BRPI0507956B1

BRPI0507956B1 - cultura de bactérias doácido lático (lab) congelada em péletes, método para sua fabricação euso da dita cultura

Info

Publication number: BRPI0507956B1
Application number: BRPI0507956-0A
Authority: BR
Inventors: Rikke Stavnsbjerg; Inge Knap; Hans Bisgaard-Frantzen
Original assignee: Chr. Hansen A/S
Priority date: 2004-02-24
Filing date: 2005-02-24
Publication date: 2020-11-03
Also published as: CN1922305B; PL1720974T5; JP2011234725A; CA2557496A1; MA28484B1; AU2005215858B2; ES2344415T5; ZA200606222B; JP2007522809A; EP1720974B2; EA010855B1; ATE466070T1; NO20064300L; EP1720974A1; DK1720974T4; EA200601540A1; AU2005215858A1; EP2223609A1; JP5727308B2; KR20060131854A

Abstract

CULTURA BACTERIANA DE ÁCIDO LÁTICO, CONGELADA, EM PÉLETES INDIVUDUAIS. A presente invenção refere-se a uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada, em uma embalagem comercialmente relevante que tem um peso de pelo menos 50 g de material congelado, onde o material congelado está presente na forma de péletes indivuduais, distinguida pelo fato de que, quando estocada a -198>C por 7 a 14 dias, os péletes individuais da cultura congelada não estão grudados entre si, e portanto, permanecem substancialmente como pélestes individuais.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a uma cultura de bactérias do á- cido lático (LAB), congelada, em péletes, em uma embalagem comercial- mente relevante, que tem um peso de pelo menos 50 g de material congelado, onde o material congelado está presente na forma de péletes individuais, distinguido pelo fato de que, quando estocado em uma temperatura abaixo da temperatura de fusão inicial (Tm1) da cultura, como por exemplo, -46 °C, por 7 a 14 dias, os péletes individuais da cultura congelada não grudam uns nos outros, e portanto, permanecem substancialmente como péletes individuais.

Antecedentes da Invenção

Microorganismos estão envolvidos na fabricação de alimentos e rações, inclusive a maioria dos produtos lácteos. Culturas bacterianas, particularmente as culturas de bactérias classificadas genericamente como bactérias do ácido lático, são essenciais na fabricação de produtos lácteos fermentados, queijo e manteiga. As culturas de tais bactérias podem ser referidas como culturas iniciadoras e elas conferem características específicas aos vários produtos lácteos por realizarem inúmeras funções.

As culturas lácteas iniciadoras são compostas genericamente de bactérias do ácido lático. No presente contexto, a expressão "bactérias do ácido lático" (LAB) designa um grupo de bactérias gram-positivas, catalase- negativas, imóbeis, não-esporulante, microaerofílicas ou anaeróbicas, que fermentam açúcares com a produção de ácidos orgânicos, inclusive o ácido lático como ácido predominantemente produzido, ácido fórmico e ácido pro- piônico. No presente contexto, as bactérias do ácido lático compreendem inúmeros gêneros de bacterianos dentro do filo Fírmícutes. Os gêneros Car- nobacteríum, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactoshaera, Leu- conostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetra- genococcus, Vagococcus e Weissellasão reconhecidos Omo LAB. Além disso, as bactérias produtoras de ácido lático, pertencentes ao filo Actino- bacteria, tais'como os gêneros Aerococcus, Microbacteriume Propionibacte- rium, bem como Bifidobacterium,são consideradas, no presente contexto, como LAB. As bactérias do ácido lático industrialmente mais úteis são encontradas entre as espécies de Lactococcus,espécies de Streptococcus, espécies de Enterococcus,espécies de Lactobacillus,espécies de Leuco- nostoc, espécies de Bifidobacteriume espécies de Pediococcus.Além do seu uso na indústria de laticínios, as culturas de bactérias do ácido lático encontram também uso disseminado na indústria de processamento de car-nes, bem como inúmeras outras indústrias.

As culturas iniciadoras existentes no mercado podem ser distribuídas como culturas congeladas. As culturas congeladas altamente concentradas são comercialmente muito interessantes, pois tais culturas podem ser inoculadas diretamente dentro do meio de fermentação (como por exemplo, leite ou carne), sem transferência intermediária. Em outras palavras, tais culturas congeladas altamente concentradas compreendem bactérias em uma quantidade que torna supérfluas as culturas iniciadoras a granel de produção própria nos usuários finais. Uma "iniciadora a granel" é aqui definida como uma cultura iniciadora propagada na fábrica de processamento de alimentos para inoculação dentro do meio de fermentação. As culturas altamente concentradas podem ser referidas como culturas de fixação direta na dorna (DVS). Para incluir bactérias suficientes para serem usadas como uma cultura DVS nos usuários finais, uma cultura congelada concentrada tem de ter genericamente um peso de pelo menos 50 g e um teor de bactérias viáveis de pelo menos 109 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama.

Uma questão importante no uso prático de culturas congeladas é a conveniência do manuseio real das culturas. Enquanto que as culturas congeladas "em bloco" são difíceis de manusear, descobriu-se que as culturas congeladas em péletes são muito fáceis de manusear, tanto para o produtor como para o consumidor.

Conseqüentemente, formou-se um mercado vicejante para culturas congeladas altamente concentradas em péletes, assim denominadas culturas congeladas por fixação direta na doma (F-DVS).

Ocorreram inúmeras publicações quanto à viabilidade de culturas congeladas.

Chavarri et ai. (1988) descrevem que a viabilidade de uma cultura congelada pura de Streptococcus lactis pode ser melhorada pela adição de 5% de lactose ou 5% de sacarose.

Cárcoba et a/. (2000) descrevem que a viabilidade de uma cultura congelada pura de Lactococcus lactis subespécie lactis pode ser melhorada pela adição de diferentes agentes crioprotetores, tais como açúcares (lactose, sacarose e trealose), ácido glutâmico e gelatina.

A patente n- US 4.140.800 (Kline) descreve que a viabilidade de culturas atomizadas pode ser melhorada pela adição de diferentes agentes crioprotetores. Além disso, é discutida a viabilidade de culturas congeladas com adição de lactose, sacarose ou maltose.

O documento n° WO 00/39281 (Kringelum et al.) descreve que a viabilidade de uma cultura iniciadora não-congelada pode ser melhorada pela adição de diferentes agentes crioprotetores, e o documento n- WO 2004/065584 A1 (Bisgaard-Frantzen) descreve que a viabilidade de uma cultura iniciadora altamente concentrada pode ser melhorada pela adição de diferentes agentes crioprotetores.

Apenas o documento n° WO 2004/065584 A1 descreve culturas congeladas em péletes e nenhuma das publicações supramencionadas se refere à estabilidade física de culturas congeladas em péletes durante a es- tocagem.

Sumário da Invenção

Comercialmente, uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB), congelada em péletes, é fornecida normalmente em uma embalagem apropriada (como por exemplo, em uma caixa "Tetrapack" de papelão de 2 litros). Ela é estocada em uma temperatura de estocagem de cerca de -46 °C, e o material congelado está presente na forma de péletes individuais com um peso relativamente pequeno.

Antes da presente invenção, os presentes inventores acredita- vam que não existiam problemas significativos com relação à estocagem de tais culturas de bactérias do ácido lático (LAB) congeladas em péletes.

Entretanto, baseados em diferentes estudos, os presentes inventores identificaram que, quando inúmeras culturas comercial mente relevantes eram estocadas a aproximadamente -46 °C por 7 dias ou por mais tempo, os péletes individuais estavam grudando uns nos outros e produzindo agregados maiores. No estabelecimento industrial, a agregação cria problemas de manuseio. Por exemplo, é significativamente mais difícil administrar uma dose adequada a partir de embalagem da cultura quando a cultura está agregada. Pode ser mesmo difícil retirar a cultura agregada para fora da embalagem de uma maneira conveniente.

Estudos adicionais identificaram que as culturas "problemáticas"poderiam ser distinguidas por terem um valor de Tm'(início da fusão do gelo, como definido por Roos (1995)) da cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes abaixo da temperatura de estocagem de aproximadamente -46 °C. O valor de Tm'é um termo físico-químico padrão usado na indústria alimentícia e em outras áreas. Tm'é medida rotineiramente por técnicas de Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC), como descrito por Roos (1991). Ela se refere à temperatura inicial de fusão do produto ali-mentício (neste caso, a cultura de LAB congelada). Para obter detalhes adicionais, pode-se consultaros livros-texto "Food Chemistry", Fennema (1996) e "Phase Transition in Foods", Roos (1995).

Sem recorrerá teoria, acredita-se que, quando uma cultura congelada tem um valor de Tm'abaixo da sua temperatura de estocagem, como por exemplo, aproximadamente -46 °C, ocorre uma transição inicial de fases (fusão) e faz com que os péletes individuais grudem uns nos outros e formem agregados maiores.

Resumindo, o trabalho dos presentes inventores identificou problemas de estocagem não-reconhecidos até agora com relação à aparência física de alguns tipos de culturas de bactérias do ácido lático congeladas em péletes, altamente concentradas e comercialmente relevantes. Tendo identificado este problema, os presentes inventores começaram tentar resolver o problema.

Independentemente de qualquer explicação teórica possível, os presentes inventores identificaram que adicionando certos compostos aditivos relevantes a uma cultura congelada em péletes, problemática, poder-se- ia obter uma cultura congelada em péletes, a qual, após 7 a 14 dias de esto- cagem a -46 °C não formou agregados de péletes individuais. Tais culturas se distinguiram pelo fato de que os péletes individuais da cultura congelada não grudavam uns nos outros, e portanto, permaneciam substancialmente como péletes individuais, mesmo após estocagem prolongada a aproximadamente -46 °C.

No todo, os compostos aditivos relevantes podem ser distinguidos pelo fato de que eles são capazes de aumentar o valor de Tm' da cultura congelada até um valor acima da temperatura de estocagem de, por exemplo, -46 °C, de tal modo que, por exemplo, uma elevação do valor de Tm’ de uma faixa entre -70 e -46 °C e uma faixa entre -45 e -15 °C.

Os exemplos funcionais neste relatório descritivo descrevem os exemplos preferidos de compostos aditivos preferidos. Os compostos descritos incluem trealose, maltodextrina, ciclodextrina, goma pulverizada ("spray- gum"), florescência de gelatina de peixe e maltitol. Baseados no conhecimento genérico comum, os versados nessas técnicas estão perfeitamente capacitados para identificar outros compostos aditivos relevantes que são capazes de aumentar o valor da Tm' de uma cultura congelada para um valor acima da temperatura de estocagem, como por exemplo, -46 °C.

Como mencionado acima, para incluir bactérias suficientes, uma cultura congelada altamente concentrada, comercialmente relevante, tem genericamente um peso de pelo menos 50 g e um teor de bactérias viáveis de pelo menos 109 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama. As culturas descritas nos artigos de Chavarri (1988) e Carcoba (2000) não são direcionadas para a estabilidade física das culturas congeladas em péletes, porém ao invés disso, à viabilidade das bactérias congeladas no presente contexto, não consideradas culturas congeladas altamente concentradas e comercialmente relevantes, pois elas são produzidas em uma escala muito menor e compreendem significativamente menos gramas de cultura congelada, e além disso, as culturas descritas não são culturas congeladas em péletes. Além disso, as culturas descritas por Chavarri (1988) e Carcoba (2000) não são direcionadas para a estabilidade física de culturas congeladas em péletes, e sim para a estabilidade das bactérias congeladas.

Conseqüentemente, um primeiro aspecto da invenção refere-se a uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB), congelada em péletes, em uma embalagem comercial mente relevante que tem um peso de pelo menos 50 g de material congelado, onde o material congelado está presente na forma de péletes individuais, tendo um teor de bactérias viáveis de pelo menos 109 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de material congelado, e compreendendo entre 0,5% e 13% de um composto aditivo, medido em p/p do material congelado.

O composto aditivo é selecionado no grupo de compostos que, usando uma quantidade de 10% do composto aditivo em p/p do material congelado, são capazes de aumentar a Tm' (temperatura inicial de fusão do gelo) da cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada, que sem o composto aditivo tem um valor de Tm' entre -70 °C e -46 °C, para um valor de Tm' entre -45 °C e -15 °C (medida por DSC).

Além disso, a cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada distingue-se pelo fato de que, quando estocada a aproximadamente -46 °C por 7 a 14 dias, os péletes individuais da cultura congelada não estão grudando uns nos outros, e portanto, permanecem como péletes individuais, onde isso é medido pelo seguinte teste: os péletes individuais da cultura congelada são congelados como péletes em nitrogênio líquido e 100 péletes individuais (cerca de 5 a 100 g de péletes) são vertidos sobre uma placa de Petri, formando assim uma camada fina de péletes soltos, separados, individuais, sendo a camada distinguida pelo fato de que a maioria dos péletes está em contato físico com um ou mais dos seus péletes vicinais, colocados a aproximadamente -46 °C por 7 a 14 dias, e examina-se para observar se os péletes ainda estão soltos ou se os péletes formaram aglomerados ou se estão grudados uns nos ou- tros, onde os critérios para que os péletes individuais da cultura congelada permanecerem substancialmente como péletes individuais são que pelo menos 80 a 100 péletes individuais permaneçam como péletes individuais soltos, separados.

Entretanto, as culturas de bactérias do ácido lático (LAB) congeladas, que compreendem LABs que são capazes de utilizar sacarose, e onde a cultura compreende um composto agente crioprotetor selecionado no grupo que consiste em sacarose, em uma quantidade entre 2% e 13% de sacarose, medida em p/p do material congelado; e trealose em uma quantidade entre 4% e 6% de trealose, medida em p/p do material congelado; e uma mistura de trealose/sacarose, ambas na quantidade entre 12% e 14% em peso do material congelado, são especificamente eximidas do primeiro aspecto desta invenção.

A "exoneração" descrita no final do primeiro aspecto refere-se ao pedido de patente PCT n° WO 2004/065584 A1. Este pedido de patente foi depositado em 19 de janeiro de 2004. Na data do depósito do pedido de patente formador de anterioridade do presente pedido de patente, o pedido de patente PCT n° WO 2004/065584 A1 não foi publicado.

O documento n- WO 2004/065584 A1 refere-se à melhora da viabilidade durante a estocagem de uma cultura congelada. Ele não descreve o problema de "grudadura de péletes" da presente invenção. Genericamente, a reivindicação principal 1 refere-se a "uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada que compreende LABs que são capazes de utilizar sacarose, tem um peso de pelo menos 50 g de material congelado, e um teor de bactérias viáveis de pelo menos 109 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de material congelado, caracterizado pelo fato de que a cultura congelada compreende entre 0,5% e 80% de um agente crioprotetor, medida em p/p do material congelado".

Embora as culturas congeladas em péletes com agentes criopro- tetores estejam descritas no documento nQ WO 2004/065584 A1, pode-se excluir que os versados nessas técnicas chegassem inevitavelmente a um resultado que cai dentro dos termos do documento n- WO 2004/065584 A1, pois o documento n- WO 2004/065584 A1 reivindica especifica mente apenas culturas que são capazes de utilizar sacarose.

Com relação à cultura congelada da presente invenção, o composto aditivo deve ser adicionado, de preferência, às bactérias viáveis antes de elas serem congeladas.

Consequentemente, em um segundo aspecto, a invenção refere- se a um método para produzir uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes do primeiro aspecto da invenção e modalidades aqui descritas, compreendendo as seguintes etapas: (i) adicionar um composto aditivo a bactérias viáveis, para obter pelo menos 50 g de material com um teor de bactérias viáveis de pelo menos 109 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de material, e compreendendo o composto aditivo em uma quantidade entre 0,5% e 13%, medida em p/p do material, (ii) congelar o material, para obter um material congelado em péletes, e (iii) embalar o material congelado de uma maneira apropriada para obter uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes do primeiro aspecto da invenção e modalidades aqui descritas.

Um terceiro aspecto da invenção refere-se a uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes, obtenível pelo método para produzir uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes do segundo aspecto da invenção.

Um quarto aspecto da invenção refere-se ao uso da cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes, descrita acima, em um processo para fabricar um produto alimentício ou ração.

Definições:

Antes de iniciar uma discussão das modalidades detalhadas da invenção, fornece-se uma definição de termos específicos relacionados aos principais aspectos da invenção. (iv) expressão "LABs que são capazes de utilizar sacarose"denota LABs que são capazes de fermentar o açúcar sacarose com a produção de ácidos. Esta é a mesma definição fornecida na publicação PCT n- WO 2004/065584 A1.

O termo "material" da cultura denota as substâncias relevantes da cultura, incluindo as bactérias viáveis e o agente crio protetor. A embalagem possível não está incluída. Conseqüentemente, o peso do material da cultura não está incluindo o peso da embalagem possível.

O termo "pacote" ou "embalagem" deve ser entendido de forma ampla. Ele denota que a cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes deve ser embalada a fim de ser fornecida para o usuário. Ela pode ser embalada em um frasco, um recipiente Tetra-Pack©, etc.

O termo "um composto aditivo" pode ser, no presente contexto, um composto aditivo específico individual ou ele pode ser dói ou mais composto aditivos diferentes. Conseqüentemente, a porcentagem em peso (p/p) do(s) composto(s) aditivo(s) dentro do material da cultura deve ser entendida como a soma da quantidade de composto(s) aditivo(s). De preferência, o termo refere-se a um composto que é adicionado à cultura depois da fermentação. Conseqüentemente, ele pode ser um composto que não está presente como tal em uma quantidade significativa no caldo de fermentação da cultura.

Os termos "congelada em péletes" e "cultura congelada em péletes" referem-se a uma cultura congelada usando um método que resulta em péletes ou grânulos da cultura congelada. Uma cultura congelada em péletes pode ser fabricada convenientemente adicionando a cultura, sob a forma de gotas, para dentro de N2 líquido, formando péletes ou grânulos congelados da cultura. Tipicamente, porém não necessariamente, o processo é realizado sobre bandejas em uma fábrica industrial convencional de secagem por congelamento.

O termo "péletes" ou "grânulos" refere-se a entidades sólida pequenas formadas por um líquido congelado com um tamanho médio de partícula entre 0,1 e 10 mm.

Modalidades da presente invenção estão descritas abaixo, meramente a título exemplificativo.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1: a correlação entre a temperatura na qual ocorre o início da fusão do gelo, Tm', e a quantidade de dissacarídeos adicionada. Para obter detalhes adicionais, vide o Exemplo 3. A temperatura de estocagem, - 46 °C, está indicada por uma linha pontilhada.

Figura 2: temperatura do início da fusão do gelo (Tm') (eixo Y) de inúmeras culturas em função da concentração de maltodextrina (Glucidex 12) (% em peso) (eixo X). A denominação da cultura seguida de "A" indica que glicerina foi adicionada à cultura, e "B" indica que a glicerina não foi adicionada à cultura antes de congelar os péletes Descrição

Detalhada da Invenção Valor de Tm'

Como explicado acima, o valor de Tm' é um termo-padrão conhecido em físico-química, que descreve a temperatura na qual ocorre o início da fusão do gelo. Na presente invenção, Tm’ denota a temperatura na qual ocorre a fusão inicial de uma cultura de LABs congelada.

De preferência, o valor de Tm’ é medido usando o protocolo de DSC descrito na seção denominada "Medição de Tm’" do Exemplo 1 abaixo.

Teste de Aglomeração de Péletes

Com explicado com respeito ao primeiro aspecto da invenção, o teste para analisar se a cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes é uma cultura que pode ser distinguida pelo fato de que, quando estocada a aproximadamente -46 °C (na presente situação um congelador pré-ajustado para -50 °C tinha uma temperatura da amostra de -46 °C) por 7 a 14 dias, os péletes individuais da cultura congelada não estão grudados uns nos outros, e portanto, permanecem substancialmente como péletes individuais em um teste que compreende o seguinte: os péletes individuais da cultura congelada são congelados como péletes em nitrogênio líquido e 100 péletes individuais (cerca de 5 a 100 g de péletes) são vertidos sobre uma placa de Petri, formando assim uma camada fina de péletes soltos, separados, individuais, sendo a camada distinguida pelo fato de que a maioria dos péletes está em contato físico com um ou mais dos seus péletes vicinais, colocados a aproximadamente -46 °C por 7 a 14 dias, e examina-se para observar se os péletes ainda estão soltos ou se os péletes formaram aglomerados ou se estão grudados uns nos outros, onde os critérios para que os péletes individuais da cultura congelada permanecerem substancialmente como péletes individuais são que pelo menos 80 dos 100 péletes individuais permaneçam como péletes individuais soltos, separados. Mais preferivelmente, pelo menos 90 dos 100 péletes individuais permanecem como péletes individuais, soltos e separados, e ainda mais preferivelmente, pelo menos 95 dos 100 péletes individuais permanecem como péletes individuais, soltos e separados.

O exame e a contagem dos péletes individuais que permanecem como péletes individuais, soltos e separados podem ser feitos visualmente. Está dentro da capacidade dos versados na técnica fazer isto de uma maneira consistente na qual os resultados seriam, dentro da incerteza técnica limitada normal, consistentes e repetíveis. O Exemplo 1 abaixo fornece detalhes técnicos adicionais.

Cultura de Bactérias do Ácido Lático (LAB) Congelada em Péletes

De preferência, a expressão "cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes" denota neste caso uma cultura que, sem compreender o composto aditivo adicionado como aqui descrito, tem um valor de Tm'entre -70 e -46 °C. A cultura pode ser congelada na forma de péletes ou grânulos, formando uma "cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes". Uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes pode ser fabricada convenientemente adicionando a cultura sob a forma de gotas para dentro de N2 líquido, formando péletes ou grânulos da cultura.

As LABs da cultura podem ser quaisquer LABs específicas comercialmente relevantes que não utilizam sacarose, de acordo com a Norma Internacional IDF nQ 146A: 1998 "Identificação de Microorganismos Característicos", pelo uso de kits de teste API apropriados (bioMérieux, Lyon, França). Os kits API "rapid ID 32 STREP" e "50 CHL Médium) são usados para estabelecer o estado da utilização de sacarose para a maioria dos gêneros de LABs.

De preferência, a LAB é uma LAB selecionada no grupo que compreende Bifidobacteriumspp., Brevibacteríumspp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp., incluindo Lactococcus lactissubespécie lactis e Lactococcus lactissubespécie cremoris, Lactobacillus spp., incluindo Lactobacillus acidophilus, Streptococcus spp., Enterococcus spp., Pediococcus spp., Leuconostoc spp., Oenococcus spp., e spp. fúngicas, incluindo Penicillium spp., Cryptococcus spp., Debraryomyces spp., Klyveromyces spp., e Sac- charomyces spp.

Muito embora algumas destas espécies em geral estejam descritas como capazes de utilizar sacarose, mutantes que não são capazes de utilizar sacarose foram, e continuarão sendo isoladas continuamente. Inde- pendentemente de como tais mutações são isoladas ou obtidas, elas mesmo assim são um aspecto da presente invenção.

As bactérias do ácido lático industrialmente mais úteis são encontradas entre espécies de Lactococcus, espécies de Streptococcus,espécies de Enterococcus,espécies de Lactobacillus,espécies de Leuconostoc, e espécies de Pediococcus.

A expressão "cultura de bactérias do ácido lático (LAB) mista" denota uma cultura mista que compreende duas ou mais espécies de LABs. A expressão "cultura de bactéria do ácido lático (LAB) pura" denota uma cultura pura que compreende apenas uma única espécie de LAB.

A cultura, como aqui descrita, pode ser uma cultura mesofílica, que consiste em bactérias mesófilas que têm temperaturas de crescimento ótimas a cerca de 30 °C. Uma "cultura mesofílica" é uma cultura que compreende duas ou mais espécies mesófilas diferentes de LABs.

Os organismos típicos pertencentes ao grupo mesofílico incluem Lactococcus lactis subespécie lactis, Lactococcus lactis subespécie cremoris, Leuconostoc mesenteroides subespécie cremoris, Pediococcus pentosa- ceus, Lactococcus lactis subespécie lactis biovar. diacetylactise Lactobacillus casei subespécie casei. As espécies bacterianas do ácido lático termofíli- cas incluem, por exemplo, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faeci- um, Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subespécie bulgaricus e Lactobacillus acidophilus.

A cultura aqui descrita pode compreender LABs que não são capazes de utilizar sacarose. Uma assim denominada cultura O é usada para fabricar queijos com buracos (Cheddar, Cheshire, Feta),e compreende tipicamente um ou mais organismos selecionados no grupo que compreende Lactococcus lactissubespécie lactis e Lactococcus lactissubespécie cremo- ris. Genericamente, as culturas O são consideradas como não utilizadoras de sacarose.

Culturas de Bactérias do Ácido Lático Congeladas em Péletes, Altamente Concentradas

As culturas congeladas aqui descritas são o que na indústria a- limentícia pode ser denominado como culturas de bactérias do ácido lático congeladas em péletes, altamente concentradas. Para possuir bactérias suficientes, tais culturas devem ser relativamente grandes (ter um peso suficiente), combinado com uma concentração relativamente alta de bactérias viáveis. É óbvio que, se relativamente mais bactérias são necessárias, o peso e/ou a concentração de bactérias viáveis devem ser aumentados.

De preferência, uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes, como aqui descrita, tem um peso de pelo menos 100 g de material congelado, mais preferivelmente um peso de pelo menos 250 g de material congelado, ainda mais preferivelmente um peso de pelo menos 500 g de material congelado, e com a maior preferência, um peso de pelo menos 900 g de material congelado. De preferência, o peso do material congelado é menor do que 500 kg.

De preferência, uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes, como aqui descrita, tem um teor de bactérias viáveis de pelo menos 5 x 109 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de material congelado, mais preferivelmente um teor de bactérias viáveis de pelo menos 1010 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de material congelado, e com a maior preferência, pelo menos 2 x 1010 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de material congelado.

A fermentação e o meio de fermentação apropriado para as LABs são bem-conhecidos na técnica e os versados na técnicas são capazes de selecionar um meio apropriado e as condições de fermentação com relação à LAB específica. Os meios e as fermentações apropriados estão indicados na seção de exemplos deste relatório descritivo.

Para obter uma quantidade suficiente de bactérias, está no presente contexto preferido fazer uma fermentação em escala relativamente grande, em tanques de fermentação grandes. São preferidos os tanques de fermentação de pelo menos 50 L, de preferência pelo menos 90 L, ainda mais preferivelmente 500 L ou maiores.

Depois de uma fermentação apropriada, as bactérias viáveis são, de preferência, isoladas pela remoção do líquido (sobrenadante) do meio de fermentação (como por exemplo, por centrifugação). As bactérias viáveis isoladas podem ser denominadas biomassa isolada. As bactérias viáveis isoladas devem ter, de preferência, um teor de bactérias viáveis de pelo menos 109 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de material congelado, mais preferivelmente um teor de pelo menos 5 x 109 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de material congelado, e com a maior preferência, um teor de pelo menos 1010 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de material congelado.

Depois da adição do composto aditivo (vide abaixo) à cultura concentrada, a cultura pode ser convenientemente congelada adicionando a mistura, sob a forma de gotas, para dentro de N2 líquido, formando péletes ou grânulos congelados da mistura. Um método factível para o processo de congelamento está descrito nos documentos n°-s- DE2805676 e FR2393251.

A cultura congelada em péletes é então embalada de uma maneira apropriada, a fim de ser fornecida ao usuário.

Composto Aditivo

Como discutido acima, de preferência, os compostos aditivos relevantes distinguem-se pelo fato de que eles são capazes de aumentar o valor da Tm' da cultura congelada para um valor acima da temperatura de estocagem, como por exemplo, -46 °C, tal como para um valor da Tm' entre - 45°C e -15°C, mais preferivelmente até um valor da Tm'entre -43°C e -15°C, e ainda mais preferivelmente, até um valor da Tm'entre -39°C e -15°C.

O Exemplo 2 abaixo ilustra uma estratégia experimental rápida para identificar compostos aditivos relevantes. Foram adicionados diferentes compostos relevantes (10% em peso) a uma cultura congelada "modelo'' com um valor de Tm'abaixo de -46 °C (no Exemplo 2, a cultura "modelo" tem um valor de Tm'de -54 °C), e os valores da Tm'antes e depois da adição foram medidos por DSC.

A cultura "modelo" do Exemplo 2 e o protocolo do testes deste Exemplo 2 são usados, de preferência, para avaliar se compostos aditivos específicos de interesse podem ser distinguidos pelo fato de que eles são capazes de aumentar o valor da Tm1da cultura congelada para um acima de -46 °C, tal como um valor da Tm’ entre -45 °C e -15 °C, mais preferivelmente até um valor da Tm'entre -43 °C e -15 °C, e ainda mais preferivelmente, até um valor da Tm'entre -39 °C e -15 °C.

No Exemplo 2, pode-se observar que a ciclodextrina aumentou a Tm* para -44 °C, maltitol aumentou a Tm'para -42 °C, a trealose aumentou a Tm’ para -38 °C, a gelatina de peixe aumentou a Tm para -37 °C, a malto- dextrina aumentou a Tm’ para -32°C, e goma pulverizada ("spraygum") aumentou a Tm’ para -31 °C.

De preferência, o composto aditivo é um composto com um peso molecular (PM) entre 150 e 100.000 g/mol, mais preferivelmente entre 250 e 100.000 g/mol, ainda mais preferivelmente, 300 a 40.000 g/mol, e com a maior preferência, 500 a 15.000 g/mol.

Em uma modalidade preferida, o composto aditivo é também um agente crioprotetor.

O termo "um agente crioprotetor" denota uma substância que é capaz de melhorar a estabilidade na estocagem da cultura congelada, medida pela viabilidade da cultura. No presente contexto, ele pode ser um único agente crioprotetor específico ou ele pode ser dois ou mais agentes diferentes. Conseqüentemente, a porcentagem em peso do(s) agente(s) crio protetores) dentro do material da cultura deve ser entendida como a soma da quantidade do(s) agente(s) crioprotetor(es).

O agente crioprotetor pode ser selecionado, de preferência, entre proteínas ou hidrolisados protéicos. Os exemplos apropriados preferidos destes agentes incluem aqueles selecionados no grupo que consiste em extrato de malte, leite em pó desnatado, soro do leite em pó, extrato de levedura, glúten, colágeno, gelatina, elastina, ceratina, e albuminas.

Mais preferivelmente, o agente crioprotetor é um carboidrato ou um composto envolvido na biossíntese de ácidos nucléicos. Os carboidratos apropriados preferidos incluem aqueles selecionados no grupo que consiste em pentoses (como por exemplo, riboses, xilose), hexoses (como por exemplo, frutose, manose, sorbose), dissacarídeos (como por exemplo, sacarose, trealose, melibiose, lactulose), oligossacarídeos (como por exemplo, rafino- se), oligofrutoses (como por exemplo, actilight, fibroloses), polissacarídeos (como por exemplo, maltodextrinas, goma xantana, pectina, alginato, celulose microcristalina, dextrana, PEG), e álcoois de açúcares (sorbitol, manitol). Mais preferivelmente, o carboidrato é um carboidrato com um peso molecular (PM) entre 150 e 100.000 g/mol, mais preferivelmente 250 a 100.000 g/mol, ainda mais preferivelmente, 300 a 40.000 g/mol, e com a maior prefe-rência, 500 a 15.000 g/mol.

Em uma modalidade muito preferida, o composto aditivo é um composto aditivo selecionado no grupo que consiste em ciclodextrina, malti- tol, gelatina de peixe, maltodextrina (de preferência, maltodextrina DE 2 até maltodextrina DE1 9), goma de pulverização ("spraygum")(como por exemplo, SpraygumIRX 51693), 5'-monofosfato de inosina (IMP) e inosina.

A cultura congelada compreende 0,5% a 13% peso de um composto aditivo, baseado no peso do material congelado, de preferência 1% a 12% em peso de um composto aditivo, baseado no peso do material congelado, mais preferivelmente 2% a 10% em peso de um composto aditivo, baseado no peso do material congelado, e ainda mais preferivelmente, 5% a 10% em peso de um composto aditivo, baseado no peso do material congelado.

A adição do composto aditivo, que pode ser também um agente crioprotetor, depois da fermentação, às bactérias viáveis isoladas (biomas- sa), pode ser feita misturando o composto aditivo sólido com a biomassa durante, por exemplo, 30 minutos, em uma temperatura apropriada. Caso o composto aditivo seja, por exemplo, maltodextrina, uma temperatura apropriada pode ser a temperatura ambiente. Alternativamente, uma solução estéril do composto aditivo pode ser misturada com a biomassa.

Método para Fabricar uma Cultura de Bactérias do Ácido Lático (LAB) Congelada em Péletes

Como dito acima, um segundo aspecto da invenção refere-se a um método para fabricar uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes, do primeiro aspecto da invenção, compreendendo as seguintes etapas: (i) adicionar um composto aditivo a bactérias viáveis, para obter pelo menos 50 g de material com um teor de bactérias viáveis de pelo menos 109 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de material, e compreendendo o composto aditivo em uma quantidade entre 0,5% e 13% em peso, baseado no peso total do material, (ii) congelar o material, para obter um material congelado em péletes, e (iii) embalar o material congelado em péletes de uma maneira apropriada.

Como discutido acima, as culturas "problemáticas" mais relevantes neste caso são culturas de bactérias do ácido lático (LAB) congeladas em péletes, as quais, sem compreender o composto aditivo adicionado como aqui descrito, têm um valor de Tm'entre -70 °C e -46 °C.

Consequentemente, em uma modalidade preferida, antes de efetuar a adição do composto aditivo, de acordo com a etapa (i) acima, mediu-se o valor de Tm’ da cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada sem compreender o composto aditivo, e identificou-se que ela tem um valor de Tm'entre -70 °C e -46 °C, ou mesmo mais baixo.

Antes de efetuar a adição do composto aditivo, de acordo com a etapa (i) acima, realizou-se um teste de agregação de péletes (vide acima) e identificou-se que os péletes individuais da cultura congelada grudam uns nos outros em uma temperatura de estocagem de -46 °C

De preferência, depois da adição do composto aditivo, o valor da Tm'da cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada, compreendendo o composto aditivo, é medido e verifica-se que o valor da Tm'é acima de -46 °C, de preferência entre -45 °C e -15 °C, mais preferivelmente entre -43 °C e -15 °C, e ainda mais preferivelmente, entre -39 °C e -15 °C.

Finalmente, depois da adição do composto aditivo, a cultura é congelada em péletes e realiza-se um teste de agregação de péletes (vide acima) para assegurar que pelos menos 80 dos 100 péletes individuais permanecem como péletes individuais soltos e separados.

Uso da Cultura de Bactérias do Ácido Lático (LAB) Congelada

Uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada, como aqui descrita, pode ser usada em um processo para a fabricação de um produto alimentício ou ração, de acordo com as técnicas anteriores.

Exemplos

Exemplo 1: R604-E (uma cultura O congelada disponível comercialmente, da Chr. Hansen A/S, Dinamarca) tende a formar péletes grudentos durante a estocagem congelada. No presente estudo, este problema é abordado observando mais de perto a temperatura de fusão, e tentando aumentá-la adicionando caseinato, sacarose ou maltodextrina.

Objetivo:

Para avaliar se é possível elevar o ponto de fusão de F-DVS de R604-E usando aditivos, o efeito de usar aditivos para aumentar o ponto de fusão de R604-E é avaliado: visualmente, e medindo a Tm'por DSC para cada uma das formulações testadas. (i) Material: 2 quilogramas da cultura disponível comercialmente, F-DVS R 604-E (Chr.Hansen A/S, Hoersholm, Dinamarca, Lote n- 2441258, material n-616581). (ii) Solução de Aditivos Usados para Formular a fim de Elevar o Ponto de Fusão: Solução de sacarose a 50% em peso (Danisco, Dinamarca) Solução de caseinato de sódio a 10% em peso (Arla, Dinamarca) Solução de maltodextrina DE 10 a 30% em peso (Glucidex 10, Roquette Frères, Lestrem, França) Solução de maltodextrina DE 2 a 30% em peso (Glucidex 2, Roquette Frères, Lestrem, França) (iii) Receita para Formulação de F-DVS R604-E:

O concentrado congelado foi descongelado e misturado com aditivos de acordo com a Tabela 1. Tabela 1 Formulações de R604-E

*gramas de aditivo em matérica seca/grama de concentrado

Avaliação Visual do Ponto de Fusão de F-DVS R604

As seis formulações de F-DVS R-604-E foram congeladas em péletes em nitrogênio líquido, e 100 péletes individuais (cerca de 20 a 30 g) de péletes foram vertidos sobre placas de Petri, formando assim uma camada fina de péletes soltos separados.

Uma amostra de cada uma das formulações foi colocada em um congelador pré-ajustado para -50 °C, e a temperatura real das amostras era 5 -46 °C. Depois de 7 dias de estocagem, as amostras foram examinadas para observar se elas ainda estavam soltas ou se os péletes tinham formado a- glomerados ou pareciam grudentos, e em caso positivo, sua sujeição de se tornarem novamente partículas soltas depois de chacoalhados. Tabela 2

Inspeção Visual de Péletes Congelados e Tm1 Medida

- = agregada, aglutinada ou grudenta (menos de 20 dos 100 péletes individuais permanecem como péletes individuais soltos e separados) + = partículas parcialmente soltas (menos de 60 dos 100 péletes individuais permanecem como péletes individuais soltos e separados) 15 ++ = partículas quase soltas (pelo menos de 80 dos 100 péletes individuais permanecem como péletes individuais soltos e separados) +++ = partículas soltas (pelo menos de 90 dos 100 péletes individuais permanecem como péletes individuais soltos e separados)

Medição de Tm1:

As amostras foram preparadas em cadinhos de alumina 100 pL e congeladas em nitrogênio líquido. Uma amostra de cada uma das formulações e F-DVS R604 foi colocada por 6 dias a -46 °C.

A fase de transição foi medida em um Calorímetro de Varredura Diferencial Mettler Toledo 822e (um DSC) com cadinhos de alumina de 100 pL, programa de temperatura, temperatura de inserção -90 °C, programa de temperatura de varredura: 5 °C/mÍn, -130 °C a 0 °C.

Os valores de Tm* (início da fusão do gelo, como definido por Roos (1995)) foram medidos. Os resultados estão indicados na Tabela 2.

Observou-se que o uso de > 6% de sacarose e 6% de maltodextrina (2 ou 10) aumenta o valor da Tm’ de péletes congelados. Não é possível observar qualquer efeito de caseinato de sódio. A partir da inspeção visual, 10% de sacarose e as duas maltodextrinas diferentes indicam um efeito positivo contra a tendência de produzir péletes grudentos. Exemplo 2 Objetivo

Para identificar quais tipos de aditivos poderiam aumentar o ponto de fusão da cultura congelada, foi realizado um estudo de triagem. Os seguintes aditivos foram testados:

Trealose, maltodextrina 12, ciclodextrina, goma pulverizada, PEG, gelatina de peixe, maltitol, cloreto de sódio, glicerol. (i) Material: F-DVS R604-E (lote 2471755, material 616581); para obter detalhes, vide Exemplo 1. (ii) Solução de Aditivos Usados para a Formulação Aumentar o Ponto de Fusão: Trealose a 50% em peso Maltodextrina DE 12 a 30% em peso (Glucidex 12, Roquette Frères, Lestrem, França) Ciclodextrina a 30% em peso Goma pulverizada a 30% em peso (IRX 51693 da CNI) PEG a 30% em peso (PEG 6000, Merck, Alemanha) Eflorescência de gelatina de peixe 200 a 30% em peso (SKW Biosystems, França) Maltitol a 30% em peso Cloreto de sódio a 30% em peso Glicerol a 30% em peso (iii) Receita para Formulação de F-DVS R604-E:

O concentrado de F-DVS R604-E congelado foi descongelado e misturado com os diferentes aditivos para uma concentração final de 10% em peso.

Medição da Tm':

As amostras foram preparadas em cadinhos de alumina de 100 |iiL e congeladas em nitrogênio líquido. As curvas de transição de fase foram registradas no Caíorímetro de Varredura Diferencial Mettler Toledo 822e e comparadas com a amostra referencial (R604E sem aditivos). As amostras foram inseridas no DSC a -90 °C e operado usando um programa de temperatura: temperatura de inserção - 90°C; temperatura de varredura 7 °C/min, entre-130 °C e 0 °C.

Resultado:

As curvas de transição de fase foram traçadas e os valores de Tm’ foram determinados como descrito por Roos (1991), e os valores estão indicados na Tabela 3 abaixo: Tabela 3 Tm’ Observada (°C)

Verificou-se que a Tm'para a amostra referencial era de -54 °C (início da fusão do gelo). Os seguintes aditivos aumentaram a Tm': PEG (-53 °C) Ciclodextrina (-44 °C) Maltitol (-42 °C) Trealose (-38 °C) Gelatina de peixe 12 (-37 °C) Maltodextrina (-32 °C) Goma pulverizada (-31 °C) Glicerol e cloreto de sódio não aumentaram o ponto de fusão dos péletes de cultura congelados.

Exemplo 3: Neste experimento a intenção foi avaliar a relação entre a quantidade do aditivo e o aumento na Tm'medida no DSC. (i) Material: F-DVS CH N 19 (Lote 2421868) (culturas LD congeladas disponíveis comercialmente na Chr. Hansen A/S, Dinamarca). Tabela 4 Formulação de CH N 19 Usando os Agentes Aditivos Sacarose e Trealose

(ii) Soluções de Aditivos Usados para a Formulação Elevar o Ponto de Fusão:

A concentração de sacarose por grama de biomassa variou entre 3% em peso e 13% em peso. A trealose foi testada apenas no nível de 5% em peso. Todas as concentrações de sacarose foram preparadas a partir de uma solução de sacarose a 50% em peso, adicionada à biomassa. A concentração de trealose foi preparada a partir de uma solução a 40% em peso.

Medição da Tm':

O concentrado de F-DVS R604-E congelado foi descongelado e misturado com os diferentes aditivos, como indicado na Tabela 4. Depois, as amostras foram transferidas para cadinhos de alumina de 100 pL e congeladas em nitrogênio líquido, e estocadas a -46 °C antes de serem analisadas. As curvas de transição de fase foram registradas no DSC para as 8 formulações e comparadas com a amostra referencial (R604E sem aditivos). As amostras foram inseridas no DSC a -90 °C e operado usando um programa de temperatura: temperatura de inserção -90 °C; temperatura de varredura 5 °C/min, -130 °C e 0 °C.

A partir destas curvas de transição de fase, a correlação entre Tm' e a quantidade de dissacarídeos adicionada pode ser observada na Figura 1.

A paritr da Figura 1, pode-se observar que 8% de sacarose e uma quantidade maior assegurarão que a cultura congelada não comece a fundir na estocagem a -46 °C.

Exemplo 4

Culturas disponíveis comercialmente na Chr. Hansen A/S, Dinamarca (HP, HPS, HP-1, LP, LL-2) foram analisadas quanto ao ponto de fusão inicial e depois da adição de maltodextrina (Glucidex 12 da Roquette Frères, Lestrem, França). Os produtos são comercializados como péletes congelados, e estes devem ser mantidos soltos, o que é assegurado por um ponto de fusão inicial acima da temperatura de estocagem.

Objetivo:

O objetivo do presente estudo foi elevar o ponto de fusão inicial para acima da temperatura de estocagem, para obter péletes soltos. Materiais e Métodos: (i) Materiais: Usou-se Glucidex 12 (Roquette Frères, Lestrem, França) como composto aditivo. Foram usados 100 g de cada uma das culturas listadas na Tabela 5. "B" indica que a glicerina não foi adicionada à cultura, enquanto que "A" indica que 10% em volume de glicerina foram adicionados antes de congelar os péletes. Tabela 5 Culturas Utilizadas

(ii) Receita para Formulação das Amostras: Culturas dos concentrados congelados foram descongeladas e misturadas com diferentes quantidades de uma solução de Glucidex 12 até uma concentração final de 3,5% a 10,1% em peso.

As diferentes formulações estão listadas na Tabela 6. (iii) Medição da Tm1:

As amostras foram preparadas em cadinhos de alumina de 100 pL. As curvas de transição de fase foram registradas em um DSC Mettler para todas as formulações. As amostras foram inseridas no DSC a -90 °C. Programa de temperatura de varredura: 7 °C/min; -100 °C a 0 °C. iiii) Avaliação Visual do Ponto de Fusão de F-DVS R604

As formulações foram congeladas em péletes em nitrogênio líquido e 100 péletes individuais (cerca de 20 a 30 g) de péletes foram vertidos sobre placas de Petri, formando assim uma camada fina de péletes soltos separados. Uma amostra de cada uma das formulações foi colocada a - 46 °C. Depois de 14 dias de estocagem, as amostras foram examinadas para observar se elas ainda estavam soltas ou se os péletes tinham formado aglomerados ou pareciam grudentos, e em caso positivo, sua sujeição de se tornarem novamente partículas soltas depois de chacoalhados.

Resultados:

Os resultados de adicionar maltodextrina (Glucidex 12) a diferentes culturas em várias quantidades estão ilustrados na Figura 1. Fica evidente que aumentar a concentração de maltodextrina aumenta a Tm’. Na Tabela 2, estão indicados os resultados sobre a avaliação da grudadu- ra/aglomeração. As amostras com uma Tm'abaixo de -46 °C estavam grudadas umas nas outras. Tabela 6 Formulações de Amostras, Temperatura de Fusão Inicial (Tm') e Inspeção Visual de Péletes Congelados

Notas: - designa agregada, aglutinada ou grudenta (menos de 20 dos 100 péletes individuais permanecem como péletes individuais soltos e separados) +++ designa partículas soltas (pelo menos de 90 dos 100 péletes individuais 5 permanecem como péletes individuais soltos e separados)

O resultado está ilustrado na Tabela 6 e na Figura 2 e indica que a maltodextrina é um agente eficaz para aumentar a Tm'em culturas que contêm 10% em volume de glicerina (série A), bem como em culturas que não contêm glicerina (série B). Este experimento demonstra ainda que um 10 crioprotetor bem-conhecido (isto é, glicerina) não pode ser usado para aumentar a estabilidade física durante a estocagem de uma cultura congelada em péletes. REFERÊNCIAS (inserir referências da pg. 26 do original)

Claims

1. Cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes, caracterizada pelo fato de que a LAB é uma LAB selecionada de Bifidobacteriumspp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp., incluindo Lactococcus lactissubespécie lactis e Lactococcus lactissubespécie cremoris, Streptococcusspp., Enterococcus spp., Pediococcusspp. e Oenococcus spp. em uma embalagem comercialmente relevante que tem um peso de pelo menos 50 g de material congelado, em que o material congelado está presente na forma de péletes individuais, tendo um teor de bactérias viáveis de pelo menos 109 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de material congelado, e compreendendo entre 0,5% e 13% de um composto aditivo, medido como p/p do material congelado, em que o composto aditivo é um composto aditivo que é selecionado no grupo de compostos aditivos que consiste em ciclodextrina, maltitol, trealose, gelatina de peixe, maltodextrina, e goma pulverizada, e em que a cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada distingue-se pelo fato de que, quando estocada a -46 °C por 7 a 14 dias, os péletes individuais da cultura congelada não estão grudando uns nos outros, e portanto, permanecem substancialmente como péletes individuais, onde isso é medido pelo seguinte teste, os péletes individuais da cultura congelada são congelados como péletes em nitrogênio líquido e 100 péletes individuais (cerca de 5 a 100 g de péletes) são vertidos sobre uma placa de Petri, formando assim uma camada fina de péletes soltos, separados, individuais, sendo a camada distinguida pelo fato de que a maioria dos péletes está em contato físico com um ou mais dos seus péletes vicinais, colocados a -46 °C por 7 a 14 dias, e examina-se para observar se os péletes ainda estão soltos ou se os péletes formaram aglomerados ou se estão grudados uns nos outros, onde os critérios para que os péletes individuais da cultura congelada permanecerem substancialmente como péletes individuais são que pelo menos 80 dos 100 péletes individuais permaneçam como péletes individuais soltos, separados.

2. Cultura congelada em péletes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada é uma cultura que, sem compreender o composto aditivo como definido na reivindicação 1, tem um valor de Tm'entre -70 °C e -46 °C.

3. Cultura congelada em péletes de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a cultura de bactérias do ácido lático congelada compreende entre 5% e 10% do composto aditivo medido como p/p do material congelado.

4. Método para fabricar uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (i) adicionar um composto aditivo a bactérias viáveis, para obter pelo menos 50 g de material com um teor de bactérias viáveis de pelo menos 109 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama de material, e compreendendo o composto aditivo em uma quantidade entre 0,5% e 13%, medida como p/p do material, (ii) congelar o material, para obter um material congelado em péletes, e (iii) embalar o material congelado em péletes de uma maneira apropriada para obter uma cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada embalada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que antes de adicionar o composto aditivo, de acordo com a etapa (i) como definida na reivindicação 4, mediu-se o valor de Tm'da cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada sem compreender o composto aditivo, e identificou-se que ela tem um valor de Tm'entre -70 °C e -46 °C; e depois de adicionar o composto aditivo, o valor da Tm'da cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada, compreendendo o composto aditivo, é medido e verifica-se que o valor da Tm' é entre -45 °C e -15 °C, mais preferivelmente entre -39 °C e -15 °C.

6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a cultura de bactérias do ácido lático congelada 5 compreende entre 5% e 10% do composto aditivo medido como p/p, do material congelado.

7. Método, de acordo com as reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o composto aditivo é um composto aditivo selecionado no grupo que consiste em ciclodextrina, maltitol, trealose, gelatina de peixe, 10 maltodextrina, e goma pulverizada.

8. Uso da cultura de bactérias do ácido lático (LAB) congelada em péletes, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser em um processo para fabricar um produto alimentício ou ração.