KR20060131854A

KR20060131854A - 개별 펠릿의 냉동 유산균 컬쳐

Info

Publication number: KR20060131854A
Application number: KR1020067017087A
Authority: KR
Inventors: 리케 스타븐스브제르그; 인제 크나프; 한스 비스가아드-프란트젠
Original assignee: 시에이치알. 한센 에이/에스
Priority date: 2004-02-24
Filing date: 2005-02-24
Publication date: 2006-12-20
Also published as: MA28484B1; ES2344415T5; PL1720974T5; CA2557496C; CN1922305A; EP1720974B2; NO20064300L; CN1922305B; PL1720974T3; DK1720974T3; ATE466070T1; AU2005215858A1; EA200601540A1; EA010855B1; ZA200606222B; WO2005080548A1; JP2011234725A; ES2344415T3; CA2557496A1; DE602005020908D1

Abstract

적어도 50g 냉동 물질의 무게를 가지는 상업적으로 적절한 패키지로 냉동된 유산균(LAB) 컬처로서, 여기에서 냉동 물질은 -46℃에서 7-14일 동안 냉동 컬쳐들의 개별 펠릿을 저장하였을 때 서로 뭉치지 않고 그러므로 실질적으로 개별 펠릿으로서 남아있는 것임을 특징으로 하는 개별 펠릿의 형태로 존재하고 있다.

냉동, 유산균 컬쳐, 개별 펠릿

Description

개별 펠릿의 냉동 유산균 컬쳐{FROZEN LACTIC ACID BACTERIA CULTURE OF INDIVIDUAL PELLETS}

본 발명은 상업적으로 적절한 패키지로 적어도 50g 냉동 물질의 무게를 갖는 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐에 관한 것으로서, 그 냉동 물질은 그 컬쳐의 초기 녹는점 (Tm’) 이하의 온도, 예로 -46℃에서 7-14일 동안 저장되었을 때, 냉동 컬쳐의 개별 펠릿들이 서로 뭉치지 않고, 그러므로 실질적으로 개별 펠릿들로 남아 있게 된다는 사실에 의해 특징되어 지는 개별 펠릿들의 형태로 존재하고 있다.

미생물들은 대부분의 유제품과 관련된 식품 및 사료 제품의 제조에 관련되어 있다. 박테리아 배양, 특히 일반적으로 유산균으로 분류된 박테리아의 배양은 모든 발효된 유제품, 치즈 및 버터의 제조에 필수적이다. 그런 박테리아의 배양은 스타터 컬쳐으로서 언급되어 지고, 그들은 수많은 기능을 수행함으로써 다양한 유제품의 특이 요소를 부여한다.

유제품의 스타터 컬쳐들은 일반적으로 유산균으로 구성된다. 본문에서 "유산균" (LAB)란 표현은 당을 우세하게 생산하는 산으로서 젖산, 포름산 및 프로피온산 을 포함하는 유기산으로 발효시키는 그램 양성, 카탈라아제 음성, 비-운동성, 비-포자형성, 미호기성 또는 혐기성 박테리아를 지정한다. 본문에서 유산균은 펄미쿠테스(Firmicutes) 문에 속하는 수많은 박테리아 속을 포함한다. 속 카르노박테리움(Carnobacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus) , 락토스패라(Lactosphaera), 루코노스톡(Leuconostoc), 멜리쏘코커스(Melissococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 페디오코커스(Pediococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 테트라제노코커스(Tetragenococcus), 바고코커스(Vagococcus) 및 훼이셀라(Weissella)는 LAB로서 인식된다. 또한 비피도박테리움(Bifidobacterium)뿐만 아니라 에로코커스(Aerococcus), 마이크로박테리움(Microbacterium) 및 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속과 같은 악티노박테리아(Actinobacte-ria) 문에 속하는 젖산-생산 그램-양성 세균도 본 발명의 LAB로서 고려된다. 산업적으로 가장 유용한 유산균은 락토코커스 속, 스트렙토코커스 속, 엔테로코커스 속, 락토바실러스 속, 루코노스톡 속, 비피도박테리움 속 및 페디오코커스 속에서 발견된다.

유제품 산업에서 그들의 이용에 추가하여, 유산균 컬쳐는 또한 수많은 다른 산업뿐만 아니라 식육 가공 산업에서도 널리 이용되고 있음이 발견된다.

상업적인 스타터 컬쳐는 냉동된 컬쳐로서 분배된다. 고도로 농축된 냉동 컬쳐들은 중간 매개자에 의한 이동없이 발효배지(예 우유 또는 고기)로 직접적으로 접종될 수 있기 때문에 상업적으로 매우 흥미롭다. 다시 말해, 그런 고도로 농축된 냉동 컬쳐들은 최종-사용자에게 인-하우스 벌크 스타터 컬쳐들이 충분하도록 만들 게 하는 양으로 박테리아를 포함한다.

"벌크 스타터(bulk starter)" 는 여기에서 발효 배지로 접종하기 위한 식품 가공 공장에서 보급된 스타터 컬쳐로서 정의된다. 고도로 농축된 컬쳐들은 DVS(direct vat set)-컬쳐로서 언급되어 진다. 최종-사용자들에서 DVS-컬쳐로 사용되는 충분한 박테리아를 포함하기 위하여, 농축된 냉동 컬쳐는 일반적으로 적어도 50g의 무게를 가져야만 하고, 적어도 g 당 10⁹ CFU(colony forming units)의 생존가능한 박테리아를 가져야만 한다.

냉동된 컬쳐의 실용적인 사용에서의 중요한 점은 컬쳐의 실제적인 취급에서의 편리함이다. 냉동된 컬쳐 "엔 블락(en block)"은 취급하기 어려운 반면, 펠릿으로된 냉동 컬쳐는 생산자 및 소비자 모두 취급하기가 매우 쉽다.

그 결과, 고도로 농축된 펠릿 냉동 컬쳐- 소위 F-DVS(frozen direct vat set)- 컬쳐의 번성된 시장이 형성되었다.

냉동 컬쳐의 생존력에 관련된 수많은 공보들이 발간되었다.

차바리 등(Chavarri et al., 1988)은 냉동된 순수 스트렙토코커스 락티스 컬쳐의 생존력이 5% 락토스 또는 5% 수크로스의 첨가에 의해 개선될 수 있음을 기재하고 있다.

카르코바 등(Carcoba et al., 2000)은 냉동된 순수 락토코커스 락티스 서브에스피. 락티스 컬쳐는 당(락토즈, 수크로스 및 트레할로스), 글루탐산 및 젤라틴과 같은 다양한 항냉동제의 첨가에 의해 개선될 수 있음을 기재하고 있다.

US 4.140.800 (Kline)은 냉동-건조된 컬쳐들의 생존력이 다양한 항냉동제의 첨가에 의해 개선될수 있음을 기재하고 있다. 또한 락토즈, 수크로스 또는 말토스가 첨가된 냉동된 컬쳐의 생존력이 논의되고 있다.

WO00/39281 (Kringelum et. al.) 은 비-냉동, 액체 스타터 컬쳐의 생존력은 다양한 항냉동제의 첨가에 의해 개선될 수 있음을 기재하고 있고,

WO 2004/065584 A1 (Bisgaard-Frantzen)은 고도로 농축된 냉동 스타터 컬쳐의 생존력은 다양한 항냉동제의 첨가에 의해 개선될 수 있음을 기재하고 있다.

오직 WO 2004/065584 A1은 펠릿-냉동 컬쳐를 기재하고 있고, 상기-언급된 공보들의 어느 것도 저장되는 동안 펠릿-냉동 컬쳐의 물리적인 안정성을 언급하는 것은 없었다.

발명의 요약:

상업적으로, 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐는 보통 적절한 패키지(예. 상자의 2ℓ 테트라 팩으로)로 제공된다. 일반적으로 약 -46℃의 저장 온도에서 저장되고 냉동 물질은 상대적으로 작은 무게의 개별적인 펠릿의 형태로 존재한다.

본 발명에 앞서, 본 발명자들은 그런 상업적으로 적절한 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐들의 저장에 관하여 중요한 문제는 없다고 믿고 있다.

그러나, 다른 연구에 기초하여 본 발명자들은 많은 수의 상업적으로 적절한 컬쳐들이 7일 또는 그 이상 기간 동안 약 -46℃에서 저장될 때, 개별 펠릿들이 서로 뭉치게 되어 큰 덩어리를 형성하게 되는 것을 확인하였다. 산업적으로 덩어리는 취급 문제를 형성한다. 컬쳐들이 뭉치게 될때 컬쳐 패키지로부터 적절한 양을 이용하는 것은 현저하게 어렵게 된다. 편리한 방식으로 패키로부터 덩어리진 컬쳐를 떼어내는 것은 어렵다.

게다가 "문제가 있는" 컬쳐는 약 -46℃의 저장 온도 이하에서 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐의 Tm’값(루스(1995)에 의해 정의된 얼음 융해 개시)을 갖는 것을 특징이 될 수 있는 것을 본 연구는 확인하였다. 그 Tm’값은 식품 산업 및 다른 산업에서 사용되는 표준 물리 화학 용어이다. Tm'은 루스(1991)에 의해 개시된 시차 주사 열량계(Differential Scanning Calorimetry, DSC)에 의해 일반적으로 측정된다. 그것은 식품 제품(여기에서 냉동된 LAB 컬쳐)의 녹는 온도의 개시와 관련되어 있다. 좀더 세부적인 것을 위해 교과서 "식품 화학" 펜네마(1996) 및 "식품에서 상 변화" 루스(1995)가 참고된다.

이론에 제한 없이, 냉동 컬쳐가 그것의 저장 온도, 예로 약 -46℃, 이하의 Tm’값을 가질 때, 초기 상 변화(융해, melting)가 발생하고 개별 펠릿들이 서로 뭉치게 되고 좀 더 큰 덩어리를 형성하게 한다.

요약하면, 본 발명자들의 작업은 상업적으로 적절한 고도로 농축된 펠릿-냉동 유산균 컬쳐들의 여러 가지 종류의 물리적인 외관과 관련하여 여기에서 인식되지 않은 저장 문제를 확인하였다. 이 문제를 확인하였을 때, 본 발명자들은 그 문제를 해결하기 위해 노력하기 시작했다.

어떤 가능한 이론적 설명에 독립하여, 본 발명자들은 적절한 첨가제 화합물을 문제의 펠릿-냉동 컬쳐에 첨가함으로써, -46℃에서 7 내지 14일 동안 저장한 후에도 개졀 펠릿들이 덩어리를 형성하지 않고, 그러므로 약 -46℃에서 장기간 저장한 후에 실질적으로 개별 펠릿으로서 남아있는 펠릿-냉동 컬쳐를 수득할 수 있었다.

전반적으로, 적절한 첨가제 화합물은 냉동된 컬쳐의 Tm’값을 저장 온도, 예 -46℃ 이상의 값, 이를 테면 예를 들어 -70 내지 -46℃의 범위에서 -45 내지 -15℃의 범위까지 Tm’값을 증가시킬 수 있는 것에 의해 특징되어 진다.

여기에서 실시예들은 적절한 첨가제 화합물들의 바람직한 예들을 기재하고 있다. 기재된 화합물은 트레할로스(trehalose), 말토덱스트린(maltodextrin), 시클로덱스트린(cyclodextrin), 스프레이 검(spray gum), 생선 젤라틴 블룸(fish gelatin bloom) 및 말티톨(maltitol)을 포함한다. 보통의 일반적인 지식에 기초하여, 당업자는 냉동 컬쳐의 Tm’값을 저장 온도, 예 -46℃ 이상의 값까지 증가시킬 수 있는 더 적절한 첨가제 화합물을 완벽하게 확인할 수 있다.

상기에서 언급하였듯이, 충분한 박테리아를 포함하기 위하여 상업적으로 적절한 고도로 농축된 냉동 컬쳐는 일반적으로 적어도 50g의 무게를 가지고 있고 g 당 적어도 10⁹ CFU(colony foming units)의 생존가능한 박테리아를 포함하고 있다. 차바리(1988) 및 카르코바(2000)의 논문에서 기재된 컬쳐들은 펠릿-냉동 컬쳐들의 물리적 안정성에 관한 것은 아니고, 차라리 상업적으로 적절한 고도로 농축된 냉동 컬쳐를 고려하지 않는 본문에서 냉동된 박테리아의 생존력에 관한 것으로, 그들은 좀더 작아진 규모로 만들었고 냉동된 컬쳐의 현저하게 작은 그램을 포함하고, 게다라 기재된 컬쳐들은 펠릿-냉동 컬쳐들이 아니기 때문이다. 또한, 차바리(1988) 및 차르코바(2000)에 의해 기재된 컬쳐들은 전혀 펠릿-냉동 컬쳐의 물리적인 안정성에 관한 것은 아니고, 차라리 냉동된 박테리아의 생존력에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 첫번째 측면은 적어도 냉동 물질의 50g의 무게를 갖는 상업적으로 적절한 패키지에서 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐에 관한 것으로, 여기에서 냉동 물질은 냉동 물질 g 당 적어도 10⁹ CFU의 생존하는 박테리아를 갖고, 냉동 물질의 w/w로서 측정된 첨가제 화합물의 0.5%에서 13%를 포함하는 개별 펠릿의 형태로 존재하는 것이다.

첨가제 화합물은 냉동 물질의 w/w로서 측정된 첨가제 화합물의 10%의 양을 사용함으로써, 냉동 유산균(LAB) 컬쳐의 Tm’(얼음 융해의 개시 온도)을 증가시킬 수 있는 화합물의 그룹에서 선택되는 것으로, 첨가제 화합물이 없이는 -70℃에서 -46℃의 Tm’값, -45℃에서 -15℃의 Tm’값(DSC에 의해 측정)을 갖는 것이다.

게다가, 냉동 유산균(LAB) 컬쳐는 약 -46℃에서 7-14일 동안 저장되었을 때 냉동 컬쳐의 개별 펠릿들이 서로 뭉쳐지 않고 그러므로 다음 테스트에 의해 측정하였을 때 개별 펠릿으로 잔존하는 것으로 특징된다:

냉동 컬쳐의 개별 펠릿들은 액체 질소에서 냉동된 펠릿이고 100개의 개별 펠릿들 (펠릿의 약 5-100g)은 페트리디쉬로 옮겨지고, 그러므로 느슨한, 개별 단일 펠릿들의 얇은 층을 형성하고, 그 층은 펠릿들의 대부분이 물리적으로 그것들의 이웃 펠릿들과 접촉되는 것을 특징으로 하는 것으로, 7-14일 동안 약 -46℃에 놓아두고, 만약 그 펠릿들이 여전히 느슨한지 또는 그 펠릿들이 덩어리를 만들었는지 또는 함께 뭉쳐졌는지를 시험하였고, 여기에서 개별 펠릿들로 실질적으로 잔존하는 냉동 컬쳐의 개별 펠릿을 위한 기준은 느슨한 개별 단일 펠릿들로 잔존하는 100개의 개별적인 펠릿들의 적어도 80개이다.

그러나, 수크로스를 이용할 수 있는 LAB를 포함하는 냉동 유산균(LAB) 컬쳐 및 여기에서 컬쳐는 냉동 물질의 w/w로서 측정된 수크로스의 2%에서 3%까지의 양으로의 수크로스; 냉동 물질의 w/w로서 측정된 트레할로스의 4%에서 6%의 양으로의 트레할로스; 및 냉동 물질의 w/w로서 측정된 12%에서 14%의 양으로 트레할로스/수크로스 혼합물 모두로 구성되는 그룹에서 선택되는 항냉동제 화합물을 포함하는 것으로, 이 발명의 첫 번째 측면에서 특별하게 면제되었다.

첫 번째 측면의 마지막에 기재된 "포기(disclaimer)"는 PCT 출원 WO 2004/065584 A1에 관련되어 있다. 이 출원은 2004년 1월 19에 출원되었다. 본 출원 PCT 출원 WO 2004/065584 A1의 출원을 형성하는 우선권의 출원 날짜는 공개되지 않았다.

WO 2004/065584 A1은 냉동 컬쳐의 저장 동안 생존력을 개선시키는 것에 관한 것이다. 본 발명의 문제점 "뭉친 펠릿"을 기재하지 않았다. 일반적으로, 청구항 제1항은 "수크로스를 이용할 수 있는 LAB를 포함하는 냉동 유산균(LAB) 컬쳐는 냉동 물질 적어도 50g의 무게 및 냉동 물질 g 당 적어도 10⁹ CFU의 생존하는 박테리아를 포함하고, 그 냉동 물질은 냉동 물질의 w/w로서 측정된 항냉동제의 0.5%에서 80%를 포함하는 것을 특징으로 하는 것"에 관한 것이다.

비록 항냉동제를 갖는 펠릿-냉동 컬쳐는 WO 2004/065584 A1에 개시되어 있으나, WO 2004/065584 A1는 특이하게 오직 수크로스를 이용할 수 있는 컬쳐만을 청구하고 있기 때문에 당업자는 필연적으로 WO 2004/065584 A1의 용어에 포함되는 결과에 도달하게 되는 것을 제외할 수 있다.

본 발명의 냉동 컬쳐에 대하여, 첨가제 화합물은 바람직하게 그들이 냉동되기 전에 생존하는 박테리아에 첨가되어져야만 한다.

따라서, 두 번째 측면에서 본 발명은 여기에서 기재된 것과 같이 발명 및 구체예의 첫 번째 측면의 펠릿-냉동 유산균 컬쳐를 제조하는 방법에 관한 것으로, 다음 단계들을 포함한다:

(i) 물질 g 당 적어도 10⁹ CFU(colony forming units)의 생존하는 박테리아를 갖는 물질의 적어도 50g을 수득하기 위하여 첨가제 화합물을 생존하는 박테리아에 첨가하고 물질의 w/w로서 측정된 0.5%에서 13%의 양으로 첨가제 화합물을 포함하고,

(ii) 펠릿-냉동 물질을 수득하기 위해 물질을 냉동시키고, 및

(iii) 여기에 기재된 본 발명 및 구체예의 첫 번째 측면의 포장된 냉동 유산균(LAB) 컬쳐를 수득하기 위해 적절한 방법으로 펠릿-냉동 물질을 포장하는 것.

본 발명의 세 번째 측면은 본 발명의 두 번째 측면의 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐를 제조하는 방법에 의해 수득될 수 있는 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐에 관한 것이다.

본 발명의 네 번째 측면은 식품 또는 사료 제품을 제조하기 위한 공정에서 상기에서 기재된 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐의 용도에 관한 것이다.

정의:

본 발명의 상세한 구체예들의 논의에 앞서, 본 발명의 주요한 측면에 관련된 특정 용어의 정의가 제공된다.

"수크로스를 이용할 수 있는 LAB" 용어는 수크로스 당을 산 생산물로 발효시킬 수 있는 LAB를 의미한다. 이는 PCT 공개 번호 WO 2004/065584 A1에서 정의된 것과 동일하다.

컬쳐의 "물질" 용어는 생존하는 박테리아 및 항냉동제 모두를 포함하는 컬쳐의 적절한 물질을 의미한다. 가능한 패킹(packing)은 포함되지 않는다. 그 결과, 컬쳐의 물질의 무게는 가능한 패킹의 무게는 포함되지 않는다.

"패킹" 또는 "패키지" 용어는 넓게 이해되어야만 한다. 펠릿-냉동 유산균 컬쳐는 사용자들에게 제공되기 위하여 포장되어야만 하는 것을 나타낸다. 그것은 병, 테트라-팩ⓒ 용기, 등에 포장될 수 있다.

"첨가제 화합물" 용어는 본문에서 하나의 특정 첨가제 화합물을 의미하거나 두개 또는 그 이상의 다른 첨가제 화합물들을 의미한다. 따라서, 컬쳐 물질 내에 첨가제 화합물의 w/w 비율은 첨가제 화합물의 양의 합계로서 이해되어야만 한다. 바람직하게, 그 용어는 발효 후에 컬쳐에 첨가되는 화합물에 관한 것이다. 따라서, 그것과 같은 컬쳐 발효 배양액에서 상당한 양으로 존재하지 않는 화합물이다.

"펠릿-냉동" 및 "펠릿-냉동 컬쳐" 용어는 냉동 컬쳐의 펠릿 또는 과립(granula)이 되는 방법의 이용에 의해 냉동된 컬쳐를 의미한다. 펠릿-냉동 컬쳐는 컬쳐의 냉동 펠릿 또는 과립을 형성시키는 액체 질소로 컬쳐 드롭와이즈(dropwise)를 첨가함으로써 편리하게 제조될 수 있다. 전형적으로, 그러나 필수적으로는 아니게, 그 공정은 전통적인 산업의 냉동-건조 공장에서 접시(trays)에서 수행된다.

"펠릿" 또는 "과립" 용어는 0.1 및 10mm 사이의 평균 크기의 냉동된 액체에 의해 형성된 작은 고체 존재를 의미한다.

본 발명의 구체예들은 하기에서 오직 실시예의 방식에 의해 기재된다.

본 발명의 상세한 설명:

Tm ’ 값

상기에서 설명한데로, Tm’ 값은 얼음 융해의 개시가 발생하는 온도를 설명하는 물리 화학에 있어서 표준으로 알려진 용어이다. 본문에서 Tm’은 냉동된 LAB 컬쳐의 융해(melting)의 개시가 발생되는 온도를 의미한다.

바람직하게, Tm’값은 여기 실시예 1의 "Tm의 측정"으로 이름지어진 부분에서 기재된 DSC 프로토콜의 사용에 의해 측정된다.

펠릿 덩어리 테스트

본 발명의 첫 번째 측면에 관련하여 설명한데로, 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐가 약 -46℃(본 상황에서 -50℃로 미리 세트된 냉동고는 -46℃의 샘플 온도를 갖는다)에서 7-14일 동안 저정될 때 냉동 컬쳐의 개별 펠릿이 서로 뭉치지 않고, 그러므로 다음으로 구성되는 테스트에서 개별 펠릿으로 실질적으로 잔존하는 것에 의해 특징지어지는 컬쳐인지를 분석하기 위한 테스트이다:

냉동 컬쳐의 개별 펠릿들은 액체 질소에서 냉동된 펠릿이고 100개의 개별 펠릿 (펠릿의 약 5-100g)은 페트리디쉬로 옮기고, 그러므로 느슨한 개별 단일 펠릿들의 얇은 층이 형성되고, 펠릿의 대다수가 그것의 이웃 펠릿들의 하나 이상과 물리적으로 접촉하고 있는 것으로 특징되는 층으로 7-14일 동안 약 -46℃에 놓아두고 그 펠릿들이 여전히 느슨한지 또는 그 펠릿들이 덩어리를 만드는지 또는 서로 뭉쳐지는지를 시험하고, 냉동 컬쳐의 개별 펠릿들이 개별 펠릿으로서 실질적으로 남아있는 기준은 100개의 개별 펠릿 중 적어도 80개는 느슨한 개별 단일 펠릿으로서 남아있는 것이다. 좀더 바람직하게 100개의 개별 펠릿들 중의 적어도 90개는 느슨한 개별 단일 펠릿으로 남아있고, 더욱더 바람직하게는 100개의 개별 펠릿들 중의 적어도 95개는 느슨한 개별 단일 펠릿으로 남아있다.

느슨한 개별 단일 펠릿으로 남아있는 개별 펠릿을 시험하고 개수하는 것은 시각적으로 수행된다. 일반적으로 제한된 기술적인 불확실성의 범위에서 그 결과가 일정하고 반복적으로 되는 일정한 방식으로 이를 수행하는 것은 당업자의 능력이다. 여기에서 실시예 1은 더욱 기술적으로 상세한 사항을 제공한다.

펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐

바람직하게, "냉동된 유산균(LAB) 컬쳐" 용어는 여기에서 기재된 것처럼 첨가된 첨가제 화합물을 포함하지 않고 -70에서 -46℃의 Tm' 값을 가지는 컬쳐를 의미한다. 그 컬쳐는 "펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐"를 형성하는 펠릿 또는 과립(granula)의 형태로 냉동된 것이다. 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐는 컬쳐의 펠릿 또는 과립을 형성하는 액체 질소로 컬쳐 드롭와이즈를 첨가함으로써 쉽게 만들어 진다.

컬쳐의 LAB는 적절한 API 테스트 키트 (bioMerieux SA, 리옹, 프랑스)의 사용에 의해 국제적 IDF 표준 146A:1998 "미생물 특징의 동정"에 따라 수크로스를 이용하지 않는 상업적으로 적절한 LAB이다. API 키트 "빠른 ID 32 STREP" 및 "50 CHL 배지"는 대부분의 LAB 속을 위한 수크로스 이용 상태를 확립하기 위하여 사용된다.

바람직하게, 그 LAB는 비피도박테리움 속(Bifidobacterium spp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium spp.), 프로피오니박테리움 속(Propionibacterium spp.), 락토코커스 락티스 서브에스피. 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) 및 락토코커스 락티스 서브에스피. 크레모리스(Lactococcus lactis subsp. cremoris)를 포함하는 락토코커스 속(Lactococcus spp.), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 포함하는 락토바실러스 속(Lacto-bacillus spp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus spp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus spp.), 페디오코커스 속(Pediococcus spp.), 오에노코커스 속(Oenococcus spp.) 및 페니실리움 속(Pencillium spp.), 크립토코커스 속(Cryptococcus spp.), 데브라리오마이세스 속(Debraryomyces spp.), 클리베로마이세스 속(Klyveromyces spp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces spp.)을 포함하는 균류 속(fungal spp.)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 LAB이다.

일반적으로 이들 종들의 몇몇이 수크로스를 이용할 수 있는 것처럼 기재된다 하더라도, 수크로스를 이용할 수 없는 변이체가 존재하고 지속적으로 분리될 수 있다. 그런 변이체들이 어떻게 분리되거나 수득되든지 간에, 그들은 여전히 본 발명의 한 측면이 된다.

산업적으로 가장 유용한 유산균은 락토코커스 속(Lactococcus species), 스트렙토코커스 속(Streptococcus species), 엔테로코커스 속(Enterococcus species), 락토바실러스 속(Lactobacillus species), 루코노스톡 속(Leuconostoc species) 및 페디오코커스 속(Pediococcus species)에서 발견된다.

"혼합된 유산균(LAB) 컬쳐" 용어는 두 개 또는 그 이상의 다른 LAB 속이 포함되는 혼합된 컬쳐를 의미한다. "순수 유산균(LAB) 컬쳐" 용어는 하나의 LAB 속 본질을 포함하는 순수 컬쳐를 의미한다.

여기에서 기재된 컬쳐는 약 30℃에서 최적 성장 온도를 갖는 중온일반세균(mesophilic bacteria)을 구성하는 중온 컬쳐이다. "중온 컬쳐"는 두 가지 또는 그 이상의 다른 중온 LAB 속을 포함하는 컬쳐이다.

중온성 그룹에 속하는 전형적인 미생물은 락토코커스 락티스 서브에스피. 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis), 락토코커스 락티스 서브에스피. 크레모리스(Lactococcus lactis subsp. cremoris), 루코노스톡 메센테로이드 서브에스피. 크레모리스(Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 락토코커스 락티스 서브에스피. 락티스 바이오바. 디아세틸락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis) 및 락토바실러스 카세이 서브에스피. 카세이(Lactobacillus casei subsp. casei)를 포함한다.

호열성 유산균 속은 예로서 스트렙토코커스 썰모필러스(Streptococcus thermophilus), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 델브루에키 서브에스피. 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) 및 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 포함한다.

여기에서 기재된 컬쳐는 수크로스를 이용할 수 없는 LAB를 포함한다. 소위 O-컬쳐는 홀이 없는 치즈(체다, 체셔, 페타)를 만들기 위해 사용되고, 전형적으로 락토코커스 락티스 서브에스피. 락티스 및 락토코커스 락티스 서브에스피. 크레모리스를 포함하는 그룹에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 미생물을 포함한다. 일반적으로 O-컬쳐는 수크로스를 이용하지 않는 것으로 고려된다.

고도로 농축된 펠릿-냉동 유산균 컬쳐

여기에서 기재된 냉동 컬쳐는 식품 산업에 있어서 고도로 농축된 펠릿-냉동 유산균 컬쳐이다. 충분한 박테리아를 포함하기 위하여, 그러한 컬쳐는 생존하는 박테리아의 상대적으로 높은 농도로 결합되어 상대적으로 커야(충분한 무게를 가져야) 한다. 만약 상대적으로 더 많은 박테리아가 요구된다면, 생존하는 박테리아의 무게 및/또는 농도가 증가 되어야만 하는 것은 자명한 것이다.

바람직하게, 여기에서 기재된 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐는 적어도 냉동 물질 100g의 무게를 가지고, 좀더 바람직하게는 냉동 물질 적어도 250g의 무게를 가지고, 더욱더 바람직하게는 냉동 물질 적어도 500g의 무게를 가지고, 최고로 바람직하게는 냉동 물질 적어도 900g의 무게를 갖는다. 바람직하게 냉동 물질의 무게는 500kg 미만이다.

바람직하게, 여기에서 기재된 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐는 냉동 물질 g 당 적어도 5×10⁹ CFU의 생존하는 박테리아를 갖고, 더욱 바람직하게는 냉동 물질 g 당 적어도 10¹⁰CFU의 생존하는 박테리아를 갖고, 가장 바람직하게는 냉동 물질 g 당 적어도 2×10¹⁰ CFU의 생존하는 박테리아를 갖는다.

발효 및 LAB를 위한 적절한 발효 배지는 당업계에 알려져 있고, 당업자는 특정 LAB와 관련된 적절한 배지 및 발효 조건을 선택할 수 있다. 적절한 배지 및 발효는 여기에서 실시예 부분에서 주어진다.

충분한 양의 박테리아를 얻기 위하여, 적절하게 큰 발효조에서 상대적으로 큰-규모의 발효가 되도록 함이 본 내용에서는 적절하다. 적어도 50ℓ의 발효조, 바람직하게는 적어도 90ℓ, 더욱 바람직하게는 500ℓ 또는 더 큰 것이 바람직하다.

적절한 발효 후에, 생존하는 박테리아는 바람직하게 발효 배지의 액체(상청액)의 제거(예. 원심분리에 의해) 분리된다. 분리된 생존하는 박테리아는 분리된 바이오매스(biomass)로 불리워진다. 분리된 생존하는 박테리아는 바람직하게 냉동 물질 g 당 적어도 10⁹ CFU의 생존하는 박테리아를 가지고, 더욱 바람직하게는 냉동 물질 g 당 적어도 5×10⁹ CFU의 생존하는 균을 가지고, 가잘 바람직하게는 냉동 물질 g 당 적어도 10¹⁰ CFU의 생존하는 박테리아를 가진다.

농축된 컬쳐에 첨가제 화합물(하기에서 보라)의 첨가 후. 컬쳐는 혼합물의 냉동된 펠릿 또는 과립(granula)을 형성하는 액체 질소에서 혼합물 드롭와이즈를 첨가함으로써 편리하게 냉동된다. 냉동 과정을 위한 적절한 방법은 DE2805676 및 FR2393251에 기재되어 있다.

그리고나서 펠릿-냉동 컬쳐는 사용자에게 제공되기 위하여 적절하게 포장된다.

첨가제 화합물

상기에서 논의한데로, 바람직하게 적절한 첨가제 화합물은 냉동된 컬쳐의 Tm’값을 저장 온도, 예. -46℃ 이상의 값까지, 이를 테면 -45℃에서 -15℃까지의 Tm’값까지, 더욱 바람직하게 -43℃에서 -15℃까지의 Tm’값까지, 가장 바람직하게 -39℃에서 -15℃까지의 Tm’값까지 증가시킬 수 있는 것에 의해 특징된다.

여기에서 실시예 2는 적절한 첨가제 화합물을 동정하기 위하여 빠른 실험적 전략을 기술한다. -46℃ 이하에서 Tm’값을 가지는 냉동 컬쳐 "모델"(실시예 2에서 -54℃에서 Tm’값을 갖는다)에 다양한 적절한 화합물들(10% W/W)이 첨가되고, 첨가 전 및 후의 Tm’값은 DSC에 의해 측정되었다.

만약 관심을 끄는 특정 첨가제 화합물이 -46℃ 이상의 값까지, 이를 테면 -45℃에서 -15℃까지의 Tm’값까지, 더욱 바람직하게 -43℃에서 -15℃까지의 Tm’값까지, 가장 바람직하게 -39℃에서 -15℃까지의 Tm’값까지, 냉동 컬쳐의 Tm’값을 증가시킬 수 있는 것에 의해 특징되는 것인지를 평가하기 위하여 실시예 2의 "모델" 컬쳐 및 이 실시예 2의 실험 프로토콜이 바람직하게 사용된다.

실시예 2에서, 시클로덱스트린은 -44℃까지 Tm’값을 증가시키고, 말티톨은 -42℃까지 Tm’값을 증가시키고, 트레할로스는 -38℃까지 Tm’값을 증가시키고, 생선 젤라틴은 -37℃까지 Tm’값을 증가시키고, 말토덱스트린은 -32℃까지 Tm’값을 증가시키고, 스프레이 검은 -31℃까지 Tm’값을 증가시킨다는 것을 볼 수 있다.

바람직하게, 첨가제 화합물은 150에서 100000 g/mol의 분자량(MW), 좀더 바람직하게 250에서 100000 g/mol, 좀더 바람직하게는 300에서 40000 g/mol 및 가장 바람직하게는 500에서 15000 g/mol의 분자량을 갖는 화합물이다.

바람직한 구체예에서, 첨가제 화합물은 또한 항냉동제이다.

"항냉동제" 용어는 컬쳐의 생존력에 의해 측정된 냉동 컬쳐의 저장 안정성을 개선시킬 수 있는 물질을 의미한다. 본문에서, 그것은 하나의 특정한 항냉동제이거나 두 개 또는 그 이상의 다양한 제제이다. 따라서, 컬쳐 물질내에 항냉동제의 w/w 비율은 항냉동제 양의 총합으로 이해되어야만 한다.

항냉동제는 단백질 또는 단백질 가수분해물로부터 선택되는 것이 바람직하다. 이들의 바람직한 적절한 예는 말토 추출물, 탈지분유(Skimmed milk powder), 유청 분말(Whey powder), 효모 추출물(Yeast extract), 글루텐(Gluten), 콜라겐(Collagen), 젤라틴(Gelatin), 엘라스틴(Elastin), 케라틴(Kelatin) 및 알부민(Albumin)으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나를 포함한다.

좀더 바람직하게, 항냉동제는 탄수화물 또는 핵산의 생합성과 관련된 물질이다. 바람직하게도 적절한 탄수화물은 5탄당(예. 리보오스, 자일로스), 6탄당(예. 플락토스, 만노스, 소르보스), 이당류(예. 수크로스, 트레할로스, 멜리바이오스, 락툴로스), 올리고당(예. 라피노스), 올리고프락토스(예. 액틸라이트, 프라이브롤로스), 다당류(예. 말토덱스트린, 잔탄 검, 펙틴, 알지네이트, 미세결정성 셀룰로오스, 덱스트란, PEG) 및 당알코올(솔비톨, 만니톨)로 구성되는 그룹에서 선택되는 하나를 포함한다. 가장 바람직하게, 탄수화물은 150에서 100000 g/mol의 분자량, 더욱 바람직하게 250에서 100000 g/mol의 분자량, 좀더 바람직하게는 300에서 40000 g/mol의 분자량 및 가장 바람직하게는 500에서 15000 g/mol의 분자량을 갖는 탄수화물이다.

가장 바람직한 구체예에서, 첨가제 화합물은 시클로덱스트린(cyclodextrin), 말티톨(maltitol), 생선 젤라틴(fish gelatin), 말토덱스트린(maltodextrin) (바람직하게 말토덱스트린 DE 2 에서 말토덱스트린 DE 19까지), 스프레이 검(spray gum) (예. 스프레이 검 IRX 51693), 이노신-5'-모노포스페이트(IMP) 및 이노신(inosine)으로 구성되는 그룹에서 선택되는 첨가제 화합물이다.

냉동 컬쳐는 냉동 물질의 w/w로 측정된 첨가제 화합물 0.5%에서 13%를 포함하고, 바람직하게는 냉동 물질의 w/w로 측정된 첨가제 화합물 1%에서 12%, 더욱 바람직하게는 냉동 물질의 w/w로 측정된 첨가제 화합물 2%에서 10%를, 가장 바람직하게는 냉동 물질의 w/w로 측정된 첨가제 화합물 5%에서 10%를 포함한다.

발효 후에 분리된 생존하는 박테리아(바이오매스)에 첨가제 화합물, 항냉동제의 추가는 적절한 온도에서 예를 들어 30분 동안 바이오매스와 고체 첨가제 화합물을 혼합함으로써 이루어진다. 만약 첨가제 화합물제가 말토덱스트린이라면 적절한 온도는 상온이 된다. 또한 첨가제 화합물의 살균 용액은 바이오매스와 혼합된다.

펠릿-냉동 유산균 컬쳐를 제조하는 방법

상기에서 언급한 데로, 본 발명의 두 번째 측면은 다음 단계를 포함하는 본 발명의 첫 번째 측면의 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐를 제조하는 방법에 관한 것이다:

(i) 물질 g 당 적어도 10⁹ CFU의 생존하는 박테리아를 갖는 물질 적어도 50g을 얻기 위하여 생존하는 박테리아에 첨가제 화합물을 첨가하고, 물질의 w/w로서 측정된 0.5%에서 13%의 양으로 첨가제 화합물을 포함하고;

(ii) 펠릿-냉동 물질을 수득하기 위하여 물질을 냉동하고, 및

(iii) 적절한 방식으로 펠릿-냉동 물질을 포장하는 것.

상기에서 논의한데로, 여기에서 가장 적절한 "문제를 갖는" 컬쳐는 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐로서, 여기에서 기재한 데로 첨가제 화합물이 첨가되지 않은 것은 -70℃에서 -46℃의 Tm’값을 갖는 것이다.

따라서, 바람직한 구체예에서, 상기 단계 (i)에 따른 첨가제 화합물을 첨가하기 전에, 첨가제 화합물을 포함하지 않는 냉동된 유산균(LAB) 컬쳐의 Tm’값을 측정하고, 이는 -70℃에서 -46℃ 또는 더 낮은 Tm’값을 갖는 것으로 확인하였다.

상기 단계 (i)에 따른 첨가제 화합물을 첨가하기 전에 펠릿 덩어리 테스트(상기에서 보라)를 수행하고 냉동 컬쳐의 개별 펠릿이 -46℃에서의 저장에서 서로 뭉치는 것을 확인하였다.

바람직하게, 첨가제 화합물의 첨가 후에, 첨가제 화합물을 포함하는 냉동 유산균(LAB) 컬쳐의 Tm’값을 측정하고, Tm’값은 -46℃ 이상, 바람직하게는 -45℃에서 -15℃, 좀더 바람직하게는 -43℃에서 -15℃, 더더욱 바람직하게는 -39℃에서 -15℃이다.

마지막으로, 첨가제 화합물의 첨가 후에 컬쳐는 펠릿-냉동이 되고, 100개의 개별 펠릿들 중 적어도 80개는 느슨하고, 개별적인 단일 펠릿들로 남아 있는 것을 확신시켜주는 펠릿 덩어리 테스트(상기에서 보라)가 수행된다.

냉동 유산균(LAB) 컬쳐의 용도

여기에서 기재된 냉동 유산균(LAB) 컬쳐는 그 기술에 따른 식품 또는 사료 제품을 제조하기 위한 공정에서 이용된다.

도 1: 얼음 융해의 개시가 일어나는 온도, Tm’, 및 첨가된 이당류의 양 사이의 상호 관계는 이 도에서 볼 수 있다. 좀더 상세하게는 실시예 3을 보라. 저장 온도, -46℃는 점선에 의해 지시된다.

도 2: 말토덱스트린 (글루시덱스 12) 농도 (% w/w)의 기능으로서(X-축) 수많은 컬쳐의 얼음 융해의 개시를 일으키는 온도(Tm’)(Y-축). "A" 컬쳐 이름은 글리세린이 컬쳐에 첨가된 것을 의미하고, B는 펠릿 냉동 전에 글리세린이 컬쳐에 첨가되지 않은 것을 의미한다.

실시예 1:

R604-E (상업적으로 이용가능한 냉동 O-컬쳐, Chr. Hansen A/S, Denmark)은 냉동 저장 동안 뭉쳐진 펠릿을 형성하는 경향이 있다. 본 연구에서, 이 문제는 융해 온도에 좀 더 밀접하게 포착함으로써, 그리고 카세인염, 수크로스 또는 말토덱스트림을 첨가함으로써 그것을 증가시키는 것을 노력함으로써 접근되어졌다.

목적:

첨가제를 사용함으로써 R04-E의 F-DVS의 녹는점을 올리는 것이 가능한지를 평가하는 것이다. R604-E의 녹점을 증가시키는 첨가제를 사용하는 것의 효과는 하기와 같이 평가된다:

시각적으로, 그리고

각각의 테스트된 제형들을 위한 DSC에 의해 Tm'을 측정함으로써 평가된다.

i) 물질:

상업적으로 이용가능한 컬쳐, F-DVS R 604-E(Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Denmark, Batch 2441258, material no. 616581)의 2kg

ii) 녹는점을 증가시키기 위한 제형을 위해 사용된 첨가제 용액:

50% (w/w) 수크로스 용액 (Danisco, Denmark).

10% (w/w) Na-카세인염 용액 (Arla, Denmark).

30% (w/w) 말토 덱스트린 DE 10 용액 (Glucidex 10, Roquette Freres, Lestrem, France).

30% (w/w) 말토 덱스트린 DE 2 용액 (Glucidex 2, Roquette Freres, Lestrem, France).

iii) F- DVS R604 -E의 제형을 위한 방법:

냉동 농축액은 녹여 표 1에 따라 첨가제를 혼합하였다.

R604-E의 제형들

제형 ID	총 세포 농축액(g)	첨가제(g)	농축액의 희석 X	첨가제^*(%)
F-DVS R604E/참고	300	0	1	0
F-DVS R604E/6% 수크로스	300	41	1,14	6
F-DVS R604E/10% 수크로스	300	75	1,25	10
F-DVS R604E/6% 말토덱스트린 DE10	300	75	1,25	6
F-DVS R604E/6% 말토덱스트린 DE2	300	75	1,25	6
F-DVS R604E/2% Na-카세인염	300	75	1,25	2

^*) g 건조된 첨가제/g 농축액

F- DVS R604 의 녹는점의 시각적 평가

F-DVS E의 제형 6은 액체 질소에서 냉동 펠릿이 되고, 펠릿들 중 100개의 개별 펠릿들 (약 20-30g)은 페트리디쉬로 옮기고, 느슨한 단일 펠릿들의 얇은 층이 형성된다. 각각의 제형들의 하나의 샘플은 -50℃로 미리 세트된 냉동고에 두었고, 샘플들의 실제 온도는 -46℃였다. 저장 7일 이후에, 샘플들이 여전히 느슨한지 또는 그 펠릿들이 덩어리를 형성하였는지 또는 뭉쳐져 있는지 및 만약 그러하다면 다시 느슨한 입자들을 교반해야 하는지 여부를 보기 위하여 시험하였다.

냉동된 펠릿들의 가시 검사와 측정된 Tm'

표시된 샘플:	-46℃에서 저장	-46℃에서, 6일 동안 저장된 샘플들에서 측정된 Tm'
F-DVS R604-E 배치 2441258 참고	-	-56
F-DVS R604-E 배치 2441258 6% 수크로스	-	-49
F-DVS R604-E 배치 2441258 10% 수크로스	++	-42
F-DVS R604-E 배치 2441258 6% 말토 덱스트린 DE10	+++	-44
F-DVS R604-E 배치 2441258 10% 말토 덱스트린 DE2	+++	-42
F-DVS R604-E 배치 2441258 2% Na-카세인염	-	-58

- = 덩어리, 뭉쳐진 또는 끈적함. (100개의 개별적인 펠릿들 중 20개 이하는 여전히 느슨한 개별 단일 펠릿들로 남아있다)

+ = 부분적으로 느슨한 입자들. (100개의 개별적인 펠릿들 중 60개 이하는 여전히 느슨한 개별 단일 펠릿들로 남아있다)

++ = 거의 느슨한 입자들. (100개의 개별적인 펠릿들 중 800개 이하는 여전히 느슨한 개별 단일 펠릿들로 남아있다)

+++ = 느슨한 입자들 (100개의 개별적인 펠릿들 중 90개 이하는 여전히 느슨한 개별 단일 펠릿들로 남아있다)

Tm' 의 측정 :

샘플들은 100㎕의 알루미나 도가니에서 준비하여 액체 질소에서 냉동시켰다. 각 제형들 중의 한 샘플 및 F-DVS R604는 6일 동안, -46℃에 놓아두었다.

상 변화는 메틀러 톨레도 822e(Mettler Toledo 822e) 시차 주사 열량계(Differential Scanning Caloriometer, DSC)에서, 100㎕의 알루미나 도가니로, 온도 프로그램, 온도 -90℃ 삽입, 스캐닝 온도 프로그램: 5℃/min.-130℃-0℃로 측정하였다.

그 Tm' 값 (루스에 의해 정의된 얼음 융해의 개시, 1995)이 측정되었다. 그 결과는 표 2에서 보여준다.

우리는 >6% 수크로스 및 6% 말토 덱스트린 (2 또는 10)의 이용이 냉동 펠릿들의 Tm' 값을 증가시키는 것을 관찰하였다. Na-카세인염의 어떤 효과를 보는 것은 불가능하였다. 가시 검사로부터 10% 수크로스 및 두 가지의 다른 말토덱스트린은 뭉쳐진 펠릿들을 만드는 경향에 대항하여 긍적적인 효과를 보였다.

실시예 2:

목적

어떤 종류의 첨가제가 냉동 컬쳐의 녹는 점을 증가시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 스크리닝 연구를 수행하였다. 다음의 첨가제들이 실험되었다:

트레할로스(Trehalose), 말토 덱스트린 12, 시클로 덱스트린, 스프레이 검, PEG, 생선 젤라틴, 말티톨(maltitol), 염화나트륨, 글리세롤.

i) 물질:

F-DVS R 604-E (배치 2471755, 물질 616581) 세부적인 사항은 실시예 1 참조.

ii) 녹는점을 올리기 위한 제형을 위해 사용된 첨가제 용액:

50% (w/w) 트레할로스.

30% (w/w) 말토 덱스트린 DE 12(글루시덱스 12(Glucidex 12), 로케트 프레르社, 레스트렘, 프랑스).

30% (w/w) 시클로덱스트린

30% (w/w) 스프레이 검 (CNI로부터의 IRX 51693)

30% (w/w) PEG (PEG 6000, 머크社, 독일)

30% (w/w) 생선 젤라틴 블룸 200 (SKW 바이오시스템社, 프랑스)

30% (w/w) 말티톨

30% (w/w) 염화나트륨

30% (w/w) 글라이세롤

iii) F- DVS R 604-E의 제형을 위한 방법:

냉동된 F-DVS R604-E 농축액을 녹여 최종 제형의 10% (W/W)로 다른 첨가제들을 혼합하였다.

Tm' 의 측정:

샘플들은 100㎕ 알루미나 도가니에서 준비하여 액체 질소에서 냉동시켰다. 상 변화 곡선은 9 제형들에 대해 메틀러 톨레도 822e 시차 주사 열량계(DSC)에 기록되었고, 참고예 (첨가제 없는 R604E)와 비교되었다. 그 샘플들은 -90℃에서 DSC에 삽입되었고 온도 프로그램을 사용하여 작용하였다: 온도 -90℃ 삽입; -130℃에서 0℃까지 7℃/min로 온도 스캐닝.

결과:

상 변화 곡선이 작성되었고, 루스(1991)에 의해 기재된 것처럼 결정된 Tm' 값은 하기 표 3에 주어졌다:

관찰된 Tm'(℃)

첨가제	Tm'(℃)
트레할로스	-38
말토 덱스트린 DE 12	-32
시클로덱스트린	-44
스프레이 검 (IRX 51693)	-31
PEG 6000	-52
생선 젤라틴 블룸 200	-37
말티톨	-42
염화나트륨	-62
글리세롤	-54
컬쳐, R-604 E	-54

참고예를 위한 Tm'은 -54℃가 되게 하였다 (얼음 융해의 개시).

다음 첨가제들은 Tm'을 증가시킨다:

PEG(-53℃)

시클로덱스트린(-44℃)

말티톨(-42℃)

트레할로스(-38℃)

생선 젤라틴(-37℃)

말토덱스트린(-32℃)

스프레이 검(-31℃)

글리세롤 및 염화나트륨은 냉동된 컬쳐 펠릿들의 녹는 점을 증가시키지 못했다.

실시예 3:

이번 시도에서, 첨가제의 양과 DSC에서 측정된 Tm'에서의 증가사이의 관계를 평가하였다.

i) 물질:

F-DVS CH N 19 (batch 2421868) (상업적으로 이용가능한 냉동된 LD - 컬쳐, Chr. 한센 A/S, 덴마크).

첨가제로서 수크로스 및 트레할로스를 이용한 CH N19 제형

제형	세포 농축액	50% 수크로스	농축액의 희석	수크로스
ID	(g)	(g)	X	%
F-DVS/-첨가제(참고)	300	0,00	1,00	0,00
F-DVS/5% 트레할로스	300	43,00	1,14	4,99
F-DVS/3% 수크로스	300	19,00	1,06	2,98
F-DVS/5% 수크로스	300	34,00	1,11	5,09
F-DVS/6% 수크로스	300	42,00	1,14	6,14
F-DVS//8% 수크로스	300	57,00	1,19	7,98
F-DVS/9% 수크로스	300	66,00	1,22	9,02
F-DVS/10% 수크로스	300	75,00	1,25	10,00
F-DVS/13% 수크로스	300	105,00	1,35	12,96

ii) 녹는점을 올리기 위해 제형에 사용한 첨가 용액들:

바이오매스 그램 당 수크로스의 농도는 3% (w/w)부터 최고 13% (w/w)까지 다양하다. 트레할로스는 오직 5% (w/w) 수준에서 실험되었다. 모든 수크로스 농도는 바이오매스에 첨가된 50% (w/w) 수크로스 용액으로 준비되었다. 트레할로스 농도는 40% (w/w) 용액으로 준비되었다.

Tm' 의 측정:

냉동 F-DVS R604-E 농축액은 녹여서 표 4에서 지시된 것처럼 다양한 첨가제들로 혼합되었다. 그 샘플들은 100㎕ 알루미나 도가니로 옮겨져서 액체 질소에서 냉동되고 분석되기 전에 -46℃에서 저장하였다. 상 변화 곡선은 8 가지 제형에 대하여 DSC에 기록되었고 참고예 (첨가제 없는 R604E)와 비교되었다. 그 샘플들은 -90℃에서 DSC로 삽입되었고 온도 프로그램을 이용하여 작동되었다: 삽입 온도 -90℃; 온도 스캐닝: 50℃/min. -130℃-0℃.

이들 상 변화 곡선으로부터의 Tm'. Tm'과 첨가된 이당류의 양 사이의 상호관계는 도 1에서 볼 수 있다.

도 1로부터 8% 수크로스 및 그 이상이 냉동된 컬쳐가 -46℃에서 저장될 때 녹기 시작하지 않음을 볼 수 있다.

실시예 4

Chr. 한센 A/S, 덴마크로부터 상업적으로 이용가능한 컬쳐들 (HP, HPS, HP-1, LP, LL-2)은 말토덱스트린의 첨가 전 및 후에 초기 녹는점을 분석하였다 (로케트 프레레 사, 레스트렘, 프랑스로부터 글루시덱스 12). 그 제품들은 냉동 펠릿으로서 판매되고, 그것들은 저장 온도 이상으로 초기 녹는점에 의해 안전하게 되도록 느슨하게 유지되어야만 한다.

목적:

본 연구의 목적은 느슨한 펠릿들을 수득하기 위하여 저장 온도 이상으로 초기 녹는점을 올리는 것이다.

물질 및 방법:

i) 물질들

글루시덱스 12 (로케트 페레사, 레스트렘, 프랑스)가 첨자게 화합물로서 이용되었다.

표 5에서 기재된 각각의 컬쳐들의 100g이 이용되었다. B는 그 컬쳐에 글리세린이 첨가되지 않은 것을 지시하고, 반면에 A는 10% v/v 글리세린이 펠릿 냉동 전에 첨가된 것을 지시한다.

사용된 컬쳐들

물질 번호	제품	배취 번호 (batch no.)
73258	HP A/B	2511924
73264	HPS A	2511063
73270	HP-1 A	2511070
72045	LP A/B	2511919
71468	LL-2 A/B	2513227

ii) 샘플들의 제형을 위한 방법:

냉동된 농축액 컬쳐들을 녹여 최종 제형의 3.5% 에서 10.1% (W/W)로 글루시덱스 12 용액을 다양한 양으로 혼합하였다.

다양한 제형들은 표 6에 기재되어 있다.

iii) Tm ’의 측정:

샘플들은 100 ㎕ 알루미나 도가니에 준비하였다. 상 변화 곡선은 모든 제형들에 있어 Mettlet DSC에 기록되었다. 그 샘플들은 -90℃에서 DSC에 삽입되었다. 스캐닝 온도 프로그램: 7℃/min.-100℃-0℃.

iiii ) F- DVS R604 의 녹는점의 가시적 평가

제형들은 액체 질소에서 냉동 펠릿이 되고 펠릿들 중에서 100개의 개별적인 펠릿들 (약 20-30g)은 페트리디쉬로 옮겨져, 느슨한 단일 펠릿들의 얇은 막을 형성하게 되었다. 저장 14일 후에, 그들이 여전히 느슨한지 또는 펠릿들이 응집체를 형성하였는지 또는 끈적하게 보이는지 및 만약 그러하다면 루스 입자들을 다시 교반해야 하는지를 보기 위하여 샘플들을 실험하였다.

결과:

다양한 양으로 다양한 컬쳐들에 말토덱스트린 (글루시덱스 12)를 첨가한 결과는 도 1에서 보여준다. 말토덱스트린의 농도 증가는 Tm'을 증가시키는 것은 분명하다. -46℃의 저장 온도 이하의 Tm'을 갖는 샘플들이 서로 끈적이게 되는 것임에 반하여 -46℃의 저장 온도 이상의 Tm'을 갖는 샘플들은 루스 펠릿이 되었다.

샘플들의 제형, 초기 녹는 점(Tm') 및 냉동 펠릿들의 가시 검사

샘플	말토덱스트린 %	Tm'	-46℃에서 저장
HP B	4.0	-46	-
HP B	6.6	-40	+++
HP B	10.1	-35	+++
HP A	3.5	-56	-
HP A	6.5	-53	-
HP A	10.0	-49	-
HP-1 A	6.0	-57	-
HPS A	0.0	-58	측정 안함
HPS A	6.1	-53	-
LP B	6.0	-45	+++
LP A	0.0	-60	측정 안함
LP A	6.0	-54	-
LL-2 B	6.1	-42	+++
LL-2 A	0.0	-61	측정 안함
LL-2 A	6.1	-54	-

표에서의 주의:

- 응집된, 뭉친 또는 끈적함을 지시한다 (100개의 개별 펠릿들 중 20개 미만은 느슨한 개별 단일 펠릿들로 남아있다).

+++ 루스 입자들을 지시한다 (100개의 개별 펠릿들 중 적어도 90개는 느슨한 개별 단일 펠릿들로 남아있다).

그 결과는 표 6 및 도 2에서 설명하고 있고, 이들은 말토덱스트린이 글리세린 (B-시리즈)를 포함하지 않는 컬쳐들에서 뿐만 아니라 10% v/v 글리세린 (A-시리즈)를 포함하는 컬쳐들에서도 Tm'을 증가시키는데 효과적인 제제임을 보여준다. 더 나아가 이들 실험은 잘 알려진 항냉동제(예. 글리세린)는 냉동 펠릿 컬쳐의 저장 동안 물리적 안정성을 증가시키기 위해선 사용될 수 없음을 증명하였다.

참고자료:

Carcoba, R. et al., “Influence of cryoprotectants on the viability and acidifying activity of fro-zen and freeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcus lactis subsp. lactis CECT 5180”, Eur Food Res Technol (2000) 211, 433-437

Chavarri, F.J. et al, “Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from non-bitter Streptococcus Lactis strains”, Biotechnology letters, vol 10, 1, 11-16 (1988)

DE2805676, (Jespersen et al.), 18 August 1978.

Fennema O. R. (ed.) Food Chemistry, 3. ed. Marcel Dekker, 1067 pp. (ISBN: 0-8247-9346-3), 1996.

FR2393251, (Jespersen et al.), 29 December 1978.

IDF (1998), International IDF Standard 146A:1998 “Identification of Characteristic Microor-ganisms”.

Roos, Y. and M. Karel (1991) Phase transitions of amorphous sucrose and frozen sucrose solu-tions. J. Food Science, 56:266-267.

ROOS, Y. Phase Transition in Foods. ACADEMIC PRESS, New York, USA. 360 pp., (ISBN: 0-12-595340-2), 1995.

US 4,140,800 (Leo Kline) 20 February 1979.

WO 00/39281 (Kringelum et al.) 6 July 2000.

WO 2004/065584 A1 (Bisgaard-Frantzen et al.) 5 August 2004 (similar to International Appli-cation Number PCT/DK2004/000025)

Claims

상업적으로 적절한 패키지에 있어서 적어도 50g 의 냉동 물질을 갖는 냉동 펠릿 유산균 (LAB) 컬쳐로서,

여기에서 냉동 물질은 냉동 물질 g 당 적어도 10⁹ CFU(colony forming units)의 생존하는 박테리아를 가지고 있고 냉동 물질의 w/w로 측정된 첨가제 화합물 0.5%부터 13%을 함유하는 개별 펠릿의 형태로 존재하고,

여기에서 첨가제 화합물은 냉동 물질의 w/w로서 측정된 첨가제 화합물의 10% 양을 사용함으로써, 냉동 유산균(LAB) 컬처의 Tm' (얼음 융해의 개시 온도)을 증가시킬 수 있는 화합물의 그룹으로부터 선택되는 첨가제 화합물로서, 첨가제 화합물이 없는 것은 -70℃부터 -46℃까지의 Tm' 값, -46℃ 이상의 Tm' 값, 이를 테면 -46℃부터 -15℃까지의 Tm' 값(DSC에 의해 측정된 것)이고,

그리고 여기에서 냉동 유산균(LAB) 컬쳐는 약 -46℃에서 7-14일 동안 저장되었을 때 냉동 컬쳐의 개별 펠릿들이 서로 뭉치지 않고 그러므로 실질적으로 다음 테스트에 의해 측정되는 개별 펠릿들로 남아있는 것으로서,

냉동된 개별 펠릿들은 액체 질소에서 냉동된 펠릿이고, 100개의 개별 펠릿들(펠릿들의 약 5-100g)은 페트리디쉬로 옮기고, 느슨한 개별 단일 펠릿들이 얇을 층을 형성하고, 그 층은 펠릿들의 대다수가 물리적으로 그것의 이웃 펠릿들의 하나 이상과 접촉되는 것임을 특징으로 하고, 7-14일 동안 약 -46℃에 두고, 그 펠릿들 이 여전히 느슨한지 또는 그 펠릿들이 덩어리를 형성하거나 서로 뭉치지 지를 실험하고, 여기에서 냉동 컬쳐의 개별 펠릿들이 실질적으로 개별 펠릿으로서 남아있게 하기 위한 기준은 100개의 개별 펠릿들의 적어도 80개는 느슨한 개별 단일 펠릿들로 남아있는 것이고;

수클로스를 이용할 수 있는 LAB를 포함하는 냉동 유산균(LAB) 컬쳐는 제외되고, 여기에서 그 컬쳐는 냉동 물질의 w/w로서 측정된 수크로스의 2%부터 13%의 양으로의 수크로스; 냉동 물질의 w/w로서 측정된 트레할로스의 4%부터 6%의 양으로의 트레할로스; 및 냉동 물질의 w/w로서 측정된 13%의 양으로 트레할로스/수크로스 혼합물 모두로 구성된 화합물로부터 구성된 그룹에서 선택되는 항냉동제 화합물을 포함한다.
제1항에 있어서, 그 컬쳐는 약 30℃에서 최적 성장 온도를 갖는 중온일반세균(mesophilic bacteria)으로 구성되어 있는 혼합된 중온성 컬쳐인 것인 펠릿-냉동 컬쳐.
제1항 또는 제2항에 있어서, 여기에서 LAB는 비피도박테리움 속(Bifidobacterium spp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium spp.), 프로피오니박테리움 속(Propionibacterium spp.), 락토코커스 락티스 subsp. 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) 및 락토코커스 락티스 subsp. 크레모리스(Lactococcus lactis subsp. cremoris)를 포함하는 락토코커스 속(Lactococcus spp.), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 포함하는 락토바실러스 속(Lacto-bacillus spp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus spp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus spp.), 페디오코커스 속(Pediococcus spp.), 오에노코커스 속(Oenococcus spp.) 및 페니실리움 속(Pencillium spp.), 크립토코커스 속(Cryptococcus spp.), 데브라리오마이세스 속(Debraryomyces spp.), 클리베로마이세스 속(Klyveromyces spp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces spp.)을 포함하는 균류 속(fungal spp.)을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 LAB인 것인 펠릿-냉동 컬쳐.
전 항들 중 어느 한 항에 있어서, 냉동 유산균(LAB) 컬쳐는 제1항에 따른 첨가제 화합물을 포함하지 않는 것은 -70℃부터 -40℃까지의 Tm' 값을 갖는 것인 펠릿-냉동 컬쳐.
전 항들 중 어느 한 항에 있어서, 냉동 유산균 컬쳐는 냉동 물질의 w/w 로서 측정된 첨가제 화합물의 5%에서 10%를 포함하는 것인 펠릿-냉동 컬쳐.
전 항들 중 어느 한 항에 있어서, 첨가제 화합물은 시클로덱스트린(Cyclodextrin), 말티톨(Maltitol), 트레할로스(Trehalose), 생선 젤라틴(Fish gelatin), 말토덱스트린(Maltodextrin), 효모추출물(Yeast extract) 및 스프레이 검(Spray gum)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 첨가제 화합물인 것인 펠릿-냉 동 컬쳐.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐를 제조하는 방법은 다음 단계들을 포함한다:

(i) 물질 g 당 적어도 10⁹ CFU(colony forming units)의 생존하는 박테리아를 갖는 물질의 적어도 50g을 수득하기 위하여 첨가제 화합물을 생존하는 박테리아에 첨가하고 물질의 w/w로서 측정된 0.5%에서 13%의 양으로 첨가제 화합물을 포함하고,

(ii) 펠릿-냉동 물질을 수득하기 위해 물질을 냉동시키고, 및

(iii) 제1항에서 제6항 중 어느 한 항의 포장된 냉동 유산균(LAB) 컬쳐를 수득하기 위해 적절한 방법으로 펠릿-냉동 물질을 포장하는 것.
제7항에 있어서, 제7항의 단계(i)에 따른 첨가제 화합물을 첨가하기 전에 첨가제 화합물을 포함하지 않는 냉동 유산균(LAB) 컬쳐의 Tm' 값을 측정하고 -70℃부터 -40℃까지의 Tm' 값을 갖는 것을 확인하고; 및

첨가제 화합물을 첨가한 후에 첨가제 화합물을 포함하는 냉동 유산균(LAB) 컬쳐의 Tm' 값을 측정하고 Tm' 값이 -49℃에서 -15℃까지, 좀더 바람직하게는 -39℃에서 -15℃까지의 값으로 다양한 것인 방법.
제7항 또는 제8항의 냉동 유산균(LAB) 컬쳐를 제조하는 방법에 의해 수득될 수 있는 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐.
식품 또는 사료 제품을 제조하기 위한 과정에서 제1항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 한 항의 펠릿-냉동 유산균(LAB) 컬쳐의 용도.