PT1255569E - Pax2 para o tratamento de doenças renais - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PAX2 PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS RENAIS" A presente invenção refere-se à utilização de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da proteina Pax2 em um mamifero tendo em vista a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento, prevenção ou retardamento de uma disfunção/insuficiência renal em um mamifero. Adicionalmente, a presente invenção fornece um processo in vitro para converter tecido mesenquimal em tecido epitelial que compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma substância capaz de induzir e/ou de intensificar a expressão da proteina Pax2 no referido mesênquima e um processo para a regeneração de células estaminais ("stem cells") renais que compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da proteina Pax2.

Ao longo do texto da presente descrição detalhada citam--se vários documentos. 0 desenvolvimento e a diferenciação iniciais do rim metanéfrico dos mamíferos ocorrem juntamente com a diferenciação induzida de células mesenquimais em uma pequena população de células estaminais que se diferenciam e sofrem uma transição mesenquimal para epitelial (Bard (1994), Mech. Dev. 48: 3-11). Esse processo é estimulado ("is supported") por sinais originários do botão uretérico ("ureteric bud") na fase em que esse botão ou broto ("bud") se desloca para fora do dueto mesonéfrico (Lechner e Dressler (1997), Mech. Dev. 62: 105-120; Dressler (1999), Dev. Gen. 24: 189-193). 2 A necrose tubular aguda [(ATN) Acute Tubular Necrosis] constitui, com a doença pré-renal, uma das duas causas mais comuns de insuficiência renal aguda. É responsável por dois terços das causas intrínsecas da insuficiência renal aguda. Por exemplo, cerca de 5% de todos os pacientes hospitalizados [com respeito à Alemanha cerca de 725 000 dos 14 321 321 pacientes a serem tratados, estatísticas de 1998 de acordo com a "Bundesgesundheitsamt" (Secretaria Federal de Saúde) em Bona Alemanha] desenvolvem uma ATN (Hou (1983), Am. J. Med. 74, 243-248), que está relacionada com uma alta taxa de mortalidade de cerca de 50 a 60% [Bartlett (1984)], Am. Soc. Artif. Intern. Organs 30, 700-702]. A base molecular dos eventos que levam à regeneração tubular após uma ATN não é inteiramente compreendida. Uma teoria interessante reivindica, que os processos de regeneração consistem em modelos de desenvolvimento para restabelecer a função de órgãos ou de tecidos (Bacallao (1989), Am. J. Physiol. 257: F913-F924; Wallin (1992) Lab. Invest. 66: 474-484) Essa teoria pode verificar-se procurando semelhanças entre processos de desenvolvimento e regenerativos no que respeita ao nível molecular durante uma ATN experimental. O epitélio tubular adulto tem uma grande capacidade de regeneração após uma lesão, o que o distingue de outros tecidos como o do cérebro ou o do coração. Durante uma ATN células quiescentes sofrem normalmente uma indiferenciação e obtêm novamente a sua capacidade de divisão depois de aumentar enormemente a sua taxa de síntese de ADN (Taylor (1966), Nature 212:472-474, 966; Safirstein (1990), Kidney Int 37:1515-1521). Após proliferação as novas células diferenciam-se a fim de restabelecer a integridade funcional do nefrão. 3 A expressão e a bioactividade dos factores de crescimento podem controlar-se através de factores de transcrição (Dey (1994), Mol. Endocrinol. 8:595-602). A expressão de factores de crescimento como o HGF (Factor de crescimento de hepatócitos) e o IGF-1 (factor de crescimento análogo à insulina I) demonstrou-se ser regulada "em alta" ("upregulated") após lesão simulada do rim, enquanto a expressão do EGF (Factor de crescimento epidérmico) se apresenta abaixo da média ("downregulated"). Entre outros genes, cuja expressão é "upregulated" após uma ATN, existem genes precoces imediatos como c-fos, c-myc, c-jun ou EGR-1 (para revisão ver 6) . O Kid-1 é um gene que contem dedos de zinco ("zinc finger gene") o qual não é expresso em rins embrionários embora ocorra expressão especifica em rins adultos (Witzgall (1993), Mol. Cell Biol. 13:1933-1942). Como a expressão do gene Kid-1 se perde nos túbulos proximais de animais tratados com ácido fólico (Witzgall (1993), Mol. Cell Biol. 13:1933-1942), a sua regulação "em baixa" ("downregulation") pode reflectir uma fase funcional similar ao desenvolvimento renal precoce. Outros exemplos que demonstram a importância biológica da expressão bifásica de proteinas durante o desenvolvimento e na vida adulta incluem a expressão de bcl-2 e de bax, que durante o desenvolvimento metanéfrico precoce são conhecidos pelas suas funções antiapoptótica e pró-apoptótica, respectivamente (Veis (1993), Cell 75:229-240; Knudson (1995), Science 270:96-99). Durante a vida adulta demonstrou-se serem reexpressos em células tubulares proximais após lesão isquémica (Basile (1997), Am. J. Physiol. 272:F640-F647) . A vimentina é um filamento intermédio e um marcador de células mesenquimais indiferenciadas. Não se encontra presente nos túbulos de adultos saudáveis mas a reexpressão ocorre durante a regeneração tubular (Wallin (1992), Lab. Invest. 66:474-484). 4

Esses exemplos são consistentes com a teoria de que durante a regeneração a cascata de vias de desenvolvimento de genes pode ser reactivada. No entanto, não se observa um padrão de expressão de um factor de transcrição que seja transitoriamente expresso durante a nefrogénese e que seja suposto fazer parte da cascata genética que conduz à regeneração renal adequada na vida adulta após uma lesão renal e não se conhecem potenciais genes de desenvolvimento. A Patente de invenção norte-americana N° 5 747 250 descreve novos agentes para diagnóstico tumoral e/ou terapia em tumores que compreendem determinados factores de transcrição "Homeobox". Esses agentes incluem, nomeadamente, moléculas de ácidos nucleicos, bem como moléculas de ácidos nucleicos anti-senso que codificam proteínas Pax ou especificamente inibem a expressão de genes Pax, respectivamente. Além disso, a Patente de invenção norte-ame-cana N° 5 747 250 refere-se a agentes terapêuticos ou de diagnóstico que contêm pelo menos uma proteína Pax, escolhida no grupo constituído por Pax 1, Pax2, Pax 3, 4 Pax, Pax 5, Pax 6, Pax 7, Pax 8, HuPl, HuP2, prd, BSH4, BSH9, Pox neuro e Pox meso. A Patente de invenção norte-americana N° 5 747 250 utiliza os mencionados genes em diagnóstico tumoral e/ou terapia em tumores e não apresenta quaisquer meios ou processos para a melhoria das doenças renais nem refere factores de transcrição específicos envolvidos na regeneração renal.

Assim, o problema técnico da presente invenção é o de proporcionar meios e processos úteis para a protecção e/ou a melhoria de doenças renais, em especial para prover meios e métodos para influenciar processos fisiológicos que conduzam a uma diminuição da função renal. 5

Obtém-se a solução desse problema técnico pela propiciação de formas de realização de acordo com a presente invenção caracterizadas nas reivindicações.

Por conseguinte, é descrito um processo de tratamento, retardamento e/ou prevenção da disfunção/insuficiência renal em um mamifero que compreende a administração de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da proteina Pax2. Preferivelmente, o mamifero nessa e nas seguintes formas de realização de acordo com a presente invenção é um ser humano. 0 termo "tratamento" ("treatment/treating") e similares utilizam-se na presente invenção para significar na generalidade a obtenção do efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado(s). 0 efeito pode ser profilático em termos de prevenção total ou parcial de uma doença ou de um seu sintoma e/ou pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou total de uma doença e/ou de um efeito secundário atribuído a essa doença. 0 termo "tratamento" quando utilizado na presente invenção abrange um qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, especialmente um ser humano, e inclui: (a) o evitar que a doença ocorra em um indivíduo que pode apresentar predisposição para essa doença mas que ainda não foi diagnosticado como atingido pela mesma, (b) a inibição da doença, isto é, o controlo do seu desenvolvimento e/ou evolução, ou (c) a extinção da doença, ou seja, a indução da regressão da doença.

Além disso, prevê-se que o processo anterior mencionado para o tratamento, retardamento e/ou prevenção de doenças renais inclua métodos como a engenharia de tecidos. A 6 engenharia de tecidos é o processo pelo qual um novo tecido é criado artificialmente in vivo ou in vitro. Na prática, a engenharia de tecidos é o processo pelo qual o tecido vital é criado com caracteristicas e funções especificas de um órgão tais como integridade mecânica, bioestabilidade, microestrutura e actividade bioquímica. A engenharia de tecidos engloba todos os aspectos biológicos e moleculares que são necessários para a formação de tecidos que incluem por exemplo a diferenciação e a proliferação celulares, interacções célula a célula e do substracto com células e a sua organização colectiva em uma estrutura integral para um órgão. No futuro, uma cirurgia reconstrutiva de um órgão que utiliza tecnologias de transplante de células/tecidos ou de órgãos completos será substituída pela cirurgia de regeneração do órgão, como uma nova disciplina médica, que utiliza mecanismos para induzir processos de histogénese reparadora directamente das células do órgão hospedeiro ou através da introdução de células estaminais (Woerly (2000) XI; Tissue engineering, Introduction, p.1-15). A morfogénese de tecidos na vida pós-natal e no desenvolvimento embrionário é similarmente controlada por poucas e altamente preservadas famílias de morfogenes (Reddi (1997) , Cytokine Growth Factors Rev. 8:11-20; Ripamonti (1998) Plat. Reconstr. Surg. 101:227-239) que estão localizadas em vários tecidos e órgãos. Então, é óbvio sugerir que há necessidade de um grande número de morfogenes para promover de forma simultânea e em sinergia a cascata da formação de padrões ou morfogénese ou, se não para iniciar individualmente esse processo. Uma terapêutica molecular futura para morfogénese de tecidos/regeneração de órgãos do organismo adulto exigirá um padrão de expressão de proteínas e co-localização de morfogenes, recapitulando eventos que 7 ocorrem durante o curso normal do desenvolvimento embrionário. 0 conceito de que a indução de um tecido adulto altamente especializado na vida pós-natal compartilha mecanismos idênticos com o desenvolvimento embrionário tem sugerido que a "memória" de eventos do desenvolvimento dos embriões pode ser transferida durante o período imediatamente após o nascimento ("post-natally") através da aplicação de associações de morfogenes em sinergia (Ripamonti (1997), J. Bone Min. Res. 12:1584-1595).

Portanto, o futuro vai trazer um "mosaicismo" terapêutico em engenharia de tecidos, e exigirá prolongado ensaio de doses e de proporções ("ratios") de associações morfogenéticas recombinantes ou de seus estimuladores no contexto clínico.

Como documentado nos exemplos anexados observou-se surpreendentemente que a expressão da proteína Pax2 está implicada e é necessária para a melhoria da disfunção/insuficiência renal. Além disso, demonstrou-se mais surpreendentemente que, após a indução de uma disfunção/insuficiência renal artificial em animais experimentais, o bloqueio da proteína Pax2 por abordagens anti-senso leva à morte desses animais. Portanto, a proteína Pax2, quer estabilizada em um contexto fisiológico, quer administrada como uma proteína [ou como um seu (seus) fragmento(s) funcional(ais)], como uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína Pax2 ou expressa in vivo ou in vítro por uma substância capaz de induzir e/ou aumentar pode utilizar-se como um medicamento para o tratamento de disfunção/insuficiência renal, em particular para o tratamento de necrose tubular aguda. Assim, a presente invenção diz respeito às substâncias ou fármacos que são 8 capazes de in vivo e in vitro induzir e/ou aumentar a concentração da proteína Pax2 em uma célula, de preferência em uma célula renal, ainda mais preferivelmente em uma célula dos túbulos proximais. A referida indução e/ou aumento também inclui toda e qualquer estimulação in vivo da expressão da Pax2 pelas referidas substâncias. Considerando-se o facto de que a Pax2. é um factor de transcrição, qualquer proteína Pax2 ou um qualquer seu fragmento funcional pode considerar--se como uma substância que induz ou aumenta a expressão da Pax2 pois, através de mecanismos de feedback, a referida Pax2 funcional pode levar à mencionada estimulação in vivo de uma proteína Pax2 em uma célula. Em conexão com a presente invenção, a expressão "fragmento(s) funcional(ais)" da proteína Pax2 significa fragmentos que conservam, eventualmente de uma forma essencial, a capacidade de processar o efeito terapêutico ou profiláctico acima descrito. Esses fragmentos funcionais incluem, mas não estão limitados a, fragmentos que são responsáveis pela (o) sua localização nuclear, seu potencial regulador ("transacting") e/ou as suas capacidades de reconhecimento de ADN. Esses fragmentos funcionais podem, nomeadamente, resultar de pesquisas de homologia utilizando outros factores de transcrição, por exemplo, por comparação com outros genes homeobox.

Além disso, é descrito um processo para o tratamento, retardamento e/ou prevenção da disfunção/insuficiência renal em que a mencionada indução e/ou o aumento da expressão da proteína Pax2 ocorre (m) ao nível da transcrição e/ou da tradução.

Em conformidade com a presente invenção, a (o) mencionada (o) indução e/ou aumento pode(m) conduzir a uma 9 elevada concentração de ARNm que codifica a proteína Pax2 e/ou a uma elevada concentração da proteína Pax2 funcional e/ou a um seu(s) fragmento(s).

Em um aspecto a mencionada indução e/ou aumento é uma indução transitória e/ou um aumento transitório da expressão da proteína Pax2.

Em um outro aspecto o processo diz respeito a um método para o tratamento, retardamento e/ou prevenção da disfunção/insuficiência renal, em que a mencionada disfunção/insuficiência renal é uma insuficiência renal aguda ou crónica. Em uma forma de realização preferida, a mencionada insuficiência renal aguda é uma necrose tubular aguda.

Além disso, considera-se um processo para o tratamento, retardamento e/ou prevenção da disfunção/insuficiência renal em que se escolhe a mencionada substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da proteína Pax2 no grupo constituído por uma molécula de um ácido nucleico que codifica a proteína Pax2, uma proteína Pax2 ou o(s) (um) (seu)s fragmento(s) funcional(ais), um factor de crescimento, uma citocina, lítio, LIF [Leukemia Inhibitory Factor (Factor Inibidor da Leucemia)], osteopontina, uma proteína apóptica e ST AT 3 [Signal transductor and activator of transcription (Transdutor e activador do sinal da transcrição)] . A proteína Pax2, sendo um factor de transcrição, não está apenas implicada na transcrição de genes envolvidos no desenvolvimento de tecidos diferenciados multicelulares podendo também estar implicada nos mecanismos de regulação de feedback. Portanto, uma substância capaz de induzir e/ou 10 aumentar a expressão de Pax2 pode também ser uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína Pax2 e eleva desse modo a concentração da proteína Pax2 em uma célula ou pode ser mesmo uma proteína Pax2 (ou um seu(s) fragmento(s) funcional(ais) que leva, através do mencionado mecanismo de feedback, a níveis crescentes de Pax2 em uma célula e assim ao desejado efeito farmacêutico e/ou terapêutico . A sequência do ácido nucleico e a sequência da proteína Pax2 são bem conhecidas na arte (Dressler (1990), Development 109, 787-795; Sanyanusin (1996), Genomics 35, 258-261; Eccles (1992), Cell Growth Differ. 3, 279-289; Ward (1994), Cell Growth Differ. 5, 1015-1021; Stapleton (1993), Nat. Genet. 3, 292-298; Tavassoli (1997), Hum. Genet. 101, 371-375) podendo obterem-se facilmente através de telas de bases de dados ("database screens"), conforme descrito seguidamente na presente memória descritiva. A expressão "molécula de ácido nucleico" em conformidade com a presente invenção compreende sequências codificantes e, sempre que aplicável, não codificantes (como promotoras, amplificadoras, etc.). De acordo com a presente invenção, a expressão é "uma molécula de ácido nucleico" compreende também qualquer derivado viável de um ácido nucleico ao qual se pode hibridizar uma sonda de ácidos nucleicos. A própria sonda de ácido nucleico mencionada pode ser um derivado de uma molécula de ácido nucleico capaz de hibridizar com a referida molécula de ácido nucleico ou o seu derivado mencionado. A expressão "molécula de ácido nucleico" compreende ainda ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) que contêm análogos de ADN com ligações amídicas nos seus cernes ("backbone") (Nielsen, Science 254 (1991), 1497-1500). A expressão "molécula de ácidos nucleicos" que codifica uma proteína Pax2 (e/ou um seu fragmento) em conexão com a 11 presente invenção, define-se ou (a) por meio de sequências especificas de ácidos nucleicos que codificam a mencionada proteína Pax2 (e/ou um seu fragmento) ou (b) por meio de sequências de ácidos nucleicos que hibridizam sob rigorosas condições com as cadeias complementares das sequências nucleotídicas de (a) e codificam uma proteína Pax2 e/ou um seu fragmento divergindo dos ácidos nucleicos de (a) mediante uma ou mais substituições, deleções, adições ou inversões de nucleótidos, apresentando a sequência nucleotídica pelo menos 40%, de preferência pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60% de identidade com a sequência nucleotídica da mencionada proteína Pax2 codificada com uma sequência de aminoácidos tal como definida na arte e descrita antes na presente invenção. As sequências de ácidos nucleicos do tipo selvagem que codificam proteínas Pax2 (ou um seu(s) fragmento (s) obtêm-se ou derivam facilmente a partir de (Dressler (1990), Development 109, 787-795; Sanyanusin (1996) , Genomics 35, 258-261; Eccles (1992), Cell Growth Differ. 3, 279-289; Ward (1994), Cell Growth Differ. 5, 1015--1021; Stapleton (1993), Nat. Genet. 3, 292-298; Tavassoli (1997) , Hum. Genet. 101, 371-375). A expressão "proteína Pax2" designa, em conformidade com a presente invenção, um péptido, uma proteína ou um (poli)péptido que compreende cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento actuando como uma proteína Pax2 ou um seu fragmento em que os restos dos aminoácidos estão ligados por ligações peptídicas covalentes. No entanto, peptidomiméticos dessa(e)s proteínas/(poli)péptidos em que se substituíram aminoácido (s) e/ou ligações peptídicas por análogos funcionais englobam-se também na presente invenção. 12 0 mencionado factor de crescimento capaz de induzir e/ou aumentar a expressão de Pax2 escolhe-se no grupo constituído por FGF2, bFGF, TGF-a, TGF-β, FGF9, oncostatina M, PDGF-a, EGF, IGF-I [Insulin-like growth factor I (Factor de crescimento análogo à insulina I)] e HGF/SP [Hepatocyte Growth Factor or Scatter Factor (Factor de crescimento de hepatócitos)], GDNF, osteopontina, Wnt-1, Wnt-4 e BMP7.

Demonstrou-se que FGF2, bFGF, EGF, IGF-I, HGF/SF influenciam a conversão de mesênquima em epitélio ou o processo de tubulogénese directamente (estimulam) ou indirectamente através da expressão de receptores para as moléculas sinalizadoras (por exemplo, a expressão de receptores met no uréter como ligante para o HGF/SF que se expressa no mesênquima) no compartimento epitelial do uréter vizinho em desenvolvimento. A adição de FGF9 (Barasch (1999), Cell 99, 377-386) conduziu à epitelização de mesênquima murino. A oncostatina M induziu a epitelização de mesênquima murino in vitro (Barasch (1999), loc. cit.). Em prole da acção de LIF [Leukemia Inhibitory Factor (Factor Inibidor da Leucemia)] houve necessidade de TGFa, o que conduziu à expressão de Pax2 in vitro no mesênquima metanéfrico (Barasch (1999), loc. cit.).

Demonstrou-se que o TGF-β participou na regeneração renal após lesão pós-isquémica restaurando a homeostasia na matriz extracelular presente na membrana basal tubular proximal (Basile (1998b), Am. J. Physiol. 275:F894-F903). Especificamente, no segmento S3 (rectilíneo) do túbulo proximal ocorre regeneração após uma lesão isquémica (Basile (1998a) Miner. Electrolyte Metab. 24:144-148). Há muito tempo, os mesmos investigadores observaram (Basile (1996), Am. J. Physiol. 270: F500-F509) que os ARNm do TGF-βΙ (Factor 13 de Transformação do Crescimento) estavam significativamente elevados às 12 h após a lesão [1,5 vezes versus grupos controlo normais (sham operated group)], e às 24 h após a lesão estavam 3,6 vezes mais elevados. Os níveis permaneceram elevados durante 14 dias após a isquémia, mas aos 28 dias após a lesão já não estavam elevados. A coloração imuno-his-toquímica localizou o TGF-β activo no lúmen dos túbulos proximais em animais de controlo e em células epiteliais tubulares descamadas e de regeneração após isquémia. A bioactividade do TGF-β pode, após lesão renal, ser induzida pela proteína Pax2 upregulated (regulada "em alta") para aumentar a regeneração tubular a partir da homeostasia da matriz. 0 GDNF [Glial cell-derived neurotrophic factor (Factor neurotrófico derivado das células da glia)], um parente distante do TGF-beta, demonstrou-se também ser fundamental para o desenvolvimento correcto dos rins (Pichei (1996), Nature 382:73-76; Sanchez (1996), Nature 382:70-73; Moore (1996), Nature 382:76-79; Vega (1996), PNAS 93:10657-10661). O GDNF induz a fosforilação da tirosina do RET após a ligação a um receptor suplementar, o GDNFRa (Jing (1996), Cell 85:1113-1124; Treanor (1996), Nature 382:80-83). As células mesenquimais renais expressam o GDNF (Hellmich (1996), Mech. Devei. 54:95-105). Mutações homozigóticas nulas do GDNF em murganhos não desenvolvem rins. Os indivíduos heterozigotos para a mutação do GDNF apresentam malformações renais. O GDNF liga-se ao receptor RET (proteína rearranjada durante a transfecção) com um domínio tirosina-quinase com uma constante de dissociação de 8 nM, e o GDNF marcado com 125I pode ser co-imunoprecipitado com anticorpos anti-RET. 14

Curiosamente, um suplemento exógeno do factor GDNF derivado do mesênquima estimulou ambas as ramificações do uréter e estimulou também a proliferação de rins embrionários na cultura desse órgão (Vega (1996), PNAS 93:10657-10661). Além disso, a activação da via RET originou aumento da mobilidade celular, dissociação da adesão celular, e a migração em direcção a uma fonte localizada de GDNF (Tang (1998), J. Cell Biol. 142:1337-1345) em um ensaio in vitro de células MDCK, uma linha de células epiteliais renais de cão de origem tubular. A regeneração e a estimulação de episódios regeneradores no rim adulto exigem também migração celular, mobilidade celular e a dissociação da adesão celular em resposta a condicionamentos (cues) devidos à localização como no desenvolvimento do rim embrionário. Por isso pode considerar-se o GDNF como um importante cofactor da Pax2 a fim de reconstituir o epitélio tubular renal danificado após lesão.

Os genes Wnt codificam glicoproteinas que se julga actuarem como factores de sinalização segregados. Os fibroblastos transfectados com Wnt-1 induzem a formação de nefrónios durante co-cultura com mesênquima renal isolado (Herzlinger (1994), Dev. Biol. 166, 815-818). Demonstrou-se que Wnt-1 é capaz de iniciar a condensação e a tubulogénese em mesênquima não induzido. O Wnt-4 é upregulated (regulado "em alta") em células mesenquimais renais à medida que elas se diferenciam em nefrónios (Stark (1994), Nature 372, 679--683) . Os murganhos de mutação nula para Wnt-4 revelam aplasia renal, mesmo quando são induzidos metanefros daqueles embriões. O mesênquima daqueles animais parece estar "congelado" em um estado indiferenciado. A regulação em alta ("upregulation") da proteína Pax2 em rins adultos com insuficiência renal aguda é consequentemente considerada, de 15 acordo com a presente invenção necessitada de co-activação do Wnt-4 para aumentar suficientemente e terminar a diferenciação adicional do epitélio dos túbulos lesados.

As proteínas morfogenéticas ósseas [(BMPs) Bone morphogenetic proteins] são membros da superfamília TGFB e realizam a transdução de sinais de crescimento através de serina/treonina quinases receptoras do tipo I e II. As BMP7 são expressas pelas ramificações dos brotos uretéricos durante o desenvolvimento inicial renal e são também upregulated (reguladas "em alta") nos nefrónios primitivos (Dudley (1995), Genes Dev. 9:2795-2807; Luo (1995), Genes Dev. 9:2808-2820).

Curiosamente demonstrou-se que o cloreto de lítio promove a indução de mesênquima isolado (Davies (1995), Dev. Biol. 167, 50-60); o litio actua também como inibidor da glicogénio sintase quinase-3 (GSK-3 beta) e activa assim a via de sinalização Wnt (Klein (1996), PNAS 93, 8455-8459) . Dados recentes fornecidos por Godin (1998; Development 125, 3473-3482) sugerem que a expressão das BMP7 no mesênquima é activada mediante tratamento com LiCl, sugerindo que a activação das BMP7 tem lugar a jusante de um sinal Wnt. O tratamento de rins íntegros com cloreto de sódio - que interrompe a síntese de proteoglicanos - resulta na perda de expressão das BMP7 nos mesênquimas enquanto a expressão nos componentes epiteliais dos rins não é afectada (Godin (1998) Development 125, 3473-3482) . Portanto a expressão das BMP7 nos componentes epiteliais do rim não depende de interacções célula a célula ou na matriz extracelular (ECM) com o mesênquima metanéfrico. Dados recentes (Dudley (1999), Genes Dev. 13:1601-1613) demonstraram que as BMP7 em conjunto com o FGF2 promovem o crescimento e mantêm a aptidão do mesênquima 16 renal in vitro, o que não é possível só pela acção das BMP7. Mesmo quando se demonstra que o FGF2 e as BMP7 individualmente e em associação (Dudley (1999), Genes Dev. 13:1601-1613) inibem a tubulogénese podem ser necessários ambos os factores para fomentar a regeneração após insuficiência renal no adulto. Essa sugestão é apoiada por dados fornecidos por Vukicevic (1998, J. Clin. Invest. 102:202-214) que demonstraram que BMP7 recombinantes foram capazes de aperfeiçoar o tratamento da insuficiência renal aguda. Ratos aos quais se administraram BMP7 10 minutos antes ou 1 h ou 16 h após isquémia demonstraram a) uma menor área de infarto e de necrose celular bem como um decréscimo no número de túbulos obturados. A acção das BMP7 originou também uma reduzida morte programada de células durante a recuperação. Em conjunto como um todo, aqueles dados sugerem que as BMP7 (sinónimo OP-1) evitam a perda da função renal associada a lesão/reperfusão isquémica e fornecem conjuntamente com outros factores uma base para o tratamento da insuficiência renal aguda. Recentemente, (Bosukunda (2000), Kidney Int. 58:1902-1911) considerou como postulado um receptor ligado à membrana, específico, de alta afinidade para as BMP7 (receptor das BMP do tipo II) com uma massa molecular relativa de aproximadamente lOOkD. In vivo e in vitro os dados sugerem que os alvos celulares para as BMP7, para além de glomérulos e de duetos colectores são túbulos renais convolutos. Portanto considera-se que as BMP7 actuam directamente sobre células tubulares lesadas modificando especificamente as suas respostas às proteínas Pax2; semelhante à sua acção sobre células neurais, onde as suas respostas à molécula sinalizadora Sonic Hedgehog produzida pelo gene shh são influenciadas de modo que se diferenciem em células da linha mediana ventral do diencéfalo da porção 17 rostral em vez de células floor plate (Dale (1997), Cell 90:257-269) .

As citocinas capazes de induzir e/ou melhorar a expressão da proteína Pax2 podem escolher-se no grupo constituído por II-6, TNF-α e citocinas do tipo II-6.

Barasch (1999), loc. cit. demonstrou que as citocinas do tipo IL-6 actuaram como LIF [Leukemia Inhibitory Factor (produzido por células do uréter em brotamento ou gemulaçâo que actuaram sobre precursores epiteliais que expressavam proteínas Pax2 e genes Wnt4)], levando à expressão da proteína Pax2 em células mesenquimais metanéfricas.

Como mencionado antes na presente invenção, o lítio pode ser considerado como uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da proteína Pax2 no tratamento, no adiamento e/ou na prevenção de disfunção/insuficiência renal em um mamífero. Davies e Garrod (1995, Dev. Biol. 167, 50-60) propuseram um sal de lítio como um ião capaz de estimular a expressão da Pax. Além disso, em Davies e Garrod (1995), loc. cit. e Davies e Bard (1996; Exp. Nephrol 4, 77-85), demonstrou-se que in vitro o lítio induziu a agregação de células mesenquimais isoladas e conduziu também à expressão da proteína Pax2 nos agregados já 4 horas depois da sua administração. Sabe-se também que o lítio é capaz de utilizar o sistema heterogéneo de veículos no sistema de túbulos renais de adultos que normalmente transporta sódio.

Além disso, o LIF (Factor Inibidor da Leucemia) pode utilizar-se nos processos, bem como na utilização (Veja seguidamente na presente invenção) da presente invenção. Demonstrou-se que o LIF é segregado por células em gemulaçâo 18 dos ureteres no início do desenvolvimento metanéfrico (Barasch (1999), loc. cit.). 0 LIF actuou sobre precursores epiteliais que expressavam Pax2 e Wnt4. Outras citocinas do tipo IL-6 actuaram como o LIF. 0 LIF desencadeia a epitelização, a tubulogénese e a nefrogénese em mesênquimas metanéfricos isolados. Assim o LIF pode também ser apropriado para actuar no organismo adulto para aumentar ou iniciar a expressão da proteína Pax2 nos túbulos proximais na insuficiência renal aguda. A acção do LIF in vitro requer pré-tratamento com factores de crescimento mesenquimais como FGF2, TGFa ou FGF9 (Barasch (1999), loc. cit.). Para examinar se o LIF actua sobre precursores epiteliais (células que expressam Pax2, Wnt4) cultivaram-se mesênquimas metanéfricos com FGF2 e monitorizaram-se tendo em vista a activação do STAT3 (Transdutor e activador do sinal da transcrição) - um alvo de activação de 130 gp - 1 h apenas depois da exposição ao LIF, o STAT3 fosforilado foi proeminente nos núcleos dessas células, sugerindo que as citocinas podem activar directamente a sinalização de segundos mensageiros nos precursores epiteliais. A osteopontina (Etal) é uma fosfoproteína com carga negativa que possui uma sequencia arginina-glicina-ácido aspártico (RGD)-serina com ligação às células reconhecida por algumas integrinas, tendo-se demonstrado in vitro que serve como substrato de ligação a alguns tipos de células via integrinas e CD44, o receptor do ácido hialurónico de proteoglicanos da superfície celular (Weber (1996), Science 271:509-512). O pré-tratamento de ratos com o factor de crescimento análogo à insulina I [(IGF-I) Insulin-like growth factor I] melhora o curso da lesão renal isquémica aguda induzindo osteopontina (Padanilam (1996), Endocrinology 137, 2133-2140). O pré-tratamento com o IGF-I deu origem a níveis 19 crescentes do ARNm da osteopontina 12 h, um dia, e 5 dias após a lesão. Cinco dias após a lesão, detectaram-se o péptido osteopontina e ARNm em túbulos proximais em regeneração. A osteopontina provavelmente serve para promover a regeneração de tecidos e a remodelação dos mesmos no intervalo de um dia após lesão isquémica aguda do rim e pode portanto actuar simultaneamente com a proteína Pax2. Consequentemente a expressão reforçada do IGF-I pela osteopontina em uma pós-isquémia temporalmente anterior pode melhorar o curso da lesão via uma acção concertada com a proteína Pax2.

Como mencionado antes na presente invenção a mesma divulga substâncias capazes de induzir e/ou aumentar a expressão da proteína Pax2, substancias essas que compreendem proteínas apoptóticas. Em uma forma de realização especialmente preferida a mencionada proteína apoptótica é CHOP, bax ou bcl-2.

Moléculas intracelulares como BCL2 têm um grande impacto sobre o crescimento metanéfrico afectando a sobrevivência das células renais (Sorensen (1995), Am. J. Physiol. 268:73-81). Os genes bax e bcl-2 em rins de adultos são conhecidos como reguladores da regeneração (Basile (1997), Am. J. Physiol. 272:F640-F647) . Após lesão renal, a expressão de ARNm de bcl--2 intensificou-se acentuadamente (2,1 vezes no período de 24h da lesão) para regenerar células do túbulo proximal que revestem a membrana basal. Para as proteínas com origem no bcl-2 apresentou-se o mesmo padrão. As concentrações permaneceram elevadas durante 3 dias e voltaram ao inicial decorridos 5 dias depois da isquémia. Para regenerar túbulos proximais após isquémia co-localizaram-se ARNm de bax e proteínas com origem em bax. Pode-se concluir que as 20 expressões de bcl-2 e bax no rim aumentam sob a forma de um padrão previsível depois de lesão renal aguda. Assim isto pode significar que esses reguladores de apoptose desempenham importantes papéis no processo de reparação dos túbulos proximais lesados após isquémia. Gobe e colaboradores demonstraram também que após insuficiência renal aguda isquémica em ratos o gene bcl-2 foi expresso antes de conhecidos factores de crescimento regeneradores como o IGF-1 e o EGF nos túbulos proximais e distais (Gobe (2000), J. Am. Soc. Nephrol. 11:454-467). Isto sugere que o túbulo distai é adaptável e resistente a lesão isquémica mediante a fomentação da sobrevivência utilizando genes bcl anti-apoptó-ticos, permitindo a sua sobrevivência a expressão de factores de crescimento fundamentais não só para a manutenção e a regeneração da sua própria população de células (autócrinas), mas também para as células tubulares proximais adjacentes sensíveis à isquémia. O processo de regeneração eficaz do epitélio tubular proximal depois de insuficiência renal aguda é, portanto, considerado, de acordo com a presente invenção dependente de prolongada e contínua expressão de bcl-2 como um factor a jusante de Pax2 necessário para a sobrevivência anti-apoptótica de especificamente epitélio lesado. A quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da proteína Pax2 pode inserir-se em uma composição ou sob a forma de uma composição. A mencionada composição pode apresentar-se sob uma forma sólida, líquida ou gasosa e pode apresentar-se, nomeadamente, sob a forma de (um) pó(s), (um) comprimido(s), (uma) solução(ões) ou (um) aerossol(es). Por isso, a presente invenção refere-se a um processo para o tratamento, o retardamento e/ou a prevenção da disfunção/insuficiência renal, em que se utilizam substâncias 21 como definidas antes na presente invenção, as quais se podem apresentar sob a forma de uma composição farmacêutica, compreendendo ainda eventualmente um veiculo e/ou diluente e/ou excipiente aceitável(eis). A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser especialmente útil na prevenção, no retardamento e/ou no tratamento de distúrbios renais patológicos em humanos ou animais. Os distúrbios patológicos mencionados compreendem, embora sem carácter limitativo, disfunção/insuficiência renal aguda e crónica. Esses distúrbios compreendem, nomeadamente, necrose tubular aguda (de origem pré-renal/hemodinâmica e renal), bem como necrose tubular aguda após transplante renal, insuficiência renal aguda e insuficiência renal aguda tóxica associadas a fármacos. Insuficiência renal crónica inclui todos os transtornos da insuficiência renal, ou seja, após glomerulonefrite de origem diferente ou insuficiência renal crónica de pacientes após transplante renal.

Como declarado antes na presente invenção, a composição farmacêutica pode utilizar-se também para fins profiláticos.

Na arte conhecem-se bem exemplos de veículos farmacêuticos adequados que incluem soluções salinas tamponadas com um fosfato, água, emulsões, tais como emulsões óleo/água, vários tipos de agentes molhantes, soluções estéreis, etc.. As composições que compreendem esses veículos podem ser formuladas por processos convencionais conhecidos. Essas composições farmacêuticas podem administrar-se aos indivíduos em uma dose adequada. A administração das composições adequadas pode efectuar-se de diferentes maneiras, por exemplo, por administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal ou intrabrônquica. No entanto, 22 visiona-se também que as composições farmacêuticas se apliquem directamente no tecido néfrico. Os modos de tratamento posológicos serão determinados pelo médico assistente ou veterinário e por factores clínicos. Como é bem conhecido na prática clínica, as posologias para qualquer paciente dependem de muitos factores, incluindo a estatura do paciente, a área da superfície corporal, o peso corporal, a função renal, a saúde geral, a idade, o sexo, o composto específico a ser administrado, o tempo e a via de administração, e outros fármacos a serem administrados concomitantemente. A substância activa sob o ponto de vista farmacêutico pode estar presente, inter alia, em quantidades entre 1 yg e 5 g por dose, no entanto, doses inferiores ou superiores a essa série exemplar de valores estão previstas, especialmente considerando os factores acima mencionados. Se o modo de tratamento é uma perfusão contínua, deve também estar nos limites unitários de 1 yg a 10 mg por quilograma de peso corporal por minuto, respectivamente. A administração de quantidades de moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína Pax2 (e/ou um seu fragmento) entre 1 yg e 5 mg/kg de peso corporal por dose está prevista. Vectores, incluindo vectores de expressão e/ou para alvejamento genético ou de transferência génica (como vectores virais) podem ser administrados em doses de 1 yg a 5 mg/kg de peso corporal. Contudo, consideram-se também doses superiores e inferiores aos valores apresentados na presente invenção. A progressão pode monitorizar-se através de uma avaliação periódica. As composições/substâncias que induzem e/ou aumentam a expressão da proteína Pax2 podem administrar-se localmente ou sistemicamente. A administração será geralmente parentérica, por exemplo, por via intravenosa. As composições/substâncias que induzem e/ou aumentam a expressão da proteína Pax2 também podem administrar-se directamente no local de destino, por 23 exemplo, mediante biolística uma técnica avançada para entrega em um sítio alvo interno ou externo como um rim ou através de cateter para um sítio em uma artéria ou podem administrar-se directamente no tecido renal e/ou mesenquimal. As preparações para administração parentérica incluem soluções aquosas ou não aquosas estéreis, suspensões, e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietilenoglicol, óleos vegetais como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis tais como oleato de etilo. Veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios com soro fisiológico e tamponados. Veículos para administração parentérica incluem uma solução de cloreto de sódio, dextrose em soluto de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, soluto de Ringer com lactato, ou óleos não voláteis. Veículos para administração intravenosa incluem agentes repositores (replenishers), isto é agentes que repõem o que se perdeu, consumiu ou que está em falta de fluidos e de nutrientes, agentes repositores de electrólitos (tais como os baseados em dextrose em soluto de Ringer), e similares. Podem também estar presentes conservantes e outros aditivos, como, por exemplo, antibióticos, antioxidantes, quelantes, e gases inertes e similares. Além disso, a "composição farmacêutica" de acordo com a presente invenção pode incluir mais agentes, dependendo da utilização pretendida da composição farmacêutica. Tais agentes podem ser medicamentos que actuam sobre o sistema excretor/secretor do rim ou do trato urinário bem como sobre a função tubular proximal e/ou distai, a função glomerular e/ou a função do sistema de duetos colectores. Além disso a mencionada composição farmacêutica pode compreender adicionalmente fármacos e compostos que podem influenciar a filtração glomerular. Outros fármacos que actuam sobre o sistema excretor ou o tracto urinário durante insuficiência 24 renal incluem, embora sem carácter limitativo, diuréticos de alça (por exemplo furosemida) ou anti-hipertensores como antagonistas do cálcio (por exemplo nifedipina) ou inibidores da enzima conversora da angiotensina (por exemplo, o ramipril e o lisinopril).

Em uma determinada forma de realização preferida, a molécula de ácido nucleico codificante da proteína Pax2 [e/ou um seu(s) fragmento(s) funcional(ais)] e capaz de induzir e/ou de aumentar a expressão da proteína Pax2 faz parte de um vector. Portanto, um outro aspecto refere-se a um processo de tratamento em que a molécula de ácido nucleico que codifica a proteína Pax2 está inserida em um vector. Um tal vector pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um cosmídeo, um vírus, um bacteriófago ou um outro vector aproveitado, por exemplo, com fins terapêuticos e/ou em engenharia de tecidos in vitro/in vivo. 0 mencionado vector pode incluir outros genes tais como genes marcadores que permitam a selecção do mencionado vector em uma célula hospedeira apropriada e sob condições adequadas, ou que permitam a monitorização da expressão correcta em células e/ou tecidos.

Além disso, os vectores podem, para além das sequências de ácidos nucleicos codificantes de proteínas Pax2, incluir elementos de controlo da expressão, permitindo a expressão correcta das regiões codificantes em células, tecidos e/ou órgãos adequada(o)s. Um perito conhece esses elementos de controlo que podem incluir um promotor, um códão de iniciação da tradução, um sítio de tradução e de inserção para a introdução de um "insert" no vector. De preferência, a molécula de ácido nucleico codificante da proteína Pax2 (e/ou um seu fragmento) liga-se eficientemente às mencionadas sequências de controlo da expressão permitindo a expressão em 25 células eucarióticas ou procarióticas. No presente contexto preferem-se especialmente sequências de controlo que permitam a expressão correcta em células renais e/ou células derivadas de tecidos renais e/ou em células mesenquimais, pluripotentes, indiferenciadas. Especialmente preferidas são, portanto, sequências de controlo que permitam a expressão correcta em células metanéfricas, como as sequências LTR do plasmideo de expressão pCMV-Pax2b (Lechner e Dressler (1996), J. Biol. Chem. 271, 21088-21093) que activa e diriqe a transcrição do gene Pax2 em células mesenquimais. No interior do terminal COOH de Pax2, os aminoácidos 279-373 são essenciais para a transactivação. No entanto essa região individualmente é insuficiente para a total transactivação quando fundidos apenas com o domínio emparelhado ou com um domínio heterólogo de ligação ao ADN. A mutação ou a deleção da sequência conservada de octapéptidos originou transactivação crescente mediada pelas proteínas Pax. A repressão mediada pelo octapéptido observa-se também em um contexto heterólogo utilizando o domínio de ligação ao ADN de GAL4 . Assim a transactivação por Pax2 conta com algumas regiões no interior do terminal COOH e é modulada negativamente pelo elemento octapeptídico.

Um outro exemplo de transactivação específica de Pax2 em células inclui experiências de cotransfecção com construções da expressão de Pax2 em células CHO-Kl (McConnell (1997), Oncogene 14, 2689-2700). As proteínas Pax2 transactivaram o promotor WT1 até 35 vezes em células CHO-Kl, e quatro a sete vezes em 293 células. Para transactivação eficiente por acção de proteínas Pax2 em células CHO-Kl foram necessárias duas regiões do promotor WT1 na mesma construção do promotor, tendo-se encontrado proteínas Pax2 recombinantes purificadas a ligarem-se aos dois sítios no promotor WTl (McConnell 26 (1997), loc. cit.), em -205/-230 e +377/+402. A remoção de sequências do promotor WT1 que contêm os sítios de ligação -205/-230, ou +377/+402 suprimiu a transactivação do promotor WT1 por Pax2 em células CHO-K1, e provocou um efeito diferencial sobre a transactivação do promotor WT1 em 293 células, dependendo das isoformas de Pax2 utilizadas. Um fragmento que contenha apenas o sítio -205/-230 poderá ser transactivado por proteínas Pax2.

Os peritos na especialidade conhecem bem elementos de controlo que asseguram a expressão em células eucarióticas. Como mencionado antes, eles normalmente incluem sequências reguladoras que asseguram o início da transcrição e, eventualmente, sinais de poli-A que asseguram o término da transcrição e a estabilização do transcrito. Elementos reguladores adicionais podem incluir promotores transcricionais bem como estimuladores traducionais, e/ou regiões promotoras naturalmente associadas ou heterólogas. Possíveis elementos reguladores permitindo a expressão em, por exemplo, células hospedeiras de mamífero incluem o promotor de CMV-HSV timidina quinase, SV40, o promotor do RSV (vírus Rous sarcomea), o promotor do factor la de elongação humano, o promotor do CMV, o promotor de CaM-quinase ou o promotor do SV40. Para a expressão, por exemplo, em rins/tecido renal e/ou células daí derivadas, algumas sequências reguladoras são bem conhecidas na arte, como o promotor do CMV de CMV-CAT (como descrito em Foecking (1986), Gene 45, 101-105; Furth (1991), Nuc. Acids Res. 19, 6205--6208), que especificamente expressa Pax2 em rins embrionários (Dressler (1993), Nature 362, 65-67). Além dos elementos que são responsáveis pela iniciação da transcrição tais elementos reguladores podem também incluir sinais de terminação da transcrição, como o sítio de poliadenilação 27 derivado do vírus SV40 (SV40-poli-A) ou o sítio de poliadenilação derivado do gene da timidina quinase (tk-poli--A), a jusante do polinucleótido. Nesse contexto, conhecem-se na arte vectores de expressão adequados como pcDVl vector de expressão de Okayama-Berg que integra cDNA (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (In-Vitrogene, quando utilizado, designadamente nos exemplos em anexo) , pSPORTl (GIBCO BRL) ou pGEMHE (Promega). Além das moléculas do ácido nucleico que codificam a proteína Pax2 o vector ainda pode incluir sequências de ácido nucleico codificantes de sinais de secreção. Um perito na especialidade conhece bem tais sequências. Além disso, dependendo do sistema de expressão utilizado, podem acrescentar-se à sequência codificante das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção sequências líderes bem conhecidas na arte capazes de encaminhar a proteína/o (poli)péptido até um compartimento celular. A(s) sequência(s) líder(es) constrói(em)-se em uma fase adequada com tradução, sequências de iniciação e de terminação, e preferivelmente, uma sequência líder capaz de dirigir a secreção da proteína traduzida, ou uma sua parte, em direcção, nomeadamente, ao núcleo. Eventualmente, a sequência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão inclusive um péptido de identificação C- ou N-terminal conferindo as características desejadas, por exemplo, a estabilização ou a purificação simplificada do produto recombinante expresso. É claro que o vector pode também incluir regiões regulatórias de organismos patogénicos.

Além disso, o mencionado vector também pode ser, além de um vector de expressão, um vector de transferência génica e/ou um vector para alvejamento génico. A terapia genética, que se baseia na introdução de genes terapêuticos em células utilizando técnicas ex-vivo ou in-vivo constitui uma das mais 28 importantes aplicações de transferência genética. Vectores apropriados, sistemas de vectores e processos de terapia génica in vitro ou in vivo são descritos na literatura e são conhecidos dos peritos na especialidade; ver, por exemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996) 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808— -813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469, WO 97/00957, Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 ou Verma, Nature 389 (1997), 239-242 e referências ai citadas. Como se demonstra nos exemplos anexos, um vector adequado para a expressão de uma molécula de um ácido nucleico que codifica proteínas Pax2 é o vector retroviral pMMuLV-SVTK-NEO, conforme descrito em Rubenstein (1984), PNAS EUA 81,7137-7140. A transferência de informação genética para o rim adulto foi recentemente mediada com êxito utilizando o sistema de virus adeno-associados (AAV) (Lipkowitz (1999), J. Am. Soc. Nephrol. 10:1908-1915). O AAV, que é um virus defeituoso da familia dos parvovirus, apresenta uma série de propriedades interessantes para a administração de genes a células renais: 1) o AAV recombinante não possui genes virais, 2) a expressão dos genes fornecidos por esses vectores não activa imunidade mediada por células; 3) o virus é capaz de transduzir células quer ou não em divisão; e 4) quer o AAV do tipo selvagem ("wild type") quer o AAV recombinante integram o cromossoma hospedeiro resultante da expressão de genes a longo prazo. Os autores foram capazes de demonstrar que o AAV pode dispensar genes repórter no túbulo proximal humano, no ramo ascendente grosso da ansa de Henle, mesangial, no túbulo colector, e em células de carcinoma de células renais em cultura primária. O AAV administrado in vivo por injecção intraparenquimatosa faz 29 surgir pelo menos três meses de expressão do gene repórter em células epiteliais tubulares. Tendo em vista que o AAV realiza preferencialmente a transdução de células na fase S do ciclo celular (Russel (1994), PNAS 91:8915-8919) esse aspecto virai pode ser perfeitamente utilizado para o tratamento da insuficiência/regeneração renal aguda em que muitas células tubulares proximais entram de novo no ciclo celular e passam pela fase S a fim de se regenerarem. Uma desvantagem importante dos vectores AAV destinados a terapia genética tem sido a sua limitação respeitante à condição de pequenos genes de doenças (acondicionamento com a dimensão de 5Kb) ; presentemente resolveu-se esse problema através do mecanismo de trans-splicing entre dois vectores independentes co-administrados no mesmo tecido (Yan (2000), PNAS 97:6716--6721). Assim é possível aplicar tecnologia AAV na recuperação relacionada com proteínas Pax2 no decurso de insuficiência renal aguda.

Bosch (1993; Exp. Nephrol. 1 49-54) tentou transferir genes através de um sistema vectorial retroviral (Psi2 BAG) para o interior do rim normal e descobriu que o muito baixo índice mitótico do rim foi o responsável pela sua falta de sucesso. No entanto, quando se danificaram as células epiteliais tubulares com ácido fólico, elas proliferaram posteriormente e demonstrou-se bem sucedida a transferência génica nas células epiteliais tubulares em regeneração mediante a utilização da actividade da beta-galactosidase como um marcador.

Para o tratamento de insuficiência renal aguda através de terapia génica é crucial uma transfecção específica de células tubulares proximais. Portanto, o controlo exacto do destino do transgene é o último pré-requisito para a perfeita 30 expressão do transgene no tecido lesado. Tal específico e bem sucedido alvejamento celular que resultou na expressão em células tubulares realizou-se recentemente utilizando poliplexos que se injectaram na artéria renal (Poglieni (2000), Gene Ther. 7: 279-285). Determinações da grandeza por espalhamento de luz laser [Laser-Light Scattering (LLS)] demonstraram que o diâmetro médio dos poliplexos (93 nm) era menor do que o dos lipoplexos (160nm; contendo o lipídico catiónico DOTAP), que antes se aplicaram especificamente a células tubulares alvo - uma vez que a barreira de filtração glomerular não pôde ser transposta. O tamanho das partículas transfectadas é, portanto, um parâmetro importante e relevante para a expressão perfeita em células tubulares. A transfecção exógena de proteínas Pax2 em células epiteliais tubulares traumatizadas a fim de estimular a regeneração deve, portanto, incluir a aplicação de poliplexos como veículos de complexos de proteína Pax2/ADN.

Para transferência génica mediada por lipossomas no rim ver Lai (1997; Gene Ther. 4:426-431). Os autores obtiveram uma transferência transitória nos túbulos. Uma vez que os mecanismos de regeneração e as proteínas aí envolvido (a)s após insuficiência renal aguda são de natureza transitória, uma transferência transitória de material genético (Pax2) é deliberadamente a melhor escolha para estimular a regeneração.

Para abordagens de transferência génica ex vivo nos rins ver Kelley (1999; Am. J. Physiol. 276 F9-F1). Nestas utilizaram-se como veículos células parenquimatosas renais de preparação experimental para administrar moléculas em um determinado sítio no rim. Como essas células do parênquima renal estão geneticamente modificadas para gerar uma molécula 31 escolhida e essas células são reintroduzidas seguidamente nos rins com a intenção de administrar a molécula escolhida, os autores usam a expressão células "transportadoras".

Podem-se seleccionar (biopsia) e utilizar células epiteliais tubulares provenientes de uma pessoa que sofra de insuficiência renal aguda, e modificarem-se essas células da forma descrita para determinar o impacto da administração de Pax2 no sentido de travar a lesão renal com células "transportadoras".

Para uma visão geral real sobre diferentes processos de transferência génica para alvejamento renal incluindo processos de administração de vectores virais - retrovirais, adenovirus - e genes incluindo o vírus hemaglutinante do Japão (HVJ), lipossomas, lipossomas catiónicos, e futuras administrações em doenças renais ver Kelley (1999; Am. J. Physiol. 276:Fl-F9).

Procurando promotores específicos de tecidos para a futura terapia genética a utilizar como alvo tendo em vista o rim Lai (1998; Life Sei. 63:121-126) demonstrou que a sequência 5 da anidrase carbónica II humana (CAI II) de aproximadamente 1,3 kb contém fortes sequências promotoras nas células tubulares renais.

Estudando o alvejamento selectivo de um órgão ("organ--selective targeting") com base na selecção in vivo de sequências peptídicas aleatórias, os autores (Pasqualini (1996), Nature 380:364-366) detectaram péptidos capazes de mediar a localização selectiva de fagos nos vasos sanguíneos do cérebro e dos rins. Recentemente, o mesmo laboratório (Trepei (2000), Hum. Gene Ther. 11:1971-1981) aperfeiçoou 32 ainda a técnica que leva ao desenvolvimento de adaptadores moleculares para vectores adenovirais alvo para terapia genética (molecular adaptors to target adenoviral gene therapy vectors) para escolherem "endereços" ("addreesses") vasculares. Os péptidos isolados por esta abordagem ligam-se aos receptores expressos nos endotélios vasculares. 0 modelo de adaptador consiste em um péptido endereçado para um órgão ("organhoming") conjugado com um fragmento (moiety) de ligação ao adenovírus. Os autores isolaram e caracterizaram vários anticorpos monoclonais que se ligam ao adenovirus tipo 5 (Ad5). Dois desses anticorpos neutralizaram a infecção por Ad5. Os autores ligaram os fragmentos Fab de um desses anticorpos a um péptido sintético endereçado para os pulmões ("lung-homing") (GFE-1) e verificaram a capacidade do conjugado biespecifico resultante para alvejar novamente Ad5. As células que expressam o receptor no péptido endereçado para os pulmões ("lung-homing") e são resistentes à infecção pelo Ad5 foram sensibilizadas para vectores recombinantes Ad5 na presença do adaptador Fab-GFE. Os achados indicam que a administração selectiva por terapia génica pode ser desenvolvida na base dessa tecnologia de alvejamento ("targeting") vascular para diferentes órgãos e tecidos. As sequências peptidicas e os adaptadores podem no futuro ajudar a controlar de forma eficiente células, fármacos e genes em tecidos seleccionados.

As moléculas de ácido nucleico e os vectores como descrita(o)s antes na presente memória descritiva podem ser projectada(o)s para introdução directa ou para introdução via lipossomas, ou vectores virais (por exemplo, adenovirus, retrovirais) no interior da célula. Além disso, sistemas de baculovirus ou sistemas baseados em virus vaccinia, virus adeno-associado (AAV) ou virus Semliki Forest podem utilizar- 33 -se como sistemas de expressão em células eucarióticas destinados às moléculas de ácido nucleico codificantes da proteína Pax2. Além da produção recombinante da proteína Pax2 e/ou de fragmentos da proteína Pax2, podem produzir-se proteínas de fusão que compreendem sequências de aminoácidos das proteínas Pax2 mediante síntese directa de péptidos utilizando técnicas em fase sólida [cf. Stewart et al. (1969) Solid Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, S. Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154]. A síntese de proteínas in vitro pode realizar-se utilizando técnicas manuais ou automatizadas. A síntese automatizada pode conseguir-se, por exemplo, utilizando Applied Biosystems 431 A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City CA) em conformidade com as instruções fornecidas pelo fabricante. Vários fragmentos podem sintetizar-se por via química separadamente e em associação utilizando processos químicos para produzir a molécula completa ("full length"). Como salientado antes na presente memória descritiva, a presente invenção refere-se, portanto, em uma forma de realização preferida a um processo de acordo com a mesma invenção em que o mencionado vector compreende uma molécula de ácido nucleico codificante de proteínas Pax2 em um vector de expressão e/ou um vector para alvejamento genético ("gene targeting") ou um vector de transferência génica. Especialmente preferidos são, como mencionado antes na presente memória descritiva, os vectores mencionados que compreendem uma sequência de controlo da expressão. Em uma forma de realização especial preferida o processo da presente invenção refere-se a um método em que a mencionada indução e/ou aumento da expressão de proteínas Pax2 ocorre em células dos túbulos proximais do rim. 34

Em um outro aspecto particular, o processo diz respeito a um método terapêutico conforme descrito antes na presente memória descritiva em que a quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de uma substância está entre os limites de lyg e de 5g. No entanto, as concentrações superiores ou inferiores a esses limites são igualmente consideradas e dependem de factores como descritos antes na presente memória descritiva. Uma vez que o rim, que tem uma função comprometida, é especialmente sensível a um qualquer dano potencialmente tóxico, devem administrar-se substâncias capazes de induzir e/ou de aumentar a expressão de proteínas Pax2 em concentrações que não causem nenhum problema histológico, fisiológico e/ou funcional adicional.

Além disso, a presente invenção refere-se à utilização de uma dose eficaz de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da proteína Pax2 em um mamífero para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar, prevenir ou retardar uma disfunção/insuficiência renal em um mamífero. Em uma forma de realização preferida, a mencionada disfunção/insuficiência renal é uma insuficiência renal aguda ou crónica, e ainda em uma forma de realização mais preferida a mencionada insuficiência renal aguda é a necrose tubular aguda. A presente invenção refere-se, mas em uma forma de realização ainda mais preferida, à sua utilização em que se escolhe a mencionada substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da proteína Pax2 no grupo constituído por uma molécula de ácido nucleico codificante da proteína Pax2, uma proteína Pax2, um factor de crescimento, uma citocina, lítio, LIF [Leukemia Inhibitory Factor (Factor Inibidor da Leucemia)], osteopontina, uma proteína apoptótica 35 e STAT3 [Signal Transductor and Activator of Transcription (Transdutor e activador do sinal da transcrição)].

Os factores de crescimento especialmente preferidos são FGF2, bFGF, FGF9, TGF-a, TGF-β, oncostatina M, PDGF-α, EGF, IGF-I (factor de crescimento similar à insulina-I) e HGF/SF [Hepatocyte Growth Factor or Scatter Factor (Factor de crescimento de hepatócitos) ] , citocinas especialmente preferidas são IL-6, citocinas do tipo IL-6, TNF-α, GDNF, Wnt-1, Wnt-4 e BMP7.

Em uma forma de realização ainda mais preferida, a presente invenção refere-se à utilização da mesma invenção em que a mencionada molécula de ácido nucleico codificante da proteína Pax2 é incluída em um vector. Esse vector pode ser um vector de expressão e/ou um vector para alvejamento genético ("gene targeting") ou um vector de transferência génica. 0 mencionado vector de expressão e/ou vector para alvejamento genético ou vector de transferência génica pode incluir ainda uma sequência de controlo da expressão.

Além disso, a presente invenção refere-se à utilização da mesma invenção em que a referida dose eficaz de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da Pax2 está nos limites entre 1 yg e 5 g. De preferência em um intervalo de 1 yg a 500 yg ou 1 g. Conforme descrito antes na presente memória descritiva, as concentrações superiores e inferiores estão consideradas e os modos de tratamento posológicos serão determinados por um médico assistente ou veterinário.

Em uma forma de realização preferida administra-se a mencionada dose eficaz antes e/ou durante e/ou após cirurgia 36 e/ou diálise renal. Preferencialmente, a mencionada administração ocorre no período de uma hora e/ou 1 a 24 horas e/ou um dia e/ou 1 a 7 dias e/ou semanalmente e/ou 1 a 4 semanas e/ou mensalmente e/ou bimestralmente e/ou trimestralmente e/ou quadrimestralmente e/ou semestralmente e/ou anualmente antes e/ou após uma cirurgia e/ou diálise renal. Ainda, a mencionada administração também pode ser antes e/ou durante e/ou após outro tratamento para a insuficiência da função renal.

Ainda uma outra questão sobre o objectivo da presente invenção consiste em um processo para a produção de uma composição farmacêutica para o tratamento, prevenção e/ou retardamento de uma disfunção/insuficiência renal em um mamífero mediante a associação de um vector constituído por uma molécula de ácido nucleico codificante de uma proteína Pax2 funcional com um veículo aceitável sob o ponto de vista biológico, em que se coloca a mencionada molécula de ácido nucleico no referido vector sob o controlo de uma sequência de controlo da expressão. Essas sequências de controlo são bem conhecidas na especialidade e descritas, entre outras, anteriormente na presente memória descritiva.

As formas de realização específicas conforme descritas anteriormente na presente memória descritiva do processo de tratamento, retardamento e/ou prevenção de uma disfunção/insuficiência renal em um mamífero ou as formas de realização específicas da utilização da presente invenção também se aplicam ao referido processo para a produção de uma composição farmacêutica. A presente invenção refere-se também a um processo in vitro para a conversão de tecido mesenquimal em um tecido 37 epitelial que compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da Pax2 no referido mesênquima. Essa substância pode administrar-se a uma cultura de tecidos ou a um animal, de preferência um mamifero e mais preferivelmente ao homem.

Todas as formas de realização especificas estão descritas anteriormente na presente memória descritiva tendo em vista a aplicação de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da Pax2, com as mudanças necessárias no processo para a conversão de tecido mesenquimal em um tecido epitelial. 0 mencionado processo pode utilizar-se quer in vivo quer in vitro.

Além disso, a presente invenção diz respeito a um processo in vitro para a regeneração de células estaminais ("stem cells") renais que consiste na administração de uma quantidade eficaz de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da proteína Pax2.

Nos processos anteriores os mencionados tecido(s) e células estaminais são, respectivamente, de mamíferos, preferivelmente tecidos e células estaminais humano(a)s ou seus derivados. A expressão "seus derivados" pretende que neste contexto se entenda que a mencionada(o) célula ou tecido tem uma célula precursora que é uma célula de tecido mesenquimal ou uma célula estaminal renal e que essencialmente mantém as características biológicas da(o) referida (o) célula ou tecido.

As formas de realização específicas descritas para os processos de tratamento, retardamento e/ou prevenção da disfunção/insuficiência renal em um mamífero ou as formas de 38 realização específicas para a utilização da presente invenção adequam-se também aos mencionados processos para a regeneração de células estaminais renais. Essa regeneração pode ser, designadamente, alcançada por indução/reactivação de células estaminais renais dormentes. Demonstrou-se que os animais aos quais se administrou uma dose subletal, mas tóxica de tunicamicina mostram uma taxa reduzida de regeneração de células epiteliais do túbulo proximal e uma taxa reduzida de apoptose. Portanto, e sem estar subordinado a qualquer tese, a mencionada regeneração mediante indução e/ou aumento da expressão da proteína Pax2 pode obter-se pela activação de proteínas da via apóptica. A presente descrição detalhada relata ainda processos para o diagnóstico da disfunção/insuficiência renal e/ou função renal e/ou disfunção/insuficiência ou susceptibilidade também em um mamífero que consistem em (a) determinar a concentração ou as condições ("status") das células renais com ARNm da Pax2 do mencionado mamífero; ou (b) determinar a concentração ou as condições ("status") da proteína Pax2 em células renais do mencionado mamífero; ou (b') determinar a concentração ou as condições ("status") do ARNm da Pax2 e a concentração ou as condições da proteína Pax2 em células renais do mencionado mamífero; e (c) comparar a mencionada concentração ou as condições ("status") do ARNm da Pax2 ou da proteína Pax2 ou do ARNm da Pax2 e da proteína Pax2 com a concentração correspondente em células renais normais; em que o termo "concentração" significa a quantidade de ARNm ou de proteína produzido(a); e, o termo condições ("status") implica que o gene Pax2, o ARNm, a proteína ou um elemento de controlo da transcrição, incluindo uma sequencia promotora/amplificadora ("enhancer") pode exibir uma mutação, deleção ou quaisquer outras modificações que afectem a 39 actividade total do gene em relação ao produto génico normal do tipo selvagem, incluindo modificações pós-traducional da proteína; e, a comparação indica se a proteína Pax2 ou o ARNm da proteína Pax2 ou a proteína Pax2 e o ARNm da Pax2 estão presentes ou activos acima ou abaixo da proteína Pax2 ou do ARNm da proteína Pax2 ou a proteína Pax2 e o ARNm da Pax2 em células normais a fim de prover as condições ("status") em células renais.

Mais preferivelmente a mencionada disfunção/insuficiência renal e/ou função renal e/ou disfunção e/ou insuficiência ou susceptibilidade também compreende necrose tubular aguda ou também susceptibilidade.

Em um aspecto, o referido processo executa-se antes e/ou durante e/ou após cirurgia e/ou diálise renal.

De preferência, o referido processo executa-se no decurso de uma hora e/ou 1 a 24 horas e/ou um dia e/ou 1 a 7 dias, semanalmente e/ou 1 a 4 semanas e/ou mensalmente e/ou bimensalmente e/ou trimestralmente e/ou três vezes por ano e/ou semestralmente e/ou anualmente antes e/ou após cirurgia e/ou diálise renal. 0 mencionado processo está indicado de preferência antes e/ou durante e/ou após o tratamento da insuficiência da função renal.

Em uma forma de realização mais preferida entre os processos descritos na presente memória descritiva o mamífero é um ser humano.

Além disso, a presente invenção refere-se à utilização de uma dose eficaz de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da Pax2 em um mamífero para a preparação 40 de uma composição farmacêutica para tratamento, prevenção, ou retardamento de uma disfunção/insuficiência renal em um mamífero. O referido mamífero é de preferência um ser humano.

Além disso, a presente invenção fornece um processo in vitro para a conversão de tecido mesenquimal em um tecido epitelial que consiste na administração de uma quantidade eficaz de uma substância capaz de induzir e/ou melhorar a expressão da Pax2 no mesênquima e um processo in vitro para a regeneração de células estaminais renais que compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da Pax2. A presente invenção refere-se também a um processo para a regeneração de células estaminais renais que consiste na administração de uma quantidade eficaz de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão da Pax2. De preferência, o tecido e as células estaminais mencionado(as), respectivamente, são de mamífero, de preferência tecidos e células estaminais humano (as) ou seus derivados, em que as mencionadas células estaminais renais não são células estaminais embrionárias humanas.

As figuras mostram:

Figura 1: Sequência temporal de valores de creatinina na fase inicial de necrose tubular aguda. Colheram-se amostras de sangue em murganhos até 72 horas após injecção de ácido fólico (250 mg/Kg de peso corporal) versus solução de controlo (300 mM de bicarbonato). As barras representam valores séricos médios (n = 2 para cada período de tempo) ± SEM (Erro padrão da média). No grupo de controlo () não houve alteração dos níveis 41 séricos de creatinina após injecção, enquanto no grupo experimental (0) houve um aumento de 4 a 5 vezes nas concentrações de creatinina após injecção de ácido fólico até 72 horas.

Figura 2: Coloração pelo PAS [Periodic acid-Schiff (Ácido periódico de Schiff)] e hibridização in sítu do ARNm da Pax2 em cortes de rim murino. (a,b) lesões histológicas documentadas por coloração pelo PAS de cortes de rim 24 horas após ácido fólico versus injecção de controlo (barras, 16 ym). (a) Cortes de rim 24 horas após a administração de carbonato de hidrogénio e sódio nos glomérulos normais e túbulos proximais. (b) Segmentos rectilineos de túbulos proximais mostram um contorno em escova destruído e um alisamento dos epitélios 24 horas após a administração de ácido fólico o que indica lesão tubular. (c,d) Hibridização in sítu do ARNm das Pax2 em rins que sofrem de ATN [Acute tubular necrosis (Necrose Tubular Aguda)] versus rins controlo (barras, 25 ym) . (c) Um corte renal 24 horas após a administração de carbonato de hidrogénio e sódio com um sinal nuclear positivo apenas nos duetos colectores (seta) . (d) Um corte de rim 24 horas após a administração de ácido fólico com sinais positivos nos núcleos de túbulos lesados (ponta da seta) além dos duetos colectores (seta).

Figura 3: Imunofluorescência das Pax2 em criocortes de rins murinos que sofrem de ATN [Acute tubular necrosis (Necrose Tubular Aguda)]. Um rim murino neonatal (El9) marcado com anticorpos anti-Pax2 úteis como um controlo positivo para a expressão das Pax2. (a) No rim neonatal (E19) existem limites definidos entre estruturas coradas 42 positivamente e negativamente. A localização nuclear de proteínas Pax2 pode observar-se em células do uréter (u), corpos em forma de s (s) e corpos em forma de vírgula (c), enquanto o tecido circundante, o mesênquima não induzido, está desprovido da proteína Pax2 (barra, 16 ym) . (b,c) Criocortes de rim murino adulto saudável marcado com anticorpos anti-Pax2. (b) Na região papilar pode-se detectar Pax2 apenas no núcleo das células dos duetos colectores (setas; barra, 50 ym) . (c) Nas células tubulares do córtex de um rim murino saudável (barra, 50 ym) não se pode detectar nenhum sinal, (d) Nas três horas após a injecção de ácido fólico não há alterações quanto à marcação da Pax2 comparativamente com o período de tempo zero (barra, 50 ym) . Decorridas 6 horas não há ainda alteração do padrão de imunofluorescência do ácido fólico ou do grupo de controlo (dados não apresentados). (e) Uma re-expressão acentuada da Pax2 por imunofluorescência pode observar-se 24 horas após injecção de ácido fólico nos núcleos das células tubulares proximais (setas), ao mesmo tempo que não se observa qualquer alteração em outras partes do nefrónio (barra, 50 ym). (f) Nos controlos, não se pode observar re-expressão de Pax2 decorridas 24 horas (barra, 50 ym). (g) Setenta e duas horas após a administração do ácido fólico a imunofluorescência das Pax2 diminuiu acentuadamente nos núcleos das células tubulares proximais (barra, 25 ym). O padrão da expressão lembra o observado no grupo controlo (h, seta indicando um túbulo colector positivo para Pax2; barra 50 ym).

Figura 4: Vinte e quatro horas após a injecção de ácido fólico obtiveram-se criocortes de rim murino de dois animais diferentes (a,b). Incubaram-se ambos os 43 criocortes com um anticorpo Pax-2. Nas células tubulares proximais identifica-se um padrão da expressão nuclear da proteína Pax2. Barras, 10 ym.

Figura 5: Vimentina e co-expressão das Pax2 nos tubos proximais.

Figura 6: Um exame Western blot para Pax2 em extractos de proteínas provenientes de cortes de rins corticais obtidos em diferentes períodos de tempo após injecção de ácido fólico versus solução de controlo (bicarbonato) . No controlo positivo (co, rim murino embrionário com 15 dias de desenvolvimento) detectaram-se duas bandas com um peso molecular de 46 e 48 kD, respectivamente. No controlo negativo (li, fígado murino adulto) não se observaram bandas específicas após incubação com anticorpos anti-Pax2. As colunas designadas "folato" carregaram-se com homogeneizados de rins provenientes de murganhos sacrificados no período de tempo indicado após injecção de ácido fólico. Ao grupo de controlo ("bicarbonato") administraram-se injecções de bicarbonato como controlo. No homogeneizado renal murino no período 0 horas observou-se uma banda com o peso de 46 kD. Vinte e quatro horas após a injecção de ácido fólico a intensidade dessa banda apresenta um aumento, indicador de concentração crescente da proteína Pax2. A banda de Pax2 baixou em homogeneizados renais obtidos 72 horas após injecção de ácido fólico. A intensidade das bandas de Pax2 no grupo de controlo injectado (24 e 72 horas após injecção de bicarbonato) é muito menor do que a intensidade da banda 24 horas após injecção de ácido fólico. Por coluna carregaram-se 60 yg de proteína, 44 excepto a do controlo positivo, onde se carregaram 10 yg ·

Figura 7: RT-PCR [(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) Reacção da transcriptase reversa, seguida de reacção em cadeia da polimerase] para Pax2 proveniente de cortes corticais de rins após ATN (Necrose Tubular Aguda) induzida por ácido fólico. Como um controlo analisaram-se os níveis de ARNm para veículo do Nucleótido Adenina [ANC (adenine nuclear carrier)], que não é expresso de um modo diferencial após lesão tubular proximal. O ARNm das Pax2 apresenta um aumento após injecção de ácido fólico com um máximo às 24 horas após indução de ATN.

Exemplo 1: Pesquisa de lesão funcional e histológica A indução de lesão renal por injecção i.p. de ácido fólico foi confirmada pelo aumento observado da creatinina sérica e dos níveis de azoto úrico no sangue [(BUN) Blood urea nitrogen] como indicadores grosseiros da função renal (a duração da acção dos valores de creatinina apresenta-se na fig. 1) . A fim de causar ATN (Necrose Tubular Aguda), administraram-se a 12 murganhos CD-I machos (Charles River Breeding Laboratories, Willmington, MA) pesando 30 + 5 g, 250 mg de ácido fólico/kg de peso corporal dissolvidos em 0,5 ml de uma solução de carbonato de hidrogénio e sódio a 300 mM por injecção i.p.. Utilizaram-se 14 murganhos como controlos negativos aos quais se administraram apenas 0,5 ml de solução de carbonato de hidrogénio e sódio a 300 mM. Sacrificaram-se três murganhos por deslocamento cervical imediatamente após a 45 administração da solução de bicarbonato no período zero. em cada período temporal (após 3, 6, 24 e 72 h) e para cada grupo (injecção de ácido fólico ou de bicarbonato) sacrificaram-se 3 murganhos, excepto às 72 horas após a injecção de bicarbonato, quando apenas se sacrificaram dois animais. Extraíram-se os rins rapidamente e um sofreu congelamento de choque ("shockfrozen") em azoto líquido enquanto o outro foi preparado para avaliação histológica. 0 sangue foi colhido por aspiração do ventrículo esquerdo para avaliar os níveis séricos de creatinina e de azoto úrico no sangue [ (BUN) Blood urea nitrogen] utilizando um Kodak Ektachem 500 Analyzer (Kodak, Rochester, NY) . A creatinina e o BUN aumentaram cerca de 4 a 5 vezes durante a fase inicial da ATN (24 a 72 h após a injecção de ácido fólico) . Não se observou nenhuma alteração nos níveis de creatinina e do BUN até às 72 h após as injecções de controlo com solução de bicarbonato. Os animais do grupo do ácido fólico começaram a mostrar sinais de doença nas 12 a 24 horas após a injecção de ácido fólico, como fadiga, vigilância reduzida e pelagem eriçada. Esses sinais estiveram ausentes no grupo de controlo injectado. Todos os animais sobreviveram até ao momento previsto para o sacrifício. A coloração com PAS [(Periodic Acid-Schiff) Ácido periódico de Schiff] de cortes renais após lesão quimicamente induzida mostrou alterações na morfologia do rim coerentes com ATN como borda em escova destruída e alisamento dos epitélios (fig. 2a, b). Em resumo, a injecção de ácido fólico originou as alterações funcionais e morfológicas esperadas da ATN com perturbação transitória da função renal. Nos 46 murganhos de controlo injectados com o veículo não se observaram alterações.

Exemplo 2: Estudos que provam a expressão de Pax2 após ATN provocada 2.1. Estudos indirectos de imunofluorescência

Para avaliação por microscopia óptica fixaram-se rins com p-formalina a 4% em diferentes momentos após a injecção quer de ácido fólico quer da solução de controlo. Com um micrótomo (Rotationsmikrotom 3455 Leitz, Leica, Bensheim, Alemanha) realizaram-se cortes de 7 ym de espessura e procedeu-se à coloração com PAS para provar a lesão histológica.

Para estudos de imunofluorescência indirecta cobriram-se cortes de rins murinos congelados de 3 a 4 mm de espessura com meio de congelamento de tecidos (Leica, Bensheim, Alemanha) e congelaram-se sobre neve carbónica. Utilizando um criostato (Kryotom Jung CM 3000, Leica, Bensheim, Alemanha) realizaram-se cortes com a espessura de 7ym, reunidos sobre lâminas gelatinizadas e secos ao ar durante 60 minutos. A produção e a especificidade do anticorpo policlonal Pax-2 foram descritas por (Dressler, 1992, Proc Natl Acad Sei 89:1179-1183; Pueschel, 1992, Mech Dev 38:197-208). Com paraformaldeido a 3% fixaram-se criocortes em tampão A (1 X PBS/0,05 % Tween 20) à temperatura ambiente durante 10 minutos. Após lavagem com tampão B (1 X PBS/0,1% Triton-X--100) durante 10 minutos e tampão A durante 5 minutos realizou-se uma pré-incubação dos cortes com soro de cabra a 15% (Gibco, Pairley, UK) em uma câmara húmida durante 10 minutos à temperatura ambiente para reduzir a coloração de 47 fundo ("background") não específica. Posteriormente incubaram-se os cortes com 80 ml de uma diluição a 1:100 do anticorpo policlonal anti-PAX-2 (0,8 ym/pl) em tampão C (Tampão A/soro de cabra a 2%) durante 15h à temperatura de 4 °C. Depois de duas fases de lavagem em tampão A durante 5 minutos pré-incubaram-se os cortes novamente com soro de cabra a 15% em tampão A. Centrifugou-se o anticorpo secundário (goat-anti-rabbit, TRITC conjugated, Sigma, Deisenhofen, Alemanha) a 15000g durante 2 minutos e diluiu-se seguidamente a 1:50 em tampão C, colocou-se sobre cada um dos cortes e realizou-se a incubação durante 5 h a 4 °C. Após três fases de lavagem durante 5 minutos em tampão A montaram--se os cortes em gelvatol (Airvol, Air products and Chemicals, Inc.; Utrecht, Países Baixos), com DABCO a 2,5% (Sigma, Deisenhofen, Alemanha), que retarda a extinção ("quenching") da fluorescência. Utilizando um microscópio de fluorescência (Leitz DMRD, Leica, Bensheim, Alemanha) analisaram-se os cortes e fotografaram-se utilizando uma película Kodak Ektachrome (Rochester, NY).

Os cortes de tecidos incubaram-se também com um anticorpo monoclonal anti-vimentina (Dianova, Heidelberg, Alemanha); para a detecção de fluorescência utilizou-se um anticorpo secundário conjugado com Cy2 (Dianova). A partir de criocortes de rins murinos obtidos em diferentes momentos após injecção de ácido fólico realizaram--se estudos indirectos de imunofluorescência. O padrão da expressão do gene Pax-2 expresso progressivamente observou-se utilizando um anticorpo policlonal. Pax-2 é expresso em células dos corpos em forma de vírgula e de S, que são precursores epiteliais dos túbulos proximais em desenvolvimento, sendo essa expressão "downregulated" 48 (regulada de forma negativa) à medida que o rim amadurece. No nosso estudo utilizámos como um controlo positivo um criocorte de um rim embrionário de murganho depois da gestação em E 19 (fig. 3a), onde a diferenciação e a epiteliogénese ainda estão presentes. Aqui em algumas subestruturas do rim em desenvolvimento observa-se um sinal positivo forte após incubação com o anticorpo anti-PAX-2. A proteína Pax-2 foi detectada em células do epitélio do uréter e em células dos corpos em forma de s e de vírgula. 0 padrão de coloração é exclusivamente nuclear mostrando limites precisos entre áreas positivas e negativas. A ATN produzida pela injecção i.p. de ácido fólico em murganhos leva no rim a um padrão alterado da expressão de Pax-2. No rim adulto saudável (período 0 horas), pôde detectar-se proteína Pax-2 apenas no núcleo dos duetos colectores, com a mais alta expressão na papila (fig. 3b). As células dos túbulos proximais ou glomérulos estavam desprovidas de expressão da proteína Pax-2. Portanto, houve apenas uma escassa coloração no córtex (fig. 3c). Não se observou alteração na expressão de Pax-2 às 3 horas após a administração de ácido fólico (fig. 3d) . Em contraste, às 24 horas após a injecção de ácido fólico observou-se uma acentuada re-expressão de proteínas Pax-2 nos núcleos das células tubulares proximais (Fig. 3e e 4). Esse resultado foi obtido para todos os animais do grupo (n = 3). As células positivas puderam identificar-se como pertencentes a túbulos proximais em regeneração devido ao extenso epitélio prismático e devido aos vestígios da borda em escova danificada, o que pôde detectar-se no lúmen dos túbulos. Posteriormente a concentração de Pax-2 nos núcleos das células proximais diminuiu e às 72 horas após a injecção de 49 ácido fólico a proteína Pax-2 foi praticamente indetectável nos túbulos proximais já que a expressão voltou a estar limitada às células dos duetos colectores (fig. 3g) . Nos animais injectados com bicarbonato como controlo, não se observou nenhum aumento da expressão da proteína Pax2 em células tubulares proximais em qualquer momento examinado (fig. 3f: 24 horas após a injecção de controlo, 3horas: 72 horas após a injecção de controlo). A Pax-2 manteve-se detectável exclusivamente nas células dos duetos colectores.

No animal de controlo a Pax2 continuou detectável exclusivamente nas células dos duetos colectores. Detectou-se vimentina e coexpressou-se com Pax2 em animais injectados com ácido fólico 24 horas após a injecção (Fig. 5) . Nos animais de controlo injectados não se observou qualquer expressão. 2.2. Western blot

Para complementar o aumento da imunofluorescência de Pax-2 em células tubulares proximais após ATN induzida por ácido fólico, analisou-se a concentração da proteína Pax-2 em homogeneizados de rim pelo processo semi-quantitativo de "western blotting" (fig. 6). Em homogeneizados de rim murino embrionário E15, que serviram como controlos positivos, puderam detectar-se três bandas com pesos moleculares de 42, 46 e 48 kD, respectivamente. A intensidade era mais forte na banda de 4 6 kD, o que corresponde à isoforma Pax-2b, que é mais abundante in vivo (Dressler, 1992 loc. cit.). No controlo negativo, que consistia em um homogeneizado de fígado murino, não se puderam observar bandas específicas. Para analisar o efeito da ATN induzida pelo ácido fólico, extraíram-se cortes corticais renais directamente após o sacrifício dos animais e transferiram-se ("blotted") com 50 anticorpos anti-PAX-2. Para minimizar o possível efeito contaminante da expressão basal da proteína Pax-2 na região papilar normal (ver fig. 3b), que tinha de ser distinguida da proteína Pax-2 recém-sintetizada no córtex, analisaram-se os extractos de células na totalidade incluindo as proteínas nucleares dos finos cortes corticais dos rins murinos. No homogeneizado de controlo do córtex renal (período 0 horas) observa-se uma muito fraca banda positiva perto do peso molecular de 46 kD. Isto provavelmente representa a proteína Pax-2 presente em cortes corticais provenientes de duetos colectores conforme averiguado por imunofluorescência indirecta. Comparável ao aumento da proteína Pax-2 nos túbulos proximais observado por estudos de imunofluorescência indirecta 24 horas após ATN, detectou-se um aumento dos níveis de proteína Pax-2 por "western blotting" de homogeneizados corticais. A regulação de forma positiva ("upregulation") da expressão da proteína Pax-2 foi temporária. Setenta e duas horas após a indução da ATN a intensidade da banda da Pax-2 perto de 46 kD diminuiu. Em comparação com a banda da Pax-2 24 horas após a lesão renal, as bandas do grupo de controlo (24 horas e 72 horas após a injecção de bicarbonato) mostraram uma intensidade muito mais fraca. 2.3. Hibridização in situ

No rim saudável de murinos adultos detecta-se o ARNm da Pax-2 exclusivamente nos núcleos das células dos duetos colectores e em menor grau nas células dos túbulos distais. Nas células Pax-2-positivas foi possível detectá-lo nos túbulos proximais de controlo 24 horas após a injecção de bicarbonato (fig. 2c) . Pelo contrário, 6 horas e 24 horas após a injecção do ácido fólico os epitélios tubulares 51 proximais da medula externa e do córtex interno mostraram um sinal nuclear manchado ("spotty") para Pax-2, que se mostrou mais pronunciado nos epitélios danificados (fig. 2d). Setenta e duas horas após a injecção de ácido fólico isso pôde observar-se apenas raramente. 0 facto, do ARNm da Pax-2 se ter detectado somente nos núcleos, mas não no citoplasma das células danificadas poderia ser devido a uma semivida curta do ARNm da Pax2. Para uma quantidade suficiente de ARNm da Pax2 ser detectável por hibridização in situ seria então expectável estar presente somente no local da sua origem, no núcleo.

2.4. Estudos de RT-PCR

Uma banda especifica com o tamanho esperado para Pax-2 pôde detectar-se em experiências quantitativas de RT-PCR do ARN proveniente de rins corticais murinos de controlo bem como em animais experimentais. No grupo injectado com ácido fólico, houve um aumento de 2 a 3 vezes na intensidade do sinal 24 horas após a injecção em comparação com o valor das 0 horas (fig. 7) ou os animais injectados com o controlo (dados não apresentados). Não se observou qualquer alteração no ARNm para ANC [(adenine nuclear carrier) veiculo do Nucleótido Adenina] como um gene housekeeping controlo não afectado pela ATN (23) . Assim, o aumento da proteína Pax-2 é também acompanhado por um aumento do ARNm da Pax-2. 2.5. Conclusão

Em conclusão, a proteína Pax2 é conhecida por desempenhar um papel crucial durante o desenvolvimento inicial do rim metanéfrico. Observou-se no devido tempo uma estreita correlação entre a deterioração da função renal e a 52 re-expressão da Pax-2 no epitélio tubular em regeneração. Após lesão renal a Pax-2 reexpressa ficou localmente restringida aos túbulos proximais em regeneração. Essa re-expressão atingiu o máximo 24 horas após a injecção de ácido fólico. Similar ao seu padrão de expressão transitório durante o desenvolvimento (Dressler, 1992 loc cit.; Eccles, 1992, Cell Growth Differ 3:279-289) a expressão em células tubulares proximais baixou após a reconstituição dos túbulos, começando 72 horas após a indução da ATN. Essa re-expressão transitória da Pax2 nos epitélios tubulares proximais após ATN tem paralelo com os achados de Winyard et al. (Winyard, 1996, J Clin Invest 98:451-459), que exibiram superexpressão da Pax2 em epitélios displásicos císticos e hiperproliferativos em malformações renais no homem. É sugestivo que a expressão transitória da Pax2 após ATN é um processo fisiológico para suprir a necessidade de um estado hiperproliferativo restringido em devido tempo ao túbulo proximal. Pelo contrário, a expressão não regulada da Pax2 pode levar a malformações tubulares devido à hiperproliferação descontrolada, quer em doenças no homem (Winyard, 1996 loc. cit.) quer durante o desenvolvimento embrionário murino (Dressler, 1993, Nature 362:65-67). Demonstrou-se igualmente que altos níveis de expressão da Pax2 estão presentes em tumores malignos como o tumor de Wilms (Dressler, 1992 loc. cit.) e carcinoma de células renais (Gnarra 1995, Câncer Res 55,4092-4098). Além disso, alguns membros da família das proteínas Pax incluindo a proteína Pax-2 apresentam potencial oncogénico (Maulbecker, 1993, Embo J 12:2361-2367).

Realizando estudos de imunofluorescência, observaram-se também possíveis alterações nos padrões de expressão de outros genes expressos progressivamente, incluindo WTl, GDNF, 53 c-ret e N-myc. Contrariamente à observação com Pax2 não se observou qualquer alteração na localização ou na intensidade da expressão desses genes até às 72 horas após a injecção do ácido fólico.

Exemplo 3: Indução da ATN e Inibição da expressão da Pax2 A indução da ATN realizou-se mediante injecção de ácido fólico e inibiu-se a expressão das Pax2 através de uma abordagem anti-senso. 3.1. Determinação do comportamento físico dos murganhos tratados A dez murganhos FVBN (Charles River Breeding

Laboratories) pesando 20 í 5 g administraram-se 250 mg/kg de peso corporal de ácido fólico dissolvidos em 0,3 ml de uma solução de bicarbonato de sódio a 300 mM por injecção i.p.. Cinco daqueles murganhos injectaram-se simultaneamente por via i.p. contralateralmente com 1,25 mg/kg de peso corporal de ADN anti-senso da proteína Pax2 comportando como substituinte um fosforotioato (sequência: ASl7:5'-ggg Agg CCg TgC Tgg gAAC-3'; como descrito por Rothenpieler e Dressler, 1993) enquanto aos outros 5 murganhos se injectaram também simultaneamente 2,50 mg/kg de peso corporal de ADN anti-senso da proteína Pax2 fosforotioato. Dissolveu-se o ADN antes da injecção por via i.p. em um total de cerca de 350 μΐ de OPTI--MEM (Gibco-BRL). Para aumentar a captação ("uptake") dos oligos utilizámos Lipofectamina (Gibco-BRL) em associação com os oligos em uma concentração de 0,8 mg/mg de ADN. Como controlos utilizaram-se mais 10 murganhos (5 cada um) aos quais se administraram 0,3 ml de solução de bicarbonato a 300 mM (negativo) ou 250 mg/kg de peso corporal de ácido fólico 54 (positivo). Sacrificaram-se mais dois murganhos por deslocamento da cervical imediatamente após a administração de solução de bicarbonato ao momento zero. Sacrificaram-se todos os outros murganhos após 24 horas ou 48 horas e verificaram-se relativamente à expressão da proteína Pax2. Removeram-se os rins rapidamente e submeteram-se a congelamento de choque em azoto líquido ou armazenaram-se à temperatura de -80 °C para avaliação posterior.

Além dos murganhos destinados para o método "western blotting" injectaram-se concomitantemente mais dois murganhos com Pax2-AS-ODN (2,5 mg/kg de peso corporal) e ácido fólico (250 mg/kg de peso corporal) para determinar a influência dos Pax2-ODNs anti-senso no que se refere à sobrevivência a longo prazo (período de observação proposto 14 dias).

Os animais injectados com ácido fólico (sem Pax2-ODNs anti-senso) começaram a mostrar sinais de doença nas 12 a 24 h após a injecção, como fadiga, pelagem eriçada e redução de alerta. O mesmo comportamento observou-se em animais que foram injectados simultaneamente com Pax2-ODNs anti-senso. Esses sinais estavam ausentes no grupo de controlo injectado (bicarbonato).

Além dos 10 animais que foram injectados simultaneamente com Pax2-ODNs anti-senso e ácido fólico e dos 24 sacrificados resp. 48 horas após a injecção, acompanhámos o comportamento e o estado físico de 2 murganhos que foram tratados com o mesmo modo de tratamento mas não sacrificados. Ambos os animais morreram próximo do 10° dia. 55 3.2. Análise por Western

Para realizar a análise por Western blotting homogeneizaram-se finos cortes corticais (cerca de 1 mm de espessura) em um homogeneizador de vidro com tampão de extracção em ebulição (TRIS 62,5 mM, pH 6,8; dodecil sulfato de sódio (SDS) a 1%, 10% de glicerol; 5% de β-mercaptoeta-nol) . Incubaram-se os homogenatos à temperatura de 95 °C durante 15 minutos e centrifugaram-se (15000g) durante 10 minutos em uma microcentrifuga Eppendorf à temperatura de 4 °C. Posteriormente analisaram-se os sobrenadantes. Após a determinação das concentrações de proteínas com o DC (Detergent Compatible) Protein Assay da BioRad (BioRad, Hercules, CA) , padronizaram-se as concentrações e armazenaram-se as alíquotas à temperatura de -80 °C.

Realizou-se o método de Western blotting conforme descrito por Harlow e Lane (1988) . Por coluna carregou-se entre 60 e 100 yg de proteína. Após electroforese e electro-blotting incubou-se a membrana de PVDF (DuPont) em metanol e TBST (tampão TBS com Tween a 0,1%). O bloqueio realizou-se com leite em pó magro a 5% em TBS. O anticorpo policlonal Pax-2 (5,0 yg/μΐ) foi utilizado em uma diluição 1:5000 em TBT + leite a 1% em TBS + 0,5% de Tween e incubou-se à temperatura ambiente durante 2 horas. Após três fases de lavagem de 10 minutos cada em 1 x TBS/0,5% Tween 20/1% de leite adicionou--se o anticorpo secundário [conjugado cabra anti-coelho/pero-xidase de rábano (horseradish peroxidase ou HRP)] em uma diluição de 1:5000 em 1 x TBS/0,5% Tween 20/1% de leite durante 1 hora. Depois de três fases de lavagem de 10 minutos cada em TBSTM (TBST + leite) e duas fases de lavagem em TBS 1M realizou-se a detecção de colunas específicas utilizando o kit de detecção de quimioluminescência melhorada (ECL) (NEN Life Science, Boston, MA) e película de detecção Kodak. 56 A concentração das proteínas Pax2 determinou-se pelo processo semi-quantitativo de "western blotting". Em homogeneizados de rins murinos, que serviram como controlos positivos (injectados com ácido fólico), detectou-se uma coluna nítida de Pax2 com o peso molecular de aproximadamente 46 kD. Murganhos servindo de controlos negativos (injecção de bicarbonato) não apresentaram qualquer coluna de Pax2. Murganhos aos quais se injectaram simultaneamente Pax2-0DNs anti-senso exibiram uma significativa redução do sinal ao nível 46kD em ambos os grupos anti-senso injectados (1,25 e 2,5 mg/kg de peso corporal como Pax2).

Exemplo 4: Conversão Fenotípica de Células Mesenquimais em Epltéllo utilizando Pax2 A fim de analisar melhor o papel da Pax2 na ATN e/ou em outras disfunções/insuficiências renais e tendo em vista estabelecer uma abordagem de transferência génica bem-sucedida, analisou-se a expressão da Pax2 e a sua consequência fisiológica através de estudos de transferência génica em mesênquima metanéfrico não induzido.

Para conferir se a Pax2 é suficiente para induzir a diferenciação de células epiteliais a partir de células mesenquimais metanéfricas da mesoderme intermédia na ausência de indução, utilizámos processos de transferência génica para introduzir vectores de expressão da Pax2 no seio de culturas primárias de mesênquima metanéfrico. Para expressar cada uma das formas Pax-2a ou Pax-2b que alternativamente sofreram "splicing" desenhou-se uma série de vectores retrovirais. Em especial, construíram-se retrovírus transdutores mediante a inserção de cada uma das regiões codificadoras (Notl-HindlII) completas da Pax-2a ou da Pax2b (Dressler (1990) loc. cit.) 57 no único sítio Sall do vector virai pMMuLV-SVTK-NEQ (Rubenstein (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 7137-7140). Transfectaram-se vectores virais recombinantes para células PA317 utilizando processos de fosfato de cálcio. E submeteram-se a selecção em G418 (geneticina) utilizando 400 yg/ml. Os meios de colónias resistentes ensaiaram-se tendo em vista a produção de vírus mediante a infecção de fibroblastos NIH 3T3 e selecção com 400 yg/ml de G418. Utilizando uma técnica de clonagem, isolaram-se e analisaram-se células 3T3 resistentes quanto à expressão da proteína Pax-2 por análise de "western blot". Os rins foram submetidos a microdissecção a partir de embriões em meio F10 de Hams à temperatura ambiente. Isolou-se mesênquima metanéfrico a partir de rins Eli por incubação em PBS contendo EDTA 0,1 M durante 4 minutos e submeteu-se a microdissecção com agulhas de seringa 30 G. Lavaram-se os mesênquimas em DMEM suplementado com soro de vitela fetal a 10% e colocaram-se em meios condicionados de células PA317 produtoras quer do vector retroviral (vector RV) quer de vírus transdutores da Pax2 (RV-Pax2). Adicionou--se polibreno a 16 yg/ml para auxiliar na absorção dos vírus. Após 2 horas, lavaram-se os mesênquimas em meios de preparação recente (DMEM + FCS 10%) e cultivaram-se durante mais 24 horas sobre um filtro Nuclepore de porosidade 1,0 ym suspenso por meio de uma grade em fio de aço inoxidável sobre uma monocamada de células PA317 produtoras de vírus. Reuniram-se 4 a 6 mesênquimas em um único agregado. Congelaram-se as culturas decorridos dias enquanto ainda estavam ligadas ao filtro e procedeu-se a preparação de cortes utilizando um criostato.

As formas alternativas que sofreram "splice" diferem pela adição de um exão codificador de 23 aminoácidos (Pax-2a) que não altera a cadeia de leitura aberta ("reading frame") a 58 jusante. Até à data não se detectaram diferenças funcionais entre Pax-a e Pax-2b (Lechner (1996), J. Biol. Chem. 271, 21088-21093). Transfectaram-se os vectores virais em direcção à linha produtora anfotrópica PA317 e os meios condicionados utilizados para infectar NIH 3T3 para titulação. A expressão correcta das proteínas pôde analisar-se em células NIH 3T3 infectadas utilizando anticorpos Pax-2 específicos. As experiências iniciais utilizaram mesênquima metanéfrico de rins murinos Eli de tipo selvagem ("wild type") que tinham sido submetidos a microdissecção provenientes do botão uretérico após tratamento com EDTA. Agruparam-se mesênquimas isolados em agregados de 4 a 6 e cultivaram-se sobre filtros Nuclepore suspensos em grades de aço inoxidável eventualmente na presença de linhas de células produtoras de retrovirus que transportam Pax-2 plaqueadas no fundo da placa. Agregados cultivados simultaneamente com células Pax-2/PA317 geraram de um modo consistente pequenos quistos epiteliais, geralmente não mais do que um por agregado. Mesênquima cultivado simultaneamente com células controlo PA317 geralmente horizontalizou ("flattened out") e não apresentou provas de formação de células epiteliais. Realizaram-se cortes dos agregados mesenquimais e coraram-se tendo em vista a Pax-2 e os marcadores epiteliais renais iniciais. A expressão da molécula de adesão caderina-E e da laminina foi indicador da polarização celular e da formação da membrana basal. Ocasionalmente, a membrana basal localizou-se no interior dos quistos epiteliais indicando uma inversão da polaridade da célula. Embora a maioria dos mesênquimas cultivados anteriormente às células de controlo PA317 não mostre qualquer sinal de deformação epitelial, uma cultura expressou Pax-2 e caderina-E. Isso foi provavelmente devido à separação do mesênquima em um estádio ligeiramente mais tardio de modo que células induzidas que expressam Pax-2 foram expostas ao 59 sinal derivado do botão uretérico durante um periodo de tempo mais longo.

Para eliminar a possibilidade de contaminação por mesênquima induzido que expresse o gene endógeno Pax-2, utilizaram-se em experiências posteriores mesênquimas metanéfricos de murganhos mutantes Pax-2-/-. Após 11 dias de gestação sacrificaram-se fêmeas provenientes de pares de acasalamento mutantes heterozigóticos Pax-2 e seleccionaram--se os embriões por inspecção visual. Embriões exibindo exencefalia da região mesencéfalo-rombencéfalo foram ainda dissecados e isolou-se o mesênquima metanéfrico. Observou-se a ausência do botão uretérico e utilizou-se o corpo do embrião para extracção de ADN para verificar o genótipo homozigótico Pax-2-/-. Incubaram-se mesênquimas de mutantes com Pax-2 ou vectores retrovirais de controlo como descrito anteriormente.

Isolaram-se mesênquimas metanéfricos de embriões Eli.5 que apresentavam graves defeitos no rombencéfalo ("hindbrain") e não evidenciavam crescimento do botão uretérico. Extraiu-se 0 ADN da metade anterior de cada embrião e procedeu-se à genotipagem por "Southern blotting" para confirmar o fenótipo homozigótico Pax-2-/-. Cultivaram--se mesênquimas de mutantes homozigóticos Pax-2 como antes sobre filtros suspensos acima dos meios que contêm virus. A transfecção transitória dos mesênquimas mutantes utilizou Lipofectamina da seguinte forma: misturaram-se 4 yg de CMV--Pax-2b ou de ADN do vector CMV com 2 yg de proteína Green Lantern ligada a ADN em 0,3 ml de DMEM isento de soro. Posteriormente, adicionaram-se ao ADN 15 yl de Lipofectamina em 0,3 ml de meio DMEM e diluiu-se a mistura com 2,4 ml de DMEM contendo os mesênquimas. Após 2 h de incubação à 60 temperatura de 37 °C, removeram-se os mesênquimas, lavaram-se com PBS e cultivaram-se sobre filtros em DMEM, FCS 10%, 50 yg/ml de transferrina.

Depois de quatro dias em cultura a maioria dos mesênquimas mutantes (6/9) cultivados com células Pax-2/PA317 mostraram evidências de formação de quistos epiteliais tendo todos os mesênquimas cultivados com células de controlo PA317 apresentado horizontalidade ("flattened out") e morrido. Como com o mesênquima "wild-type" (tipo selvagem) cortes através do mesênquima mutante revelaram a expressão da caderina-E na superfície da célula e da laminina ao longo da membrana basal. A expressão de Pax-2 pôde também detectar-se, embora os níveis fossem inferiores aos do mesênquima "wild-type".

Para além da transferência génica mediada por retrovírus utilizámos ADNs plasmidiais e Lipofectamina para expressar a Pax-2 no mesênquima mutante homozigótico. Misturaram-se o plasmídeo de expressão pCMV-Pax2b (Lechner (1996) loc, cit.) e os vectores de controlo pCMV com o vector de expressão GFP [(Green Fluorescent Protein) Proteína Verde Fluorescente] e introduziram-se em elementos embrionários mesenquimais isolados. Depois de 2 ou 3 dias em cultura, a GFP pôde visualizar-se directamente, indicando transfecção bem sucedida. Fixaram-se as culturas e corou-se todo o aglomerado com anticorpos Pax-2 e de caderina-E. Imagens por microscopia confocal revelam a expressão nuclear das Pax-2 e da caderina--E sobre a superfície celular nas culturas transfectadas com pCMV-Pax2b mas não nos controlos (dados não apresentados) . Como com a transferência génica retroviral a expressão das Pax-2 foi suficiente para converter as células mesenquimais em um fenótipo epitelial como evidenciado pela expressão da caderina-E e da formação da membrana basal.

Lisboa, 12 de Novembro de 2010.

Claims (20)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão de Pax2 escolhida no grupo constituído por uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína Pax2, uma proteína Pax2, um factor de crescimento, uma citocina, lítio, LIF [Leukemia Inhibitory Factor (Factor Inibidor da Leucemia) ], osteopontina, uma proteína apoptótica e STAT-3 [signal transduction and activator of transcription (transdutor do sinal e activador da transcrição)] para utilização no tratamento, no retardamento e/ou na prevenção de uma disfunção/insuficiência renal em um mamífero, em que a referida disfunção/insuficiência renal é uma insuficiência renal crónica e em que a referida citocina é a IL-6 ou uma citocina do tipo da IL-6.

2. Substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão de Pax2 escolhida no grupo constituído por uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína Pax2, uma proteína Pax2, um factor de crescimento, uma citocina, lítio, LIF [Leukemia Inhibitory Factor (Factor Inibidor da Leucemia)], osteopontina, uma proteína apoptótica e STAT-3 [signal transduction and activator of transcription (transdutor do sinal e activador da transcrição)] para utilização no tratamento, no retardamento e/ou na prevenção de uma disfunção/insuficiência renal em um mamífero, em que a referida disfunção/insuficiência renal é uma insuficiência renal aguda e em que se escolhe o mencionado factor de crescimento no grupo constituído por FGF2, bFGF, TGF-β, FGF9, PDGF-α, oncostatina M, GDNF, Wnt-1, e Wnt-4. 2

3. Substância para utilização de acordo com a reivindicação 2., em que a mencionada insuficiência renal aguda é uma necrose tubular aguda.

4. Substância para utilização de acordo com a reivindicação 1., em que se escolhe o mencionado factor de crescimento no grupo constituído por FGF2, bFGF, TGF-a, TGF-β, FGF9, EGF, PDGF-a, oncostatina M, IGF-I [insulin like growth factor (factor de crescimento análogo à insulina I)], HGF/SF [hepatocyte growth factor/scatter factor (factor de crescimento de hepatócitos também conhecido por factor de dispersão)], GDNF, Wnt-1, Wnt-4 e BMP7.

5. Substância para utilização de acordo com a reivindicação 2. ou 3., em que se escolhe a mencionada citocina no grupo constituído por IL-6, citocinas do tipo da IL-6 e TNF-a.

6. Substância para utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 3., em que a mencionada proteína apoptótica é CHOP, bax ou bcl-2.

7. Substância para utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 3., em que a mencionada molécula de ácido nucleico que codifica Pax2 está inserida em um vector.

8. Substância para utilização de acordo com a reivindicação 7., em que o mencionado vector é um vector de expressão e/ou um vector de alvejamento genético ("gene targeting vector") ou um vector de transferência genética ("gene transfer vector").

9. Substância para utilização de acordo com a reivindicação 8., em que o mencionado vector de expressão e/ou vector de 3 alvejamento genético ("gene targeting vector") ou o vector de transferência genética ("gene transfer vector") inclui ainda uma sequência de controlo da expressão.

10. Substância para utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 9., em que a quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de uma substância se situa entre 1 pg e 5 g.

11. Substância para utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 10., em que a mencionada indução e/ou intensificação da expressão de Pax2 ocorre nas células dos túbulos proximais do rim.

12. Processo para a produção de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento, à prevenção e/ou ao retardamento de uma disfunção/insuficiência renal em um mamífero mediante a associação de um vector que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína Pax2 funcional com um veículo aceitável sob o ponto de vista biológico, em que se coloca a mencionada molécula de ácido nucleico no referido vector sob o controlo de uma sequência de controlo da expressão.

13. Processo in vitro para a conversão de tecido mesenquimal em tecido epitelial que compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão de Pax2 no mencionado mesênquima, em que se escolhe a referida substância no grupo constituído por uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína Pax2, uma proteína Pax2, um factor de crescimento, uma citocina, osteopontina, uma proteína apoptótica e STAT-3 [signal 4 transduction and activator of transcription (transdutor do sinal e activador da transcrição)]

14. Processo de acordo com a reivindicação 13., em que se escolhe o mencionado factor de crescimento entre o grupo constituído por FGF2, bFGF, TGF-a, TGF-β, FGF9, EGF, PDGF-a, oncostatina M, IGF-I [insulin like growth factor (factor de crescimento análogo à insulina I)], HGF/SF [hepatocyte growth factor/scatter factor (factor de crescimento de hepatócitos também conhecido por factor de dispersão)], GDNF, Wnt-4 e BMP7 .

15. Processo de acordo com a reivindicação 13., em que a mencionada citocina é a IL-6 ou o TNF-a.

16. Processo in vitro para a regeneração de células estaminais renais que compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma substância capaz de induzir e/ou aumentar a expressão de Pax2, em que se escolhe a mencionada substância no grupo constituído por uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína Pax2, uma proteína Pax2, um factor de crescimento, uma citocina, lítio, LIF [Leukemia Inhibitory Factor (Factor Inibidor da Leucemia)], osteopontina, uma proteína apoptótica e STAT-3 [signal transduction and activator of transcription (transdutor do sinal e activador da transcrição)], em que as mencionadas células estaminais renais não são células estaminais embrionárias humanas.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16., em que se escolhe o mencionado factor de crescimento no grupo constituído por FGF2, bFGF, TGF-a, TGF-β, FGF9, EGF, PDGF-a, oncostatina M, IGF-I [insulin like growth factor (factor de 5 crescimento análogo à insulina I) ], HGF/SF [hepatocyte growth factor/scatter factor (factor de crescimento de hepatócitos também conhecido por factor de dispersão)], GDNF, Wnt-1, Wnt--4 e BMP7.

18. Processo de acordo com a reivindicação 16., em que se escolhe a mencionada citocina no grupo constituído por IL-6, citocinas do tipo IL-6 e TNF-a.

19. Substância para utilização ou processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 12., em que o mencionado mamífero é o homem.

20. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 13. a 18., em que o mencionado tecido e as mencionadas células estaminais, respectivamente, são de mamífero, preferivelmente tecido e células estaminais de um humano ou derivado e derivadas desse tecido ou dessas células, em que as mencionadas células estaminais renais não são células estaminais embrionárias humanas. Lisboa, 12 de Novembro de 2010.