PT1909561E - Método de apresentação e análise de uma população animal com um metaboloma essencialmente idêntico - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO DE APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DE UMA POPULAÇÃO ANIMAL COM UM METABOLOMA ESSENCIALMENTE IDÊNTICO" A presente invenção refere-se a um método de apresentação de uma população de animais mamíferos com um metaboloma essencialmente idêntico, compreendendo a compilação de uma população de animais mamíferos essencialmente da mesma idade, a manutenção da população animal por um período de tempo suficiente para aclimatação nas seguintes condições de abrigo: (i) temperatura constante, (ii) humidade constante, (iii) separação física dos animais mamíferos em relação à população de animais mamíferos, (iv) alimentação ad libitum, encontrando-se o alimento que vai ser fornecido essencialmente isento de contaminação química ou microbiana, (v) ingestão de bebida ad libitum, em encontrando-se o líquido para beber essencialmente isento de contaminação química ou microbiana, (vi) período de iluminação constante e apresentação da população animal mencionada depois do período de tempo. Além disso, a presente invenção refere-se a métodos de identificação de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero ou métodos de identificação de um marcador desses compostos. Além disso, a presente invenção engloba métodos de identificação desses compostos ou respectivos marcadores, compreendendo a análise metabólica de uma amostra de pelo menos um animal mamífero de uma população de animais mamíferos. 2

As técnicas mais avançadas de análise do fenotipo dos organismos inclui, entre outras, a análise da totalidade do genoma do organismo mencionado, designada genómica, análise da totalidade das proteínas, designada proteómica e a análise da totalidade das transcrições de ARN. Mais recentemente, estas técnicas fundamentais de análise fenotípica foram completadas com a análise do metaboloma, a totalidade dos metabolitos de um organismo. Esta análise é designada metabolómica ou, por vezes metabonómica. A metabolómica pode ser definida como a determinação qualitativa e quantitativa de todos os compostos de baixo peso molecular (isto é metabolitos) numa célula ou fluido corporal de um organismo num momento específico e em condições ambientais específicas. Uma vantagem da metabolómica reside na possibilidade de controlo imediato dos efeitos provocados por factores exógenos graças às alterações metabólicas que normalmente aparecem muito antes das alterações, se as houver, no proteoma ou mesmo no genoma.

Foram já descritas várias técnicas de análise do metaboloma de um organismo. Estas técnicas incluem, por exemplo, espectroscopia de massa, RMN, espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FT-IR) e detecção por ionização de chama (FID), opcionalmente em conjunto com técnicas de separação cromatográfica, tal como cromatografia líquida, cromatografia gasosa ou HPLC. Estas técnicas permitem uma selecção de elevado rendimento de grandes populações de organismos por variações na composição do respectivo metaboloma, isto é, permitem determinar um fenotipo metabólico. Um fenotipo metabólico de um organismo consiste na totalidade dos respectivos metabolitos (metaboloma) num determinado momento e é o 3 resultado de interacções complexas da sua composição genética e do ambiente vital do organismo. Assim, as diferenças no metaboloma dos indivíduos de uma população de organismos podem ser provocadas não só pelas diferenças no genoma como também por factores ambientais que influenciam actividades metabólicas. A metabolómica permite, assim, determinar até os efeitos de factores exógenos que não influenciam imediatamente o genoma, a transcrição ou o proteoma de um organismo. Por exemplo, um composto tóxico é prejudicial para um organismo mas não provoca necessariamente alterações no genoma do dito organismo. Actualmente, animais de laboratório de uma população de animais mamíferos são mantidos individualmente em condições ambientais e nutricionais iguais e controladas (US-A-5163380, US-A-346488).

Actualmente, uma desvantagem da metabolómica em comparação com outras homologações de análise fenotípica fundamentais reside no facto de os organismos e, em particular, animais mamíferos que são utilizados em estudos metabólicos na técnica anterior não partilham um metaboloma comum no início de um estudo. Na genómica, por exemplo, pode ser facilmente apresentada uma população com um genoma essencialmente idêntico com as técnicas de clonagem mais avançadas. No entanto, seria muito desejável detectar as influências metabólicas de factores exógenos, tal como compostos tóxicos ou fármacos em condições optimizadas. As técnicas de determinação de animais mamíferos com um metaboloma essencialmente idêntico constituem a base de uma análise metabolómica fidedigna e eficiente. Muito embora haja a necessidade, estas técnicas não foram ainda descritas. 4

Assim, o problema técnico subjacente à presente invenção deve ser encarado como a apresentação de métodos que satisfaçam as necessidades anteriormente mencionadas, isto é apresentação de uma população de animais mamíferos com um metaboloma essencialmente idêntico para estudos fidedignos do metaboloma e análises fidedignas. 0 problema técnico é resolvido pelas concretizações caracterizadas nas reivindicações e descritas seguidamente.

Assim, a presente invenção refere-se a um método de apresentação de uma população de animais mamíferos com um metaboloma essencialmente idêntico, compreendendo: a) Compilação de uma população de animais mamíferos essencialmente da mesma idade; b) Manutenção da população de animais mamíferos mencionada na etapa a) por um primeiro período de tempo suficiente para aclimatação nas seguintes condições de abrigo: i) temperatura constante; ii) humidade constante; iii) separação física dos animais mamíferos da população de animais mamíferos; iv) Alimentação ad libitum, estando o alimento a ser fornecido essencialmente isento de contaminantes químicos ou microbianos; v) bebida ad libitum, estando o líquido de beber essencialmente isento de contaminantes químicos ou microbianos; iv) Período de iluminação constante e 5 c) apresentação da população de animais mamíferos da etapa b) passado o primeiro período de tempo mencionado. 0 termo "método de apresentação", tal como presentemente utilizado, preferivelmente não engloba métodos de tratamento do corpo do animal mamífero. Especificamente, o método referido não é adequado para tratamento médico ou terapia de qualquer doença ou transtorno, nem adequado para melhorar ou manter o bem-estar geral de animais mamíferos da população de animais mamíferos em comparação com animais mamíferos mantidos noutras condições fisiológicas. Além disso, o termo não inclui quaisquer técnicas de criação per se. 0 termo "população de animais mamíferos" refere-se a um conjunto plural de animais mamíferos. Um conjunto plural de animais mamíferos tal como presentemente utilizado é um grupo de animais mamíferos que consiste em pelo menos dois, de preferência 5 a 120, mais preferivelmente 5 a 25 dos animais mamíferos mencionados, divididos por sexo, dose e momento temporal. Os animais mamíferos da população de animais mamíferos são da mesma espécie e, de preferência, da mesma estirpe. Os animais mamíferos preferidos que serão utilizados no método da presente invenção são roedores, mais preferencialmente, ratos ou ratinhos. Se forem empregues ratos para o método da presente invenção prefere-se ainda que estes ratos sejam ratos Wistar (CrlGlxBrlHan: Wi) (Charles River, EUA) . Outras estirpes de ratos preferidas são: estirpes BDIX; BDIX/CrCrl, BDlX/OrlCrl, estirpes Brown Norway; BN/CrlCrlj, BN/Crl, BN/0rlCrl, BN/0rlCrl, BN/SsNHsdMcwiCrl, estirpe Buffalo; BUF/CrCrl; estirpes Fischer, F344/DuCrl, F344/DuCrlCrlj , F344/lcoCrl, F344/DuCrl, estirpe SASCO Fischer, F344/NCrl; estirpes 6

Copenhaga, COP/CrCrl, COP/NCrl; estirpe Cotton, COT/NCrl; estirpe Dahl/SS, SS/JrHsdMcwiCrl; estirpe Fawn Hooded, FHH/EurMcwiCrl; estirpe GK, GK/Crlj; estirpes Lewis, LEW/CrlCrl; LEW/Crl; estirpe Noble, NBL/CrlCrl; estirpes SHR, SHR/NCrlCrlj, SHR/NCrl, SHR/NCrl; WAG estirpe, WAG/RijCrl; estirpes Wistar Furth, WF/CrCrl, WF/lcoCrl; estirpes WKY, WKY/NCrl, WKY/NCrlCrlj, WKY/NlcoCrl; estirpes ZDF, ZDF/Crl-Lepf ZDF/Crl-Leprfa/ estirpes CD, Crl:CD(SD), Crij:CD(SD), Crl:CD(SD), Crl:CD(SD); estirpe SASCO SD, Crl:SD; estirpes OFA, Crl:OFA(SD), Cri:OFA(SD)-hr; estirpe DIO, Cri:CD(SD)DR; estirpe DR, Cri:CD(SD)DR; estirpe Donryu, CrljrDON; estirpe LEC, Crlj:LEC; estirpes Wistar, Crlj:Wl, Crl:Wl; estirpes Wistar Han, Crl:Wl(Han), Crl:Wl(Han), Crl:Wl (Han), CrlrWl(Han); estirpe Wistar WU, Crl:Wl(WU) ou qualquer outra estirpe derivada das estirpes anteriormente mencionadas por cruzamento ou manipulação genética. As estirpes anteriormente mencionadas são bem conhecidas na técnica e encontram-se disponíveis comercialmente, por exemplo junto da Charles River, EUA ou Harlan, EUA. Se forem empregues ratinhos para o método da presente invenção prefere-se ainda que estes ratinhos sejam ratinhos C57BL/GNCrl (Charles River, EUA). Outras estirpes de ratinhos preferidas são: estirpes CD-I, Crij:CD1(ICR) , Cri:CD1 (ICR), Cri:CD1(ICR), Cri:CD1(ICR), Cri:CDl(ICR); estirpes CF-1, CrlrCFl, CrlrOFl; estirpes CFW, Crl:CFW(SW); estirpes NMRI, Cri:NMRI, Cri:NMRI (Han); estirpe PGP, Cri:CF1-Abcbla, estirpes SKH1, Crl:SKHl-hr, Crl:SKHl-hr estirpe SKH2, Crl:SKH2-hr estirpe A/J, A/J; estirpes 129, 12 9S2/SvPasCrl, 129S2/SvPasCrl; 12 9/Sl/Sv-p+Tyr+KÍ tsI'J/Crl, 129/sl/svlmJ; estirpe AKR, AKR/NCrl; estirpes BALB/c, BALB/cAnNCrlCrlj, BALB/CAnNCrl, BALB/cByJ; estirpes C3H, C3H/HeJCrl, C3H/ HeNCrlCrlj, C3H/HeNcrl, C3H/HeOuJ; estirpes C57BU6, C57BU6JCrl, C57BL/6J, C57BL/6JCrl. 7 C57BL/6NCrlCrlj, C57BL/6NCrl, C57BL/6J, C57BU6JCrl, C57BL/6J; estirpes C57BU10, C57BL/10JCrl, C57BL/10JCrl; estirpes CBA, CBA/ CaCrl, CBA/J, CBA/JNCrlj, CBA/JNCrljCrlg; estirpe CB17, CB17/lcrCrl; estirpes DBA/1, DBA/1JCRL, DBA/1JNCrlj, DBA/ lNlcoCrl; estirpes DBA/2, DBA/2J, DBA/2NCrlCrlj, DBA/2NCrl, DBA/2JCrl; estirpe FVB, FVB/NCrl; estirpe NC, NC/NgaT- ndCrlj; estirpe NOD, NOD/LtJCrl; estirpes SJL, SJL/JOrlCrl, SJL/JOrl/CrlCrlj, SJUJ, SJL/JCrl; estirpes B6C3F1, B6C3F1/Crl, B6C3F1/Crlj; estirpes B6CBAF1, B6CBAF1/Crl, B6CBAF1/J, B6CBAF1/Crl; estirpes BDF1 (B6D2F1), B6D2F1/Crl, B6D2F1/J, B6D2F1/Crlj; estirpe B6SJLF1, B6SJLF1/J; estirpe C3D2F1, C3D2F1/Crl; estirpes CDF1 (CD2F1), CD2F1/Crl, CD2F1/Crlj, CD2F1/Crl; estirpe CBAB6F1, CBAB6F1/Crl; estirpe CB6F1, CB6F1/Crl; estirpe NMRCF1, NMRCFl/Crl ou qualquer outra estirpe derivada das estirpes anteriormente mencionadas por cruzamento ou manipulação genética As estirpes anteriormente mencionadas são bem conhecidas na técnica e encontram-se disponíveis comercialmente, por exemplo junto da Charles River, EUA ou Harlan, EUA. Outros mamíferos preferidos são cães. Cães preferidos incluem beagles, mais preferencialmente, as estirpes de beagle HsdRdgrDOBE ou HsdHFrrDOBE que são derivadas das estirpes anteriormente mencionadas por meio de cruzamento ou manipulação genética. As estirpes anteriormente mencionadas podem ser adquiridas junto da Harlan EUA. Outros beagles preferidos pertencem a uma estirpe mestiça e podem ser adquiridos junto da BASF AG, Alemanha. No entanto, os animais mamíferos utilizados são estão limitados aos animais mamíferos mencionados anteriormente e podem ser ainda seleccionados do grupo constituído por: gatos, cavalos, vacas, ovelhas, cabras, coelhos. 8 0 termo "metaboloma", tal como presentemente utilizado, designa a totalidade dos metabolitos numa célula, tecido, órgão ou todo o animal mamífero. Os metabolitos são, de preferência, pequenos compostos moleculares, tal como substratos de enzimas ou vias metabólicas, intermediários dessas vias ou os produtos obtidos por uma via metabólica. As vias metabólicas são bem conhecidas na técnica e podem variar entre espécie. Preferivelmente, estas vias incluem pelo menos o ciclo do ácido cítrico, cadeia respiratória, fotossíntese, fotorrespiração, glicólise, gluconeogénese, via do monofosfato de hexose, via fosfato pentose oxidativa, produção e β-oxidação de ácidos gordos, ciclo da ureia, vias de biossíntese dos aminoácidos, vias da degradação das proteínas, tal como da degradação proteossómica, vias da degradação dos aminoácidos, biossíntese ou degradação de: lípidos, policetídeos (incluindo, por exemplo flavonóides e isoflavonóides), isoprenóides (incluindo por exemplo terpenos, esteróis, esteróides, carotenóides, xantofilos), hidratos de carbono, fenilpropanóides e antocianos, hormonas, vitaminas, co-factores tal como grupos protésicos ou transportadores de electrões, linhina, glucosinolatos, purinas, pirimidinas, nucleósidos, nucleótidos e moléculas relacionadas, tal como tANRs, microARNs (miARN) ou mARNs. Assim, pequenos metabolitos do composto molecular são constituídos preferivelmente pelas seguintes classes de compostos: Álcoois, alcanos, alcenos, alcinos, compostos aromáticos, cetonas, aldeídos, ácidos carboxílicos, ésteres, aminas, iminas, amidas, cianidas, aminoácidos, peptídeos, tióis, tioésteres, ésteres de fosfato, ésteres de sulfato, tioéteres, sulfóxidos, ésteres ou combinações ou derivados dos compostos anteriormente mencionados. As pequenas moléculas entre os metabolitos podem ser metabolitos 9 primários que são necessários para normalizar toda a função, função orgânica ou crescimento animal, desenvolvimento ou saúde. Além disso, pequenos metabolitos moleculares incluem ainda metabolitos secundários com função ecológica essencial, por exemplo, metabolitos que permitem a um organismo adaptar-se ao seu ambiente. Ainda, os metabolitos não estão limitados aos metabolitos primários e secundários mencionados e englobam ainda compostos de molécula pequena artificiais. Estes compostos de molécula pequena são derivados de pequenas moléculas fornecidas exogenamente, as quais são administradas ou incorporadas por um organismo mas não constituem metabolitos primários ou secundários tal como anteriormente definido. Por exemplo, compostos de molécula pequena artificiais podem ser produtos metabólicos obtidos a partir de medicamentos ou vias metabólicas do animal mamífero. Além disso, os metabolitos incluem ainda peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, oligonucleótidos e polinucleótidos, tal como ARN ou ADN. Mais preferencialmente, um metabolito possui um peso molecular de 50 Da (Dalton) a 30,000 Da, preferivelmente menos de 30.000 Da, menos de 20,000 Da, menos de 15,000 Da, menos de 10.000 Da, menos de 8,000 Da, menos de 7,000 Da, menos de 6, 000 Da, menos de 5, 000 Da, menos de 4,000 Da, menos de 3.000 Da, menos de 2,000 Da, menos de 1,000 Da, menos de 500 Da, menos de 300 Da, menos de 200 Da, menos de 100 Da. Preferivelmente, um metabolito tem, contudo, um peso molecular de pelo menos 50 Da. Mais preferivelmente, um metabolito de acordo com a presente invenção possui um peso molecular de 50 Da até 1.500 Da. O termo "metaboloma essencialmente idêntico" significa que todos os indivíduos da população de animais mamíferos 10 apresentados pelo método da presente invenção têm actividades metabólicas sincronizadas resultando (i) na presença de essencialmente os mesmos metabolitos no metaboloma de cada indivíduo da população e (ii) em quantidades dos metabolitos mencionados que são essencialmente idênticos para cada um dos indivíduos da população de animais mamíferos. Preferivelmente, actividades metabólicas sincronizadas, tal como presentemente utilizado, significa todas as vias metabólicas que afectam o metaboloma dos animais mamíferos estão activas essencialmente nas mesmas células, tecidos ou órgãos, essencialmente ao mesmo tempo, os níveis de expressão genética em todos os animais mamíferos são essencialmente idênticos e existem moléculas pequenas artificiais para todos os animais mamíferos em quantidades essencialmente idênticas. Subentende-se que as quantidades metabólicas podem variar entre indivíduos da população de animais mamíferos dentro de certos limites. A presença os mesmos metabolitos em quantidades essencialmente iguais nos indivíduos da população de animais mamíferos indicados de acordo com a presente invenção pode ser determinada por meio de várias técnicas de análise de compostos, qualitativas e/ou quantitativas. Estas técnicas incluem, sem se limitarem a técnicas cromatográficas de separação de compostos associadas a técnicas de análise de compostos, tal como espectrometria de massa (MS), espectrometria de ressonância iónica ciclotrónica com transformada de Fourier ou FiD. De acordo com a presente invenção é preferida uma determinação quantitativa e/ou qualitativa dos metabolitos recorrendo a cromatografia líquida e gasosa associada a espectrometria de massa (LC-MS e (GC-MS). Seguidamente são descritos pormenores dos métodos preferidos mencionados. Preferivelmente, um população de animais mamíferos possui 11 um metaboloma essencialmente idêntico se nos espectros de massa gerados por uma destas técnicas forem essencialmente idênticos para cada indivíduo da população. Os espectros de massa são essencialmente idênticos se todos os picos principais que são detectáveis por, por exemplo, um algoritmo de anotação de pico comercial, tal como ChemStation (Agilent Technologies, EUA), Analyst (MDS SCIEX, Canada) ou AMDIS (NIST, EUA), aparecem em todos os espectros com tempos de retenção cromatográficos essencialmente idênticos. Como anteriormente discutido, são toleráveis variações mínimas se não provocarem diferenças estatisticamente significativas. A insignificância da variação, de acordo com a presente invenção, pode ser determinada por algoritmos estatísticos adequados, bem conhecidos dos especialistas na técnica, tal como a análise de componentes principais (PCA) ou regressão parcial em mínimos quadrados (PLS). De preferência, é possível determinar um metaboloma essencialmente idêntico dos animais mamíferos da população de animais mamíferos conjuntamente em análise multivariada (por exemplo PCA) ou aglomeração hierárquica. 0 termo "compilação", tal como presentemente utilizado, refere-se à selecção dos animais mamíferos a partir de qualquer fonte para estabelecer a população de animais mamíferos a ser sujeita ao método da presente invenção. Assim, os animais mamíferos podem ser descendentes do mesmo animal mamífero mãe ou descendentes de animais mamíferos mães diferentes. No caso de utilização como fonte de uma descendência única de um animal mamífero mãe, tanto pode ser utilizada toda a descendência para compilação da população de animais mamíferos ou podem ser utilizados animais mamíferos seleccionados dessa descendência. Tal 12 como presentemente utilizado, a compilação é executada tendo em conta a idade dos animais, isto é todos os indivíduos da população terão essencialmente a mesma idade, como descrito seguidamente em pormenor. No entanto, podem ser consideradas outras características. Além disso, tal como peso, sexo, aspecto geral (por exemplo, podem ser seleccionados apenas animais de aspecto saudável). 0 termo "essencialmente a mesma idade" significa que os animais mamíferos estão num estado de desenvolvimento comparável, por exemplo, os animais mamíferos podem ser embriões, juvenis ou adultos. Uma idade preferida para utilização dos animais mamíferos no método da presente invenção é a idade da adolescência, de preferência fase adolescente inicial. Os animais mamíferos da população de animais mamíferos têm, preferivelmente, uma idade entre X ± n dias, em que X é a idade pretendida da população de animais mamíferos e n é seleccionado de um número inteiro de 1 a 5 dias, mais preferencialmente n é igual a 1 dia. Por outras palavras, um dado animal mamífero da população será, no máximo, um dia mais velho ou mais novo do que a idade média dos animais mamíferos da população de animais mamíferos. Mais preferivelmente, todos os animais mamíferos da população têm uma idade igual a X. Estes animais mamíferos podem ser apresentados por compilação de animais mamíferos que pertencem à mesma ninhada, ou que são compilados a partir de ninhadas diferentes nascidas no mesmo dia. No caso da utilização de embriões, subentende-se que essencialmente a mesma idade se refere às fases de desenvolvimento. As etapas de desenvolvimento dos embriões de várias espécies podem ser determinadas por técnicas bem conhecidas na técnica. Podem ser calculadas, isto é, baseadas no momento da fertilização. Além disso, embriões 13 individuais podem ser faseados em termos de desenvolvimento graças a caracteristicas morfológicas conhecidas. Além disso, no caso da utilização de embriões, subentende-se ainda que as mães grávidas dos embriões mencionados deverão ser mantidas nas condições mencionadas.

Se forem utilizados ratos ou ratinhos como animais mamíferos no método da presente invenção, prefere-se que os animais mamíferos tenham idade igual a X ± 1 dias, em que X é seleccionado de um número inteiro de 10 a 100 dias, mais preferencialmente, um número inteiro de 20 a 80 dias e mais preferivelmente X é 63, 64 ou 65 dias após o nascimento. Mais preferivelmente, X é igual a 64 dias após o nascimento. No caso da utilização de cães como animais mamíferos no método da presente invenção, X tem preferivelmente 6 meses de vida. 0 termo "tratamento" tal com é utilizado de acordo com o método da presente invenção refere-se às condições de abrigo, alimentação de sólidos e líquidos e ambientais que são aplicadas aos animais mamíferos da população de animais mamíferos. É preferido que os animais mamíferos sejam mantidos nas condições apresentadas em OECD Guideline For The Testing Of Chemicals N°.: 407. Além disso, as condições específicas são descritas seguidamente: i) Todos os animais mamíferos da população de animais mamíferos são mantidos à mesma temperatura constante. Convém ter cuidado na escolha de uma temperatura para a execução do método da presente invenção que não aflija os animais mamíferos. Preferivelmente, a temperatura deve oscilar entre 20 a 24 + 2o C, mais preferencialmente 22 ± 2o C, mais preferivelmente 22, 23 ou 24° C. 14 ii) Além disso, todos os animais mamíferos da população de animais mamíferos são mantidos à mesma humidade constante. A humidade deve situar-se a pelo menos 30 %, mas não deve exceder 70 %. No entanto, em situações excepcionais raras (tal como durante a limpeza da sala ou da gaiola) a humidade pode exceder os 70 %.

De preferência, a humidade situa-se entre 50 e 60 %. iii) Constatou-se que a separação física dos animais mamíferos da população de animais mamíferos é igualmente importante para o método da presente invenção. Assim, cada animal mamífero da população de animais mamíferos deve ser mantido num espaço separado, por exemplo uma gaiola separada. iv) Os animais mamíferos da população de animais mamíferos recebem alimento ad libitum. O alimento utilizado deve estar essencialmente isento de contaminantes químicos ou microbianos. As normas aplicadas estão definidas em Fed. Reg. Vol. 44, No. 91, Maio 09, 1979, p. 27354. Mais preferivelmente, os contaminantes microbianos, tais como bactérias, encontram-se abaixo de 5 x 105 células opr g de alimento. Este alimento pode ser adquirido junto da Provimi Kliba SA Kaiseraugst (Suíça) sob a forma de dieta de manutenção para ratinho/rato Kliba moída, alimento "GLP". v) Os animais mamíferos da população de animais mamíferos recebem líquido para beber ad libitum. De preferência o líquido mencionado é água. No entanto, podem igualmente ser empregues outros líquidos à base de água. Estes líquidos podem incluir, por exemplo, suplementos nutricionais, 15 vitaminas ou minerais que são necessários aos animais. Se for utilizada água como liquido para beber, a água deverá estar isenta de contaminantes químicos e microbianos, tal como definido na directiva europeia 98/83/CE relativa à qualidade da água para consumo humano. vi) Finalmente, cada animal mamífero da população de animais mamíferos deve ser sujeito aos mesmos períodos de iluminação constante. A iluminação constante é atingida, preferivelmente, por meio de iluminação artificial (espectro solar normal). 0 período de iluminação é de 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão. Depois recomeça o período de iluminação. Um período de iluminação preferido consiste, assim, em 12 horas de luz, entre as 6h00 e 18h00, e 12 horas de escuridão, entre as 18h00 e as 6h0 0 .

As condições anteriormente mencionadas de abrigo podem ser aplicadas aos animais mamíferos recorrendo a um espaço de armazém vulgar para as gaiolas com os animais mamíferos fisicamente separados. 0 espaço de armazém comum pode ser uma sala ou casa para animais mamíferos. Ao manter todos os animais mamíferos da população na mesma sala, pode-se manter facilmente humidade, temperatura e período de iluminação constantes mediante a regulação destes parâmetros para toda a sala ou casa. A regulação dos parâmetros é preferivelmente apoiada por meios automáticos e os parâmetros são constantemente vigiados.

Com o termo "período preliminar suficiente para aclimatação" subentende-se que os animais mamíferos da população de animais mamíferos devem ser mantidos nas condições de abrigo particulares mencionadas anteriormente 16 por um período de tempo que permita a sincronização das actividades metabólicas dos animais mamíferos, de forma que os animais mamíferos estejam aclimatados e tenham essencialmente o mesmo metaboloma. Especificamente, este período preliminar terá duração suficiente para permitir a todos os indivíduos da população adoptarem o mesmo ritmo circadiano, ritmo de digestão ou períodos de quiescência/movimento. Além disso, o período preliminar deverá permitir a cada animal mamífero adaptar os seus parâmetros bioquímicos e fisiológicos em resposta às condições ambientais aplicadas, tal como humidade e temperatura. Preferivelmente, este período preliminar tem uma duração de 5 a 10 dias, mais preferencialmente 6 a 8 e mais preferivelmente 7 dias.

Nos estudos subjacentes à presente invenção, constatou-se surpreendentemente que uma população de animais mamíferos com essencialmente o mesmo metaboloma pode ser fornecida pelo método da presente invenção. Os resultados superiores atingidos com o método mencionado dependem, no entanto, do respeito rigoroso das condições de abrigo anteriormente mencionadas e dos critérios de compilação da população de animais mamíferos, isto é compilação no que respeita à idade dos animais mamíferos da população de animais. Este último ponto é particularmente surpreendente porque, segundo a directiva da OECD n° 407, loc. cit., deve-se ter cuidado no que respeita ao peso ou sexo durante a compilação de animais mamíferos para fins analíticos. Vantajosamente, a utilização do método da presente invenção possibilita a geração de uma população de animais mamíferos que pode ser aplicada em metabolómica comparada. Graças ao metaboloma essencialmente idêntico é possível estudar de forma fidedigna e eficiente, por exemplo os efeitos tóxicos 17 de compostos ou determinar modos de acção de compostos tal como medicamentos ou candidatos a medicamentos. Além disso, o método da presente invenção pode ser facilmente implementado em unidades de animais mamíferos já existentes sendo, assim, economicamente viável. A presente invenção abrange também um método de identificação de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero, compreendendo: a) preparação de uma população de animais mamíferos recorrendo às etapas do método da reivindicação 1; b) administração à população de animais mamíferos mencionada de um composto suspeito de afectar o metaboloma de um animal mamífero e c) análise do metaboloma da população de animais mamíferos da etapa b); d) realização da necropsia de cada um dos animais mamíferos da população de animais mamíferos. 0 termo "identificação", tal como presentemente utilizado significa que o método da presente invenção deverá ser aplicado na identificação ou selecção de compostos que afectam o metaboloma de um animal mamífero. Assim, pretende-se que o método proporcione dados que permitam a identificação de um composto que afecte o metaboloma de um animal mamífero. Estes dados podem ser obtidos por meio de várias técnicas de análise do metaboloma de um animal mamífero descritas pormenorizadamente em seguida. Os dados podem encontrar-se sob a forma de dados em bruto ou dados 18 processados. Preferivelmente, o resultado da análise ao metaboloma sob a forma de dados em bruto ou processados será comparado com os dados correspondentes obtidos a partir de uma referência. Assim, subentende-se que a identificação utilizada de acordo com o método da presente invenção pode ainda exigir outras etapas. No entanto, estas etapas adicionais referem-se a técnicas bem conhecidas na análise comparativa, incluindo as mencionadas anteriormente e seguidamente. Além disso, a identificação tal como presentemente utilizado engloba a identificação da propriedade dos compostos para desencadear um efeito no metaboloma de um animal mamífero, em princípio, independentemente do tipo de efeito ou modo de acção. No entanto, o termo inclui ainda, preferivelmente, a identificação do tipo de efeito que é desencadeado ou mesmo o modo preciso de acção. Por conseguinte, o método da presente invenção pode ainda ser utilizado na identificação de uma via metabólica específica, influenciada por um composto ou um determinado modo de acção de um composto. Mais preferencialmente, o método de identificação descrito anteriormente e seguidamente pode ser utilizado para 0 termo "composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero" inclui todas as classes de compostos químicos. De preferência, um composto tal como presentemente utilizado é um composto de molécula pequena, um peptídeo, um polipeptídeo ou um polinucleótido. As moléculas pequenas, designadas de acordo com a presente invenção incluem moléculas inorgânicas e orgânicas com baixo peso molecular, de preferência um peso molecular que é inferior a 30.000 kDa, mais preferencialmente inferior a 20.000 Da, 10.000 Da, 8.000 Da, 5.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da ou 500 Da. Mais preferivelmente, o composto mencionado é suspeito 19 de ser um composto tóxico, um nutriente, um suplemento nutricional ou um composto terapeuticamente activo (isto é um medicamento). Um medicamento de acordo com a presente invenção terá um efeito terapêutico no animal mamífero, isto é, irá tratar ou aliviar um estado médico. 0 estado médico mencionado poderá ser uma doença ou transtorno ou diminuição do bem-estar de um animal mamífero. 0 alívio ou tratamento podem ser controlados pelo aparecimento ou grau dos sintomas da doença, transtorno ou deficiência mencionados. Os medicamentos de acordo com a presente invenção incluem também precursores de fármacos que são convertidos in vivo no medicamento terapeuticamente activo e compostos suspeitos de serem medicamentos, isto é candidatos a medicamentos. Os peptídeos ou polipeptídeos utilizados de acordo com o método da presente invenção incluem peptídeos e polipeptídeos naturais bem como peptídeos e polipeptídeos artificiais. Peptídeos e polipeptídeos naturais podem ser obtidos a partir de todos os tipos de organismos, incluindo plantas animais, fungos, bactérias e vírus. Peptídeos ou polipeptídeos artificiais podem ser gerados por técnicas de síntese de peptídeos aleatórias, por exemplo. Peptídeos ou polipeptídeos preferidos, utilizados de acordo com a presente invenção são aqueles que influenciam directa ou indirectamente actividades metabólicas ou vias metabólicas num animal mamífero de acordo com a presente invenção. Mais preferencialmente, os polipeptídeos ou peptídeos mencionados têm um valor terapêutico, tal como hormonas peptídicas, factores de crescimento, factores de sobrevivência, citoquinas, receptores dos polipeptídeos mencionados, anticorpos ou respectivos fragmentos biologicamente activos. Os polinucleótidos a utilizar de acordo com o método da presente invenção são moléculas de 20 ARN ou de ADN. De preferência, os polinucleótidos mencionados codificam peptideos ou polipeptideos que influenciam directa ou indirectamente actividades metabólicas ou vias metabólicas. Por exemplo, polinucleótidos adequados podem codificar enzimas, de preferência as das vias metabólicas, peptideos ou polipeptideos, tal como anteriormente especificado ou peptideos ou polipeptideos que regulam a expressão dos peptideos ou polipeptideos, tal como factores de transcrição. Além disso, os polinucleótidos utilizados no método da presente invenção como compostos podem ser polinucleótidos que interferem com a expressão genética (isto é transcrição ou tradução), tal como moléculas de ARN anti-sense, oligonucleótidos anti-sense ou ARN de interferência pequena (siRNA) utilizados na tecnologia de ARN de interferência (RNAi).

Os compostos referidos de acordo com a presente invenção são seleccionados quanto à sua capacidade para afectar o metaboloma de um animal mamífero. Deste modo, um composto no sentido da presente invenção irá alterar a composição do metaboloma de um animal mamífero quando administrado. Esse efeito no metaboloma de um animal mamífero poderá ser um efeito qualitativo ou quantitativo. Um efeito qualitativo no metaboloma tal como presentemente utilizado significa que pelo menos um metabolito do metaboloma do animal mamífero está ausente ou pelo menos um metabolito adicional está presente após a administração do composto. Um efeito quantitativo, tal como utilizado de acordo com a presente invenção significa que a quantidade de pelo menos um metabolito está alterada, isto é, é superior ou inferior após a administração do composto mencionado. Deve-se subentender que um composto que afecta o metaboloma de um 21 animal mamífero pode ainda influenciar a função biológica das células, tecidos ou os órgãos do animal mamífero e poderá provocar intoxicações, melhorias ou deficiências ao nível da saúde ou transtornos. 0 termo "administração" tal como presentemente utilizado, inclui todas as técnicas de aplicação sistémica de compostos ao animal mamífero. Além disso, o termo engloba técnicas de administração dos compostos no local de acção suspeito, tal como um tecido ou órgão potencialmente alvo, isto é administração tópica. Os compostos a administrar de acordo com a presente invenção podem estar incluídos numa composição que inclui ainda veículos adequados, tal como veículos farmacêuticos, excipientes e/ou diluentes. Exemplos de diluentes bem conhecidos incluem soluções salinas com tampão de fosfato, água, emulsões, tal como emulsões óleo/água, vários tipos de agentes humectantes, soluções estéreis, etc. A administração dos compostos das composições adequadas anteriormente mencionadas pode ser efectuada de várias formas, por exemplo por administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal ou intrabrônquica. De preferência, a administração é realizada por administração oral, mais preferivelmente o composto é misturado com líquido para beber ou alimento. 0 tratamento adequado e regimes de dosagem são bem conhecidos dos especialistas na técnica e encontra-se descrito um tratamento preferido e regime de dosagem nos exemplos. De preferência, os animais mamíferos da população de animais mamíferos de ensaio (isto é, a população de animais mamíferos a quem será administrado o composto) são subdivididos em pelo menos um grupo de machos e pelo menos um grupo de fêmeas e pelo 22 menos um grupo de dose elevada e pelo menos um grupo de dose baixa. 0 termo "análise do metaboloma", tal como utilizado de acordo com a presente invenção refere-se às técnicas de análise quantitativa ou qualitativa do metaboloma. Numa primeira etapa, a análise qualitativa ou quantitativa do metaboloma inclui a determinação qualitativa e qualitativa da composição do metaboloma, isto é dos metabolitos. Os meios e métodos de análise qualitativa do metaboloma incluem aqueles capazes de determinar a presença ou ausência dos metabolitos incluídos no metaboloma. Os meios e métodos de análise quantitativa do metaboloma são aqueles que determinam a quantidade dos metabolitos mencionados. Deve-se subentender que existem meios e métodos que podem determinar a presença ou ausência, bem como a quantidade dos metabolitos e permitir assim uma combinação de análises qualitativas e quantitativas. Além disso, de acordo com os métodos da presente invenção, não será obrigatoriamente necessário determinar a totalidade dos metabolitos do metaboloma. Em vez disso, a análise do metaboloma pode ser efectuada por meio da determinação da presença ou ausência ou da quantidade de uma porção dos metabolitos considerados característicos, um conjunto pré-determinado de metabolitos ou um perfil metabólico do metaboloma. Metabolitos característicos ou pré-determinados incluem metabolitos conhecidos, bem como os designados desconhecidos conhecidos. Estes últimos são metabolitos que são apenas conhecidos pelo seu sinal, por exemplo no espectro de massa. A natureza química dos desconhecidos conhecidos mencionados, contudo, não é conhecida com precisão. Um perfil metabólico, tal como presentemente utilizado, refere-se a todo o tipo de identificador único para um 23 23 luz determinado metaboloma, isto é, uma impressão digital de um metaboloma. A análise qualitativa ou quantitativa do metaboloma é preferivelmente executada recorrendo a técnicas de análise informática de compostos. Os dispositivos adequados para esta determinação de compostos são bem conhecidos na técnica. De preferência, é utilizada a espectrometria de massa, em particular cromatografia gasosa associada a espectrometria de massa (GC-MS), cromatografia liquida associada a espectrometria de massa (LC-MS), espectrometria de massa de infusão directa ou espectrometria de massa de ressonância ciclotrónica de iões com transformada de Fourier (FT-ICR-MS), espectrometria de massa com electroforése capilar (CE-MS), cromatografia liquida de elevado rendimento acoplada a espectrometria de massa (HPLC-MS), espectrometria de massa quadripolar, qualquer espectrometria acoplada sequencialmente, tal como MS-MS ou MS-MS-MS, espectrometria de massa com fonte de plasma acoplada indutivamente (ICP-MS), espectrometria de massa com pirólise (Py-MS), espectrometria de massa mobilidade iónica ou espectrometria de massa por tempo de voo (TOF). Mais preferencialmente, são utilizadas LC-MS e/ou GC-MS tal como se descreve pormenorizadamente em seguida. Estas técnicas são divulgadas, por exemplo em Nissen, Journal of Chromatography A, 703, 1995: 37-57, US 4,540,884 ou US 5,397,894. Alternativamente ou adicionalmente às técnicas de espectrometria de massa, podem ser empregues as seguintes técnicas para a determinação de compostos: ressonância magnética nuclear (RMN), imagiologia por ressonância magnética (IRM), análise nos infravermelhos por transformada de Fourier (FT-IR), espectroscopia nos ultra-violetas (UV), índice de refracção (IR), detecção fluorescente, detecção radioquímica, detecção electroquímica, dispersão da luz (LS) , 24 espectroscopia dispersiva de Raman ou detecção por ionização da chama (FID). Estas técnicas são bem conhecidas dos especialistas na técnica e podem ser aplicadas sem necessidade de mais explicações.

Numa etapa adicional, a análise do metaboloma, tal como presentemente utilizado, inclui de preferência uma comparação das quantidades de metabolitos ou o perfil metabólico com uma referência correspondente. Essa referência pode ser derivada de uma análise ao metaboloma de uma população de animais mamíferos, à qual não foram administrados compostos suspeitos de afectarem o metaboloma de um animal mamífero, preferindo-se que esta população de animais mamíferos de referência tenha sido tratada de uma forma idêntica em todos os outros aspectos. Referências adequadas adicionais para uma comparação de acordo com a presente invenção poderão ser derivadas de uma análise ao metaboloma de animais mamíferos aos quais se administraram compostos que se sabe afectarem o metaboloma. Estes compostos poderão ser compostos que são tóxicos ou que são terapeuticamente activos através de um modo de acção conhecido. Deste modo, utilizando animais mamíferos tratados com os compostos anteriormente mencionados, conhecidos por afectarem o metaboloma, como referência apenas se pode determinar se um composto novo afecta o metaboloma em geral. Pode-se sim determinar ainda se o novo composto mencionado desencadeia efeitos tóxicos ou pode ser terapeuticamente activo através de um certo modo de acção ou contém o potencial para o realizar. De preferência, os dados resultantes de uma análise ao metaboloma das referências descritas anteriormente, são guardados e apresentados sob a forma de uma base de dados adequada. Além disso, os dados de uma análise do metaboloma efectuada 25 segundo o método da presente invenção para compostos novos podem ainda servir de referência para outros compostos novos e podem ser guardados e apresentados igualmente pela base de dados mencionada para análise posterior. Tal como presentemente utilizado, a comparação engloba a comparação dos dados em bruto obtidos pela análise do metaboloma ou qualquer tipo de dados processados derivados dos dados em bruto mencionados. Os meios e métodos adequados de comparação de dados são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, análise de componentes principais (PCA) ou regressão parcial em mínimos quadrados (PLS). Em princípio, qualquer ensaio estatístico que permita determinar se metabolitos, porções destes ou um perfil metabólico, como anteriormente descrito, difere significativamente entre animais mamíferos diferentes ou pontos temporais de determinação é adequado para executar a comparação presentemente referida. Em princípio, as diferenças anteriormente mencionadas podem ser determinadas por algoritmos de identificação de padrões, algoritmos de ensaio estatístico e/ou algoritmos multivariados, por exemplo análise de componentes principais (PCA), análise de componentes simples (SCA), análise de componente independente (ICA), Regressão do componente principal (PCR), regressão parcial em mínimos quadrados (PLS), análise descriminante de PLS (PLS-DA), máquinas de suporte vectorial (SVM), redes neurais, redes bayesianas, redes de aprendizagem bayesianas, informação mútua, redes de retropropagação, redes simétricas Feed-Forward, mapas auto-organizados (SOMs), algoritmos genéticos, agregação hierárquica ou média K, Anova, teste T de Student, teste de Kruskal-Wallis, teste de Mann-Whitney, teste de Tukey-Kramer ou teste de Hsu. 0 processamento de dados mencionado anteriormente pode incluir preferencialmente uma etapa de 26 validação dos dados. Na etapa de validação dos dados mencionada, são excluídos os dados inconsistentes da análise futura. Os dados inconsistentes podem ser derivados de problemas técnicos durante a determinação qualitativa ou quantitativa da composição do metaboloma. Por conseguinte, pretende-se que os parâmetros técnicos dos dispositivos utilizados para a determinação sejam constantemente controlados e sejam preparados para validação de dados numa base de dados adequada. Pode-se conseguir validação adicional dos dados por meio de ferramentas de validação interna que avaliam estatisticamente cada valor medido ou parâmetro de um conjunto de dados. Por exemplo, se for empregue espectrometria de massa para a análise do metaboloma , é gerado um conjunto de dados em bruto, incluindo picos. Os picos mencionados surgem numa certa posição num espaço tridimensional, consistindo num intervalo do tempo de retenção, um intervalo de intensidade e um intervalo da proporção massa/carga (m/z). Cada um dos picos mencionados pode ser avaliado e confirmado por algoritmos de validação do pico, tal como ChemStation (Agilent Technologies, EUA), Analyst (MDS SCIEX, Canadá) ou AMDIS (NIST, EUA).

Além disso, os dados relacionados com o animal mamífero ou com o abrigo podem ser tidos em conta para a validação dos dados. Por exemplo, se as condições de abrigo variarem, o metaboloma de um animal mamífero da população de animais mamíferos pode ser negativamente influenciado. Um metaboloma negativamente influenciado de um animal mamífero pode, contudo, acusar resultados positivos ou negativos falsos. Por conseguinte, é preferido vigiar igualmente os dados relacionados com o animal mamífero ou com o abrigo 27 como descrito seguidamente em pormenor e ter em atenção estes dados durante a validação dos dados.

Além disso, o processamento dos dados inclui preferivelmente a normalização dos dados em bruto relativamente a referências internas. Por exemplo, picos que podem ser atribuídos a metabolitos conhecidos podem ser utilizados para normalizar picos de metabolitos desconhecidos inseridos num conjunto de dados obtidos para um metaboloma de um indivíduo da população de animais mamíferos relativamente a por exemplo intensidade de sinal.

Além disso, o processamento de dados pode ainda ter de criar dados coerentes convertendo os dados num formato numérico, convertendo os dados num formato unitário comum e/ou reduzindo dimensionalmente os dados. Os dados podem ainda ser integrados na medida em que a informação relacionada com a amostra ou com o animal mamífero é atribuída a estes. Meios e métodos adequados de criação destes dados coerentes são divulgados na WO 03/046798.

As etapas de processamento dos dados e a comparação designada anteriormente são preferivelmente assistidos automaticamente, por exemplo por um programa informático adequado a correr num computador. O computador está, preferivelmente, ligado de forma operacional às várias bases de dados indicadas de acordo com a presente invenção. Assim, numa realização, a presente invenção está também relacionada com uma base de dados ou sistema de bases de dados que inclui os resultados obtidos pelo método da presente invenção. Mais preferencialmente, uma base de dados ou sistema de bases de dados destas inclui informação relacionada com os metabolomas desencadeados por compostos 28 suspeitos de afectarem o metaboloma de um organismo, tal como compostos tóxicos ou terapeuticamente activos (isto é, medicamentos). Deste modo, a base de dados pode ser utilizada como ferramenta (base de dados de referência) para análises de selecção para identificação de novos medicamentos ou compostos tóxicos pelo seu modo de acção reflectido pelo metaboloma.

Subentende-se que a análise do metaboloma será efectuada passado um período de tempo suficiente para permitir que o composto penetre nas células efectoras, tecidos ou órgãos, isto é um período de incubação. Por outras palavras, a análise deve ser efectuada depois de o composto se tornar biodisponível. Dependendo da natureza química do composto, os especialistas na técnica saberão qual o intervalo de tempo suficiente para a biodisponibilidade do composto mencionado. Um intervalo de tempo assim pode ficar também definido numa experiência piloto. Por exemplo, um composto de natureza química semelhante ou idêntica pode estar ligado a um marcador detectável. Esse composto marcado pode então ser administrado a um animal mamífero. 0 tempo até o marcador se tornar detectável nas células efectoras, tecidos ou órgãos suspeitos será determinado e irá servir de período de incubação para o método da presente invenção. A análise do metaboloma inclui ainda de preferência a recolha de uma amostra de cada animal mamífero da população de animais mamíferos que será ainda analisada como anteriormente descrito. Amostras adequadas incluem células, tecidos ou órgãos do animal ou fluidos corporais, incluindo sangue, plasma, soro, urina, fluido espinal. É bem conhecida na técnica a forma como estas amostras podem ser colhidas. Técnicas adequadas incluem recolha de amostras de 29 sangue, biopsia, recolha de fluido, selecção de células, etc. Um programa preferido de recolha de amostras é descrito nos exemplos. A amostra pode ser sujeita a tratamentos preliminares. Estes tratamentos preliminares incluem digestão enzimática do material biológico que não é adequado para a análise do metaboloma, procedimentos de extracção para obter determinados metabolitos da amostra, fraccionamento da amostra, por exemplo para obter fracções polares e/ou não polares dos metabolitos ou derivatização dos metabolitos, por exemplo antes de cromatografia. Estas técnicas de tratamento preliminar são bem conhecidas na técnica e podem ser aplicadas pelos especialistas na técnica sem necessidade de mais explicações.

Vantajosamente, graças à apresentação da população de animais mamíferos de acordo com a presente invenção, pode ser realizada uma análise comparativa fidedigna do metaboloma. Os resultados da análise fidedigna mencionada, de acordo com o método da presente invenção, irão acelerar a descoberta de medicamentos e avaliações toxicológicas. Preferivelmente, são criadas base de dados que incluem dados metabólicos (isto é dados sobre a composição qualitativa e quantitativa de metabolomas ou perfis metabólicos) de um modo de acção de um composto ou dados metabólicos que reflectem a administração de compostos tóxicos ou medicamentos. Os dados metabólicos das bases de dados mencionadas podem ser utilizados como referências durante a utilização do método da presente invenção para uma selecção de outros compostos com suspeita de afectarem o metaboloma. Pretende-se que cada selecção produza uma perspectiva mais abrangente dos modos de acção. Além disso, por comparação com os dados metabólicos mencionados (dados de referência) é possível identificar rapidamente os 30 compostos tóxicos ou terapeuticamente activos. De preferência, o método da presente invenção é realizado no formato de elevado débito.

Numa realização preferida do método da presente invenção, a população de animais mamiferos é mantida por um segundo periodo de tempo após a administração à população de animais mamiferos dos compostos suspeitos de afectarem o metaboloma na etapa b), nas condições de abrigo descritas.

Mais preferencialmente, procede-se à análise da etapa c) pelo menos durante o segundo periodo de tempo ou pelo menos três vezes durante o segundo periodo de tempo, sendo a segunda análise, bem como qualquer outra análise adicional, efectuada após um periodo de tempo que é igual ao dobro do periodo de tempo decorrido desde a análise anterior. Mais preferivelmente, a primeira análise é efectuada sete dias depois da administração do composto na etapa b).

Constatou-se no estudo subjacente à presente invenção que é vantajoso avaliar o metaboloma ao longo de um intervalo de tempo desde efeitos agudos até efeitos a longo prazo, incluindo momentos intermédios. Deste modo, o método da presente invenção permite medições repetidas durante a investigação. Assim, a análise dos animais mamiferos é efectuada preferivelmente pelo menos uma vez, de preferência duas vezes e mais preferivelmente pelo menos três vezes durante o segundo periodo. Os momentos de análise devem ser seleccionados de modo a incluir os efeitos agudos iniciais, bem como os efeitos crónicos ou a longo-prazo. É possivel determinar momentos adequados para a análise por um especialista na técnica, dependendo do animal mamífero que é analisado sem precisão de mais 31 informações. Especificamente, se for utilizada uma população de animais mamíferos roedores, tal como uma população de ratos ou ratinhos, prefere-se uma progressão temporal da análise na qual a segunda análise e qualquer análise posterior seja efectuada passado um período igual ao dobro do período decorrido desde a análise anterior, isto é se a primeira análise for realizada 7 dias depois da administração do composto, a segunda análise deverá ser realizada 14 dias e a terceira análise deverá ser realizada 28 dias após a administração. De preferência, se a análise é realizada numa amostra de fluido corporal, tal como sangue, prefere-se que os animais mamíferos da população de animais mamíferos sejam mantidos em jejum (isto é sem alimento) por um período de 16 a 20 horas antes da recolha de sangue. Além disso, a realização da análise durante uma janela de tempo constante permite compensar as alterações metabólicas que podem ser provocadas, por exemplo, pelo ritmo circadiano dos animais mamíferos da população de animais mamíferos. Por conseguinte, prefere-se que a recolha de sangue e a análise sejam efectuadas num intervalo de tempo constante para todas as análises. De preferência, a análise, incluindo recolha de amostras, é efectuada entre as 7h30 e as 10h30 da manhã. Além disso, os métodos da presente invenção podem ainda incluir, para além da análise do metaboloma do sangue outras investigações do metaboloma de órgãos ou fluidos corporais diferentes dos animais mamíferos da população de animais mamíferos.

Além disso, para além das investigações do metaboloma, o método pode incluir outras investigações que não estão relacionadas com o metaboloma. Especificamente, pretende-se que cada animal mamífero da população de animais mamíferos seja sujeito a uma investigação patológica depois da 32 análise metabólica. Esta investigação inclui necropsia dos animais, incluindo exame cuidadoso da superfície externa do corpo, todos os orifícios, cavidades craniana, torácica e abdominal e respectivos conteúdos. Além disso, a análise patológica do fígado, dos rins, das supra-renais, testículos, canais epididimários, timo, baço, cérebro e coração será efectuada como apropriado e como descrito, por exemplo em directiva n° 407 loc cit. Além disso, será efectuado um exame histopatológico, de preferência como descrito seguidamente:

Os seguintes tecidos devem ser conservados no meio de fixação mais adequado para o tipo de tecido e exame histopatológico posterior pretendido. todas as lesões maiores, cérebro (regiões representativas incluindo encéfalo, cerebelo e protuberância), medula espinal, estômago, intestino grosso e delgado (incluindo as placas de Peyer), fígado, rins, supra-renais, baço, coração, timo, tiróide, traqueia e pulmões (conservados por insuflação com fixante seguida de imersão), gónadas, órgãos sexuais acessórios (por exemplo, útero, próstata), bexiga, nódulos linfáticos (de preferência um nódulo linfático que cubra a via de administração e outro distante da via de administração para cobri efeitos sistémicos), nervo periférico (ciático ou tibial) de preferência próximo do músculo e secção da medula óssea (ou, em alternativa, um aspirado de medula óssea acabada de montar). As descobertas clínicas e outras poderão sugerir a necessidade de exame dos tecidos adicinais. De igual modo, quaisquer órgãos considerados como possíveis órgãos alvo com base nas propriedades conhecidas do composto de ensaio devem ser conservados. 33

Além disso, prefere-se também que sejam determinados parâmetros hematológicos e bioquímicos dos animais mamíferos da população de animais mamíferos. Prefere-se que os dados relativos à patologia e hematologia, bem como os parâmetros bioquímicos sejam guardados numa base de dados adequada para cada um dos animais mamíferos da população de animais mamíferos como dados relativos ao animal mamífero. Os dados guardados são utilizados preferivelmente para a avaliação dos dados metabólicos gerados pela análise do metaboloma e/ou processamento de dados. Numa realização preferida do método da presente invenção, ter em conta estes dados de animal mamífero permite evitar resultados falsos positivos ou falsos negativos porque os animais mamíferos que, em comparação com os respectivos paralelos numa população de animais mamíferos, revelarem uma patologia, hematologia anómalas ou parâmetros bioquímicos anómalos podem ser excluídos da avaliação dos dados durante o processamento dos dados. Além disso, prefere-se ainda incluir dados relacionados com o mamífero sobre o peso corporal, consumo de alimento, consumo de líquidos e sinais clínicos, bem como eventuais anomalias que surgem quando os animais mamíferos são mantidos pelo primeiro e segundo períodos como anteriormente especificado.

Deste modo, noutra realização preferida do método da presente invenção, o método mencionado inclui ainda o controlo do peso corporal, consumo de alimento, consumo de líquido e sinais clínicos da população de animais mamíferos Mais preferencialmente este controlo pode ser assistido automaticamente e os dados controlados sobre o peso corporal, consumo de alimento, consumo de líquido e sinais clínicos são recolhidos numa base de dados para cada animal mamífero da população de animais mamíferos. 34

Além disso, à luz do exposto, o método da presente invenção compreende preferivelmente o controlo de anomalias por cada animal mamífero da população de animais mamíferos. 0 termo "anomalias" tal como presentemente utilizado, refere-se a anomalias que podem ser facilmente detectadas por funcionários de manutenção, isto é anomalias que normalmente não exigem um controlo por um médico. Mais preferencialmente, as anomalias são controladas automaticamente e os dados obtidos a partir deste controlo são guardados numa base de dados por cada indivíduo da população de animais mamíferos.

Tal como anteriormente referido, numa realização preferida do método da presente invenção, esta análise inclui a comparação do metaboloma da população de animais mamíferos com uma referência.

Mais preferencialmente, a comparação inclui a geração de um perfil metabólico do metaboloma dos animais mamíferos da população de animais mamíferos e comparação desse perfil com uma referência. Mais preferivelmente, uma diferença nos perfis metabólicos é indicativa de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero. Subentende-se que a referência nesta realização mais preferida é um perfil metabólico derivado de um animal mamífero sem tratamento. 0 termo "perfil metabólico" significa é estabelecida uma impressão digital específica durante a análise de cada metaboloma de um animal mamífero da população de animais mamíferos. Esse perfil metabólico pode ser derivado de pelo menos um sinal (por exemplo, um pico no espectro de massa) obtido de um animal mamífero ou respectiva amostra pelo 35 método da presente invenção. Mais preferencialmente, é derivado um perfil metabólico a partir de vários sinais desses. Os sinais podem ser obtidos a partir de um único metabolito ou de uma variedade de metabolitos. Subentende-se que os sinais básicos podem ainda ser processados por técnicas adequadas, tal como anteriormente descrito. Preferivelmente, é gerado um conjunto de dados tridimensionais utilizando pelo menos uma técnica de separação resolvida no tempo e pelo menos uma técnica de separação resolvida em massa. Um conjunto de dados destes pode ser obtido, por exemplo por cromatografia associada a espectrometria de massa, como anteriormente descrito. Estes conjuntos de dados tridimensionais podem ser analisados por algoritmos de determinação do pico convencionais, tal como ChemStation ou AMDIS, que permitem detecção específica de máximos e/ou mínimos no conjunto de dados tridimensional. Os máximos e mínimos extraídos deste modo constituirão o perfil metabólico específico do metaboloma de um animal mamífero específico de uma população de animais mamíferos. Além disso, os sinais extraídos, tal como os máximos e mínimos dos picos, podem ainda ser processados em valores caracterí sticos como uma função do tempo e massa respectivos. Subentende-se que os perfis metabólicos gerados pelas técnicas anteriormente mencionadas consistem, de preferência em conjuntos de dados que são reduzidos dimensionalmente e, deste modo, podem ser facilmente comparados entre si por análises estatísticas, incluindo análise de componentes principais (PCA) ou regressão parcial em mínimos quadrados (PLS). Uma diferença no perfil metabólico de um metaboloma de um animal mamífero de ensaio (isto é um animal mamífero que obteve um composto suspeito de afectar o metaboloma de um animal mamífero) e uma referência é um indicador de que o composto induz 36 efectivamente alterações metabólicas no animal mamífero de ensaio. No entanto, como foi já descrito, este facto não significa necessariamente que a composição quantitativa do metaboloma (isto é, o número de compostos que estão presentes) sofra alterações. Alterações nos perfis metabólicos podem ainda ser um indicador de uma composição quantitativa alterada do metaboloma (isto é, a porção dos compostos que estão presentes é alterada). Mais preferencialmente, os perfis metabólicos podem ser comparados com os perfis metabólicos compreendidos numa base de dados com referência aos perfis de medicamentos conhecidos, pró-medicamentos ou compostos tóxicos ou respectivos modos de acção. De modo vantajoso, o método da presente invenção permite, assim, tornar procedimentos de selecção para medicamentos e candidatos a medicamentos mais eficientes no tempo, uma vez que os efeitos tóxicos ou prejudiciais dos compostos podem ser determinados numa etapa precoce do desenvolvimento do medicamento. Além disso, podem ser facilmente realizados ensaios de toxicidade de um modo eficiente no tempo, uma vez que o aparecimento de eventos tóxicos pode ser controlado por alterações dos perfis metabólicos. Particularmente, este facto é vantajoso para compostos que provocam efeitos tóxicos a longo prazo em vez de efeitos imediatos.

Subentende-se que diferenças ou alterações no metaboloma de um animal mamífero podem também ser analisadas por comparação de metabolitos específicos de natureza química conhecida ou desconhecida, em oposição com um perfil metabólico.

Por conseguinte, noutra realização preferida do método da presente invenção, a comparação inclui a comparação de pelo 37 menos um metabolito do metaboloma da população de animais mamíferos com uma referência. Mais preferivelmente, uma diferença no pelo menos um metabolito mencionado é indicativa de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero. Subentende-se que a referência nesta realização mais preferida é um perfil metabólico derivado de um animal mamífero sem tratamento.

Noutra realização preferida do método da presente invenção e à luz do exposto, o composto mencionado é um composto suspeito de ser tóxico ou um composto suspeito de ser um medicamento. A presente invenção refere-se ainda a um método para a identificação de um marcador de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero, compreendendo as etapas do método da presente invenção tal como anteriormente descrito e a etapa adicional de fornecimento de um marcador do composto mencionado com base na análise do metaboloma. Numa realização preferida do método da presente invenção, este marcador é um perfil metabólico da população de animais mamíferos alterado em comparação com uma referência. Mais preferivelmente, o marcador mencionado indica toxicidade de um composto, um modo de acção de um composto ou uma actividade terapêutica de um composto.

Além disso, a presente invenção engloba um método de identificação de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero compreendendo a análise metabólica de uma amostra de pelo menos um animal mamífero de uma população de animais mamíferos na qual foi administrado um composto suspeito de afectar o metaboloma e em que a população de animais mamíferos mencionada foi mantida antes e depois da 38 administração do composto nas condições de abrigo mencionadas anteriormente. 0 termo "análise metabólica" tal como presentemente utilizado, engloba preferivelmente todos os meios, métodos e realizações descritas anteriormente para análise do metaboloma de um metaboloma de um animal mamífero. 0 termo "amostra", tal como presentemente utilizado, engloba amostras de material biológico, obtidas a partir do animal mamífero em investigação. Foram já anteriormente descritas fontes adequadas de amostras.

Numa realização preferida do método da presente invenção, esta análise inclui a comparação do metaboloma da amostra de um animal mamífero da população de animais mamíferos com uma referência.

Mais preferencialmente, a comparação inclui a geração de um perfil metabólico da amostra de um animal mamífero da população de animais mamíferos e comparação desse perfil com uma referência. Mais preferivelmente, uma diferença nos perfis metabólicos é indicativa de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero. Subentende-se que a referência nesta realização preferida é um perfil metabólico derivado de um animal mamífero sem tratamento.

Igualmente mais preferencialmente, a comparação inclui a comparação de pelo menos um metabolito do metaboloma da amostra de um animal mamífero da população de animais mamíferos com uma referência. Mais preferivelmente, uma diferença no pelo menos um metabolito mencionado é indicativa de um composto que afecta o metaboloma de um 39 animal mamífero. Subentende-se que a referência nesta realização mais preferida é um perfil metabólico derivado de um animal mamífero sem tratamento. A presente invenção refere-se ainda a um método para a identificação de um marcador de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero, compreendendo as etapas dos métodos anteriormente descritos (com base nas amostras) e a etapa adicional de fornecimento do marcador mencionado com base na análise do metaboloma.

Numa realização preferida do método da presente invenção, este marcador é um perfil metabólico ou pelo menos um metabolito do metaboloma da amostra de um animal mamífero da população de animais mamíferos alterada em comparação com uma referência. Mais preferivelmente, o marcador mencionado indica toxicidade de um composto, um modo de acção de um composto ou uma actividade terapêutica de um composto. A presente invenção é seguidamente ilustrada pelos exemplos seguintes. No entanto, os exemplos destinam-se apenas a servir de ilustração e não se pretende que constituam uma limitação do âmbito da invenção.

Exemplo 1: Tratamento dos animais

Ratos da estirpe CrlGlxBrlHan:Wi foram adquiridos junto da Charles River, Sulzfeld, Alemanha, com idades compreendidas entre 63 e 65 dias. Cada animal foi etiquetado consecutivamente com uma tatuagem na orelha. Os animais foram mantidos nas seguintes condições de abrigo: 40

Condições do ar: Temperatura 20 a 24° C, humidade 30 a 70 %. Foram documentados quaisquer desvios.

Período de iluminação: 12 horas de luz entre as 6h00 e as 18hoo, 12 horas de escuridão entre as 18h00 e as 6h00.

Tipo de gaiola: Gaiolas de arame, tipo DK III, BECKER &

Co., Castrop-Rauxel, Alemanha. N°. de animais por gaiola: 1

Tipo de dieta: Dieta de manutenção ratinho/rato Kliba moída "GLP", fornecido por Provimi Kliba SA, Kaiseraugst (Suíça), ad libitum Água: água para beber ad libitum.

Aclimatação: Durante o período de aclimatação de 7 dias, os animais foram acostumados às condições ambientais do estudo e à dieta.

Exemplo 2: Investigação metabólica de compostos de ensaio

Ratos Wistar machos e fêmeas foram aleatoriamente atribuídos aos grupos de dosagem antes do início do período de administração, com base nos respectivos pesos. Os animais foram tratados com cinco compostos de ensaio diferentes, com um nível de dosagem alto e baixo, de acordo com o seguinte calendário, apresentado no quadro 1. 41

Quadro 1:

Grupo de dosagem Substância de ensaio Nível de dosagem (ppm na dieta) N°. de animais por sexo Animal n°. machos fêmeas 00 0 0 10 1-10 61-70 01 A Dose baixa 5 11-15 71-75 02 A Dose elevada 5 16-20 76-80 03 B Dose baixa 5 21-25 81-85 04 B Dose elevada 5 26-30 86-90 05 C Dose baixa 5 31-35 91-95 06 C Dose elevada 5 36-40 96-100 07 D Dose baixa 5 41-45 101-105 08 D Dose elevada 5 46-50 106-110 09 E Dose baixa 5 51-55 11-115 10 E Dose elevada 5 56-60 116-120

Foi executada a colheita de sangue como indicado no calendário seguinte, apresentado no quadro 2.

Quadro 2:

Cata Fase de estudo/Exame Cata do estudo Cata de início da experiência: Chegada dos animais e inicio do período de aclimatação -6 Distribuição aleatória dos animais Inicio do período de administração 0 Colheita de sangue1’2’ 7 Colheita de sangue1’2’ 14 Colheita de sangue1’2’ e necropsia 28

Cata Fase de estudo/Exame Cata do estudo Preparação da amostra de sangue Avaliação das conclusões clínicas Resumo dos resultados clínicos 1)= período de jejum (retirada de alimento) antes da necropsia/exame do sangue de cerca de 16 a 20 horas. 2) = Entre 07:30 e 10:30 42

Durante a experiência procedeu-se a uma verificação de animais moribundos ou mortos duas vezes ao dia, entre segunda e sexta-feira e uma vez ao Sábado, Domingo e feriados. Os animais serão verificados diariamente para detectar sinais clínicos anómalos. As anomalias e modificações serão documentadas por cada animal. 0 consumo de alimento foi determinado aos dias 6, 13, 20 e 27 do estudo. O consumo de água de beber foi verificado diariamente, no âmbito das observações gerais. Foi determinado o peso corporal antes do início do período de administração, a fim de aleatorizar os animais. Durante o período de administração, o peso corporal foi determinado nos dias 0, 6, 13, 20 e 27 do estudo. A absorção média diária das substâncias de ensaio foi calculada com base nos valores individuais de peso corporal e consumo de alimento. Os desvios médios e padrão foram calculados com o teste de Dunnet. A colheita de sangue foi executada da seguinte forma: 16 a 20 horas antes da necropsia ou colheita de sangue retirou-se o alimento (período de jejum). A colheita de sangue foi realizada entre as 7H30 e 10h30 da manhã. Foi colhido sangue do plexo venoso retro orbital de animais anestesiados com isoflurano. Por cada animal colhe-se 1 ml de sangue em tubos de plástico com EDTA como anticoagulante (10 μΐ) de uma solução a 10%) . As amostras de sangue são centrifugadas. O plasma de cada amostra é separado e transferido para outro tubo de plástico. Os eritrócitos precipitados são lavados por três vezes com NaCl a 0,9% e preenchidos com água estéril destilada (Ampuwa®, Fresenius, Bad Homburg, Alemanha) até perfazer 1 ml a fim de hemolisar os glóbulos vermelhos. A hemoglobina é determinada nas 43 amostras de sangue hemolisadas (40 μΐ de hemolisado, mais 160 μΐ de NaCl 1,5%) com um analisador automático (ADVIA 120, Bayer AG, Fernwald, Alemanha). O sangue, plasma e hemolisado são colhidos e guardados em tubos Eppendorf originais. O transporte e preparação das amostras são efectuados com arrefecimento em gelo. No final da preparação da amostra, todas as amostras são sobrepostas com uma atmosfera de azoto puro, seladas com "Parafilm M" e guardadas a -80° C (sob atmosfera de azoto) até à continuação do processamento (por exemplo remessa).

Uma vez concluída a experiência, foi determinada a patologia clínica de cada animal. Com este fim, todos os animais sobreviventes do estudo foram sacrificados por decapitação sob anestesia com isoflurano (no caso de se pretender uma colheita final de sangue) ou com anestesia com CO2.

Lisboa, 30 de Abril de 2010

Claims (30)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de apresentação de uma população de animais mamíferos com um metaboloma essencialmente idêntico, compreendendo: a) Compilação de uma população de animais mamíferos essencialmente da mesma idade; b) Manutenção da população de animais mamíferos mencionada na etapa a) por um primeiro período de tempo suficiente para aclimatação nas seguintes condições de abrigo: i) temperatura constante; ii) humidade constante; iii) separação física dos animais mamíferos da população de animais mamíferos; iv) Alimentação ad libitum, estando o alimento a ser fornecido essencialmente isento de contaminantes químicos ou microbianos; v) bebida ad libitum, estando o líquido de beber essencialmente isento de contaminantes químicos ou microbianos e c) apresentação da população de animais mamíferos da etapa b) passado o primeiro período de tempo mencinado.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a população de animais mamíferos é uma população de roedores. 2

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o roedor é um rato ou ratinho.

4. Método da reivindicação 3, em que a idade mencionada se encontra dentro do intervalo de x ± 1 dia, em que x é a idade pretendida da população.

5. Método de identificação de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero, compreendendo: a) preparação de uma população de animais mamíferos recorrendo às etapas do método da reivindicação 1; b) administração à população de animais mamíferos mencionada de um composto suspeito de afectar o metaboloma de um animal mamífero; c) análise do metaboloma da população de animais mamíferos da etapa b) e d) realização da necropsia de cada um dos animais mamíferos da população de animais mamíferos.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a população de animais mamíferos é mantida por um segundo período de tempo após a administração à população de animais mamíferos dos compostos suspeitos de afectarem o metaboloma na etapa b) , nas condições de abrigo descritas.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a análise da etapa c) é efectuada pelo menos uma vez durante o segundo período de tempo.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a análise da etapa c) é efectuada pelo menos três vezes 3 durante o segundo período de tempo, sendo a segunda análise, bem como qualquer outra análise adicional, efectuada após um período de tempo que é igual ao dobro do período de tempo decorrido desde a análise anterior.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a primeira análise é efectuada sete dias depois da administração do composto na etapa b).

10. Método de qualquer uma das reivindicações 5 a 9, uqe inclui ainda o controlo do peso corporal, consumo de alimento, consumo de liquido e sinais clínicos da população de animais mamíferos

11. Método de qualquer uma das reivindicações 5 a 10, uqe inclui ainda o controlo de anomalias em cada animal mamífero da população de animais mamíferos.

12. Método de qualquer uma das reivindicações 5 a 11, em que a análise inclui a comparação do metaboloma da população de animais mamíferos com uma referência.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a comparação inclui a geração de um perfil metabólico do metaboloma de um animal mamífero da população de animais mamíferos e comparação desse perfil com uma referência.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que uma diferença nos perfis metabólicos é indicativa de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero. 4

15. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a comparação inclui a comparação de pelo menos um metabolito do metaboloma de um animal mamífero da população de animais mamíferos com uma referência.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que uma diferença no pelo menos um metabolito mencionado é indicativa de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 16, em que o composto mencionado é um composto suspeito de ser tóxico ou um composto suspeito de ser um medicamento.

18. Método para a identificação de um marcador de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero, compreendendo as etapas do método de qualquer uma das reivindicações 5 a 17 e a etapa adicional de fornecimento de um marcador do composto mencionado com base na análise do metaboloma.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que este marcador é um perfil metabólico ou é pelo menos um metabolito de um mamífero da população de animais mamíferos que está alterado em comparação com uma referência.

20. Método das reivindicação 18 ou 19, em que o marcador mencionado indica toxicidade de um composto, um modo de acção de um composto ou uma actividade terapêutica de um composto. 5

21. Método de identificação de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero compreendendo a análise metabólica de uma amostra de pelo menos um mamífero de uma população de animais mamíferos na qual foi administrado um composto suspeito de afectar o metaboloma de um mamífero e em que a população de animais mamíferos mencionada foi mantida antes e depois da administração do composto nas condições de abrigo descritas na reivindicação 1.

22. Método da reivindicação 21, em que a análise mencionada inclui a comparação do metaboloma da amostra de um mamífero da população de animais mamíferos mencionada com uma referência.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a comparação inclui a geração de um perfil metabólico a partir da amostra de um animal da população de animais mamíferos e comparação desse perfil com uma referência.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que uma diferença no perfil metabólico é indicativa de um composto que afecta o metaboloma de um mamífero.

25. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a comparação inclui a comparação de pelo menos um metabolito do metaboloma da amostra de uma população de animais mamíferos com uma referência.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que uma diferença no pelo menos um metabolito mencionado é 6 indicativa de um composto que afecta o metaboloma de um animal mamífero.

27. Método de qualquer uma das reivindicações 21 a 26, em que o composto é um composto tóxico ou um medicamento.

28. Método para a identificação de um marcador de um composto que afecta o metaboloma de um mamífero, compreendendo as etapas do método de qualquer uma das reivindicações 21 a 26 e a etapa adicional de fornecimento do marcador mencionado com base na análise do metaboloma.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que este marcador é um perfil metabólico ou é pelo menos um metabolito de um metaboloma da amostra de um mamífero da população de animais mamíferos que está alterado em comparação com uma referência.

30. Método das reivindicação 28 ou 29, em que o marcador mencionado indica toxicidade de um composto, um modo de acção de um composto ou uma actividade terapêutica de um composto. Lisboa, 30 de Abril de 2010