JP3101679B2 - 動物細胞の凍結保存用血清不含培地及び保存方法 - Google Patents
動物細胞の凍結保存用血清不含培地及び保存方法Info
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- JP3101679B2 JP3101679B2 JP03187008A JP18700891A JP3101679B2 JP 3101679 B2 JP3101679 B2 JP 3101679B2 JP 03187008 A JP03187008 A JP 03187008A JP 18700891 A JP18700891 A JP 18700891A JP 3101679 B2 JP3101679 B2 JP 3101679B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な動物細胞の凍結
保存用血清不含培地及び当該培地を使用する凍結保存方
法に関する。
保存用血清不含培地及び当該培地を使用する凍結保存方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、動物細胞を凍結保存する場
合、その凍結培地中に血清の添加を必要とする。また、
血清の替りとしてメチルセルロースを添加した凍結保存
用培地を用いて凍結する方法も確立されている。
合、その凍結培地中に血清の添加を必要とする。また、
血清の替りとしてメチルセルロースを添加した凍結保存
用培地を用いて凍結する方法も確立されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、血清の
構成成分は、未だ完全に解明されておらず、その上、凍
結保存中に動物細胞に何らかの変異を促す因子が存在す
る可能性もある。また血清やメチルセルロースを細胞凍
結時の保護剤として添加した、凍結保存用培地を用いて
も、それらによって十分に凍結保存ができない動物細胞
があることも知られている。この発明の目的は、既知の
成分からなる凍結保存用培地を用いて、多くの種類の動
物細胞の凍結保存に有効な動物細胞用凍結保存方法を提
供することにある。
構成成分は、未だ完全に解明されておらず、その上、凍
結保存中に動物細胞に何らかの変異を促す因子が存在す
る可能性もある。また血清やメチルセルロースを細胞凍
結時の保護剤として添加した、凍結保存用培地を用いて
も、それらによって十分に凍結保存ができない動物細胞
があることも知られている。この発明の目的は、既知の
成分からなる凍結保存用培地を用いて、多くの種類の動
物細胞の凍結保存に有効な動物細胞用凍結保存方法を提
供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成する本発
明の動物細胞の凍結保存用培地は、トレハロースあるい
はゼラチンを含有することを特徴とする。すなわち、こ
の発明は、 (1)凍結保護剤として２糖類であるトレハロースを含有
することを特徴とする動物細胞の凍結保存用血清不含培
地。 (2)凍結保護剤としてゼラチンを含有することを特徴と
する動物細胞の凍結保存用血清不含培地。 (3)凍結保護剤として２糖類であるトレハロースとゼラ
チンをを含有することを特徴とする動物細胞の凍結保存
用血清不含培地。 以上の動物細胞の凍結保存用血清不含培地を提供する。
さらにまた、この発明は上述した凍結保存用培地を用い
て動物細胞を凍結保存する方法を提供する。
明の動物細胞の凍結保存用培地は、トレハロースあるい
はゼラチンを含有することを特徴とする。すなわち、こ
の発明は、 (1)凍結保護剤として２糖類であるトレハロースを含有
することを特徴とする動物細胞の凍結保存用血清不含培
地。 (2)凍結保護剤としてゼラチンを含有することを特徴と
する動物細胞の凍結保存用血清不含培地。 (3)凍結保護剤として２糖類であるトレハロースとゼラ
チンをを含有することを特徴とする動物細胞の凍結保存
用血清不含培地。 以上の動物細胞の凍結保存用血清不含培地を提供する。
さらにまた、この発明は上述した凍結保存用培地を用い
て動物細胞を凍結保存する方法を提供する。
【０００５】
【発明の効果】この発明により、血清を含まず、既知の
成分から構成される動物細胞の凍結保存用血清不含培地
及びそれを用いた凍結保存方法が提供される。この発明
における凍結保護剤であるトレハロースとゼラチンは、
水に易溶な為、調整も簡単であり、さらに動物細胞に対
する毒性も低いと考えられる。その為、凍結保護剤とし
て使用可能な動物細胞も、単に動物由来細胞株や正常リ
ンパ球だけでなく家畜由来の精子、受精卵や骨髄由来細
胞などにも適用できると考えられる。すなわち、この発
明の用途としては細胞培養技術を用いる分野であり例え
ば、動物細胞を用いた研究以外に畜産分野や医療分野が
あげられる。
成分から構成される動物細胞の凍結保存用血清不含培地
及びそれを用いた凍結保存方法が提供される。この発明
における凍結保護剤であるトレハロースとゼラチンは、
水に易溶な為、調整も簡単であり、さらに動物細胞に対
する毒性も低いと考えられる。その為、凍結保護剤とし
て使用可能な動物細胞も、単に動物由来細胞株や正常リ
ンパ球だけでなく家畜由来の精子、受精卵や骨髄由来細
胞などにも適用できると考えられる。すなわち、この発
明の用途としては細胞培養技術を用いる分野であり例え
ば、動物細胞を用いた研究以外に畜産分野や医療分野が
あげられる。
【０００６】
【発明の具体的な説明】本発明の動物細胞の凍結保存用
培地としては以下の培地組成があげられる。 (a)基礎培地に終濃度10％となるようにジメチルスルフ
ォキシドと終濃度0.1Ｍ〜0.25Ｍとなるようにトレハロ
ースを添加した培地。 (b)基礎培地に終濃度15％となるようにグリセロールと
終濃度0.1〜0.25Ｍとなるようにトレハロースを添加し
た培地。 (c)基礎培地に終濃度10％となるようにジメチルスルフ
ォキシドと終濃度0.2％となるようにゼラチンを添加し
た培地。 (d)基礎培地に終濃度10％となるようにジメチルスルフ
ォキシドと終濃度0.2％となるようにゼラチン及び終濃
度0.1〜0.25Ｍとなるようにトレハロースを添加した培
地。しかし、この発明の特徴は培地にトレハロースもし
くはゼラチンを添加することである。よって、その他の
添加剤は凍結される細胞に応じて選択されるべきであ
り、この発明は以上の培地に限定されない。
培地としては以下の培地組成があげられる。 (a)基礎培地に終濃度10％となるようにジメチルスルフ
ォキシドと終濃度0.1Ｍ〜0.25Ｍとなるようにトレハロ
ースを添加した培地。 (b)基礎培地に終濃度15％となるようにグリセロールと
終濃度0.1〜0.25Ｍとなるようにトレハロースを添加し
た培地。 (c)基礎培地に終濃度10％となるようにジメチルスルフ
ォキシドと終濃度0.2％となるようにゼラチンを添加し
た培地。 (d)基礎培地に終濃度10％となるようにジメチルスルフ
ォキシドと終濃度0.2％となるようにゼラチン及び終濃
度0.1〜0.25Ｍとなるようにトレハロースを添加した培
地。しかし、この発明の特徴は培地にトレハロースもし
くはゼラチンを添加することである。よって、その他の
添加剤は凍結される細胞に応じて選択されるべきであ
り、この発明は以上の培地に限定されない。
【０００７】特に凍結される動物細胞は限定されない
が、凍結時の細胞密度としては１×105cells/ml以上が
望ましい。また、凍結及び保存に用いる機材としては、
プログラムフリーザーあるいは−80℃以下の保冷能力有
するディープフリーザーが利用可能である。さらに凍結
保存には液体窒素保存容器も使用する可能である。次に
実施例により本発明を詳述する。
が、凍結時の細胞密度としては１×105cells/ml以上が
望ましい。また、凍結及び保存に用いる機材としては、
プログラムフリーザーあるいは−80℃以下の保冷能力有
するディープフリーザーが利用可能である。さらに凍結
保存には液体窒素保存容器も使用する可能である。次に
実施例により本発明を詳述する。
【０００８】
【実施例１】表１に示す細胞を用いて、トレハロース及
びゼラチンの凍結保護剤としての効果を確認する実験を
行った。検討培地は、基礎培地であるeRDF培地に表１の
組み合わせの添加物を加え調整したものを用いた。凍結
は、−80℃のディープフリーザーで急速凍結し、そのま
ま−80℃にて９日間保存した。その後、融解し、トリパ
ンブルー染色を用いて生細胞率を測定した。その結果を
表１に示す。この結果より、トレハロース、ゼラチンは動
物細胞の凍結保存用無血清培地の添加物として多くの細
胞に対し有効であった。
びゼラチンの凍結保護剤としての効果を確認する実験を
行った。検討培地は、基礎培地であるeRDF培地に表１の
組み合わせの添加物を加え調整したものを用いた。凍結
は、−80℃のディープフリーザーで急速凍結し、そのま
ま−80℃にて９日間保存した。その後、融解し、トリパ
ンブルー染色を用いて生細胞率を測定した。その結果を
表１に示す。この結果より、トレハロース、ゼラチンは動
物細胞の凍結保存用無血清培地の添加物として多くの細
胞に対し有効であった。
【０００９】
【表１】 1A4: マウスハイブリドーマ M0C5,K-1-5: ヒトハイブリドーマ MKN-45: ヒト胃ガン由来細胞 MCF-7: ヒト乳ガン由来細胞
【００１０】
【実施例２】リンパ球の無血清凍結培地による凍結保存
について検討した。正常人より採血した末梢血より、フ
ィコールを用いてリンパ球を分離し、凍結実験に用いる
前に血清の介在をなくすため基礎培地により２回洗浄し
た。凍結は−80℃のディープフリーザーで急速凍結し、
そのまま９日間保存した。解凍は60℃の恒温水浴中で急
速解凍を行った。解凍直後のリンパ球の生存率をトリパ
ンブルーを用いて測定した。さらに基礎培地でeRDF培地
にインシュリン、トランスフェリン、エタノールアミン
及び卵黄リポタンパクを添加した無血清培地で凍結後の
リンパ球を３日間培養し、生細胞率と抗体産生量を測定
した。実験に用いた凍結培地は、表２に示した添加物を
基礎培地に加え調整した。それぞれの結果を表２に示
す。この結果より、トレハロース及びゼラチンは正常な
リンパ球に対して凍結保護効果を有することが明らかで
ある。
について検討した。正常人より採血した末梢血より、フ
ィコールを用いてリンパ球を分離し、凍結実験に用いる
前に血清の介在をなくすため基礎培地により２回洗浄し
た。凍結は−80℃のディープフリーザーで急速凍結し、
そのまま９日間保存した。解凍は60℃の恒温水浴中で急
速解凍を行った。解凍直後のリンパ球の生存率をトリパ
ンブルーを用いて測定した。さらに基礎培地でeRDF培地
にインシュリン、トランスフェリン、エタノールアミン
及び卵黄リポタンパクを添加した無血清培地で凍結後の
リンパ球を３日間培養し、生細胞率と抗体産生量を測定
した。実験に用いた凍結培地は、表２に示した添加物を
基礎培地に加え調整した。それぞれの結果を表２に示
す。この結果より、トレハロース及びゼラチンは正常な
リンパ球に対して凍結保護効果を有することが明らかで
ある。
【００１１】
【表２】
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 血清を含まず、凍結保護剤として２糖類
であるトレハロースを含有することを特徴とする動物細
胞の凍結保存用血清不含培地。 - 【請求項２】 血清を含まず、凍結保護剤としてゼラチ
ンを含有することを特徴とする動物細胞の凍結保存用血
清不含培地。 - 【請求項３】 血清を含まず凍結保護剤として２糖類で
あるトレハロースとゼラチンを含有することを特徴とす
る動物細胞の凍結保存用血清不含培地。 - 【請求項４】 請求項(1)(2)(3)記載の培地を使用し
て、ヒト正常リンパ球及び動物由来細胞を凍結・保存す
る方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03187008A JP3101679B2 (ja) | 1991-07-02 | 1991-07-02 | 動物細胞の凍結保存用血清不含培地及び保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03187008A JP3101679B2 (ja) | 1991-07-02 | 1991-07-02 | 動物細胞の凍結保存用血清不含培地及び保存方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH057489A JPH057489A (ja) | 1993-01-19 |
| JP3101679B2 true JP3101679B2 (ja) | 2000-10-23 |
Family
ID=16198590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03187008A Expired - Fee Related JP3101679B2 (ja) | 1991-07-02 | 1991-07-02 | 動物細胞の凍結保存用血清不含培地及び保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3101679B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH063679U (ja) * | 1992-04-28 | 1994-01-18 | 株式会社旭東 | カード差しシート |
| JPH0629881U (ja) * | 1992-09-29 | 1994-04-19 | 豊宏 秋山 | 整理用見出し欄付き書類ホルダー |
| USRE41893E1 (en) | 1997-07-08 | 2010-10-26 | Bristol-Myers Squibb Company | Epothilone derivatives |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL1720974T5 (pl) * | 2004-02-24 | 2023-09-18 | Chr. Hansen A/S | Zamrożona kultura bakterii kwasu mlekowego w oddzielnych peletkach |
| JP2009005584A (ja) * | 2007-06-26 | 2009-01-15 | Miyazaki Prefecture | ゲル化剤、凍結保存剤、細胞保存用容器、細胞の凍結保存方法、細胞の融解方法、哺乳動物の細胞 |
| CN105543168B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-01-22 | 北京弘润天源基因生物技术有限公司 | 免疫细胞的储存及运输方法 |
| EP3478060A4 (en) | 2016-06-29 | 2020-02-12 | The General Hospital Corporation | ICE NUCLEATION FORMULATIONS FOR THE CRYCON PRESERVATION AND STABILIZATION OF BIOLOGICS |
| JP7265268B2 (ja) * | 2020-07-06 | 2023-04-26 | 株式会社ポル・メド・テック | 生体試料保存容器 |
| CN112998009A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-06-22 | 北京益华生物科技有限公司 | Nk细胞冻存液及其制备方法和应用 |
-
1991
- 1991-07-02 JP JP03187008A patent/JP3101679B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH063679U (ja) * | 1992-04-28 | 1994-01-18 | 株式会社旭東 | カード差しシート |
| JPH0629881U (ja) * | 1992-09-29 | 1994-04-19 | 豊宏 秋山 | 整理用見出し欄付き書類ホルダー |
| USRE41893E1 (en) | 1997-07-08 | 2010-10-26 | Bristol-Myers Squibb Company | Epothilone derivatives |
| USRE41895E1 (en) | 1997-07-08 | 2010-10-26 | Bristol-Myers Squibb Company | Epothilone derivatives |
| USRE41911E1 (en) | 1997-07-08 | 2010-11-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Epothilone derivatives |
| USRE43003E1 (en) | 1997-07-08 | 2011-12-06 | Bristol-Myers Squibb Company | Epothilone derivatives |
| US8536327B2 (en) | 1997-07-08 | 2013-09-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Epothilone derivatives |
| US8921542B2 (en) | 1997-07-08 | 2014-12-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Epothilone derivatives |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH057489A (ja) | 1993-01-19 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |