PT1638594E - Composição de polipéptido hip/pap para uso na regeneração do fígado e para a prevenção de insuficiência hepática - Google Patents

Composição de polipéptido hip/pap para uso na regeneração do fígado e para a prevenção de insuficiência hepática Download PDF

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PT1638594E
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Marie-Therese Simon-Gage-Soufflot
Alain Pauloin
J Guilherme Tralhao
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Description

DESCRIÇÃO
COMPOSIÇÃO DE POLIPÉPTIDO HIP/PAP PARA USO NA REGENERAÇÃO DO FÍGADO E PARA A PREVENÇÃO DE INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA Âmbito do invento 0 presente invento diz respeito ao uso da proteína pancreática-associada / hepatocarcinoma-intestino-pâncreas humana (HIP/PAP) para estimular a regeneração do figado bem como à prevenção de insuficiência hepática.
Antecedentes da técnica A insuficiência hepática ocorre em diversas condições clinicas agudas e crónicas, incluindo hepatotoxicidade induzida por drogas, infecções virais, lesão vascular, doença auto-imune, ou trauma contuso. Além disso, pacientes sujeitos a erros inatos de metabolismo podem estar sob risco de desenvolvimento de insuficiência hepática. Os sintomas de insuficiência hepática que ocorrem como resultado destas condições clinicas incluem, por exemplo, hepatite aguda fulminante, hepatite crónica, ou cirrose, e em muitos casos, a restauração da função normal do figado é vital para a sobrevivência dos pacientes. Por exemplo, a cirrose é a sétima causa principal de morte e a quarta doença relacionada com a causa de morte em pessoas com idades entre 25 e 44. (Fonte: American Liver Foundation).
Em doenças agudas do figado, o figado pode regenerar após a lesão. Se a doença progredir para além da capacidade do figado em regenerar novas células, todo o metabolismo do organismo é severamente afectado. A perda da função do figado 1 pode resultar em instabilidade metabólica combinada com ruptura de funções corporais essenciais (i.e., abastecimento energético, equilíbrio ácido-base e termorregulação.) Se não for rapidamente invertido, ocorrem complicações tais como hemorragia descontrolada e septicemia, e órgãos dependentes, tais como o cérebro e os rins, deixam de funcionar devido a subprodutos tóxicos ou porque o fígado já não está a sintetizar nutrientes importantes. Após lesão grave do fígado, o tecido do fígado perde as suas funções regenerativas e metabólicas, e o transplante do fígado é uma estratégia terapêutica geralmente utilizada. Contudo, a aplicação clinica do transplante do fígado está limitada pela disponibilidade de hepatócitos humanos, de tecido de fígado e do número de células de fígado que podem ser transplantadas de modo seguro de uma vez. Além disso, as complicações latentes antes da cirurgia e pós-cirurgia podem ser críticas para contrariar a fase aguda da insuficiência hepática. Outra estratégia terapêutica consiste numa ressecção do fígado (remoção de uma parte do fígado). As indicações mais típicas para a ressecção do fígado são um tumor maligno, um carcinoma hepatocelular ou doenças biliares proliferativas incluindo colangiocarcinoma. Os tumores podem ser primários (desenvolvidos no fígado) ou metastáticos (desenvolvidos noutro órgão, que migram para o fígado). A maioria das metástases do fígado vem do cólon. 0 tumor único ou mais de um tumor confinado ao lado esquerdo ou ao lado direito do fígado pode ser ressecado com sucesso com uma sobrevivência a 5-anos tão elevada quanto 60%. As ressecções do fígado executadas em pacientes com doença extra-hepática podem aliviar os sintomas causados pelo tumor, mas conferem pouca melhoria na sobrevivência. Os tumores benignos do fígado (adenoma, e hiperplasia nodular focal) também podem ser geridos com sucesso através da ressecção do fígado. Também 2 são levadas a cabo ressecções do fígado em pessoas dispostas a doar parte do seu fígado.
Tendo em conta a importância do transplante de fígado e ressecção de fígado, foram sugeridas várias estratégias para estimular a regeneração do fígado e suprimir ou limitar a insuficiência hepática no caso de ressecção ou transplante do fígado.
Pensa-se que a célula do fígado é controlada por vários estimuladores do crescimento e citocinas inibidoras do crescimento de origem autócrina ou parácrina, contudo, o papel exacto e mecanismo de acção destes factores de crescimento estão longe serem completamente entendidos. As citocinas são péptidos ou proteínas segregados que regulam o metabolismo intermediário de aminoácidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos e minerais. As citocinas incluem péptidos ou proteínas que actuam para mediar a inflamação e estão envolvidas na comunicação intracelular que modula a proliferação celular, e a adesão de células inflamatórias às paredes dos vasos, e para a matriz extra-celular. As citocinas são essenciais para a comunicação entre o fígado e sítios extra-hepáticos e dentro do próprio fígado. As citocinas interagem com hormonas tais como glucocorticóides, resultando numa rede complexa de controlo mútuo. Muitas citocinas exercem actividade de crescimento para além dos seus efeitos pro-inflamatórios específicos. 0 fígado é um local importante de síntese de citocinas e o órgão de remoção principal de várias citocinas. Em doença do fígado, as citocinas estão envolvidos no início de respostas imunes intra-hepáticas, na regeneração do fígado, e na transformação fibrótica e cirrótica do fígado. 3
Pensa-se também que as células do fígado são controladas por vários factores de crescimento. Os factores de crescimento são necessários para regular eventos de desenvolvimento ou necessários para regular a expressão de genes que codificam outras proteínas segregadas que podem participar em comunicação intracelular e coordenação de desenvolvimento e incluem, factor-I e II do crescimento insulínico (IGF I e II), factor do crescimento epidérmico (EGF), factor do crescimento transformante do tipo a e tipo b (TGF-α e TGF-β), factor do crescimento derivado das plaquetas (PDGF).
Mostrou-se, in vitro, que a síntese de ADN em hepatócitos é estimulada por factores de crescimento tais como a TGFa, ou EGF. Mostrou-se que uma proteína adicional, designada factor de crescimento de hepatócitos (HGF) é um agente mitogénico para hepatócitos primários.
Com base nestas observações, foi proposto que estes factores podem ser mediadores importantes da regeneração do fígado. Consequentemente, os factores de crescimento como TGFa, EGF ou HGF com actividades do tipo factor de crescimento foram indicados no tratamento da regeneração do fígado. Contudo, estas estratégias terapêuticas, sugeridas para estimular a regeneração do fígado e suprimir a insuficiência hepática, não provaram a sua eficácia sem toxicidade, e efeitos adversos. Designadamente, estes factores de crescimento favorecem a progressão tumoral (Gangue-Hong, et al., 1992; Lee 1992; Horiguchi, et al. 2002).
Consequentemente, permanece uma necessidade na técnica para um método eficaz que estimule a regeneração do fígado, proteja contra a insuficiência hepática, e que não tenha efeitos tóxicos e cancerígenos adversos. Esta necessidade 4 existe em qualquer população paciente na qual a lesão do fígado tenha sido induzida. Esta necessidade existe não apenas para pacientes transplantados mas também para os dadores, e pacientes que foram submetidos a ressecção do fígado. Além disso, existe ainda uma necessidade na técnica para novos compostos terapeuticamente úteis que estimulem a regeneração do fígado.
Adicionalmente, tendo em conta a baixa disponibilidade de órgãos dadores, os dadores vivos de transplante parcial de fígado é reconhecido como uma medida para superar a falta de órgãos, e facilidade para transplante parcial de fígado. Contudo, o transplante parcial de fígado não pode ser considerado como uma operação segura para adultos que representam a maioria de pacientes de transplante porque o peso do fígado ressecável de dadores é frequentemente inferior ao peso de fígado necessário para o receptor. Assim existe uma necessidade para um meio de regeneração de fígado segura e rápida para enxertos pequenos.
Em conformidade, é objecto do presente invento proporcionar um meio para o estímulo da regeneração do fígado após ressecção parcial. Um objecto do presente invento consiste também em proporcionar uma droga que possa promover a regeneração do fígado ou crescimento de hepatócitos após transplante de fígado tal como transplante parcial do fígado, bem como após ocorrência de uma doença que cause insuficiência hepática, tal como cirrose, hepatite aguda e hepatite crónica.
Estes e objectos adicionais serão aparentes ao perito na técnica. 5
Sumário do invento 0 presente invento baseia-se na constatação experimental que a HIP/PAP tem efeitos mitogénicos e anti-apoptóticos in vitro em hepatócitos em cultura primária. Além disso, a HIP/PAP é uma molécula mitogénica e anti-apoptótica para hepatócitos, in vivo, durante a insuficiência hepática e a regeneração do fígado. 0 presente invento baseia-se também na constatação experimental que a HIP/PAP não tem efeitos adversos em mamíferos.
Um primeiro objecto do invento consiste numa composição farmacêutica para estimular a regeneração do figado in vivo compreendendo uma quantidade eficaz de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no residuo de aminoácidos 36 e termina no residuo de aminoácidos 175 da sequência SEQ ID N° 1, em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável.
Noutro aspecto, o presente invento refere-se a uma composição farmacêutica para estimular a regeneração do fígado in vivo compreendendo uma quantidade eficaz da proteina pancreática-associada/hepatocarcinoma-intestino-pâncreas humana (HIP/PAP) da sequência SEQ ID N° 1, em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável. 0 presente invento refere-se também a uma composição farmacêutica com efeitos adversos limitados em necrose hepática compreendendo: (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto hepatotóxico, 6 (ii) uma lesão no fígado por uma quantidade eficaz de um polipéptido como acima definido.
Descrição dos desenhos:
Figura 1 Representação esquemática do transgene. 0 aumentador (2 kb) e promotor (0,3 kb) das regiões reguladoras do gene da albumina de ratinho são indicados através de linhas a tracejado. Os exões II, III, IV, V e VI e os intrões do gene HIP/PAP humano (1,6 kb) são indicados por caixas pretas e uma linha a tracejado, respectivamente. O fragmento poli A da hormona do crescimento bovina (1021-1235) do pcDNA 3.1 é indicado por uma linha a tracejado. O ADN plasmídico é indicado pela linha carregada. Os locais de restrição relevantes são indicados pelas setas.
Figura 2 Imunodetecção da proteína HIP/PAP. A. Imunohistoquímica: ampliação x 20 original, 1 fígado de tipo selvagem, 2 HIP/PAP transgénicas do fígado, 3 hepatócitos do tipo selvagem, 4 HIP/PAP do hepatócito. B. Western blot por hibridação com anticorpos de actina e HIP/PAP que mostram uma banda com o tamanho esperado de 16 kDA e 45 kDa, respectivamente. Caminho 1 proteína HIP/PAP purificada (10 ng), caminhos 2, 3 e 4, fígado do tipo selvagem; HIP/PAP transgénica do fígado 27 e 24 estirpes homozigotas, respectivamente, caminhos 5, 6 e 7 HIP/PAP 27 do tipo selvagem, e 24 hepatócitos após isolamento, respectivamente. 7
Figura 3 Decurso no tempo de regeneração hepática in vivo após hepatectomia parcial. A. Imunodetecção de núcleos positivos BrU, em
figados do tipo selvagem (1, 2, 3, 4) e HIP/PAP transgénicos (5, 6, 1, 8); 1 e 5 24 horas, 2 e 6 36 horas, 3 e 7 46 horas, 4 e 8 55 horas após hepatectomia. B. Cada caixa dos bigodes compreende cinco linhas horizontais que exibem o 10°, 25°, 50°, 75°, percentil de uma variável. Todos os valores da variável acima do 90° percentil e abaixo do 10° percentil são representados separadamente, de forma que as caixas dos bigodes sejam valiosas no realce de qualquer valor extremo. Ratinhos de tipo selvagem (n=9), e HIP/PAP transgénico de ratinhos (n=10) (p=0,0014) . C. As massas dos figados foram medidas em ratinhos não submetidos a hepatectomia normal. A razão massa de figado/corpo foi calculada e expressa como a percentagem média ± DP. Não houve diferença nesta razão entre os dois grupos (0,0460 ± 0,0064, n=12 e 0,0489 ± 0,0035 n=16 para o tipo selvagem e HIP/PAP transgénico de ratinhos, respectivamente). A percentagem de recuperação média de massa de figado normal (± dp) em tipo selvagem (0) e HIP/PAP de ratinhos () a vários pontos no tempo após hepatectomia parcial mostra
recuperação estimulada na HIP/PAP transgénica de ratinhos (5 a 9 ratinhos foram submetidos a hepatectomia em cada momento para cada grupo) A diferença foi estatisticamente significativa às 48 8 horas (p < 0, 001), 60 horas (p < 0,003) e 96 horas (p < 0, 002) .
Figura 4 Síntese de ADN em hepatócitos do tipo selvagem e HIP/PAP transgénica. A. Imunodetecção de hepatócitos BrU-positivos a 60 horas, tipo selvagem (a), HIP/PAP (b) (ampliação original x 200). Os valores mostrados são a média ± DP de culturas independentes de 12 ratinhos de cada genótipo. B. Decurso no tempo de síntese de ADN em hepatócitos estimulados por EGF (30 ng.imlú1), tipo selvagem (0), HIP/PAP (). C. Síntese de ADN em hepatócitos cultivados 60 horas após plaqueamento: Adicionaram-se Factores de Crescimento (EGF 30 ng ml-1, HIP/PAP 40 ng ml-1) após ligação celular. Adicionou-se forskolin para as últimas 16 horas. Os dados de 4 a 20 das experiências foram apresentados como média ± DP (□) tipo selvagem, () HIP/PAP.
Figura 5 HIP/PAP inibe apoptose induzida por TNF-α +
ActD em hepatócitos primário cultivados. A. Redução na viabilidade celular dependente da dose de TNF-α em hepatócitos do tipo selvagem (□) e HIP/PAP transgénica (). Os dados apresentados são a média ± s.e.m de culturas independentes com quatro réplicas de cinco ratinhos de cada genótipo. B. Trataram-se os hepatócitos como indicado durante 17 horas, tipo selvagem (□), HIP/PAP () . Os 9 histogramas representam os valores médios ± s.e.m. de três experiências separadas com quatro réplicas. C. Núcleos picnóticos de hepatócitos ainda ligados foram corados com Hoechst 33258 (ampliação x 400). As setas indicam características de corpos apoptóticos organizadas em "rosetas" caracteristico da apoptose de hepatócitos induzida por TNF-α, tipo selvagem (1, 3, 5) HIP/PAP (2, 4, 6) culturas de controlo: sem adição (1 e 2), TNF-a 2 ng nf1 + ActD (3 e 4), TNF-a 20 ng ml-1 +ActD (5 e 6).
Figura 6 Estímulo da regeneração do fígado em ratinhos SCID transplantados com hepatócitos de ratinhos do tipo selvagem ou HIP/PAP transgénica. A. Avaliação macroscópica dos fígados de ratinhos SCID, transplantados com hepatócitos de ratinhos do tipo selvagem ou HIP/PAP transgénica, e mortos 7 dias após hepatectomia. B. Caixa dos bigodes das massas de fígado de ratinhos SCID hepatócito-transplantados 7 dias após hepatectomia. Observou-se uma diferença significativa (p=0,0008) entre SCID transplantados com hepatócitos do tipo selvagem versus SCID transplantados com hepatócitos HIP/PAP, usando o teste de Mann-Whitney.
Figura 7 Estímulo da regeneração do fígado em ratinhos SCID através da proteína HIP/PAP.
Caixa dos bigodes das massas de fígado de ratinhos SCID injectados via intra-esplénica 36 horas após hepatectomia parcial com proteína HIP/PAP (600 ng/ratinho) ou tampão fosfato (PBS) (100 pL) . 10
Sacrificaram-se os ratinhos 7 dias após hepatectomia. Observou-se uma diferença significativa (p=0,0022) entre SCID injectado com proteína HIP/PAP versus SCID injectado com PBS, usando o teste de Mann-Whitney.
Figura 8 Injecção da proteína HIP/PAP estimula a regeneração do fígado em ratinhos C57.
Comparou-se o efeito da proteína HIP/PAP versus solução salina injectada imediatamente após hepatectomia parcial de C57B16, na restauração da massa hepática, a incorporação de BrdU e mitose, 46 horas após hepatectomia parcial. Apresentam-se as caixas dos bigodes que representam a massa hepática, a incorporação de BrdU e mitose. Realizou-se um teste de Mann-Whitney, e p < 0,05 é considerado estatisticamente significativo.
Figura 9 Análise estatística da população de ratinhos de acordo com BrdU e mitose. A distribuição é estatisticamente diferente entre grupos, que são definidos de acordo com mediana combinada para a incorporação de BrdU e mitose 46 horas após hepatectomia parcial.
Figura 10 Expressão de citocinas hepáticas no fígado de ratinhos transplantados após hepatectomia.
Comparou-se a expressão de citocinas no fígado a TO de PHX (hepatectomia parcial) e após 46 horas em ratinhos SCID transplantados com HIP/PAP versus hepatócitos de controlo. A metodologia de protecção de Rnase permitiu comparar na mesma experiência linfotoxina-β (LTβ), TNF-α e TGF-β num pool de HIP/PAP transgénica de ratinho de 4 extractos de fígado caminhos a e b; ratinhos SCID caminhos c e d a TO (caminhos a e c) e a T46 horas após 11 PHX (caminhos b e d). Análise densitométrica quantificou os sinais que foram normalizados versus dois genes "house keeping" (L32 e GAPDH). Mediram-se também os níveis de ARNm em extractos de fígado. 0 gráfico representa para cada grupo de ratinhos, a média do teor de ARNm do L32 e GAPDH.
Figura 11 Mediu-se o decurso no tempo da acumulação/degradação pós-hepatectomia da activação de Stat 3 de fosfo-STAT3 nuclear em HIP/PAP transgénica versus ratinhos C57B16, durante as primeiras 24 horas após hepatectomia parcial (figura. 11). Detectou-se activação ao fim de 1 hora pós PHX em HIP/PAP mas não em ratinhos C57B16 (p=0,02). Além disso, a activação de STAT3 voltou a níveis inferiores em HIP/PAP relativamente a ratinhos C57B16 (p=0,04), ao fim de 12 horas. Os resultados foram validados e visualizados por análise western blot com anticorpos fosforilados anti-STAT3.
Figura 12 Ratinhos HIP/PAP transgénicos são protegidos contra insuficiência hepática aguda induzida por acetaminofeno (APAP).
A sobrevivência de ratinhos HIP/PAP transgénicos fêmea (Tg HIP fêmeas) e ratinhos HIP/PAP transgénicos macho (Tg HIP machos) tratados com uma dose letal de APAP (acetaminofeno) (1000 mg.kg-1), foi comparada à sobrevivência de ratinhos C57B16 de controlo (CT C57B16 machos e fêmeas), tratados por APAP ou PBS. Observou-se uma diferença significativa na sobrevivência entre ratinhos HIP/PAP transgénicos injectados com APAP versus ratinhos C57B16 de controlo injectados com APAP. A 12 HIP/PAP também tem um efeito preventivo contra intoxicação por APAP.
Figura 13 HIP/PAP não exibe efeito tóxico durante seguimento in vivo a longo prazo
Ratinhos HIP/PAP transgénicos (promotor da metalotioneina) foram cruzados com ratinhos WHV/c-myc nos quais a expressão especifica do figado de c-myc conduzida por sequências reguladora de hepatite de woodchuck (WHV) causa cancro do figado em todos os animais. As curvas de sobrevivência mostraram que ο T50 de ratinhos bi-transgénicos foi de 60 semanas (n=87 ratinhos) versus 42 semanas para ο T50 de onco-ratinhos WHV/c-myc (n=39 ratinhos). As curvas de sobrevivência foram idênticas para ratinhos HIP/PAP transgénicos e para os controlos negativos da mesma ninhada. Assim, em primeiro lugar, a toxicidade da proteína HIP/PAP durante o período de vida destes ratinhos não foi detectada e o início de HCC é atrasada em ratinhos que transportam ambos os transgenes, i.e., WHV/c-myc e HIP/PAP.
Descrição detalhada do invento:
Os inventores constataram de acordo com o invento que a HIP/PAP tem efeitos mitogénicos e anti-apoptóticos in vitro em hepatócitos em cultura primária. Além disso, a HIP/PAP é uma molécula mitogénica e anti-apoptótia para hepatócitos, in vivo, durante insuficiência hepática e regeneração do fígado. O gene da proteína pancreática-associada/ hepatocarcinoma-intestino-pâncreas humana (HIP/PAP) foi identificado devido à sua expressão aumentada em 25% no carcinoma hepatocelular humano usando análises northern blot (Lasserre et ai., 1992). 13
Mostrou-se que a proteína HIP/PAP é detectada em indivíduos normais no intestino (células de Paneth e neuro-endrócinas) e no pâncreas (células acinares pancreáticas e ilhotas de Langerhans) . A proteína HIP/PAP também é detectada em algumas células do fígado progenitoras potenciais à volta da área portal do fígado normal (Christa et al., 1999). A HIP/PAP é rapidamente sobre-expressa durante a fase aguda da pancreatite. Também actua como uma molécula de adesão para hepatócitos de ratinhos e interage com proteínas da matriz extracelular tais como laminina-1 e fibronectina. Esta proteína contém um péptido de sinal putativo, e assim pertence para ao grupo VII da família das lectinas do tipo C, de acordo com a classificação de Drickamer e análise estrutural (Abergel et al., 1999).
Constataram agora os inventores que a regeneração do fígado é estimulada, in vivo, em ratinhos que expressam o gene da HIP/PAP humana, após hepatectomia parcial. Adicionalmente, constataram de acordo com o invento que a HIP/PAP também tem um efeito mitogénico in vitro em hepatócitos de cultura primária. Noutro aspecto, constatou-se também de acordo com o invento que a HIP/PAP tem um efeito anti-apoptótico contra apoptose induzida por TNF-α combinada com actinomicina D em hepatócitos de cultura primária. Mostrou-se também de acordo com o invento que hepatócitos que expressam de modo recombinante HIP/PAP induzem a regeneração do fígado, quando injectados localmente em fígado parcialmente ressecável de ratinhos. Os inventores mostraram que a proteína HIP/PAP, quando injectada em ratinhos submetidos a hepatectomia parcial, induz a regeneração do fígado. Levando estas observações em linha conta, os inventores mostraram que a proteína HIP/PAP proporciona efeitos mitogénicos e anti-apoptóticos eficazes, e protege contra insuficiência 14 hepática, in vivo, não tem efeitos adversos e é particularmente destituída de qualquer efeito carcinogénico, em contraste com os factores de crescimento conhecidos na técnica tais como HGF, TGFa ou EGF, como acima descrito.
Analisados em conjunto, estes resultados demonstram a importância terapêutica da HIP/PAP na regeneração do fígado. Assim, estes resultados experimentais permitiram aos inventores projectar composições farmacêuticas para estimular a regeneração do fígado in vivo compreendendo uma quantidade eficaz da proteína pancreática-associada/ hepatocarcinoma-intestino-pâncreas humana (HIP/PAP) da sequência SEQ ID N° 1, em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável.
Um primeiro objecto do invento consiste numa composição farmacêutica para estimular a regeneração do fígado in vivo incluindo após insuficiência hepática crónica/aguda, compreendendo uma quantidade eficaz de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e que termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1, em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável. 0 invento também diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo um fragmento polipeptídico de HIP/PAP, que é eficaz para a regeneração do fígado. Este polipéptido da sequência que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1 consiste numa parte biologicamente activa da proteína HIP/PAP que foi 15 previamente descrita como uma sequência do Dominio de Reconhecimento de Carbohidratos (CRD) (Christa et al. 1994).
Num primeiro modo de execução preferido, a composição farmacêutica do invento compreende uma parte biologicamente activa da HIP/PAP como acima descrito, que pode ser isolada de células ou fontes de tecido por um esquema de purificação apropriado usando técnicas de purificação de proteínas padrão.
Noutro modo de execução preferido da dita composição farmacêutica a parte biologicamente activa da HIP/PAP é produzida através de técnicas de ADN recombinante, tal como descrito nos exemplos. De acordo com um terceiro modo de execução preferido, a parte biologicamente activa da HIP/PAP é quimicamente sintetizada usando técnicas de síntese de péptidos padrão.
Uma parte biologicamente activa isolada ou purificada da HIP/PAP está substancialmente isenta de material celular ou outras proteínas contaminantes da célula ou fonte de tecido da qual a HIP/PAP é derivada, ou substancialmente isenta de precursores químicos quando quimicamente sintetizada.
Para determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos, as sequências são alinhadas para fins de comparação óptimos. Por exemplo, podem ser introduzidos hiatos numa ou em ambas de uma primeira e segunda sequência de aminoácidos para alinhamento óptimo e as sequências não-homólogas podem ser ignoradas para fins de comparação. 16
Para fins de comparação óptimos, a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos pode ser alcançada com CLUSTAL W (versão 1.82) com os seguintes parâmetros: (1) MODO CPU = ClustalW mp; (2) ALINHAMENTO = «completo»; (3) FORMATO DE SAÍDA = «aln com números»; (4) ORDEM DE SAÍDA = «alinhado»; (5) ALINHAMENTO DA COR = «não»; (6) KTUP (tamanho da palavra) = «defeito»; (7) COMPRIMENTO DA JANELA = «defeito»; (8) TIPO DE MARCAÇÃO = «percentagem»; (9) TOPDIAG = «defeito»; (10) PAIRGAP = «defeito»; (11) TIPO FILOGENÉTICO ÁRVORE/ ÁRVORE = «nenhum»; (12) MATRIZ = «defeito»; (13) ABERTURA DO HIATO = «defeito»; (14) HIATOS TERMINAIS = «defeito»; (15) EXTENSÃO do HIATO = «defeito»; (16) DISTÂNCIAS DOS HIATOS = «defeito»; (17) TIPO DE ÁRVORE = «cladogram» e (18) DISTÂNCIAS GRAP DA ÁRVORE = «escondido».
Partes biologicamente activas da HIP/PAP incluem péptidos compreendendo sequências de aminoácidos suficientemente homólogas à sequência de aminoácidos completa da HIP/PAP de SEQ ID N° 1, que incluem o mesmo número de aminoácidos que a HIP/PAP completa, e exibem pelo menos a mesma actividade biológica que HIP/PAP.
Partes biologicamente activas da HIP/PAP incluem péptidos adicionais compreendendo sequências de aminoácidos suficientemente homólogas à sequência de aminoácidos completa da HIP/PAP de SEQ ID N° 1, que incluem mais aminoácidos que a HIP/PAP completa, e exibem pelo menos a mesma actividade biológica que HIP/PAP.
Pretende-se que pela "mesma actividade biológica", aplicado a péptidos biologicamente activos homólogos à HIP/PAP, signifique aqui péptidos que induzem regeneração do figado in vivo com a mesma ordem de magnitude que a HIP/PAP completa, 17 como pode ser facilmente determinado pelo perito na técnica, por exemplo medindo a incorporação de BrdU por hepatócitos, e medindo a restauração da massa de figado como mostrado no Exemplo 2.
Tal como é aqui utilizado a parte biologicamente activa da HIP/PAP abrange um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade com o polipéptido da sequência que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1. De acordo com o invento uma primeira sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com uma segunda sequência de aminoácidos, compreende pelo menos 90%, e de preferência pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade em aminoácidos com a dita segunda sequência de aminoácidos.
Os polipéptidos de acordo com o invento também compreendem variantes, tal como a sequência CRD de diferentes mamíferos, e por exemplo da proteína "thread" pancreática bovina (BPTP) ou a proteína 1 pancreática associada (PAP1) do rato, descrita por Orelle, et al.
Para além das variantes alélicas naturais da parte biologicamente activa das sequências da HIP/PAP que existem em mamíferos, o perito na técnica apreciará adicionalmente que podem ser introduzidas alterações por mutação na sequência nucleotídica de SEQ ID N° 1, conduzindo assim a mudanças na sequência de aminoácidos da HIP/PAP sem alterar a actividade biológica da HIP/PAP.
Além disso, podem ser feitas substituições de aminoácidos não essenciais nas sequências que correspondem à HIP/PAP. Um 18 resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo de aminoácido que pode ser alterado da sequência da HIP/PAP do tipo selvagem sem alterar a actividade biológica, ao passo que um resíduo de aminoácido "essencial" é necessário para a actividade biológica.
Um segundo objecto do invento consiste numa composição farmacêutica para estimular a regeneração do fígado in vivo compreendendo um polipéptido da sequência que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1, em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável.
Outro objecto do invento consiste numa composição farmacêutica para estimular a regeneração do fígado in vivo compreendendo uma quantidade eficaz de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 27 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1, em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável.
Um objecto adicional do invento consiste numa composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 compreendendo uma quantidade eficaz do polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 27 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1, em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável.
Outro objecto do invento consiste numa composição farmacêutica para estimular a regeneração do fígado in vivo 19 compreendendo uma quantidade eficaz da proteína pancreática-associada / hepatocarcinoma-intestino-pâncreas humana (HIP/PAP), em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável.
Sem desejar ser associado a qualquer teoria particular, os inventores julgam que a proteína HIP/PAP completa da sequência SEQ ID N° 1, i.e. um polipéptido compreendendo a sequência CRD, um péptido sinal, e um pro-péptido, conduz a um melhor pregueamento da dita proteína, particularmente quando a dita proteína é produzida através de técnicas de ADN recombinante em células eucarióticas que foram transfectadas com uma cassete de expressão que a codifica. A propósito, um correcto pregueamento da HIP/PAP terapeuticamente activa pode conduzir a uma melhor eficiência biológica para a composição farmacêutica compreendendo a dita proteína, para a regeneração do fígado comparado a uma composição compreendendo apenas uma parte da proteína.
Num modo de execução preferido, a HIP/PAP tem a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID N° 1. Noutros modos de execução, a HIP/PAP é substancialmente idêntica à SEQ ID N° 1 e retém a mesma actividade biológica, para a regeneração do fígado, quando comparado à proteína da sequência SEQ ID N° 1, mas difere na sequência de aminoácidos devido a variações alélicas naturais ou por mutagénese. Em conformidade, noutro modo de execução a HIP/PAP é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90%, e de preferência 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 1. O invento também abrange proteínas HIP/PAP quiméricas ou de fusão. Tal como é aqui utilizado, uma proteína quimérica ou 20 uma proteína de fusão compreende os polipéptidos acima citados que são fundidos a um polipéptido que não HIP/PAP. Dentro da proteína de fusão, o polipéptido HIP/PAP e o polipéptido não-HIP/PAP são fundidos um ao outro. 0 polipéptido não-HIP/PAP pode ser fundido ao terminal N ou ao terminal C do polipéptido HIP/PAP.
Por exemplo, num modo de execução, a proteína de fusão é uma proteína de fusão GST-HIP/PAP na qual a sequência HIP/PAP é fundida ao terminal C da sequência de GST. Tais proteínas de fusão podem facilitar a purificação de HIP/PAP recombinante.
Em todos os casos as proteínas de fusão do invento possuem a mesma actividade biológica que a HIP/PAP da SEQ ID N° 1.
Duas vias diferentes activam a regeneração do fígado, uma causa a replicação de hepatócitos diferenciado ou células biliares após hepatectomia parcial ou ligação do dueto biliar (Fausto et al., 1994, Fausto et al., 2000). A segunda via regenerativa é activada após lesão tóxica, em necrose massiva ou carcinogénese, quando a proliferação de hepatócitos ou células biliares é prejudicada ou retardada pela lesão (Factor VM et al., Petersen B et al., (1998), Akhurst B et al.). Nestas condições, propôs-se a proliferação e diferenciação de células do tipo estaminais em hepatócitos e células epiteliais biliares, e então repopular o fígado. Em roedores, as células designadas ovais representam um compartimento celular heterogéneo no qual sub-populações bem definidas têm que ainda ser isoladas. Em humanos, os compartimentos das células ovais podem participar na repopulação do fígado após necrose massiva aguda, e também foram identificadas em doenças do fígado crónicas (Roskams T, et al., Sell S et al.) . Tal como é aqui utilizado, a frase 21 «regeneração do fígado» diz respeito ao processo pelo qual células «do tipo estaminais» proliferam e diferenciam-se em hepatócitos e células epiteliais biliares, e então repopulam o fígado bem como a replicação de hepatócitos e células biliares. 0 termo "quantidades biologicamente activas" diz respeito à quantidade da composição de acordo com o invento suficiente para tratar as doenças do fígado associadas a um número diminuído de hepatócitos, em que a regeneração do fígado conduzida por HIP/PAP pode restabelecer a função hepática. A regeneração do fígado conduzida pela HIP/PAP pode ser útil em várias situações tais como cirurgia, transplante, doenças, e após exposição a compostos hepatóxicos conduzindo a necrose hepática ou necrose hepática parcial.
Em primeiro lugar, as composições farmacêuticas de acordo com o invento são adequadas no tratamento de insuficiência hepática agudo e crónica. A insuficiência hepática aguda é geralmente causada por uma apoptose/necrose massiva dos hepatócitos, e representa uma condição devastadora de origem virai ou tóxica. A insuficiência hepática aguda é principalmente induzida por hepatite virai (cerca de 70% dos casos), através de envenenamento por drogas, por exemplo com acetaminofeno durante tentativa de suicídio. A insuficiência hepática crónica que pode ser tratada pelas composições de acordo com o invento pode ser induzida através de infecções por vírus da hepatite B ou C ou pelo álcool. A hepatite B crónica, a cirrose, mas também a doença do fígado 22 gordo não alcoólica (NAFLD). NAFLD é um termo recentemente escolhido para descrever uma sindrome clinica e patológica que abrange um espectro desde esteatose simples a esteato-hepatite não alcoólica (NASH).
Em conformidade, as composições de acordo com o invento são adequadas no tratamento de insuficiência hepática, a seguir a doenças tais como:
Hepatite B, Hepatite C, defeitos no ciclo da ureia, hipercolesterolemia familiar, cirrose induzida pelo álcool, Doença de Armazenamento de Glicogénio, Hepatite Auto-imune, Hiperoxalúria Primária do tipo I, cirrose Criptogénica, sindrome de Crigler-Najjar do tipo I, Fibrose Hepática Congénita, Doença de Neimann-Pick, Cirrose Biliar Primária, Amiloidose Familiar, Atresia Biliar, Carcinoma Hepatocelular, Colangite obliterante primária, Hepatoblastoma, Sindrome de Alagille, Hemangioendotelioma, Colestase Familiar, Não-carcinóide neuro-endócrino, insuficiência hepática induzida por drogas, tumor do fígado benigno tal como hiperplasia nodular focal tumores do fígado tais como carcinoma Hepatocelular e Colangiocarcinoma, insuficiência hepática Aguda/fulminante, sindrome de Budd-Chiari, deficiência de Alfa-l-antitripsina, Doença de Wilson, Hemocromatose, Tirosinemia, Protoporfiria, e fibrose cística.
As composições de acordo com o invento são adequadas no tratamento de todas as situações patológicas que resultam de uma exposição a compostos hepatotóxicos. Vários compostos hepatotóxicos, incluindo álcool, vírus, tais como HBV, HCV ou HIV, cogumelos, tais como amanite de 23 "phaloidide", parasitas tais como Plasmodium Falciparum ou certos terapêuticos, induzem citotoxicidade e necrose hepática. Entre estes terapêuticos, podemos divulgar analgésicos, tais como Enflurane, neuro-psicotrópicos tais como Hidrazidas, anticonvulsivantes tal como ácido valpróico, analgésicos, tal como Acetaminofeno, antimicrobianos tais como Anfotericina B ou Penicilina, hormonas tais como Acetohexamidas, drogas cardiovasculares, tal como Papaverina, Imunosupressores e antineoplásticos, tal como asparaginase, drogas anti-hipertensão, drogas anti-inflamatórias e drogas diversas tais como vitamina A, Oxifenisatina, ião iodeto.
Embora o mecanismo exacto da hepatotoxicidade seja incerto, estes compostos têm efeitos prejudiciais no metabolismo de hepatócitos e contribuem para a necrose do tecido hepático, e aparecimento de insuficiência hepática.
Especialmente, como mostrado no exemplo 9, as composições farmacêuticas de acordo com o invento são adequadas no tratamento de insuficiência hepática causada pelo acetaminofeno, e têm um efeito preventivo contra intoxicação por acetaminofeno.
Um objecto adicional do invento consiste num equipamento com efeito adverso limitado na necrose hepática compreendendo: (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto hepatotóxico, (ii) uma quantidade eficaz de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no 24 resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1. 0 invento também abrange um equipamento compreendendo um fragmento polipeptídico de HIP/PAP, parte biologicamente activa da HIP/PAP ou a proteína HIP/PAP completa como acima definido. 0 composto hepatotóxico da composição pode ser um dos acima citados.
As composições farmacêuticas de acordo com o invento também são adequadas no tratamento de insuficiência hepática, a seguir a ressecção do fígado e transplante do fígado. A composição farmacêutica de acordo com o invento pode ser administrada ao dador de uma transplante de fígado, para o receptor de tal transplante, a pacientes após uma ressecção do fígado para prevenir o estabelecimento ou progressão de insuficiência hepática por estimulação da regeneração do figado.
Ao estimular a regeneração do figado, as composições do invento têm outros efeitos benéficos. Entre eles, podemos citar a oportunidade de tornar o transplante de figado e o transplante parcial de fígado com maior eficácia e também a oportunidade para estimular a regeneração do fígado ex vivo, por exemplo estimular o crescimento de um transplante de fígado, células epiteliais do fígado, células estaminais do fígado, ou células de HIP/PAP geneticamente modificadas antes do transplante.
Especialmente, as composições farmacêuticas de acordo com o invento podem ser formuladas numa forma galénica adequada para a preservação de transplantes de figado, de preferência um meio líquido em que a HIP/PAP é dissolvida ou suspensa. 25 A frase "insuficiência hepática" é aqui utilizada no sentido mais amplo, e indica qualquer lesão estrutural ou funcional que resulta directa ou indirectamente de um número diminuído de células epiteliais do fígado i.e. hepatócitos e células biliares . 0 termo "transplante de fígado" tem o significado comum na técnica e inclui transplante parcial e total do fígado no qual um fígado de um dador é parcialmente ou completamente submetido a ressecção e parcialmente ou completamente transplantado para um receptor. 0 transplante parcial de fígado é classificado pelo modo de operação em transplante parcial de fígado ortotópico, transplante parcial de fígado heterotópico, e semelhantes, e o presente invento pode ser aplicado a qualquer deles. No transplante parcial de fígado, um transplante de fígado ou um transplante parcial de fígado de um dador correspondendo a aproximadamente 30-50% do volume normal do fígado de um receptor é tipicamente transplantado como um enxerto no receptor cujo fígado foi completamente submetido a ressecção. Mas o presente invento tem o efeito de promover a regeneração do fígado ou crescimento de hepatócitos mesmo se o enxerto for de aproximadamente 30% ou menos. 0 transplante parcial de fígado é de particular importância no que diz respeito à escassez significativa de dadores de órgão de cadáveres, associado com um crescimento exponencial no número de pacientes nas listas de espera por todo o mundo e o sucesso de dadores vivos de transplante de fígado (LDLT) em receptores pediátrico. Na prática, a falta de enxertos de fígado de cadáveres ou de tamanho adequado conduziu ao desenvolvimento de transplante de fígado reduzido, dividido de dadores vivos. Embora a regeneração ocorra rapidamente no 26 enxerto transplantado, os pacientes submetidos a enxertos de fígado de dadores vivos recebem uma massa hepática menor que os que recebem um transplante de cadáver, e a controvérsia sobre a síndrome de tamanho pequeno intensificou nos últimos anos. Os enxertos de fígado de tamanho pequeno podem ser definidos por uma síndrome clínica reconhecida que resulta do transplante de uma massa funcional insuficientemente grande de fígado num determinado receptor, e representa o maior obstáculo ao transplante de dadores vivos em adultos (Heaton, 2003) . Uma razão da massa do enxerto para a massa de receptor inferior a 0,8 prejudica os afluxos venosos resultando em hipertensão portal e maiores necessidades metabólicas em pacientes com uma condição clínica debilitada. A divisão de fígados em enxertos do lóbulo direito e esquerdo aumenta os riscos potenciais de tamanho pequeno no receptor. Estes pontos são considerados como um factor principal que causa síndrome de tamanho pequeno que dá origem a regeneração do fígado prejudicada e necrose do enxerto pequeno. Como um mau ajuste do tamanho é um obstáculo principal na sobrevivência do adulto relacionada com transplante de fígado, a redução do impacto de SFSS usando as composições farmacêuticas supracitado optimizará o uso de órgãos disponíveis e reduzirá a morbosidade e mortalidade globais.
Tal como é aqui utilizado "transplante do fígado" significa um fígado transplantado para um receptor pela operação de transplante como acima descrito, e também inclui o designado "transplante parcial do fígado" que corresponde a um enxerto que consiste em parte do fígado de um dador. O transplante de fígado também significa injecção de hepatócitos (geneticamente modificados ou estimulados para proliferarem ou diferenciarem) na veia portal. 27
Tal como usado no caso de transplante de fígado, a frase "regeneração do fígado" significa alterações morfológicas nas quais tecidos do fígado perdidos são substituídos por crescimento de hepatócitos de um transplante de fígado ou transplante parcial de fígado, mas também inclui alterações bioquímicas tais como melhoria, recuperação, ou normalização das funções hepáticas. Indivíduos específicos a serem tratados pela composição do invento incluem, por exemplo, pacientes que receberam transplante parcial do fígado depois de o fígado ter sido completamente ressecado para tratar insuficiência hepática causada por doenças do fígado tais como hepatite, cirrose hepática alcoólica, causa virai, por droga ou desconhecida, ou cancro hepático.
As composições farmacêuticas de acordo com o invento são também adequadas no tratamento de insuficiência hepática a seguir a reperfusão isquémica Hepática (I/R) que permanece uma limitação significativa tanto para ressecção do fígado como transplante do fígado, e pode ser responsável por insuficiência hepática, lesão pulmonar e morte.
Embora a parte seguinte da especificação refira-se especialmente à formulação de composições compreendendo a proteína HIP/PAP, também é adequada para composições terapêuticas compreendendo fragmentos polipeptídicos ou partes biologicamente activas da HIP/PAP.
Para os propósitos do presente invento, a HIP/PAP pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, pelos quais a HIP/PAP é combinada em mistura com um portador farmaceuticamente aceitável. Portadores adequados e suas formulações encontram- 28 se descritos em Remington's Pharmaceutical Science, 16° ed, 1980, publicações Mack Co, editado por Oslo et al.
Pretende-se que "excipiente fisiologicamente aceitável" signifique enchedor sólido ou liquido, diluente ou substância que podem ser usadas de modo seguro em administração sistémica ou tópica. Dependendo da via de administração particular, existem uma variedade de portadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica e incluem enchedores, diluentes, hidrotopos, agentes tensioactivos sólidos ou líquidos e substâncias de encapsulação.
Estas composições conterão tipicamente uma quantidade eficaz da proteína HIP/PAP, por exemplo, da ordem de desde cerca de 6 yg/ml até cerca de 10 mg/ml, juntamente com uma quantidade adequada de portador para preparar composições farmaceuticamente aceitáveis adequadas para administração eficaz ao paciente. A HIP/PAP pode ser administrado por via parentérica ou por outro método que assegure a sua entrega à circulação sanguínea numa forma eficaz. A HIP/PAP pode ser de preferência administrada usando uma via intra-hepática. As dosagens e concentrações de droga desejadas de tais composições farmacêuticas podem variar dependendo do uso particular desejado. Uma dose eficaz típica em experiências de ratinho é de cerca de 30 μ/kg. O escalonamento das dosagens entre espécies pode ser executado de um modo conhecido na técnica e.g. como divulgado em Mordenti et al., Pharmaceut Res 8 pl351 (1991). 29 Ο ρΗ da formulação depende principalmente do tipo particular e da concentração de proteína HIP/PAP, mas varia de preferência em qualquer lugar de cerca de 3 a cerca de 8.
Composições particularmente bem adequadas para a administração clínica de HIP/PAP incluem soluções aquosas esterilizadas ou pós hidratáveis esterilizados tal como proteína liofilizada. Tipicamente, também é usada uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável na formulação para tornar a formulação isotónica. A esterilização é prontamente alcançada por filtração estéril através de membranas (0,2 mícron). A composição farmacêutica da proteína HIP/PAP será formulada, doseada, e administrada de um modo consistente com a boa prática médica. Factores a considerar neste contexto incluem a desordem particular a ser tratada, o mamífero particular a ser tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa da desordem, o local de entrega do agente, o método de administração, o esquema de administração, e outros factores conhecidos dos médicos. A "quantidade terapeuticamente eficaz" de proteína HIP/PAP a ser administrada será governada por tais considerações, e é a quantidade mínima necessária para induzir, ou alternativamente aumentar a regeneração do fígado e prevenir insuficiência hepática. Tal quantidade é de preferência inferior à quantidade que é tóxica ao mamífero ou torna o mamífero significativamente mais susceptível a infecções. O termo "administração" ou "administrado" tal como é aqui utilizado em referência à proteína HIP/PAP refere-se à 30 administração da proteína HIP/PAP que ocorre antes de, simultaneamente, ou após uma ressecção do fígado, ou um transplante do fígado.
Composições celulares de acordo com o invento
Um objecto do invento consiste numa composição compreendendo dividir hepatócitos em combinação com um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1.
Outro objecto do invento consiste numa composição compreendendo hepatócitos que foram transfectados com uma cassete de expressão que conduz a expressão de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1.
Uma cassete de expressão que conduz a expressão de um polipéptido como acima descrito pode ser obtida por exemplo como descrito na parte intitulada "Ratinhos transgénicos que expressam HIP/PAP no fígado".
Os hepatócitos tal como são aqui utilizados, são directamente recolhidos de um fígado, ou obtidos de células estaminais e particularmente de células estaminais da medula óssea que foram diferenciadas em hepatócitos. A diferenciação de células estaminais da medula óssea em hepatócitos foi 31 divulgada em Petersen et al., (1999) e Mitchell et al. 0 recurso a tais células estaminais da medula óssea pode evitar o recurso a hepatectomia para obter culturas de hepatócitos in vitro.
Um objecto adicional do invento consiste numa composição compreendendo uma quantidade eficaz de células estaminais da medula óssea em combinação com um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1.
Sem desejar ser associado a qualquer teoria particular, os inventores julgam que a administração de células estaminais da medula óssea tratadas com HIP/PAP a um paciente pode acelerar o processo de regeneração do fígado.
As composições celulares acima descritas podem ser utilizadas para cultura de hepatócitos in vitro a longo prazo, por exemplo para a finalidade de ensaios celulares in vitro. A disponibilidade das composições celulares anteriores evita um recurso recorrente a hepatectomia para obter culturas de hepatócitos in vitro. O invento também compreende composições farmacêuticas para estimular a regeneração do fígado in vivo compreendendo uma quantidade eficaz de uma composição como aqui em acima definido.
Em modos de execução preferidos do presente invento, o polipéptido das composições acima citadas é substituído por um fragmento polipeptídico de HIP/PAP, uma parte biologicamente activa de HIP/PAP ou a proteína HIP/PAP completa como definido na presente especificação. 32
Processo de acordo com o invento
Outro objecto do invento consiste num processo para estimular o crescimento de hepatócitos in vitro compreendendo: (a) recolher hepatócitos; (b) cultivar os ditos hepatócitos num meio de cultura apropriado; (c) tratar os ditos hepatócitos com uma quantidade mitogénica de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1.
Pretende-se que "quantidade mitogénica" signifique que os hepatócitos serão tratados com uma quantidade suficiente do polipéptido como aqui anteriormente definido para induzir crescimento de hepatócitos quando adicionados a uma cultura de hepatócitos. De um modo geral, uma "quantidade mitogénica" como acima especificado consiste numa quantidade do dito polipéptido que induz a proliferação dos hepatócitos cultivados, como pode ser facilmente determinado pelo perito na técnica, por exemplo por incorporação de BrdU como divulgado nos exemplos.
Outro objecto do invento consiste num processo para estimular o crescimento de hepatócitos in vitro compreendendo: (a) recolher hepatócitos; (b) cultivar os ditos hepatócitos num meio de cultura apropriado; 33 (c) transfectar os ditos hepatócitos com uma cassete de expressão que conduz a expressão da proteína HIP/PAP nas ditas células hepáticas.
Os passos (a) a (c) podem ser conduzidos de acordo com as técnicas divulgadas no exemplo 5 e à secção correspondente na parte "materiais e métodos." A frase "recolher hepatócitos", tal como é aqui utilizado, significa que os hepatócitos são directamente recolhidos de um fígado, ou significa que eles são obtidos de células estaminais e particularmente de células estaminais da medula óssea que foram diferenciadas em hepatócitos. A diferenciação de células estaminais da medula óssea em hepatócitos foi divulgada em Petersen et al., (1999) e Mitchell et al. 0 recurso a tais células estaminais da medula óssea pode evitar o recurso a hepatectomia para obter culturas de hepatócitos in vitro. Assim, outro objecto do invento consiste num processo para estimular o crescimento de hepatócitos in vitro compreendendo: (a) recolher células estaminais da medula óssea; (b) cultivar as ditas células estaminais da medula óssea num meio de cultura apropriado; (c) tratar as ditas células estaminais da medula óssea com uma quantidade mitogénica de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1. 34
Sem desejar ser associado a qualquer teoria particular, os inventores julgam que o tratamento acima descrito aumenta a capacidade das células estaminais da medula óssea em regenerar o figado. Em modos de execução preferidos do presente invento, o polipéptido do processo acima citado é substituído por um fragmento polipeptidico de HIP/PAP, uma parte biologicamente activa de HIP/PAP ou a proteína HIP/PAP completa como definido na presente especificação.
Uso de acordo com o invento
Outro objecto do presente invento consiste no uso de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1 na manufactura de uma composição farmacêutica para estimular a regeneração do fígado in vivo.
Um objecto adicional do presente invento consiste no uso de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1 na manufactura de uma composição farmacêutica para a prevenção do estabelecimento ou progresso de insuficiência hepática num paciente sob risco de desenvolver ou ter sido diagnosticado com insuficiência hepática. O invento também abrange o uso de fragmentos polipeptídicos de HIP/PAP e partes biologicamente activas da HIP/PAP como acima definido. 35
Num modo de execução preferido, a insuficiência hepática é uma consequência de uma ressecção do figado, um transplante do figado, ou hepatite.
Num aspecto adicional do invento, o uso de acordo com o invento diz respeito a um paciente sob risco de desenvolver ou ter sido diagnosticado com insuficiência hepática causada por uma doença compreendida no grupo que consiste em:
Hepatite B, Hepatite C, defeitos no Ciclo da Ureia, hipercolesterolemia Familiar, cirrose induzida por álcool, Doença de Armazenamento de Glicogénio, Hepatite Auto-imune, Hiperoxalúria Primária do tipo I, cirrose Criptogénica, sindrome de Crigler-Najjar do tipo I, Fibrose Hepática Congénita, Doença de Neimann-Pick, Cirrose Biliar Primária, Amiloidose Familiar, Atresia Biliar, Carcinoma Hepatocelular, Colangite obliterante Primária, Hepatoblastoma, Sindrome de Alagille, Hemangioendotelioma, Colestase Familiar, Não-carcinóide neuro-endócrino, insuficiência hepática induzida por Droga, tumor do figado benigno tal como hiperplasia nodular focal tumores do figado tais como carcinoma Hepatocelular e Colangiocarcinoma, insuficiência hepática aguda/fulminante, sindrome de Budd-Chiari, deficiência em Alfa-l-antitripsin, Doença de Wilson, Hemocromatose, Tirosinemia, Protoporfiria, e fibrose cística. Métodos de acordo com o invento
Outro objecto do invento consiste num método para estimular a regeneração do fígado compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de 36 aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no residuo de aminoácido 36 e termina no residuo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1 a um paciente.
Num modo de execução preferido, o método de acordo com o invento abrange um método compreendendo administrar uma quantidade eficaz de fragmentos polipeptidicos de HIP/PAP, partes biologicamente activas de HIP/PAP ou a proteína HIP/PAP completa como definido na presente especificação.
Outro objecto do invento consiste num método para o tratamento de um paciente com um agente terapêutico hepatotóxico eficaz na prevenção ou tratamento de uma desordem ou condições fisiológicas patológicas, compreendendo: (a) administrar ao dito paciente, simultaneamente ou em ordem opcional, uma dose biologicamente eficaz do dito agente terapêutico e uma quantidade eficaz sob o ponto de vista preventivo de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1.
Outro objecto do invento consiste num método para a prevenção do estabelecimento ou progresso de insuficiência hepática, consequência de uma ressecção do fígado, um transplante de fígado, ou uma hepatite compreendendo administrar a um paciente uma quantidade eficaz de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de 37 identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no residuo de aminoácido 36 e termina no residuo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1.
De acordo com o método anterior, o polipéptido é administrado antes, durante ou após uma ressecção do figado ou um transplante de figado. 0 polipéptido também pode ser administrado ao dador de um transplante de figado, ou ao receptor para evitar, por exemplo, complicações pós-cirurgia. De acordo com o método anterior o polipéptido usado é um fragmento da HIP/PAP, uma parte biologicamente activa da HIP/PAP ou a proteína HIP/PAP completa como definido na presente especificação.
Outro objecto do invento consiste num método para estimular a regeneração do fígado num paciente compreendendo: (a) recolher hepatócitos do dito paciente; (b) cultivar os ditos hepatócitos num meio de cultura apropriado; (c) tratar os ditos hepatócitos com uma quantidade mitogénica de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1; e (d) injectar as ditas células no dito paciente.
Pretende-se que "quantidade mitogénica" signifique que os hepatócitos serão tratados com uma quantidade suficiente do polipéptido como aqui anteriormente definido antes de induzir 38 uma regeneração do fígado quando injectado num paciente. De um modo geral, uma "quantidade mitogénica" como acima especificado consiste numa quantidade do dito polipéptido que induz proliferação dos hepatócitos cultivados, como pode ser facilmente determinado pelo perito na técnica, por exemplo por incorporação de BrdU como divulgado nos exemplos.
Os passos (a) a (d) podem ser conduzidos de acordo com as técnicas divulgadas no exemplo 5 e à secção correspondente na parte "material e métodos." Num modo de execução preferido, o método compreende passos adicionais: (e) monitorizar o dito paciente para indicação de insuficiência hepática, e (f) Continuar injecções de acordo com o passo (d) até a dita regeneração do fígado ser suficiente.
Outro objecto do invento consiste num método para estimular a regeneração do fígado num paciente compreendendo: (a) recolher hepatócitos do dito paciente; (b) cultivar os ditos hepatócitos num meio de cultura apropriado; (c) transfectar os ditos hepatócitos com uma cassete de expressão que conduz a expressão da proteína HIP/PAP nas ditas células hepáticas, e (d) injectar as ditas células no dito paciente.
Uma cassete de expressão que conduz a expressão de um polipéptido como acima descrito pode ser obtida por exemplo como descrito na parte intitulada "Ratinhos transgénicos que expressam HIP/PAP no fígado." 39
Um objecto adicional do invento consiste num método para estimular a regeneração do figado num paciente compreendendo: (a) recolher células estaminais da medula óssea do dito paciente; (b) cultivar as ditas células estaminais da medula óssea num meio de cultura apropriado (c) tratar as ditas células com uma quantidade mitogénica de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1 (d) injectar as células obtidas no passo (c) no dito paciente. A disponibilidade do método anterior evita um recurso recorrente a hepatectomia para obter culturas de hepatócitos in vitro. Sem desejar ser associado a qualquer teoria particular, os inventores julgam que a administração de células estaminais da medula óssea tratadas com HIP/PAP a um paciente pode acelerar o processo de regeneração do fígado.
Os passos (a) a (d) podem ser conduzidos de acordo com as técnicas divulgadas no exemplo 5 e na secção correspondente na parte "material e métodos." Num modo de execução preferido, o método compreende passos adicionais: (e) Monitorizar o dito paciente para indicação de insuficiência hepática, e (f) Continuar injecções de acordo com o passo (e) até que a dita regeneração do fígado seja suficiente. 40
Num outro modo de execução o invento refere-se a um método para a prevenção do estabelecimento ou progresso de insuficiência hepática num paciente a risco de desenvolver ou ter sido diagnosticado com hepatite virai ou auto-imune, ou um cirrose compreendendo administrar ao dito paciente uma quantidade preventiva de insuficiência hepática de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1.
Noutro modo de execução do método anterior, o polipéptido usado é um fragmento da HIP/PAP, uma parte biologicamente activa da HIP/PAP ou a proteína HIP/PAP completa como definido na presente especificação. O invento também diz respeito a HIP/PAP como um ingrediente activo de uma composição para estimular a regeneração do fígado in vivo, compreendendo uma quantidade eficaz de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N° 1 em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável.
Detalhes adicionais do invento são ilustrados nos seguintes exemplos não limitativos 41
MATERIAIS E MÉTODOS
Produção e purificação de HIP/PAP:
Produziu-se HIP/PAP em leite de ratinho transgénico que transporta o gene WAP de coelho capaz de conduzir a expressão do gene HIP/PAP na glândula mamária, como previamente descrito pelos inventores (Christa et al., 2000). A construção dos ratinhos transgénico que transportam WAP/HIP foi gerada por microinjecções numa célula zigótica de ratinho de estirpes hibridas C57BI/6xCBA. Estes foram identificados por análises de ADN da cauda em Southern blots. O ADN de ratinho foi digerido com Saci, e os fragmentos gerados separados em géis de agarose a 1% e transferidos para Nytran 13N. A presença do transgene foi detectada usando um fragmento Xhol de 4,4-kb derivado da região a montante do gene WAP de coelho.
Todas as experiências, incluindo o bem-estar dos animais e condições para manipulação dos animais antes do sacrifício, foram conduzidas conforme as directrizes do Ministério da Agricultura Francês (datadas de 19 de Abril de 1988). - Amostras de leite
Recolheu-se leite no dia 13 pós-parto de ratinhos anestesiados previamente injectados com 0,05 U de oxitocina para estimular a extracção do leite. O leite de ratinho foi diluído (1/10) em Tris/HCl 10 mM pH 7,5, CaCl2 100 mM, e centrifugado durante 30 min a 40 000 g. Rejeitou-se o pellet e centrifugou-se novamente o sobrenadante sob as mesmas condições. O sobrenadante ou lactosoro foi imediatamente 42 usado para a purificação de HIP/PAP ou mantido congelado a 20 °C.
Purificação da proteína HIP/PAP de leite de ratinho transgénico O lactosoro resultante (ver acima) foi acidificado a pH 4,6 pela adição de ácido acético (1 M) sob agitação a 0 °C durante 30 min. O material precipitado foi removido por centrifugação a 110 000 g durante 1 h num rotor Beckman 50,2 Ti (Gagny, França). O sobrenadante foi dialisado durante a noite a 4 °C contra 1 L de tampão acetato de sódio 20 mM pH 4,8, clarificado por centrifugação a alta velocidade como anteriormente e filtrado num filtro Millex 0,22 ym (Millipore, Guyancourt, França) antes de ser carregado numa coluna de permuta catiónica Mono S HR 5/5 previamente equilibrada com tampão acetato de sódio 70 mM pH 4,8. Rejeitou-se o que escoou, e iniciou-se um gradiente de 20-mL de NaCl 0-500 mM no tampão de trabalho quando a absorvância voltou à linha base. O caudal da coluna foi de 1 mL min-1 e recolheram-se fracções de 1-mL. Agruparam-se as fracções contendo HIP/PAP, diluíram-se em 5 vol. de tampão acetato de sódio 140 mM a pH 4,0 e reaplicaram-se à coluna Mono S HR 5/5 equilibrada com tampão acetato de sódio 140 mM pH 4,0. Rejeitou-se o que escoou e a coluna foi desenvolvida com um gradiente de 20-mL variando de 0 a 400 mM de NaCl no tampão de trabalho. O caudal da coluna foi de 1 mL/min e recolheram-se fracções de 1-mL. Agruparam-se as fracções contendo HIP/PAP, diluíram-se em 1 vol. de glicerol e armazenaram-se a 20 °C.
Determinaram-se as concentrações de proteína nas amostras usando o ensaio de proteínas Peterson. Levaram-se a cabo géis 43 de poliacrilamida desnaturante em dodecil sulfato de sódio (12,5% acrilamida, SDS/PAGE) de acordo com Laemmli. Correram-se géis corantes de coomassie azul e quantificou-se usando uma máscara de imagem.
Animais - Ratinhos transgénico que expressam HIP/PAP no figado.
Clonou-se a região reguladora do gene 18 da albumina de ratinho a montante do fragmento do gene de HIP/PAP para conduzir uma expressão do gene HIP/PAP humano especificamente no figado como descrito na figura 1. Procedeu-se à microinjecção da construção NotI/Kpnl linearizada completa em célula únicas zigóticas de ratinho de estirpes híbridas na Experimentação no departamento de Transgénese (Villejuif França). As linhas transgénicas homozigotas 24 e 27 foram desenvolvidas de criadores independentes em base genética. As condições de bem-estar dos animais para a manipulação dos animais foram asseguradas antes do sacrifício e todos os procedimentos experimentais foram assegurados de acordo com as directrizes do Ministério Francês da Agricultura (datadas de 19 de Abril de 1988). - Ratinhos de controlo
Os ratinhos C57BL/6 foram facultados por IFFA CREDO (L'Arbresle, França) e foram utilizados como controlos de ratinhos HIP/PAP transgénicos. 44
Receptores de hepatócitos isolados
Ratinhos fêmea com seis semanas de idade com imunodeficiência combinada severa (SCID) (IFFA-CREDO, L'Arbresle França) foram utilizados como receptores de hepatócitos isolados de ratinhos HIP/PAP transgénicos macho ou ratinhos C57BL/6 macho (IFFA-CREDOA, L'Arbresle França), para minimizar qualquer risco de rejeição celular.
Hepatectomia parcial e incorporação de BrdU in vivo. A ressecção do fígado representa 70% da massa total do fígado, como descrito por Higgins e Anderson (Higgins et ai.) em ratinhos com dois meses de idade. Os animais receberam uma injecção intra-peritoneal de 60 mg por kg de massa corporal de BrdU em NaCl a 0,9% durante 2 horas antes da dissecação. Foram sacrificados 24, 36, 46 e 55 horas pós-hepatectomia.
Pesaram-se os animais e os fígados e os núcleos marcados com BrdU após incubação com anticorpo anti-BrdU (clone Bu 20A) e a revelação foi levada a cabo usando o equipamento da peroxidase de rábano LSAB2 Universal (Dako) com pelo menos 20 campos de microscópio de ampliação baixa (xlO) para cada lâmina com fígado (Olympus BX60). Mais de 1600 núcleos foram analisados por lâmina.
Hepatócitos em cultura primária
Isolaram-se hepatócitos primários de ratinho com 2 a 3 meses de idade, como previamente descrito (Klaunig et al, Renton et al) com Blendzima Liberase. Purificaram-se os hepatócitos viáveis usando um método de centrifugação Percoll de iso-densidade de baixa velocidade, como descrito por (Kreamer et al) . Ressuspenderam-se as células em meio 199 contendo 45 penicilina, estreptomicina, fungizona, albumina do soro bovino (0,1%) e soro de bezerro fetal (10%), a densidades de 2x105 e 4xl05 para proliferação e experiências apoptóticas respectivamente em placas Primaria. Mantiveram-se as células a 37 °C numa atmosfera humidificada e o meio foi mudado após ligação às placas durante 2 e 3 horas. A seguir à ligação, lavaram-se as células uma vez e cultivaram-se com o mesmo meio não contendo soro e então expuseram-se a ActD (0,05 yg.ml-1) mais TNF-α a gamas de concentração de 0,2 a 40 ng/ml durante 17 a 18 horas, a menos que especificado em caso contrário nas legendas das figura. Para as experiências de proliferação, o meio foi suplementado com 3,5,3'-triiodotironina 5 10“8 M, dexametasona 10“7 M, Insulina 10 yg/ml 2 10“6 M, transferrina 5,5 yg ml, selénio 7 ng/ml, piruvato 20 mM e soro de bezerro fetal 5%. Síntese de ADN em hepatócitos em cultura primária
Para medir a síntese de ADN, adicionou-se BrdU (20 mM) durante as últimas 16 horas antes de avaliação. Lavaram-se os hepatócitos com PBS, fixaram-se, e tornaram-se permeáveis em solução de ácido acético/etanol 30:70 a -20 °C durante 30 minutos. Localizou-se o BrdU incorporado usando o equipamento de marcação de BrdU e o de Detecção II. Mediu-se a síntese de ADN replicativa registando a percentagem de células marcadas com BrdU num campo de microscópio em ampliação de pelo menos 10 vezes para cada amostra (Olympus CK2). Mais de 1000 hepatócitos foram analisados por poço. 46
Viabilidade celular e avaliação de apoptose em hepatócitos em cultura primária.
Dezassete horas após a adição de TNF-α, fixou-se a monocamada com paraformaldeído a 4% durante 20 minutos à temperatura ambiente, marcada com Hoechst 33258 (0,5 yg/ml). Examinaram-se as células apoptóticas a comprimentos de onda entre 350 e 460 nm usando um microscópio de fluorescência Olympus BX60 invertido (Olympus América Inc.)· Quantificou-se a perda de viabilidade celular usando o ensaio MTT: trataram-se 30,000 células por poço numa placa de microtitulo de 96 poços com uma solução de MTT x μΐ (0,5 mg/ml), dissolvida de fresco em meio durante 1 hora a 37 °C. Aspirou-se em seguida o meio e adicionaram-se 100 μΐ de DMSO para solubilizar o corante. Mediu-se a absorvância a 570 nm usando um leitor de microplacas de 96 poços Dynex MRX (Tecnologias Dynex, França). Cada medição foi executada em quadruplicado para HIP/PAP e hepatócitos do tipo selvagem dispensados na mesma placa. Calculou-se a percentagem de sobrevivência celular tendo em conta a densidade óptica que leituras de células que receberam um tratamento particular, dividindo este número pela leitura de DO para células de controlo sem tratamento e multiplicando então por 100. A comparação dos resultados com o número de células apoptóticas visualizadas usando Hoechst 33258 validou a precisão do ensaio MTT.
Isolamento e transplante de células do fígado
Isolaram-se hepatócitos de ratinhos HIP/PAP transgénicos macho e ratinhos C57BL/6 macho com dois meses de idade, usando a Liberase Blendzima, como previamente descrito por Klaunig e Renton. Purificaram-se hepatócitos viáveis usando um método de centrifugação Percoll de baixa-velocidade e iso- 47
Anestesiaram-se densidade, como descrito por Kreamer. ratinhos SCID fêmea com xilazina (Bayer, Leverkusen,
Alemanha) e cetamina (Biomérieux, Lyon, França) dissolvido em NaCl a 0,9%, extrairam-se baços através de uma incisão pequena no flanco esquerdo, e utilizou-se uma seringa com uma agulha de medida 26 para injectar 100 μΐ de suspensão celular (0,75 x 106 hepatócitos viáveis) em meio Willliams (Gibco/BRL). Manteve-se o receptor SCID durante 30 dias para permitir tempo suficiente para a proliferação e reorganização de hepatócitos de dador no parênquima do figado, antes de levar a cabo hepatectomia parcial.
Avaliação da Regeneração do Fígado.
Os animais receberam uma injecção intra-peritoneal de 60 mg kg-1 de massa corporal de BrdU em NaCl a 0,9% 2 horas antes da dissecação. Foram sacrificados 24, 36, 46 e 55 horas pós- hepatectomia. Pesaram-se os animais e os fígados e registaram-se os núcleos marcados com BrdU após incubação com anticorpo anti-BrdU (clone Bu 20A) e a revelação foi levada a cabo com o equipamento da peroxidase de rábano LSAB2 Universal (Dako) com pelo menos 20 campos de microscópio de ampliação baixa (xlO) para cada lâmina com fígado (Olympus BX60). Mais de 1600 núcleos foram analisados por lâmina.
Injecção de proteína HIP/PAP purificada após Hepatectomia.
Produziu-se e purificou-se proteína HIP/PAP recombinante como previamente descrito (Christa et al., 2000), e diluiu-se em NaCl a 0,9%. a 6 yg/ml. Injectaram-se 100 μΐ de proteína HIP/PAP ou PBS (tampão de Fosfato) nos baços de ratinhos com imunodeficiência combinada celular (SCID) 36 h após 48 hepatectomia parcial. Sacrificaram-se os animais 8 dias após hepatectomia parcial.
Detecção de Células do Fígado Transplantadas por Análise de RT-PCR.
Extraiu-se o ARN de tecidos do figado congelados de acordo com as instruções facultadas do reagente TRIZOL (Life Technologies). Sintetizou-se ADNc através de 200 unidades da transcriptase inversa da leucemia murina Moloney (Promega) e iniciou-se com 400 ng de iniciadores aleatórios (Invitrogen), de 1 pg de ARN total, a 42 °C durante 45 min, na presença de 10 U RNasin, 1 x tampão facultado pela enzima, 40 mmol 1_1 dos quatro desoxinucleótidos. A PCR foi executada com 40 ciclos de amplificação de 1 min cada às seguintes temperaturas: 94 °C, 60 °C, e 72 °C, de 1/8 ADNc, usando Taq™ pura e o equipamento "ready-to-go™ PCR Beads" (Amersham Biosciences). A expressão do transgene HIP/PAP humano foi detectada com os iniciadores 19/101. A expressão do gene HIP/PAP/Mo endógena foi detectada com os iniciadores 104/105 da sequência Itoh e Terakoa de ratinho publicada (). 19 senso: 5' cgc ccc ggg atg ctg cct ccc atg gcc ctg 101 anti-senso: 5' cgc gaa tcc gcc cat gat gag ttg cac acc aaa c 3' 104 senso: 5' cgc gga ttc atg ctg cct cca aca gcc tgc t 3' 105 anti-senso: 5' cgc aag ctt tta acc agt aaa ttt gca gac ata 3 ' 49
Ensaios HIP/PAP: Análise western blot, Imunohistoquímica e Teste ELISA.
Produziu-se e purificou-se proteína HIP/PAP do leite de ratinhos transgénico lactantes como acima descrito, e de acordo com Christa et al., 2000. Levaram-se a cabo análises de western blot e imunohistoquímica com anticorpos pre-HIP, como previamente descrito (Christa et al., 1999). Analisaram-se os níveis de HIP/PAP no soro usando um teste em sanduíche ELISA, em conformidade com as instruções do fabricante (Dynabio, La Gaude, França).
Activação do factor de transcrição STAT3
Estudou-se a activação da transcrição do factor STAT3 pelo equipamento TramsAM (motivo Activo) e por análises de western blot executada como previamente descrito (Simon et al., 2003), com anticorpos anti-STAT3 total e anti-fosfo STAT3 (Santa Cruz)
Expressão de Citocinas no fígado
Avaliou-se a expressão de citocinas no fígado através do ensaio protecção de RNase como previamente descrito (Tralhao J G, 2002,)
Intoxicação por APAP:
Intoxicaram-se ratinhos HIP/PAP transgénicos e C57B16 com uma dose letal de APAP (1000 mg/kg), como descrito por Bedda et al., 2003 ou Ferret et al., 2001. Injectou-se por via intravenosa proteína HIP/PAP recombinante (600 ng ou 1200 ng) 1 hora antes da injecção intraperitoneal de APAP aos ratinhos 50 C57B16. Monitorizaram-se os animais durante 24 horas, e calculou-se a sobrevivência usando o método de Kaplan-Meier.
Análises estatísticas.
Os resultados para hepatócitos em cultura primária foram expressos como média +/- DP, e determinou-se a significância estatística (P < 0,05) usando um teste de Student não emparelhado. Representou-se a regeneração do fígado in vivo pelas percentagens de núcleos que incorporam BrdU usando a representação da caixa e dos bigodes, e a significância estatística das diferenças entre os ratinhos HIP/PAP transgénicos e de tipo selvagem foram determinadas pelo teste U de Mann-Whitney (P < 0,05), porque a distribuição dos dados não foi normal (Statview 5', Abacus Concepts, Berkeley, CA).
RESULTADOS
Exemplo 1: Caracterização de ratinhos transgénicos com HIP/PAP Humana O transgene HIP/PAP foi especificamente expresso no fígado, e os ratinhos que expressavam HIP/PAP não desenvolveram tumores no fígado, após seguimento durante dois anos. Análises de Imunohistolocalização detectaram proteína HIP/PAP no fígado dos ratinhos transgénicos como imunocoloração intra-hepatócitos difusa, ocupando a maior parte do citoplasma dos hepatócitos (figuras 2A, 1 e 2). A coloração foi heterogénea e as regiões positivas estavam localizadas ou na área centrolobular ou portal do ácino do fígado. Esta distribuição heterogénea reflecte provavelmente a secreção de HIP/PAP, assim os hepatócitos puderam ser positivos ou negativos antes ou após a secreção de HIP/PAP respectivamente. A proteína 51 HIP/PAP foi segregada no soro (250 ng/ml a 700 ng/ml) nas linhas transgénicas homozigotas 24 e 27, e no meio de cultura de hepatócitos primários (30 a 120 ng/ml por 2xl05 células). Não foi detectada diferença morfológica e ploidia entre os hepatócitos que expressam HIP/PAP e de controlo através de exame histológico (os hepatócitos de ratinho eram 80% binucleares após adesão como previamente descrito por Leist et al.). Visões imunohistoquimicas de HIP/PAP de hepatócitos em cultura mostraram que mais de 50% dos hepatócitos estavam marcados com HIP/PAP (Figuras 2A, 3 e 4). Análises de western blot detectaram HIP/PAP como uma proteina de 16 kDa em extractos de figado e hepatócitos em cultura primária de ratinhos HIP/PAP transgénicos (Figura 2B) . A proteina HIP/PAP não foi detectada em ratinhos do tipo selvagens. Hibridação de actina permitiu uma estimativa precisa das 50 pg de proteina carregada para figados e hepatócitos (50 pg corresponderam aproximadamente a 50,000 hepatócitos).
Exemplo 2: A regeneração do fígado é estimulada em ratinhos que expressam o Gene HIP/PAP Humano
Para testar in vivo o efeito da HIP/PAP na proliferação de células do figado, examinou-se a regeneração do figado induzida por hepatectomia parcial. São apresentadas na Figura 3A visões de baixa ampliação (x20) para os tempos 24, 36, 46 e 55 horas pós hepatectomia parcial. Nos tempos indicados, as percentagens de células BrdU positivas foram superiores em figados de HIP/PAP transgénicos do que nos do tipo selvagem, apesar da baixa frequência global de núcleos que tinham incorporado BrdU em ambos os grupos. As percentagens de núcleos que incorporaram BrdU foram significativamente superiores em ratinhos HIP/PAP transgénicos (mediana 33%; gama 20-42%) comparados aos do tipo selvagem (mediana 18%; 52 gama 11-27%) (P = 0,0014), 46 horas após hepatectomia parcial (Figura 3 B). Para reforçar a hipótese que a proteína HIP/PAP pode actuar como um Factor de Crescimento durante a regeneração do fígado, estabeleceu-se o decurso no tempo na restauração de massa hepática nos ratinhos transgénicos e de tipo selvagem, após hepatectomia (Figura 3C) . Mediram-se as massas dos animais e fígado em ratinhos normais e não hepatectomizados. Calculou-se a razão de massa fígado/corpo e expressou-se como a percentagem média ± DP. Não existiu diferença nesta razão entre os dois grupos: 0,0460 ± 0,0064, n=12 e 0,0489 ± 0,0035 n=16 para ratinhos do tipo selvagem e HIP/PAP transgénicos, respectivamente. A recuperação do fígado foi superior nos ratinhos HIP/PAP transgénicos que nos de tipo selvagem, e a diferença foi estatisticamente significativa a 48 horas (p < 0,001), 60 horas (p < 0,003) e 96 horas (p < 0,002). A 120 horas, a massa de fígado restabeleceu à mesma percentagem nos ratinhos de tipo selvagem e HIP/PAP transgénicos.
Exemplo 3: Efeito mitogénico de HIP/PAP em hepatócitos em cultura primária
Com vista a investigar adicionalmente a regeneração do fígado aumentada observada in vivo após hepatectomia em ratinhos HIP/PAP transgénicos, utilizaram-se culturas primárias de hepatócitos para avaliar um efeito mitogénico de HIP/PAP. Os hepatócitos derivados de ratinhos HIP/PAP transgénicos e do tipo selvagem exibiram dois picos de síntese de ADN, 60 e 84 horas após plaqueamento, quando estimulados por EGF (figuras 4 A e B). Às 60 horas, as percentagens médias de hepatócitos BrdU-positivos eram de 31 ± 7% (n=19) e 16 ± 4% (n=20) em ratinhos transgénicos e de tipo selvagem, respectivamente (p < 0,0001). Quando as células foram estimuladas por HGF, a 53 síntese de ADN também foi superior em hepatócitos HIP/PAP do que nos do tipo selvagem (41 ± 14% n=4, contra 31 ± 11%, n=4, respectivamente após 60 horas) embora esta diferença não tenha atingido significância. Quando os hepatócitos não foram estimulados pelo Factor de Crescimento, as incorporações de BrdU foram 11% ± 3 (n=8) e 6% ± 3 (n=7) em hepatócitos transgénico e de tipo selvagem respectivamente e a diferença foi estatisticamente significativa (p=0,0146). A HIP/PAP é uma proteína segregada, e testou-se então se poderia actuar como um factor mitogénico parácrino. Quando se adicionou proteína HIP/PAP (40 ng.ml-1) aos hepatócitos do tipo selvagem, a síntese de ADN EGF-induzida aumentou de 16 ± 4% a 24 ± 7% (p=0,0168; n=8; figura 4C). Estes resultados mostraram que a HIP/PAP era um factor mitogénico para hepatócitos em cultura primária. O efeito mitogénico da HIP/PAP na proliferação de hepatócitos foi assim demonstrado tanto in vivo como in vitro.
Exemplo 4: Efeito anti-apoptótico de HIP/PAP contra apoptose induzida por TNF-ot + ActD em hepatócitos em cultura primária
Examinou-se em seguida se o efeito mitogénico da HIP/PAP estava associado com um efeito anti-apoptótico da HIP/PAP. Os hepatócitos de rato em culturas primárias não eram sensíveis à morte celular causada apenas por tratamento com TNF-α. Ao invés, eles morrem por apoptose após exposição a TNF-a combinada com uma baixa dose de ActD (22) . A morte de célula de hepatócitos de ratinho foi induzida por TNF-α combinada com uma dose de ActD tão baixo quanto 0,05 yg/ml, apesar de a ActD sozinha (0,05 yg ml-1) não ter induzido qualquer perda de viabilidade (Figura 5B). Mostra-se (figura 5A) que os hepatócitos que expressam HIP/PAP resistiram a apoptose induzida por TNF-α + ActD após 16-17 horas de tratamento. A 54 sobrevivência celular atingiu 75% contra 43% (p < 0,0001) para 2 ng ml-1 de TNF-α, e 60% contra 27% para 20 ng ml-1 de TNF-α, (p < 0, 0001). O LD50 para TNF-α foi superior a 40 ng ml-1 e 1 ng ml-1 em hepatócitos HIP/PAP e do tipo selvagem, respectivamente. O pré-tratamento de células com pan-anticaspase z-VAD-fmk (50 μΜ) preveniu completamente a morte celular induzida por TNF-α, indicando assim que este processo ocorre por apoptose dos hepatócitos. Examinou-se também se as células mortas exibiram as caracteristicas típicas de apoptose. Quando coradas com Hoechst 33258, as células não-viáveis exibiram cromatina condensada, núcleos fragmentados e corpos apoptóticos, ao passo que as células viáveis não exibiram. As caracteristicas dos corpos apoptóticos eram organizadas em "rosetas" caracteristicas de apoptose de hepatócitos induzida por TNF-α (Figura 5C) . Quando se adicionou proteína HIP/PAP (40 ng ml-1) aos hepatócitos do tipo selvagem, a protecção contra 20 ng ml-1 de TNF-α + ActD aumentou de 27% para 47% (p < 0,0001). Estes dados mostram que a HIP/PAP repeliu parcialmente apoptose induzida por TNF-α em hepatócitos primários.
Exemplo 5 A regeneração do fígado é estimulada em ratinhos por hepatócitos isolados de ratinhos HIP/PAP transgénicos
Estabeleceu-se um modelo experimental in vivo para testar o efeito na regeneração do fígado global da expressão de HIP/PAP numa minoria de células do fígado. Levou-se assim a cabo o transplante de células do fígado de hepatócitos isolados de ratinhos HIP/PAP transgénicos e C57BLU6, e testou-se em seguida a extensão de regeneração do fígado após hepatectomia parcial nos ratinhos SCID receptores. 55
Usaram-se duas abordagens complementares para avaliar o transplante de células do fígado. Em primeiro lugar, tirou-se vantagem da expressão do transgene HIP/PAP humano para monitorizar o destino das células do fígado transplantadas, usando imunohistoquímica com anticorpos de HIP/PAP. Uma estimativa semi-quantitativa indicou que as células transplantadas constituíram menos do que 1/1000 nos fígados receptores. Além disso, a expressão de HIP/PAP foi mostrada num número limitado de células do fígado sem distribuição preferencial nas secções do fígado (área portal ou centrolobular). Em segundo lugar, tirou-se vantagem da presença da sequência HIP/PAP humana para levar a cabo RT-PCR. A expressão de HIP/PAP humana foi realmente detectada no fígado SCID receptor, antes de hepatectomia parcial, confirmando assim transplante das células do fígado. Além disso a expressão de HIP/PAP humana persiste na secção do fígado obtida a tempos diferentes após hepatectomia. Estes resultados demonstraram que células transplantadas persistiram após estímulo da regeneração do fígado receptor e manteve expressão do gene.
Avaliaram-se em seguida os efeitos da implantação intra-hepática de células do fígado relativamente à extensão da regeneração do fígado após hepatectomia parcial. A avaliação macroscópica do fígado 8 dias após hepatectomia parcial mostrou um aumento acentuado na massa do fígado de ratinhos receptores transplantados com células do fígado de ratinhos HIP/PAP transgénicos (Figura 6A) . Além disso, estes resultados foram confirmados por medições da massa do fígado, que foram significativamente maiores em ratinhos receptores transplantados com células do fígado relativamente aos HIP/PAP transgénicos (Figura 6B). Análises de incorporação de BrdU executadas 48 h após hepatectomia parcial confirmaram um 56 aumento acentuado na síntese de ADN celular após transplante de hepatócitos que expressam HIP/PAP humana. Assim o transplante de 750 000 hepatócitos viáveis foi suficiente para aumentar a regeneração do fígado. Exame histológico padrão do fígado não revelou quaisquer alterações morfológicas óbvias.
Exemplo 6 A regeneração do fígado é estimulada em ratinhos por administração de HIP/PAP
Testou-se se a injecção de HIP/PAP purificada poderia ter o mesmo efeito que o transplante na regeneração do fígado.
Compararam-se as massas dos fígados restantes 8 dias após hepatectomia parcial em ratinhos SCID que tinham sido injectados 36 h após hepatectomia parcial com 100 yl de HIP/PAP purificada (600 ng por ratinhos). Os resultados apresentados na figura 7 indicaram um aumento de 10% na massa do fígado em ratinhos injectados com HIP/PAP comparado com o observado em ratinhos injectados com PBS. Esta observação demonstrou um efeito parácrino mitogénico da proteína HIP/PAP in vivo.
Exemplo 7 A regeneração do fígado e a mitose são estimuladas em ratinhos C57B16 por administração de HIP/PAP
Comparou-se o efeito da proteína HIP/PAP contra soro fisiológico injectados imediatamente após hepatectomia parcial de C57B16, na restauração da massa hepática, na incorporação de BrdU e mitose, 46 horas após hepatectomia parcial. (Figura 8). Observou-se um aumento na restauração da massa do fígado 46 horas após hepatectomia parcial, embora a diferença não tenha sido estatisticamente significativa (p=0,08) provavelmente porque 46 horas é muito cedo para 57 observar um aumento consistente na massa do fígado. Contudo, existe um aumento na incorporação de BrdU (p < 0,02) e no número de mitoses (p < 0,04) em ratinhos injectados com HIP/PAP.
As distribuições da incorporação de BrdU e mitoses foram heterogéneas, como avaliado pelas diferenças nas médias e medianas em cada grupo de ratinhos. Usando o teste da mediana (que é uma aplicação do teste exacto de Fisher), validou-se que ratinhos injectados com HIP/PAP representavam um grupo estatisticamente diferente de ratinhos injectados com NaCl. (Tabela I)
Tabela I
Núcleos positivos BrDU (%) Hepatócitos Mitóticos (%) NaCl HIP Combinado NaCl HIP Combinado n 16 15 31 16 15 31 Média 12,669 22,313 17,335 0, 525 1,567 1, 029 Mediana 7,300 23,000 15,800 0, 000 0,7200 0, 000 Valor 0,0038 0,0113 de P
Para caracterizar o benefício da HIP/PAP na regeneração do fígado, usou-se o modelo do teste da mediana para classificar os ratinhos em quatro grupos nominais de acordo com a mediana combinada para BrdU e mitose, (figura 9). Análise estatística de populações de ratinhos de acordo com a BrdU associadas a mitose mostrou que ratinhos injectados com HIP/PAP eram mais positivos tanto para núcleos de BrdU como para hepatócitos 58 mitóticos (fígado em fase S/M do ciclo da célula) relativamente a ratinhos injectados como soro fisiológico (p=0,01), sugerindo que a HIP/PAP poderia acelerar a progressão de hepatócitos através do ciclo da célula.
Exemplo 8 Expressão de citocinas no fígado e activação do factor de transcrição STAT3 durante o decurso no tempo da regeneração do fígado A regeneração do fígado tem de ser iniciada por citocinas IL-6 e TNF-α para dar início aos hepatócitos para entrarem na fase G1 do ciclo da célula. Sob controlo da IL-6, o factor de transcrição STAT3 é activado por fosforilação e translocado para o núcleo. Contudo, a persistência da expressão de TNF-a/lL6 e a activação de STAT3 é deletéria e retarda o decurso no tempo da regeneração. 0 efeito da HIP/PAP na expressão de citocinas no fígado e na activação de STAT3 foi investigado. Neste contexto, comparou-se a expressão de citocinas no fígado a TO de PHX (hepatectomia parcial) e após 46 horas em ratinhos SCID transplantados com HIP/PAP versus hepatócitos de controlo. A metodologia de protecção de Rnase permitiu comparar na mesma experiência linfotoxina-β (Ι,Τβ), TNF-α e TGF-β num pool de 4 extractos de fígado (Figura 10; ratinhos HIP/PAP transgénicos caminhos a e b; ratinhos SCID caminhos c e d) a TO (caminhos a e c) e a T46 horas pós PHX (caminhos b e d) . Análises densitométricas quantificaram os sinais que foram normalizados contra dois genes "house keeping" (L32 e GAPDH). Os resultados não mostraram diferença na expressão hepática de TGF-β quando o transplante foi realizado com HIP/PAP ou hepatócitos de controlo: a 46 horas pós PHX, a TGF-β aumentou na mesma extensão. Pelo contrário, a expressão de Ι.Τβ e TNF- α (ambas as citocinas pertencem à mesma família funcional) foi inibida nos fígados de SCID transplantados com 59 hepatócitos HIP/PAP. Estes resultados mostram que a HIP/PAP inibe a expressão de TNF-α hepática em fígado de SCID. A metodologia de protecção de Rnase não permitiu detectar a expressão de IL6 durante a regeneração do fígado do SCID. Contudo, investigou-se a cinético de activação do factor de transcrição STAT3 em ratinhos HIP/PAP transgénicos e C57B16. 0 decurso no tempo da acumulação/degradação de fosfo-STAT3 nuclear foi activado em ratinhos HIP/PAP transgénicos versus C57B16, durante as primeiras 24 horas após PHX (figura 11) . A activação foi detectada ao fim de 1 hora pós PHX em HIP/PAP mas não em ratinhos C57B16 (p=0,02). Além disso, a activação de STAT3 voltou a níveis inferiores em HIP/PAP relativamente a ratinhos C57B16 (p=0,04), ao fim de 12 horas. Os resultados foram validados e visualizados por análise de western blot com anticorpos anti-STAT3 fosforilados. (figura 11)
Exemplo 9 A HIP/PAP é uma droga protectora contra insuficiência hepática aguda induzida por APAP A indução da insuficiência hepática aguda humana pode ser simulada por um modelo animal experimental pertinente, consistindo em intoxicação por APAP (acetaminofeno) . A overdose de APAP conduz à produção aumentada de NAPQ1, um metabolito altamente reactivo que esgota o pool intracelular de GSH, um tiol não-proteico com capacidades captadoras oxidantes e reguladoras redox. Consequentemente, durante a intoxicação por APAP no ratinho, são geradas espécies de oxigénio reactivas tóxicas (ROS) conduzindo a insuficiência hepática aguda. Uma dose única grande de APAP no ratinho, tal como em humanos, pode causar destruição parenquimatosa centrolobular maciça e morte de hepatócitos. A actividade terapêutica da proteína HIP/PAP num modelo de ratinho de 60 insuficiência hepática aguda APAP-induzida foi investigada. Para este propósito, testou-se a resistência de ratinhos HIP/PAP transgénicos contra uma dose letal de APAP injectada em ratinhos do tipo selvagem. Foi alcançada insuficiência hepática aguda induzida por droga em 24 ratinhos HIP/PAP transgénicos e 24 C57/bl6 (12 machos e 12 fêmeas em cada grupo) pela injecção intraperitoneal de uma dose letal de 1000 mg/ml (APAPiooo) diluida em 200 pL de tampão fosfato estéril.
Os tempos de sobrevivência mostraram que 80% dos ratinhos HIP/PAP transgénicos (machos ou fêmeas) sobreviveram mais de 24 horas, contra 25% no grupo de controlo do tipo selvagem. Estes resultados mostram que a proteína HIP/PAP é um bom candidato para aplicações terapêuticas clínicas que visam prevenir e tratar insuficiência hepática, através da sua acção tanto na regeneração como no estado das células do fígado (figura 12).
Injectou-se proteína HIP/PAP por via intravenosa na cauda de C57B16 1 hora antes de APAP para investigar a protecção parácrina preventiva da proteína HIP/PAP contra intoxicação por APAP. Os resultados mostraram uma protecção preventiva dependente da dose de proteína HIP/PAP: para 600 ng, sobreviveram 4/10 e 2/10 ratinhos injectados com HIP/PAP e injectados com soro fisiológico respectivamente; para 1200 ng, sobreviveram 8/10 e 2/10 ratinhos injectados com HIP/PAP e injectados com soro fisiológico, respectivamente. 61
Exemplo 10 A Proteína hip/pap não exibe efeito tóxico durante o seguimento a longo prazo in vivo de ratinhos transgénicos que expressam HIP/PAP
Qualquer droga capaz de estimular a proliferação de células do fígado tem potencial para induzir cancro, de forma que os riscos de desenvolvimento de HCC devem ser determinados antes de qualquer administração. Desenvolveram-se dois modelos de ratinhos transgénicos que expressam o gene HIP/PAP humano sob o promotor do gene da albumina de ratinho (duas estirpes) ou o promotor do gene metalotioneína de ratinho (duas estirpes). Ambos os modelos têm como objectivo a expressão do gene HIP/PAP no fígado e a secreção da proteína HIP/PAP no sangue. Nenhum dos ratinhos que expressam HIP/PAP desenvolveu tumores do fígado (ou outro), após um período de seguimento de dois anos.
Exemplo 11 HIP/PAP retarda o desenvolvimento de HCC em ratinhos transgénicos com predisposição
Investigaram-se os efeitos da proteína HIP/PAP num modelo de carcinogénese do fígado por seguimento a longo prazo de ratinhos bi-transgénicos. Cruzaram-se os ratinhos HIP/PAP transgénicos (promotor da metalotioneína) com ratinhos WHV/c-myc nos quais a expressão fígado-específica de c-myc conduzida por sequências reguladoras da hepatite de woodchuck (WHV) causa cancro do fígado em todos os animais Terradillos et al. (1997). As curvas de sobrevivência mostraram que ο T50 de ratinhos bi-transgénicos era de 60 semanas (n=87 ratinhos) contra 42 semanas para ο T50 de onco-ratinhos WHV/c-myc (n=39 ratinhos), que era a mediana publicada por Terradillos et al. (1997). As curvas de sobrevivência foram idênticas para ratinhos HIP/PAP transgénicos e para controlos negativos da 62 mesma ninhada. Assim, em primeiro lugar, a toxicidade da proteina HIP/PAP durante o periodo de vida destes ratinhos não foi detectada, e em segundo lugar, mostrou-se que o inicio da HCC é retardado em ratinhos que transportam ambos os transgenes, i.e. WHV/c-myc e HIP/PAP. (Figura 13) Não existe evidência para a toxicidade durante a administração a longo prazo de HIP/PAP. Além disso, observou-se um inicio retardado de HCC em ratinhos transgénico com cancro do figado c-myc-induzido.
Referências:
Abergel C, Chenivesse S, Stinnakre M G, Guasco S, Brechot C, Claverie J M, Devinoy E, Christa L (1999) Crystallization and preliminary crystallographic study of HIP/PAP, a human C-lectin overexpressed in primary liver cancers. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55, 1487-1489.
Alison M, Sarraf C. (1998) Hepatic stem cells. J. Hepat 29, 676-682.
Akhurst B., Croager EJ, Farley-Roche C A, Ong. JK., Dumble ML, Knight B, Yeoh GC. (2001). A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology 34, 519-522.
Bedda S, Laurent A, Conti F, Chereau C, Tran A, Tran-Van Nhieu J, Jaffray P, Soubrane O, Goulvestre C, Calmus Y, Weill B, Batteux F. (2003) Mangafodipir prevents liver injury induced by acetaminophen in the mouse. J Hepatol. November; 39(5):765-72. 63
Christa, L., Felin, M., Morali, O., et al. (1994) The human HIP gene, overexpressed in primary liver câncer encodes for a C-Type carbohydrate binding protein with lactose binding activity. FEBS Letters 337, pp 114-118. Christa, L., Carnot, F., Simon, Μ. T., Levasseur, F., Stinnakre , M. G., Lasserre, C., Thépot, D., Clément, B., Devinoy, E., Bréchot, C. (1996) HIP/PAP, a human C- -type lectin, is an adhesive molecule expressed in hepatocellular carcinoma, as well as in normal paneth and pancreatic cells. Am. J. Physiol. 271, G993 G1002.
Christa L, Simon Μ T, Brezault-Bonnet C, Bonte E, Carnot F, Zylberberg H, Franco D, Capron F, Roskams T, Brechot C. (1999) Hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatic associated protein (HIP/PAP) is expressed and secreted by proliferating ductules as well as by hepatocarcinoma and cholangiocarcinoma cells. Am J Pathol 155, 1525-33.
Christa L. Pauloin A, Simon Μ T, Stinnakre M G, Fontaine M L, Delpal S. Ollivier-Bousquet M, Brechot C, Devinoy E. ((2000)) High expression of the human hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatic associated protein (HIP/PAP) gene in the mammary gland of lactating transgenic mice. Secretion into the milk and purification of the HIP/PAP lectin. Eur J. Biochem 267, 1665-1671.
Drickamer K. (1993) Calcium-dependent carbohydrate-re-cognition domains in animal proteins. Current Opinion in Structural Biology 3, 393-400.
Factor V M, Radaeva S A, Thorgeirsson SS. (1994) Origin and fate of oval cells in Dipin-induced hepatocarcinogenesis In the mouse. Am. J. Pathol. 145, 409-422. 64
Fausto NF. (1994) Liver stem cells. In: Arias IM, Boyer JL, Fausto NF, Jakoby WB, Schachter DA, Shafritz DA, editors. The liver: Biology and pathobiology. Third Ed. New York: Raven, 1501-1518 .
Fausto NF. (2000) Liver regeneration. Journal of Hepatol 32:19-31.
Ferret PJ, Hammoud R, Tulliez M, Tran A, Trebeden H, Jaffray P, Malassagne B, Calmus Y, Weill B, Batteux F. (2001) Detoxification of reactive oxygen species by a nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase cures acetaminophen-induced acute liver failure in the mouse. Hepatology. May; 33(5):1173-80 .
Fu XX, Su CY, Lee Y, Hintz R, Biempica L, Snyder R, Rogler C E (1988). Insulin like growth factor II expression and oval cell proliferation associated with hepatocarcinogenesis in woodchuck virus carriers. J. Virol. 62, 3422-3430.
Gang-Hong L, Merlino, G, Fautso, N, (1992) Development of liver tumors in transforming Growth Factor α transgenic mice. Câncer Research. 52, pp 5162-5170.
Heaton N (2003) Small-for-size liver syndrome after auxiliary and split liver transplantation: donor selection. Liver Transpl. 2003 September; 9 (9): S26-8.
Higgins G & Anderson R. (1931) Experimental pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol 12, 186-202. 65
Horigushi N, Takayama H, et al. (2002) Hepatocyte Growth Factor promotes hepatocarcinogenesis through c-Met autocrine activation and enhanced angiogenesis in transgenic mice treated with diethylnitrosamine. Oncogene 21, pp 1791-1799.
Klaunig JE, Goldblatt PJ, Hinton DE, Lipsky MM, Chacko J. Trump BF (1981) Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro 10, 913-925.
Kreamer BL, Staecker JL, Sawada N, Sattler GL, Hsia MT, Pitot HC (1986) Use of a low-speed, iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. In vitro Cell Dev Biol 4, 201-211.
Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 227, 680 685.
Lasserre, C., Christa, L., Simon, M.T., Vernier, P., Bréchot, C. (1992) A novel gene (HIP) activated in human primary liver câncer. Câncer Res. 52, 5089 5095.
Lee GH, Merlino G, Fausto N. (1992) Development of liver tumors in transforming growth factor alpha transgenic mice. Câncer Res, October 1; 52 (19): 5162-70.
Leist M, Gantner F., Bohlinger I, Germann PG, Tiegs G, Wendel A. (1994) Murine hepatocyte apoptosis induced in vitro and in vivo by TNF-alpha requires transcriptional arrest. J. Immunol 15, 1778-1788. 66
Libbrecht L, De Vos R, Cassiman D, Desmet V, Aerts R, Roskams T. (2001) Hepatic progenitor cells in hepatocellular adenomas. Am J Surg Pathol 11, 1388-96.
Mitchell Claudia and Fausto Nelson (2002) Bone Marrow-derived hepatocytes rare but promising Am. J. Pathol, vol 161, 349-350
Orelle, B., Keim, V., Masciotra, L., Dagorn, J.C., and Iovanna, J.L. (1992) J. Clin. Invest 90, 2284-2291.
Petersen BE, Zajac VF, Michalopoulos GK. (1998) Hepatic oval cell activation in response to injury following chemically induced periportal or pericentral damage in rats. Hepatology 27, 1030-1038.
Petersen BE, Bowen W.C. et al. (1999) Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science vol 284, 1168-1170
Peterson, G.L. (1977) A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which Is more generally applicable. Anal. Biochem. 83, 346 356.
Pinkert CA, Omitz DM, Brinster RL, Palmiter RD (1987) An albumin enhancer located 10 kb upstream functions along with its promoter to direct efficient, liver-specific expression in transgenic mice. Genes Dev 3, 268-276.
Renton KW, Deloria LB, Mannering GJ (1978) Effects of polyribonoinosinic acid polyribocytidylic acid and a mouse interferon preparation on cytochrome Ρ-450-dependent 67 monooxygenase Systems in cultures of primary mouse hepatocytes. Mol. Pharmacol 4, 672-681.
Roskams T, De Vos R, Van Eyken P, Myazaki H, Van Damme B, Desmet V. (1198) . Hepatic OV-6 expression in human liver disease and rat experiments: evidence for hepatic progenitor cells in man. J. Hepatol 29, 455-463.
Sell S. (1998) Comparison of liver progenitor cells in human atypical ductular reactions with those seen in experimental models of liver injury. Hepatology 27, 317-331.
Simon MT, Pauloin A, Normand G, Lieu HT, Mouly H, Pivert G, Carnot F, Tralhao JG, Brechot C, Christa L. (2003) HIP/PAP stimulates liver regeneration after partial hepatectomy and combines mitogenic and anti-apoptotic functions through the PKA signaling pathway. FASEB J. 17(11):1441-50.
Sirica AE, Gainey TW, Harrel MB, Caran N. (1997) Cholangiocarcinogenesis and biliary adaptation responses in hepatic injury. In: Biliary and pancreatic ductal epithelia; Pathobiology and Pathophysiology. Edited by Sirica A E, Longnecker D S. New York, Mareei Dekker, 229-290.
Terradillos O, Billet O, Renard CA, Levy R, Molina T, Briand P, Buendia MA. (1997) The hepatitis B virus X gene potentiates c-myc-induced liver oncogenesis in transgenic mice. Oncogene. January 30; 14(4):395-404.
Thépot, D., Devinoy, E., Fontaine, M.L., Stinnakre, M.G., Massoud, M., Kann, G., Houdebine, L.M. (1995) Rabbit whey acidic protein gene upstream region Controls high-level 68 expression of bovine growth hormone in the mammary gland of transgenic mice. Mol. Reprod. Dev. 42, 261 267.
Tralhao JG, Roudier J, Morosan S, Giannini C, Tu H, Goulenok C, Carnot F, Zavala F, Joulin V, Kremsdorf D, Brechot C. (2002) Paracrine in vivo inhibitory effects of hepatitis B virus X protein (HBx) on liver cell proliferation: an alternative mechanism of HBx-related pathogenesis. Proc Natl Acad Sei USA. May 14; 99(10):6991-6.
LISTAGEM DA SEQUÊNCIA <110> Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale
<120> Composições para regeneração do fígado e para a prevenção de insuficiência hepática <130> Q087FR - INSERM <140> <141> <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 69
Met Leu Pro Pro Met Ala Leu Pro Ser Vai Ser Trp Met Leu Leu 15 10 15
Cys Leu Met Leu Leu Ser Gin Vai Gin Gly Glu Glu Pro Gin Arg 20 25 30
Leu Pro Ser Ala Arg Ile Arg Cys Pro Lys Gly Ser Lys Ala Tyr 35 40 45
Ser His Cys Tyr Ala Leu Phe Leu Ser Pro Lys Ser Trp Thr Asp 50 55 60
Asp Leu Ala Cys Gin Lys Arg Pro Ser Gly Asn Leu Vai Ser Vai 65 70 75
Ser Gly Ala Glu Gly Ser Phe Vai Ser Ser Leu Vai Lys Ser Ile 85 90 95
Asn Ser Tyr Ser Tyr Vai Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Gin 100 105 110
Thr Glu Pro Asn Gly Glu Gly Trp Glu Trp Ser Ser Ser Asp Vai 115 120 125
Asn Tyr Phe Ala Trp Glu Arg Asn Pro Ser Thr Ile Ser Ser Pro 130 135 140
His Cys Ala Ser Leu Ser Arg Ser Thr Ala Phe Leu Arg Trp Lys 145 150 155
Tyr Asn Cys Asn Vai Arg Leu Pro Tyr Vai Cys Lys Phe Thr Asp 165 170 175 26-11-2010
Ser Glu Gly Ala Leu 80 Gly Gly Met Gly Asp 160 70

Claims (18)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica para uso no estimulo da regeneração do figado in vivo, protecção contra insuficiência hepática crónica/aguda, ou protecção contra apoptose de hepatócitos, compreendendo uma quantidade eficaz de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N°l, em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável.
  2. 2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 compreendendo uma quantidade eficaz do polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 36 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N°l, em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável.
  3. 3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 compreendendo uma quantidade eficaz de um polipéptido compreendendo um sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com o polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 27 e termina no resíduo de aminoácido 175 da sequência SEQ ID N°l, em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável.
  4. 4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 compreendendo uma quantidade eficaz do polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos que inicia no resíduo de aminoácido 27 e termina no resíduo de aminoácido 175 da 1 sequência SEQ ID N°l, em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável.
  5. 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 compreendendo uma quantidade eficaz da proteina pancreática-associada/hepatocarcinoma-intestino-pâncreas humana (HIP/PAP) da sequência SEQ ID N°1 em combinação com pelo menos um excipiente fisiologicamente aceitável.
  6. 6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para estimular a regeneração do figado in vivo após insuficiência hepática crónica/aguda.
  7. 7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para tratar pacientes que tenham sido submetidos a uma ressecção do figado.
  8. 8. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para tratar pacientes que são os indivíduos de um transplante de figado, uma insuficiência hepática causada por doenças do figado seleccionadas do grupo que consiste em (i) hepatite aguda e crónica que advém de etiologias tóxicas, medicamentosas, virais, alcoólicas e desconhecidas, (ii) cirurgia e (iii) cancro do figado.
  9. 9. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para tratar pacientes que são os indivíduos de uma doença compreendida no grupo que consiste em: Hepatite B, Hepatite C, defeitos do ciclo da ureia, hipercolesterolemia familiar, cirrose induzida pelo álcool, Doença de Armazenamento de Glicogénio, Hepatite Auto-imune, Hiperoxalúria Primária do tipo I, cirrose Criptogénica, síndrome de Crigler-Najjar do tipo I, Fibrose Hepática 2 Congénita, Doença de Neimann-Pick, Cirrose Biliar Primária, Amiloidose Familiar, Atresia Biliar, Carcinoma Hepatocelular, Colangite obliterante primária, Hepatoblastoma, Sindrome de Alagille, Hemangioendotelioma, Colestase Familiar, Não-carcinóide neuro-endócrino, insuficiência hepática induzida por drogas, tumor do fígado benigno tal como hiperplasia nodular focal tumores do fígado tais como carcinoma Hepatocelular e Colangiocarcinoma, insuficiência hepática Aguda/fulminante, sindrome de Budd-Chiari, deficiência de Alfa-l-antitripsina, Doença de Wilson, Hemocromatose, Tirosinemia, Protoporfiria, e fibrose cística, doença do fígado gordo não alcoólico (NAFLD) e esteato-hepatite não alcoólica (NASH).
  10. 10. Composição farmacêutica com efeitos adversos limitados na necrose hepática compreendendo: (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto hepatotóxico, e (ii) uma quantidade eficaz de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
  11. 11. Composição compreendendo hepatócitos em divisão em combinação com um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 to5.
  12. 12. Composição compreendendo hepatócitos que foram transfectados com um cassete de expressão que conduz a expressão de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 nos ditos hepatócitos transfectados.
  13. 13. Composição compreendendo uma quantidade eficaz de células estaminais da medula óssea em combinação com um 3 polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
  14. 14. Composição farmacêutica para estimular a regeneração do fígado in vivo compreendendo uma quantidade eficaz de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13.
  15. 15. Processo para estimular o crescimento de hepatócitos in vitro compreendendo: (a) recolher hepatócitos; (b) cultivar os ditos hepatócitos num meio de cultura apropriado; e (c) tratar os ditos hepatócitos com uma quantidade mitogénica de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
  16. 16. Processo para estimular o crescimento de hepatócitos in vitro compreendendo: (a) recolher hepatócitos; (b) cultivar os ditos hepatócitos num meio de cultura apropriado; e (c) transfectar os ditos hepatócitos com uma cassete de expressão que conduz a expressão de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 nos ditos hepatócitos transfectados.
  17. 17. Processo para tratar células estaminais da medula óssea in vitro compreendendo: (a) recolher células estaminais da medula óssea; 4 (b) cultivar as ditas células estaminais da medula óssea num meio de cultura apropriado; e (c) tratar as ditas células estaminais da medula óssea com uma quantidade mitogénica de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
  18. 18. Uso de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para fabricar uma composição farmacêutica para estimular a regeneração do figado in vivo. 26-11-2010 5
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1488798A1 (en) * 2003-06-18 2004-12-22 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) HIP/PAP polypeptide composition for use in liver regeneration and for the prevention of liver failure
SI2044111T1 (sl) 2006-06-21 2015-02-27 Musc Foundation For Research Development Ciljanje komplementa faktorja H za zdravljenje bolezni
EP1900749A1 (en) 2006-09-12 2008-03-19 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Nucleic acids for expressing a polynucleotide of interest in mammalian cancer cells
US7923014B2 (en) * 2007-02-12 2011-04-12 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Expression and purification of HIP/PAP and uses therefor
EP2260857A1 (en) * 2009-06-11 2010-12-15 Alfact Innovation Novel applications of HIP/PAP or derivatives thereof
RS20120461A1 (en) 2009-07-02 2013-06-28 Musc Foundation For Research Development METHODS FOR STIMULATION OF LIVER REGENERATION
KR20120130748A (ko) 2009-11-05 2012-12-03 알렉시온 캠브리지 코포레이션 발작성 야간 혈색소뇨증, 용혈성 빈혈, 및 혈관내 및 혈관외 용혈을 수반한 질환 상태의 치료
ES2717912T3 (es) 2010-05-14 2019-06-26 Univ Colorado Regents Grupos dirigidos al receptor del complemento 2 (cr2) mejorados
KR20130036276A (ko) 2010-06-22 2013-04-11 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트 보체 결합 3의 C3d 조각에 대한 항체들
EP2508607A1 (en) 2011-04-07 2012-10-10 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Medicament for liver regeneration and for treatment of liver failure
EP2687225A1 (en) 2012-07-19 2014-01-22 Alfact Innovation HIP/PAP protein and derivatives thereof for use in treating cancer
US10413620B2 (en) 2012-08-17 2019-09-17 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Light-emitting versions of the monoclonal antibody to C3D (MAB 3D29) for imaging
WO2014028865A1 (en) 2012-08-17 2014-02-20 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for detecting complement activation
US8893292B2 (en) 2012-11-14 2014-11-18 Mitsubishi Electric Research Laboratories, Inc. Privacy preserving statistical analysis for distributed databases
US20160039877A1 (en) 2013-03-15 2016-02-11 Shenzhen Hightide Biopharmaceutical, Ltd. Compositions and methods of using islet neogenesis peptides and analogs thereof
FR3004354A1 (fr) 2013-04-10 2014-10-17 Alfact Innovation Composition comprenant la proteine hip/pap ou l'un de ses derives pour le traitement de la resistance a l'insuline
RU2559935C1 (ru) * 2014-06-10 2015-08-20 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ стимуляции регенерации резецированной печени l-аргинином
RU2590859C1 (ru) * 2015-06-30 2016-07-10 государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России) Способ дистантной стимуляции регенерации гепатоцитов
RU2601160C1 (ru) * 2015-07-09 2016-10-27 государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Омский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО ОмГМУ Минздрава России) Способ резекции печени у мелких лабораторных животных
EP3401685B1 (en) * 2016-01-08 2021-12-01 Kyoto University Diagnostic method and medicine comprising adamts13 as main ingredient
RU2636194C1 (ru) * 2016-11-23 2017-11-21 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ стимуляции репаративной регенерации печени после ее резекции
CN107936111B (zh) * 2017-12-16 2021-09-07 广州安辰新药研究院有限公司 一种hip/pap蛋白的制备方法
CN109439612B (zh) * 2018-09-18 2021-09-21 广州领晟医疗科技有限公司 促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的多肽及其用途
CN110627866B (zh) * 2019-10-23 2022-10-18 广州领晟医疗科技有限公司 多肽rly4及其促进肝再生和抑制肝细胞凋亡的用途
CN110669126B (zh) * 2019-10-23 2022-08-16 广州领晟医疗科技有限公司 多肽gpr5及其促进肝细胞增殖和抑制肝细胞凋亡的用途
US20240058279A1 (en) * 2020-12-21 2024-02-22 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Use of cell turnover factors for increasing tissue regeneration
EP4085922A1 (en) 2021-05-07 2022-11-09 The Healthy Aging Company Hip/pap protein or a derivative thereof for treating peripheral neuropathy
CN113528639B (zh) * 2021-06-04 2023-06-13 南方医科大学南方医院 一组预测慢加急性肝功能衰竭预后的标志物及其应用
EP4252766A1 (en) 2022-04-01 2023-10-04 The Healthy Aging Company Hip/pap protein or a derivative thereof for treating and/or preventing a disorder characterized by a high cxcl5 serum level in an individual

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2661187B1 (fr) * 1990-04-20 1994-08-05 Inst Nat Sante Rech Med Proteine associee a la pancreatite aiguue. moyens pour le diagnostic de la pancreatite aiguue.
FR2700011B1 (fr) * 1992-12-24 1995-02-24 Inst Nat Sante Rech Med Détection de la mucoviscidose ou d'une mutation du gêne CFTR au moyen d'un dosage de la PAP.
EP1488798A1 (en) * 2003-06-18 2004-12-22 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) HIP/PAP polypeptide composition for use in liver regeneration and for the prevention of liver failure

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Publication number Publication date
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