ES2347077T3 - Dispositivo de deteccion de fluorescencia multiple que tiene modulos opticos desmontables. - Google Patents

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Abstract

Un dispositivo de detección que comprende: un disco (13) que tiene varias cámaras de procesamiento cada una de ellas para contener una muestra (22) respectiva y uno o más colorantes fluorescentes, teniendo dichos colorantes fluorescentes diferentes longitudes de onda de emisión; un motor para rotar dicho disco; varios módulos ópticos (16); un alojamiento (46) que tiene varias posiciones adaptadas para recibir los módulos ópticos, en el que cada uno de los varios módulos ópticos se puede desmontar de las posiciones en el alojamiento; un detector (18); y un haz de fibras ópticas (14) acoplado con la pluralidad de módulos ópticos para transmitir la luz fluorescente desde los múltiples módulos ópticos al detector; en el que cada uno de los módulos ópticos incluye un canal óptico, teniendo cada módulo óptico una fuente de luz (30) elegida para excitar uno de los colorantes diferentes y una lente (42) para capturar la luz fluorescente emitida por el disco, estando dichos módulos ópticos configurados ópticamente para estudiar los colorantes diferentes a longitudes de onda diferentes.

Description

Dispositivo de detección de fluorescencia múltiple que tiene módulos ópticos desmontables.
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Campo técnico
La invención se refiere a sistemas de análisis y, más concretamente, técnicas para la detección de varias especies diana usando colorantes fluorescentes.
Antecedentes
Los sistemas de disco óptico se usan a menudo para realizar varios análisis biológicos, químicos y bioquímicos. En un sistema típico se usa un disco rotatorio como medio para almacenar y procesar especímenes fluidos, tales como sangre, plasma, suero, orina u otros fluidos.
Un tipo de análisis es la reacción en cadena de la polimerasa (abreviado generalmente como PCR por sus iniciales en inglés: polymerase chain reaction) que a menudo se usa para el análisis de secuencias de ácidos nucleicos. En particular, la PCR se usa a menudo para la secuenciación del ADN, clonación, cartografía genética y otras formas de análisis de secuencia de ácidos nucleicos.
En general, la PCR se basa en la capacidad de enzimas duplicadoras del ADN para permanecer estables a temperaturas elevadas. Las etapas principales de la PCR son tres: desnaturalización, hibridación y extensión. Durante la desnaturalización, se calienta una muestra líquida a aproximadamente 94ºC. Durante este proceso, el ADN de cadena doble se "abre" dando lugar a ADN de cadena sencilla y todas las reacciones enzimáticas se detienen. Durante la hibridación, el ADN de cadena sencilla se enfría a 54ºC. A esta temperatura, los iniciadores se unen o "hibridan" con los extremos de las cadenas de ADN. Durante la extensión, la muestra se calienta a 75ºC. A esta temperatura, los nucleótidos se añaden a los iniciadores y finalmente se forma una copia complementaria del patrón de ADN.
Existen varios instrumentos de PCR diseñados para determinar los niveles de secuencias de ADN y de ARN específicas en la muestra durante la PCR en tiempo real. Muchos de los instrumentos se basan en la utilización de colorantes fluorescentes. En particular, muchos de los instrumentos de PCR en tiempo real detectan una señal fluorescente producida proporcionalmente durante la amplificación del producto de la PCR.
Los instrumentos de PCR en tiempo real convencionales usan diferentes métodos para la detección de diferentes colorantes fluorescentes. Por ejemplo, algunos instrumentos de PCR convencionales incorporan fuentes de luz blanca con ruedas de filtros para resolver espectralmente cada colorante. Las fuentes de luz blanca son lámparas halógenas de wolframio que tienen una vida útil máxima de unos pocos miles de horas. Las ruedas de filtros son generalmente partes electromecánicas complicadas que son susceptibles de gastarse.
En el documento WO 03/058253, se describen sistemas de procesamiento de muestras y métodos para usar estos sistemas para el procesamiento de materiales de las muestras localizados en dispositivos que están separados del sistema, en los que los sistemas de procesamiento de muestras incluyen una base rotatoria sobre la que los dispositivos de procesamiento de muestras se colocan durante la operación de los sistemas, incluyendo estos sistemas los aparatos de conexión para permitir una fácil y rápida extracción y/o reemplazo de las placas de la base.
El documento US-A-4.909.990 describe un aparato sencillo que emplea la reflexión interna total de la radiación de excitación en la interfaz entre una varilla o fibra conductora reemplazable y una fase líquida circundante de menor índice de refracción.
El documento DE-A-20 55 944 describe un iluminador fluorescente para la luz incidente de un sistema de microscopio que tiene un filtro excitante, un espejo reflectante, un espejo divisor dicroico y un filtro de bloqueo localizado a lo largo del eje del haz de luz excitante.
Sumario
En general, la invención se refiere a técnicas para la detección de múltiples especies diana por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) en tiempo real, denominada en la presente memoria PCR múltiple. En particular, se describe un dispositivo de detección de fluorescencia múltiple que incorpora varios módulos ópticos. Cada uno de los módulos ópticos está optimizado para la detección de un colorante fluorescente respectivo en una banda de longitudes de onda discreta. En otras palabras, los módulos ópticos se pueden usar para estudiar múltiples reacciones paralelas a diferentes longitudes de onda. La reacción puede producirse, por ejemplo, en una cámara de procesamiento individual (por ejemplo, un pozo) de un disco rotatorio. Adicionalmente, cada módulo óptico puede ser retirado para cambiar rápidamente las capacidades de detección del dispositivo.
La variedad de módulos ópticos se pueden acoplar con un detector individual mediante un haz de fibra óptica con varios brazos. De esta forma, la multiplexación se puede obtener usando varios módulos ópticos y un único detector, por ejemplo un tubo fotomultiplicador. Los componentes ópticos de cada módulo óptico pueden ser elegidos para maximizar la sensibilidad y minimizar la cantidad de interferencia óptica, es decir las señales de un colorante en otro módulo óptico.
En otro modo de realización, un dispositivo comprende un motor para rotar un disco que tiene varias cámaras de procesamiento, portando cada una de ellas una muestra respectiva y varios colorantes fluorescentes, varios módulos ópticos y un alojamiento con varias posiciones adaptadas para acoplar los módulos ópticos, donde cada uno de los módulos ópticos incluye un canal óptico que tiene una fuente de luz elegida para excitar uno de los colorantes y una lente para capturar la luz fluorescente emitida por el disco.
En otro modo de realización, un sistema comprende un dispositivo de adquisición de datos. El sistema comprende adicionalmente un dispositivo de detección acoplado con el dispositivo de adquisición de datos, donde el dispositivo de detección comprende un motor para rotar un disco que tiene varias cámaras de procesamiento, portando cada una de ellas una muestra respectiva y varios colorantes fluorescentes, varios módulos ópticos y un alojamiento con varias posiciones adaptadas para acoplar los módulos ópticos, donde cada uno de los módulos ópticos incluye un canal óptico, teniendo cada módulo óptico una fuente de luz elegida para excitar uno de los colorantes y una lente para capturar la luz fluorescente emitida por el disco.
El dispositivo de detección se puede usar en un método que comprende rotar un disco que tiene varias cámaras de procesamiento, teniendo cada una de ellas varias especies que emiten luz fluorescente a diferentes longitudes de onda, excitar el disco con varios haces de luz para producir varios haces de luz fluorescente emitida, capturar los haces de luz fluorescentes con varios módulos ópticos, donde los módulos están configurados ópticamente para diferentes longitudes de onda, estando contenidos la variedad de módulos diferentes en un alojamiento.
La invención puede proporcionar una o más ventajas. Por ejemplo, el diseño modular puede permitir a un operador intercambiar rápida y eficazmente los módulos de detección dependiendo de las reacciones particulares que se estén realizando. Además, el operador puede elegir los módulos de detección que estén optimizados ópticamente para las reacciones diferentes. Adicionalmente, se pueden instalar y utilizar diferentes combinaciones de módulos de detección en el dispositivo de PCR múltiple en tiempo real.
Aunque el dispositivo puede ser capaz de de realizar la PCR en tiempo real, el dispositivo puede ser capaz de analizar cualquier tipo de reacción biológica mientras se produzca. El dispositivo puede ser capaz de modular la temperatura de cada reacción independientemente o como un grupo elegido, y el dispositivo puede ser capaz de soportar varias etapas de reacciones incluyendo una válvula entre dos cámaras. Esta válvula puede ser abierta durante las reacciones mediante el uso de un láser que suministra una ráfaga de energía a la válvula.
En algunos modos de realización, el dispositivo puede ser portátil y robusto para permitir la operación en áreas remotas o laboratorios temporales. El dispositivo puede incluir un ordenador de adquisición de datos para analizar las reacciones en tiempo real, o el dispositivo puede comunicar los datos a otro dispositivo mediante interfaces de comunicación por cable o inalámbricas.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se explican en los dibujos que se acompañan y en la descripción que se da a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y de los dibujos y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama de bloques que ilustra un ejemplo de modo de realización de un dispositivo de detección de fluorescencia múltiple.
La Figura 2 es un diagrama esquemático que ilustra un ejemplo de módulo de detección que puede corresponder con cualquiera de los varios módulos de detección del dispositivo de detección de la fluorescencia de la Figura 1.
La Figura 3 es un diagrama en perspectiva que ilustra una vista frontal de una serie de módulos ópticos desmontables en el alojamiento del dispositivo.
La Figura 4 es un diagrama en perspectiva que ilustra el ejemplo de una serie de módulos ópticos desmontables en el alojamiento del dispositivo.
La Figura 5 es un diagrama en perspectiva que ilustra una vista lateral de un ejemplo de una serie de módulos ópticos desmontables que tiene un módulo que ha sido desmontado para exponer un conector del módulo.
Las Figuras 6A y 6B son diagramas en perspectiva que ilustran los componentes en el ejemplo de módulos ópticos desmontables principales.
Las Figuras 7A y 7B son diagramas en perspectiva que ilustran los componentes en el ejemplo de módulos ópticos desmontables complementarios.
La Figura 8 es un diagrama de bloques que ilustra un ejemplo de modo de realización del dispositivo de detección de la fluorescencia múltiple con más detalle.
La Figura 9 es un diagrama de bloques del detector individual acoplado a cuatro fibras ópticas del haz de fibras ópticas.
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La Figura 10 es un diagrama de flujo que ilustra un ejemplo de operación del dispositivo de detección de fluorescencia múltiple.
Las Figuras 11 y 12 muestran los espectros de absorción y de emisión de colorantes usados generalmente que pueden ser utilizados en la PCR múltiple.
Las Figuras 13A y 13B muestran los datos en bruto obtenidos de dos ejemplos de módulos de detección con un detector individual durante el análisis por PCR.
La Figura 14 es un gráfico que muestra los datos después de ser ajustados por el desfase temporal.
Las Figura 15A y 15B muestran el límite de detección (LOD) para los datos obtenidos con los dos módulos de detección del ejemplo.
La Figura 16 es un ejemplo de una captura de pantalla de la interfaz de usuario del control de temperatura.
La Figura 17 es un ejemplo de una captura de pantalla de la interfaz de usuario del control óptico.
La Figura 18 es un ejemplo de una captura de pantalla de la interfaz de usuario de la PCR en tiempo real.
Descripción detallada
La Figura 1 es un diagrama de bloques que ilustra un ejemplo de modo de realización de un dispositivo 10 de detección de fluorescencia múltiple. En el ejemplo mostrado, el dispositivo 10 tiene cuatro módulos ópticos 16 que proporcionan cuatro "canales" para la detección óptica de cuatro colorantes diferentes. En particular, el dispositivo 10 tiene cuatro módulos ópticos 16 que excitan diferentes regiones del disco rotatorio 13 a cualquier tiempo dado y recogen la energía luminosa fluorescente emitida a diferentes longitudes de onda por los colorantes. Como resultado, los módulos 16 pueden ser usados para estudiar múltiples reacciones paralelas que se producen en la muestra.
Las múltiples reacciones se pueden producir, por ejemplo, simultáneamente en una cámara individual del disco rotatorio 13. Cada uno de los módulos ópticos 16 estudia la muestra 22 y recoge la energía luminosa fluorescente a diferentes longitudes de onda a medida que el disco 13 rota. Por ejemplo, las fuentes de excitación en los módulos 16 se pueden activar secuencialmente durante periodos suficientes para recoger los datos a las correspondientes longitudes de onda. Es decir, un módulo óptico 16A se puede activar durante un periodo de tiempo para recoger los datos en un primer intervalo de longitudes de onda elegidas para un primer colorante que corresponde con la primera reacción. La fuente de excitación puede ser entonces desactivada y se puede activar una fuente de excitación en el módulo 16B para estudiar la muestra 22 en un segundo intervalo de longitudes de onda elegidas para un segundo colorante que corresponde a una segunda reacción. Este procedimiento continúa hasta que se han recogido los datos de todos los módulos ópticos. En un modo de realización, cada una de las fuentes de excitación en los módulos ópticos 16 se activa durante un periodo inicial de aproximadamente dos segundos para alcanzar el estado estacionario seguido por un periodo de estudio que se prolonga durante 10-50 rotaciones del disco 13. En otros modos de realización, las fuentes de excitación pueden secuenciarse para periodos más cortos (por ejemplo, 1 ó 2 milisegundos) o más largos. En algunos modos de realización, se puede activar más de un módulo simultáneamente para el análisis concurrente de la muestra 22 sin detener la rotación del disco 13.
Aunque se presenta una muestra 22 individual, el disco 13 puede contener varias cámaras que portan muestras. Los módulos ópticos 16 pueden analizar algunas o todas las cámaras diferentes a longitudes de onda diferentes. En un modo de realización, el disco 13 incluye 96 cámaras espaciadas alrededor de la circunferencia del disco 13. Con un disco de 96 cámaras y cuatro módulos ópticos 16, el dispositivo 10 puede ser capaz de adquirir datos de 384 especies diferentes.
En un modo de realización, los módulos ópticos 16 incluyen fuentes de excitación que son diodos emisores de luz (LEDs) de alta potencia que no son caros y están disponibles comercialmente en una pluralidad de longitudes de onda y tienen tiempos de vida útil largos (por ejemplo 100.000 horas o más). En otro modo de realización se pueden usar lámparas halógenas o lámparas de mercurio convencionales como fuentes de excitación.
Como se muestra en la Figura 1, cada uno de los módulos ópticos 16 puede estar acoplado con un brazo de un haz de fibras ópticas 14. El haz de fibras ópticas 14 proporciona un mecanismo flexible para recoger las señales fluorescentes de los módulos ópticos 16 sin perder sensibilidad. En general, un haz de fibras ópticas comprende múltiples fibras ópticas colocadas una al lado de otra y unidas en los extremos y recubiertas por una camisa protectora flexible. Alternativamente, el haz de fibras ópticas 14 puede comprender un número más pequeño de fibras multimodo discretas de gran diámetro, bien de vidrio o bien de plástico, que tienen un extremo común. Por ejemplo, para un dispositivo con cuatro módulos ópticos, el haz de fibras ópticas 16 puede comprender cuatro fibras multimodo discretas, teniendo cada una de ellas un diámetro interior de 1 mm. El extremo común del haz contiene las cuatro fibras unidas. En este ejemplo, la apertura del detector 18 puede ser de 8 mm que más que suficiente para acoplar las cuatro fibras.
En este ejemplo, el haz de fibras ópticas 14 acopla los módulos ópticos 16 con un único detector 18. Las fibras ópticas llevan la luz fluorescente recogida por los módulos ópticos 16 y suministran de forma eficaz la luz capturada al detector 18. En un modo de realización, el detector 18 es un tubo fotomultiplicador. En otro modo de realización, el detector puede incluir múltiples elementos fotomultiplicadores, uno para cada fibra óptica, en el detector individual. En otros modos de realización se pueden usar uno o más detectores de estado sólido.
El uso de un único detector 18 puede ser ventajoso en cuanto que permite usar un detector muy sensible y posiblemente caro (por ejemplo, un fotomultiplicador) manteniendo a la vez un coste mínimo ya que solo es necesario usar un único detector. En la presente memoria se describe un único detector; sin embargo, se puede incluir uno o más detectores para detectar un mayor número de colorantes. Por ejemplo, se pueden añadir al sistema cuatro módulos ópticos adicionales 16 y un segundo detector para permitir la detección de ocho longitudes de onda diferentes emitidas por un disco. Un ejemplo de haz de fibras ópticas acoplado a un único detector para ser usado con el disco rotatorio 13 se describe en la solicitud de patente estadounidense Nº de serie 11/174,755, titulada "MULTIPLEX FLUORESCENCE DETECTION DEVICE HAVING FIBER BUNDLE COUPLING MULTIPLE OPTICAL MODULES TO A COMMON DETECTOR", presentada el 5 de Julio de 2005.
Los módulos ópticos 16 se pueden retirar del dispositivo y son fácilmente intercambiables con otros módulos ópticos que están optimizados para el análisis de diferentes longitudes de onda. Por ejemplo, los módulos ópticos 16 pueden montarse físicamente en posiciones del alojamiento del módulo. Cada uno de los módulos ópticos 16 puede insertarse fácilmente en una posición respectiva del alojamiento a lo largo de las guías (por ejemplo, ranuras empotradas) que se acoplan con una o más marcas (por ejemplo, ejes guía) del módulo óptico. Cada módulo óptico incluye una salida óptica (mostrada en las Figuras 6A y 7A) para acoplar el brazo del haz de fibras ópticas 14. La salida óptica tiene un extremo roscado acoplado con el conector roscado del brazo. Alternativamente, se puede usar una forma de "conexión rápida" (por ejemplo, una conexión deslizante que tiene una junta tórica y un pivote de arrastre) que permite que el haz de fibras ópticas 14 pueda ser conectado y desconectado mediante deslizamiento de la salida óptica. Además, cada uno de los módulos ópticos 16 puede tener uno o más contactos eléctricos para acoplar electrónicamente la unidad de control 23 cuando está totalmente insertada.
La arquitectura modular del dispositivo 10 permite que el dispositivo se pueda adaptar fácilmente para todos los colorantes fluorescentes usados en un medio de análisis dado, tal como una PCR múltiple. Otros procesos químicos que se pueden usar en el dispositivo 10 incluyen Invader (Third Wave, Madison, Wisconsin), Transcripción mediada por amplificación (GenProbe, San Diego, California), análisis de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) marcadas por fluorescencia, hibridación in situ fluorescente (FISH). La arquitectura modular del dispositivo 10 puede proporcionar otras ventajas en cuanto que la sensibilidad del módulo óptico 16 puede optimizarse eligiendo la correspondiente fuente de excitación (no mostrada) y filtros de excitación y de detección para un intervalo objetivo específico pequeño de longitudes de onda con el fin de excitar y detectar selectivamente un colorante correspondiente en una reacción múltiple.
A modo de ejemplo se ilustra el dispositivo 10 en una disposición múltiple de 4 colores, pero se pueden usar más o menos canales con el haz de fibras ópticas apropiado. Este diseño modular permite al usuario mejorar fácilmente el dispositivo 10 en el campo simplemente añadiendo otro módulo óptico 16 a la base 20 e insertando un brazo del haz de fibras ópticas 14 en el nuevo módulo óptico. Los módulos ópticos 16 pueden tener electrónica integrada que identifique los módulos ópticos y descargar los datos de calibración en un módulo de control interno u otra electrónica interna (por ejemplo, la unidad de control 23) del dispositivo 10.
En el ejemplo de la Figura 1, las muestras 22 están contenidas en cámaras del disco 13 que están montadas sobre una plataforma rotatoria bajo el control de la unidad de control 23. Un activador 27 del sensor de ranura proporciona una señal de salida usada por la unidad de control 23 y el dispositivo de adquisición de datos 21 para sincronizar la adquisición de los datos con la posición de la cámara durante la rotación del disco. El activador 27 del sensor de ranura puede ser un sensor mecánico u óptico. Por ejemplo, el sensor puede ser un láser que envía un haz de luz al disco 13 y la unidad de control 23 usa un sensor que detecta la luz que pasa a través de una ranura en el disco 13 para localizar las cámaras en el disco. En otro modo de realización, el disco 13 puede incluir una etiqueta, protuberancia o superficie reflectante además de o en lugar de la ranura. El activador 27 del sensor de ranura puede usar cualquier estructura o mecanismo físico para localizar la posición radial en el disco 13 a medida que este rota. Los módulos ópticos 16 pueden ser montados físicamente encima de la plataforma rotatoria 25. Como resultado, los módulos ópticos 16 se superponen con las diferentes cámaras en cualquier momento.
El dispositivo de detección 10 también puede incluir un elemento calefactor (no mostrado) para modular la temperatura de la muestra 22 en el disco 13. El elemento calefactor puede comprender una lámpara halógena cilíndrica contenida en un espacio reflectante. La cámara reflectante tiene una forma adecuada para enfocar la radicación de la lámpara en la sección radial del disco 13. Generalmente, el área calentada del disco 13 parece un anillo a medida que el disco 13 gira. En este modo de realización, la forma del espacio reflectante puede ser una combinación de geometrías elípticas y esféricas que permiten un enfoque preciso. En otros modos de realización, el espacio reflectante puede tener una forma diferente o la lámpara puede irradiar un área mayor. En otros modos de realización, el espacio reflectante puede tener una forma adecuada para enfocar la radiación de la lámpara sobre un área individual del disco 13, tal como una cámara de procesamiento individual que contiene la muestra 22.
En algunos modos de realización, el elemento calefactor puede calentar el aire y forzar el aire caliente sobre una o más muestras para modular la temperatura. Adicionalmente, las muestras pueden ser calentadas directamente por el disco. En este caso, el elemento calefactor puede estar localizado en la plataforma 25 y térmicamente acoplado con el disco 13. Una resistencia eléctrica en el elemento calefactor puede calentar una región elegida del disco controlada por la unidad de control 23. Por ejemplo, una región puede contener una o más cámaras, posiblemente el disco completo. Un ejemplo de elemento calefactor para ser usado con el disco rotatorio 13 se describe en la solicitud de patente estadounidense Nº de serie 11/174,691, titulada "HEATING ELEMENT FOR A ROTATING MULTIPLEX FLUORESCENCE DETECTION DEVICE", presentada el 5 de Julio de 2005.
Alternativamente, o adicionalmente, el dispositivo 10 también puede incluir un componente refrigerante (no mostrado). En el dispositivo 10 se incluye un ventilador para suministrar aire frío, es decir aire a temperatura ambiente, al disco 13. La refrigeración puede ser necesaria para modular la temperatura de la muestra de forma apropiada y almacenar las muestras después de que un experimento ha sido concluido. En otros modos de realización, el componente refrigerante puede incluir el acoplamiento térmico entre la plataforma 25 y el disco 13, ya que la plataforma 25 puede reducir su temperatura cuando sea necesario. Por ejemplo, algunas muestras biológicas se pueden almacenar a 4 grados Celsius para reducir la actividad enzimática o la desnaturalización de las proteínas.
El dispositivo de detección 10 también puede ser capaz de controlar las especies de reacción contenidas en una cámara de procedimiento. Por ejemplo, puede ser beneficioso cargar algunas especies en una cámara de procesamiento para generar una reacción y después añadir otras especies a la muestra una vez que la primera reacción ha terminado. Se puede añadir una válvula buscadora láser para controlar una posición de la válvula que separa una cámara contenedora interna de la cámara de procesamiento, controlando de esta forma la adición de las especies a la cámara durante la rotación del disco 13. Este dispositivo láser puede estar localizado en uno de los módulos ópticos 16 o separado de los módulos ópticos. Directamente por debajo del láser, bajo el disco 13, puede haber un sensor láser para posicionar el láser con respecto al disco 13.
En un modo de realización, el láser es un láser de infrarrojo cercano (NIR) con al menos dos ajustes de potencia. Con el ajuste de baja potencia, el sensor posicionador del láser puede indicar que el láser está en posición sobre la válvula de la cámara reconociendo la luz NIR a través de una ranura en el disco 13. Una vez que el láser esté en posición, la unidad de control 23 dirige el láser para que salga una ráfaga corta de alta potencia para calentar la válvula y abrirla. La válvula abierta puede permitir entonces que el espécimen fluido interior fluya desde la cámara interior hacia la cámara de procesamiento exterior y que se produzca una segunda reacción. En algunos modos de realización, el disco 13 puede contener varias válvulas para generar varias reacciones en secuencia. También se pueden usar más de un ajuste del láser y del sensor láser cuando se usan múltiples válvulas de cámara. Un ejemplo de sistema de control de válvula buscadora láser para usarlo con el disco rotatorio se describe en la solicitud de patente estadounidense Nº de serie 11/174.957, titulada "VALVE CONTROL SYSTEM FOR A ROTATING MULTIPLEX FLUORESCENCE DETECTION DEVICE", presentada el 5 de Julio de 2005.
El dispositivo de adquisición de datos 21 puede recoger los datos del dispositivo 10 para cada colorante bien secuencialmente o bien en paralelo. En un modo de realización, el sistema de adquisición de datos 21 recoge los datos de los módulos ópticos 16 en secuencia y corrige la superposición espacial mediante un retraso del activador para cada uno de los módulos ópticos medido a partir del activador del sensor de ranura 27.
Una aplicación del dispositivo 10 es la PCR en tiempo real, pero las técnicas descritas en la presente memoria se pueden extender a otras plataformas que usan la detección de fluorescencia a diferentes longitudes de onda. El dispositivo 10 puede combinar ciclos térmicos rápidos, usando el elemento calefactor, y microfluidos controlados por centrifugación para el aislamiento, amplificación y detección de ácidos nucleicos. Usando la detección de fluorescencia múltiple se pueden detectar varias especies diana y analizarlas en paralelo.
Para la PCR en tiempo real, se usa la fluorescencia para medir la cantidad de amplificación en una de tres técnicas generales. La primera técnica es el uso de un colorante, tal como Sybr Green (Molecular Probes, Eugene, Oregon), cuya fluorescencia aumenta al enlazarse con el ADN de doble cadena. La segunda técnica usa sondas marcadas por fluorescencia cuya fluorescencia cambia cuando se enlazan con la secuencia diana amplificada (sondas de hibridación, sondas de horquilla, etc.). Esta técnica es similar a la utilización del colorante enlazado al ADN de cadena doble pero es más específica porque la sonda se enlazará solo a una cierta sección de la secuencia diana. La tercera técnica es el uso de sondas de hidrólisis (Taqman^{TM}, Applied BioSystems, Foster City California), en la que la actividad exonucleasa de la enzima polimerasa escinde una molécula de enfriamiento de la sonda durante la fase de extensión de la PCR, haciéndola que sea activa para la fluorescencia.
En cada uno de los enfoques, la fluorescencia es linealmente proporcional a la concentración diana amplificada. El sistema de adquisición de datos 21 mide una señal de salida del detector 18 (o alternativamente de forma opcional, muestreada y comunicada por la unidad de control 23) durante la reacción de PCR para observar la amplificación casi en tiempo real. En la PCR múltiple, las múltiples dianas están marcadas con diferentes colorantes que se miden independientemente. Hablando de forma general, cada colorante tendrá espectros de absorbancia y de emisión diferentes. Por esta razón, los módulos ópticos 16 pueden tener fuentes de excitación, lentes y filtros relacionados que se eligen ópticamente para el análisis de la muestra 22 a diferentes longitudes de onda.
Algunos ejemplos de técnicas o materiales de construcción adecuados que se pueden adaptar para ser usados en conexión con la presente invención pueden describirse en, por ejemplo, la patente estadounidense de titularidad compartida Nº 6.734.401 titulada "ENHANCED SAMPLE PROCESSING DEVICES SYSTEMS AND METHODS" (Bedingham et al.) y en la publicación de patente estadounidense Nº US 2002/0064885 titulada "SAMPLE PROCESSING DEVICES." Otras construcciones de dispositivo que se pueden usar se pueden encontrar, por ejemplo, en la solicitud de patente estadounidense provisional Nº de Serie 60/214.508 presentada el 28 de Junio de 2000 y titulada "THERMAL PROCESSING DEVICES AND METHODS"; la solicitud de patente estadounidense provisional Nº de Serie 60/214.642 presentada el 28 de Junio de 2000 y titulada "SAMPLE PROCESSING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS"; la solicitud de patente estadounidense provisional Nº de Serie 60/237.072 presentada el 2 de Octubre de 2000 y titulada "SAMPLE PROCESSING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS"; la solicitud de patente estadounidense provisional Nº de Serie 60/260.063 presentada el 6 de Enero de 2001 y titulada "SAMPLE PROCESSING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS"; la solicitud de patente estadounidense provisional Nº de Serie 60/284.637 presentada el 18 de Abril de 2001 y titulada "ENHANCED SAMPLE PROCESSING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS"; y la publicación de patente estadounidense Nº US 2002/0048533 titulada "SAMPLE PROCESSING DEVICES AND CARRIERS". Otras construcciones de dispositivos potenciales se pueden encontrar, por ejemplo, en la patente estadounidense Nº 6.627.159 titulada "CENTRIFUGAL FILLING OF SAMPLE PROCESSING DEVICES" (Bedingham et al.).
La Figura 2 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de módulo óptico 16A que puede corresponder con cualquiera de los módulos ópticos 16 de la Figura 1. En este ejemplo, el módulo óptico 16A contiene una fuente de excitación de alta energía, LED 30, una lente colimadora 32, un filtro de de excitación 34, un filtro dicroico 36, una lente de enfoque 38, un filtro de detección 40 y una lente 42 para enfocar la fluorescencia en un brazo del haz de fibras ópticas 14.
Consecuentemente, la luz de excitación del LED 30 es colimada por la lente colimadora 32, filtrada por el filtro de excitación 34, transmitida a través del filtro dicroico 36 y enfocada en la muestra 22 mediante la lente de enfoque 38. La fluorescencia resultante emitida por la muestra es recogida por la misma lente de enfoque 38, reflejada fuera del filtro dicroico 36 y filtrada por el filtro de detección 40 antes de ser enfocada en un brazo del haz de fibras ópticas 14. El haz de fibras ópticas 14 transfiere entonces la luz al detector.
El LED 30, la lente de colimación 32, el filtro de excitación 34, el filtro dicroico 36, la lente de enfoque 38, el filtro de detección 40 y la lente 42 se eligen en función de las bandas de absorción y de emisión específicas de los múltiples colorantes con los que se va a usar el módulo óptico 16A. De esta forma, los módulos ópticos 16 pueden ser configurados y cargados en el dispositivo 10 para centrarse en diferentes colorantes.
La Tabla 1 lista ejemplos de componentes que se pueden usar en un dispositivo 10 de detección de fluorescencia múltiple de 4 canales para una pluralidad de colorantes fluorescentes. FAM, HEX, JOE, VIC, TET, ROX son marcas registradas de Applera, Norwalk, California. Tamra es una marca registrada de AnaSpec, San Jose, California. Texas Red es una marca registrada de Molecular Probes. Cy 5 es una marca registrada de Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido.
TABLA 1
1
Una ventaja de la arquitectura de detección múltiple modular descrita es la flexibilidad para optimizar la detección para una amplia variedad de colorantes. Posiblemente, un usuario puede tener un banco con varios módulos ópticos diferentes que pueden ser conectados con el dispositivo 10 a medida que sea necesario, de los que N pueden ser usados en cualquier momento, donde N es el número máximo de canales soportados por el dispositivo. Por lo tanto, el dispositivo 10 y los módulos ópticos 16 pueden ser usados con cualquier colorante fluorescente y cualquier método de detección por PCR. Se puede usar un haz de fibras ópticas mayor para soportar un mayor número de canales de detección. Además, se pueden usar múltiples haces de fibras ópticas con múltiples detectores. Por ejemplo, se pueden usar haces de fibras ópticas de 4 brazos con ocho módulos ópticos 16 y dos detectores 18.
La Figura 3 es un diagrama en perspectiva que ilustra una vista frontal de una serie de módulos ópticos desmontables en el alojamiento del dispositivo. En la Figura 3, el dispositivo 10 incluye un brazo de base 44 y un alojamiento 46 del módulo. El módulo óptico principal 48, complementario del módulo óptico 52 y complementario del módulo óptico 56 están contenidos en el alojamiento 46 del módulo. Los módulos ópticos 48, 52 y 56 producen los haces de salida óptica 49, 53 y 57, respectivamente, que excitan secuencialmente diferentes cámaras de procesamiento del disco 13. En otras palabras, los haces de salida 49, 53 y 57 siguen la curvatura del disco 13 para excitar cada uno la misma posición radial del disco que contiene las cámaras de procesamiento. El activador del sensor de ranura 27 incluye una fuente de luz infrarroja 31 que produce el haz de luz 35 que es detectado por el detector 33.
Cada uno de los módulos ópticos 48, 52 y 56 incluye una palanca de liberación respectiva 50, 54 ó 58, respectivamente, para ensamblar el alojamiento del módulo 46. Cada palanca de liberación puede proporcionar una inclinación hacia arriba para ensamblar un pasador respectivo formado en el alojamiento 46 del dispositivo. Un operador u otro usuario pueden bajar las palancas de liberación 50, 54 ó 58, respectivamente, con el fin de desacoplar y desmontar el módulo óptico 48, 52 ó 56 del alojamiento 46 del módulo. Un lector de códigos de barras 29 incluye un láser 62 para identificar el disco 13.
El brazo de la base 44 se extiende desde el dispositivo de detección 10 y proporciona el soporte para el alojamiento 46 del módulo y los módulos ópticos 48, 52 y 56. El alojamiento 46 del módulo puede montarse de forma segura por encima del brazo de la base 44. El alojamiento 46 del módulo puede contener una posición adaptada para recibir uno de los módulos ópticos 48, 52 y 56 respectivos. Aunque se ha descrito como ejemplo con respecto al alojamiento 46 del módulo, el alojamiento 46 del módulo del dispositivo de detección 10 puede tener varias posiciones para recibir los módulos ópticos 48, 52 y 56. En otras palabras, no es necesario usar un alojamiento separado para los módulos ópticos 48, 52 y 56.
Cada posición del alojamiento 46 del módulo puede contener una o más vías o guías que ayuden a colocar correctamente el módulo óptico asociado en su posición cuando un operador u otro usuario inserten el módulo óptico. Estas guías pueden estar localizadas a lo largo de la superficie, el fondo o los laterales de cada posición. Cada uno de los módulos ópticos 48, 52 y 56 pueden incluir guías o vías que coincidan con las guías o vías de las posiciones del alojamiento 46 del módulo. Por ejemplo, el alojamiento 46 del módulo puede tener guías prominentes que coinciden con las guías huecas en los módulos ópticos 48, 52 y 56.
En algunos modos de realización, el alojamiento 46 del módulo puede no encerrar completamente los módulos ópticos 48, 52 y 56. Por ejemplo, el alojamiento 46 del módulo puede proporcionar puntos de montaje para asegurar cada uno de los módulos ópticos 48, 52 y 56 en el brazo de la base 44, pero partes o la totalidad de cada uno de los módulos ópticos puede quedar expuesta. En otros modos de realización, el alojamiento 46 del módulo puede encerrar completamente los módulos ópticos 48, 52 y 56. Por ejemplo, el alojamiento 46 del módulo puede incluir una puerta individual que se cierre sobre los módulos ópticos 48, 52 y 56, o una puerta respectiva para cada uno de los módulos. Este modo de realización puede ser apropiado para aplicaciones en las que los módulos se retiren pocas veces o en las que el dispositivo de detección 10 esté sometido a condiciones medioambientales extremas.
Un operador puede retirar fácilmente cualquiera de los módulos ópticos 48, 52 ó 56, y puede hacerse usando solo una mano. Por ejemplo, el operador puede apoyar su dedo índice bajo un borde moldeado localizado bajo la palanca de liberación 54 del módulo óptico 52. El pulgar del operador puede entonces presionar la palanca de liberación 54 para liberar el módulo óptico 52 del alojamiento 46 del módulo. Mientras se agarra el módulo óptico 52 entre el pulgar y el índice, el operador puede tirar del módulo óptico para retirar el módulo óptico del dispositivo de detección 10. Se pueden usar otros métodos para retirar cualquiera de los módulos ópticos 48, 52 ó 56, incluyendo los métodos que usan las dos manos para retirarlos. La inserción de cualquiera de los módulos ópticos 48, 52 ó 56 se puede realizar de forma inversa con una o con las dos manos.
En la Figura 3, los componentes de los dos módulos ópticos se combinan para formar el módulo óptico principal 48. El módulo óptico principal 48 puede contener fuentes de luz que produzcan dos longitudes de onda de luz diferentes y detectores para detectar cada longitud de onda diferente de la fluorescencia de las muestras en el disco 13. Por lo tanto, el módulo óptico principal 48 se puede conectar con dos brazos del haz de fibras ópticas 14. De esta forma, el módulo óptico principal 48 puede considerarse como un módulo óptico de dos canales que tiene dos canales independientes de excitación óptica y de recogida. En algunos modos de realización, el módulo óptico principal 48 puede contener componentes ópticos para más de dos módulos ópticos. En otros casos, el alojamiento 46 del módulo contiene varios (por ejemplo, dos o más) módulos ópticos de un solo canal, tal como los módulos ópticos complementarios 52 y 56.
Como se muestra en la Figura 3, el módulo óptico principal 48 también puede contener componentes para un sistema 51 de control de válvula por láser (localizado en el módulo óptico 48). El sistema 51 de control de válvula por láser detecta la posición del disco 13 mediante una pequeña ranura localizada cerca del borde exterior del disco 13. Un detector (no mostrado) detecta la luz láser de baja energía 55 para cartografiar la posición del disco 13 con respecto al motor que gira el disco. La unidad de control 23 usa este mapa para localizar las válvulas (no mostradas) en el disco 13.
El sistema 51 de control de válvula por láser enfoca la luz láser 55 sobre las válvulas que separan las cámaras contenedoras en el centro del disco 13 de las cámaras de procesamiento cerca del borde exterior del disco 13. Cuando los contenidos en las cámaras contenedora van a ser enviados a las cámaras de procesamiento asociadas, el sistema 51 de control de válvula por láser aplica la luz láser 55 para calentar una válvula que separa las cámaras, haciendo que la válvula se abra y proporcionando una comunicación fluida entre las dos cámaras. En particular, una vez que la válvula se abre, los contenidos de la cámara contenedora interior pueden fluir entonces hacia la cámara de procesamiento exterior a medida que el disco 13 gira. El dispositivo de detección 10 puede controlar entonces la reacción subsiguiente en la cámara de procesamiento. Los contenidos en una cámara pueden incluir sustancias en estado sólido o fluido.
En algunos modos de realización, el sistema 51 de control de válvula por láser puede estar contenido en un módulo óptico de un solo canal, por ejemplo el módulo óptico complementario 54 o el módulo óptico complementario 56. En otros modos de realización, el sistema 51 de control de válvula por láser puede estar montado en el dispositivo de detección 10 separadamente de cualquiera de los módulos ópticos 48, 52 ó 56. En este caso, el sistema 51 de control de válvula por láser puede retirarse y adaptarse para ensamblarlo en una posición en el alojamiento 46 del módulo o un diferente alojamiento del dispositivo de detección 10.
En el ejemplo de la Figura 3, el activador del sensor de ranura 27 está localizado cerca de los módulos desmontables en cualquiera de los lados del disco 13. En un modo de realización, el activador del sensor de ranura 27 contiene una fuente de luz 31 para emitir una luz infrarroja (IR) 35. El detector 33 detecta la luz IR 35 cuando la ranura en el disco 13 permite que la luz pase a través del disco hasta el detector 33. La unidad de control 23 puede usar esta información para sincronizar la posición del disco 13 durante su giro con los datos de los módulos ópticos 48, 54 y 56. En algunos modos de realización, el activador del sensor de ranura 27 puede extenderse desde el brazo de la base 44 para alcanzar el borde exterior del disco 13 durante la operación del dispositivo 10. En otros modos de realización se puede usar un detector mecánico para detectar la posición del disco 13.
El lector de código de barras 29 usa un láser 62 para leer un código de barras localizado en el borde lateral del disco 13. El código de barras identifica el tipo de disco 13 para permitir la operación adecuada del dispositivo 10. En algunos modos de realización, el código de barras puede identificar el disco para ayudar al operador en el seguimiento de los datos de muestras específicas de varios discos 13.
Todos los componentes superficiales de los módulos ópticos 48, 52 y 56 pueden estar construidos de un polímero, material compuesto o aleación metálica. Por ejemplo, se puede usar poliuretano de elevado peso molecular para formar los componentes superficiales. En otros casos, se puede crear una aleación de aluminio o una estructura de fibra de carbono. En cualquier caso, el material puede ser resistente al calor, fatiga, tensión y corrosión. Como el dispositivo de detección 10 puede entrar en contacto con materiales biológicos, las estructuras deben ser esterilizables en el caso de que los contenidos de la cámara escapen fuera del disco 13.
La Figura 4 es un diagrama en perspectiva que muestra un ejemplo de una serie de módulos ópticos desmontables 48, 52 y 56 en el alojamiento 46 del módulo del dispositivo de detección 10. En el ejemplo de la Figura 4, el brazo de la base 44 soporta el lector de código de barras 29 así como los módulos ópticos desmontables 48, 52 y 56 unidos en el alojamiento 46 del módulo. El disco 13 está localizado bajo los módulos ópticos 48, 52 y 56 estando localizadas las cámaras de procesamiento bajo un respectivo camino óptico de cada uno de los módulos en diferentes momentos de tiempo.
En el alojamiento 46 del módulo se pueden observar los frontales del módulo complementario 56 y del módulo óptico principal 48. El módulo complementario 56 contiene el borde moldeado 59 y la palanca de liberación 58. Como se ha descrito previamente, el borde moldeado 59 se puede usar para agarrar el módulo 56 cuando se retira o se inserta el módulo en el alojamiento 46 del módulo. Todos los módulos ópticos 48, 52 y 56 pueden tener un borde moldeado y una palanca de liberación respectivos, o se puede usar una sola palanca de liberación para retirar todos los módulos ópticos. En algunos modos de realización, los módulos ópticos 48, 52 y 56 pueden contener un componente diferente para agarrar el módulo. Por ejemplo, cada uno de los módulos ópticos 48, 52 y 56 puede contener un asidero para retirar el módulo respectivo en una dirección vertical u horizontal del alojamiento 46 del módulo.
La posición de los módulos ópticos 48, 52 y 56 en el alojamiento 46 del módulo puede fijarse con el fin de excitar separadamente diferentes muestras en el disco 13 en cualquier momento de tiempo particular. Por ejemplo, el módulo óptico principal 48 puede estar localizado ligeramente más en la dirección del brazo de la base 44 que los módulos ópticos complementarios 52 y 56, que están desplazados en una posición a cualquier lado del módulo principal. Además, los módulos ópticos 48, 52 y 56 pueden estar desplazados en una dirección horizontal (indicada por una flecha en la Figura 4, en la que X es la distancia que los haces de luz exteriores están desplazados con respecto a los haces de luz interiores) de forma que la excitación de los haces de luz producida por los módulos sigue la curvatura del disco 13. En esta disposición, los haces de luz producidos por los módulos ópticos 48, 52 y 56 atraviesan el mismo camino a medida que el disco 13 rota, excitando y recogiendo luz de esta forma de las cámaras de procesamiento localizadas a lo largo del camino. En otros modos de realización, los módulos ópticos 48, 52 y 56 están alineados de forma que los haces de luz de excitación atraviesan diferentes caminos alrededor del disco 13 en rotación.
En este ejemplo, el brazo de la base 44 contiene un panel 66 de contactos eléctricos que se extiende hasta el alojamiento 46 del módulo. Dentro del alojamiento 46 del módulo, el panel 66 de contactos eléctricos puede contener contactos eléctricos para cada uno de los módulos ópticos 48, 52 y 56. El panel 66 de contactos eléctricos puede estar acoplado eléctricamente con la unidad de control 23. En algunos modos de realización, cada uno de los módulos ópticos 48, 52 y 56 puede tener asociado un panel de contactos eléctricos separado que está conectado a la unidad de control 23.
El acoplador de fibra óptica 68 acopla un brazo del haz de fibras ópticas 14 a una salida óptica del módulo óptico 56. Aunque no se muestra, cada uno de los módulos ópticos 48, 52 y 56 incluye una salida óptica adaptada para ensamblar un acoplador de fibra óptica respectivo montado en el alojamiento 46 del módulo. La conexión entre el acoplador de fibra óptica 68 y el brazo del haz de fibras ópticas 14 puede ser un cierre de tornillo roscado, un cierre trincado o un ajuste por fricción.
El lector de códigos de barras 29 produce una luz láser 64 para leer el código de barras del disco 13. La luz láser 64 sigue un camino directo en el que interactúa con el borde exterior del disco 13. La luz 64 puede extenderse para cubrir un área grande del disco 13 al mismo tiempo. El lector de código de barras 29 lee el código de barras del disco 13 cuando el disco está rotando a baja velocidad. En otros modos de realización, el lector de código de barras 29 puede leer el código de barras periódicamente durante la operación para asegurarse de que no se ha cargado un nuevo disco en el dispositivo 10. En otros modos de realización, el lector de código de barras 29 puede detectar más de un código de barras en el disco 13.
En algunos modos de realización, el brazo de la base 44 puede moverse con respecto al disco 13. En este caso, el brazo de la base 44 puede ser configurable para detectar muestras en discos de diferente tamaño o en muestras localizadas en el interior del disco 13. Por ejemplo, se puede usar un disco más grande que contiene más cámaras de procesamiento o cámaras de procesamiento más grandes moviendo el brazo de la base 44 más lejos del centro del disco 13. El alojamiento 46 del módulo también puede tener una posición configurable para cada módulo óptico 48, 52 ó 56 de forma que cada módulo se pueda mover en uno o más caminos circulares de las cámaras de procesamiento alrededor del disco 13.
La Figura 5 es un diagrama en perspectiva que ilustra una vista lateral de un ejemplo de una serie de módulos ópticos desmontables que tiene un módulo que ha sido retirado para exponer un conector del módulo. En particular, el alojamiento 46 del módulo no se muestra en la Figura 5 y el módulo óptico 56 ha sido retirado para exponer los módulos ópticos 52 y 48 junto con las conexiones para el módulo 56 retirado.
La palanca de liberación 58 (Figura 3) del módulo óptico 56 se une de forma segura en la patilla de sujeción 69 montada en el brazo de la base 44. En este ejemplo, la patilla de sujeción 69 se extiende hasta el módulo óptico 56 y se acopla con la palanca de liberación 58. En otros modos de realización, se pueden usar otros mecanismos de sujeción para fijar el módulo óptico 56 con el brazo de la base 44, tal como un tornillo o un dispositivo de fijación rápido.
El brazo de la base 44 proporciona dos conexiones operativas diferentes en el alojamiento 46 del módulo para recibir y ensamblar el módulo óptico 56 una vez que está insertado. En particular, el brazo de la base 44 proporciona un panel de contactos eléctricos 66 que incluye las conexiones eléctricas 70 para acoplar los contactos eléctricos (no mostrados) contenidos en el módulo óptico 56. Las conexiones eléctricas 70 permiten que la unidad de control 23 se comunique con los componentes eléctricos del módulo 56. Por ejemplo, el módulo 56 puede incluir circuitos eléctricos, soporte físico, soporte lógico o cualquier combinación de ellos. En un ejemplo, los componentes eléctricos internos pueden almacenar una salida para la única información de identificación de la unidad de control 23, tal como un número de serie. Alternativamente, o adicionalmente, los componentes eléctricos pueden proporcionar información que describa las características específicas de los componentes ópticos contenidos en el módulo desmontables 56. Por ejemplo, los componentes eléctricos pueden incluir una memoria programable de solo lectura (PROM), una memoria rápida u otros medios de almacenamiento internos o desmontables. Otros modos de realización pueden incluir una serie de resistencias, un circuito o un procesador encastrado para sacar una única firma de los módulos ópticos 48, 52 ó 56 hacia la unidad de control 23. En otro ejemplo, el módulo óptico 56 puede incluir una fuente de láser y otros componentes que formen parte del sistema de control de válvula por láser, es decir el sistema 51 de control de válvula por láser.
El panel de contactos eléctricos 66 puede retirarse y ser reemplazado por otra versión asociada con un módulo óptico desmontable diferente. Esta opción puede soportar actualizaciones en la capacidad del dispositivo. En otros modos de realización, las conexiones 70 pueden contener más o menos patillas de conexión.
Además, el brazo de la base 44 y el alojamiento 46 del módulo proporciona un canal óptico 72 en la posición para recibir el módulo óptico 56. El canal óptico 72 está conectado a un acoplador de fibra óptica (Figura 4) que se interconecta con un brazo de las fibras ópticas 14. El canal óptico 72 se inserta en una posición con el módulo óptico 56. La luz capturada por el módulo óptico 56 puede ser dirigida a través del canal óptico 72, el acoplador de fibra óptica 68 y el haz de fibras ópticas 15 hacia el detector. El ajuste entre estas conexiones puede ser ajustado para asegurarse de que la luz no escapa o entra en el camino óptico.
En algunos modos de realización, las conexiones con el módulo óptico 56 se pueden disponer en una configuración diferente. Por ejemplo, las conexiones se pueden localizar en otra posición para aceptar el módulo óptico 56 desde otra dirección. En otros modos de realización, las conexiones eléctricas pueden estar localizadas en un lateral del módulo óptico 56 mientras que una conexión óptica está localizada en una segunda superficie del módulo 56. En cualquier caso, las conexiones eléctricas y ópticas localizadas en la posición del alojamiento 46 del módulo alojan un módulo óptico desmontable, es decir el módulo óptico 56 en este ejemplo.
Las conexiones ópticas y eléctricas del módulo 56 descritas en la Figura 5 se pueden usar con cualquier módulo, incluyendo los módulos ópticos 48 y 52. Además, las conexiones de cada módulo óptico pueden no ser idénticas. Como las conexiones pueden ser modificadas mediante acoplamiento con un módulo óptico desmontable adecuado, las conexiones usadas en cualquier módulo óptico particular insertado en una posición particular del alojamiento 46 del módulo puede variar en cualquier momento.
La Figura 6A es un diagrama en perspectiva que ilustra los componentes en un ejemplo de módulo óptico principal desmontable 48A. En el ejemplo de la Figura 6A, el módulo óptico principal 48A incluye una palanca de liberación 50, un pivote 51 y un pasador 74. El alojamiento interno 78 separa cada lado del módulo 48A y contiene el área de contactos eléctricos 80 conectada con la cinta 81. Los componentes ópticos incluyen el LED 82, la lente de colimación 84, el filtro de excitación 86, el filtro dicroico 88, la lente de enfoque 90, el filtro de detección 92 y la lente 94. La salida óptica 17 se acopla a un brazo del haz de fibras ópticas 14. Una serie separada de componentes ópticos para un segundo canal óptico (no mostrado) está localizada en el otro lado del alojamiento interno 78. Además, el módulo principal 48A incluye el conector 96, el diodo láser 98 y la lente de enfoque 100 como parte de un sistema 51 de control de válvula por láser controlado por la unidad de control 23.
La palanca de liberación 50 está unida al módulo óptico 48A mediante un pivote 61. El pivote 61 permite que la palanca de liberación 50 rote alrededor del eje del pivote. Cuando se abate la palanca de liberación 50, el brazo 63 rota en sentido contrario a las agujas del reloj para alcanzar el pasador 74. Una vez que se ha alcanzado el pasador 74, el módulo óptico 48A puede estar libre para retirarlo del alojamiento 46 del módulo. Puede haber un muelle u otro mecanismo para mantener una fuerza de inclinación contra la palanca de liberación 50 para mantener el pasador 74 en una posición hacia abajo. En algunos modos de realización, se puede incluir un muelle alrededor del pivote 61 para proporcionar un momento que mantiene el pasador 74 en la posición hacia abajo o bloqueada. En otros modos de realización, se pueden añadir o usar otros mecanismos de montaje en lugar de la palanca descrita. Por ejemplo, el módulo óptico 48A puede estar unido a un alojamiento 46 del módulo por uno o más tornillos o patillas.
El panel de montaje 76 puede estar instalado en el módulo óptico 48A para unir la cinta de comunicación 81 y el LED 82. La cinta 81 está conectada al área de contacto eléctrico 80 y proporciona una conexión entre el área y los componentes eléctricos en el módulo óptico 48A. El área de contactos 80 y la cinta 81 pueden llevar la información necesaria para ambos lados del módulo óptico principal 48A, incluyendo el sistema 51 de control de válvula por láser y cualquier memoria interna u otro medio de almacenamiento. La cinta 81 puede ser flexible para entrecruzarse dentro del módulo óptico 48A. La cinta 81 puede contener varios hilos conductores eléctricos para comunicar las señales entre los componentes eléctricos y la unidad de control 23 y/o para suministrar potencia a los componentes eléctricos. En algunos modos de realización, cada componente eléctrico puede tener un cable separado conectando el componente con la unidad de control 23. El operador puede necesitar desconectar un cable o circuito flexible del alojamiento 46 del módulo cuando retire el módulo óptico 48A del alojamiento.
En algunos modos de realización, el módulo óptico 48A puede contener sistemas electrónicos para procesar y almacenar los datos. Los sistemas electrónicos pueden contener un circuito de telemetría para transmitir sin cables los datos que representan la luz detectada a la unidad de control 23. La comunicación sin cables se puede realizar por luz infrarroja, frecuencia de radio, bluetooth u otra técnica de telemetría. El módulo óptico 48A puede también incluir una batería para alimentar los sistemas electrónicos que puede ser recargable mediante la unidad de control 23.
El LED 82 se fija al panel de montaje 76 y está acoplado eléctricamente a la cinta 81. El LED 82 produce la luz de excitación 49 de una longitud de onda predeterminada para excitar la muestra 22. Después de que la luz 49 sale del LED 82, la luz se expande mediante una luz de colimación 84 antes de que la luz atraviese el filtro de excitación 86. La luz 49 de una banda de longitud de onda pasa por el filtro dicroico 88 y se enfoca sobre la muestra mediante la lente de enfoque 90. La luz 49 excita la muestra y se recoge la fluorescencia enfocando la lente 90 y se envía al filtro de detección 92 mediante el filtro dicroico 88. La banda de longitud de onda de luz resultante es recogida por la lente 94 y se envía a la salida óptica 17 donde la luz fluorescente recogida entra por un brazo del haz de fibras ópticas 14 para su transmisión al detector 18.
El alojamiento interno 78 puede soportar todos los componentes incluidos en la excitación de la muestra y la detección de la luz fluorescente emitida por la muestra para una longitud de onda elegida. Por el otro lado del alojamiento interno 78 se puede incluir una configuración similar de todos los componentes ópticos para producir luz de una diferente longitud de onda y detectar la correspondiente longitud de onda fluorescente diferente. La separación de cada lado puede evitar que la contaminación lumínica de un lado entre en el canal óptico del otro lado.
Alojados parcialmente entre cada lado del módulo 48A pueden estar los componentes del sistema 51 de control de válvula por láser, incluyendo el conector 96, el diodo láser 98 y la lente de enfoque 100. El alojamiento interno 78 puede proporcionar soporte físico para estos componentes. La cinta 81 se conecta al conector 96 para comunicar las señales de control y la potencia para la fuente láser. El diodo láser 98 se conecta al conector 96 y produce la energía láser 55 usada para abrir las válvulas en el disco 13. El diodo láser 98 envía esta luz de infrarrojo cercano (NIR) a la lente de enfoque 100 para dirigir la energía láser 55 a las válvulas específicas en el disco 13. Debajo del disco 13 se puede localizar un sensor de NIR para localizar las válvulas particulares que deben ser abiertas. En otros modos de realización, estos componentes pueden estar alojados separadamente de los componentes ópticos.
En algunos modos de realización, la lente de emisión 98 y la lente de enfoque 100 del sistema 51 de control de válvula por láser pueden estar contenidas en un módulo óptico de un solo canal, tal como el módulo óptico complementario 52 y 56 (Figura 3).
La Figura 6B es un diagrama en perspectiva que muestra los componentes en un módulo óptico diferente, esencialmente similar al de la Figura 6A. El módulo óptico 48B incluye muchos de los mismos componentes del módulo óptico 48A. Las diferencias incluyen la tuerca 85, el circuito flexible 87 y el conector del circuito flexible 89.
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El módulo óptico 48B no necesita un mecanismo con pasador para unir el alojamiento 46 del módulo. Alternativamente, la tuerca 85 está roscada y se encaja con un tornillo roscado adecuado unido a través del alojamiento 46 del módulo. Una vez que se ha apretado, el módulo óptico 48B está unido de forma segura con el dispositivo de detección 10. En otros modos de realización, se puede usar un dispositivo de fijación diferente. Por ejemplo, un fijador o un carril pueden mantener el módulo óptico 48B en su lugar.
El circuito flexible 87 proporciona la conexión eléctrica entre los componentes del módulo óptico 48B con la unidad de control 23. El circuito flexible 87 es flexible para poderse mover entre varias posiciones. El conector 89 del circuito flexible está acoplado al circuito flexible 87 y proporciona una conexión segura con el módulo óptico 48B. El conector 89 del circuito flexible se puede desencajar para retirar completamente el módulo óptico 48B del alojamiento 46 del módulo.
La Figura 7A es un diagrama en perspectiva que muestra los componentes en un ejemplo de módulo óptico complementario que puede retirarse o insertarse fácilmente en el dispositivo de detección 10. En el ejemplo de la Figura 7A, el módulo óptico 56A incluye una palanca de liberación 58, un pivote 59 y un pasador 102, de forma similar al módulo óptico principal 48A. El módulo óptico 56A también incluye un área de contactos eléctricos 106 conectado a una cinta 107. La cinta 107 también puede estar conectada a un panel de montaje 104. De forma similar al módulo óptico principal 48A, los componentes ópticos incluyen el LED 108, la lente de colimación 110, el filtro de excitación 112, el filtro dicroico 114, la lente de enfoque 116, el filtro de detección 118 y la lente 120. La salida óptica 19 se acopla a un brazo del haz de fibras ópticas 14.
La palanca de liberación 58 está unida al módulo óptico 56A mediante un pivote 65. El pivote 65 permite que la palanca de liberación rote alrededor del eje del pivote. Cuando se abate la palanca de liberación 58, el brazo 67 rota en sentido contrario a las agujas del reloj para alcanzar el pasador 102. Una vez que se ha alcanzado el pasador 102, el módulo óptico 56A puede estar libre para retirarlo del alojamiento 46 del módulo. Puede haber un muelle u otro mecanismo para mantener una fuerza de inclinación contra la palanca de liberación 58 para mantener el pasador 102 en una posición hacia abajo. Alternativamente, puede haber un muelle localizado por encima del pasador 102. En algunos modos de realización, se puede incluir un muelle alrededor del pivote 65 para proporcionar un momento que mantiene el pasador 102 en la posición hacia abajo o bloqueada. En otros modos de realización, se pueden añadir o usar otros mecanismos de montaje en lugar de la palanca descrita. Por ejemplo, el módulo óptico 56A puede estar unido a un alojamiento 46 del módulo por uno o más tornillos o patillas.
El panel de montaje 104 puede estar instalado en el módulo óptico 56A para unir la cinta de comunicación 107 y el LED 108. La cinta 107 está conectada al área de contacto eléctrico 106 y proporciona una conexión entre el área y los componentes eléctricos en el módulo óptico 56A. El área de contactos 106 y la cinta 107 pueden llevar la información necesaria para que los componentes ópticos operen. La cinta 107 puede ser flexible para entrecruzarse dentro del módulo óptico 56A. La cinta 107 puede contener varios hilos conductores eléctricos para comunicar las señales entre los componentes y la unidad de control 23 y/o para suministrar potencia a los componentes eléctricos. En algunos modos de realización, cada componente eléctrico puede tener un cable separado conectando el componente con la unidad de control 23. El operador puede necesitar desconectar un cable o circuito flexible del alojamiento 46 del módulo cuando retire el módulo óptico 56A del alojamiento.
En algunos modos de realización, el módulo óptico 56A puede contener sistemas electrónicos para procesar y almacenar los datos. Los sistemas electrónicos pueden contener un circuito de telemetría para transmitir sin cables los datos que representan la luz detectada a la unidad de control 23. La comunicación sin cables se puede realizar por luz infrarroja, frecuencia de radio, bluetooth u otra técnica de telemetría. El módulo óptico 56A puede también incluir una batería para alimentar los sistemas electrónicos que puede ser recargable mediante la unidad de control 23.
El LED 108 se fija al panel de montaje 104 y está acoplado eléctricamente a la cinta 107. El LED 108 produce la luz de excitación 101 de una longitud de onda predeterminada para excitar la muestra 22. Después de que la luz 101 sale del LED 108, la luz se expande mediante una luz de colimación 110 antes de que la luz atraviese el filtro de excitación 112. La luz 101 de una banda de longitud de onda pasa por el filtro dicroico 114 y se enfoca sobre la muestra mediante la lente de enfoque 116. La luz 101 excita la muestra y se recoge la fluorescencia enfocando la lente 116 y se envía al filtro de detección 118 mediante el filtro dicroico 114. La banda de longitud de onda de luz resultante es recogida por la lente 120 y se envía a la salida óptica 19 donde la luz fluorescente recogida entra por un brazo del haz de fibras ópticas 14 para su transmisión al detector 18.
El módulo complementario 56A también puede contener los componentes del sistema 51 de control de válvula por láser. El sistema 51 de control de válvula por láser puede ser el único sistema usado en el dispositivo 10 o puede haber varios sistemas de control de válvula por láser. Los componentes usados en este sistema pueden ser similares a los componentes descritos en el módulo óptico 48A de la Figura 6A.
Los componentes del módulo óptico complementario 56A pueden ser similares a cualquier módulo óptico complementario de cualquier módulo óptico usado para emitir y detectar una banda de longitudes de onda de luz. En algunos modos de realización, los componentes pueden estar alterados en la configuración para tener en cuenta diferentes aplicaciones experimentales. Por ejemplo, cualquier módulo óptico puede ser modificado para insertarlo en una dirección diferente o para colocarlo en el dispositivo en una posición diferente con respecto al disco 13. En cualquier caso, los módulos ópticos son desmontables para proporcionar flexibilidad de modificación al dispositivo.
La Figura 7B es un diagrama en perspectiva que muestra los componentes en un módulo óptico complementario diferente, esencialmente similar al de la Figura 7A. El módulo óptico 56B incluye muchos de los mismos componentes del módulo óptico 56A. Las diferencias incluyen la tuerca 91, el circuito flexible 93 y el conector del circuito flexible 95.
El módulo óptico 56B no necesita un mecanismo con pasador para unir el alojamiento 46 del módulo. Alternativamente, la tuerca 91 está roscada y se encaja con un tornillo roscado adecuado unido a través del alojamiento 46 del módulo. Una vez que se ha apretado, el módulo óptico 56B está unido de forma segura con el dispositivo de detección 10. En otros modos de realización, se puede usar un dispositivo de fijación diferente. Por ejemplo, un fijador o un carril pueden mantener el módulo óptico 56B en su lugar.
El circuito flexible 93 proporciona la conexión eléctrica entre los componentes del módulo óptico 56B con la unidad de control 23. El circuito flexible 93 es flexible para poderse mover entre varias posiciones. El conector 95 del circuito flexible está acoplado al circuito flexible 93 y proporciona una conexión segura con el módulo óptico 56B. El conector 95 del circuito flexible se puede desencajar para retirar completamente el módulo óptico 56B del alojamiento 46 del módulo.
La Figura 8 es un diagrama de bloques funcionales del dispositivo de detección de fluorescencia múltiple 10. En particular, la Figura 8 muestra las conexiones eléctricas entre los componentes del dispositivo y los caminos generales de la luz a través de los componentes. En el ejemplo de la Figura 8, el dispositivo 10 incluye al menos un procesador 122 u otra lógica de control, una memoria 124, el motor 126 del disco, la fuente de luz 30, el filtro de excitación 34, la lente 38, el filtro de detección 40, la lente de adquisición 42, el detector 18, el activador del sensor de ranura 27, la interfaz de comunicación 130, el elemento calefactor 134, el láser 136 y una fuente de alimentación 132. Como se muestra en la Figura 3, no es necesario que la lente 38 y la lente de adquisición 42 estén conectadas eléctricamente con ningún otro componente. Además, la fuente de luz 30, los filtros 34 y 40, la lente 38 y la lente de adquisición 42 son representativas de un módulo óptico. Aunque no se muestra en la Figura 8, el dispositivo 10 puede contener módulos ópticos 16 adicionales, como se ha descrito previamente. En dicho caso, cada módulo óptico adicional puede incluir componentes dispuestos esencialmente de forma similar a los que se han mostrado en la Figura 8.
La luz sigue un cierto camino a través de varios componentes en la Figura 8. Una vez que la luz es emitida por la fuente de luz 30, pasa por el filtro de excitación 34 y sale como luz de una longitud de onda discreta. A continuación pasa a través de la lente 38 donde deja el dispositivo de detección 10 y excita la muestra 22 en una cámara de procesamiento. La muestra 22 responde emitiendo fluorescencia a una longitud de onda diferente, momento en el que esta luz fluorescente pasa por la lente 38 y es filtrada por el filtro de detección 40. El filtro 40 elimina la luz de fondo de longitudes de onda diferentes de la fluorescencia deseada de la muestra 22. La luz restante es enviada a través de la lente de adquisición 42 y entra en un brazo del haz de fibras ópticas 14 antes de ser detectada por el detector. El detector 18 amplifica subsiguientemente la señal luminosa recibida.
El procesador 122, la memoria 124 y la interfaz de comunicación 130 pueden formar parte de la unidad de control 23. El procesador 122 controla el motor del disco 126 para que rote o gire el disco 13 a medida que sea necesario para recoger la información de la fluorescencia o mover el fluido a través del disco 13. El procesador 122 puede usar la información de la posición del disco recibida del activador del sensor de ranura 27 para identificar la posición de las cámaras en el disco 13 durante la rotación y sincronizar la adquisición de los datos de fluorescencia recibidos del disco.
El procesador 122 también puede controlar si la fuente de luz 30 en el módulo óptico 16 está encendida o apagada. En algunos modos de realización, el procesador 122 controla el filtro de excitación 34 y el filtro de detección 40. Dependiendo de la muestra que está siendo iluminada, el procesador 122 puede cambiar el filtro para permitir que diferentes longitudes de onda de la luz de excitación alcancen la muestra o que una longitud de onda diferente de la fluorescencia alcance la lente de adquisición 42. En algunos modos de realización, uno o ambos filtros pueden ser optimizados por la fuente de luz 30 del módulo óptico 16 particular y no pueden ser cambiados por el procesador 122.
La lente de adquisición 42 está acoplada con un brazo del haz de fibras 14 que proporciona un camino óptico para la luz de la lente de adquisición al detector 18. El procesador 122 puede controlar la operación del detector 18. Mientras que el detector 18 puede estar constantemente detectando toda la luz, algunos modos de realización pueden utilizar otros modos de adquisición. El procesador 122 puede determinar si el detector 18 recoge los datos y puede programar otros parámetros de configuración del detector 18. En un modo de realización, el detector 18 es un tubo fotomultiplicador que captura la información de la fluorescencia de la luz proporcionada por la lente de adquisición 42. En respuesta, el detector 18 produce una señal de salida 128 (por ejemplo, una señal de salida analógica) representativa de la luz recibida. Aunque no se muestra en la Figura 8, el detector 18 puede recibir conjuntamente luz de otros módulos ópticos 16 del dispositivo 10. En este caso, la señal de salida 128 representa eléctricamente una combinación de la entrada óptica recibida por el detector 18 de varios módulos ópticos 16.
El procesador 122 también puede controlar el flujo de datos del dispositivo 10. Datos tales como la fluorescencia muestreada por el detector 18, la temperatura de las muestras del elemento calefactor 134 y los sensores relacionados, y la información de la rotación del disco pueden ser almacenados en la memoria 124 para el análisis. El procesador 122 puede comprender uno o más cualesquiera de un microprocesador, un procesador de señal digital (DSP), un circuito integrado específico de aplicación (FPGA) y otro circuito lógico digital. Además, el procesador 122 proporciona un medio de operación para soportes lógicos inalterables, software o sus combinaciones, almacenados en un medio que pueda ser leído por ordenador, tal como una memoria 124.
La memoria 124 puede incluir uno o más memorias para almacenar una variedad de información. Por ejemplo, una memoria puede contener parámetros de configuración específicos, instrucciones ejecutables, y otra puede contener los datos recogidos. Por lo tanto, el procesador 122 puede usar los datos almacenados en la memoria 124 para controlar la operación y calibración del dispositivo. La memoria 124 puede incluir uno o más cualesquiera entre una memoria de acceso aleatorio (RAM), memoria de solo lectura (ROM), memoria ROM programable, borrable electrónicamente (EEPROM), memoria rápida o similares.
El procesador 122 puede controlar además el elemento calefactor 134. Basándose en las instrucciones contenidas en la memoria 124, el elemento calefactor 134 puede ser controlado selectivamente para controlar la temperatura de una o más cámaras según los perfiles de calentamiento deseados. Generalmente, el elemento calefactor calienta una sección radial del disco 13 a medida que el disco gira. El elemento calefactor 134 puede comprender una lámpara halógena y un reflector para enfocar la energía de calentamiento sobre un área específica del disco 13. En otros modos de realización, el elemento calefactor 134 puede calentar una o más cámaras secuencialmente. Este modo de realización requeriría que el disco 13 permaneciera estacionario mientras que se calienta la cámara. En cualquier modo de realización, el elemento calefactor 134 puede ser capaz de encenderse y apagarse de forma extremadamente rápida a medida que sea necesario.
El láser 136 se usa para controlar la apertura de la válvula que permite que los contenidos de la cámara contenedora fluyan a otra cámara del disco 13, por ejemplo un pozo de reacción o una cámara de procesamiento. El procesador 122 y el equipo de soporte físico controlan el láser 136 para abrir selectivamente las válvulas específicas contenidas en el disco 13. El procesador 122 puede interaccionar con un sensor láser debajo del disco 13 para determinar la posición del láser con respecto a la válvula deseada. Cuando está en posición, el procesador 122 saca una señal para dirigir el láser 136 para producir una ráfaga de energía orientada a la válvula. En algunos casos, la ráfaga puede durar durante aproximadamente 0,5 segundos, mientras que en otros modos de realización puede incluir tiempos de apertura de duración mayor o menor. La energía del láser y la duración del pulso pueden estar controladas por el procesador 122 mediante la comunicación con el láser.
El procesador 122 usa la interfaz de comunicación 130 para comunicarse con el sistema de adquisición de datos 21. La interfaz de comunicación 130 puede incluir un único método o una combinación de métodos para transferir los datos. Algunos métodos pueden incluir un puerto de bus serial universal (USB) o un puerto IEEE 1394 para la conectividad con el equipo con velocidades de transferencia de datos muy grandes. En algunos modos de realización, un dispositivo de almacenamiento puede estar unido directamente a uno de estos puertos para el almacenamiento de datos y procesamiento posterior. Los datos pueden ser procesados previamente por el procesador 122 y dispuestos para visualizarlos, o puede ser necesario que los datos en bruto sean completamente procesados antes de que pueda iniciarse el análisis.
Las comunicaciones con el dispositivo de detección 10 también se pueden realizar por comunicación por frecuencia de radio (RF) o conexión por red de área local (LAN). Además, la conectividad se puede obtener por conexión directa o a través de un punto de acceso de red, tal como un nodo o un direccionador que pueden soportar comunicaciones con o sin cables. Por ejemplo, el dispositivo de detección 10 puede transmitir datos con una frecuencia RF determinada para su recepción por el dispositivo de adquisición de datos 21 objetivo. El dispositivo de adquisición de datos 21 puede ser un ordenador general, un ordenador portátil, un dispositivo manual de computación o un dispositivo de aplicación específica. Además, varios dispositivos de adquisición de datos pueden recibir los datos simultáneamente. En otros modos de realización, el dispositivo de adquisición de datos 21 puede estar incluido en el dispositivo de detección 10 como un sistema integrado de detección y adquisición.
Además, el dispositivo de detección 10 puede ser capaz de descargar soporte lógico actualizado, soporte lógico inalterable y datos de calibración de un dispositivo remoto a través de una red, tal como internet. La interfaz de comunicación 130 puede también permitir que el procesador 122 controle el informe de inventario de cualquier fallo. Si se produce un problema de operación, el procesador 122 puede ser capaz de sacar información de error para ayudar al usuario para resolver el problema proporcionándole datos de operación. Por ejemplo, el procesador 122 puede proporcionar información para ayudar al usuario a diagnosticar un elemento calefactor que falle o un problema de sincronización.
La fuente de alimentación 132 suministra energía de operación a los componentes del dispositivo 10. La fuente de alimentación 132 puede usar electricidad de una salida eléctrica estándar de 115 voltios o incluir una batería y un circuito de generación de energía para producir la energía de operación. En algunos modos de realización, la batería puede ser recargable para permitir una operación extensa. Por ejemplo, el dispositivo 10 puede ser portátil para la detección de muestras biológicas en una emergencia, tal como un área de un desastre. La recarga puede ser realizada a través de una salida eléctrica de 115 voltios. En otros modos de realización, se pueden usar baterías tradicionales.
La Figura 9 es un diagrama de bloques funcional del detector individual 18 acoplado a cuatro fibras ópticas del haz de fibras ópticas. En este modo de realización el detector 18 es un tubo fotomultiplicador. Cada brazo del haz de fibras ópticas 14, la fibra óptica 14A, la fibra óptica 14B, la fibra óptica 14C y la fibra óptica 14D, se acopla con una interfaz de entrada óptica 138 del detector 18. De esta forma, la luz llevada por cualquiera de las fibras ópticas 14 es suministrada a una sola interfaz de entrada óptica 138 del detector 18. La interfaz de entrada óptica 138 proporciona la luz total al electromultiplicador 140. El ánodo 142 recoge los electrones y produce la correspondiente señal analógica con señal de salida.
En otras palabras, como se muestra, las fibras ópticas 14 se ajustan en la apertura óptica de entrada del detector 18. Por consiguiente, el detector 18 puede usarse para detectar luz de cada brazo del haz de fibras ópticas 14 simultáneamente. La interfaz de entrada óptica 138 proporciona la luz al electromultiplicador 140. Para un tubo fotomultiplicador, los fotones de las fibras ópticas impactan en primer lugar en un cátodo fotosensible que a su vez libera fotoelectrones. A continuación, los fotoelectrones crean una cascada impactando en una serie de dinodos emitiéndose más fotoelectrones por contacto con cada dinodo. El grupo resultante de electrones multiplican esencialmente las pequeñas señales luminosas transmitidas originalmente por las fibras ópticas 14. El número de electrones aumentado se recoge finalmente por el ánodo 142. Esta corriente del ánodo 142 se transfiere mediante una corriente al amplificador de voltaje 144 como una señal de salida analógica que es representativa de las señales ópticas de fluorescencia de la muestra proporcionada por la pluralidad de los módulos ópticos 16.
La unidad de control 23 incluye un convertidor analógico a digital (A/D) 146 que convierte la señal analógica en una corriente de datos digitales muestreados, es decir: una señal digital. El procesador 122 recibe la señal digital y almacena los datos muestreados en la memoria 124 para comunicación de los datos al dispositivo de adquisición 21, como se ha descrito anteriormente. En algunos modos de realización, el convertidor A/D 146 puede estar contenido en el detector 18 en lugar de en la unidad de control 23.
De esta forma, un único detector 18 puede ser utilizado para recoger toda la luz del haz óptico 14 y producir una señal representativa de ella. Una vez que la señal es amplificada por el amplificador 144 y convertida en una señal digital, puede ser separada digitalmente en datos que corresponden a la luz recogida por cada uno de los módulos ópticos 16 individuales. La señal total puede ser separada por intervalos de frecuencia en cada una de las señales detectadas representativas de cada fluorescencia. Estas frecuencias pueden ser separadas por un filtro digital aplicado por el dispositivo de adquisición de datos 21 o en el dispositivo 10.
En otros modos de realización, la señal amplificada puede ser separada por frecuencias usando filtros analógicos y ser enviada a canales separados antes del convertidor A/D. A continuación, cada canal puede ser digitalizado separadamente y enviado al dispositivo de adquisición de datos. En ambos casos, el detector individual es capaz de capturar toda la información de la fluorescencia de cada módulo óptico 16. El dispositivo de adquisición de datos 21 puede entonces representar y analizar la señal adquirida de cada cámara del disco 13 en tiempo real sin necesidad de detectores múltiples.
En algunos modos de realización, el detector 18 puede no ser un tubo fotomultiplicador. En general, el detector 18 puede ser cualquier tipo de dispositivo de detección analógico o digital capaz de capturar luz de varios brazos de un mecanismo de suministro óptico, es decir el haz de fibras 14, y producir una representación que se pueda transmitir de la luz capturada.
La Figura 10 es un diagrama de flujo que ilustra la operación del dispositivo de detección de fluorescencia múltiple 10. Inicialmente, un operador especifica los parámetros del programa en el dispositivo de adquisición de datos 21 o a través de una interfaz con la unidad de control 23 (148). Por ejemplo, estos parámetros pueden incluir una velocidad y un periodo de tiempo para rotar el disco 13, definir los perfiles de temperatura para la reacción y las posiciones de la muestra en el disco 13.
A continuación, el usuario carga el disco 13 en el dispositivo de detección 10 (150). Después de asegurar el dispositivo 10, el usuario inicia el programa (152) haciendo que la unidad de control 23 comience a girar el disco (154) a una velocidad especificada. Después de que el disco comience a girar, pueden ocurrir dos procesos concurrentes.
En primer lugar, el dispositivo de detección 10 comienza a detectar fluorescencia de la luz de excitación (156) producida por una o más reacciones en una o más muestras. El detector 18 amplifica las señales de fluorescencia de cada muestra que están sincronizadas con cada muestra respectiva y el tiempo al que se emitió la fluorescencia (158). Durante este proceso, el procesador 122 salva los datos capturados en la memoria 124 y puede comunicar los datos al dispositivo de adquisición de datos 10 en tiempo real para controlar el progreso del análisis y para procesamientos adicionales (160). Alternativamente, el procesador 122 puede salvar los datos en el dispositivo 10 hasta que se complete el programa. El procesador 122 continua detectando la fluorescencia de la muestra y salva los datos hasta que el programa finaliza (162). Una vez que se ha completado la ejecución, la unidad de control 23 detiene el giro del disco (164).
Durante este proceso, la unidad 23 controla la temperatura del disco (166) y modula la temperatura del disco, o de cada muestra, para obtener la temperatura objetivo para cada tiempo (168). La unidad de control 23 sigue monitorizando y controlando las temperaturas hasta que el programa finaliza (170). Una vez que se ha completado la ejecución, la unidad de control 23 mantiene la temperatura de las muestras a la temperatura de almacenamiento de las muestras, generalmente 4 grados Celsius (172).
La operación del dispositivo 10 puede variar del ejemplo de la Figura 10. Por ejemplo, las revoluciones por minuto del disco se pueden modificar mediante el programa y el láser 16 puede ser utilizado para abrir las válvulas entre las cámaras del disco para permitir reacciones múltiples. Estas etapas pueden ocurrir en cualquier orden durante la operación, dependiendo del programa que el usuario defina.
En un método para detectar luz y muestrear datos del disco, el usuario especifica inicialmente qué módulos detectarán la fluorescencia del disco 13 y la unidad de control 23 enciende el LED de un módulo. Una vez que el LED se ha calentado hasta el estado estacionario, la unidad de control 23 gira el disco 13 una rotación a una velocidad aproximada de 1470 revoluciones por minuto. Durante esta rotación, el módulo recoge la luz de fluorescencia de las cámaras de procesamiento del disco 13 y la unidad de control 23 coloca 16 muestras de cada cámara de procesamiento en la memoria BIN asociada con cada cámara de procesamiento.
Si el disco 13 debe ser girado otra rotación, la unidad de control 23 ejecuta otra revolución del disco 13. Si se han muestreado 16 revoluciones, el módulo ha completado la detección con el LED. Por lo tanto, cada cámara de procesamiento se muestreó un total de 256 veces y el dispositivo de adquisición de datos 21 integra las muestras para crear un histograma de cada cámara de procesamiento. La unidad de control 23 apaga el LED. Si se debe usar otro módulo para la detección continua, la unidad de control 23 enciende el siguiente LED del módulo. Si no es necesario recoger datos de otros módulos, la unidad de control 23 finaliza la adquisición de datos del disco 13.
En algunos modos de realización, cada cámara de procesamiento puede ser muestreada más o menos veces. La unidad de control 23 puede girar el disco 13 a una velocidad mayor para proporcionar resultados más rápidos o girar el disco 13 más despacio para adquirir los datos de más muestras. En otros modos de realización, los LEDs de dos o más módulos se pueden encender para detectar la fluorescencia simultáneamente en varias longitudes de onda.
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Ejemplo
Las Figuras 11 y 12 muestran los espectros de absorción y de emisión de colorantes usados generalmente que pueden ser utilizados con el dispositivo 10 en la PCR múltiple. En estos ejemplos, los máximos de absorción de los colorantes varían de 480-620 nm y los máximos de emisión resultantes varían de 520-670 nm. Las señales para cada colorante en la Figura 12 se numeran como FAM 174, Sybr 176, JOE 178, TET 180, HEX 182, ROX 184, Tx Red 186 y Cy5 188. Las señales en la Figura 13 son FAM 190, Sybr 192, TET 194, JOE 196, HEX 198, ROX 200, Tx Red 202 y Cy5 204. FAM, HEX, JOE, VIC, TET, ROX son marcas registradas de Applera, Norwalk, California. Tamra es una marca registrada de AnaSpec, San Jose, California. Texas Red es una marca registrada de Molecular Probes. Cy 5 es una marca registrada de Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido.
En un ejemplo, un disco de 96 cámaras se rellenó con diferentes concentraciones de los colorantes FAM y ROX diluidos en disolución tampón de reacción de PCR estándar. Se añadieron cuatro réplicas de cada colorante en una serie de diluciones 2x, empezando con FAM 200 nM y ROX 2000 nM. El volumen de cada muestra fue de 10 \muL. La cámara 82 tenía una mezcla de 5 \muL de FAM 200 nM y 5 \muL de ROX 2000 nM. El dispositivo 10 se construyó como un dispositivo de detección de PCR múltiple con dos canales con dos módulos ópticos 16 para la detección de los colorantes.
El primer módulo óptico (el módulo FAM) contenía un LED azul, un filtro de excitación a 475 nm y un filtro de detección a 520 nm. El segundo módulo óptico (el módulo ROX) contenía un LED verde con un filtro de excitación a 560 nm y un filtro de detección a 610 nm. Otra opción sería incorporar un LED naranja y un filtro de excitación a 580 nm para optimizar la detección del ROX.
Se realizó el análisis por PCR y las señales fluorescentes de las muestras se multiplexaron en un haz de fibras ópticas bifurcado. El haz de fibras se interconectó con un solo detector, específicamente un tubo fotomultiplicador (PMT). Se recogieron los datos en un panel de adquisición de datos (DAQ) de National Instruments con una interfaz con un programa de adquisición de datos Visual Basic ejecutado en un ordenador de uso general. Los datos se recogieron mientras los discos giraban a 1.000 revoluciones por minuto (nominalmente). Se usaron secuencialmente el módulo FAM y el módulo ROX para estudiar las muestras. Cada barrido consistía en una media de 50 rotaciones. Los datos en bruto de los módulos ópticos se muestran en las Figuras 13A y 13B.
La gráfica de la Figura 13A se tomó encendiendo el LED en el módulo FAM y la gráfica de la Figura 13B se tomó encendiendo el LED en el módulo ROX.
Durante el análisis, los datos recogidos mostraron claramente que había un desfase temporal asociado con los módulos ópticos que estaban localizados sobre diferentes cámaras a cualquier tiempo. Se calculó el valor del desfase determinando el desfase temporal entre los módulos ópticos 1 y 2 para una cámara particular, es decir: en este caso, la cámara 82. En otras palabras, el desfase temporal indica la cantidad de retraso temporal entre los datos obtenidos por el módulo FAM y los datos obtenidos por el módulo ROX para la misma cámara.
La Figura 14 es un gráfico que muestra los datos integrados después de restar el desfase para cada cámara. El FAM está indicado por las barras en línea de puntos, el ROX está indicado por las barras en líneas continuas y los datos del ROX se sitúan sobre los datos del FAM. Los datos mostraron que no había señal del colorante ROX en el módulo óptico 1 y que no había señal del FAM en el módulo óptico 2. Había un ruido de fondo mayor en el módulo 1 que fue corregido usando una serie de filtros optimizados. Se analizaron los datos para determinar el límite de detección (LOD) descrito como la señal equivalente al nivel de ruido de la línea base. El nivel de ruido de la línea base fue definido como la media de diez barridos de una cámara en blanco más tres veces la desviación estándar.
El LOD se determinó mediante un ajuste lineal por mínimos cuadrados de la señal integrada representada frente a la concentración de los patrones de FAM y ROX. Se calculó que el LOD de los módulos de FAM y ROX eran 1 y 4nM, respectivamente, como se muestra en las Figuras 15A y 15B.
La Figura 16 es un ejemplo de una captura de pantalla de la interfaz de usuario del control de temperatura. La pantalla de control de temperatura 250 está destacada y muestra los controles de temperatura 252. El gráfico de temperatura 254 muestra las lecturas de temperatura mientras el indicador de estado 256 muestra la información general. La ventana de mensajes 258 muestra los comandos cuando el dispositivo de detección 10 está en funcionamiento.
El operador puede elegir la pantalla de control de la temperatura 250 para ver la información de la temperatura del dispositivo 10. La pantalla de control de temperatura 250 es una de las varias pantallas que se pueden elegir para mostrar información asociada con la operación de la unidad de control 23 o con el dispositivo de adquisición de datos 21. La pantalla 250 incluye controles de temperatura 252 que muestran información numérica al operador. El gráfico de temperatura 254 muestra gráficamente información de la temperatura como una gráfica de la temperatura en función del tiempo. En algunos modos de realización, el operador puede cambiar manualmente los valores localizados en los controles de temperatura 252.
El indicador de estado 256 está siempre visible para el usuario. El indicador de estado 256 muestra tiempos de operación importantes, número de ciclos, temperatura y otra información importante. La ventana de mensaje 258 muestra los comandos actuales de la unidad de control 23. La ventana 258 incluye una barra de desplazamiento para localizar cualquier comando suministrado a la unidad de control 23 durante la operación del dispositivo 10. En algunos modos de realización, la ventana de mensaje 258 puede mostrar información de error y otra información importante para el operador.
La Figura 17 es un ejemplo de una captura de pantalla de la interfaz de usuario del control óptico. La pantalla de control óptico 260 está destacada y muestra el gráfico de señal 262. El histograma 264 muestra la señal integrada de cada cámara de procesamiento. La pantalla 260 también incluye una ventana de mensaje 266 y un control de desfase 268.
El gráfico de señal 262 muestra los datos ópticos en bruto detectados por el dispositivo de detección 10. La señal mostrada en el gráfico 262 es la señal en bruto de los módulos ópticos 48, 52 y 56 e incluye ciclos que corresponden con el cambio de señal entre las cámaras de procesamiento. El operador puede cambiar el control de desfase 268 para hacer coincidir la clasificación de la señal en compartimentos apropiados que representan cada cámara de procesamiento con la forma de onda de la señal. La pérdida de señal entre cada pico representa la detección de luz del disco 13 entre cada cámara de procesamiento. La señal correspondiente se integra para producir un histograma 264 que muestra la señal detectada con cada una de las 96 cámaras de procesamiento. La unidad de control 23 integra 16 muestras de una cámara de procesamiento en cada una de las 16 rotaciones del disco 13. El histograma 264 contiene por lo tanto 256 muestras de los contenidos de cada cámara de procesamiento de las muestras. En algunos modos de realización, el programa puede ajustar automáticamente el control de desfase 268 reconociendo los elementos de la forma de onda de la señal en bruto. La ventana de mensaje 266 muestra la información de comandos y los mensajes de error que se refieren al control óptico de la detección de la luz.
La Figura 18 es un ejemplo de una captura de pantalla de la interfaz de usuario de la PCR en tiempo real. La pantalla de datos 270 está destacada y muestra el histograma 272 y un gráfico del producto 274. La pantalla 270 muestra los datos en tiempo real recogidos de las cámaras de procesamiento del disco 13. El histograma 272 muestra la señal integrada para cada cámara de procesamiento, mientras que el gráfico del producto 274 muestra la cantidad de producto amplificado en función del número de ciclos. En otros modos de realización, los resultados de las cámaras de procesamiento pueden variar en aplicaciones diferentes.

Claims (15)

1. Un dispositivo de detección que comprende:
un disco (13) que tiene varias cámaras de procesamiento cada una de ellas para contener una muestra (22) respectiva y uno o más colorantes fluorescentes, teniendo dichos colorantes fluorescentes diferentes longitudes de onda de emisión;
un motor para rotar dicho disco;
varios módulos ópticos (16);
un alojamiento (46) que tiene varias posiciones adaptadas para recibir los módulos ópticos, en el que cada uno de los varios módulos ópticos se puede desmontar de las posiciones en el alojamiento;
un detector (18); y
un haz de fibras ópticas (14) acoplado con la pluralidad de módulos ópticos para transmitir la luz fluorescente desde los múltiples módulos ópticos al detector;
en el que cada uno de los módulos ópticos incluye un canal óptico, teniendo cada módulo óptico una fuente de luz (30) elegida para excitar uno de los colorantes diferentes y una lente (42) para capturar la luz fluorescente emitida por el disco, estando dichos módulos ópticos configurados ópticamente para estudiar los colorantes diferentes a longitudes de onda diferentes.
2. El dispositivo de detección según la reivindicación 1, en el que cada uno de la pluralidad de varios módulos ópticos comprende una pluralidad de guías que encajan con una pluralidad de carriles en cada una de las varias posiciones del alojamiento adaptadas para recibir los módulos ópticos.
3. El dispositivo de detección según la reivindicación 1, que comprende además una unidad de control, donde la unidad de control controla la fuente de luz en cada uno de los módulos ópticos a través de contactos eléctricos y en el que cada uno de los módulos ópticos incluye un componente eléctrico que comunica con la unidad de control a través de contactos eléctricos.
4. El dispositivo de detección según la reivindicación 3, en el que el componente eléctrico de cada uno de los módulos ópticos saca la información de identificación única para el módulo óptico respectivo.
5. El dispositivo de detección según la reivindicación 3, en el que el componente eléctrico incluye una memoria de solo lectura programable (PROM), una memoria rápida, un medio de almacenamiento interno o un medio de almacenamiento desmontable.
6. El dispositivo de detección según la reivindicación 3, en el que el componente eléctrico incluye una fuente láser que emite un láser para abrir una válvula que separa una cámara de procesamiento de una cámara contenedora en el disco.
7. El dispositivo de detección según la reivindicación 1, en el que se pueden combinar uno o más módulos ópticos para formar un módulo óptico mayor.
8. El dispositivo de detección según la reivindicación 1, en el que los varios módulos ópticos están alineados alrededor del disco para estudiar secuencialmente una o más cámaras de procesamiento.
9. El dispositivo de detección según la reivindicación 1, en el que dos o más módulos ópticos estudian una o más cámaras de procesamiento sin detener la rotación del disco.
10. El dispositivo de detección según la reivindicación 1, en el que la pluralidad de módulos ópticos están dispuestos de forma que cada módulo óptico detecta muestras en su posición radial asociada en el disco.
11. Un sistema de detección que comprende: un dispositivo de adquisición de datos; y un dispositivo de detección según la reivindicación 1 acoplado con el dispositivo de adquisición de datos.
12. El sistema según la reivindicación 11, en el que cada una de las posiciones incluye una serie de uno o más contactores eléctricos, y en el que cada uno de los módulos ópticos tiene una serie de uno o más contactos eléctricos para acoplar electrónicamente los contactos eléctricos de las posiciones cuando se insertan en el alojamiento.
13. El sistema según la reivindicación 11, en el que cada uno de los módulos ópticos incluye una salida óptica para acoplarse con un brazo del haz de fibras ópticas.
14. El sistema según la reivindicación 11 que comprende además un activador del sensor de ranura para proporcionar una señal de salida para la sincronización de la rotación del disco con la luz fluorescente capturada emitida por el disco.
15. El dispositivo de detección según la reivindicación 1 o el sistema según la reivindicación 11 que comprenden además un sistema de control de válvulas por láser acoplado eléctricamente con uno de los varios módulos ópticos.
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