胞因子的表达。RNA酶保护方法允许在一组4种提取物的同一实验中比较淋巴毒素-β(LT-β)、TNF-α和TGF-β((图10；在PHX后T0(泳道a和c)和T46小时(泳道b和d)的HIP/PAP转基因小鼠泳道a和b；SCID小鼠道c和d)。光密度分析将信号定量，其中信号已经对两个看家基因(L32和GAPDH)进行了标准化。结果显示当使用HIP/PAP或对照肝细胞进行移植时TGF-β的肝脏表达没有差异：在PHX后46小时，TGF-β以相同程度增加。相反，在用HIP/PAP肝细胞移植的SCID肝脏中LTβ和TNF-α(两种细胞因子属于同一功能家族)的表达被抑制。这些结果显示HIP/PAP抑制SCID肝脏中肝TNF-α的表达。
RNA酶保护方法不允许在SCID的肝再生期间检测IL6的表达。然而，已经在HIP/PAP转基因小鼠和C57BI6小鼠中研究了转录因子STAT3活化的动力学。在PHX后第一个24小时期间，相对于C57BI6小鼠在HIP/PAP转基因小鼠中活化了细胞核磷酸化STAT3的积累/降解时间过程(图11)。PHX后1小时就在HIP/PAP转基因小鼠中检测到活化作用，而在C57BI6小鼠中未检测到(p＝0.02)。而且，一到12小时，HIP/PAP小鼠体内的STAT3活化返回到比C57BI6小鼠中更低的水平(p＝0.04)。通过使用抗STAT3磷酸化抗体的western印迹分析验证并显示了这些结果(图11)。
实施例9：HIP/PAP是抗APAP诱导急性肝衰竭的保护性药物
通过相关实验动物模型能够模拟人急性肝衰竭诱导，包括APAP(醋氨酚)中毒。APAP过量导致NAPQ1产量增加，NAPQ1是消耗细胞内GSH库的高反应性代谢产物，GSH是具有氧化剂清除剂和氧化还原作用调节能力的非蛋白硫醇。因此，在小鼠APAP中毒期间，产生毒素活性氧(ROS)，导致急性肝衰竭。如在人类中一样，在小鼠中单次大剂量APAP能够引起大量小叶中心实质破坏和肝细胞死亡。已经研究了在APAP诱导的急性肝衰竭的小鼠模型中HIP/PAP蛋白质的治疗活性。为了该目的，已经测试了HIP/PAP转基因小鼠对在野生型小鼠中所注射的致死剂量APAP的抗性。 通过腹膜内注射稀释于200μL无菌磷酸缓冲盐的致死剂量1000mg/ml(APAP1000)，在24只HIP/PAP转基因小鼠和24只C57/bl6小鼠(每组中12只雄鼠和12只雌鼠)中实现了药物诱导的急性肝衰竭。
存活时间显示80％的HIP/PAP转基因小鼠(雄性或雌性)存活超过24小时，在野生型对照组中仅为25％。这些结果表明：虽然HIP/PAP蛋白质作用于肝细胞的再生和生活状态，但是对于以预防和治疗肝衰竭为目标的临床治疗应用，HIP/PAP蛋白质是好的候选药物(图12)。
为了研究HIP/PAP蛋白质对APAP中毒的预防性旁分泌保护作用，在施用APAP之前1小时已经通过C57BI6小鼠尾部静脉注射入HIP/PAP蛋白质。结果显示了HIP/PAP蛋白质的剂量依赖性预防保护作用：对于600ng，分别有4/10的HIP/PAP注射小鼠和2/10的盐水注射小鼠存活；对于1200ng，分别有8/10的HIP/PAP注射小鼠和2/10的盐水注射小鼠存活。
实施例10：在长期体内跟踪表达HIP/PAP转基因小鼠期间，HIP/PAP蛋白质为表现出毒性效应
能够刺激肝细胞增殖的任何药物具有引起癌症的潜能，以致于在任何施用之前必须确定形成HCC的危险性。已经研发出或者处于小鼠白蛋白基因启动子下(两个品系)或者处于小鼠金属硫蛋白基因启动子(两个品系)控制下表达人HIP/PAP基因的两个转基因小鼠模型。两个模型都靶向肝脏中HIP/PAP基因表达和血中HIP/PAP蛋白质的分泌。在两年的追踪后，没有一个HIP/PAP表达小鼠发展成肝脏肿瘤(或其它肿瘤)。
实施例11：HIP/PAP使易感染转基因小鼠中HCC形成延迟
已经研究了HIP/PAP蛋白质对来自双转基因小鼠长期追踪的肝脏致癌作用模型的影响。HIP/PAP转基因小鼠(金属硫蛋白启动子)与WHV/c-myc小鼠杂交，其中由旱獭肝炎(WHV)调控序列驱动的c-myc的肝脏特异性表达在所有动物中引起肝癌(Terradillos等，1997)。存活曲线显示双转基因小鼠的T50是60周(n＝87只小鼠)，WHV/c-myc癌小鼠的T50为42周(n＝39只小鼠)，这是由Terradillos等(1997)公开的中位数。对 于HIP/PAP转基因小鼠和同窝幼仔阴性对照小鼠，存活曲线是相同的。因此，首先，在这些小鼠的寿命期间内没有检测到HIP/PAP蛋白质的毒性，并且其次，已经显示在携带两个转基因(即WHV/c-myc和HIP/PAP)的小鼠中延缓了HCC的发病(图13)。
没有证据表明长期施用HIP/PAP具有毒性。而且，已经观察到在c-myc诱导肝癌的转基因小鼠中HCC发病延缓。
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Met Leu Pro Pro Met Ala Leu Pro Ser Val Ser Trp Met Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Met Leu Leu Ser Gln Val Gln Gly Glu Glu Pro Gln Arg Glu
20 25 30
Leu Pro Ser Ala Arg Ile Arg Cys Pro Lys Gly Ser Lys Ala Tyr Gly
35 40 45
Ser His Cys Tyr Ala Leu Phe Leu Ser Pro Lys Ser Trp Thr Asp Ala
50 55 60
Asp Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser Val Leu
65 70 75 80
Ser Gly Ala Glu Gly Ser Phe Val Ser Ser Leu Val Lys Ser Ile Gly
85 90 95
Asn Ser Tyr Ser Tyr Val Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gln Gly
100 105 110
Thr Glu Pro Asn Gly Glu Gly Trp Glu Trp Ser Ser Ser Asp Val Met
115 120 125
Asn Tyr Phe Ala Trp Glu Arg Asn Pro Ser Thr Ile Ser Ser Pro Gly
130 135 140
His Cys Ala Ser Leu Ser Arg Ser Thr Ala Phe Leu Arg Trp Lys Asp
145 150 155 160
Tyr Asn Cys Asn Val Arg Leu Pro Tyr Val Cys Lys Phe Thr Asp
165 170 175
Claims (13)
1.用于在体内刺激肝再生、提供抗慢性／急性肝衰竭保护、对肝细胞具有抗凋亡作用的药物组合物，其包含与至少一种生理可接受赋形剂相组合的有效量的多肽，其中所述多肽选自：
a)由序列SEQ ID NO1中起始于氨基酸残基36并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽；
b)由序列SEQ ID NO1中起始于氨基酸残基27并终止于氨基酸残基175的氨基酸序列组成的多肽；
c)SEQ ID NO1的人肝癌-肠-胰腺/胰相关蛋白质(HIP／PAP)。
2.对肝脏坏死具有有限有害效应的药物组合物，其包含：
(i)治疗有效量的肝毒性化合物，和
(ii)有效量的根据权利要求1所述的多肽。
3.组合物，其包含权利要求1所述的多肽和分裂肝细胞。
4.包含已经用表达盒转染的肝细胞的组合物，其中所述表达盒驱动根据权利要求1所述的多肽在所述的转染肝细胞中表达。
5.组合物，其包含根据权利要求1所述的多肽和有效量的骨髓干细胞。
6.用于体内刺激肝再生的药物组合物，其包含有效量的根据权利要求3-5中任意一项所述的组合物。
7.体外刺激肝细胞生长的方法，其包括：
(a)收集肝细胞；
(b)在适当培养基中培养所述肝细胞；和
(c)用促有丝分裂量的根据权利要求1所述的多肽处理所述肝细胞。
8.体外刺激肝细胞生长的方法，其包括：
(a)收集肝细胞；
(b)在适当培养基中培养所述肝细胞；和
(c)用表达盒转染所述肝细胞，所述表达盒驱动根据权利要求1所述的多肽在所述转染肝细胞中表达。
9.体外处理骨髓干细胞的方法，其包括：
(a)收集骨髓干细胞；
(b)在适当培养基中培养所述骨髓干细胞；和
(c)用促有丝分裂量的根据权利要求1所述的多肽处理所述骨髓干细胞。
10.根据权利要求1所述的多肽的用途，其用于制造用于体内刺激肝再生的药物组合物。
11.根据权利要求10的用途，用于制造用于治疗已经接受肝切除的患者的药物组合物。
12.根据权利要求11的用途，用于制造用于治疗如下患者的药物组合物，所述患者为接受部分肝脏移植的患者、以及具有由选自如下的肝脏疾病引起的肝衰竭的患者：(i)源自毒性、药物、病毒、酒精和未知病因的急性和慢性肝炎，(ii)外科手术和(iii)肝癌。
13.根据权利要求10的用途，用于制造用于治疗如下患者的药物组合物，所述患者患有选自以下的疾病：乙型肝炎、丙型肝炎、尿素循环不良、家族性高胆固醇血症、酒精诱导的肝硬化、糖原贮积病、自身免疫性肝炎、I型原发性尿草酸盐过多、原因不明的肝硬化、I型克-纳综合征、先天性肝纤维化、尼曼病、原发性胆汁性肝硬化、家族性淀粉样变、胆道闭锁、肝细胞癌、原发性硬化性胆管炎、肝母细胞瘤、阿拉日耶综合征、血管内皮瘤、家族性胆汁郁积、Non-Carciniod neuro-endocrine、药物诱导的肝衰竭、良性肝肿瘤例如灶性结节性增生、肝肿瘤如肝细胞癌和胆管癌、急性／暴发性肝衰竭、巴-希综合征、α1抗胰蛋白酶缺乏症、威尔逊病、血色素沉着病、酪氨酸血症、原卟啉症、囊性纤维化、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
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