JPH0225401A - 胚の低温保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は低温生物学に関し、哺乳動物の胚の低温保存方
法に関する。

適用される産業分野 本発明は、絶滅しつつあるかつ希少な動物種の胚の低温
バンクを確立する目的で、胚の深冷凍結に関して最も有
利に適用することができるが、かかるバンクは生殖学、
家畜繁殖学（ｔｈｃｒｉｏｇｃｎｏｌｏｇｙ）、薬理学
、免疫学、ウィルス学及び実験−臨床医学の更なる進歩
のために使用することが有利である遺伝的に貴重な品種
のマウスを維持するうえで極めて必要である。

本発明は、他のいくつかの低温生物学、例えば公衆の健
康サービスにおいても用途を見出すことができ、その場
合に女性患者への結果的に成功する胚移入は最も基本的
な抗不妊手段となるが、方卵巣組織の移植は様々な病因
のいくつかの疾患に関して患者の総合的ホルモン状態の
改善のために有効な方法である。しかも、免疫原性が低
下した胚匍髄の潅流は、女性患者における造血抑制の治
療に際して有望な手段である。前記の治療手段において
は、深冷凍結状態での長期貯蔵が行われた場合にのみ入
手可能な十分量の適切な生物学的物質を必要とする。

本発明は、凍結保存された胚が新品種の飼育動物を繁殖
させるうえで広い用途を有している畜産業、商業的畜産
業、並びに特にチョウザメ及びコイの魚胚の凍結保存に
関する養魚業においても応用することができる。

生体からの単離後における胚貯蔵のためのこのような低
温及び特に深冷冷凍の応用例は、人間の経済活動及び公
衆の健康維持を含めた更に一層広い分野にわたっている
。

現在、遺伝子資源貯蔵のだめの低温ノ１ンクを確立しよ
うとする時代の趨勢は、特に畜産を振興するために行わ
れる商業的に有用な飼育動物の胚貯蔵のための低温バン
クに関して、最も広範な発展を遂げさせてきた。

医療及び畜産業における咄乳動物胚の大規模な利用は、
移植物質に関する必要性を更に切迫化させるようになっ
てきたか、その品質は、不妊症に対抗しかつ高生産性飼
育動物の育成を促進させるうえて必要な移植操作の最終
的結果のためには重要である。

しかしながら、胚の凍結保存のためにこれまで開発され
た方法によれば、凍結された細胞を高レベルで保存する
ことかできず、貴重な生物学的物質を大量に損失してし
まう。胚の凍結保存に関する実験では、それらの最適化
は一段階の超高速冷却で凍結された生物学的試料におけ
るガラス質（ｖｉｔｒｉｒｉｃａｔｉｏｎ）生成の可能
性と関係していることを明らかにしている。

従来技術 現在の当業界において公知なものに、−３，５°Ｃで結
晶化を開始し、０．２〜２．０℃／分の速度で一４０℃
まで冷却し、しかる後冷媒、即ち液体窒素中に浸漬する
ことを特徴とする１、０Ｍジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）媒体中でマウス胚を凍結させる方法がある。それ
らの解凍後における胚の生存率は６５％である〔エクス
ペリメンタル・セル・リサーチ、第８９巻、第１号。

１９７４年、ニス・ピー・レイボ、ピー・エム・マズー
ル、ニス・シー・ジャコラスキー（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖ、８９．Ｎｏ
、１．１９７４゜Ｓ、Ｐ、Ｌｅｊｂｏ、Ｐ、Ｍ、Ｍａｚ
ｕｒ、Ｓ、Ｃ，Ｊａｃｋｏｗｓｋｙ）、　　“凍結及び
解凍中にマウス胚の生存に影響を及ぼす因子”第７９−
８９頁参照〕。

この方法の欠点は、凍結保存された胚の生存率の低さで
あり、凍結−解凍プロセスパラメーターに関して最適値
からの差が最も取るに足らないものであってもその差に
応じて凍結結果に悪影響をうけていた。

ＤＭＳＯｌ、４５Ｍ含有のリン酸塩緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ
）中におけるマウス胚の凍結保存のための更にもう一つ
の従来技術方法が、現在までに使用しうろことが知られ
ている。その方法によれば、凍結防止剤は肺中に滴下し
て導入されかつそこから取出されるか、冷却速度は０．
３℃／分で、生存率は６７〜６８％である。

前記方法は、関与する胚の低生存率、その方法の再現性
の悪さ、冷却操作のマニュアルコントロール、結晶化プ
ロセスコントロールの同期化を複雑化しかつ結果の再現
性に悪影響を与える装置における可動的成分の多さとい
う問題を有する。

その方法の他の欠点としては、凍結保存サイクルの長時
間性、並びに行われる作業の複雑性及び高労働消費性が
ある〔クリオバイオロジー第１６巻、１９７９年、ジー
・エッチ・レイルメーカー　シーφエムービー・エム・
ベル）＼−ム（Ｃｒｙｏｂｉｏ　ｌ　ｏｇｙ　、　ｖ、
　１Ｂ　、　ｌ　９７９　、　Ｇ、Ｈ，Ｒｅｊ　Ｉｍａ
ｋｅｒ、　Ｃ，Ｍ、　Ｐ、Ｍ。

ｖｅｒｈａ＋＋ｕｎｅ）　、　　“マウス胚を凍結させ
るための簡略化された方法”、第６−１０頁参照〕。

２．０Ｍグリセロール＋０．５Ｍサッカロースの媒体中
におけるマウス胚のもう一つの凍結保存方法が、現在の
当業界において公知である。１５分間のインキュベート
後、胚は内系４ｍｍのポリスチレンチューブ中に入れら
れ、密閉シールされた後、液体窒素中に浸漬された。こ
のように処理された胚の生存率は８４％であった。

この方法の欠点は、結晶の生成と、不都合なことに解凍
後の培地中において進行してしまう細胞の潜在的ダメー
ジの原因をなす高浸透活性とである。チューブ周囲にお
ける断熱シェルの形成に関係する冷却速度が低すぎると
（約２０°Ｃ／分）、結晶化プロセスを進行させてしま
い、低温生物系の液体部分におけるガラス質化の可能性
に影響を与える〔テリオゲノロジー、第２３巻、第１号
。

１９８５年、チー・ジエイ・ウィリアムス、ニスΦイー
ートーンソン（Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、　ｖ、
　２Ｂ　、　Ｎｏ、　ｌ　。

１９８５、Ｔ、Ｊ、Ｗｉｌｌｊａｍｓ、Ｓ、Ｅ、Ｔｏｈ
ｎｓｏｎ）、　　“４日令マウス胚の急速凍結”、第２
３５頁参照〕。

０．５Ｍサッカロースと混合された３、５Ｍグリセロー
ルの媒体中におけるマウス胚の更にもう一つの凍結保存
方法が、現在の当業界において公知である。細胞中に凍
結保存剤を分別的に添加する場合、後者はポリスチレン
チューブ中に入れられ、密閉シールされた後、液体窒素
中に浸漬されたが、このように処理された胚の生存率は
８５％である。

上記方法の欠点は、凍結保存剤中における浸透性物質の
濃度が高すぎること、胚の冷却速度が低いことであって
、後者は細胞膜の潜在的障害の原因をなしており、解凍
後に培地中において胚のその後の成長に悪影響を与える
〔テリオゲノロジー第２５巻、第１号、１９８６年、チ
ー・ニー・）く−リー、ジー・イー・セデル・ジュニア
、アール・ピー・エルスデン（ＴＩ＋ｃｒｉｏｇｅｎｏ
ｌｏｇｙ、ｖ、２５．Ｎｏ、　ｌ。

１９８Ｂ、に、Ａ、Ｂｉｅｒｙ、Ｇ、Ｅ、５ｅｄｄｅｌ
　Ｊｒ、Ｒ，Ｐ、Ｅｌｓｄｅｎ）。

“液体窒素中に直接浸漬することによるマウス胚の凍結
保存”、第１４０頁参照〕。

もう一つの胚凍結保存方法が公知であり、その場合にマ
ウスの生体から単離された胚は１．４Ｍグリセロール及
び１．１Ｍサッカロースの媒体が入ったポリスチレンチ
ューブ中に入れられ、チューブは両端で密閉シールされ
て、細胞がチューブ中で２５〜３０分間放置される〔テ
リオゲノロジー、第２３巻、第１号、１９８５年、チー
・チー・クラグ、アイ・エム・コーラ−、アル・ダブル
・ライト（Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、ｖ、２３．
Ｎｏ、　Ｌ。

１９８５、に、Ｔ、Ｋｒａｇ、　１．Ｍ、Ｋｏｅｈｌｅ
ｒ、Ｒ，Ｗ、Ｗｒｉｇｈｔ）　、　　″液体窒素中に直
接浸漬することによる初期マウス胚の凍結方法゛、第１
９９頁参照〕。

次いで、チューブを液体窒素中に浸漬した。解凍は３７
℃で行われた。チューブ内容物をペトリ皿に注ぎ、いく
つかに分けた０、５Ｍサッカロースで３回洗浄し、しか
る後それらを栄養培地中で培養した。解凍された胚の４
０〜６７％が胚盤胞段階にまで成長した。肺中にほとん
ど浸透しないグリセロール及びその中に全く浸透しない
サッカロースのような高濃度の凍結防止剤は、急速冷却
（約２０°Ｃ／分の速度）後におけるそれらのガラス質
化のだめのバックグラウンドを確立するために、細胞の
脱水が目的とされている。

問題の方法は、凍結防止媒体中における余りに高い凍結
保存剤濃度のせいで低結果を生じており、３段階に分け
て胚に加えられた場合であっても凍結防止剤は浸透要因
によってそれらのダメージの原因を作出している。用い
られる凍結保存剤の総濃度が４８．６％である場合は、
胚に対する凍結防止剤化合物の毒性作用も問題となる。

上記すべてに加えて、液体窒素中へのそれらの直接浸漬
により得られる胚の冷却速度は高濃度の凍結保存剤の場
合であってもガラス質化が進行するうえで十分に高いも
のではないが、その理由はチューブ及び液体窒素間で形
成されかつ窒素蒸気からなる耐熱シェルが、処理される
胚からの高速的熱放出を妨げてしまうからである。

解決すべき問題 本発明は胚の冷却方法を提供することをその目的として
おり、その場合において冷却プロセスは細胞外及び細胞
内双方の大部分の水のガラス質化の進行のために十分に
高い速度で生じ、しかも解凍中の再結晶化により胚の生
物学的構造上で生じる有害作用はより低い程度でしか発
生しないようになるであろう。

問題を解決するための手段 前記目的は、凍結防止剤、即ちグリセロールを含有した
緩衝塩液中における冷媒温度への冷却を含む胚の低温保
存方法において、本発明によれば、冷却が冷媒温度まで
予め冷却された高熱拡散性粉末物質中で行われ、しかも
緩衝塩液が凍結防止剤、即ちジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）及び二価アルコール誘導体の一つを更に含有し
ている、という事実に基づき達成される。

ここに提案された胚の低温保存方法は高熱拡散性粉末物
質の補助をうけたそれらの冷却のせいで関与する胚の更
に高い生存率に寄与しており、その物質か数千度／分も
の高い冷却速度の達成を可能にして、その結果ガラス質
化プロセスが処理される胚において進行するようになる
。

しかも、本明細書で提案された方法によれば、解凍中に
おける胚の生物学的構造上の再結晶化により生じる有害
作用の悪影響の程度を減少させることができ、これは凍
結保存処方剤中への凍結防止剤、即ちＤＭＳＯ及び二価
アルコール誘導体の導入に基づき達成されるが、双方と
も結晶移動を防止しかつ生体高分子及びタンパク質触媒
中心の周囲の水和シェルの一層となる結晶の大きさ増加
を妨げる抗塩緩衝剤として機能する。

異なる細胞膜浸透度をもつ３種類の使用される凍結防止
剤（グリセロール中、ＤＭＳＯ又は二価アルコール誘導
体の一つ）は、低い総濃度（１４，７５〜１５．２５％
）で用いられた場合に、浸透障害又は毒性進行を生ぜず
、同時にガラス質化を促進しかつ凍結防止及び解凍中に
おいて胚を包括的に保護する。しかも、使用される凍結
保存剤混合物は細胞にダメージを与えることなく］　１ ］　２ 回収される。

提案された方法によれば、それは操作者側に特別の専門
的技術を要求しない最も簡単な操作の最少の組合せから
なるだけであるため、胚の低温保存プロセスを実質上簡
略化することができる。

更に、この方法によれば、操作数の減少に基づいて低温
保存の全サイクルを行うために要する時間とこれらの操
作の各々に費やされる時間とを著しく削減することがで
き、その結果本方法は更に一層効率的かつ安価になる。

本発明の好ましい態様においては、亜鉛が高熱拡散性粉
末物質として用いられる。

かかる粉末物質の選択は、いくつかの低価格粉末物質を
比較した中から高い熱伝導率をもつものに関してなされ
るが、このような物質であれば胚に高い冷却速度を与え
ることができる。

１．２−プロパンジオールが二価ナルコール誘導体の一
つとして用いられ、しかもＤＭＳＯは最も容易に胚細胞
中に浸透しかつ凍結及び解凍時に細胞内生物構造を保護
しうる実質的な凍結防止剤であるという事実から、ＤＭ
ＳＯとのその混合物が選択されることか好都合である。

１，２−プロパンジオールを使用すれば、胚の細胞内構
造のみならずその膜器官をも好結果に保護することがで
きるが、これは本方法で使用される他の凍結防止剤と比
較した場合のかかるアルコールの平均浸透率に起因して
いる。

液体窒素が冷媒として用いられる場合の本発明の一態様
によれば、３種の凍結防止剤の各々は４．７５〜５．２
５％の範囲内の濃度で使用される。上記濃度で用いられ
る場合、凍結防止剤はそれらの凍結防止作用を最も効果
的に発現し、しかも事実上無毒性でかつわずかな浸透性
という特徴を示す。

本発明の別の態様によれば、各々の凍結防止剤は１．１
の比率で用いられる。このような比率の場合、胚の細胞
内構造及び膜器官に対して、がかる低温生物系領域にお
ける凍結防止剤の均一な分布に基づき、同等の凍結防止
効果を与えつるという期待をもつことかできるが、これ
は凍結防止剤の異なる細胞内浸透能力に起因している。

本発明の好ましい態様において、緩衝塩液は生物学的有
効物質を含んでいる。かかる物質の利用は、氷への相変
換中における温度ショック及び“溶解効果”から細胞質
膜を保護することによって細胞の生存率に大いに寄与す
る。生物学的有効物質は細胞膜の天然構造を安定化させ
、ひいては再結晶化過程においてそのダメージを防止す
ることができる。

塩化コリン溶液が生物学的有効物質として用いられるこ
とか非常に望ましいが、これは生物学的構造の天然メチ
ル化プロセスに関与しており、メチル基の存在によって
天然膜構造を安定化させている。

本発明のもう一つの態様によれば、塩化コリン溶液は０
．４％の濃度で用いられるが、これは高濃度になると前
記物質の界面活性作用に基づき膜構造組織が乱れてしま
い、一方この物質が低濃度になると上記安定化効果を示
さなくなるからである。

本発明の他の目的及び利点は、下記のいくつかの具体的
態様に関する詳細な説明から一層明らかになるであろう
。

態　　様 胚の低温保存方法は、緩衝塩液中における冷媒の介助に
よる後者の温度までのそれらの冷却を特徴とする。冷却
プロセスは、予め冷媒温度まで冷却された高熱拡散性粉
末物質中で行イっれる。緩衝塩液は次の凍結防１１−剤
の混合物・グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）及び二価アルコール誘導体の一つ、並びに生物学
的有効物質、例えば濃度０．４％の塩化コリン溶液を含
有している。

亜鉛か高熱拡散性粉末物質として使用可能である。

１．２−プロパンジオールが二価アルコール誘導体の一
つとして使用可能である。

液体窒素か冷媒として使用される場合、３種各々の凍結
防止剤は４．７５〜５．２５％の濃度でかつ１：１の比
率で用いられる。

本方法は、割球の３２期に達したネズミ胚の凍結保存に
関して実施された。

例１ 総数６０個の胚を各々１０個の胚からなる（各群５滴中
の）６群に分けた。各群に、グリセロル１０，５％、プ
ロピレングリコール１０．６％、ＤＭＳＯｌ、０．５％
及び塩化コリン０．８％（各々の凍結防止剤の濃度は５
．２５％で、塩化コリンの濃度は０．４％である）含有
のダルベツコ（Ｄｕ　ｌ　ｂｅｃｃｏ）のリン酸塩液媒
体を５滴加えた。すべての操作を４°Ｃで行った。次い
で、凍結防止剤含有液中の胚を、１ｘ１，５ｃｍ、収容
量０．１ｍ、ｌｌｌ及び壁厚０．０３ｍｍの食品用ホイ
ル製容器に移した。容器の自由端をフレア状に広げ、液
体窒素の温度まで冷却された粉末亜鉛で満たされている
金属製容器中に１０秒間浸漬した。次いで、容器を液体
窒素中に３週間そこで保存すべく放置し、しかる後それ
らを水浴中４０℃で解凍した。解凍された胚の生存率は
、培地中におけるそれらの成長性から評価したところ、
９４．２％であった。

凍結防止剤の濃度を実証するために、凍結防止剤の濃度
を変えて例１と同様に実験を行った。

胚の生存率も、胚盤胞の段階までの培地中におけるそれ
らの成長性に基づくデータから調べた。

実験結果は第１表に示されている。

低温保存後の培養中における胚の生長は、第１〜５表に
おいて、同数の天然胚の生長と比較して計算されている
。

第１表 凍結防止剤の様々な総濃度下に おける低温保存後の胚の生存率 グリセ。−ル　プロピレン グリコール ５．７５　　　　　５．７５ ５．５　　　　　５．５ ５．２５　　　　　５．２５ ５．０　　　　　５．０ ４．７５　　　　　４．７５ ４．５　　　　　４．５ ４．２５　　　　　４．２５ ＤＭＳＯ０率％ ５．７５　７１．８±１，４５ ５．５　　８５．４±１．９１ ５．２５　９４．２±０．６２ ５．０　　９４．８±１．０６ ４．７５　９３．９±０．１８ ４．５　　８６．８±０．１６ ４．２５　７８．１±１，２ 最高の胚生存率は凍結防止剤が４．７５〜５゜２５％の
濃度（総濃度は１４．２５〜１５．７５％の範囲である
）で用いられた場合に得られることが、第１表から判明
する。

例１と同様の実験を、凍結防止媒体中における凍結防止
剤の濃度間の比率を実証するために行ったが、凍結防止
剤は凍結保存剤中におけるそれらの総濃度が１４．２５
〜１５．７５％の範囲内であるように様々な比率で用い
た。結果は第２〜４表に示されている。

第２表 凍結防止剤間の様々な比率下かつ１５．７５％の総濃度
下での低温保存後における胚の生存率グリセロール　プ
０ピ”　　ＤＭＳＯ存率％グリコール ５．２５ ５．０ ５．５ ５．０ ５．５ ５．２５ ５．０ ５．２５ ５．０ ５．５ ５．２５ ５．５ ５．５ ５．５ ５．２５ ５．２５ ５．０ ５．０ ８０．１±１，１６ ８３．２±０．１８ ８４．２±２．１８ ８３．４±１．０６ ８２．３±１．０６ ８２．２±２．１２ 第３表 凍結防止剤間の様々な比率下かつ１５％の総濃度下での
低温保存後における胚の生存率 第４表 凍結防止剤間の様々な比率下かつ１４．２５％の総濃度
下での低温保存後における胚の生存率グリセロール プロピレン ＤＭＳ　Ｏ０率％ ５．０ ４．７５ ５．２５ ４．７５ ５．２５ ５．０ ４．７５ ５．０ ４．７５ ５．２５ ５．０ ５．２５ ５．２５ ５．２５ ５．０ ５．０ ４．７５ ４．７５ ８１．６±１．４２ ８０、■±２．１２ ７８．６±０．１９ ７９．８±０．２６ ８２．６±１，２１ ８３．５±１．２１ グリセロール プロピレン ＤＭＳＯ０率％ グリコール ５．０　　　　　　　４．５　　　　　　４．７５　７
６．８±２，１４４．５　　　　　　　　５．０　　　
　　　４．７５　７４．９±０．１８４．７５　　　　
　　　４．５　　　　　　５．０　　７９．１±１．２
８４．５　　　　　　　　４．７５　　　　　　５．０
　　８１！±０．１９４．７５　　　　　　　５．０　
　　　　　４．５　　７７．５±０．２６５．０　　　
　　　　４．７５　　　　　４．５　　７９．８±２．
１８胚の生存率は、１４．２５〜１５．７５％の総濃度
でかつ一定比率（０，４％）の塩化コリン存在下におい
て凍結媒体中の凍結防止剤％間の比率に関する変動に応
じて低下することが、第２〜４表から明らかとなる。

塩化コリン濃度を実証するために、本方法を例１と同様
にして行ったが、但し塩化コリン濃度は０．３％及び０
．　５％であった。結果は第５表に示されている。

第５表 凍結保存剤中における塩化コリン及び凍結防止剤の濃度
に対する低温保存後における胚の生存率クリヤ　プロピ
　　　　塩化コリン Ｍ Ｏ−、、レンゲ　　　　濃　度 Ｏ リコール　　　０．３％ ５．７５　　５．７５　　５．７５　６０．１±１．１
８５．５　　５．５　　５．５　７１．６±２．１９５
．２５　　５．２５　　５．２５　７６．９±１．０４
５．０　　５．０　　５．０　７４．８±０．８６４．
７９　　４．７５　　４．７５　７０．１±０．９１４
．５　　４．５　　４．５　７６．６±０．３６４．２
５　　４．２５　　４．２５　８３．５±１．１８塩化
コリン 濃度 ０．５％ ６５．３±１．１２ ７６．２±１．１６ ８４．６±０．２１ ７２．１±１，１２ ６８．９±１．４１ ６９．５±２．１ ５４．２±１．１２ 胚の生存率は０゜ ４％を超えるか又は未満の塩 化コリン濃度で影響をうけることが、第５表から明らか
になる。

例２ 本方法を例１と同様に実施したが、但し凍結保存媒体と
して用いられたものは原型で用いられたもの、即ち１．
４Ｍグリセロール及び１．１Ｍサッカロース含有のリン
酸塩液媒体であった。一つのケースでは胚を食品用ホイ
ル製容器中で、−万能のケースではポリスチレンチュー
ブ中で凍結させた。解凍後、培地中で成長性を示した胚
のパセンテージはそれぞれ６９．０±１．０６及び１０
．０±１．２であった。したがって、胚の高生存率は粉
末亜鉛中での凍結か本発明の液体媒体中で行われた場合
にのみ達成可能となる。

例３ 本方法を例１と同様に実施したが、但し胚は粉末亜鉛中
ではなく液体窒素中で凍結させた。解凍後に培地中で成
長した胚のパーセンテージは３０．０十０．１８であっ
た。したがって、胚の高生存率は凍結が粉末亜鉛中でか
つ本発明の液体媒体中で行われた場合にのみ達成可能と
なる。

以上のように、本発明の方法によれば解凍された胚の生
存率を２７．８％まで増加させることができる。

発明の効果 本発明は、遺伝的に貴重なネズミ品種の胚及び絶滅しつ
つあるかつ希少な動物種の胚を含めた胚の低温バンクを
確立するための哺乳動物胚の深冷凍結に関して用途を見
出すことができる。かがるバンクの使用は、特に抗不妊
手段としての実験臨床医学並びに非常に貴重な動物の生
殖学を補強するための畜産業の進展に関する進歩と係わ
っている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、凍結防止剤、即ちグリセロールを含有した緩衝塩液
   中における冷媒温度への冷却を含む胚の低温保存方法で
   あって、 冷却が冷媒温度まで予め冷却された高熱拡散性粉末物質
   中で行われ、しかも緩衝塩液が凍結防止剤、即ちジメチ
   ルスルホキシド及び二価アルコール誘導体の一つを更に
   含有していることを特徴とする方法。 ２、高熱拡散性粉末物質として亜鉛が用いられる、請求
   項１に記載の方法。 ３、二価アルコール誘導体の一つとして１，２−プロパ
   ンジオールが用いられる、請求項１に記載の方法。 ４、冷媒として液体窒素が用いられる場合に、３種の凍
   結防止剤の各々が４．７５〜５．２５％の濃度を有する
   、請求項１に記載の方法。 ５、３種の凍結防止剤の各々が１：１の比率で用いられ
   る、請求項１に記載の方法。 ６、緩衝塩液が生物学的有効物質を含有している、請求
   項１に記載の方法。 ７、生物学的有効物質として塩化コリン溶液が用いられ
   る、請求項６に記載の方法。 ８、塩化コリン溶液が０．４％の濃度を有する、請求項
   ７に記載の方法。