MXPA06009060A - Cultivo bacteriano de acido lactico congelado de granulos individuales - Google Patents

Abstract

Un cultivo de bacterias deácido láctico (LAB) congelado en un empaque pertinente comercialmente que tiene un peso de por lo menos 50 g de material congelado, en donde el material congelado estápresente en la forma de gránulos individuales caracterizados porque cuando se almacenan a -46ºC por 7-14 días los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegan unos a otros y por lo tanto permanecen sustancialmente como gránulos individuales.

Description

CULTIVO BACTERIANO DE ACIDO LÁCTICO CONGELADO DE GRANULOS INDIVIDUALES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a un cultivo bacteriano de ácido láctico (LAB por sus siglas en inglés) congelado granulado en un empaque pertinente comercialmente que tiene un peso de por lo menos 50 g de material congelado, en donde el material congelado está presente en la forma de granulos individuales caracterizados por el hecho de que cuando se almacenan a una temperatura por debajo de la temperatura de fusión inicial (Tm' ) del cultivo, por ejemplo, a -46aC, por 7-14 días los granulos individuales del cultivo congelado no se pegan entre sí y por lo tanto permanecen sustancialmente como granulos individuales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los microorganismos están involucrados en la fabricación de alimentos y productos alimenticios que incluyen la mayoría de los productos lácteos. Los cultivos bacterianos, en particular cultivos de bacterias que generalmente están clasificadas como bacterias de ácido láctico, son esenciales en la fabricación de todos los productos de leche fermentados, queso y mantequilla. Los cultivos de las bacterias se pueden referir como fermentos lácteos e imparten REF. : 174708 imparten características específicas a varios productos lácteos mediante la realización de un sinnúmero de funciones. Los cultivos de fermentos lácticos lácteos generalmente se componen de bacterias de ácido láctico. En el contexto presente, la expresión ^bacterias de ácido láctico" (LAB) designa a un grupo de bacterias Gram positivas, catalasa negativo, no móviles, sin formación de esporas, icroaerofílicas o anaeróbicas las cuales fermentan azúcares con la producción de ácidos orgánicos, incluyendo ácido láctico como el ácido producido predominantemente, ácido fórmico y ácido propiónico. En el contexto presente las bacterias de ácido láctico comprenden un sinnúmero de géneros bacterianos dentro del filum Firmicutes . Los géneros Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus , Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus , Onenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus , Vagococcus y Weissella son reconocidos como LAB. También las bacterias Gram positivas que producen ácido láctico pertenece al filum Actinobacteria tal como los géneros Aerococcus, Microbacterium y Propionibacterium además de BífidoJacterium que están en el contexto presente consideradas como LAB. Las bacterias de ácido láctico más útiles industrialmente se encuentran entre la especie Lactococcus, especie Streptococcus, especie Enterococcus, especie Lactobacillus, especie Leuconostoc, especie Bifidobacterium y especie Pediococcus . Además para su uso en la industria lechera los cultivos de bacterias de ácido láctico también encuentran amplio uso en la industria de procesamiento de carne además de un sinnúmero de otras industrias . Los fermentos lácteos comerciales se pueden distribuir como cultivos congelados. Los cultivos congelados altamente concentrados son muy interesantes comercialmente puesto que tales cultivos pueden ser inoculados directamente en el medio de fermentación (por ejemplo, leche o carne) sin intermediario de transferencia. En otras palabras, tales cultivos congelados altamente concentrados comprenden bacterias en una cantidad que hace superfluos a los fermentos lácteos en volumen doméstico en los usuarios finales superfluos. Un "fermentador de volumen" se define en la presente como un fermento láctico propagado en la planta de procesamiento de alimento para inoculación en el medio de fermentación. Los cultivos altamente concentrados se pueden definir como cultivos directos de conjunto de tinas (DVS) . Con el propósito de comprender bacterias suficientes para ser usadas como un cultivo DVS en los usuarios finales, un cultivo congelado concentrado generalmente debe tener un peso de por lo menos 50 g y un contenido de bacterias viables de por lo menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g.

Un punto importante en el uso práctico de cultivos congelados es la conveniencia del manejo actual de los cultivos . Considerando que los cultivos congelados "en blogue" son difíciles de manejar se ha encontrado que los cultivos congelados en granulos son muy fáciles de manejar tanto para el productor como para el consumidor. Consecuentemente, se ha formado un mercado próspero para cultivos congelados granulos altamente concentrados llamados cultivos directos de conjunto de tinas congelados (F-DVS) . Han ocurrido un sinnúmero de publicaciones concernientes con la viabilidad de cultivos congelados. Chavarri y colaboradores, (1988) describe que la viabilidad de un cultivo de Streptococcus lactis puro congelado se puede mejorar por la adición de 5% de lactosa o 5% de sacarosa. Cárcoba y colaboradores, (2000) describe que la viabilidad de un cultivo de Lactocossus lactis subespecie Lactis puro congelado se puede mejorar por adición de diferentes agentes crioprotectores tales como azúcares (lactosa, sacarosa y trehalosa) , ácido glutámico y gelatina.

La patente de EUA 4,140,800 (Kline) , describe que la viabilidad de cultivos secos congelados se puede mejorar por adición de diferentes agentes crioprotectores. También se discute la viabilidad de cultivos congelados adicionados con lactosa, sacarosa o maltosa. La WO 00/39281 (Kringelum y colaboradores) describe que la viabilidad de un fermento láctico líquido no congelado se puede mejorar por adición de agentes crioprotectores diferentes, y La WO 2004/065584 Al (Bisgaard-Frantzen) describe que la viabilidad de un fermento láctico congelado altamente concentrado se puede mejorar por adición de diferentes agentes crioprotectores . Solamente la WO 2004/065584 Al describe cultivos congelados granulos y ninguna de las publicaciones mencionadas anteriormente hace referencia a la estabilidad física de los cultivos congelados granulos durante almacenamiento .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Comercialmente, un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado normalmente se proporciona en un empaque apropiado (por ejemplo, en un tetra pack 2 L de caja de cartón) . Normalmente éste se almacena a una temperatura de alrededor de -46°C y el material congelado está presente en la forma de granulos individuales de un peso relativamente pequeño . Antes de la presente invención, los inventores presentes creían que no había problemas significantes con respecto al almacenamiento de cultivos de bacterias de ácido láctico (LAB) congelados granulos pertinentes comerciales. Sin embargo, con base en diferentes estudios los inventores presentes identificaron que cuando un número de cultivos pertinentes comercialmente se almacenaron aproximadamente a -46 °C por 7 días o más los granulos individuales se pegaron y formaron aglutinados más grandes. En el entorno industrial el acumulamiento crea problemas de manejo. Esto es, por ejemplo, significativamente más difícil de administrar una dosis adecuada del empaque de cultivo cuando el cultivo está aglutinado . Aún puede ser más difícil sacar el cultivo aglutinado del empaque en la forma conveniente. Más estudios identifican que los cultivos "problemáticos" se pueden caracterizar por tener un valor de TM' (comienzo de fusión de hielo, como se define por Roos (1995) ) del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado por debajo de la temperatura de almacenamiento de aproximadamente -46°C. El valor de Tm' es un término físico químico estándar usado en la industria alimenticia y en otras. La Tm' rutinariamente se mide por las técnicas de calorimetría de barrido diferencial (DSC) como se describe por Roos (1991) . Se relaciona a la temperatura de comienzo de la fusión del producto alimenticio (en la presente, el cultivo LAB congelado) . Para más detalles se hace referencia a los libros de texto "Food Chemistry" Fennema (1996) y "Phase Transition in Foods" Roos (1995) . Sin estar limitados a la teoría, se cree que cuando un cultivo congelado tiene un valor de Tm' por debajo de su temperatura de almacenamiento, por ejemplo, aproximadamente -46°C, ocurre una transición de fase inicial (fusión) y provoca que los granulos individuales se peguen unos a otros y formen aglutinados grandes . En resumen, el trabajo de los inventores presentes ha identificado problemas de almacenamiento no reconocidos hasta ahora en relación a la apariencia física de algunos tipos de cultivos de bacterias de ácido láctico congelados granulos altamente concentrados pertinentes comercialmente. Una vez habiendo identificado este problema, los inventores presentes pueden empezar a tratar de resolver el problema. Independientemente de cualquier explicación teórica posible, los inventores presentes identificaron que mediante la adición de ciertos compuestos aditivos relevantes a un cultivo congelado granulado problemático, se puede obtener un cultivo congelado granulado, el cual después de 7 a 14 días de almacenamiento a -46 °C no formó aglutinados de granulos individuales. Tales cultivos se caracterizaron porque los granulos individuales del cultivo congelado no se pegaron uno a otro y por lo tanto permanecieron sustancialmente como granulos individuales después de almacenamiento prolongado a aproximadamente -46 °C . En general, los compuestos aditivos relevantes se pueden caracterizar porque son capaces de incrementar el valor de Tm' , del cultivo congelado, a un valor por arriba de la temperatura de almacenamiento, por ejemplo, -46 °C, tal como por ejemplo para aumentar el valor de Tm' del rango de -70 a -46°C hasta el rango de -45 a -15°C. Los ejemplos de trabajo en la presente describen ejemplos preferidos de compuestos aditivos apropiados. Los compuestos descritos incluyen trehalosa, maltodextrina, ciclodextriná, goma de rocío, velo gelatinizado de pescado y maltitol . Con base en el conocimiento general común la persona experta es perfectamente capaz de identificar más compuestos aditivos relevantes que son capaces de aumentar el valor de Tm' , de un cultivo congelado, a un valor por arriba de la temperatura de almacenamiento, por ejemplo, -46 °C. Como se dijo anteriormente, con el propósito de comprender bacterias suficientes un cultivo congelado altamente concentrado pertinente comercialmente generalmente tiene un peso de por lo menos 50 g y un contenido de bacterias viable de por lo menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g. Los cultivos descritos en los artículos de Chavarri (1988) y Carcoba (2000) no están dirigidos a la estabilidad física de los cultivos congelados granulos, más bien a la viabilidad de las bacterias congeladas en el contexto presente sin considerar cultivos congelados altamente concentrados pertinente comercialmente puesto que están hechos en escala menor y comprende significativamente menos gramos de cultivo congelado, y más aún los cultivos descritos no son cultivos congelados granulos. También, los .cultivos descritos por Chavarri (1988) y Carcoba (2000) no se dirigen en absoluto a la estabilidad física de cultivos congelados granulos, sino más bien a la viabilidad de las bacterias congeladas. En consecuencia, un primer aspecto de la invención se relaciona con un cultivo, de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado en un empaque pertinente comercialmente que tiene un peso de por lo menos 50 g de material congelado, en donde el material congelado está presente en la forma de granulos individuales, que tienen un contenido de bacterias viables de por lo menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado y que comprende desde 0.5% hasta 13% de un compuesto aditivo medido como p/p del material congelado. El compuesto aditivo se selecciona del grupo de compuestos que, mediante el uso de una cantidad de 10% del compuesto aditivo medido como p/p del material congelado, son capaces de aumentar la Tm' (temperatura de comienzo de fusión de hielo) del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB_ congelado, el cual sin el compuesto aditivo tiene un valor de Tm' de -70°C hasta -46°C, a un valor de Tm' de -45 hasta -15 °C (medido por DSC) . Además, el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado se caracteriza por que cuando se almacena aproximadamente a -46 °C por 7-14 días los granulos individuales del cultivo congelado no se pegan uno a otro y por lo • tanto permanecen sustancialmente como granulos individuales cuando se miden por la siguiente prueba: Los granulos individuales del cultivo congelado se congelan granulos en nitrógeno líquido y 100 granulos individuales (alrededor de 5-100 g de granulos) se vierten dentro de una caja petri, formando así una capa delgada de granulos únicos individuales sueltos, la capa que se caracteriza en que la mayoría de los granulos están en contacto físico con uno o más de sus granulos vecinos, colocados a aproximadamente -46 °C por 7-14 días y examinados para ver si los granulos todavía están sueltos o si los granulos han formado aglutinados o están pegados unos a otros, en donde el criterio para los granulos individuales del cultivo congelado que permanecen sustancialmente como granulos individuales es que por lo menos 80 de los 100 granulos individuales permanecen como granulos únicos individuales sueltos. Sin embargo, los cultivos de bacterias de ácido láctico (LAB) congelados que comprenden LAB que son- capaces de utilizar sacarosa y en donde el cultivo comprende un compuesto de agente crioprotector seleccionado del grupo que consiste de sacarosa en una cantidad desde 2% hasta 13% de sacarosa medida como p/p del material congelado; y trehalosa en una cantidad de 4% hasta 6% de trehalosa medida como p/p del material congelado; y una mezcla de trehalosa/sacarosa ambas en la cantidad de desde 12% hasta 14% medidas como p/p del material congelado, se exentan específicamente del primer aspecto de esta invención. La "negación" descrita al final del primer aspecto se relaciona a la solicitud de PCT WO 2004/065584 Al. Esta solicitud fue presentada el 19 de enero de 2004. En la fecha de registro de la prioridad que forma la solicitud de la presente solicitud de la solicitud PCT WO 2004/065584 Al no fue publicada. La WO 2004/065584 Al se relaciona con'el mejoramiento de la viabilidad durante el almacenamiento de un cultivo congelado. No describe el problema de "pegado entre granulos" de la presente invención. La reivindicación principal general 1 se relaciona a "un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado que comprende LAB que son capaces de utilizar sacarosa, tiene un peso de por lo menos 50g de material congelado y un contenido de bacterias viables de por lo menos 109 unidades que forman colonias (CFU, por sus siglas en inglés) por g de material congelado, caracterizado porque ese cultivo congelado comprende de 0.5% hasta 80% de un agente crioprotector medido como p/p del material congelado" . Aunque los cultivos congelados de granulos con agentes crioprotectores se describen en WO 2004/06684A1, se puede descartar que una persona experta puede llegar inevitablemente a un resultado que cae dentro de los términos de WO 2004/065584 Al puesto que WO 2004/065584 Al específicamente solamente reivindica cultivos que son capaces de utilizar sacarosa. Con respecto al cultivo congelado de la presente invención, el compuesto aditivo preferiblemente debe ser agregado a las bacterias viables antes de que sean congeladas. En consecuencia, en un segundo aspecto la invención se relaciona a un método para producir un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado del primer aspecto de la invención y las modalidades como se describen en la presente, comprenden los siguientes pasos: (i) adición de un compuesto aditivo a bacterias viables para obtener por lo menos 50 g de material con un contenido de bacterias viables de por lo menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material y que comprende el compuesto aditivo en una cantidad desde 0.5% hasta 13% medido como p/p del material, (ii) congelamiento del material para obtener material congelado granulado, y (iii) empaque del material congelado en una forma apropiada para obtener un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado empacado del primer aspecto de la invención y las modalidades como se describen en la presente . Un tercer aspecto de la invención se relaciona a un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado obtenible por el método para producción de un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado del segundo aspecto de la invención. Un cuarto aspecto de la invención se relaciona al uso del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado descrito anteriormente en un proceso para producción de un alimento o producto alimenticio.

Definiciones Antes de una descripción de las modalidades detalladas de la presente invención se proporciona una definición de los términos relacionados con los principales aspectos de la invención. El término "LAB que son capaces de utilizar sacarosa" denota las, LAB que son capaces de fermentar la sacarosa del azúcar con la producción de ácidos . Es la misma definición que en la publicación PCT número WO 2004/065584 Al. El término "material" de cultivo denota las sustancias relevantes del cultivo que incluyen tanto las bacterias viables como el agente crioprotector. El empaque posible no se incluye. Consecuentemente, el peso del material del cultivo no está incluyendo el peso del empaque posible. El término "empaquetamiento" o "empaque" se debe entender ampliamente. Este denota que el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado se debe empacar con el propósito de ser proporcionado " al usuario. Se puede empacar en una botella, un recipiente de tetra-pack® , etc. El término "un compuesto aditivo", eri el contexto presente, puede ser un compuesto aditivo específico único o pueden ser dos o más compuestos aditivos diferentes. En consecuencia, el porcentaje p/p del o los compuestos aditivos dentro del material de cultivo se" debe entender como la suma de la cantidad de compuestos aditivos. Preferiblemente, el término se relaciona a un compuesto que se agrega al cultivo después de fermentación: Consecuentemente, puede ser un compuesto que no está presente en una cantidad significante en el caldo de fermentación del cultivo como tal . Los término "congelado granulado" y "cultivo congelado granulado" se refieren a un cultivo congelado mediante el uso de un método el cual resulta en granulos o granulos del cultivo congelado. Un cultivo congelado granulado convenientemente se hace por adición de goteo del cultivo dentro del N2 líquido formando granulos o granulos congelados del cultivo. Comúnmente, pero no necesariamente, el proceso se realiza sobre charolas en una planta de secado por congelamiento industrial convencional . " El término "granulos" o "granulos" se refiere a entidades sólidas pequeñas formadas por líquido congelado de un tamaño promedio entre 0.1 y 10 mm. Las modalidades de la presente invención se describen posteriormente, a manera de ejemplos solamente Descripción de las Figuras Figura 1 : La correlación entre la temperatura a la cual ocurre el comienzo de la fusión del hielo, Tm' , y la cantidad de disacáridos agregados se puede ver en esta figura. Para más detalles, ver el Ejemplo 3 de trabajo. La temperatura de almacenamiento, -46°C, está indicada por una línea punteada.

Figura 2 : Temperatura de comienzo de fusión de hielo (Tm' ) (eje Y) de un número de cultivos como una función de la concentración de maltodextrina (glucidex 12) (% p/p) . El nombre del cultivo seguido por "A" indica que la glicerina se ha agregado al cultivo, B indica que la glicerina no fue agregada al cultivo antes de congelamiento del granulado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Valor de Tm' Como se explicó anteriormente, el valor de Tm' es un término conocido estándar en físico química que describe la temperatura en la cual ocurre el comienzo de la fusión del hielo. En el contexto presente Tm' denota la temperatura a la cual ocurre el comienzo de la fusión de un cultivo de LAB congelado . Preferiblemente, el valor de Tm' se mide por el uso del protocolo DSC descrito en la sección llamada "Medición de Tm" del ejemplo de trabajo 1 en la presente.

Evaluación de la aglomeración de granulos. Como se explicó con respecto al primer aspecto de la invención la prueba para analizar si el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado es un cultivo que se puede caracterizar porque cuando se almacena a aproximadamente -46°C (en la situación presente un congelador previamente preparado a -50 °C tuvo una temperatura de muestra de -46°C) por 7-14 días los granulos individuales del cultivo congelado no están pegados unos a otros y por lo tanto sustancialmente permanecen como granulos individuales en una prueba que comprende lo siguiente : Los granulos individuales del cultivo congelado son granulos congelados en nitrógeno líquido y 100 granulos individuales (alrededor de 5-100 g de granulos) se vierten dentro de una caja petri, formando así una capa delgada de granulos únicos individuales sueltos, la capa que se caracteriza en que la mayoría de los granulos están en contacto físico con uno o más de sus granulos vecinos, colocados a aproximadamente -46 °C por 7-14 días y examinados para ver si los granulos todavía están sueltos o si los granulos han hecho aglutinados o están pegados unos con otros, en donde el criterio para que los granulos individuales del cultivo congelado sustancialmente permanezcan como granulos individuales es que por--lo menos 80 de los 100 granulos individuales permanecen como granulos únicos individuales sueltos. Más preferiblemente por lo menos 90 de 100 granulos individuales permanecen como granulos únicos individuales sueltos y aún más preferiblemente por lo menos 95 de los 100 granulos individuales permanecen como granulos únicos individuales sueltos . _ El examen y conteo de los granulos individuales que permanecen como granulos únicos individuales sueltos se puede hacer visualmente. Está dentro de la capacidad de una persona experta hacer esto en una forma consistente cuando los resultados podrían, dentro de la incertidumbre técnica limitada normal, ser consistentes y repetibles . El ejemplo de trabajo 1 en la presente proporciona más detalles técnicos.

Un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado. Preferiblemente, el término "un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado" denota en la presente un cultivo el cual sin comprender el compuesto aditivo agregado como se describe en la presente tienen un valor de Tm' de desde -70hasta -46°C. El cultivo puede estar congelado en la forma de granulos o granulos, que forman un "cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado" . Un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado puede estar hecho convenientemente por adición del goteo de cultivo en N2 líquido que forma granulos o granulos congelados del cultivo. Las LAB del cultivo pueden ser cualquiera en pueden ser cualquiera LAB pertinente comercial en particular que no utilice sacarosa de acuerdo con Estándar IDF Internacional 146A:1998 "Identificación de Microorganismos Característicos" por el uso de kits de prueba API apropiados (bioMériux SA, Lyon, Francia) . El kit API "rapad ID 32 STREP" y "Medio 50 CHL" se usa para estabilizar el estado de utilización de la sacarosa para la mayoría de los géneros de LAB. Preferiblemente, el LAB es un LAB seleccionado del grupo que consiste de especie Bifidobacterium, especie Brevibacterium, especie Propionibacterium gue incluye Lactococcus lactis subespecie lactis y Lactococcus lactis subespecie Cremoris, especie Lactobacillus que incluyen Lactobacillus acidophilus, especie Streptococcus , especie Entercoccus , especie Pediococcus, especie Leuconostoc, especie Oenococcus y especies de hongos que incluyen especie Pencillium, especie Cryptococcus, especie Debraryomyces , especie Klyveromyces y especie Saccharomyces . Aún a pesar de que algunas de estas especies se describen en general como capaces de utilizar mutantes de sacarosa que no son capaces de utilizar sacarosa, han sido, y continuamente serán aisladas. No importa cómo sean aisladas u obtenidas tales mutaciones, son todavía un aspecto de la presente invención. Las bacterias de ácido láctico más útiles industrialmente se encuentran entre especies de Lactococcus, especies de Sptreptococcus , especies de Enterococcus, especies de Lactobacillus , especies de Leuconostoc y especies de Pediococcus . - .

El término "cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado mezcladas" denota un cultivo mezclado que comprende dos o más diferentes especies de LAB. El término un "cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) puro" denota un cultivo puro que comprende solamente una especie de LAB única. El cultivo como se describe en la presente puede ser un cultivo mesofílico que consiste de bacterias mesofílicas que tienen temperaturas de crecimiento óptimas en alrededor de °C. Un "cultivo mesofílico" es un cultivo que comprende dos o más diferentes especies de LAB mesofílicas. Comúnmente los organismos que pertenecen al grupo mesofílico incluyen Lactococcus lactis subespecie lactis, Lactococcus lactis subespecie cremoris , Leuconostoc mesenteroides ' subespecie cremoris, Pediococcus pentosaceus , Lactococcus lactis subespecie lactis biovar. diacetilactis y Lactobacillus casei subespecie casei . Las especies bacterianoes de ácido láctico termofílicas incluyen como ejemplos Streptococcus thermophilus , Enterococcus faecium, Lactobacillus lactis, Lactobacillus Yelveticus, Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus y Lactobacillus acidophilus . El cultivo como se describe en la presente puede comprender LAB que no son capaces de utilizar sacarosa. Un cultivo O así llamado se usa para hacer " queso sin agujeros (Cheddar, Cheshire, Feta) y comúnmente comprende uno o más organismos seleccionados del grupo que comprende Lactococcus lactis subespecie lactis y Lactococcus lactis subespecie cremoris . En general los cultivos O se consideran que no utilizan sacarosa.

Cultivos de bacterias de ácido láctico congelados en granulos altamente concentrados. Los cultivos congelados como se describen en la presente son aquellos que en la industria alimenticia se pueden nombrar cultivo de bacterias de ácido láctico congelados en granulos concentrados . Con el propósito de comprender bacterias suficientes, los cultivos deben ser relativamente grandes (tienen un peso suficiente) combinados con una concentración relativamente alta de bacterias viables. Es obvio que si se requieren relativamente más bacterias, el peso y/o la concentración de las bacterias viables se debe incrementar . Preferiblemente, un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado como se describe en la presente tiene un peso de por lo menos 100 g de material congelado, más preferiblemente un peso de por lo menos 250 g de material congelado, aún más preferiblemente un peso de por lo menos 500 g" de material congelado y más preferiblemente un peso de por lo menos 900 g de material congelado. Preferiblemente, el peso del material congelado es menor que 500 kg. Preferiblemente, un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado como se describe en la presente tiene un contenido de bacterias viables de por lo menos 5x109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado, más preferiblemente un contenido de bacterias viables de por lo menos 1010 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado, y más preferiblemente un contenido de bacterias viables de por lo menos 2x1010 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado. La fermentación y los medios de fermentación apropiados para las LAB se conocen en la técnica y la persona experta es capaz de seleccionar un medio apropiado y condiciones de fermentación en relación a las LAB específicas . El medio apropiado y fermentaciones se dan en la sección de ejemplo de trabajo en la presente. Con el propósito de obtener suficiente cantidad de bacterias, en el presente contexto se prefiere hacer una fermentación relativamente a gran escala en tanques de fermentación grandes apropiados. Son preferidos los tanques de fermentación de por lo menos 50 L, preferiblemente por lo menos 90 L, aún más preferiblemente 500 L o mayores. Después de una fermentación apropiada, las bacterias viables se aislan preferiblemente por remoción del líquido (sobrenadante) del medio de fermentación (por ejemplo, por centrifugación) . Las bacterias viables aisladas pueden ser llamadas la biomasa aislada. Las bacterias viables aisladas preferiblemente deben tener un contenido de bacterias viables de por lo menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado, más preferiblemente un contenido de por lo menos 5x109 CFU por g de material congelado, y más preferiblemente un contenido de por lo menos 1010 CFU por g de material congelado. Después de la adición del compuesto aditivo (ver a continuación) para el cultivo concentrado. El cultivo convenientemente puede ser congelado por adición del goteo de la mezcla en N2 líquido formando granulos o granulos congelados de la mezcla. Un método factible para el proceso de congelamiento se describe en DE2805676 y FR2393251. El cultivo congelado granulado se empaca luego en una forma apropiada con el propósito de ser proporcionado al usuario .

Compuesto aditivo . Como se discute anteriormente, preferiblemente los compuestos aditivos relevantes se caracterizan porque son capaces de incrementar el valor de Tm' , del cultivo congelado, a un valor por arriba de la temperatura de almacenamiento, por ejemplo, -46aC, así como a un valor de Tm' de -452C hasta -152C, más preferiblemente a un valor de Tm' de -43 aC hasta -15aC y aún más preferiblemente hasta un valor de Tm' desde -39SC hasta -15aC. El ejemplo de trabajo 2 en la presente ilustra una estrategia experimental rápida para identificar compuestos aditivos relevantes. A un cultivo congelado "modelo" con un valor de T ' por debajo de -46aC (en el ejemplo 2 el cultivo "modelo" tiene un valor de Tm' de -542C) se agregaron compuestos relevantes diferentes (10% P/P) y el valor de T ' antes y después de la adición se midieron por DSC. El cultivo "modelo" del ejemplo 2 y el protocolo de prueba de este ejemplo 2 preferiblemente se usa para evaluar si los compuestos aditivos específicos de interés se pueden caracterizar por que son capaces de incrementar el valor de Tm' , del cultivo congelado, a un valor por arriba de -46 °C tal como a un valor de Tm' de -45 °C hasta -15 °C, más preferiblemente hasta un valor de Tm' de -43 °C hasta -15 "C, aún más preferiblemente a un valor de Tm' de -39 °C hasta - 15°C. En el ejemplo de trabajo 2 se puede ver que la ciclodextrina aumentó la Tm' a -44 °C, el" Maltitiol aumentó Tm' a -42 °C, la Trehalosa aumento Tm' a -38 °C, la gelatina de pescado aumentó Tm' a -37 °C, la Maltodextrina aumentó Tm' a - 32 °C y la goma de rocío aumentó Tm' a -31 °C. -Preferiblemente, el compuesto aditiva es un compuesto con un peso molecular (PM) desde 150 hasta 100000 g/mol, más preferiblemente 250 hasta 100000 g/mol, aún más preferiblemente desde 300 hasta 40000 g/mol y más preferiblemente desde 500 hasta 15000 g/mol. En una modalidad preferida el compuesto aditivo también es un agente crioprotector. El término "un agente crioprotector" denota una sustancia que es capaz de mejorar la estabilidad de almacenamiento del cultivo congelado medido por viabilidad del cultivo. En el presente contexto éste puede ser un agente crioprotector específico único o pueden ser dos o más agentes diferentes. En consecuencia, el porcentaje p/p del o los agentes crioprotectores dentro del material de cultivo, se debe entender como la suma de la cantidad de agentes crioprotectores . El agente crioprotector preferiblemente se puede seleccionar de proteínas o hidrolisados de proteína. Ejemplos apropiados preferidos de estos incluyen los seleccionados del grupo que consiste de extracto de Malta, polvo de leche espumado', polvo de suero de leche, extracto de levadura, Gluten, Colágeno, Gelatina, Elastina, Keratina, y Albúminas.

Más preferiblemente, el agente crioprotector es un carbohidrato o un compuesto involucrado en la biosíntesis de ácidos nucleicos . Los carbohidratos apropiados preferidos incluyen los seleccionados del grupo que consiste de Pentosas (por ejemplo, Ribosa, Xilosa), Hexosas (por ejemplo, fructosa, mañosa, Sorbosa) , Disacáridos (por ejemplo, Sacarosa, Trehalosa, Melibiosa, Lactulosa) , Olígosacáridos (por ejemplo, Rafinosa), Oligofructosas (por ejemplo, Actilight, Fribrolosas) , Polisacáridos (por ejemplo, Maltodextrinas, Goma de Xantano, Pectina, Algenato, celulosa Microcristalina, Dextrano, PEG) , y alcoholes de Azúcar (Sorbitol, Manitol) . Más preferiblemente, el carbohidrato es un carbohidrato con un peso molecular (PM) desde 150 hasta 100000 g/mol, más preferiblemente 250 hasta 100000 g (mol, aún más preferiblemente desde 300 hasta 40000 g/mol y más preferiblemente desde 500 hasta 15000 g/mol. En una modalidad muy preferida, el compuesto aditivo es un compuesto aditivo seleccionado del grupo que consiste de Ciclodextrina, Maltitol, gelatina de pescado, Maltodextrina (preferiblemente maltodextrina DE 2 a maltodextrina DE 19) , Goma de rocío (por ejemplo, Goma de rocío IRX 51693), inopina-5 ' -monofosfato (IMP) e inosina. El cultivo congelado comprende de 0.5% hasta 13% de un compuesto aditivo medido como p/p del material congelado, preferiblemente desde 1% hasta 12% de un compuesto aditivo medido como p/p del material congelado y más preferiblemente desde 2% hasta 10% de un compuesto aditivo medido como p/p del material -congelado y aún más preferiblemente desde 5% hasta 10% de un compuesto aditivo medido como p/p del material congelado . La adición del compuesto aditivo, el cual también puede ser un agente crioprotector, después de fermentación, a las bacterias viables (biomasa) aisladas se puede hacer por mezclado del compuesto aditivo sólido con la biomasa durante por ejemplo, 30 minutos a una temperatura apropiada. Si el agente del compuesto aditivo es por ejemplo, maltodextrina, una temperatura apropiada puede ser la temperatura ambiente. Alternativamente, se puede mezclar una solución estéril del compuesto aditivo con la biomasa.

Un método para producción de un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado. Como se dijo anteriormente, un segundo aspecto de la invención se relaciona a un método para producir un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado del primer aspecto dé la invención que comprende los siguientes pasos : (i) adición de un compuesto aditivo a las bacterias viables para obtener por lo menos 50 g de material con un contenido de bacterias viables de por lo menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material y que comprende el compuesto aditivo en una cantidad desde 0.5% hasta 13% medido como p/p del material, (ii) congelamiento del material para obtener material congelado granulado, y (iii) empaque del material congelado granulado en una forma apropiada. Como se discute anteriormente, los cultivos "problemáticos" más relevantes en la presente son cultivos de bacterias de ácido láctico (LAB) congelados en granulos, los cuales sin que comprendan el compuesto aditivo agregado como se describe en la presente tiene un valor de Tm' de desde -70aC hasta -46aC. En consecuencia, en una modalidad preferida antes de hacer la adición del compuesto aditivo de acuerdo con el paso (i) anterior, se debe medir el valor de Tm' del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado sin que comprenda el compuesto aditivo e identificar que este tiene un valor de Tm' de desde -702C hasta -46aC o aún menor. Antes de realizar la adición del compuesto aditivo de acuerdo con el paso (i) anterior se ha llevado a cabo una prueba de acumulación de granulos (ver anterior) e identificado que los granulos individuales del cultivo congelado se pegan unos a otros en almacenamiento a -46SC. Preferiblemente, después de la adición del compuesto aditivo el valor de Tm' del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado que comprende el compuesto aditivo se mide y se verifica que el valor de Tm' está por arriba de -46aC, preferiblemente desde -45aC hasta -152C, más preferiblemente desde -432C hasta -15aC y aún más preferiblemente desde -392C hasta -15aC. Finalmente, después de la adición del compuesto aditivo el cultivo se congela y forma un granulo y se realiza una prueba de aglutinamiento de granulado (ver anterior) que asegura que por lo menos 80 de los 100 granulos individuales permanecen como granulos únicos individuales sueltos.

Uso del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado Un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado como se describe en la presente se puede usar en un proceso para producir alimentos o productos alimenticios de acuerdo con la técnica. EJEMPLOS Ejemplo 1: El R604-E (un cultivo 0 congelado disponible comercialmente, Chr. Hansen A/S, Dinamarca) tiende a formar granulos pegajosos durante almacenamiento congelado. En el estudio presente este problema se enfoca al tomar una mirada cercana a la temperatura de fusión, y tratar de aumentarla por adición de caseinato, sacarosa o maltodextrina. Objetivo: Evaluar si es posible aumentar el punto de fusión de F-DVS de R604-E mediante el uso de aditivos. Se evalúa el efecto del uso de aditivos para aumentar el punto de fusión de R604-E: Visualmente, y Por medición de la T ' por DSC para cada una de las formulaciones evaluadas . i) Material: 2 kilos de cultivo disponible comercialmente, F-DVS R 604-E (Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Dinamarca, Lote 2441258, material no. 616581). ii) Solución de aditivos usada para formulación para elevar el punto de fusión: 50% (p/p) de solución de sacarosa (Danisco, Dinamarca) . 10% (p/p) de solución de Na-caseinato (Arla, Dinamarca) . % (p/p) de solución de Malto Dextrin DE 10 (Glucidex 10, Roquette Fréres, Lestrem, Francia) . 30% (p/p) de solución de Malto Dextrin DE 2 (Glucidex 2, Roquette Fréres, Lestrem, Francia) . iii) Receta para formulación de F-DVS R604-E: El concentrado congelado fue deshelado y mezclado con aditivos de acuerdo con la Tabla 1.

Tabla 1. Formulaciones de R604-E *) g de aditivo de materia seca/ g de concentrado Evaluación visual del punto de fusión de F-DVS R604. Las 6 formulaciones de F-DVS R-604 E fueron congeladas en granulos en nitrógeno liquido y 100 granulos individuales (alrededor de 20-30 g) de granulos se vertieron dentro de cajas de petri, formando así una capa delgada de granulos únicos sueltos. Se colocó una muestra de cada una de las formulaciones en un congelador previamente enfriado a -50 °C, la temperatura eñ el momento de las muestras fue de -46°C. Después de 7 días de almacenamiento las muestras se examinaron para ver si todavía estaban sueltas o si los granulos habían hecho aglutinados o parecido "pegajoso -y si es así- su disponibilidad para ser sacudidos para nuevamente ser partículas sueltas.

Tabla 2 ; Inspección visual de granulos congelados y T ' medido .

- = Aglutinado, endurecido o pegajoso, (menos de 20 de los 100 granulos individuales permanecen como granulos únicos individuales sueltos) + = Partículas parcialmente sueltas, (menos de 60 de los 100 granulos individuales permanecen como granulos únicos individuales sueltos) ++ = Partículas casi sueltas. (al menos 80 de los 100 granulos individuales permanecen como granulos únicos individuales sueltos) +++ = Partículas sueltas, (al menos 90 de los 100 granulos individuales permanecen como granulos únicos individuales sueltos) Medición de Tm7 : Las muestras se prepararon en crisoles de alúmina de 100 µL y se congelaron en nitrógeno líquido. Una muestra de cada una de las formulaciones y F-DVS R604 se colocó por 6 días a -46°C. La fase de transición se midió en un Calorímetro de Barrido Diferencial (un DSC) MettIer Toledo 822e con crisoles de alúmina de 100 µL, programa de temperatura, temperatura de inserción -90 °C, programa de temperatura de barrido: 5°C/min. -130°C -0°C. Se midieron los valores de Tm' (comienzo de fusión de hielo, como se definió por Roos (1995) ) . Los resultados se muestran en la tabla 2. Observamos que el uso de sacarosa >6% y malto dextrina 6% (2 ó 10) aumenta el valor de Tm' de granulos congelados. No es posible observar ningún efecto del Na-caseinato. De la inspección visual de sacarosa 10% y las dos diferentes maltodextrinas mostraron efectos positivos contra la tendencia a hacer granulos pegajosos.

Ej emplo 2 : Objetivo Para identificar qué tipo de aditivos pueden aumentar el punto de fusión del cultivo congelado se hizo un estudio de selección por exclusión. Se evaluaron los siguientes aditivos : Trehalosa, Malto dextrina 12, ciclo dextrina, goma de rocío, PEG, gelatina de pescado, maltitol, cloruro de sodio, glicerol . i) Material: F-DVS R 604-E (lote 2471755, material 616581) para detalles favor de ver el Ejemplo 1. ii) Solución de aditivos usados para formulación para aumentar el punto de fusión: 50% (p/p) de trehalosa. 30% (p/p) de Malto Dextrina DE 12 (Glucidex 12, Roquette Fréres, Lestrem, Francia) . 30% (p/p) de ciclodextrina 30% (p/p) de Goma de rocío (IRX 51693 de CNI) 30% (p/p) de PEG (PEG 6000, Merck, Alemania) 30% (p/p) de velo gelatinizado de pescado 200 (SKW Biosystems, Francia) 30% (p/p) de maltitol 30% (p/p) de Cloruro de Sodio 30% (p/p) de glicerol iii) Receta para formulación de F-DVS R604-E: El concentrado de F-DVS R604-E congelado se desheló y mezcló con los diferentes aditivos para una formulación final de 10% (P/P) .

Medición de Tm' : Las muestras se prepararon en crisoles de alúmina de 100 µL y se congelaron en nitrógeno líquido. Las curvas de transición de fase fueron registradas en el Calorímetro de Barrido Diferencial MettIer Toledo 822c para las 9 formulaciones y se compararon con la muestra de referencia (R604E sin aditivos) . Las muestras se insertaron al DSC a -90°C y se corrieron usando el programa de temperatura: temperatura de inserción 90°C, escaneo de temperatura 7°C/min desde -130°C hasta 0°C.

Resultado: Las curvas de transición de fase se hicieron y los valores de Tm' se determinaron como se describe por Roos (1991) los valores se dan en la tabla 3 a continuación : Tabla 3; T ' Observada (°C) La Tm' para la muestra de referencia se encontró que es de -54 °C (comienzo de fusión del hielo) . Los siguientes aditivos están incrementando la Tm' : PEG (-53° C) , Ciclodextrina (-44 °C) , Maltitol (-42 °C) , Trehalosa (-38 °C) Gelatina de pescado (-37 °C) Maltodextrina 12 (-32 °C) Goma de rocío (-31 °C) El glicerol y el cloruro de sodio no aumentaron el punto de fusión de los granulos de cultivo congelados.

EJEMPLO 3: En esta prueba la intención fue evaluar la relación entra la cantidad de aditivo y el aumento en la medición de Tm' en DSC. i) Material: F-DVS CH N 19 (Lote 2421868) (cultivos LD congelados disponibles comercialmente, Chr. Hansen A/S, Dinamarca) .

Tabla 4. Formulación CH N19 usando sacarosa y trehalosa como agentes aditivos . ii) Soluciones de aditivo usadas para formulación para aumentar el punto de fusión: La concentración de sacarosa por gramo de biomasa varió desde 3% (p/p) hasta 13% (p/p) . La trehalosa se evaluó solamente en un nivel de 5% (p/p) . Todas las concentraciones de sacarosa se prepararon a partir de una solución de sacarosa al 50% (p/p) agregada a la biomasa. La concentración de trehalosa se preparó a partir de una solución de 40% (p/p) Medición de Tm' : El concentrado F-DVS R604-E congelado se desheló y mezcló con los aditivos diferentes como se indica en la tabla 4. Luego las muestras fueron transferidas a crisoles de alúmina de 100 µL y se congelaron en nitrógeno líquido y almacenaron a -46°C antes de analizar. Las curvas de transición de fase se registraron en el DSC para las 8 formulaciones y se compararon con la muestra de referencia (R604E sin aditivos) . Las muestras se insertaron en el DSC a -90°C y corrieron usando el programa de temperatura: temperatura de inserción -90 °C; barrido de temperatura: 5°C/min. -130°C-0°C. A partir de estas curvas de transición de fase la Tm' . La correlación entre Tm' y la cantidad de disacáridos agregados se puede ver en la Figura 1. De la Figura 1 se puede ver que la sacarosa al 8% y más asegurará que el cultivo congelado no inicia la fusión a -46 °C de almacenamiento.

Ejemplo 4 Los cultivos disponibles comercialmente de Chr. Hansen A/S, Dinamarca (HP, HPS-, HP-1, LP, LL-2) se analizaron a partir del punto de fusión inicial y después de adición de maltodextrina (Elucides 12 de Roquette Fréres, Lestrem, Francia) . Los productos se vendieron como granulos congelados, y se deben mantener sueltos lo cual se asegura por un punto de fusión inicial por arriba de la temperatura de almacenamiento.

Objetivo: El objetivo del estudio presente fue aumentar el punto de fusión inicial por arriba de la temperatura de almacenamiento con el propósito de obtener granulos sueltos .

Materiales y métodos: i) Materiales Se usó Glucidex 12 (Roquette Fréres, Lestrem, Francia) como compuesto aditivo . Se usaron 100 g de cada uno de los cultivos listados en la Tabla 5. B indica que la glicerina no se agregó al cultivo, donde como A indica que 10% v/v de glicerina se agregó antes de congelamiento de granulado.

Tabla 5: Cultivos usados ii) Receta para formulación de las muestras: Los cultivos de concentrado congelado fueron deshelados y mezclados con las cantidades diferentes de una solución de Glucidex 12 a una formulación final de 3.5% hasta 10.1% (P/P) • Las diferentes formulaciones se listan en la Tabla 6.- iii) Medición de T ' : Las muestras se prepararon en crisoles de alúmina de 100 µL. Las curvas de transición de fase se registraron en el DSC Mettlet para todas las formulaciones. Las muestras se insertaron al DSC a 90 °C. Programa de temperatura de escaneo: 7°C/min. -10?"°C-0°C. iiii) Evaluación visual del punto de fusión de F-DVS R604. Las formulaciones fueron congeladas y paletizadas en nitrógeno líquido y 100 granulos individuales (alrededor de 20 - 30 g) de granulos fueron vertidos dentro de caja petries, formando así una capa delgada de granulos únicos sueltos. Una muestra de cada una de las formulaciones se colocó a -46°C. Después de 14 días de almacenamiento las muestras fueron examinadas para ver si todavía estaban sueltas o si los granulos se habían aglutinado o parecían pegajosos - y si era así - su disponibilidad para agitarse para volverse partículas sueltas nuevamente.

Resultados : Los resultados de adición de maltodextrina (Glucidex 12) a diferentes cultivos en varias cantidades se muestran en la Figura 1. Se aclara que el aumento de la concentración de maltodextrina aumenta la T ' . En la Tabla 2 se enlistan los resultados en la evaluación de la pegaj osidad/aglutinamiento. Las muestras con una Tm' por arriba de la temperatura de almacenamiento de 46°C fueron granulos sueltos mientras que las muestras que tienen Tm' por debajo de -46°C estuvieron pegados unos a otros.

Tabla 6: Formulaciones de muestras, temperatura de fusión Inicial (Tm' ) e inspección visual de granulos congelados .

Nota de la tabla: - designa aglutinado, endurecido o pegajoso (menos que 20 de los 100 granulos individuales permanecen como granulos únicos individuales sueltos) . +++ designa partículas sueltas (por lo menos 90 de los 100 granulos individuales permanecen como granulos únicos individuales sueltos) . El resultado se ilustra en la tabla 6 y en la fig. 2 y muestra que la maltodextrina es un agente efectivo para aumentar la Tm' en cultivos que contienen 10% v/1 de glicerina (serie A) además en cultivos que no contienen glicerina (serie B) . Este experimento además .demuestra que un crioprotector bien conocido (esto es, glicerina) no se puede usar para incrementar la estabilidad física durante el almacenamiento de un cultivo congelado granulado.

REFERENCIAS Cárcoba, R. y colaboradores, "Influence of cryoprotectants on the viability and acidifying activity of frozen and freeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcus lactis Subsp. Lactis CECT 5180", Eur Food Res Technol (2000) 211,433-437 Chavarri, F. J. y colaboradores, "Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from non-bitter Streptococcus Lactis strains", Biotechnology letters, vol 10, 1, 11-16 (1988) DE2805676, (Jespersen y colaboradores), 18 de agosto de 1978. Fennema O. R. (ed.) Food Chemistry, 3. ed. Marcel Dekker, 1067 pp. (ISBN: 0-8247-9346-3), 1996. FR2393251, (Jespersen y colaboradores) , 29 de diciembre de 1978. IDF (1998), International IDF Standard 146a:1998 "Identification of Characteristic Micro organisms". Roos, Y. and M. Karol (1991) Phase transitions of amorphous sucrose and frozen sucrose solutions. J. Food Science, 56:166-167. ROOS, Y. Phase Transition in Foods. ACADEMIC PRESS, New York, USA. 360 pp., (ISBN: 0-12-595340-2), 1995. US 4,140,800 (Leo Kline) 20 de febrero de 1979. WO 00/39281 (Kringelum y colaboradores) 6 de julio de 2000.

WO 2004/065584 Al (Bisgaard-Frantzen y colaboradores) 5 de agosto de 2004 (similar a Internacional Application Number PCT/DK2004/000025) Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (13)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .

1. Un cultivo"" de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado en un paquete pertinente comercialmente que tiene un peso de por lo menos 50 g de material congelado, " caracterizado porque el material congelado está presente en la forma de granulos individuales, que tienen un contenido de bacterias viables de por lo menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado .y que comprenden desde 0.5% hasta 13% de uh compuesto aditivo medido como p/p del material congelado, en donde el compuesto aditivo es un • compuesto aditivo que se selecciona del grupo de compuestos aditivos de que consisten de: Ciclodextrina, Maltitol, Trehalosa, Gelatina de Pescado, Maltodextrina, Extracto de Levadura y Goma en Rocío, y que se caracterizado además porque: cuando se usa una cantidad del 10% del compuesto aditivo medido como p/p del material congelado, el compuesto es capaz de aumentar la T ' (temperatura de comienzo de fusión de hielo) del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB congelado, el cual sin el compuesto aditivo tiene un valor de Tm' de -702C hasta -46aC, a un valor de T ' por arriba de -46aC, tal como de -452C hasta -152C (medido por DSC) , y en donde el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado se distingue porque cuando se almacena aproximadamente a -46aC por 7-14 días los granulos individuales del cultivo congelado no se pegan uno a otro y por lo tanto permanecen sustancialmente como granulos individuales cuando se miden por la siguiente prueba, los granulos individuales del cultivo congelado se congelan en granulos en nitrógeno líquido y 100 granulos individuales (alrededor de 5-100 g de granulos) se vierten dentro de un caja petri, formando así una capa delgada de granulos únicos individuales sueltos, la capa se distingue en que la mayoría de los granulos están en contacto físico con uno o más de sus granulos vecinos, colocados a aproximadamente -46SC por 7-14 días y examinados para ver si los granulos todavía están sueltos o si los granulos han formado aglutinados o están pegados unos a otros, en donde los criterios para que los granulos individuales del cultivo congelado permanezcan sustancialmente como granulos individuales es que por lo menos 80 de los 100 granulos individuales permanecen como granulos únicos individuales sueltos; con la excepción de un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado que comprende LAB que son capaces de utilizar sacarosa y en donde el cultivo comprende un compuesto de agente crioprotector seleccionado del grupo que consiste de sacarosa en una cantidad desde 2% hasta 13% de sacarosa medida como p/p del material congelado; y trehalosa en una cantidad de 4% hasta 6% de trehalosa medida como p/p del material congelado; y una mezcla de trehalosa/sacarosa ambas en la cantidad desde 13% medidas como p/p del material congelado .

2. El cultivo congelado granulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cultivo es un cultivo mesofílico mezclado que consiste de bacterias mesofílicas que tienen temperaturas de crecimiento óptimo a aproximadamente 30°C.

3. El cultivo congelado granulado de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el LAB es un LAB seleccionado del grupo que comprende especie Bifidobacterium, especie Brevibacterium, especie Propionibacterium, especie Lactococcus que incluye Lactococcus lactis subespecie lactis y Lactococcus lactis subespecie Cremoris , especie Lactobacillus que incluyen Lactobacillus acidophilus, especie Streptococcus , especie Enterococcus, especie Pediococcus, especie Oenococcus y especies fúngicas que incluyen especie Pencillium, especie Cryptococcus, especie Debraryomyces, especie Klyveromyces y especie Saccharomyces .

4. El cultivo congelado granulado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado es un cultivo el cual sin que comprenda el compuesto aditivo de conformidad con la reivindicación 1 tiene un valor de T ' de desde -702C hasta -462C.

5. El cultivo congelado granulado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cultivo de bacterias de ácido láctico congelado comprende desde 5% hasta 10% del compuesto aditivo medido como p/p del material congelado.

6. Un método para producir un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende los siguientes pasos : (i) agregar de un compuesto aditivo a bacterias viables para obtener por lo menos 50 g de material con un contenido de bacterias viables de por lo menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material y que comprende el compuesto aditivo en una cantidad desde 0.5% hasta 13% medido como p/p del material, (ii) congelar el material para obtener material congelado granulado, y (üi) empacar el material congelado granulado en una forma apropiada para obtener un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado empacado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque, antes de la adición del compuesto aditivo de acuerdo con el paso (i) de la reivindicación 6 se mide el valor de T ' del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado sin que comprenda el compuesto aditivo y se identifica que tenga un valor de Tm' de desde -702C hasta -46aC; y después de la adición del compuesto aditivo se mide el valor de Tm' del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado que comprende el compuesto aditivo y se verifica que el valor de T ' es desde -49 aC hasta -152C, más preferiblemente desde -39aC hasta -15aC.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque el cultivo es un cultivo mesofílico mezclado que consiste de bacteria mesofílica que tiene temperaturas de crecimiento óptimas a alrededor de 30°C.

9. El método de conformidad con la reivindicación 6 hasta 8, caracterizado porque el LAB es un LAB seleccionado del grupo que comprende especie Bifidobacterium, especie Brevibacterium, especie Propionibacterium, especie Lactococcus que incluye Lactococcus lactis subespecie lactis y Lactococcus lactis subespecie Cremoris, especie Lactobacillus que incluyen Lactobacillus acidophilus , especie Streptococcus, especie Enterococcus, especie Pediococcus, especie Oenococcus y especies fúngicas que incluyen especie Pencillium, especie Cryptococcus, especie Debraryomyces , especie Klyveromyces y especie Saccharomyces .

10. El método de conformidad con la reivindicación 6 hasta 9, caracterizado porque el cultivo de bacterias de ácido láctico congelado comprende desde 5% hasta 10% del compuesto aditivo medido como p/p del material congelado.

11. El método de conformidad con la reivindicación 6 hasta 10, caracterizado porque el compuesto aditivo es un compuesto aditivo seleccionado del grupo que consiste de Cíclodextrina, Maltitol, Trehalosa, Gelatina de Pescado, Maltodextrina, Extracto de Levadura y Goma en Rocío.

12. Un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado caracterizado porque es obtenible por el método para producción de un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado de conformidad con la reivindicación 6 hasta 11.

13. Uso del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado granulado de conformidad con cualquiera de la reivindicaciones 1-5 y 12 en un proceso para producir un alimento o producto alimenticio.