ES2344415T5

ES2344415T5 - Cultivo de bacterias de ácido láctico congelado de gránulos individuales

Info

Publication number: ES2344415T5
Application number: ES05706788T
Authority: ES
Inventors: Rikke Stavnsbjerg; Inge Knap; Hans Bisgaard-Frantzen
Original assignee: Chr Hansen AS
Current assignee: Chr Hansen AS
Priority date: 2004-02-24
Filing date: 2005-02-24
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2025-02-24
Also published as: BRPI0507956B1; CN1922305B; PL1720974T5; JP2011234725A; CA2557496A1; MA28484B1; AU2005215858B2; ZA200606222B; JP2007522809A; EP1720974B2; EA010855B1; ATE466070T1; NO20064300L; EP1720974A1; DK1720974T4; EA200601540A1; AU2005215858A1; EP2223609A1; JP5727308B2; KR20060131854A

Description

DESCRIPCIÓN

Cultivo de bacterias de ácido láctico congelado de gránulos individuales

CAMPO DE LA INVENCIÓN:

[0001] La presente invención se refiere a un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos en un embalaje comercialmente pertinente el cual tiene un peso de al menos 50 g de material congelado, donde el material congelado está presente en forma de gránulos individuales caracterizado por el hecho de que estando almacenado a una temperatura por debajo de la temperatura de fusión inicial (Tm') del cultivo, p. ej. a -46°C, durante 7-14 días los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegan entre sí y en consecuencia permanecen sustancialmente como gránulos individuales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN:

[0002] Hay microorganismos implicados en la producción de alimentos y productos alimenticios incluyendo la mayoría de los productos lácteos. Cultivos bacterianos, en particular cultivos de bacterias las cuales generalmente se clasifican como bacterias de ácido láctico, son esenciales en el proceso de producción de todos los productos lácteos fermentados, quesos y mantequillas. Cultivos de bacterias de este tipo pueden ser referidos como cultivos iniciadores y éstos imparten características específicas a diferentes productos lácteos mediante la realización de varias funciones.

[0003] Los cultivos lácteos iniciadores generalmente están compuestos por bacterias de ácido láctico. En el contexto presente, la expresión "bacterias de ácido láctico" (LAB) designa un grupo de bacterias Gram positivas, catalasas negativas, no móviles, que no producen esporas, microaerofílicas o anaeróbicas que fermentan azúcares con la producción de ácidos orgánicos, incluyendo ácido láctico como el ácido predominantemente producido, ácido fórmico y ácido propiónico. En el presente contexto las bacterias de ácido láctico comprenden varios géneros bacterianos dentro del filo Firmicutes. Los géneros Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosfaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oencoccus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella están reconocidos como LAB. También las bacterias Gram-positivas productoras de ácido láctico pertenecientes al filo Actinobacteria tales como los géneros Aerococcus, Microbacterium y Propionibacterium así como Bifidobacterium se consideran en el contexto presente como LAB. Las bacterias de ácido láctico más útiles a nivel industrial se encuentran entre la especie Lactococcus, la especie Streptococcus, la especie Enterococcus, la especie Lactobacillus, la especie Leuconostoc, la especie Bifidobacterium y la especie Pediococcus. Además de su uso en las bacterias de ácido láctico de la industria lechera los cultivos también tienen mucho uso en la industria del tratamiento cárnico al igual que en otras numerosas industrias.

[0004] Los cultivos iniciadores comerciales se pueden distribuir como cultivos congelados. Los cultivos congelados altamente concentrados son muy interesantes comercialmente ya que los cultivos de este tipo se pueden inocular directamente en el medio de fermentación (p. ej. leche o carne) sin transferencia intermedia. En otras palabras, tales cultivos concentrados altamente congelados comprenden bacterias en una cantidad que hace superfluos los cultivos iniciadores a granel de producción propia en los usuarios finales. Una "iniciadora a granel" se define aquí como un cultivo iniciador propagado en la planta de procesamiento de alimentos para la inoculación dentro del medio de fermentación. Los cultivos altamente concentrados se pueden referir como cultivos de fijación directa de artesa (DVS). Para comprender bacterias suficientes para usarlas como un cultivo DVS en los usuarios finales, un cultivo concentrado congelado generalmente tiene que tener un peso de al menos 50 g y un contenido de bacterias adecuadas de al menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g.

[0005] Un aspecto importante en el uso práctico de cultivos congelados es la conveniencia de la manipulación real de los cultivos. Mientras que los cultivos congelados "en bloque" son difíciles de manejar se ha observado que los cultivos congelados en gránulos son muy fáciles de manejar tanto para el productor como para el consumidor.

[0006] En consecuencia, se ha formado un mercado próspero para los cultivos congelados en gránulos altamente concentrados, denominados como cultivos de fijación directa de artesa congelados (F-DVS).

[0007] Ha habido varias publicaciones concernientes a la viabilidad de los cultivos congelados.

[0008] Chavarri et al. (1988) describe que la viabilidad de un cultivo de Streptococcus lactis puro congelado se puede mejorar por la adición de un 5 % de lactosa o un 5 % de sacarosa.

[0009] Cárcoba et al. (2000) describe que la viabilidad de un cultivo congelado puro de Lactococcus lactis subesp. lactis se puede mejorar por la adición de diferentes agentes crioprotectores tales como azúcares (lactosa, sacarosa y trehalosa), ácido glutámico y gelatina.

[0010] US 4.140.800 (Kline), describe que la viabilidad de los cultivos liofilizados se puede mejorar por la adición de diferentes agentes crioprotectores. También la viabilidad de la lactosa, sacarosa o maltosa añadidas a cultivos congelados, está discutida.

[0011] WO00/39281 (Kringelum et. al.) describe que la viabilidad de un cultivo iniciador líquido no congelado se puede mejorar por la adición de diferentes agentes crioprotectores, y

[0012] WO 2004/065584 A1 (Bisgaard-Frantzen) describe que la viabilidad de un cultivo iniciador congelado altamente concentrado se puede mejorar por la adición de diferentes agentes crioprotectores.

[0013] Sólo WO 2004/065584 A1 describe cultivos congelados en gránulos y ninguna de las publicaciones mencionadas arriba se refiere a la estabilidad física de los cultivos congelados en gránulos durante el almacenamiento.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN:

[0014] Comercialmente, un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos se proporciona normalmente en un paquete adecuado (p. ej. en un envase de tetra pak de cartón de 2 l). Normalmente se almacena a una temperatura de almacenamiento de alrededor de -46°C y el material congelado está presente en forma de gránulos individuales de un peso relativamente pequeño.

[0015] Antes de la presente invención, los inventores presentes creían que no había ningún problema significante con respecto al almacenamiento de tales cultivos de bacterias de ácido láctico (LAB) congelados en gránulos comerciales relevantes.

[0016] No obstante, en base a diferentes estudios los inventores presentes identificaron que cuando varios cultivos comercialmente relevantes donde se almacenan a aproximadamente -46°C durante 7 días o más tiempo los gránulos individuales se pegaban entre sí y hacían aglutinaciones más grandes. En los parámetros industriales la aglutinación crea problemas de manipulación. Es p. ej. significativamente más difícil administrar una dosis adecuada del paquete del cultivo cuando el cultivo está aglutinado. Incluso puede ser difícil sacar el cultivo aglutinado del paquete de una manera conveniente.

[0017] Otros estudios identificaron que los cultivos "problemáticos" se podrían caracterizar por tener un valor T m' (aparición de la fusión a hielo, tal y como se define por Roos (1995)) del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos por debajo de la temperatura de almacenamiento de aproximadamente -46°C. El valor Tm' es un término de la química física estándar usado en la industria alimentaria y en otros lugares. Tm' se mide rutinariamente por técnicas de Caloriometría Diferencial de Barrido (DSC) como se describe por Roos (1991). Se refiere a la temperatura inicial de fusión del producto alimenticio (aquí el cultivo de LAB congelado). Para más detalles se hace referencia a los libros de texto "Food Chemistry" (Química alimentaria) Fennema (1996) y Roos "Phase Transition in Foods" (Transición de fase en los alimentos) (1995).

[0018] Sin estar limitado a la teoría, se cree que cuando un cultivo congelado tiene un valor T m' por debajo de su temperatura de almacenamiento, p. ej. de aproximadamente -46°C, ocurre una transición de fase inicial (fusión) y causa que los gránulos individuales se peguen entre sí y formen aglutinaciones más grandes.

[0019] En resumen, el trabajo de los inventores presentes ha identificado hasta ahora problemas de almacenamiento no reconocidos en relación a la apariencia física de algunos tipos de cultivos de bacterias de ácido láctico congelados en gránulos altamente concentrados comercialmente relevantes. Una vez habiendo identificado este problema, los inventores presentes podrían empezar a intentar resolver el problema.

[0020] Independientemente de cualquier explicación teórica posible, los inventores presentes identificaron que, añadiendo ciertos compuestos aditivos adecuados a un cultivo congelado en gránulos problemático, uno podría obtener un cultivo congelado en gránulos, el cual después de entre 7 y 14 días de almacenamiento a -46°C no formó aglutinaciones de gránulos individuales. Tales cultivos se caracterizaron por el hecho de que los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegaron entre sí y en consecuencia sustancialmente permanecieron como gránulos individuales incluso después de un almacenamiento prolongado a aproximadamente -46°C.

[0021] A nivel global, los compuestos aditivos relevantes pueden estar caracterizados por el hecho de ser capaces de aumentar el valor Tm', del cultivo congelado, hasta un valor sobre la temperatura de almacenamiento, p. ej. -46°C, tal como por ejemplo aumentar el valor Tm' del rango de -70 a -46°C al rango de -45 a -15°C.

[0022] Los ejemplos de funcionamiento describen aquí ejemplos preferidos de compuestos aditivos adecuados. Los compuestos descritos incluyen trehalosa y maltodextrina.

[0023] Como se ha dicho anteriormente, para comprender suficientes bacterias un cultivo congelado altamente concentrado comercialmente relevante generalmente tiene un peso de al menos 50 g y un contenido de bacterias viables de al menos 109 unidades formadoras de colonias (CPU) por g. Los cultivos descritos en los artículos de Chavarri (1988) y Cárcoba (2000) no van dirigidos a la estabilidad física de los cultivos congelados en gránulos, sino más bien a la viabilidad de las bacterias congeladas en el contexto presente no consideradas como cultivos congelados altamente concentrados comercialmente relevantes puesto que éstos se han hecho a una escala mucho más pequeña y comprenden significativamente menos gramos de cultivo congelado, y además los cultivos descritos no son cultivos congelados en gránulos. También, los cultivos descritos por Chavarri (1988) y Cárcoba (2000) no van en absoluto dirigidos a la estabilidad física de los cultivos congelados en gránulos, sino más bien a la viabilidad de las bacterias congeladas.

[0024] Por consiguiente, un primer aspecto de la invención se refiere a un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos en el que las LAB son Lactococcus spp. incluyendo Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. Cremoris en un paquete comercialmente pertinente que tiene un peso de al menos 50 g de material congelado, donde el material congelado está presente en forma de gránulos individuales, con un contenido de bacterias viables de al menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado y comprendiendo de un 0,5 % a un 13 % de un compuesto aditivo medido como p/p del material congelado, donde el compuesto aditivo es un compuesto aditivo que se selecciona del grupo de compuestos aditivos que consiste en Trehalosa y Maltodextrina, y que además se caracteriza por,

si se usa una cantidad del 10 % del compuesto aditivo medido como p/p del material congelado, el compuesto es capaz de aumentar la Tm' (temperatura inicial de fusión del hielo) del cultivo de bacterias de ácido láctico congelado (LAB), el cual sin el compuesto aditivo tiene un valor Tm' de -70°C a -46°C, hasta un valor de Tm' por encima de -46°C de -45°C hasta -15°C (medido por DSC).

y donde el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado se caracteriza por el hecho de que estando almacenado a aproximadamente -46°C durante 7-14 días los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegan entre sí y en consecuencia permanecen sustancialmente como gránulos individuales donde esto se mide por la prueba siguiente:

los gránulos individuales del cultivo congelado son gránulos congelados en nitrógeno líquido y 100 gránulos individuales (alrededor de 5 - 100 g de gránulos) se vierten en una placa de Petri, formando así un estrato fino de gránulos individuales sueltos, estando caracterizado el estrato por el hecho de que la mayoría de los gránulos están en contacto físico con uno o más de sus gránulos contiguos, colocados a aproximadamente -46°C durante 7-14 días y examinados para ver si los gránulos están todavía sueltos o si los gránulos han hecho aglutinaciones o están pegados entre sí, donde el criterio para los gránulos individuales del cultivo congelado que permanecen sustancialmente como gránulos individuales es que al menos 80 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos individuales sueltos, con la excepción de un cultivo congelado de bacterias de ácido láctico (LAB) que comprenden LAB capaces de utilizar la sacarosa.

[0025] La "limitación de responsabilidad" descrita al final del primer aspecto se refiere a la solicitud PCT WO 2004/065584 A1. Esta solicitud se presentó el 19 de enero de 2004. En la fecha de presentación del borrador de solicitud de prioridad de la solicitud presente no se publicó la solicitud PCT WO 2004/065584 A1.

[0026] WO 2004/065584 A1 se refiere a mejorar la viabilidad durante el almacenamiento de un cultivo congelado. No describe el problema del "pegado de los gránulos" de la presente invención. La reivindicación principal general 1 se refiere a "un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado que comprende LAB el cual es adecuado para utilizar sacarosa, tiene un peso de al menos 50 g de material congelado y un contenido de bacterias viables de al menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado, caracterizado por el hecho de que el cultivo congelado comprende de un 0,5 % a un 80 % de un agente crioprotector medido como p/p del material congelado."

[0027] Aunque se describen cultivos congelados en gránulos con agentes crioprotectores en WO 2004/065584 A1, se puede excluir que un experto en la materia llegase inevitablemente a un resultado decreciente dentro de los términos de WO 2004/065584 A1 ya que WO 2004/065584 A1 específicamente sólo reivindica cultivos los cuales son capaces de utilizar sacarosa.

[0028] Con respecto al cultivo congelado de la presente invención, el compuesto aditivo debería añadirse a las bacterias viables preferiblemente antes de que éstas estén congeladas.

[0029] Por consiguiente, en un segundo aspecto la invención se refiere a un método para hacer un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos del primer aspecto de la invención y las formas de realización como se describe en este caso, comprendiendo las siguientes fases:

(i) añadir un compuesto aditivo a las bacterias viables para obtener al menos 50 g de material con un contenido de bacterias viables de al menos 109 unidades formadoras de colonias (CPU) por g de material y comprendiendo el compuesto aditivo en una cantidad de un 0,5 % a un 13 % medido como p/p del material, (ii) congelar el material para obtener material congelado en gránulos, y

(iii) empaquetar el material congelado de una manera adecuada para obtener un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos empaquetado del primer aspecto de la invención y de las formas de realización como se describe en este caso.

[0030] Un cuarto aspecto de la invención se refiere a usar el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos como se ha descrito anteriormente en un proceso para hacer un alimento o producto alimenticio.

DEFINICIONES:

[0031] Antes de una discusión de las formas de realización detalladas de la invención se proporciona una definición de términos específicos relacionados con los aspectos principales de la invención.

[0032] El término "LAB capaces de utilizar sacarosa" denota LAB capaces de fermentar la sacarosa de azúcar con la producción de ácidos. Ésta es la misma definición que en el número de publicación PCT WO 2004/065584 A1.

[0033] El término "material" del cultivo denota las sustancias pertinentes del cultivo incluyendo las bacterias viables y el agente crioprotector. El posible envasado no está incluido. En consecuencia, el peso del material del cultivo no incluye el peso del posible envasado.

[0034] El término "envasado" o "envase" debería entenderse en un sentido amplio. Denota que el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos se debería envasar para proporcionarse al usuario.

Puede ser envasado en una botella, un envase de tetra-pack©, etc.

[0035] El término "un compuesto aditivo" puede ser en el contexto presente un único compuesto aditivo específico o pueden ser dos o más compuestos aditivos diferentes. Por consiguiente, el porcentaje en p/p del/de los compuesto(s) aditivo(s) dentro del material del cultivo debería entenderse como la suma de la cantidad de compuesto(s) aditivo(s). Preferiblemente, el término se refiere a un compuesto que se añade al cultivo después de la fermentación. Por consiguiente, puede ser un compuesto que no está presente en una cantidad significante en el caldo de fermentación del cultivo como tal.

[0036] Los términos "congelado en gránulos" y "cultivo congelado en gránulos" se refieren a un cultivo congelado usando un método que resulta en gránulos o granulado del cultivo congelado. Un cultivo congelado en gránulos se puede hacer convenientemente añadiendo el cultivo gota a gota en N2 líquido formando gránulos congelados o granulado del cultivo congelado. Típicamente, pero no necesariamente, el proceso se realiza en cubetas en una planta de liofilización industrial convencional.

[0037] El término "gránulos" o "granulado" se refiere a pequeñas entidades sólidas formadas por líquido congelado de un tamaño medio de entre 0,1 y 10 mm.

DIBUJOS

[0038] Formas de realización de la presente invención se describen abajo, sólo a modo de ejemplos

Figura 1: La correlación entre la temperatura en la cual ocurre la iniciación de fusión del hielo, Tm', y la cantidad de disacáridos añadida se puede ver en esta figura. Para más detalles, véase el Ejemplo de funcionamiento 3.

La temperatura de almacenamiento, -46°C, se indica por una línea discontinua.

Figura 2: Temperatura de iniciación de fusión del hielo (Tm') (eje Y) de varios cultivos como función de la concentración de maltodexdrina (Glucidex 12) (% p/p) (eje X). El nombre del cultivo seguido de "A" indica que la glicerina se ha añadido al cultivo, B indica que la glicerina no se ha añadido al cultivo antes de la congelación en gránulos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN:

Valor Tm'

[0039] Como se ha explicado anteriormente, el valor Tm' es un término estándar conocido en la química física describiendo la temperatura a la cual ocurre la iniciación de la fusión del hielo. En el contexto presente Tm' denota la temperatura a la cual ocurre la iniciación de fusión de un cultivo de LAB congelado.

[0040] Preferiblemente, el valor Tm' se mide usando el protocolo de DSC descrito en la sección denominada "Medición de Tm" del ejemplo de funcionamiento 1 aquí.

Prueba de aglutinación de los granulos

[0041] Como se ha explicado con respecto al primer aspecto de la invención la prueba para analizar si el cultivo de bacterias del ácido láctico (LAB) congeladas en gránulos es un cultivo que se puede caracterizar por el hecho de que estando almacenado a aproximadamente -46°C (en la situación presente un congelador programado a -50°C tenía una temperatura de muestra de -46°C) durante 7-14 días los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegan entre sí y en consecuencia sustancialmente permanecen como gránulos individuales en una prueba comprendiendo lo siguiente:

Los gránulos individuales del cultivo congelado son gránulos congelados en nitrógeno líquido y 100 gránulos individuales (alrededor de 5 - 100 g de gránulos) se vierten en una placa de Petri, formando así una capa fina de gránulos únicos individuales sueltos, estando caracterizada la capa por el hecho de que la mayoría de los gránulos están en contacto físico con uno o más de sus gránulos contiguos, están colocados a aproximadamente -46°C durante 7-14 días y examinados para ver si los gránulos todavía están sueltos o si los gránulos han formado aglutinaciones o están pegados entre sí, donde el criterio para que los gránulos individuales del cultivo congelado permanezcan sustancialmente como gránulos individuales es que al menos 80 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos únicos individuales sueltos. Más preferiblemente al menos 90 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos únicos individuales sueltos e incluso más preferiblemente al menos 95 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos únicos individuales sueltos.

[0042] El examen y el recuento de los gránulos individuales que permanecen como gránulos únicos individuales sueltos pueden hacerse visualmente. Está dentro de la capacidad del experto en la materia hacer esto de una manera consistente donde los resultados deberían, dentro de una incertidumbre técnica normal limitada, ser consistentes y repetibles. El ejemplo de funcionamiento 1 aquí proporciona otros detalles técnicos.

Un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos

[0043] Preferiblemente, el término "un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado" denota aquí un cultivo que sin comprender el compuesto aditivo añadido como se describe en este caso tiene un valor Tm' de -70 a -46°C. El cultivo puede estar congelado en forma de gránulos o granulado, formando un "cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos". Un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos se puede hacer convenientemente añadiendo el cultivo gota a gota en N2 líquido formando gránulos congelados o granulado del cultivo.

[0044] El LAB del cultivo es un Lactococcus spp. que no utiliza sacarosa según el IDF International Standard 146A:1998 "Identification of Characteristic Microorganisms" (Identificación de microorganismos característicos) usando equipos de prueba API apropiados (bioMérieux SA, Lión, Francia). El equipo API "rapid ID 32 STREP" y "50 CHL Medium" se utiliza para establecer el estado de utilización de sacarosa para la mayoría de géneros de LAB.

[0045] LAB es Lactococcus spp. incluyendo Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris.

[0046] Aunque alguna de estas especies en general se describen como capaces de utilizar mutantes de sacarosa que no son capaces de utilizar sacarosa, han sido, y serán continuamente aislados. Sin importar cómo son aisladas u obtenidas tales mutaciones, éstas todavía son un aspecto de la presente invención.

[0047] Las bacterias de ácido láctico más útiles industrialmente se encuentran entre la especie Lactococcus, la especie Streptococcus, la especie Enterococcus, la especie Lactobacillus, la especie Leuconostoc y la especie Pediococcus.

[0048] El término "cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) mezclado" denota un cultivo mezclado que comprende dos o más especies de LAB diferentes. El término un "cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) puro" denota un cultivo puro que comprende sólo una única especie de la especie LAB.

[0049] El cultivo como se describe en este caso puede ser un cultivo mesofílico que consiste en bacterias mesofílicas que tienen temperaturas de crecimiento óptimo a aproximadamente 30°C. Un "cultivo mesofílico" es un cultivo que comprende dos o más especies LAB mesofílicas diferentes.

[0050] Un así denominado cultivo O se utiliza para hacer queso sin agujeros (Cheddar, Cheshire, Feta) y típicamente comprende uno o más organismos seleccionados del grupo comprendiendo Lactococcus lactis subesp. lactis y Lactococcus lactis subesp. cremoris. En general los cultivos O se considera que no utilizan sacarosa.

Cultivos de bacterias de ácido láctico congelados en gránulos altamente concentrados

[0051] Los cultivos congelados como se describe en este caso son lo que en la industria alimentaria se puede denominar como cultivos de bacterias de ácido láctico congelados en gránulos altamente concentrados. Para comprender bacterias suficientes, tales cultivos deberían ser relativamente grandes (tener un peso suficiente) combinados con una concentración relativamente alta de bacterias viables. Es obvio que, si se requieren relativamente más bacterias, el peso y/o la concentración de bacterias viables deberían aumentar.

[0052] Preferiblemente, un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos como se describe en este caso tiene un peso de al menos 100 g de material congelado, más preferiblemente un peso de al menos 250 g de material congelado, incluso más preferiblemente un peso de al menos 500 g de material congelado y de la forma más preferible un peso de al menos 900 g de material congelado. Preferiblemente, el peso del material congelado es inferior a 500 kg.

[0053] Preferiblemente, un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos como se describe en este caso tiene un contenido de bacterias viables de al menos 5x109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado, más preferiblemente un contenido de bacterias viables de al menos 1010 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado, y de la forma más preferible un contenido de bacterias viables de al menos 2x1010 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado.

[0054] La fermentación y los medios de fermentación adecuados para las LAB que se conocen en la técnica y por el experto en la materia son capaces de seleccionar unos medios adecuados y condiciones de fermentación en relación a las LAB específicas. Medios adecuados y fermentaciones se dan en la sección del ejemplo de funcionamiento aquí.

[0055] Para obtener una cantidad suficiente de bacterias, se prefiere en el contexto presente hacer una fermentación a escala relativamente grande en tanques de fermentación grandes adecuados. Se prefieren tanques de fermentación de al menos 50 l, preferiblemente al menos 90 l, incluso más preferiblemente 500 l o más.

[0056] Después de una fermentación adecuada, las bacterias viables preferiblemente se aíslan por eliminación del líquido (sobrenadante) de los medios de fermentación (p. ej. por centrifugado). Las bacterias aisladas viables pueden denominarse como la biomasa aislada. Las bacterias aisladas viables deberán tener preferiblemente un contenido de bacterias viables de al menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado, más preferiblemente un contenido de al menos 5x109 CFU por g de material congelado, y de la forma más preferible un contenido de al menos 1010 CFU por g de material congelado.

[0057] Después de añadir el compuesto aditivo (véase abajo) al cultivo concentrado. El cultivo se puede congelar convenientemente añadiendo la mezcla gota a gota en N2 líquido formando gránulos congelados o granulado de la mezcla. Un método realizable para el proceso de congelación se describe en DE2805676 y FR2393251.

[0058] El cultivo congelado en gránulos se envasa luego de una manera adecuada para proporcionarse al usuario.

Compuesto aditivo

[0059] Como se ha mencionado anteriormente, preferiblemente los compuestos aditivos pertinentes se caracterizan por el hecho de que estos son capaces de aumentar el valor Tm', del cultivo congelado, hasta un valor sobre la temperatura de almacenamiento, p. ej. -46°C, tal como a un valor Tm' de -45°C a -15°C, más preferiblemente hasta un valor Tm' de -43°C a -15°C e incluso más preferiblemente hasta un valor Tm' de -39°C a -15°C.

[0060] El ejemplo de funcionamiento 2 aquí ilustra una estrategia rápida experimental para identificar compuestos aditivos pertinentes. A un cultivo congelado "modelo" con un valor Tm' por debajo de -46 °C (en el cultivo "modelo" del ejemplo 2 tiene un valor Tm' de -54°C) se añadieron diferentes compuestos pertinentes (10 % p/p) y se midieron los valores Tm' antes y después de la adición por DSC.

[0061] El cultivo "modelo" del ejemplo 2 y el protocolo de prueba de este ejemplo 2 se usa preferiblemente para evaluar si los compuestos aditivos específicos de interés pueden caracterizarse por el hecho de que éstos son capaces de aumentar el valor Tm', del cultivo congelado, hasta un valor sobre los -46°C tal como hasta un valor Tm' de -45°C a -15°C, más preferiblemente hasta un valor Tm' de -43°C a -15°C, incluso más preferiblemente hasta un valor T m' de -39°C a -15°C.

[0062] En el ejemplo de funcionamiento 2 se puede observar que la ciclodextrina aumentó la Tm' a -44°C, el maltitol aumentó la Tm' a -42°C, la trehalosa aumentó la Tm' a -38°C, la gelatina de pez aumentó la Tm' a - 37°C, la maltodextrina aumentó la Tm' a -32°C y la goma de pulverización aumentó la Tm' a -3°C.

[0063] El cultivo congelado comprende de un 0,5 % a un 13 % de un compuesto aditivo medido como p/p del material congelado, preferiblemente de un 1 % a un 12 % de un compuesto aditivo medido como p/p del material congelado, más preferiblemente de un 2 % a un 10 % de un compuesto aditivo medido como p/p del material congelado e incluso más preferiblemente de un 5 % a un 10 % de un compuesto aditivo medido como p/p del material congelado.

[0064] La adición del compuesto aditivo, que también puede ser un agente crioprotector, después de la fermentación, para las bacterias aisladas viables (biomasa) puede hacerse mezclando el compuesto aditivo sólido con la biomasa durante p. ej.30 minutos a una temperatura adecuada. Si el agente del compuesto aditivo es p. ej. maltodextrina una temperatura adecuada puede ser la temperatura ambiente. De forma alternativa, se puede mezclar una solución estéril del compuesto aditivo con la biomasa.

Un método para hacer un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas en gránulos

[0065] Como se ha dicho anteriormente, un segundo aspecto de la invención se refiere a un método para hacer un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas en gránulos del primer aspecto de la invención comprendiendo las fases siguientes:

(i) añadir un compuesto aditivo a bacterias viables para obtener al menos 50 g de material con un contenido de bacterias viables de al menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material y comprendiendo el compuesto aditivo en una cantidad del 0,5 % al 13 % medido como p/p del material,

(ii) congelar el material para obtener material congelado en gránulos, y

(iii) envasar el material congelado en gránulos de una manera adecuada.

[0066] Como se ha mencionado anteriormente, los cultivos "problemáticos" más relevantes aquí son los cultivos de bacterias de ácido láctico (LAB) congelados en gránulos los cuales sin comprender el compuesto aditivo añadido como se describe en este caso tiene un valor T m' de entre -70°C y -46°C.

[0067] Por consiguiente, en una forma de realización preferida antes de añadir el compuesto aditivo según la etapa (i) anterior uno ha medido el valor Tm' del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado sin comprender el compuesto aditivo y ha identificado que éste tiene un valor Tm' de entre -70°C y -46°C o incluso menos.

[0068] Antes de hacer la adición del compuesto aditivo según la etapa (i) anterior uno ha realizado una prueba de aglutinación del granulado (véase arriba) y ha identificado que los gránulos individuales del cultivo congelado se pegan entre sí en un almacenamiento a -46°C.

[0069] Preferiblemente, después de la adición del compuesto aditivo el valor Tm' del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas comprendiendo el compuesto aditivo se mide y se verifica que el valor Tm' es superior a -46°C, preferiblemente de -45°C a -15°C, más preferiblemente de -43°C a -15°C e incluso más preferiblemente de -39°C a -15°C.

[0070] Finalmente, después de la adición del compuesto aditivo el cultivo se congela en gránulos y se realiza una prueba de aglutinación de los gránulos (véase arriba) asegurando que al menos 80 de los 100 gránulos individuales permanecen como gránulos únicos individuales sueltos.

Uso del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado

[0071] Un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado como se describe en este caso se puede utilizar en un proceso para hacer un alimento o producto alimenticio según la técnica.

EJEMPLOS:

Ejemplo 1:

[0072] R604-E (un cultivo O congelado disponible comercialmente, Chr. Hansen A/S, Dinamarca) tiende a formar gránulos pegajosos durante el almacenamiento congelado. En el estudio presente este problema se aborda echando un vistazo más de cerca a la temperatura de fusión, e intentando aumentarla añadiendo caseinato, sacarosa o maltodextrina.

Objetivo:

[0073] Evaluar si es posible elevar el punto de fusión de F-DVS de R604-E usando aditivos.

[0074] El efecto de usar aditivos para elevar el punto de fusión de R604-E se evalúa:

visualmente, y

midiendo el Tm' por DSC para cada una de las formulaciones evaluadas.

i) Material:

[0075] 2 kilos de cultivo disponible comercialmente, F-DVS R 604-E (Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Dinamarca, lote 2441258, material n°. 616581).

ii) Solución de aditivos usada para formulación para elevar el punto de fusión:

[0076]

un 50 % (p/p) de solución de sacarosa (Danisco, Dinamarca).

un 0 % (p/p) de solución de Na-caseinato (Arla, Dinamarca).

un 30 % (p/p) de solución de malto dextrina DE 10 (Glucidex 10, Roquette Fréres, Lestrem, Francia). un 30 % (p/p) de solución de malto dextrina DE 2 (Glucidex 2, Roquette Fréres, Lestrem, Francia). iii) Receta para la formulación de F-DVS R604-E:

[0077] El concentrado congelado se descongeló y mezcló con aditivos según la Tabla 1.

Tabla 1 Formulaciones de R604-E

Evaluación visual del punto de fusión de F-DVS R604.

[0078] Las 6 formulaciones de F-DVS R-604 E se congelaron en gránulos en nitrógeno líquido y 100 gránulos individuales (alrededor de 20 - 30 g) de gránulos se vertieron en placas de Petri, formando así un estrato fino de gránulos únicos sueltos.

[0079] Una muestra de cada una de las formulaciones se colocó en un congelador programado a -50 °C, la temperatura real de las muestras era de - 46 °C. Después de 7 días de almacenamiento las muestras se examinaron para ver si éstas todavía estaban sueltas o si los gránulos habían hecho aglutinaciones o parecían pegajosos, y de ser así, su disposición para agitarse hasta obtener de nuevo partículas sueltas.

Tabla 2 Ins ección visual de los ránulos con elados Tm' medida

Medición de Tm':

[0080] Las muestras se prepararon en 100 pl de crisoles de alúmina y se congelaron en nitrógeno líquido. Una muestra de cada una de las formulaciones y de F-DVS R604 se guardó durante 6 días a -46°C.

[0081] La transición de fase se midió en un Calorímetro por Análisis Diferencial Mettler Toledo 822e (una DSC) con 100 pl de crisoles de alúmina, un programa de temperatura, una temperatura insertada de -90°C, un programa de temp. de análisis: 5°C/min. -130°C -0°C.

[0082] Se midieron los valores Tm' (inicio de fusión del hielo, tal y como se define por Roos (1995)). Los resultados se muestran en la Tabla 2.

[0083] Observamos que el uso de un > 6 % de sacarosa y un 6 % de malto dextrina (2 ó 10) aumenta el valor Tm' de los gránulos congelados. No es posible ver ningún efecto del Na-caseinato. A partir de la inspección visual un 10 % de sacarosa y las dos diferentes maltodextrinas muestran un efecto positivo contra la tendencia a hacer gránulos pegajosos.

Ejemplo 2:

Objetivo

[0084] Para identificar qué clase de aditivos podían elevar el punto de fusión del cultivo congelado se hizo un estudio de selección. Se evaluaron los aditivos siguientes:

Trehalosa, malto dextrina 12, ciclo dextrina, goma de pulverización, PEG, gelatina de pez, maltitol, cloruro sódico, glicerol.

i) Material:

[0085] F-DVS R 604-E (lote 2471755, material 616581) para más detalles por favor véase el Ejemplo 1.

ii) La solución de aditivos usada para la formulación para elevar el punto de fusión:

[0086]

50 % (p/p) de trehalosa.

30 % (p/p) de malto dextrina DE 12 (Glucidex 12, Roquette Fréres, Lestrem, Francia).

30 % (p/p) de ciclodextrina

30 % (p/p) de goma de pulverización (IRX 51693 de CNI)

30 % (p/p) de PEG (PEG 6000, Merck, Alemania)

30 % (p/p) de gelatina de pez bloom 200 (SKW Biosystems, Francia)

30 % (p/p) de maltitol

30 % (p/p) de cloruro sódico

30 % (p/p) de glicerol iii)

iii) Receta para la formulación de F-DVS R604-E:

[0087] El concentrado F-DVS R604-E congelado se descongeló y se mezcló con los diferentes aditivos hasta una formulación final del 10 % (p/p).

Medición de Tm':

[0088] Las muestras se prepararon en 100 pl de crisoles de alúmina y se congelaron en nitrógeno líquido. Las curvas de transición de fase se registraron en el Calorímetro por Análisis Diferencial Mettler Toledo 822e para las 9 formulaciones y se compararon con la muestra de referencia (R604E sin aditivos). Las muestras se insertaron en la DSC a -90°C y se utilizaron usando el programa de temperatura: temperatura de inserto -90°C; temperatura de análisis 7°C /min de -130°C a 0°C.

Resultado:

[0089] Se hicieron las curvas de transición de fase y se determinaron los valores Tm' como se describe por Roos (1991) los valores se dan en la tabla 3 abajo:

Tabla 3 Tm' observada °C.

[0090] La Tm' de la muestra de referencia es de -54°C (inicio de fusión del hielo).

[0091] Los aditivos siguientes elevan la Tm':

PEG (-53°C),

Ciclodextrina (-44°C),

Maltitol (-42°C),

Trehalosa (-38°C)

Gelatina de pez (-37°C)

Maltodextrina 12 (-32°C)

Goma de pulverización (-31 °C)

[0092] El glicerol y el cloruro sódico no elevaron el punto de fusión de los gránulos del cultivo congelados.

Referencia

Ejemplo 3:

[0093] En esta prueba se pretendía evaluar la relación entre la cantidad de aditivo y el aumento de la Tm' medida en el DSC.

i) Material:

[0094] F-DVS CH N 19 (lote 2421868) (cultivos LD congelados disponibles comercialmente, Chr. Hansen A/S, Dinamarca).

Tabla 4. Formulación CH N19 usando sacarosa trehalosa como a entes aditivos.

ii) La soluciones aditivas usadas para la formulación para elevar el punto de fusión:

[0095] La concentración de sacarosa por gramo de biomasa varió del 3 % (p/p) al 13 % (p/p). La trehalosa sólo se evaluó en un nivel del 5 % (p/p). Todas las concentraciones de sacarosa se prepararon a partir de un 50 % (p/p) de solución de sacarosa añadida a la biomasa. La concentración de trehalosa se obtuvo a partir de un 40 % (p/p) de solución.

Medición de Tm':

[0096] El concentrado F-DVS R604-E congelado se descongeló y se mezcló con los diferentes aditivos como se indica en la tabla 4. Luego las muestras se transfirieron a 100 pl de crisoles de alúmina y se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -46°C antes de analizarse. Las curvas de transición de fase se registraron en la DSC para las 8 formulaciones y se compararon con la muestra de referencia (R604E sin aditivos). Las muestras se insertaron en la DSC a -90°C y se utilizaron usando el programa de temperatura: temperatura de inserto -90°C; temperatura de análisis: 5°C/min. -130°C -0°C.

[0097] A partir de estas curvas de transición de fase se obtiene la Tm'. La correlación entre la Tm' y la cantidad de disacáridos añadidos puede verse en la Figura 1.

[0098] A partir de la Figura 1 se puede observar que un 8 % de sacarosa y más asegurará que el cultivo congelado no comienza a fusionarse a un almacenamiento de -46 °C.

Ejemplo 4

[0099] Los cultivos disponibles comercialmente de Chr. Hansen A/S, Dinamarca (CV, HPS, HP-1, LP, LL-2) se analizaron para obtener el punto de fusión inicial antes y después de la adición de maltodextrina (Glucidex 12 de Roquette Fréres, Lestrem, Francia). Los productos se venden como gránulos congelados, y estos deberían mantenerse sueltos lo cual se asegura mediante un punto de fusión inicial por encima de la temperatura de almacenamiento.

Objetivo:

[0100] El objetivo del estudio presente fue elevar el punto de fusión inicial por encima de la temperatura de almacenamiento para obtener gránulos sueltos.

Materiales y métodos:

i) Materiales

[0101] Glucidex 12 (roquette Fréres, Lestrem, Francia) se usó como compuesto aditivo.

[0102] 100 g de cada uno de los cultivos catalogados se usaron en la Tabla 5. B indica que la glicerina no se añadió al cultivo, donde como A indica que un 10 % v/v de glicerina se añadió antes de la congelación a gránulos.

Tabla 5: Cultivos usados

ii) Receta para la formulación de las muestras:

[0103] Los cultivos concentrados congelados se descongelaron y mezclaron con las diferentes cantidades de una solución de Glucidex 12 hasta obtener una formulación final de un 3,5 % a un 10,1 % (p/p).

[0104] Las diferentes formulaciones se catalogan en la Tabla 6.

iii) Medición de Tm':

[0105] Las muestras se prepararon en 100 pl de crisoles de alúmina. Las curvas de transición de fase se registraron en el DSC Mettlet para todas las formulaciones. Las muestras se insertaron en la DSC a -90°C. Programa de temperatura de análisis: 7°C/min. -100°C -0°C.

iiii) Evaluación visual del punto de fusión de F-DVS R604.

[0106] Las formulaciones se congelaron a gránulos en nitrógeno líquido y 100 gránulos individuales (alrededor de 20 - 30 g) de los gránulos se vertieron en placas de Petri, formando así un estrato fino de gránulos únicos sueltos. Una muestra de cada una de las formulaciones se colocó a -46 °C. Después de 14 días de almacenamiento las muestras se examinaron para ver si éstas todavía estaban sueltas o si los gránulos habían hecho aglutinaciones o parecían pegajosos, y de ser así, su disposición para agitarse hasta conseguir que las partículas vuelvan a estar sueltas.

Resultados:

[0107] Los resultados de añadir maltodextrina (Glucidex 12) a cultivos diferentes en diferentes cantidades se muestran en la Figura 1. Está claro que aumentar la concentración de maltodextrina eleva la Tm'. En la Tabla 2 se catalogan los resultados de evaluar la pegajosidad/aglutinación. Muestras con una Tm' superior a la temperatura de almacenamiento de -46°C eran gránulos sueltos donde como las muestras que tienen una Tm' inferior a -46°C se pegaban entre sí.

Tabla 6: Formulaciones de muestras, temperatura de fusión inicial (Tm') e ins ección visual de los ránulos con elados.

[0108] El resultado se ilustra en la tabla 6 y en la Fig. 2 y muestra que la maltodextrina es un agente eficaz para elevar la Tm' en cultivos conteniendo un 10 % p/p de glicerina (serie A) también en cultivos no conteniendo glicerina (serie B). Este experimento demuestra además que un crioprotector bien conocido (es decir, glicerina) no puede utilizarse para aumentar la estabilidad física durante el almacenamiento de un cultivo congelado en gránulos

REFERENCIAS:

[0109]

Cárcoba, R. et al., "Influence of cryoprotectants on the viability and acidifying activity of frozen and freeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcus lactis subsp. lactis CECT 5180", Eur Food Res Technol (2000) 211, 433 - 437

Chavarri, F.J. et al, "Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from non-bitter Streptococcus Lactis strains" Biotechnology letters, vol 10, 1, 11- 16 (1988)

DE2805676, (Jespersen et al.), 18 de agosto de 1978.

Fennema O. R. (ed.) Food Chemistry, 3. ed. Marcel Dekker, 1067 pp. (ISBN: 0-8247-9346-3), 1996. FR2393251, (Jespersen et al.), 29 de diciembre de 1978.

IDF (1998), International IDF Standard 146A:1998 "Identification of Characteristic Microorganisms". Roos, Y. and M. Karel (1991) Phase transitions of amorphous sucrose and frozen sucrose solutions. J. Food Science, 56:266-267.

ROOS, Y. Phase Transition in Foods.

ACADEMIC PRESS, New York, USA. 360 pp., (ISBN: 0-12-595340-2), 1995.

US 4.140.800 (Leo Kline) 20 de febrero de 1979.

WO 00/39281 (Kringelum et al.) 6 de julio de 2000.

WO 2004/065584 A1 (Bisgaard-Frantzen et al.) 5 de agosto de 2004 (similar al Número de Solicitud Internacional PCT/DK2004/000025)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos, donde LAB es un Lactococcus spp. incluyendo Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris en un paquete comercialmente pertinente el cual tiene un peso de al menos 50 g de material congelado, donde el material congelado está presente en forma de gránulos individuales, con un contenido de bacterias viables de al menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado y comprendiendo de un 0,5 % a un 13 % de un compuesto aditivo medido en p/p del material congelado, donde el compuesto aditivo es un compuesto aditivo que se selecciona del grupo de compuestos aditivos que consisten en trehalosa y maltodextrina,y el cual además se caracteriza por el hecho de que,

al usar una cantidad del 10 % del compuesto aditivo medido en p/p del material congelado, el compuesto es capaz de aumentar la Tm' (temperatura de iniciación de fusión a hielo) del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas, que sin el compuesto aditivo tiene un valor Tm' de -70°C a -46°C, a un valor Tm' por encima de -46°C, tal como de -45°C a -15°C (medido por DSC)

y donde el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas se caracteriza por el hecho de que estando almacenado a aproximadamente -46°C durante 7-14 días los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegan entre sí y en consecuencia sustancialmente permanecen como gránulos individuales donde esto se mide mediante la siguiente prueba

los gránulos individuales del cultivo congelado son gránulos congelados en nitrógeno líquido y 100 gránulos individuales (aproximadamente 5 - 100 g de gránulos) se vierten en una placa de Petri, formando así una capa fina de gránulos únicos individuales sueltos, estando caracterizada la capa por que la mayoría de los gránulos están en contacto físico con uno o más de sus gránulos contiguos, puestos a aproximadamente -46 °C durante 7 14 días y examinados para ver si los gránulos todavía están sueltos o si los gránulos han formado aglutinaciones o están pegados entre sí donde el criterio para que los gránulos individuales del cultivo congelado permanezcan sustancialmente como gránulos individuales es que al menos 80 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos únicos individuales sueltos;

con la excepción de un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado que comprende LAB que son capaces de utilizar sacarosa.

2. Cultivo congelado en gránulos según la reivindicación 1, donde el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado es un cultivo que sin comprender el compuesto aditivo según la reivindicación 1 tiene un valor Tm' de -70°C a -46°C.

3. Cultivo congelado en gránulos de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el cultivo de bacterias de ácido láctico congelado comprende de un 5 % a un 10 % del compuesto aditivo medido en p/p del material congelado.

4. Método para hacer un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende las siguientes etapas:

(i) añadir un compuesto aditivo a bacterias viables para obtener al menos 50 g de material con un contenido de bacterias viables de al menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material y que comprende el compuesto aditivo en una cantidad de un 0,5 % a un 13 % medido en p/p del material,

(ii) congelar el material para obtener material congelado en gránulos, y

(iii) envasar el material congelado en gránulos de una manera adecuada para obtener un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado envasado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Método según la reivindicación 4, donde antes de añadir el compuesto aditivo según la etapa (i) de la reivindicación 4 uno ha medido el valor Tm' del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado sin comprender el compuesto aditivo y ha identificado que este tiene un valor Tm' de entre -70°C y -46°C; y

después de añadir el compuesto aditivo se mide el valor Tm' del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado que comprende el compuesto aditivo medido y se verifica que el valor Tm' sea de -49°C a -15°C, más preferiblemente de -39°C a -15°C.

6. Método según la reivindicación 4 ó 5, donde el cultivo de bacterias de ácido láctico congeladas comprende de un 5 % a un 10 % del compuesto aditivo medido en p/p del material congelado.

7. Uso del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un proceso para fabricar un alimento o producto alimenticio.