ES2344415T3 - Cultivo de bacterias de acido lactico de granulos individuales. - Google Patents
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Abstract
Cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos en un paquete comercialmente pertinente el cual tiene un peso de al menos 50 g de material congelado, donde el material congelado está presente en forma de gránulos individuales, con un contenido de bacterias viables de al menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado y comprendiendo de un 0,5% a un 13% de un compuesto aditivo medido en p/p del material congelado, donde el compuesto aditivo es un compuesto aditivo que se selecciona del grupo de compuestos aditivos que consisten en ciclodextrina, maltitol, trehalosa, gelatina de pez, maltodextrina, extracto de levadura y goma de pulverización, y el cual además se caracteriza por el hecho de que, al usar una cantidad del 10% del compuesto aditivo medido en p/p del material congelado, el compuesto es capaz de aumentar el Tm'' (temperatura de iniciación de fusión a hielo) del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas, que sin el compuesto aditivo tiene un valor Tm'' de -70ºC a -46ºC, a un valor Tm'' por encima de -46ºC, tal como de -45ºC a -15ºC (medido por DSC) y donde el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas se caracteriza por el hecho de que estando almacenado a aproximadamente -46 °C durante 7-14 días los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegan entre sí y en consecuencia sustancialmente permanecen como gránulos individuales donde esto se mide mediante la siguiente prueba los gránulos individuales del cultivo congelado son gránulos congelados en nitrógeno líquido y 100 gránulos individuales (aproximadamente 5 - 100 g de gránulos) se vierten en una placa de Petri, formando así una capa fin de gránulos únicos individuales sueltos, estando caracterizada la capa por que la mayoría de los gránulos están en contacto físico con uno o más de sus gránulos contiguos, puestos a aproximadamente -46ºC durante 7-14 días y examinados para ver si los gránulos todavía están sueltos o si los gránulos han formado aglutinaciones o están pegados entre sí donde el criterio para que los gránulos individuales del cultivo congelado permanezcan sustancialmente como gránulos individuales es que al menos 80 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos únicos individuales sueltos; con la excepción de un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado que comprende LAB que son capaces de utilizar sacarosa y donde el cultivo comprende compuesto de agente crioprotector seleccionado del grupo que consiste en sacarosa en una cantidad de un 2% a un 13% de sacarosa medida en p/p del material congelado; y trehalosa en una cantidad de un 4% a un 6% de trehalosa medida en p/p del material congelado; y una mezcla de trehalosa/sacarosa ambas en la cantidad de un 13% medido en p/p del material congelado.
Description
Cultivo de bacterias de ácido láctico de
gránulos individuales.
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La presente invención se refiere a un cultivo de
bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos en un
embalaje comercialmente pertinente el cual tiene un peso de al menos
50 g de material congelado, donde el material congelado está
presente en forma de gránulos individuales caracterizado por el
hecho de que estando almacenado a una temperatura por debajo de la
temperatura de fusión inicial (Tm') del cultivo, p. ej. a -46ºC,
durante 7-14 días los gránulos individuales del
cultivo congelado no se pegan entre sí y en consecuencia permanecen
sustancialmente como gránulos individuales.
Hay microorganismos implicados en la producción
de alimentos y productos alimenticios incluyendo la mayoría de los
productos lácteos. Cultivos bacterianos, en particular cultivos de
bacterias las cuales generalmente se clasifican como bacterias de
ácido láctico, son esenciales en el proceso de producción de todos
los productos lácteos fermentados, quesos y mantequillas. Cultivos
de bacterias de este tipo pueden ser referidos como cultivos
iniciadores y éstos imparten características específicas a
diferentes productos lácteos mediante la realización de varias
funciones.
Los cultivos lácteos iniciadores generalmente
están compuestos por bacterias de ácido láctico. En el contexto
presente, la expresión "bacterias de ácido láctico" (LAB)
designa un grupo de bacterias Gram positivas, catalasas negativas,
no móviles, que no producen esporas, microaerofílicas o anaeróbicas
que fermentan azúcares con la producción de ácidos orgánicos,
incluyendo ácido láctico como el ácido predominantemente producido,
ácido fórmico y ácido propiónico. En el presente contexto las
bacterias de ácido láctico comprenden varios géneros bacterianos
dentro del filo Firmicutes. Los géneros Carnobacterium,
Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosfaera, Leuconostoc,
Melissococcus, Oencoccus, Pediococcus, Streptococcus,
Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella están reconocidos como
LAB. También las bacterias Gram-positivas
productoras de ácido láctico pertenecientes al filo Actinobacteria
tales como los géneros Aerococcus, Microbacterium y
Propionibacterium así como Bifidobacterium se consideran
en el contexto presente como LAB. Las bacterias de ácido láctico más
útiles a nivel industrial se encuentran entre la especie
Lactococcus, la especie Streptococcus, la especie
Enterococcus, la especie Lactobacillus, la especie
Leuconostoc, la especie Bifidobacterium y la especie
Pediococcus. Además de su uso en las bacterias de ácido
láctico de la industria lechera los cultivos también tienen mucho
uso en la industria del tratamiento cárnico al igual que en otras
numerosas industrias.
Los cultivos iniciadores comerciales se pueden
distribuir como cultivos congelados. Los cultivos congelados
altamente concentrados son muy interesantes comercialmente ya que
los cultivos de este tipo se pueden inocular directamente en el
medio de fermentación (p. ej. leche o carne) sin transferencia
intermedia. En otras palabras, tales cultivos concentrados altamente
congelados comprenden bacterias en una cantidad que hace superfluos
los cultivos iniciadores a granel de producción propia en los
usuarios finales. Una "iniciadora a granel" se define aquí como
un cultivo iniciador propagado en la planta de procesamiento de
alimentos para la inoculación dentro del medio de fermentación. Los
cultivos altamente concentrados se pueden referir como cultivos de
fijación directa de artesa (DVS). Para comprender bacterias
suficientes para usarlas como un cultivo DVS en los usuarios
finales, un cultivo concentrado congelado generalmente tiene que
tener un peso de al menos 50 g y un contenido de bacterias adecuadas
de al menos 10^{9} unidades formadoras de colonias (CFU) por
g.
Un aspecto importante en el uso práctico de
cultivos congelados es la conveniencia de la manipulación real de
los cultivos. Mientras que los cultivos congelados "en bloque"
son difíciles de manejar se ha observado que los cultivos congelados
en gránulos son muy fáciles de manejar tanto para el productor como
para el consumidor.
En consecuencia, se ha formado un mercado
próspero para los cultivos congelados en gránulos altamente
concentrados, denominados como cultivos de fijación directa de
artesa congelados (F-DVS).
Han habido varias publicaciones concernientes a
la viabilidad de los cultivos congelados.
Chavarri et al. (1988) describe que la
viabilidad de un cultivo de Streptococcus lactis puro
congelado se puede mejorar por la adición de un 5% de lactosa o un
5% de sacarosa.
Cárcoba et al. (2000) describe que la
viabilidad de un cultivo congelado puro de Lactococcus lactis
subesp. lactis se puede mejorar por la adición de diferentes
agentes crioprotectores tales como azúcares (lactosa, sacarosa y
trehalosa), ácido glutámico y gelatina.
US 4.140.800 (Kline), describe que la viabilidad
de los cultivos liofilizados se puede mejorar por la adición de
diferentes agentes crioprotectores. También la viabilidad de la
lactosa, sacarosa o maltosa añadidas a cultivos congelados, está
discutida.
WO00/39281 (Kringelum et. al.) describe
que la viabilidad de un cultivo iniciador líquido no congelado se
puede mejorar por la adición de diferentes agentes crioprotectores,
y
WO 2004/065584 A1
(Bisgaard-Frantzen) describe que la viabilidad de un
cultivo iniciador congelado altamente concentrado se puede mejorar
por la adición de diferentes agentes crioprotectores.
Sólo WO 2004/065584 A1 describe cultivos
congelados en gránulos y ninguna de las publicaciones mencionadas
arriba se refiere a la estabilidad física de los cultivos congelados
en gránulos durante el almacenamiento.
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Comercialmente, un cultivo de bacterias de ácido
láctico (LAB) congelado en gránulos se proporciona normalmente en un
paquete adecuado (p. ej. en un envase de tetra pak de cartón de 2
l). Normalmente se almacena a una temperatura de almacenamiento de
alrededor de -46ºC y el material congelado está presente en forma de
gránulos individuales de un peso relativamente pequeño.
Antes de la presente invención, los inventores
presentes creían que no había ningún problema significante con
respecto al almacenamiento de tales cultivos de bacterias de ácido
láctico (LAB) congelados en gránulos comerciales relevantes.
No obstante, en base a diferentes estudios los
inventores presentes identificaron que cuando varios cultivos
comercialmente relevantes donde se almacenan a aproximadamente -46ºC
durante 7 días o más tiempo los gránulos individuales se pegaban
entre sí y hacían aglutinaciones más grandes. En los parámetros
industriales la aglutinación crea problemas de manipulación. Es p.
ej. significativamente más difícil administrar una dosis adecuada
del paquete del cultivo cuando el cultivo está aglutinado. Incluso
puede ser difícil sacar el cultivo aglutinado del paquete de una
manera conveniente.
Otros estudios identificaron que los cultivos
"problemáticos" se podrían caracterizar por tener un valor Tm'
(aparición de la fusión a hielo, tal y como se define por Roos
(1995)) del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en
gránulos por debajo de la temperatura de almacenamiento de
aproximadamente -46ºC. El valor Tm' es un término de la química
física estándar usado en la industria alimentaria y en otros
lugares. Tm' se mide rutinariamente por técnicas de Caloriometría
Diferencial de Barrido (DSC) como se describe por Roos (1991). Se
refiere a la temperatura inicial de fusión del producto alimenticio
(aquí el cultivo de LAB congelado). Para más detalles se hace
referencia a los libros de texto "Food Chemistry" (Química
alimentaria) Fennema (1996) y Roos "Phase Transition in Foods"
(Transición de fase en los alimentos) (1995).
Sin estar limitado a la teoría, se cree que
cuando un cultivo congelado tiene un valor Tm' por debajo de su
temperatura de almacenamiento, p. ej. de aproximadamente -46ºC,
ocurre una transición de fase inicial (fusión) y causa que los
gránulos individuales se peguen entre sí y formen aglutinaciones más
grandes.
En resumen, el trabajo de los inventores
presentes ha identificado hasta ahora problemas de almacenamiento no
reconocidos en relación a la apariencia física de algunos tipos de
cultivos de bacterias de ácido láctico congelados en gránulos
altamente concentrados comercialmente relevantes. Una vez habiendo
identificado este problema, los inventores presentes podrían empezar
a intentar resolver el problema.
Independientemente de cualquier explicación
teórica posible, los inventores presentes identificaron que
añadiendo ciertos compuestos aditivos adecuados a un cultivo
congelado en gránulos problemático, uno podría obtener un cultivo
congelado en gránulos, el cual después de entre 7 y 14 días de
almacenamiento a -46ºC no formó aglutinaciones de gránulos
individuales. Tales cultivos se caracterizaron por el hecho de que
los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegaron entre
sí y en consecuencia sustancialmente permanecieron como gránulos
individuales incluso después de un almacenamiento prolongado a
aproximadamente -46ºC.
A nivel global, los compuestos aditivos
relevantes pueden estar caracterizados por el hecho de ser capaces
de aumentar el valor Tm', del cultivo congelado, hasta un valor
sobre la temperatura de almacenamiento, p. ej. -46ºC, tal como por
ejemplo aumentar el valor Tm' del rango de -70 a -46ºC al rango de
-45 a -15ºC.
Los ejemplos de funcionamiento describen aquí
ejemplos preferidos de compuestos aditivos adecuados. Los compuestos
descritos incluyen trehalosa, maltodextrina, ciclodextrina, goma de
pulverización, gelatina de pescado bloom y maltitol. En base al
conocimiento común general el experto en la materia es perfectamente
capaz de identificar otros compuestos aditivos aplicables capaces de
aumentar el valor Tm', de un cultivo congelado, hasta un valor sobre
la temperatura de almacenamiento, p. ej. -46ºC.
Como se ha dicho anteriormente, para comprender
suficientes bacterias un cultivo congelado altamente concentrado
comercialmente relevante generalmente tiene un peso de al menos 50 g
y un contenido de bacterias viables de al menos 10^{9} unidades
formadoras de colonias (CPU) por g. Los cultivos descritos en los
artículos de Chavarri (1988) y Cárcoba (2000) no van dirigidos a la
estabilidad física de los cultivos congelados en gránulos, sino más
bien a la viabilidad de las bacterias congeladas en el contexto
presente no consideradas como cultivos congelados altamente
concentrados comercialmente relevantes puesto que éstos se han hecho
a una escala mucho más pequeña y comprenden significativamente menos
gramos de cultivo congelado, y además los cultivos descritos no son
cultivos congelados en gránulos. También, los cultivos descritos por
Chavarri (1988) y Cárcoba (2000) no van en absoluto dirigidos a la
estabilidad física de los cultivos congelados en gránulos, sino más
bien a la viabilidad de las bacterias congeladas.
Por consiguiente, un primer aspecto de la
invención se refiere a un cultivo de bacterias de ácido láctico
(LAB) congelado en gránulos en un paquete comercialmente pertinente
que tiene un peso de al menos 50 g de material congelado, donde el
material congelado está presente en forma de gránulos individuales,
con un contenido de bacterias viables de al menos 10^{9} unidades
formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado y
comprendiendo de un 0,5% a un 13% de un compuesto aditivo medido
como p/p del material congelado.
El compuesto aditivo se selecciona del grupo de
compuestos que, usando una cantidad del 10% del compuesto aditivo
medido como p/p del material congelado, son capaces de aumentar el
Tm' (temperatura inicial de fusión del hielo) del cultivo de
bacterias de ácido láctico congelado (LAB), el cual sin el compuesto
aditivo tiene un valor Tm' de -70ºC a -46ºC, hasta un valor de Tm'
de -45 hasta -15ºC (medido por DSC).
Además, el cultivo de bacterias de ácido láctico
(LAB) congelado se caracteriza por el hecho de que estando
almacenado a aproximadamente -46ºC durante 7-14
días los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegan
entre sí y en consecuencia permanecen sustancialmente como gránulos
individuales donde esto se mide por la prueba siguiente:
- los gránulos individuales del cultivo congelado son gránulos congelados en nitrógeno líquido y 100 gránulos individuales (alrededor de 5 - 100 g de gránulos) se vierten en una placa de Petri, formando así un estrato fino de gránulos individuales sueltos, estando caracterizado el estrato por el hecho de que la mayoría de los gránulos están en contacto físico con uno o más de sus gránulos contiguos, colocados a aproximadamente -46ºC durante 7-14 días y examinados para ver si los gránulos están todavía sueltos o si los gránulos han hecho aglutinaciones o están pegados entre sí, donde el criterio para los gránulos individuales del cultivo congelado que permanecen sustancialmente como gránulos individuales es que al menos 80 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos individuales sueltos.
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No obstante, los cultivos de bacterias de ácido
láctico (LAB) congelados que comprenden LAB que son capaces de
utilizar sacarosa y donde el cultivo comprende un compuesto de
agente crioprotector seleccionado del grupo que consiste en sacarosa
en una cantidad de un 2% a un 13% de sacarosa medida como p/p del
material congelado; y trehalosa en una cantidad del 4% al 6% de
trehalosa medida como p/p del material congelado; y una mezcla de
trehalosa/sacarosa ambos en la cantidad de entre 12% y el 14% medido
como p/p del material congelado, están específicamente exceptuadas
desde el primer aspecto de esta invención.
La "limitación de responsabilidad" descrita
al final del primer aspecto se refiere a la solicitud PCT WO
2004/065584 A1. Esta solicitud se presentó el 19 de enero de 2004.
En la fecha de presentación del borrador de solicitud de prioridad
de la solicitud presente no se publicó la solicitud PCT WO
2004/065584 A1.
WO 2004/065584 A1 se refiere a mejorar la
viabilidad durante el almacenamiento de un cultivo congelado. No
describe el problema del "pegado de los gránulos" de la
presente invención. La reivindicación principal general 1 se refiere
a "un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado que
comprende LAB el cual es adecuado para utilizar sacarosa, tiene un
peso de al menos 50 g de material congelado y un contenido de
bacterias viables de al menos 10^{9} unidades formadoras de
colonias (CFU) por g de material congelado, caracterizado por el
hecho de que el cultivo congelado comprende de un 0,5% a un 80%
de un agente crioprotector medido como p/p del material
congelado".
Aunque se describen cultivos congelados en
gránulos con agentes crioprotectores en WO 2004/065584 A1, se puede
excluir que un experto en la materia llegase inevitablemente a un
resultado decreciente dentro de los términos de WO 2004/065584 A1 ya
que WO 2004/065584 A1 específicamente sólo reivindica cultivos los
cuales son capaces de utilizar sacarosa.
Con respecto al cultivo congelado de la presente
invención, el compuesto aditivo debería añadirse a las bacterias
viables preferiblemente antes de que éstas estén congeladas.
Por consiguiente, en un segundo aspecto la
invención se refiere a un método para hacer un cultivo de bacterias
de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos del primer aspecto de
la invención y las formas de realización como se describe en este
caso, comprendiendo las siguientes fases:
- (i)
- añadir un compuesto aditivo a las bacterias viables para obtener al menos 50 g de material con un contenido de bacterias viables de al menos 109 unidades formadoras de colonias (CPU) por g de material y comprendiendo el compuesto aditivo en una cantidad de un 0,5% a un 13% medido como p/p del material,
- (ii)
- congelar el material para obtener material congelado en gránulos, y
- (iii)
- empaquetar el material congelado de una manera adecuada para obtener un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos empaquetado del primer aspecto de la invención y de las formas de realización como se describe en este caso.
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Un cuarto aspecto de la invención se refiere a
usar el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en
gránulos como se ha descrito anteriormente en un proceso para hacer
un alimento o producto alimenticio.
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Antes de una discusión de las formas de
realización detalladas de la invención se proporciona una definición
de términos específicos relacionados con los aspectos principales de
la invención.
El término "LAB capaces de utilizar
sacarosa" denota LAB capaces de fermentar la sacarosa de azúcar
con la producción de ácidos. Ésta es la misma definición que en el
número de publicación PCT WO 2004/065584 A1.
El término "material" del cultivo denota
las sustancias pertinentes del cultivo incluyendo las bacterias
viables y el agente crioprotector. El posible envasado no está
incluido. En consecuencia, el peso del material del cultivo no
incluye el peso del posible envasado.
El término "envasado" o "envase"
debería entenderse en un sentido amplio. Denota que el cultivo de
bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos se debería
envasar para proporcionarse al usuario. Puede ser envasado en una
botella, un envase de tetra-pack©, etc.
El término "un compuesto aditivo" puede ser
en el contexto presente un único compuesto aditivo específico o
pueden ser dos o más compuestos aditivos diferentes. Por
consiguiente, el porcentaje en p/p del/de los
compuesto(s)
aditivo(s) dentro del material del cultivo debería entenderse como la suma de la cantidad de compuesto(s) aditivo(s).
Preferiblemente, el término se refiere a un compuesto que se añade al cultivo después de la fermentación. Por consiguiente, puede ser un compuesto que no está presente en una cantidad significante en el caldo de fermentación del cultivo como tal.
aditivo(s) dentro del material del cultivo debería entenderse como la suma de la cantidad de compuesto(s) aditivo(s).
Preferiblemente, el término se refiere a un compuesto que se añade al cultivo después de la fermentación. Por consiguiente, puede ser un compuesto que no está presente en una cantidad significante en el caldo de fermentación del cultivo como tal.
Los términos "congelado en gránulos" y
"cultivo congelado en gránulos" se refieren a un cultivo
congelado usando un método que resulta en gránulos o granulado del
cultivo congelado. Un cultivo congelado en gránulos se puede hacer
convenientemente añadiendo el cultivo gota a gota en N_{2} líquido
formando gránulos congelados o granulado del cultivo congelado.
Típicamente, pero no necesariamente, el proceso se realiza en
cubetas en una planta de liofilización industrial convencional.
El término "gránulos" o "granulado" se
refiere a pequeñas entidades sólidas formadas por líquido congelado
de un tamaño medio de entre 0,1 y 10 mm.
Formas de realización de la presente invención
se describen abajo, sólo a modo de ejemplos.
Figura 1: La correlación entre la temperatura en
la cual ocurre la iniciación de fusión del hielo, Tm', y la cantidad
de disacáridos añadida se puede ver en esta figura. Para más
detalles, véase el Ejemplo de funcionamiento 3. La temperatura de
almacenamiento, -46ºC, se indica por una línea perforada.
Figura 2: Temperatura de iniciación de fusión
del hielo (Tm') (eje Y) de varios cultivos como función de la
concentración de maltodexdrina (Glucidex 12) (% p/p) (eje X). El
nombre del cultivo seguido de "A" indica que la glicerina se ha
añadido al cultivo, B indica que la glicerina no se ha añadido al
cultivo antes de la congelación en gránulos.
Como se ha explicado anteriormente, el valor Tm'
es un término estándar conocido en la química física describiendo la
temperatura a la cual ocurre la iniciación de la fusión del hielo.
En el contexto presente Tm' denota la temperatura a la cual ocurre
la inciciación de fusión de un cultivo de LAB congelado.
Preferiblemente, el valor Tm' se mide usando el
protocolo de DSC descrito en la sección denominada "Medición de
Tm" del ejemplo de funcionamiento 1 aquí.
Como se ha explicado con respecto al primer
aspecto de la invención la prueba para analizar si el cultivo de
bacterias del ácido láctico (LAB) congeladas en gránulos es un
cultivo que se puede caracterizar por el hecho de que estando
almacenado a aproximadamente -46ºC (en la situación presente un
congelador programado a -50ºC tenía una temperatura de muestra de
-46ºC) durante 7-14 días los gránulos individuales
del cultivo congelado no se pegan entre sí y en consecuencia
sustancialmente permanecen como gránulos individuales en una prueba
comprendiendo lo siguiente:
- Los gránulos individuales del cultivo congelado son gránulos congelados en nitrógeno líquido y 100 gránulos individuales (alrededor de 5 - 100 g de gránulos) se vierten en una placa de Petri, formando así una capa fina de gránulos únicos individuales sueltos, estando caracterizada la capa por el hecho de que la mayoría de los gránulos están en contacto físico con uno o más de sus gránulos contiguos, están colocados a aproximadamente -46ºC durante 7-14 días y examinados para ver si los gránulos todavía están sueltos o si los gránulos han formado aglutinaciones o están pegados entre sí, donde el criterio para que los gránulos individuales del cultivo congelado permanezcan sustancialmente como gránulos individuales es que al menos 80 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos únicos individuales sueltos. Más preferiblemente al menos 90 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos únicos individuales sueltos e incluso más preferiblemente al menos 95 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos únicos individuales sueltos.
El examen y el recuento de los gránulos
individuales que permanecen como gránulos únicos individuales
sueltos pueden hacerse visualmente. Está dentro de la capacidad del
experto en la materia hacer esto de una manera consistente donde los
resultados deberían, dentro de una incertidumbre técnica normal
limitada, ser consistentes y repetibles. El ejemplo de
funcionamiento 1 aquí proporciona otros detalles técnicos.
[0047] Preferiblemente, el término "un cultivo
de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado" denota aquí un
cultivo que sin comprender el compuesto aditivo añadido como se
describe en este caso tiene un valor Tm' de -70 a -46ºC. El cultivo
puede estar congelado en forma de gránulos o granulado, formando un
"cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en
gránulos". Un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB)
congelado en gránulos se puede hacer convenientemente añadiendo el
cultivo gota a gota en N_{2} líquido formando gránulos congelados
o granulado del cultivo.
El LAB del cultivo puede ser cualquier LAB
comercial pertinente en particular que no utilice sacarosa según el
IDF International Standard 146A:1998 "Identification of
Characteristic Microorganisms" (Identificación de microorganismos
característicos) usando equipos de prueba API apropiados (bioMérieux
SA, Lión, Francia). El equipo API "rapid ID 32 STREP" y "50
CHL Médium" se utiliza para establecer el estado de utilización
de sacarosa para la mayoría de géneros de LAB.
Preferiblemente, el LAB es un LAB seleccionado
del grupo comprendiendo Bifidobacterium spp.,
Brevibacterium spp., Propionibacterium spp.,
Lactococcus spp. incluyendo Lactococcus lactis subesp.
lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris,
Lactobacillus spp. incluyendo Lactobacillus acidofilus,
Streptococcus spp., Enterococcus spp.,
Pediococcus spp., Leuconostoc spp., Oenococcus
spp. y fúngico spp. incluyendo Pencillium, spp.
Criptococcus spp., Debraryomyces spp.,
Klyveromyces spp. y Saccharomyces spp.
Aunque alguna de estas especies en general se
describen como capaces de utilizar mutantes de sacarosa que no son
capaces de utilizar sacarosa, han sido, y serán continuamente
aislados. Sin importar cómo son aisladas u obtenidas tales
mutaciones, éstas todavía son un aspecto de la presente
invención.
Las bacterias de ácido láctico más útiles
industrialmente se encuentran entre la especie Lactococcus,
la especie Streptococcus, la especie Enterococcus, la
especie Lactobacillus, la especie Leuconostoc y la
especie Pediococcus.
El término "cultivo de bacterias de ácido
láctico (LAB) mezclado" denota un cultivo mezclado que comprende
dos o más especies de LAB diferentes. El término un "cultivo de
bacterias de ácido láctico (LAB) puro" denota un cultivo puro que
comprende sólo una única especie de la especie LAB.
El cultivo como se describe en este caso puede
ser un cultivo mesofílico que consiste en bacterias mesofílicas que
tienen temperaturas de crecimiento óptimo a aproximadamente 30ºC. Un
"cultivo mesofílico" es un cultivo que comprende dos o más
especies LAB mesofílicas diferentes.
Organismos típicos del grupo mesofílico incluyen
Lactococcus lactis subesp. lactis, Lactococcus lactis
subesp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subesp.
cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subesp.
lactis biovar. diacetylactis y Lactobacillus
casei subesp. casei. Las especies bacterianas de ácido
láctico termofílicas incluyen como ejemplos Streptococcus
thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus lactis,
Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subesp.
bulgaricus y Lactobacillus acidofilus.
El cultivo como se describe en este caso puede
comprender un LAB que no es capaz de utilizar sacarosa. Un así
denominado cultivo O se utiliza para hacer queso sin agujeros
(Cheddar, Cheshire, Feta) y típicamente comprende uno o más
organismos seleccionados del grupo comprendiendo Lactococcus
lactis subesp. lactis y Lactococcus lactis subesp.
cremoris. En general los cultivos O se considera que no
utilizan sacarosa.
Los cultivos congelados como se describe en este
caso son lo que en la industria alimentaria se puede denominar como
cultivos de bacterias de ácido láctico congelados en gránulos
altamente concentrados. Para comprender bacterias suficientes, tales
cultivos deberían ser relativamente grandes (tener un peso
suficiente) combinados con una concentración relativamente alta de
bacterias viables. Es obvio que si se requieren relativamente más
bacterias, el peso y/o la concentración de bacterias viables
deberían aumentar.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Preferiblemente, un cultivo de bacterias de
ácido láctico (LAB) congelado en gránulos como se describe en este
caso tiene un peso de al menos 100 g de material congelado, más
preferiblemente un peso de al menos 250 g de material congelado,
incluso más preferiblemente un peso de al menos 500 g de material
congelado y de la forma más preferible un peso de al menos 900 g de
material congelado. Preferiblemente, el peso del material congelado
es inferior a 500 kg.
Preferiblemente, un cultivo de bacterias de
ácido láctico (LAB) congelado en gránulos como se describe en este
caso tiene un contenido de bacterias viables de al menos 5x10^{9}
unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado,
más preferiblemente un contenido de bacterias viables de al menos
10^{10} unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material
congelado, y de la forma más preferible un contenido de bacterias
viables de al menos 2x10^{10} unidades formadoras de colonias
(CFU) por g de material congelado.
La fermentación y los medios de fermentación
adecuados para las LAB que se conocen en la técnica y por el experto
en la materia son capaces de seleccionar unos medios adecuados y
condiciones de fermentación en relación a las LAB específicas.
Medios adecuados y fermentaciones se dan en la sección del ejemplo
de funcionamiento aquí.
Para obtener una cantidad suficiente de
bacterias, se prefiere en el contexto presente hacer una
fermentación a escala relativamente grande en tanques de
fermentación grandes adecuados. Se prefieren tanques de fermentación
de al menos 50 l, preferiblemente al menos 90 l, incluso más
preferiblemente 500 l o más.
Después de una fermentación adecuada, las
bacterias viables preferiblemente se aíslan por eliminación del
líquido (sobrenadante) de los medios de fermentación (p. ej. por
centrifugado). Las bacterias aisladas viables pueden denominarse
como la biomasa aislada. Las bacterias aisladas viables deberán
tener preferiblemente un contenido de bacterias viables de al menos
10^{9} unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material
congelado, más preferiblemente un contenido de al menos 5x10^{9}
CFU por g de material congelado, y de la forma más preferible un
contenido de al menos 10^{10} CFU por g de material congelado.
Después de añadir el compuesto aditivo (véase
abajo) al cultivo concentrado. El cultivo se puede congelar
convenientemente añadiendo la mezcla gota a gota en N_{2} líquido
formando gránulos congelados o granulado de la mezcla. Un método
realizable para el proceso de congelación se describe en DE2805676 y
FR2393251.
El cultivo congelado en gránulos se envasa luego
de una manera adecuada para proporcionarse al usuario.
Como se ha mencionado anteriormente,
preferiblemente los compuestos aditivos pertinentes se caracterizan
por el hecho de que estos son capaces de aumentar el valor Tm', del
cultivo congelado, hasta un valor sobre la temperatura de
almacenamiento, p. ej. -46ºC, tal como a un valor Tm' de -45ºC a
-15ºC, más preferiblemente hasta un valor Tm' de -43ºC a -15ºC e
incluso más preferiblemente hasta un valor Tm' de -39ºC a -15ºC.
El ejemplo de funcionamiento 2 aquí ilustra una
estrategia rápida experimental para identificar compuestos aditivos
pertinentes. A un cultivo congelado "modelo" con un valor Tm'
por debajo de -46ºC (en el cultivo "modelo" del ejemplo 2 tiene
un valor Tm' de -54ºC) se añadieron diferentes compuestos
pertinentes (10% p/p) y se midieron los valores Tm' antes y después
de la adición por DSC.
El cultivo "modelo" del ejemplo 2 y el
protocolo de prueba de este ejemplo 2 se usa preferiblemente para
evaluar si los compuestos aditivos específicos de interés pueden
caracterizarse por el hecho de que éstos son capaces de aumentar el
valor Tm1, del cultivo congelado, hasta un valor sobre los -46ºC tal
como hasta un valor Tm' de -45ºC a -15ºC, más preferiblemente hasta
un valor Tm' de -43ºC a -15ºC, incluso más preferiblemente hasta un
valor Tm' de -39ºC a -15ºC.
En el ejemplo de funcionamiento 2 se puede
observar que la ciclodextrina aumentó el Tm' a -44ºC, el maltitol
aumentó el Tm' a -42ºC, la trehalosa aumentó el Tm' a -38ºC, la
gelatina de pez aumentó el Tm' a - 37ºC, la maltodextrina aumentó el
Tm' a -32ºC y la goma de pulverización aumentó el Tm' a -31ºC.
Preferiblemente, el compuesto aditivo es un
compuesto con un peso molecular (PM) de 150 a 100.000 g/mol, más
preferiblemente de 250 a 100.000 g/mol, incluso más preferiblemente
de 300 a 40.000 g/mol y de la forma más preferible de 500 a 15.000
g/mol.
En una forma de realización preferida el
compuesto aditivo también es un agente crioprotector.
El término "un agente crioprotector" denota
una sustancia que es capaz de mejorar la estabilidad de
almacenamiento del cultivo congelado medido por la viabilidad del
cultivo. En el contexto presente éste puede ser un único agente
crioprotector específico o dos o más agentes diferentes. Por
consiguiente, el porcentaje en p/p del/de los agente(s)
crioprotector(es) dentro del material de cultivo se debería
entender como la suma de la cantidad de agente(s)
crioprotector(es).
El agente crioprotector se puede seleccionar
preferiblemente a partir de proteínas o hidrolizados de proteínas.
Los ejemplos preferidos adecuados de éstos incluyen los
seleccionados del grupo que consiste en extracto de malta, polvo de
leche desnatada, polvo de lactosuero, extracto de levadura, gluten,
colágeno, gelatina, elastina, queratina, y albúminas.
Más preferiblemente, el agente crioprotector es
un carbohidrato o un compuesto implicado en la biosíntesis de ácidos
nucleicos. Los carbohidratos adecuados preferidos incluyen los
seleccionados del grupo que consiste en pentosas (por ejemplo
ribosa, xilosa), hexosas (por ejemplo fructosa, mañosa, sorbosa),
disacáridos (por ejemplo sacarosa, trehalosa, melibiosa, lactulosa),
oligosacáridos (por ejemplo rafinosa), oligofrutosas (por ejemplo.
Actilight, fribralosas), polisacáridos (por ejemplo maltodextrinas,
goma de xantano, pectina, alginato, celulosa microcristalina,
dextrano, PEG), y polialcoholes (sorbitol, manitol). De la forma más
preferible, el carbohidrato es un carbohidrato con un peso molecular
(PM) de 150 a 100.000 g/mol, más preferiblemente de 250 a 100.000
g/mol, incluso más preferiblemente de 300 a 40.000 g/mol y de la
forma más preferible de 500 a 15.000 g/mol.
En una forma de realización muy preferida, el
compuesto aditivo es un compuesto aditivo seleccionado del grupo que
consiste en ciclodextrina, maltitol, gelatina de pez, maltodextrina
(preferiblemente maltodextrina DE 2 a maltodextrina DE 19), goma de
pulverización (p. ej. goma de pulverización IRX 51693),
inosina-5'-monofosfato (IMP) e
inosina.
El cultivo congelado comprende de un 0,5% a un
13% de un compuesto aditivo medido como p/p del material congelado,
preferiblemente de un 1% a un 12% de un compuesto aditivo medido
como p/p del material congelado, más preferiblemente de un 2% a un
10% de un compuesto aditivo medido como p/p del material congelado e
incluso más preferiblemente de un 5% a un 10% de un compuesto
aditivo medido como p/p del material congelado.
La adición del compuesto aditivo, que también
puede ser un agente crioprotector, después de la fermentación, para
las bacterias aisladas viables (biomasa) puede hacerse mezclando el
compuesto aditivo sólido con la biomasa durante p. ej. 30 minutos a
una temperatura adecuada. Si el agente del compuesto aditivo es p.
ej. maltodextrina una temperatura adecuada puede ser la temperatura
ambiente. De forma alternativa, se puede mezclar una solución
estéril del compuesto aditivo con la biomasa.
Como se ha dicho anteriormente, un segundo
aspecto de la invención se refiere a un método para hacer un cultivo
de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas en gránulos del
primer aspecto de la invención comprendiendo las fases
siguientes:
- (i)
- añadir un compuesto aditivo a bacterias viables para obtener al menos 50 g de material con un contenido de bacterias viables de al menos 10^{9} unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material y comprendiendo el compuesto aditivo en una cantidad del 0,5% al 13% medido como p/p del material,
- (ii)
- congelar el material para obtener material congelado en gránulos, y
- (iii)
- envasar el material congelado en gránulos de una manera adecuada.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha mencionado anteriormente, los
cultivos "problemáticos" más relevantes aquí son los cultivos
de bacterias de ácido láctico (LAB) congelados en gránulos los
cuales sin comprender el compuesto aditivo añadido como se describe
en este caso tiene un valor Tm' de entre -70ºC y -46ºC.
Por consiguiente, en una forma de realización
preferida antes de añadir el compuesto aditivo según la etapa (i)
anterior uno ha medido el valor Tm' del cultivo de bacterias de
ácido láctico (LAB) congelado sin comprender el compuesto aditivo y
ha identificado que éste tiene un valor Tm' de entre -70ºC y -46ºC o
incluso menos.
Antes de hacer la adición del compuesto aditivo
según la etapa (i) anterior uno ha realizado una prueba de
aglutinación del granulado (véase arriba) y ha identificado que los
gránulos individuales del cultivo congelado se pegan entre sí en un
almacenamiento a -46ºC.
Preferiblemente, después de la adición del
compuesto aditivo el valor Tm' del cultivo de bacterias de ácido
láctico (LAB) congeladas comprendiendo el compuesto aditivo se mide
y se verifica que el valor Tm' es superior a -46ºC, preferiblemente
de -45ºC a -15ºC, más preferiblemente de -43ºC a -15ºC e incluso más
preferiblemente de -39ºC a -15ºC.
Finalmente, después de la adición del compuesto
aditivo el cultivo se congela en gránulos y se realiza una prueba de
aglutinación de los gránulos (véase arriba) asegurando que al menos
80 de los 100 gránulos individuales permanecen como gránulos únicos
individuales sueltos.
Un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB)
congelado como se describe en este caso se puede utilizar en un
proceso para hacer un alimento o producto alimenticio según la
técnica.
R604-E (un cultivo O congelado
disponible comercialmente, Chr. Hansen A/S, Dinamarca) tiende a
formar gránulos pegajosos durante el almacenamiento congelado. En el
estudio presente este problema se aborda echando un vistazo más de
cerca a la temperatura de fusión, e intentando aumentarla añadiendo
caseinato, sacarosa o maltodextrina.
Evaluar si es posible elevar el punto de fusión
de F-DVS de R604-E usando
aditivos.
El efecto de usar aditivos para elevar el punto
de fusión de R604-E se evalúa:
- visualmente, y
- midiendo el Tm' por DSC para cada una de las formulaciones evaluadas.
2 kilos de cultivo disponible comercialmente,
F-DVS R 604-E (Chr. Hansen A/S,
Hoersholm, Dinamarca, lote 2441258, material nº. 616581).
- un 50% (p/p) de solución de sacarosa (Danisco, Dinamarca),
- un 0% (p/p) de solución de Na-caseinato (Arla, Dinamarca).
- un 30% (p/p) de solución de malto dextrina DE 10 (Glucidex 10, Roquette Fréres, Lestrem, Francia).
- un 30% (p/p) de solución de malto dextrina DE 2 (Glucidex 2, Roquette Fréres, Lestrem, Francia).
El concentrado congelado se descongeló y mezcló
con aditivos según la Tabla 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
Las 6 formulaciones de F-DVS
R-604 E se congelaron en gránulos en nitrógeno
líquido y 100 gránulos individuales (alrededor de 20 - 30 g) de
gránulos se vertieron en placas de Petri, formando así un estrato
fino de gránulos únicos sueltos.
Una muestra de cada una de las formulaciones se
colocó en un congelador programado a -50ºC, la temperatura real de
las muestras era de -46ºC. Después de 7 días de almacenamiento las
muestras se examinaron para ver si éstas todavía estaban sueltas o
si los gránulos habían hecho aglutinaciones o parecían pegajosos, y
de ser así, su disposición para agitarse hasta obtener de nuevo
partículas sueltas.
Las muestras se prepararon en 100 \mul de
crisoles de alúmina y se congelaron en nitrógeno líquido. Una
muestra de cada una de las formulaciones y de F-DVS
R604 se guardó durante 6 días a -46ºC.
La transición de fase se midió en un Calorímetro
por Análisis Diferencial Mettler Toledo 822e (una DSC) con 100
\mul de crisoles de alúmina, un programa de temperatura, una
temperatura insertada de -90ºC, un programa de temp. de análisis:
5ºC/min. -130ºC -0ºC.
Se midieron los valores Tm' (inicio de fusión
del hielo, tal y como se define por Roos (1995)). Los resultados se
muestran en la Tabla 2.
Observamos que el uso de un >6% de sacarosa y
un 6% de malto dextrina (2 ó 10) aumenta el valor Tm' de los
gránulos congelados. No es posible ver ningún efecto del
Na-caseinato. A partir de la inspección visual un
10% de sacarosa y las dos diferentes maltodextrinas muestran un
efecto positivo contra la tendencia a hacer gránulos pegajosos.
Para identificar qué clase de aditivos podían
elevar el punto de fusión del cultivo congelado se hizo un estudio
de selección. Se evaluaron los aditivos siguientes:
Trehalosa, malto dextrina 12, ciclo dextrina,
goma de pulverización, PEG, gelatina de pez, maltitol, cloruro
sódico, glicerol.
F-DVS R 604-E
(lote 2471755, material 616581) para más detalles por favor véase el
Ejemplo 1.
- 50% (p/p) de trehalosa.
- 30% (p/p) de malto dextrina DE 12 (Glucidex 12, Roquette Fréres, Lestrem, Francia).
- 30% (p/p) de ciclodextrina
- 30% (p/p) de goma de pulverización (IRX 51693 de CNI)
- 30% (p/p) de PEG (PEG 6000, Merck, Alemania)
- 30% (p/p) de gelatina de pez bloom 200 (SKW Biosystems, Francia)
- 30% (p/p) de maltitol
- 30% (p/p) de cloruro sódico
- 30% (p/p) de glicerol
El concentrado F-DVS
R604-E congelado se descongeló y se mezcló con los
diferentes aditivos hasta una formulación final del 10% (p/p).
Las muestras se prepararon en 100 \mul de
crisoles de alúmina y se congelaron en nitrógeno líquido. Las curvas
de transición de fase se registraron en el Calorímetro por Análisis
Diferencial Mettler Toledo 822e para las 9 formulaciones y se
compararon con la muestra de referencia (R604E sin aditivos). Las
muestras se insertaron en la DSC a -90ºC y se utilizaron usando el
programa de temperatura: temperatura de inserto -90ºC; temperatura
de análisis 7ºC /min de -130ºC a 0ºC.
Se hicieron las curvas de transición de fase y
se determinaron los valores Tm' como se describe por Roos (1991) los
valores se dan en la tabla 3 abajo:
El Tm' para la muestra de referencia se observó
de -54ºC (inicio de fusión del hielo).
Los aditivos siguientes elevan el Tm':
- PEG (-53ºC),
- Ciclodextrina (-44ºC),
- Maltitol (-42ºC),
- Trehalosa (-38ºC)
- Gelatina de pez (-37ºC)
- Maltodextrina 12 (-32ºC)
- Goma de pulverización (-31ºC)
El glicerol y el cloruro sódico no elevaron el
punto de fusión de los gránulos del cultivo congelados.
En esta prueba la intensión fue para evaluar la
relación entre cantidad de aditivo y aumento en el Tm' medido en
DSC.
F-DVS CH N 19 (lote 2421868)
(cultivos LD congelados disponibles comercialmente, Chr. Hansen A/S,
Dinamarca).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de sacarosa por gramo de
biomasa varió del 3% (p/p) al 13% (p/p). La trehalosa sólo se evaluó
en un nivel del 5% (p/p). Todas las concentraciones de sacarosa se
prepararon a partir de un 50% (p/p) de solución de sacarosa añadida
a la biomasa. La concentración de trehalosa se obtuvo a partir de un
40% (p/p) de solución.
El concentrado F-DVS
R604-E congelado se descongeló y se mezcló con los
diferentes aditivos como se indica en la tabla 4. Luego las muestras
se transfirieron a 100 \mul de crisoles de alúmina y se congelaron
en nitrógeno líquido y se almacenaron a -46ºC antes de analizarse.
Las curvas de transición de fase se registraron en la DSC para las 8
formulaciones y se compararon con la muestra de referencia (R604E
sin aditivos). Las muestras se insertaron en la DSC a -90ºC y se
utilizaron usando el programa de temperatura: temperatura de inserto
-90ºC; temperatura de análisis: 5ºC/min. -130ºC -0ºC.
A partir de estas curvas de transición de la
fase el Tm'. La correlación entre el Tm' y la cantidad de
disacáridos añadidos puede verse en la Figura 1.
A partir de la Figura 1 se puede observar que un
8% de sacarosa y más asegurará que el cultivo congelado no comienza
a fusionarse a un almacenamiento de -46ºC.
Los cultivos disponibles comercialmente de Chr.
Hansen A/S, Dinamarca (CV, HPS, HP-1, LP,
LL-2) se analizaron para obtener el punto de fusión
inicial antes y después de la adición de maltodextrina (Glucidex 12
de Roquette Fréres, Lestrem, Francia). Los productos se venden como
gránulos congelados, y estos deberían mantenerse sueltos lo cual se
asegura mediante un punto de fusión inicial por encima de la
temperatura de almacenamiento.
El objetivo del estudio presente fue de elevar
el punto de fusión inicial por encima de la temperatura de
almacenamiento para obtener gránulos sueltos.
\vskip1.000000\baselineskip
Glucidex 12 (roquette Fréres, Lestrem, Francia)
se usó como compuesto aditivo.
100 g de cada uno de los cultivos catalogados se
usaron en la Tabla 5. B indica que la glicerina no se añadió al
cultivo, donde como A indica que un 10% v/v de glicerina se añadió
antes de la congelación a gránulos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cultivos concentrados congelados se
descongelaron y mezclaron con las diferentes cantidades de una
solución de Glucidex 12 hasta obtener una formulación final de un
3,5% a un 10,1% (p/p).
Las diferentes formulaciones se catalogan en la
Tabla 6.
Las muestras se prepararon en 100 \mul de
crisoles de alúmina. Las curvas de transición de fase se registraron
en el DSC Mettlet para todas las formulaciones. Las muestras se
insertaron en la DSC a -90ºC. Programa de temperatura de análisis:
7ºC/min. -100ºC -0ºC.
Las formulaciones se congelaron a gránulos en
nitrógeno líquido y 100 gránulos individuales (alrededor de 20 - 30
g) de los gránulos se vertieron en placas de Petri, formando así un
estrato fino de gránulos únicos sueltos. Una muestra de cada una de
las formulaciones se colocó a -46ºC. Después de 14 días de
almacenamiento las muestras se examinaron para ver si éstas todavía
estaban sueltas o si los gránulos habían hecho aglutinaciones o
parecían pegajosos, y de ser así, su disposición para agitarse hasta
conseguir que las partículas vuelvan a estar sueltas.
Los resultados de añadir maltodextrina (Glucidex
12) a cultivos diferentes en diferentes cantidades se muestran en la
Figura 1. Está claro que aumentar la concentración de maltodextrina
eleva el Tm'. En la Tabla 2 se catalogan los resultados de evaluar
la pegajosidad/aglutinación. Muestras con un Tm' superior a la
temperatura de almacenamiento de -46ºC eran gránulos sueltos donde
como las muestras que tienen un Tm' inferior a -46ºC se pegaban
entre sí.
El resultado se ilustra en la tabla 6 y en la
Fig. 2 y muestra que la maltodextrina es un agente eficaz para
elevar el Tm' en cultivos conteniendo un 10% p/p de glicerina (serie
A) también en cultivos no conteniendo glicerina (serie B). Este
experimento demuestra además que un crioprotector bien conocido (es
decir, glicerina) no puede utilizarse para aumentar la estabilidad
física durante el almacenamiento de un cultivo congelado en
gránulos.
Cárcoba, R. et al., "Influence
of cryoprotectants on the viability and acidifying activity of
frozen and freeze-dried cells of the novel starter
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2004 (similar al Número de Solicitud Internacional
PCT/DK2004/000025).
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de documentos citados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
- \bullet US 4140800 A, Kline [0010]
- \bullet WO 2004065584A1 A [0028]
- \hskip0,3cm[0120]
- \hskip0,3cm[0028] [0035]
- \bullet WO 0039281 A, Kringelum
- \bullet DE 2805676 [0062] [0120]
- \hskip0,3cm[0011] [0120]
- \bullet FR 2393251 [0062] [0120]
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- \bullet DK 2004000025 W [0120]
\hskip0,3cmFrantzen [0012] [0013] [0029]
\hskip0,3cm[0030] [0030] [0030]
[0120]
\bulletCárcoba, R. et al.
Influence of cryoprotectants on the viability and acidifying
activity of frozen and freeze- dried cells of the novel starter
strain Lactococcus lactis subsp. lactis CECT 5180 Eur Food Res
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Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from
non-bitter Streptococcus Lactis strains
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\bulletRoos, Y. M. Karel Phase
transitions of amorphous sucrose and frozen sucrose solutions J.
Food Science, 1991, vol. 56, 266-267
[0120]
\bulletROOS, Y. Phase Transition in
Foods. ACADEMIC PRESS 1995. 360- [0120]
Claims (12)
1. Cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB)
congelado en gránulos en un paquete comercialmente pertinente el
cual tiene un peso de al menos 50 g de material congelado, donde el
material congelado está presente en forma de gránulos individuales,
con un contenido de bacterias viables de al menos 10^{9} unidades
formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado y
comprendiendo de un 0,5% a un 13% de un compuesto aditivo medido en
p/p del material congelado, donde el compuesto aditivo es un
compuesto aditivo que se selecciona del grupo de compuestos aditivos
que consisten en ciclodextrina, maltitol, trehalosa, gelatina de
pez, maltodextrina, extracto de levadura y goma de pulverización, y
el cual además se caracteriza por el hecho de que,
al usar una cantidad del 10% del compuesto
aditivo medido en p/p del material congelado, el compuesto es capaz
de aumentar el Tm' (temperatura de iniciación de fusión a hielo) del
cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas, que sin el
compuesto aditivo tiene un valor Tm' de -70ºC a -46ºC, a un valor
Tm' por encima de -46ºC, tal como de -45ºC a -15ºC (medido por
DSC)
y donde el cultivo de bacterias de ácido láctico
(LAB) congeladas se caracteriza por el hecho de que estando
almacenado a aproximadamente -46 °C durante 7-14
días los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegan
entre sí y en consecuencia sustancialmente permanecen como gránulos
individuales donde esto se mide mediante la siguiente prueba
los gránulos individuales del cultivo congelado
son gránulos congelados en nitrógeno líquido y 100 gránulos
individuales (aproximadamente 5 - 100 g de gránulos) se vierten en
una placa de Petri, formando así una capa fin de gránulos únicos
individuales sueltos, estando caracterizada la capa por que
la mayoría de los gránulos están en contacto físico con uno o más de
sus gránulos contiguos, puestos a aproximadamente -46ºC durante
7-14 días y examinados para ver si los gránulos
todavía están sueltos o si los gránulos han formado aglutinaciones o
están pegados entre sí donde el criterio para que los gránulos
individuales del cultivo congelado permanezcan sustancialmente como
gránulos individuales
es que al menos 80 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos únicos individuales sueltos;
es que al menos 80 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos únicos individuales sueltos;
con la excepción de un cultivo de bacterias de
ácido láctico (LAB) congelado que comprende LAB que son capaces de
utilizar sacarosa y donde el cultivo comprende compuesto de agente
crioprotector seleccionado del grupo que consiste en sacarosa en una
cantidad de un 2% a un 13% de sacarosa medida en p/p del material
congelado; y trehalosa en una cantidad de un 4% a un 6% de trehalosa
medida en p/p del material congelado; y una mezcla de
trehalosa/sacarosa ambas en la cantidad de un 13% medido en p/p del
material congelado.
2. Cultivo congelado en gránulos según la
reivindicación 1, donde el cultivo es un cultivo mesofílico mezclado
el cual consiste en bacterias mesofílicas que tienen temperaturas de
crecimiento óptimo a aproximadamente 30ºC.
3. Cultivo congelado en gránulos según la
reivindicación 1 ó 2, donde el LAB es un LAB seleccionado del grupo
comprendiendo Bifidobacterium spp., Brevibacterium
spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp.
incluyendo Lactococcus lactis subesp. lactis y
Lactococcus lactis subesp. cremoris, Lactobacillus
spp. incluyendo Lactobacillus acidofílus, Streptococcus spp.,
Enterococcus spp., Pediococcus spp., Oenococcus
spp. y fúngico spp. incluyendo Pencillium, spp.
Criptococcus spp., Debraryomyces spp.,
Klyveromyces spp. y Saccharomyces spp.
4. Cultivo congelado en gránulos de cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, donde el cultivo de bacterias
de ácido láctico (LAB) congelado es un cultivo que sin comprender el
compuesto aditivo según la reivindicación 1 tiene un valor Tm' de
-70ºC a -46ºC.
5. Cultivo congelado en gránulos de cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, donde el cultivo de bacterias
de ácido láctico congelado comprende de un 5% a un 10% del compuesto
aditivo medido en p/p del material congelado.
6. Método para hacer un cultivo de bacterias de
ácido láctico (LAB) congelado en gránulos de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 comprendiendo las siguientes etapas:
- (i)
- añadir un compuesto aditivo a bacterias viables para obtener al menos 50 g de material con un contenido de bacterias viables de al menos 10^{9} unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material y comprendiendo el compuesto aditivo en una cantidad de un 0,5% a un 13% medido en p/p del material,
- (ii)
- congelar el material para obtener material congelado en gránulos, y
- (iii)
- envasar el material congelado en gránulos de una manera adecuada para obtener un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado envasado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Método según la reivindicación 6, donde
antes de añadir el compuesto aditivo según la
etapa (i) de la reivindicación 6 uno ha medido el valor Tm' del
cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado sin comprender
el compuesto aditivo y ha identificado que éste tiene un valor Tm'
de entre -70ºC y -46ºC; y
después de añadir el compuesto aditivo se mide
el valor Tm' del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB)
congelado comprendiendo el compuesto aditivo medido y se verifica
que el valor Tm' sea de -49ºC a -15ºC, más preferiblemente de -39ºC
a -15ºC.
8. Método según la reivindicación 6 ó 7, donde
el cultivo es un cultivo mesofílico mezclado que consiste en
bacterias mesofílicas las cuales tienen temperaturas de crecimiento
óptimo a aproximadamente 30ºC.
9. Método según la reivindicación 6 a 8, donde
el LAB es un LAB seleccionado del grupo comprendiendo
Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp.,
Propionibacterium spp., Lactococcus spp. incluyendo
Lactococcus lactis subesp. lactis y Lactococcus
lactis subesp. cremoris, Lactobacillus spp. incluyendo
Lactobacillus acidofilus, Streptococcus spp.,
Enterococcus spp., Pediococcus spp., Oenococcus
spp. y fúngico spp. incluyendo Pencillium, spp.
Cryptococcus spp., Debraryomyces spp.,
Klyveromyces spp. y Saccharomyces spp.
10. Método según la reivindicación 6 a 9, donde
el cultivo de bacterias de ácido láctico congeladas comprende de un
5% a un 10% del compuesto aditivo medido en p/p del material
congelado.
11. Método según la reivindicación 6 a 10, donde
el compuesto aditivo es un compuesto aditivo seleccionado del grupo
que consiste en ciclodextrina, maltitol, trehalosa, gelatina de pez,
maltodextrina, extracto de levadura y goma de pulverización.
12. Uso del cultivo de bacterias de ácido
láctico (LAB) congelado en gránulos de cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 en un proceso para fabricar un
alimento o producto alimenticio.
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