ES2343082T3 - Un metodo para proveer y analizar una poblacion animal que tiene un metaboloma esencialmente identico. - Google Patents
Un metodo para proveer y analizar una poblacion animal que tiene un metaboloma esencialmente identico. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para proveer una población animal mamífera que tiene un metaboloma esencialmente idéntico que comprende: a) compilar una población animal mamífera siendo esencialmente de la misma edad; b) mantener dicha población animal mamífera del paso a) por un primer período suficiente para aclimatación bajo las siguientes condiciones de alojamiento: i) temperatura constante; ii) humedad constante; iii) separación física de los animales mamíferos de la población animal mamífera; iv) alimentar ad libitum, donde la comida a ser brindada es esencialmente libre de contaminantes químicos y microbianos; v) beber ad libitum, donde el líquido de bebida es esencialmente libre de contaminantes químicos o microbianos; vi) período de iluminación constante; y c) proveer la población animal mamífera del paso b) después de dicho primer período de tiempo.
Description
Un método para proveer y analizar una población
animal que tiene un metaboloma esencialmente idéntico.
La presente invención se relaciona con un método
para proveer una población de animales mamíferos que tienen un
metaboloma esencialmente idéntico que comprende la compilación de
una población de animales mamíferos siendo esencialmente de la
misma edad, manque tiene dicha población de animales mamíferos por
un periodo de tiempo suficiente para aclimatación bajo las
siguientes condiciones de alojamiento: (i) temperatura constante,
(ii) humedad constante, (iii) separación física de los animales
mamíferos de la población animal mamífera, (iv) alimentación ad
libitum, donde el alimento a ser ofrecido es esencialmente libre
de químicos o contaminantes microbianos, (v) líquido de bebida
ad libitum, donde el líquido de bebida es esencialmente libre
de químicos o contaminantes microbianos, (vi) período constante de
iluminación, y proveer la población animal de mamíferos después de
dicho período de tiempo. Adicionalmente, la presente invención está
relacionada con los métodos para la identificación de un compuesto
el cual tiene efecto sobre el metaboloma de un animal mamífero, o
métodos para la identificación de un indicador para tales
compuestos. Además, la presente invención abarca métodos para la
identificación de tales compuestos o indicadores del mismo que
comprende analizando metabólicamente una muestra de por lo menos un
animal mamífero de una población animal mamífera.
Técnicas de punta de análisis de fenotipo de
organismos comprenden, inter alia, análisis del genoma completo de
dicho organismo, llamado genómico, análisis de todas las proteínas,
llamado proteómico, y el análisis de todas las transcripciones de
ARN. Mas recientemente, estas técnicas fundamentales de análisis
fenotípico han sido completadas por el análisis del metaboloma,
todos los metabolitos, de un organismo. Este análisis es llamado
metabolómica o, algunas veces, metabonómica. Se puede definir
metabolómica como la determinación cualitativa y cuantitativa de
todos los compuestos de bajo peso molecular (es decir metabolitos)
en las células de un organismo o fluido corporal en un momento
específico y bajo condiciones ambientales específicas. Una ventaja
de la metabolómica es que efectos causados por factores exógenos
pueden ser monitoreados inmediatamente debido a cambios metabólicos
que usualmente aparecen mucho más temprano que cambios, si alguno,
en el proteóma o incluso en el genoma.
Ya se han descrito varias técnicas para el
análisis del metaboloma de un organismo. Estas técnicas incluyen,
por ejemplo, espectroscopia de masa, NMR, espectroscopia infrarroja
con transformadas de Fourier (FT-IR), y detección
por ionización de llama (FID), opcionalmente emparejado con técnicas
por separación cromatográfica tales como cromatografía líquida,
cromatografía de gas o HPLC. Estas técnicas permiten exploración de
alto rendimiento de grandes poblaciones de organismos para
variaciones en la composición de su metaboloma, es decir éstas
permiten determinar un fenotipo metabólico. El fenotipo metabólico
de un organismo son todos sus metabolitos (metaboloma) en cierto
momento y es el resultado de interacciones complejas de su
composición genética y del ambiente en el que vive el organismo.
Como corresponde, diferencias en el metaboloma de los individuos de
una población de organismos pueden ser causadas no solo por
diferencias en el genoma pero también por factores ambientales que
influencian actividades metabólicas. La metabolómica, por lo tanto,
permite determinar inclusive efectos de factores exógenos que no
influencian inmediatamente el genoma, transcripción o proteoma de un
organismo. Por ejemplo, un compuesto tóxico es nocivo para un
organismo pero no debe necesariamente causar cambios en el genoma
de dicho organismo. Actualmente, animales de laboratorio de una
población animal mamífera son mantenidos individualmente bajo
condiciones ambientales y nutricionales iguales y controladas
(US-A-5163380,
US-A-346488).
En el presente, una desventaja en la
metabolómica en comparación a otras aprobaciones de principio de
análisis fenotípico es que organismos y, en particular, animales
mamíferos que son usados en estudios metabólicos en la técnica
previa no comparten un metaboloma común al principio del estudio. En
genómica, por ejemplo, una población que tiene un genoma
esencialmente idéntico puede ser fácilmente proporcionada por
técnicas de clonación de punta. Sin embargo, sería altamente
deseable detectar influencias metabólicas de factores exógenos,
tales como compuestos tóxicos o drogas bajo condiciones
optimizadas. Técnicas para establecer animales mamíferos que tienen
un metaboloma esencialmente idéntico son la base para un análisis de
metaboloma confiable y eficiente. No obstante la necesidad por
consiguiente, tales técnicas todavía no son descritas.
Por consiguiente, el problema técnico subyacente
a la presente invención debe ser visto como la provisión de métodos
para cumplir con las necesidades antes mencionadas, es decir proveer
una población mamífera animal la cual tiene un metaboloma
esencialmente idéntico apropiado para estudios confiables de
metaboloma y análisis confiable. El problema técnico es resuelto
por las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones y
descritas aquí abajo.
Por consiguiente, la presente invención se
relaciona a un método para proveer una población animal de mamíferos
que tienen un metaboloma esencialmente idéntico que comprende:
- a)
- Compilar una población animal de mamíferos siendo de esencialmente la misma edad;
- b)
- Mantener dicha población animal de mamíferos del paso a) por un primer período de tiempo suficiente para aclimatación bajo las siguientes condiciones de alojamiento:
- i)
- Temperatura constante;
- ii)
- Humedad constante;
- iii)
- Separación física de los animales mamíferos de la población animal mamífera;
- iv)
- Alimentar ad libitum, donde la comida a ser ofrecida es esencialmente libre de contaminantes químico o microbianos;
- v)
- Beber ad libitum, donde el líquido de bebida es esencialmente libre de contaminantes químicos o microbianos;
- vi)
- Período constante de iluminación; y
- c)
- Proporcionar la población animal mamífera del paso b) después de dicho primer período de tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "método para proporcionar" como
es usado de aquí en adelante, preferiblemente, no abarca métodos de
tratamiento del cuerpo del animal mamífero. Específicamente, el
método al que aquí se hace referencia no es apropiado para
tratamiento médico o terapia de cualquier enfermedad o trastorno ni
tampoco apropiado para mejorar o mantener el bienestar general de
los animales mamíferos de la población animal mamífera en
comparación con animales mamíferos mantenidos bajo otras
condiciones fisiológicas. Además, el término no incluye ninguna
técnica de reproducción per se.
El término "población animal mamífera" se
relaciona con la pluralidad de animales mamíferos. Una pluralidad
de animales mamíferos como es usado aquí es un grupo de animales
mamíferos que consiste de por lo menos, preferiblemente, 5 a 120,
mas preferiblemente 5 a 25 de dichos animales mamíferos por sexo,
dosis y punto en el tiempo. Los animales mamíferos de la población
animal mamífera son de la misma especie y, preferiblemente, de la
misma cepa. Animales mamíferos preferidos para ser usados en el
método de la presente invención son roedores, más preferiblemente,
ratas o ratones. Si se usan ratas para el método de la presente
invención, es además preferido que estas ratas sean ratas wistar
(CrlGlxBrlHan: Wi) (Charles RIver, USA). Cepas adicionales de rata
preferidas son: cepas BDIX; BDIX/CrCrl, BDIX/OrlCrl, cepas Brown
Norway; BN/CrlCrlj, BN/Crl, BN/OrlCrl, BN/OrlCrl, BN/SsNHsdMcwiCrl,
cepa Buffalo; BUF/CrCrl; cepas Fischer, F344/DuCrl, F344/DuCrlCrlj,
F344/lcoCrl, F344/DuCrl, SASCO cepa Fischer, F344/NCrl; cepas
Copenhagen, COP/CrCrl, COP/NCrl; cepas Cotton, cepa COT/NCrl;
Dahl/SS, SS/JrHsdMcwiCrl; cepa Fawn Hooded, FHH/EurMcwiCrl; cepa
GK, GK/Crlj; cepas Lewis, LEW/CrlCrl; LEW/Crl; cepa Noble,
NBL/CrlCrl; cepa SHR, SHR/NCrlCrlj, SHR/NCrl, SHR/NCrl; cepa WAG,
WAG/RijCrl; cepas Wistar Furth, WF/CrCrl, WF/lcoCrl; cepas WKY,
WKY/NCrl, WKY/NCrlCrlj, WKY/NlcoCrl; cepas ZDF,
ZDF/Crl-Leprfa, ZDF/Crl-Leprfa;
cepas CD, Crl:CD(SD), Crlj:CD(SD), Crl:CD(SD),
Crl:CD(SD); cepa SASCO SD, Crl:SD; cepas OFA,
Crl:OFA(SD), Crl:OFA(SD)-hr; cepa DIO,
Crl:CD(SD)DR; cepa DR, Crl:CD(SD)DR;
cepa Donryu, Crlj:DON; cepa LEC, Crlj:LEC; cepas Wistar, Crlj:Wl,
Crl:Wl; cepas Wistar Han, Crl:Wl(Han), Crl:Wl(Han),
Crl:Wl (Han), Crl:Wl(Han); cepa Wistar WU, Crl:Wl(WU)
o cualquier cepa que sea derivada de las cepas arriba mencionadas
por medio de reproducción cruzada o manipulación genética. Las
cepas anteriormente mencionadas son bien conocidas en la técnica y
comercialmente disponibles, por ejemplo, por medio de Charles
River, USA o Harlan, USA. Si se usan ratones para el método de la
presente invención, es preferido que los ratones sean ratones
C57BL/GNCrl (Charles River, USA). Otras cepas de ratón preferidas
son: cepas CD-1, Crlj:CD1(ICR), Crl:CD1
(ICR), Crl:CD1(ICR), Crl:CD1(ICR),
Crl:CD1(ICR); cepas CF-1, Crl:CF1, Crl:OF1;
cepas CFW, Crl:CFW(SW); cepas NMRI, Crl:NMRI, Crl:NMRI (Han);
cepa PGP, Crl:CF1-Abcb1a, cepas SKH1,
Crl:SKH1-hr, Crl:SKH1-hr; cepa SKH2,
Crl:SKH2-hr; cepa A/J, A/J; cepas 129,
129S2/SvPasCrl, 129S2/SvPasCrl;
129/S1/Sv-p+Tyr+Kitsl-J/Crl,
129/s1/svlmJ; cepa AKR, AKR/NCrl; cepas BALB/c, BALB/cAnNCrlCrlj,
BALB/CAnNCrl, BALB/cByJ; cepas C3H, C3H/HeJCrl,
C3H/HeNCrlCrlj,
C3H/HeNcrl, C3H/HeOuJ; cepas C57BU6, C57BU6JCrl, C57BL/6J, C57BL/6JCrl. C57BL/6NCrlCrlj, C57BL/6NCrl, C57BL/6J, C57BU6JCrl, C57BL/6J; cepas C57BU10, C57BL/10JCrl, C57BL/10JCrl; cepas CBA, CBA/CaCrl,
CBA/J, CBA/JNCrlj, CBA/JNCrljCrlg; cepa CB17, CB17/lcrCrl; cepas DBA/1, DBA/1JCRL, DBA/1JNCrlj,
DBA/1NlcoCrl; cepas DBA/2, DBA/2J, DBA/2NCrlCrlj, DBA/2NCrl, DBA/2JCrl; cepa FVB, FVB/NCrl; cepa NC, NC/NgaTndCrlj; cepa NOD, NOD/LtJCrl; cepas SJL, SJL/JOrlCrl, SJL/JOrl/CrlCrlj, SJUJ, SJL/JCrl; cepas B6C3F1, B6C3F1/Crl, B6C3F1/Crlj; B6CBAF1 strains, B6CBAF1/Crl, B6CBAF1/J, B6CBAF1/Crl; BDF1 (B6D2F1) strains, B6D2F1/Crl, B6D2F1/J, B6D2F1/Crlj; cepa B6SJLF1, B6SJLF1/J; cepa C3D2F1, C3D2F1/Crl; cepas CDF1
(CD2F1), CD2F1/Crl,CD2F1/Crlj, CD2F1/Crl; cepa CBAB6F1, CBAB6F1/Crl; cepa CB6F1, CB6F1/Crl; cepa
NMRCF1, NMRCF1/Crl o cualquier cepa que sea derivada de las cepas anteriormente mencionadas por medio de reproducción cruzada o manipulación genética. Las cepas anteriormente mencionadas son bien conocidas en la técnica y comercialmente disponibles, por ejemplo, por medio de Charles River, USA o Harlan, USA. Adicionales animales mamíferos preferidos son perros. Perros preferidos abarcan beagles, mas preferiblemente, las cepas de Beagle HsdRdg:DOBE o HsdHFr:DOBE o cepas que son derivadas de las cepas anteriormente mencionadas por medio de reproducción cruzada o manipulación genética. Las cepas anteriormente mencionadas pueden ser compradas de Harlan, USA. Otros beagles preferidos son de una cepa endogámica y pueden ser comprados de BASF AG, Alemania. Sin embargo, los animales mamíferos a ser usados no están limitados a los animales mamíferos antes mencionados y pueden ser posteriormente seleccionados de un grupo que consiste de: gatos, caballos, vacas, ovejas, cabras, conejos.
C3H/HeNcrl, C3H/HeOuJ; cepas C57BU6, C57BU6JCrl, C57BL/6J, C57BL/6JCrl. C57BL/6NCrlCrlj, C57BL/6NCrl, C57BL/6J, C57BU6JCrl, C57BL/6J; cepas C57BU10, C57BL/10JCrl, C57BL/10JCrl; cepas CBA, CBA/CaCrl,
CBA/J, CBA/JNCrlj, CBA/JNCrljCrlg; cepa CB17, CB17/lcrCrl; cepas DBA/1, DBA/1JCRL, DBA/1JNCrlj,
DBA/1NlcoCrl; cepas DBA/2, DBA/2J, DBA/2NCrlCrlj, DBA/2NCrl, DBA/2JCrl; cepa FVB, FVB/NCrl; cepa NC, NC/NgaTndCrlj; cepa NOD, NOD/LtJCrl; cepas SJL, SJL/JOrlCrl, SJL/JOrl/CrlCrlj, SJUJ, SJL/JCrl; cepas B6C3F1, B6C3F1/Crl, B6C3F1/Crlj; B6CBAF1 strains, B6CBAF1/Crl, B6CBAF1/J, B6CBAF1/Crl; BDF1 (B6D2F1) strains, B6D2F1/Crl, B6D2F1/J, B6D2F1/Crlj; cepa B6SJLF1, B6SJLF1/J; cepa C3D2F1, C3D2F1/Crl; cepas CDF1
(CD2F1), CD2F1/Crl,CD2F1/Crlj, CD2F1/Crl; cepa CBAB6F1, CBAB6F1/Crl; cepa CB6F1, CB6F1/Crl; cepa
NMRCF1, NMRCF1/Crl o cualquier cepa que sea derivada de las cepas anteriormente mencionadas por medio de reproducción cruzada o manipulación genética. Las cepas anteriormente mencionadas son bien conocidas en la técnica y comercialmente disponibles, por ejemplo, por medio de Charles River, USA o Harlan, USA. Adicionales animales mamíferos preferidos son perros. Perros preferidos abarcan beagles, mas preferiblemente, las cepas de Beagle HsdRdg:DOBE o HsdHFr:DOBE o cepas que son derivadas de las cepas anteriormente mencionadas por medio de reproducción cruzada o manipulación genética. Las cepas anteriormente mencionadas pueden ser compradas de Harlan, USA. Otros beagles preferidos son de una cepa endogámica y pueden ser comprados de BASF AG, Alemania. Sin embargo, los animales mamíferos a ser usados no están limitados a los animales mamíferos antes mencionados y pueden ser posteriormente seleccionados de un grupo que consiste de: gatos, caballos, vacas, ovejas, cabras, conejos.
El término "metaboloma" como es usado aquí
se refiere a todos los metabolitos en una célula, tejido, órgano o
todo el animal mamífero. Los metabolitos son, preferiblemente,
compuestos de moléculas pequeñas, tales como sustratos para enzimas
de rutas metabólicas, intermedios de tales rutas o los productos
obtenidos por una ruta metabólica. Las rutas metabólicas son bien
conocidas en la técnica u pueden variar entre especies.
Preferiblemente, dichas vías incluyen por lo menos el ciclo del
acido cítrico, la cadena respiratoria, fotosíntesis, foto
respiración, glicolisis, gluconeogénesis, ruta de hexosa
monofosfato, ruta de fosfato pentosa oxidativo, producción y
\beta-oxidación de ácidos grasos, ciclo de la
urea, rutas de biosíntesis de amino ácidos, rutas de degradación de
proteína tales como degradación proteasomal, rutas de degradación
de amino ácidos, biosíntesis o degradación de: lípidos, policetidos
(incluyendo por ejemplo flavonoides e isoflavonoides), isoprenoides
(incluyendo por ejemplo terpenos, esteroles, esteroides,
carotenoides, xantofilos), carbohidratos, fenilpropanoides y
derivados, alcaloides, bencenoides, indoles, compuestos de
indol-azufre, porfirinas, antocianes, hormonas,
vitaminas, co-factores tales como grupos
prostéticos o vehículos de electrones, lignina, glucosinolatos,
purinas, pirimidinas, nucleosidos, nucleótidos y moléculas
relacionadas tales como tARNs, microARNs (miARN) o mARNs. Por
consiguiente, metabolitos de compuestos de moléculas pequeñas son
preferiblemente compuestos de las siguientes clases de compuestos:
alcoholes, alcanos, alquenos, alquinos, compuestos aromáticos,
cetonas, aldehídos, ácidos carboxílicos, ésteres, aminas, iminas,
amidas, cianuros, amino ácidos, péptidos, tioles, tioesteres,
ésteres de fosfato, ésteres de sulfato, tioeteres, sulfoxidos,
éteres, o combinaciones o derivados de los compuestos anteriormente
mencionados. Las moléculas pequeñas entre los metabolitos pueden
ser metabolitos primarios los cuales son necesarios para todo
funcionamiento normal, función de órganos o crecimiento animal,
desarrollo o salud. Además, metabolitos de molécula pequeña
posteriormente comprenden metabolitos secundarios que tienen función
ecológica esencial, por ejemplo metabolitos que le permiten a un
organismo adaptarse a su ambiente. Además, los metabolitos no están
limitados a dichos metabolitos primarios y secundarios y
adicionalmente abarcan compuestos artificiales de pequeñas
moléculas, Dichos compuestos artificiales de pequeñas moléculas son
derivados de pequeñas moléculas provistas exógenamente las cuales
son administradas o asimiladas por un organismo pero no son
metabolitos primarios o secundarios como definido arriba. Por
ejemplo, compuestos artificiales de pequeñas moléculas pueden ser
productos metabólicos obtenidos de drogas por rutas metabólicas del
animal mamífero. Además, metabolitos adicionalmente incluyen
péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, oligonucleótidos y
polinucleótidos, tales como ARN o ADN. Mas preferiblemente, un
metabolito tiene un peso molecular de 50 Da (Dalton) a 30,000 Da,
más preferiblemente menos que 30,000 Da, menos que 20,000 Da, menos
que 15,000 Da, menos que 10,000 Da, menos que 8,000 Da, menos que
7,000 Da, menos que 6,000 Da, menos que 5,000 Da, menos que 4,000
Da, menos que 3,000 Da, menos que 2,000 Da, menos que 1,000 Da,
menos que 500 Da, menos que 300 Da, menos que 200 Da, menos que 100
Da. Preferiblemente, un metabolito tiene, sin embargo, un peso
molecular de por lo menos 50 Da. Más preferiblemente, un metabolito
de acuerdo con la presente invención tiene un peso molecular de 50
Da hasta 1,500 Da.
El término "metaboloma esencialmente
idéntico" significa que todos los individuos de la población
animal mamífera provistos por el método de la presente invención
tienen actividades metabólicas sincronizadas resultando (i) en la
presencia de esencialmente los mismos metabolitos en el metaboloma
de cada individuo de la población y (ii) en cantidades de dichos
metabolitos los cuales son esencialmente idénticos para cada uno de
los individuos de la población animal mamífera. Preferiblemente,
actividades metabólicas sincronizadas como son usadas aquí
significa que todas las rutas metabólicas que afectan al metaboloma
de los animales mamíferos son activos en esencialmente las mismas
células, tejidos u órganos a esencialmente el mismo tiempo, niveles
de expresión genética en todos los animales mamíferos son
esencialmente idénticos y moléculas pequeñas artificiales están
disponibles para todos los animales mamíferos en esencialmente
cantidades idénticas. Es de ser entendido que las cantidades de
metabolito pueden variar entre los individuos de la población animal
mamífera dentro de ciertos límites. Si los mismos metabolitos están
presentes en esencialmente las mismas cantidades en los individuos
de la población animal mamífera a la que se hace referencia de
acuerdo con la presente invención, puede ser determinado por varias
técnicas de análisis de compuestos cualitativas y/o cuantitativas.
Estas técnicas incluyen pero no están limitadas a técnicas
cromatográficas para separación de compuestos junto a técnicas de
análisis de compuestos tales como espectrometría de masa (MS),
espectroscopia de resonancia de ion con transformadas de Fourier
(FT-IR), o FiD. De acuerdo con la presente invención
se prefiere una determinación cuantitativa y/o cualitativa de los
metabolitos usando cromatografía líquida y de gas junto con
espectrometría de masa (LC-MS y
GC-MS). Detalles de dichos métodos preferidos son
descritos abajo. Preferiblemente, una población animal de mamíferos
tiene un metaboloma esencialmente idéntico si los espectros de masa
generados por una de estas técnicas son esencialmente idénticos
para cada individuo de la población. Dichos espectros de masa son
esencialmente idénticos si todos los picos importantes que son
detectables por, por ejemplo, un algoritmo comercial de anotación
pico, tales como ChemStation (Agilent Technologies, USA), Analyst
(MDS SCIEX, Canada) o AMDIS (NIST, USA), aparecen en todos los
espectros a esencialmente idénticos tiempos de retención
cromatográfica. Como discutido arriba, variaciones menores son
tolerables si no resultan en diferencias estadísticas
significativas. Si una variación es menor de acuerdo con la
presente invención puede ser determinado por algoritmos estadísticos
apropiados bien conocidos para la persona diestra en la técnica tal
como análisis del componente principal (PCA) o pruebas de mínimos
cuadrados parciales (PLS). Preferiblemente, un metaboloma
esencialmente idéntico de los animales mamíferos de la población
animal mamífera puede ser determinado junto con un análisis de
múltiples variables (por ejemplo PCA) o agrupación jerárquica.
El término "compilación" como es usado aquí
se refiere a seleccionar los animales mamíferos de cualquier fuente
para establecer la población animal mamífera a ser sometida al
método de la presente invención. Por consiguiente, los animales
mamíferos pueden ser progenie de la misma madre animal mamífera o
progenie de diferentes madres animales mamíferas. En caso que una
sola progenie de una madre mamífera animal sea usada como fuente,
toda la progenie puede ser usada para la compilación de la
población mamífera animal o animales mamíferos seleccionados de la
progenie pueden ser usados. Compilar como es usado aquí es realizado
con respecto a la edad de los animales mamíferos, es decir todos
los individuos de la población deben tener esencialmente la misma
edad como es descrito abajo en detalle. Sin embargo,
características adicionales pueden ser tomadas en consideración.
Adicionalmente, tales como peso, sexo, apariencia en general (es
decir sólo animales saludables por apariencia pueden ser
seleccio-
nados).
nados).
El término "esencialmente la misma edad"
significa que los animales mamíferos tienen un estado comparable de
desarrollo, por ejemplo los animales mamíferos pueden ser embriones,
juveniles o adultos. Una edad preferida de los animales mamíferos a
ser usados en el método de la presente invención es una edad de la
etapa adolescente, preferiblemente la etapa de joven adolescencia.
Los animales mamíferos de la población animal mamífera,
preferiblemente, tienen una edad con el rango de X \pm n día,
donde X es la edad prevista de la población animal mamífera y n es
seleccionado de un número entero de 1 a 5 días, y, más
preferiblemente, n es 1 día. En otras palabras, un animal mamífero
dado de la población debe ser como máximo por un día mayor o menor
que la edad promedio de los animales mamíferos de la población
animal mamífera. Más preferible, todos los animales mamíferos de la
población son de edad X. Tales animales mamíferos pueden ser
proporcionados compilando animales mamíferos que son progenie de
una camada, es decir, compañeros de camada, o son compilados de
diferentes camadas del mismo día. En caso que se vayan a usar
embriones, es de ser entendido que esencialmente la misma edad se
relaciona a sus etapas de desarrollo. Las etapas de desarrollo de
embriones de varias especies pueden ser determinadas por técnicas
bien conocidas en la técnica. Pueden ser calculadas, por ejemplo,
basados en el punto en el tiempo de fertilización. Además, en caso
que se usen embriones, debe ser adicionalmente entendido que las
madres preñadas que tienen dichos embriones deben ser mantenidas en
condiciones a las que aquí se hace referencia.
Si se usan ratas o ratones como los animales
mamíferos en el método de la presente invención, es preferido que
los animales mamíferos sean de edad X \pm 1 día, donde X es
seleccionado de un numero entero de 10 a 100 días, más
preferiblemente, un número entero de 20 a 80 días, y, más
preferible, X es 63, 64 o 65 días después del nacimiento. Más
preferible, X es 64 días después del nacimiento. Si se usan perros
como los animales mamíferos en el método de la presente invención,
X es preferiblemente 6 meses después del nacimiento.
El término "mantener" como es usado de
acuerdo al método de la presente invención se refiere a las
condiciones particulares de alojamiento, alimentación, bebida y
ambientales que son aplicadas a los animales mamíferos de la
población animal mamífera. Es preferido que los animales mamíferos
sean mantenidos bajo condiciones como es expuesto en la Guía para
la Prueba de Químicos OECD No: 407. Además, condiciones particulares
son descritas como sigue.
- i)
- Todos los animales mamíferos de la población animal mamífera son mantenidos bajo la misma temperatura constante. Debe tenerse cuidado para elegir una temperatura para realizar el método de la presente invención que no cause estrés a los animales mamíferos. Preferiblemente, la temperatura debe ser entre 20 a 24 \pm 2ºC, más preferible 22 \pm 2ºC, más preferiblemente 22, 23 o 24ºC.
- ii)
- Además, todos los animales mamíferos de la población animal mamífera son mantenidos bajo la misma humedad constante. La humedad debe ser por lo menos 30%, pero no debe exceder 70%. Sin embargo, en situaciones raras excepcionales (tales como durante la limpieza del cuarto o la jaula) la humedad puede exceder 70%. Preferiblemente, la humedad es 50-60%.
- iii)
- Se ha encontrado que la separación física de los animales mamíferos de la población animal mamífera también es importante para el método de la presente invención. Por consiguiente, cada animal mamífero de la población animal mamífera debe ser mantenido en un espacio separado, por ejemplo, una jaula separada.
- iv)
- Los animales mamíferos de la población animal mamífera son alimentados ad libitum. La comida a ser usada debe estar esencialmente libre de contaminantes químicos o microbianos. Los estándares a ser aplicados son expuestos en Fed. Reg. Vol. 44, No. 91, Mayo 09, 1979, p. 27354. Más preferible, contaminantes microbianos tales como bacteria están debajo de 5 x 10^{5} células por g de comida. Tal comida puede ser comprada de Provimi Kliba SA Kaiseraugst (Suiza) como alimento Molido Kliba dieta de mantenimiento para ratón/rata "GLP".
- v)
- Los animales mamíferos de la población animal mamífera son suplidos ad libitum con un líquido para beber. Preferiblemente, dicho líquido es agua. Sin embargo, otros líquidos en base de agua pueden también ser usados. Tales líquidos pueden comprender, por ejemplo, nutrientes, vitaminas o minerales que son requeridos por los animales. Si se usa agua como el líquido de beber, el agua debe estar libre de contaminantes químicos y microbianos como es expuesto en la Directiva Europea para Agua de Bebida (European Drinking Water Directive) 98/83/EG.
- vi)
- Finalmente, cada animal mamífero de la población animal mamífera deber ser sometido a los mismos períodos constantes de iluminación. La iluminación constante es lograda, preferiblemente, por iluminación artificial (espectro solar normal). El período de iluminaciones es 12 horas de luz seguido por 12 horas de oscuridad. Después el período de iluminación comienza nuevamente. Un período de iluminación preferido, por lo tanto, es 12 horas de luz, desde 6:00 a 18:00, y 12 horas de oscuridad, desde 18:00 a 6:00.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de alojamiento anteriormente
mencionadas pueden ser aplicadas a los animales mamíferos usando un
espacio de almacenamiento común para las jaulas que comprende los
animales mamíferos físicamente separados. Dicho espacio común de
almacenamiento puede ser una habitación o casa de animales
mamíferos. Manque tiene todos los animales mamíferos de la
población en la misma habitación, se pueden lograr fácilmente
humedad constante, temperatura y período de iluminación regulando
estos parámetros para toda la habitación o casa. La regulación de
estos parámetros es preferiblemente asistida por automatización y
los parámetros son monitoreados constantemente.
Bajo el término "primer período de tiempo
suficiente para aclimatación" debe ser entendido que los animales
mamíferos de la población animal mamífera deben ser mantenidos bajo
las condiciones de alojamiento particulares anteriormente
mencionadas por un período de tiempo que permita la sincronización
de las actividades metabólicas de los animales mamíferos para que
los animales mamíferos sean aclimatados y tengan esencialmente el
mismo metaboloma. Específicamente, dicho primer período debe ser lo
suficientemente largo como para permitir que todos los individuos
de la población adopten el mismo ritmo circadiano, ritmo de
digestión de comida, o períodos de quietud/movimiento. Además, el
primer período de tiempo debe permitir que cada animal mamífero
ajuste sus parámetros bioquímicos y fisiológicos en respuesta a las
condiciones ambientales aplicadas, tales como humedad y
temperatura. Preferiblemente, dicho primer período de tiempo tiene
una duración de 5 a 10 días, más preferible 6 a 8, y más
preferiblemente 7 días.
En los estudios que subyacen la presente
invención, ha sido sorprendentemente encontrado que una población
animal mamífera que tiene esencialmente el mismo metaboloma puede
ser proporcionada por el método de la presente invención. Los
resultados superiores logrados por dicho método dependen, sin
embargo, en obedecer estrictamente las condiciones de alojamiento
anteriormente mencionadas y los criterios para la compilación de la
población animal mamífera, es decir compilar con respecto a la edad
de los animales mamíferos de la población animal. El último asunto
es particularmente sorprendente porque de acuerdo con la Guía OECD
No: 407, loc. cit., debe tenerse cuidado con respecto al peso o el
sexo cuando se seleccionan animales mamíferos para propósitos
analíticos. Ventajosamente, usando el método de la presente
invención, es posible generar una población animal mamífera que
puede ser aplicada para la metabolómica comparativa. A causa del
metaboloma esencialmente idéntico es posible estudiar
confiablemente y eficientemente, por ejemplo, efectos tóxicos de
compuestos o determinar formas de acción de compuestos tales como
drogas o candidatos a drogas. Además, el método de la presente
invención puede ser fácilmente implementado en instalaciones ya
existentes de animales mamíferos y es, por consiguiente,
rentable.
La presente invención también abarca un método
para la identificación de un compuesto que tiene efecto sobre el
metaboloma de un animal mamífero que comprende:
- a)
- Proporcionar una población animal mamífera usando los pasos del método de la reivindicación 1;
- b)
- Administrar a dicha población animal mamífera un compuesto que se sospecha tiene efecto sobre el metaboloma de un animal mamífero; y
- c)
- Analizar el metaboloma de la población animal mamífera del paso b);
- d)
- Realizar una necropsia de cada uno de los animales mamíferos de la población animal mamífera.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "identificación" como es usado
aquí significa que el método de la presente invención debe ser
aplicado para identificar o explorar compuestos que pueden tener
efecto sobre el metaboloma de un animal mamífero. Por consiguiente,
es previsto que el método va a proveer datos que permiten la
identificación de un compuesto que tiene efecto sobre el metaboloma
de un animal mamífero. Tales datos pueden ser obtenidos por varias
técnicas para analizar el metaboloma de un animal mamífero descrito
en detalle abajo. Los datos pueden ser en forma de datos crudos o
datos procesados. Preferiblemente, el resultado del análisis del
metaboloma en forma de datos crudos o datos procesados será
comparado con datos correspondientes obtenidos de una referencia.
Por consiguiente, es de ser entendido que identificación como usada
de acuerdo con el método de la presente invención puede requerir de
pasos adicionales. Sin embargo, estos pasos adicionales están
relacionados a técnicas bien conocidas en análisis comparativo
incluyendo aquellas mencionadas antes y abajo. Además,
identificación como es usado aquí abarca preferiblemente
identificación de la propiedad de los compuestos para provocar un
efecto al metaboloma de un animal mamífero, en principio, a pesar
del tipo del efecto o del modo de acción. Además, el termino abarca
adicionalmente, preferiblemente, la identificación del tipo de
efecto que es provocado o incluso el modo de acción preciso. Por lo
tanto, el método de la presente invención puede también ser usado
para identificar una ruta metabólica en particular influenciada por
un compuesto o cierto modo de acción de un compuesto. Más
preferiblemente, puede usarse el método para identificación descrito
más arriba y más abajo.
El término "compuesto que tiene efecto sobre
el metaboloma de un animal mamífero" abarca todas las clases de
compuestos químicos. Preferiblemente, un compuesto como es usado
aquí es un compuesto de moléculas pequeñas, un péptido, un
polipéptido o un polinucleótido. Pequeñas moléculas como se hace
referencia de acuerdo con la presente invención incluyen moléculas
inorgánicas y orgánicas que tienen un bajo peso molecular,
preferiblemente un peso molecular que es más bajo que 30,000 kDa,
más preferible más bajo que 20,000 Da, 10,000 Da, 8,000 Da, 5,000
Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da o 500 Da. Más preferible, se
sospecha que dicho compuesto es un compuesto tóxico, un nutriente,
un compuesto nutracéutico o terapéuticamente activo (es decir una
droga). Una droga de acuerdo con la presente invención tendrá un
efecto terapéutico sobre el animal mamífero, es decir tratará o
mejorará una condición médica. Dicha condición médica puede ser una
enfermedad o condición o un bienestar deficiente de un animal
mamífero. Mejoramiento o tratamiento pueden ser monitoreados por la
apariencia o grado de los síntomas de dicha enfermedad, desorden o
deficiencia. Drogas de acuerdo con la presente invención también
incluyen precursores de drogas que son convertidos in vivo a drogas
terapéuticamente activas y compuestos sospechados de ser drogas, es
decir candidatos a drogas. Péptidos y polipéptidos a ser usados de
acuerdo con el método de la presente invención incluyen péptidos y
polipéptidos que ocurren naturalmente como también péptidos y
polipéptidos artificiales. Péptidos y polipéptidos que ocurren
naturalmente pueden ser obtenidos de todo tipo de organismos
incluyendo plantas, animales, hongos, bacterias o virus. Péptidos y
polipéptidos artificiales pueden ser generados, por ejemplo, con
técnicas aleatorias de síntesis de péptidos. Péptidos o
polipéptidos preferidos a ser usados de acuerdo con la presente
invención son aquellos que influencian directa o indirectamente
actividades metabólicas o rutas metabólicas en un animal mamífero de
acuerdo con la presente invención. Más preferiblemente, dichos
polipéptidos o péptidos tienen un valor terapéutico, tales como
hormonas peptídicas, factores de crecimiento, factores de
supervivencia, citocinas, receptores para dichos polipéptidos,
anticuerpos o fragmentos biológicamente activos del mismo.
Polinucleótidos a ser usados de acuerdo con el método de la
presente invención son moléculas de ARN o ADN. Preferiblemente,
dichos polinucleótidos codifican péptidos o polipéptidos que
influencian directa o indirectamente actividades metabólicas o rutas
metabólicas. Por ejemplo, polinucleótidos apropiados pueden
codificar enzimas, preferiblemente aquellas de rutas metabólicas,
péptidos o polipéptidos como es especificado arriba o péptidos o
polipéptidos que regulan la expresión de los péptidos o
polipéptidos anteriormente mencionados, tales como factores de
transcripción. Además, polinucleótidos a ser usados en el método de
la presente invención como compuestos pueden ser polinucleótidos que
interfieren con expresión de genes (es decir transcripción o
translación), tales como moléculas ARN anti-sentido,
oligonucleótidos anti-sentido o pequeños ARN de
interferencia (siARN) a ser usados para tecnología de interferencia
ARN (ARNi).
Los compuestos a los que se hace referencia de
acuerdo con la presente invención son explorados por su capacidad
para tener efectos sobre el metaboloma de un animal mamífero. Por lo
tanto, un compuesto en el sentido de la presente invención alterará
la composición del metaboloma de un animal mamífero en cuanto se
administra. Dicho efecto sobre el metaboloma de un animal mamífero
puede ser un efecto cualitativo o cuantitativo. Un efecto
cualitativo sobre el metaboloma como es usado aquí significa que por
lo menos un metabolito del metaboloma del animal mamífero está
ausente o por lo menos un metabolito adicional está presente
después de la administración del compuesto. Un efecto cuantitativo
como es usado de acuerdo con la presente invención significa que la
cantidad de por lo menos un metabolito es alterada, es decir más
alta o más baja, después de la administración de dicho compuesto.
Es de ser entendido que un compuesto que tiene efecto sobre el
metaboloma de un animal mamífero puede también influenciar la
función biológica de las células, los tejidos o los órganos de dicho
animal mamífero y puede causar intoxicaciones, mejoramientos de
salud, deterioración de salud o afecciones.
El término "administrar" como es usado aquí
incluye todas las técnicas por las cuales los compuestos pueden ser
provistos sistémicamente al animal mamífero. Además, el término
abarca técnicas para administrar los compuestos a presuntos sitios
de acción potencial tales como un tejido u órgano objetivo, es decir
administración tópica. Los compuestos a ser administrados de
acuerdo con la presente invención pueden estar comprendidos en una
composición posterior que comprende vehículos apropiados, tales
como vehículos farmacéuticos, excipientes y/o diluyentes. Ejemplos
para diluyentes bien conocidos incluyen soluciones salinas
amortiguadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones
de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones
estériles, etc. Administración de los compuestos o de las
composiciones apropiadas anteriormente mencionadas puede ser
realizada de diferentes formas, por ejemplo por administración
intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica,
intradérmica, intranasal o intrabronquial. Preferiblemente, la
administración es lograda por administración oral, mas
preferiblemente el compuesto es mezclado con el líquido de bebida o
la comida. Regímenes apropiados de tratamiento y dosificación son
bien conocidos a la persona diestra en la técnica y un régimen de
tratamiento y dosis preferido es descrito en los Ejemplos.
Preferiblemente, los animales mamíferos de la población de animales
mamíferos de prueba (es decir la población de animales mamíferos a
la cual se le ha de administrar el compuesto) son subdivididos en
por lo menos un grupo de machos y por lo menos un grupo de hembras y
por lo menos un grupo de dosis alta y por lo menos un grupo de
dosis baja.
El término "analizar el metaboloma" como
usado de acuerdo con la presente invención se refiere a técnicas
para analizar cuantitativamente o cualitativamente el metaboloma. En
un primer paso, dicho análisis cualitativo o cuantitativo del
metaboloma comprende determinar cualitativamente o cuantitativamente
la composición del metaboloma, es decir los metabolitos. Medios y
métodos para analizar cualitativamente el metaboloma comprenden
aquellos que son capaces de determinar la presencia o ausencia de
los metabolitos comprendidos por el metaboloma. Medios y métodos
para analizar cuantitativamente el metaboloma son aquellos que
determinan la cantidad de dichos metabolitos. Es de ser entendido
que hay medios y métodos que pueden determinar la presencia o
ausencia como también la cantidad de los metabolitos y, por lo
tanto, permitir una combinación de análisis cualitativo o
cuantitativo. Además, de acuerdo con los métodos de la presente
invención no es necesariamente requerido para determinar todos los
metabolitos del metaboloma. Más bien, análisis del metaboloma puede
ser realizado determinando la presencia o ausencia o la cantidad de
una porción de los metabolitos encontrados de ser característicos,
una serie predeterminada de metabolitos o un perfil metabólico para
el metaboloma. Metabolitos característicos o predeterminados
comprenden metabolitos conocidos como también así llamados conocidos
desconocidos. Los últimos son metabolitos que son apenas conocidos
por su señal en, por ejemplo, espectros de masa. La naturaleza
química de dichos conocidos desconocidos, sin embargo, no es
conocida con precisión. Un perfil metabólico como es usado aquí se
relaciona a todo tipo de identificador único para un cierto
metaboloma, es decir una huella digital de un metaboloma. Análisis
cualitativo o cuantitativo del metaboloma es, preferiblemente,
realizado usando técnicas de análisis de compuesto. Dispositivos
apropiados para tal determinación de compuestos son bien conocidos
en la técnica. Preferiblemente, espectrometría de masa es usada en
particular cromatografía de gas espectrometría de masa
(GC-MS), cromatografía liquida espectrometría de
masa (LC-MS), espectrometría de masa de infusión
directa o espectrometría de masa con transformadas de Fourier
ion-ciclotrón-resonancia
(FT-ICR-MS), electroforesis capilar
espectrometría de masa (CE-MS), espectrometría de
masa junto con cromatografía líquida de alto rendimiento
(HPLC-MS), espectrometría de masa cuadripolo,
cualquier espectrometría de masa secuencialmente emparejada, tal
como MS-MS o
MS-MS-MS, espectrometría de masa de
plasma emparejada inductivamente (ICP-MS),
espectrometría de masa pirolisis (Py-MS),
espectrometría de masa de movilidad de ion o espectrometría de masa
de tiempo de vuelo (TOF). Más preferible, LC-MS y/o
GC-MS son usados como descrito en detalle abajo.
Dichas técnicas son reveladas en, por ejemplo, Nissen, Journal of
Chromatography A, 703, 1995: 37-57, US 4,540,884 o
US 5,397,894. Como una alternativa o en adición a técnicas de
espectrometría de masa las siguientes técnicas pueden ser usadas
para determinación de compuesto: resonancia magnética nuclear (NMR),
imágenes de resonancia magnética (MRI), análisis infrarrojo con
transformadas de Fourier (FT-IR), espectroscopia
ultra violeta (UV), índice de refracción (RI), detección por
fluorescencia, detección radioquímica, detección electroquímica,
dispersión de luz (LS), espectroscopia dispersiva Raman o detección
por ionización de llama (FID). Estas técnicas son bien conocidas
para la persona diestra en la técnica y puede ser aplicada sin más
preámbulos.
En un paso adicional, analizar el metaboloma
como es usado aquí, preferiblemente, incluye una comparación de los
metabolitos, cantidades de metabolitos o el perfil metabólico a una
referencia correspondiente. Dicha referencia puede ser derivada de
un análisis de metaboloma de una población animal mamífera a la cual
no se le ha administrado ningún compuesto sospechado de causar
efectos sobre el metaboloma de un animal mamífero, a través del
cual es preferido que esta población animal mamífera de referencia
haya sido tratada por lo demás de forma idéntica. Posteriores
referencias apropiadas para una comparación de acuerdo con la
presente invención pueden ser derivadas de un análisis de
metaboloma de animales mamíferos a los cuales se les administraron
compuestos que se conocen tienen efecto sobre el metaboloma. Tales
compuestos pueden ser compuestos que son tóxicos o que son
terapéuticamente activos a través de un modo de acción conocido. De
esta forma, usando animales mamíferos tratados con los compuestos
anteriormente mencionados que se conoce tienen efecto sobre el
metaboloma como referencia, puede no solamente ser determinado si
un nuevo compuesto tiene un efecto sobre el metaboloma en general.
Mas bien, puede ser posteriormente determinado si dicho nuevo
compuesto provoca efectos tóxicos o puede ser terapéuticamente
activo a través de un cierto modo de acción o tiene por lo menos el
potencial de hacerlo. Preferiblemente, los datos resultantes de un
análisis de metaboloma de las referencias descritas antes son
guardados y provistos en forma de una base de datos apropiada.
Además, datos de un análisis de metaboloma realizado por el método
de la presente invención para nuevos compuestos pueden también
servir como referencia para otros nuevos compuestos y puede ser
guardado y provisto también por dicha base de datos para posterior
análisis. Comparar como es usado aquí abarca comparación de los
datos crudos obtenidos por el análisis del metaboloma o cualquier
tipo de datos procesados derivados de dichos datos crudos. Medios y
métodos adecuados para comparación de datos son bien conocidos en
la técnica e incluyen, por ejemplo, análisis del componente
principal (PCA) o pruebas de mínimos cuadrados parciales (PLS). En
principio, cualquier prueba estadística que permita determinar si
metabolitos, cantidades del mismo o un perfil metabólico como es
descrito arriba difieren significativamente entre diferentes
animales mamíferos o puntos de tiempo de determinación es apropiado
para realizar la comparación a la que se hace referencia aquí. Las
diferencias anteriormente mencionadas pueden, en principio, ser
determinadas por algoritmos de reconocimiento de modelo, algoritmos
de prueba estadística y/o algoritmos multivariables, por ejemplo,
Análisis de Componente Principal (PCA), Análisis de Componente
Simple (SCA), Análisis de Componente Independiente (ICA), Regresión
de Componente Principal (PCR), Mínimos Cuadrados Parciales (PLS),
Análisis Discriminante PLS (PLS-DA), Máquinas de
Vector de Soporte (SVM), Canales Neurales, Canales Bayesianos,
Canales de Aprendizaje Bayesiano, Información Mutua, Canales de
Retropropagación, Canales simétricos de Alimentación Directa, Mapas
de Auto-Organización (SOMs), Algoritmos Genéticos,
Agrupación Jerárquica o de K-Media, Anova, Prueba T
de Estudiantes, Prueba de Kruskal-Wallis, Prueba
Mann-Whitney, Prueba Tukey-Kramer o
Prueba lo Mejor de Hsu. Procesamiento de datos como se hace
referencia arriba puede incluir preferiblemente un paso de
validación de datos. En dicho paso de validación de datos, datos
inconsistentes son excluidos de posterior análisis. Datos
inconsistentes pueden resultar en problemas técnicos durante la
determinación cualitativa o cuantitativa de la composición del
metaboloma. Por lo tanto, es previsto que los parámetros técnicos
de los dispositivos usados para determinación son monitoreados
constantemente y proporcionados para validación de datos en una
base de datos apropiada. Posterior validación de los datos puede ser
lograda con herramientas de validación internas que evalúan
estadísticamente cada valor o parámetro medido de una serie de
datos. Por ejemplo, si espectrometría de masa es usada para analizar
el metaboloma, una serie de datos crudos que comprende picos es
generada. Dichos picos aparecen a cierta posición en un espacio
tri-dimensional consistiendo de un rango de tiempo
de retención, un rango de intensidad y un rango índice
masa-a-carga (m/z). Cada uno de
dichos picos puede ser evaluado y confirmado por algoritmos de
validación por picos tales como ChemStation (Agilent Technologies,
USA), Analyst (MDS SCIEX, Canada) o AMDIS (NIST, USA).
Además, datos relacionados a animales mamíferos
o a alojamiento pueden ser tomados en consideración para validación
de datos. Por ejemplo, si las condiciones de alojamiento varían, el
metaboloma de un animal mamífero de la población animal mamífera
puede ser influenciado adversamente. Tal metaboloma adversamente
influenciado de una animal mamífero puede, sin embargo, causar
resultados falso positivos o negativos. Por consiguiente, es
preferido también monitorear datos relacionados a animales mamíferos
o a alojamiento como es descrito abajo en detalle y tener en cuenta
estos datos durante la validación de datos.
Además, procesamiento de datos, preferiblemente,
incluye normalización de los datos crudos con respecto a
referencias internas. Por ejemplo, picos que pueden ser asignados a
metabolitos conocidos pueden ser usados para normalizar picos de
metabolitos desconocidos dentro de una serie de datos obtenidos para
un metaboloma de un individuo de la población animal mamífera con
respecto a, por ejemplo, intensidad de la señal.
Además, procesamiento de datos puede ser
posteriormente requerida para crear datos coherentes convirtiendo
datos en un formato numérico, convirtiendo los datos a una unidad de
formato común y/o reduciendo los datos dimensionalmente. Los datos
pueden ser posteriormente integrados en esa información
relacionándolos a la muestra o animales mamíferos que es asignada a
esto. Medios y métodos apropiados para crear tales datos coherentes
son revelados en WO 03/046798.
Los pasos de procesamiento de datos y la
comparación a la que se hace referencia arriba son preferiblemente
asistidos por automatización, por ejemplo, por un programa de
computadora adecuado que corre en una computadora. La computadora
es, preferiblemente, operativamente conectada a varias bases de
datos a las que se hace referencia de acuerdo con la presente
invención. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención
también está relacionada con una base de datos o sistema de bases
de datos que comprende los resultados obtenidos por el método de la
presente invención. Más preferible, tal base de datos o sistema de
bases de datos comprende información relacionada con los
metabolomas obtenida por compuestos que se sospecha afectan el
metaboloma de un organismo, tales como compuestos tóxicos o
terapéuticamente activos (es decir drogas). De este modo, la base de
datos puede ser usada como una herramienta (base de datos de
referencia) para ensayos de exploración los cuales están dirigidos
a identificar nuevas drogas o compuestos tóxicos por su modo de
acción reflejado por el metaboloma.
Es de ser entendido que el análisis del
metaboloma debe ser realizado después de un período de tiempo
suficiente para permitirle al compuesto entrar en sus células
efectoras, tejidos u órganos, es decir un período de tiempo de
incubación. En otras palabras, el análisis debe ser realizado
después que el compuesto se ha vuelto biodisponible. Dependiendo de
la naturaleza química del compuesto, la persona diestra en la
técnica sabrá qué período de tiempo debe ser suficiente para la
biodisponibilidad de dicho compuesto. Tal período de tiempo puede
también ser definido en un experimento piloto. Por ejemplo, un
compuesto siendo de naturaleza química similar o idéntica puede ser
conectado a una etiqueta detectable. Dicho compuesto etiquetado
puede entonces ser administrado a un animal mamífero. El tiempo
hasta que la etiqueta sea detectable en las células efectoras
sospechosas, tejidos u órganos será determinado y servirá como
período de tiempo de incubación para el método de la presente
invención.
El análisis del metaboloma también,
preferiblemente, comprende tomar una muestra de cada animal mamífero
de la población animal mamífera que será posteriormente analizado
como descrito arriba. Muestras adecuadas incluyen células, tejidos
u órganos del animal o fluidos corporales incluyendo sangre, plasma,
suero, orina, licor espinal. Es bien conocido en la técnica, cómo
tales muestras pueden ser tomadas. Técnicas apropiadas incluyen
muestreo de sangre, biopsia, muestreo de licor, clasificación
celular, etc. Un programa preferido para el muestreo es descrito en
los Ejemplos. La muestra puede ser sometida a pre tratamientos.
Tales pre tratamientos incluyen digestión enzimática de material
biológico que no es apropiado para análisis de metaboloma,
procedimientos de extracción para obtener ciertos metabolitos de la
muestra, fraccionamiento de la muestra, por ejemplo, para poder
obtener fracciones polares y/o no polares de metabolitos, o
formación de derivados de metabolitos, por ejemplo, previo a
cromatografía. Dichas técnicas de pre tratamiento son bien conocidas
en la técnica y pueden ser aplicadas por la persona diestra en la
técnica sin más preámbulos.
Ventajosamente, debido a proporcionar la
población animal mamífera de acuerdo con la presente invención se
puede realizar análisis comparativo confiable del metaboloma. Los
resultados de dicho análisis confiable de acuerdo con el método de
la presente invención hará más rápido el descubrimiento de drogas y
evaluaciones toxicológicas. Preferiblemente, bases de datos son
creadas que comprenden datos metabólicos (es decir datos sobre la
composición cualitativa y cuantitativa de metabolomas o sus perfiles
metabólicos) para un modo de acción de un compuesto o datos
metabólicos que reflejan la administración de compuestos tóxicos o
drogas. Los datos metabólicos de dichas bases de datos pueden ser
usados como referencias cuando se usa el método de la presente
invención para una exploración de compuestos posteriores que se
sospecha tienen efecto sobre el metaboloma. Es previsto que cada
exploración producirá una vista más exhaustiva sobre los modos de
acción. Además, por comparación con dichos datos metabólicos (datos
de referencia) compuestos tóxicos o compuestos terapéuticamente
activos pueden ser identificados rápidamente. Preferiblemente, el
método de la presente invención es realizado en un formato de alto
rendimiento.
En una modalidad preferida del método de la
presente invención, la población animal mamífera es mantenida por
un segundo período de tiempo después de administrar a la población
animal mamífera los compuestos sospechados de tener efecto sobre el
metaboloma en el paso b) bajo las condiciones de alojamiento
descritas a las que se hace referencia arriba.
Mas preferible, el análisis del paso c) es
realizado por lo menos una vez durante dicho segundo período de
tiempo o por lo menos tres veces durante el segundo período de
tiempo, donde el segundo y cualquier análisis adicional es
realizado después de un período de tiempo que es dos veces el
período de tiempo que pasó desde el previo análisis. Más
preferible, el primer análisis es realizado siete días después de la
administración del compuesto en el paso b).
Se ha encontrado en el estudio subyacente a la
presente invención que es ventajoso evaluar el metaboloma sobre un
rango de tiempo desde efectos agudos hasta efectos a largo plazo
incluyendo puntos de tiempo intermedios. Por lo tanto, el método de
la presente invención permite mediciones repetidas durante una
investigación. Por consiguiente, el análisis de los animales
mamíferos es preferiblemente realizado por lo menos una vez,
preferiblemente dos veces o más preferible por lo menos tres veces
durante el segundo período de tiempo. Los puntos de tiempo para
análisis han de ser seleccionados para incluir los efectos tempranos
agudos como también los efectos crónicos o a largo plazo. Puntos de
tiempo apropiados para el análisis pueden ser determinados por la
persona diestra en el arte dependiendo del animal mamífero que es
analizado sin más preámbulos. Específicamente, si un animal
mamífero roedor es usado, tal como una población de ratas o ratones,
un curso de tiempo de análisis es preferido en el cual el segundo y
cualquier análisis adicional es realizado 7 días después de la
administración del compuesto, el segundo análisis debe ser
realizado después de 14 días y el tercer análisis debe ser realizado
después de 28 días después de la administración. Preferiblemente,
si el análisis es realizado analizando una muestra de fluido
corporal, tal como sangre, es preferido que los animales mamíferos
de la población animal mamífera serán mantenidos por un período de
ayunas (es decir retiro de comida) por aproximadamente 16 a 20
horas antes del muestreo de sangre. Además, realizar el análisis
durante una ventana de tiempo constante permite compensar por
cambios metabólicos que pueden ser causados por ejemplo por el ritmo
circadiano de los animales mamíferos de la población animal
mamífera. Por lo tanto, es preferido que el muestreo de sangre y
análisis sea realizado dentro y a una ventana de tiempo constante
para todos los análisis. Preferiblemente análisis incluyendo
muestras es realizado entre 7.30 y 10.30 a.m. Además, los métodos de
la presente invención pueden adicionalmente abarcar en adición al
análisis del metaboloma sanguíneo posteriores investigaciones del
metaboloma de diferentes órganos o fluidos corporales de los
animales mamíferos de la población animal mamífera.
Además, en adición a las investigaciones del
metaboloma, el método puede comprender investigaciones adicionales
que no se relacionan al metaboloma. Específicamente, es previsto que
cada animal mamífero de la población animal mamífera será
patológicamente investigado después de que el análisis metabólico es
completado. Dicha investigación incluye necropsia de los animales
incluyendo exanimación cuidadosa de la superficie externa del
cuerpo, todos los orificios, las cavidades craneal, torácica y
abdominal y sus contenidos. Además, un análisis patológico del
hígado, los riñones, las adrenales, los testículos, el epidídimo, el
timo, el bazo, el cerebro y el corazón deben ser realizados como
sea apropiado y como es descrito en las Guías No. 407, loc. Cit.,
por ejemplo. Además, la exanimación histopatológica debe ser
realizada, preferiblemente, como descrito en lo siguiente:
- Los siguientes tejidos deben ser preservados en el medio de fijación más apropiado para el tipo de tejido y para la pretendida exanimación histopatológica subsecuente: todas las lesiones brutas, cerebro (regiones representativas incluyendo cerebro, cerebelo y puente tronco encefálico), medula espinal, estómago, intestinos delgado y grueso (incluyendo las placas de Peyer), hígado, riñones, adrenales, bazo, corazón, timo, tiroides, tráquea y pulmones (preservado inflando con fijador y después inmersión), gónadas, órganos sexuales accesorios (por ejemplo útero, próstata), vejiga urinaria, nódulos linfáticos (preferiblemente un nódulo linfático que cubre la ruta de administración y otro distante de la ruta de administración para cubrir los efectos sistémicos), nervios periféricos (ciático o tibial) preferiblemente próximo al músculo, y una sección de medula espinal (o, alternativamente, un aspirado de medula espinal preparado fresco). Los descubrimientos clínicos y otros descubrimientos pueden sugerir la necesidad de examinar tejidos adicionales. También cualquier órgano considerado probable a ser órgano objetivo basado en las propiedades conocidas del compuesto a prueba debe ser preservado.
Además, también es preferido que parámetros
hematológicos y bioquímicos de los animales mamíferos de la
población animal mamífera sean determinados. Es preferido que los
datos relacionados a la patología y a los parámetros hematológicos
como también a los bioquímicos sean almacenados en una base de datos
apropiados para cada uno de los animales mamíferos de la población
animal mamífera como datos relacionados a animales mamíferos. Los
datos almacenados son usados preferiblemente para la evaluación de
los datos metabólicos generados por el análisis del metaboloma y/o
para procesamiento de datos. En una modalidad preferida del método
de la presente invención, tomando en consideración estos datos
relacionados a animales mamíferos permite evitar resultados falsos
positivos o falsos negativos porque los animales mamíferos que deben
en comparación a sus paralelos en una población animal mamífera una
patología anormal, hematología o parámetros bioquímicos anormales
pueden ser excluidos de la evaluación de datos durante el
procesamiento de datos. Además, es posteriormente preferido incluir
datos relacionados a animales mamíferos sobre peso corporal, consumo
de alimento, consumo de líquido de beber y signos clínicos como
también posibles anormalidades que pueden aparecer cuando los
animales mamíferos son mantenidos por el primer y segundo período
de tiempo como especificado arriba.
De este modo, en otra modalidad preferida del
método de la presente invención, dicho método que comprende
adicionalmente monitoreo de peso corporal, consumo de alimento,
consumo de líquido de bebida y signos clínicos de la población
animal mamífera. Dicho monitoreo puede ser, mas preferible, asistido
por automatización y los datos monitoreados de peso corporal,
consumo de alimento, consumo de líquido de bebida y signos clínicos
son recolectados en una base de datos para cada uno de los animales
mamíferos de la población animal mamífera.
Además, en vista de lo anterior, el método de la
presente invención, preferiblemente, consta de monitoreo de
anormalidades para cada animal mamífero de la población animal
mamífera. El término "anormalidades" como es usado aquí se
refiere a anormalidades que pueden ser fácilmente detectadas por
personal de mantenimiento, es decir anormalidades que usualmente no
requieren monitoreo por un doctor. Mas preferible, las anormalidades
son monitoreadas automáticamente y los datos obtenidos de dicho
monitoreo son guardados en una base de datos para cada individuo de
la población animal mamífera.
Como se hace ya referencia arriba, en una
modalidad preferida del método de la presente invención, dicho
análisis comprende comparar el metaboloma de la población animal
mamífera con una referencia.
Más preferible, comparar comprende generar un
perfil metabólico del metaboloma de los animales mamíferos de la
población animal mamífera y comparando dicho perfil con una
referencia. Mas preferible, una diferencia en los perfiles
metabólicos es indicativo para un compuesto que tiene efecto sobre
el metaboloma de un animal mamífero. Es de ser entendido que la
referencia en esta modalidad mas preferida es un perfil metabólico
derivado de un animal mamífero no tratado.
El término "perfil metabólico" significa
que una huella digital específica es establecida durante análisis
para cada metaboloma de un animal mamífero de la población animal
mamífera. Dicho perfil metabólico puede ser derivado de por lo
menos una señal (por ejemplo un pico en el espectro de masa)
obtenido de un animal mamífero o una muestra del mismo por el
método de la presente invención. Más preferible, un perfil
metabólico es derivado de una pluralidad de dichas señales. Las
señales pueden ser obtenidas de un solo metabolito o de una
pluralidad de metabolitos. Es de ser entendido que las señales
primarias pueden ser adicionalmente procesadas por técnicas
apropiadas como descritas arriba. Preferiblemente, una serie de
datos tri-dimensionales es generado usando por lo
menos una técnica de separación de tiempo resuelta y por lo menos
una técnica de separación resuelta. Tal serie de datos podría ser
obtenida, por ejemplo de cromatografía junto con espectrometría de
masa como es descrito arriba. Tal serie de datos
tri-dimensional puede ser analizada por algoritmos
convencionales de determinación de picos, tales como ChemStation o
AMDIS, que permiten la detección especifica de máxima y/o mínima en
dichas series de datos tri-dimensionales. La máxima
y mínima de este modo extraídas serán el perfil metabólico
específico para el metaboloma de cierto animal mamífero de una
población animal mamífera. Además, las señales extraídas, tales
como la máxima o mínima de los picos pueden ser posteriormente
procesadas en valores característicos como una función del
respectivo tiempo y masa. Es de ser entendido que los perfiles
metabólicos generados por las técnicas anteriormente mencionadas
consisten, preferiblemente, de series de datos que son
dimensionalmente reducidos y, por lo tanto, puede ser fácilmente
comparado con cada uno por pruebas estadísticas, incluyendo
análisis de componente principal (PCA) o pruebas de mínimos
cuadrados parciales (PLS). Una diferencia en el perfil metabólico
de un metaboloma de un animal mamífero de prueba (es decir un
animal mamífero que ha obtenido un compuesto sospechoso de tener
efecto sobre el metaboloma de un animal mamífero) y una referencia
es un indicador de que el compuesto efectivamente induce cambios
metabólicos en el animal mamífero de prueba. Sin embargo como ya
descrito arriba, esto no necesariamente significa que la composición
cuantitativa del metaboloma (es decir el numero de compuestos que
están presentes) será cambiado. Cambios en los perfiles metabólicos
puede también ser un indicador para una composición cuantitativa
alterada del metaboloma (es decir la cantidad de los compuestos que
están presentes es alterada). Más preferible, los perfiles
metabólicos pueden ser comparados a perfiles metabólicos
comprendidos por una base de datos con perfiles de referencia para
drogas conocidas, pro-drogas o compuestos tóxicos o
sus modos de acción. Ventajosamente, el método de la presente
invención, por lo tanto, permite que los procedimientos
exploratorios para drogas y candidatos de drogas sean más
eficientes en tiempo ya que efectos tóxicos o dañinos de los
compuestos pueden ser determinados a una etapa temprana del
desarrollo de la droga. Posteriormente, pruebas de toxicidad pueden
ser realizadas fácilmente de forma eficiente en tiempo ya que el
inicio de eventos tóxicos puede ser monitoreado por cambios de los
perfiles metabólicos. En particular, esto es ventajoso para
compuestos que causan efectos tóxicos a largo plazo en vez de
efectos inmediatos.
Es de ser entendido que diferencias o cambios en
el metaboloma de un animal mamífero pueden también ser analizados
comparando metabolitos específicos de naturaleza química conocida o
desconocida en lugar de un perfil metabólico.
Por consiguiente, en otra modalidad preferida
del método de la presente invención, comparar comprende comparar
por lo menos un metabolito del metaboloma de una población animal
mamífera con una referencia. Más preferible, una diferencia en
dicho por lo menos un metabolito es indicativo para un compuesto que
tiene efecto sobre el metaboloma de un animal mamífero. Es de ser
entendido que la referencia en esta modalidad mas preferida es un
perfil metabólico derivado de un animal mamífero no tratado.
En otra modalidad preferida del método de la
presente invención y en luz de lo anterior, dicho compuesto es un
compuesto sospechoso de ser tóxico o un compuesto sospechoso de ser
una droga.
La presente invención adicionalmente se
relaciona con un método para la identificación de un marcador para
un compuesto que tiene efecto sobre el metaboloma de un animal
mamífero, que comprende los pasos del método de la presente
invención como descrita antes y el paso adicional de proveer un
marcador para dicho compuesto basado en el análisis del metaboloma.
En una modalidad preferida del método de la presente invención,
dicho marcador es un perfil metabólico de la población animal
mamífera que es alterado comparado a una referencia. Más
preferible, dicho marcador indica toxicidad de un compuesto, un modo
de acción de un compuesto o una actividad terapéutica de un
compuesto.
Además, la presente invención abarca un método
para identificar un compuesto que tiene efecto sobre el metaboloma
de un animal mamífero que comprende análisis metabólico de una
muestra de por lo menos un animal mamífero de una población animal
mamífera al cual se le administró un compuesto sospechoso de tener
efecto sobre el metaboloma y donde dicha población animal mamífera
ha sido mantenida antes y después de la administración del
compuesto bajo las condiciones de alojamiento a las que se hizo
referencia anteriormente.
El término "analizando metabólicamente"
como es usado aquí, preferiblemente, abarca todos los medios,
métodos y modalidades descritas anteriormente para analizar el
metaboloma de un animal mamífero.
El término "muestra" como es usado aquí
abarca muestras de material biológico obtenidas del animal mamífero
a ser investigado. Fuentes apropiadas para muestras ya han sido
descritas arriba.
En una modalidad preferida del método de la
presente invención, dichos análisis comprenden comparar el
metaboloma de la muestra de un animal mamífero de dicha población
animal con una referencia.
Más preferible, comparar comprende generar un
perfil metabólico para la muestra de un animal mamífero de la
población animal mamífera y comparando dicho perfil con una
referencia. Más preferible, una diferencia en el perfil metabólico
es indicativa para un compuesto que tiene efecto sobre el metaboloma
de un animal mamífero. Es de ser entendido que la referencia en
esta modalidad preferida es un perfil metabólico derivado de un
animal mamífero no tratado.
También más preferible, comparar comprende
comparar por lo menos un metabolito del metaboloma de una muestra
de un animal mamífero de la población animal mamífera con una
referencia. Mas preferible, una diferencia en el mencionado por lo
menos un metabolito es indicativo para un compuesto que tiene efecto
sobre el metaboloma de un animal mamífero. Es de ser entendido que
la referencia en esta modalidad mas preferida es un perfil
metabólico derivado de un animal mamífero no tratado.
También abarcado por la presente invención es un
método para la identificación de un marcador para un compuesto que
tiene efecto sobre el metaboloma de un animal mamífero que comprende
los pasos de los métodos anteriormente mencionados (basado en las
muestras) y el paso adicional de proveer dicho marcador basado en el
análisis del metaboloma.
En una modalidad preferida de dicho método de la
presente invención, dicho marcador es un perfil metabólico o es por
lo menos un metabolito del metaboloma de la muestra de un animal
mamífero de la población animal mamífera que es alterado comparado
a una referencia. Más preferible, dicho marcador indica toxicidad de
un compuesto, un modo de acción de un compuesto o una actividad
terapéutica de un compuesto.
La invención va a ser ahora ilustrada por los
siguientes Ejemplos. Sin embargo, los Ejemplos son simplemente para
propósito de ilustración y no es el propósito limitar el campo de
aplicación de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratas de la cepa CrlGlxBrlHan:Wi fueron
compradas de Charles River, Sulzfeld, Alemania que tiene una edad
de 63 a 65 días. Consecutivamente, cada animal ha sido marcado con
un tatuaje en la oreja. Los animales fueron mantenidos bajo las
siguientes condiciones de alojamiento:
- Condiciones del aire:
- Temperatura 20-24ºC, humedad 30-70%. Cualquier desviación ha sido documentada.
- Período de iluminación:
- 12 horas de luz desde 6.00 a 18.00 horas, 12 horas de oscuridad desde 18.00 a 6.00 horas.
- Tipo de jaula:
- Jaulas de alambre, tipo DK III, BECKER & Co., Castrop-Rauxel, Alemania.
- No. de animales por jaula:
- 1
- Tipo de dieta:
- dieta de mantenimiento molida Kliba para ratón/rata "GLP", harina, suministrada por Provimi Kliba SA, Kaiseraugst (Suiza), ad libitum
- Agua:
- Agua de bebida ad libitum
- Aclimatación:
- Durante el período de aclimatación de 7 días, los animales han sido acostumbrados a las condiciones ambientales del estudio y a la dieta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratas wistar hembras y machos han sido
aleatorizadas y asignadas a los grupos de dosis antes del inicio del
período de administración en base a sus pesos. Los animales han sido
tratados con cinco compuestos de prueba diferentes a un nivel de
dosis alto y uno bajo de acuerdo al siguiente programa mostrado en
la Tabla 1.
El muestreo de sangre fue realizado como es
indicado en el siguiente programa de tiempo mostrado en la Tabla
2.
Durante el experimento, una revisión de animales
moribundos y muertos ha sido realizada dos veces, diariamente de
Lunes a Viernes y una vez al día el Sábado, Domingo y feriados. Los
animales serán revisados diariamente para cualquier signo clínico
anormal. Anormalidades y cambios serán documentados para cada
animal.
El consumo de comida ha sido determinado en los
días del estudio 6, 13, 20 y 27. Consumo de agua de bebida ha sido
revisado diariamente dentro de las observaciones generales. El peso
corporal ha sido determinado antes del inicio del período de
administración, para poder aleatorizar los animales. Durante el
período de administración el peso corporal ha sido determinado en
los días del estudio 0, 6, 13, 20 y 27. El consumo promedio diario
de las sustancias de prueba ha sido calculado basado en los valores
individuales para peso corporal y consumo de comida.
Medias y desviaciones estándar han sido
calculadas usando la prueba de Dunnet.
\newpage
El muestreo de sangre fue realizado como
sigue:
Antes de la necropsia o muestreo de sangre, se
retiró la comida por aproximadamente 16 a 20 horas (período de
ayuno). El muestreo de sangre fue realizado entre las 7:30 y 10:30
am. La sangre fue tomada del plexo venoso
retro-orbital de animales anestesiados con
isoflurano. De cada animal se recolectará 1 ml de sangre en tubos
plásticos con EDTA como anticoagulante (10 \mul de una solución al
10%). Las muestras de sangre son centrifugadas. El plasma de cada
muestra es separado y transferido a otro tubo plástico. Los
eritrocitos precipitados son lavados tres veces con NaCl al 0.9%, y
llenados a 1 ml con agua destilada estéril (Ampuwa®, Fresenius, Bad
Homburg, Alemania) para hemolizar los glóbulos rojos. La hemoglobina
es determinada en las muestras de sangre hemolizadas (40 \mul
hemolizante mas 160 \mul de NaCl al 1.5%) con un analizador
automático (ADVIA 120, Bayer AG, Fernwald, Alemania). Sangre, plasma
y hemolizado son muestreados y guardados en tubos Eppendorf
originales. Transporte y preparación de las muestras es realizado
bajo enfriamiento con hielo. Al final de la preparación de la
muestra todas las muestras son superpuestas con una atmosfera de
nitrógeno puro, selladas con "Parafilm M" y guardadas a -80ºC
(bajo atmósfera de nitrógeno) hasta posterior procesamiento de las
muestras (por ejemplo, envío).
Después de completar el experimento, se
determinó la patología clínica para cada animal. Para este fin todos
los animales que sobrevivieron el estudio han sido sacrificados por
decapitación bajo anestesia por isoflorano (si fue previsto
muestreo final de sangre) o por anestesia con CO_{2}.
Claims (30)
1. Un método para proveer una población animal
mamífera que tiene un metaboloma esencialmente idéntico que
comprende:
- a)
- compilar una población animal mamífera siendo esencialmente de la misma edad;
- b)
- mantener dicha población animal mamífera del paso a) por un primer período suficiente para aclimatación bajo las siguientes condiciones de alojamiento:
- i)
- temperatura constante;
- ii)
- humedad constante;
- iii)
- separación física de los animales mamíferos de la población animal mamífera;
- iv)
- alimentar ad libitum, donde la comida a ser brindada es esencialmente libre de contaminantes químicos y microbianos;
- v)
- beber ad libitum, donde el líquido de bebida es esencialmente libre de contaminantes químicos o microbianos;
- vi)
- período de iluminación constante; y
- c)
- proveer la población animal mamífera del paso b) después de dicho primer período de tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1, donde dicha
población animal mamífera es una población de roedores.
3. El método de la reivindicación 2, donde dicho
roedor es una rata o ratón.
4. El método de la reivindicación 3, donde dicha
edad está dentro del rango de X \pm 1 día, donde X es la edad
visualizada de la población.
5. Un método para la identificación de un
compuesto que tiene efecto sobre el metaboloma de un animal mamífero
que comprende:
- a)
- proveer una población animal mamífera usando los pasos del método de la reivindicación 1;
- b)
- administrar a dicha población animal mamífera un compuesto sospechoso de tener efecto sobre el metaboloma de un animal mamífero;
- c)
- analizar el metaboloma de la población animal mamífera del paso b); y
- d)
- realizar la necropsia de cada uno de los animales mamíferos de la población animal mamífera.
\vskip1.000000\baselineskip
6. El método de la reivindicación 5, donde la
población animal mamífera es mantenida por un segundo período de
tiempo después de administrar a la población animal mamífera un
compuesto sospechoso de ser tóxico en el paso b) bajo las
condiciones de alojamiento descritas en la reivindicación 1.
7. El método de la reivindicación 6, donde el
análisis del paso c) es realizado por lo menos una vez durante
dicho segundo período de tiempo.
8. El método de la reivindicación 6, donde el
análisis del paso c) es realizado por lo menos tres veces durante
el dicho segundo período de tiempo, donde el segundo y posteriores
análisis son realizados después de un período de tiempo el cual es
dos veces el período de tiempo que transcurrió desde el previo
análisis.
9. El método de la reivindicación 8, donde el
primer análisis es realizado siete días después de la administración
del compuesto en el paso b).
10. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 9, que comprende adicionalmente monitoreo del
peso corporal, consumo de alimento, consumo de líquido de beber y
signos clínicos de la población animal mamífera.
11. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 10, que comprende adicionalmente monitoreo de
anormalidades para cada animal mamífero de la población animal
mamífera.
12. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 11, donde el análisis comprende comparar el
metaboloma de la población animal mamífera con una referencia.
13. El método de la reivindicación 12, donde la
comparación comprende generar un perfil metabólico para el
metaboloma de un animal mamífero de una población animal mamífera y
comparando dicho perfil con una referencia.
14. El método de la reivindicación 13, donde una
diferencia en los perfiles metabólicos es indicativa para un
compuesto que tiene efecto sobre el metaboloma de un animal
mamífero.
15. El método de la reivindicación 12, donde
comparar comprende la comparación de por lo menos un metabolito del
metaboloma de un animal mamífero de la población animal mamífera con
una referencia.
16. El método de la reivindicación 15, donde una
diferencia en el dicho por lo menos un metabolito es indicativo
para un compuesto que tiene efecto sobre el metaboloma de un
mamífero.
17. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 16, donde dicho compuesto es un compuesto
sospechoso de ser tóxico o es un compuesto sospechoso de ser una
droga.
18. Un método para la identificación de un
marcador para un compuesto que tiene efecto sobre el metaboloma de
un mamífero que comprende los pasos del método de cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 17 y el paso adicional de proveer un marcador
para dicho compuesto basado en el análisis del metaboloma.
19. El método de la reivindicación 18, donde
dicho marcador es un perfil metabólico o es por lo menos un
metabolito de un mamífero de la población animal mamífera que es
alterado comparado a una referencia.
20. El método de la reivindicación 18 o 19,
donde dicho marcador indica la toxicidad de un compuesto, un modo
de acción de un compuesto o una actividad terapéutica de un
compuesto.
21. Un método para identificar un compuesto que
tiene efecto sobre el metaboloma de un mamífero que comprende
analizar metabólicamente una muestra de por lo menos un mamífero de
una población animal mamífera a la cual se le administró un
compuesto sospechoso de tener efecto sobre el metaboloma de un
mamífero y donde dicha población animal mamífera ha sido mantenida
antes y después de la administración del compuesto bajo las
condiciones de alojamiento descritas en la reivindicación 1.
22. El método de la reivindicación 21, donde
dicho análisis comprende comparar el metaboloma de la muestra de un
mamífero de dicha población animal mamífera con una referencia.
23. El método de la reivindicación 22, donde
comparar comprende generar un perfil metabólico para la muestra de
un animal de la población animal mamífera y comparando dicho perfil
con una referencia.
24. El método de la reivindicación 23, donde una
diferencia en el perfil metabólico es indicativo para un compuesto
que tiene efecto sobre el metaboloma de un mamífero.
25. El método de la reivindicación 22, donde
comparar comprende comparar por lo menos un metabolito del
metaboloma de la muestra de una población animal con una
referencia.
26. El método de la reivindicación 25, donde una
diferencia en el dicho por lo menos un metabolito es indicativo
para un compuesto que tiene efecto sobre el metaboloma de un
animal.
27. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26, donde dicho compuesto es un compuesto
tóxico o droga.
28. Un método para la identificación de un
marcador para un compuesto que tiene efecto sobre el metaboloma de
un mamífero que comprende los pasos del método de cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26 y el paso adicional de proveer dicho
marcador basado en el análisis del metaboloma.
29. El método de la reivindicación 28, donde
dicho marcador es un perfil metabólico o es por lo menos un
metabolito del metaboloma de la muestra de un mamífero de la
población animal mamífera que es alterado comparado a una
referencia.
30. El método de la reivindicación 28 o 29,
cuando dicho marcador indicando toxicidad de un compuesto, un modo
de acción de un compuesto o una actividad terapéutica de un
compuesto.
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