CN115777584A - 基于鱼群条件位置偏好对芬太尼类药物的成瘾性及神经毒性评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于鱼群条件位置偏好对芬太尼类药物的成瘾性及神经毒性评价的方法，包括采用斑马鱼成鱼在药物腹腔注射染毒后进行鱼群的条件位置偏爱实验、社交模型实验、探索模型实验、镜像模型实验、潜水模型实验以及T迷宫实验等斑马鱼行为学实验，获得斑马鱼鱼群表现出的条件位置偏好，鱼群中个体的焦虑、攻击、社交和记忆行为指标，通过以上特征的分析参数来评价药物的行为毒性强弱与影响表征；该方法还需利用行为学实验后的斑马鱼鱼脑进行神经递质水平检测，并与行为学实验结果相联系，确定芬太尼类药物对于神经传导的影响机制，能有效提高评价此类药物的成瘾风险与神经毒性的准确性。

Description

基于鱼群条件位置偏好对芬太尼类药物的成瘾性及神经毒性 评价方法

技术领域

本发明涉及药物行为毒性评价技术领域，尤其涉及一种药物对斑马鱼成鱼成瘾性及神经毒性影响的评价方法。

背景技术

芬太尼类物质具有致成瘾性作用，其具有的强亲脂性可以帮助其快速透过血脑屏障进入大脑并短时间内在血液中形成药物高峰，极易造成人体的耐受和药物依赖。同时芬太尼也具有非常高的危险性。

斑马鱼是行为研究的有效脊椎动物模型，可以通过自我给药和条件位置偏好来评估新的精神活性物质的奖励作用。在斑马鱼模型上，条件位置偏好试验已被用来评估药物的奖励作用，如吗啡、甲基苯丙胺、乙醇和尼古丁。这些利用斑马鱼探索药物奖赏效应的研究通常采用单个实验对象的条件位置偏爱实验，这是因为单条鱼的行为数据容易实现追踪和量化分析，但是实验中个体差异大，实验结果不稳定。在这些试验中，鱼表现出不稳定的地点偏好或异常的行为能力都可能导致实验失败，增加了实验成本。

发明内容

随着模式动物行为跟踪设备和图像跟踪算法的进步，现在可以量化斑马鱼的群体行为，分析斑马鱼鱼群在指定区域的偏好(一定时间内的平均数量)和群体行为特征(鱼与其最相邻鱼的间距，鱼到其他所有鱼的间距，所有鱼平均向量的大小等)。单个斑马鱼会被鱼群中同类更强烈的偏好所强迫到特定的位置，从而降低了个体行为异常造成的不稳定性。据我们所知，目前还没有在CPP试验中使用斑马鱼的群体行为来研究药物奖励效应。

基于鱼群条件位置偏好对芬太尼类药物的成瘾性评价比传统的基于个体的实验相比效率更高、结果更准确、实验的不稳定性大大降低。通过多种行为学模型进一步研究芬太尼染毒后对斑马鱼个体的焦虑、攻击、社交和记忆行为的影响，再结合斑马鱼脑内神经递质的改变，可以探明此类精神活性物质在药物奖赏效应方面的影响，并为该类药物成瘾造成的神经毒性评价提供基础。

本发明提供了一种基于鱼群条件位置偏好对芬太尼类药物的成瘾性和神经毒性评价方法，通过群体行为对药物奖赏效应进行研究，是对传统基于个体的条件位置偏爱实验的优化，可以对芬太尼类药物的成瘾性和神经毒性进行更方便的评价。

一种基于鱼群条件位置偏好对芬太尼类药物的成瘾性及神经毒性评价方法，包括如下步骤：

(1)斑马鱼成鱼分离单独饲养，然后以腹腔注射的方法进行芬太尼类药物的药物暴露，注射后将整个鱼群隔离至伴药箱中，次日注射生理盐水并隔离至空白箱，重复上述操作两个循环；

(2)通过优化的基于鱼群的条件位置偏好实验对芬太尼类药物的奖赏效应进行评价，通过优化的基于个体行为特征的社交模型实验、探索模型实验、镜像模型实验、潜水模型实验和T迷宫实验分别对芬太尼的神经毒性进行评价。

(3)根据神经递质含量的变化研究芬太尼的神经毒性机制。

上述评价方法通过对神经系统已发育完全的成年斑马鱼进行行为实验，能更为客观地表现出芬太尼类药物对于斑马鱼的生物行为影响，提高了该类药物毒性评价的准确性。

所述芬太尼类药物可以为化学结构与芬太尼(N-[1-(2-苯乙基)-4- 哌啶基]-N-苯基丙酰胺)相比，符合以下一个或多个条件的物质：一、使用其他酰基替代丙酰基；二、使用任何取代或未取代的单环芳香基团替代与氮原子直接相连的苯基；三、哌啶环上存在烷基、烯基、烷氧基、酯基、醚基、羟基、卤素、卤代烷基、氨基及硝基等取代基；四、使用其他任意基团(氢原子除外)替代苯乙基。

所述斑马鱼为野生AB品系斑马鱼。斑马鱼饲养遵从其适合的生长环境参数，不做严格要求，应保证健康、发育良好。

斑马鱼成鱼在实验前装入独立的鱼缸并从系统中分离，转移至温度适宜、环境安静的房间并单独饲养。每日上午8时打开室内灯光并使用斑马鱼养殖系统用水将缸内的水体更换，夜晚10时关闭灯光。隔离养殖2日后停止喂食。每日实验后独立鱼缸中的水均需完全更换。

所述药物暴露方式为腹腔注射。药物浓度的设置不做严格设置，可以采用本领域常规的浓度梯度设置或受芬太尼影响的环境中的浓度，其中进样量为每次5uL。

在药物暴露前应进行条件位置偏爱实验的基线测定，观察时长为20 min，取样区段为1min/次。偏爱训练中斑马鱼成鱼在芬太尼类药物暴露后在中伴药箱隔离时间为40min，空白暴露后在空白箱的隔离时间也为 40min。

社交模型实验、探索模型实验、镜像模型实验、潜水模型实验均在条件位置偏好实验后进行，观测总时长均为5min。

进行上述实验时，应保持安静的环境以及相同的光照强度。可选地，光照强度应保持在斑马鱼成鱼日常饲养时的光照强度。特殊地，在进行潜水测试时应保持较低的光照强度，应为饲养光照强度的六分之一。

斑马鱼成鱼条件位置偏爱的指标包括，averagecount(单位时间内鱼群在伴药箱与空白箱中的平均计数)、nnd(鱼i与其最相邻鱼的间距，平均值)、iid(鱼i到其他所有鱼的间距，平均值)、polarization(所有鱼平均向量的大小)、平均速度；

所述社交模型实验、探索模型实验、镜像模型实验、潜水模型实验的指标包括区域持续时间、移动距离、趋触性、行为次数等；

所述T迷宫实验的指标包括持续时间、移动距离、首次进入时间等。

所述神经递质分析对象为谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、多巴胺、血清素。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

基于鱼群条件位置偏好对芬太尼类药物的成瘾性评价比传统的基于个体的实验相比效率更高、结果更准确、实验的不稳定性大大降低。同时多种行为测试模型能够全面揭示芬太尼成瘾后的社会性、焦虑性、攻击性和记忆性变化，并结合斑马鱼成鱼的脑内神经递质含量进行了毒性机制研究，提高了该类药物毒性评价的准确性。

附图说明

图1为CPP实验缸图；图2为社交测试缸；

图3为新奇物体探索缸；

图4为镜像缸；

图5为潜水测试缸；

图6为T迷宫；

图7为条件位置偏爱实验中鱼群的停留参数与活动参数；

图8为社交实验中斑马鱼成鱼个体在平均移动距离，两区时间，穿梭次数和进入社会区的潜伏时间差异；

图9为新奇物体探索模型中斑马鱼成鱼个体在平均移动距离，两区时间，穿梭次数和进入新物体区的潜伏时间差异；

图10为镜像模型中斑马鱼成鱼个体在平均移动距离，镜像区时间，穿梭次数和镜像区快速运动时间差异；

图11为潜水模型中斑马鱼成鱼个体在平均移动距离，顶部区时间，穿梭次数和进入顶部区的潜伏时间差异；

图12为T迷宫实验中斑马鱼成鱼个体在两区的持续时间与移动距离，个体首次到达食物记忆区(红区)的时间差异；

图13为斑马鱼成鱼脑内谷氨酰胺、氨基丁酸、盐酸多巴胺，氢化可的松、血清素的含量；

具体实施方式

为更清楚地说明条件位置偏爱实验、社交模型实验、探索模型实验、镜像模型实验、潜水模型实验、T迷宫实验，下面将结合附图和具体实施例进行更详细的说明。

图1～图6为本发明所用到的实验装置。图1为条件位置偏爱实验缸，具体为一容积9L(30cm×20cm×15cm，长×宽×高)的透明亚克力水缸。该缸均分为空白区与点阵区(伴药箱)两区，空白区无内容，点阵区底部贴有直径2cm的黑色圆点四个，两区之间有一可拆卸透明隔板。

图2为社交测试缸，该社交测试缸为一容积为3L(30cm×10cm×10 cm，长×宽×高)的透明亚克力水缸。该缸在长边三分之一处有一可拆卸隔板，被隔离的10cm×10cm×10cm的区域为社交集群区，另一部分为测试区。

图3为新奇物体探索缸，具体为一容积2L(20cm×10cm×10cm，长×宽×高)的透明亚克力水缸，该缸中设置有一直径6cm的不透明圆柱体，该物体距离各缸壁均有大于1cm的空隙。

图4为镜像缸，该镜像缸为一容积2L(20cm×10cm×10cm，长×宽×高)的透明亚克力水缸，一面缸壁上贴有镜面。距离镜面5cm距离的范围为攻击区。

图6为潜水测试缸，具体为一容积2L的不规则透明水缸，截面为一梯形，高20cm。

图7为T迷宫，具体为一容积9L的T字型鱼缸。T字较短的两端中，一端贴有红色不透明塑料膜，另一端贴有绿色不透明塑料膜，较长的一段无任何处理。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施，对本发明进一步详细说明。本实施例为芬太尼对斑马鱼社会行为与成瘾的影响评价方法。

斑马鱼养殖

采用WT-AB品系斑马鱼种鱼，种鱼饲养在28.5℃恒温、每日14h光照10h黑暗的光周期循环系统中(上海海圣水族设备公司)，水体的pH值维持在7.0-8.0、盐度保持在0.25‰-0.50‰、电导率维持在500-800μS/cm、总氨氮低于0.02mg/L，每日喂食2次经孵化清洗后的丰年虫。

实验对象的准备

选取体型匀称健康的适龄斑马鱼成鱼共64尾，性别均匀。将选取好的成鱼随机均分为四组，编号为0mg/L组(控制组)、10mg/L组、100mg/L 组、1000mg/L组，每组各16尾，0mg/L组为控制组，另外三组为实验组。将各组装入独立的鱼缸并从系统中分离，转移至温度适宜、环境安静的房间并单独饲养。每日上午8时打开室内灯光并使用斑马鱼养殖系统用水将缸内的水体更换，夜晚10时关闭灯光。隔离养殖2日后停止喂食。

视频数据的采集与分析

基线与偏爱测定采用Viewpoint斑马鱼行为跟踪软件的Multicount模式实时采集实验对象在分析区中的平均计数，视频采样频率为5次/s，计数频率为1min/次。社交模型、探索模型、镜像模型、潜水模型、T迷宫实验记录产生的视频使用Noldus公司的EthoVisionXT 14分析软件，对象跟踪方法为动态剪影法，视频采样频率为5次/s。

数据统计与分析

本方法所涉及的所有结果均表示为平均值±SEM(平均值的标准误差)。所有数据均采用GraphPad prism 8软件进行双向方差分析(two-way ANOVA)后多重比较或单向方差分析(one-way ANOVA)以及t检验。显著性阶段设置为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

行为学实验

实施例1鱼群条件位置偏爱实验(CPP)：

基线测定：使用纯净水将CPP缸清洗多次后，使用斑马鱼养殖系统的系统循环水清洗一次。将系统水加入CPP缸内，水位在6-8cm左右。将单个组内所有的斑马鱼放入CPP缸内，并将鱼缸放入成鱼观察箱内。开始记录实验对象在缸内的活动情况，观察箱内的光照参数为顶端发光，光强度为固定值，观察时长为20min，取样区段为1min/次。观察结束后将 CPP缸内的鱼捞回饲养缸内，更换组别后关好箱门继续观测后续组别。

偏爱训练：以两天的实验为一周期，重复2个周期。DAY1药物注射与训练：将CPP缸放于观察箱内，光照强度等环境设置与基线测定相同，使用透明隔板将空白箱与伴药箱分离，使斑马鱼无法穿越两个区域。使用微量注射针抽取目标溶液5μL后，自鱼腹鳍周边将针头插入鱼腹腔内约3 mm，轻推注射器把溶液注入成鱼体内。再将注射完毕的成鱼放入伴药箱内，关闭观察箱门训练40min。控制组注射鱼用生理盐水，实验组注射的药物均为芬太尼盐酸盐的鱼用生理盐水稀释液，浓度梯度为10mg/L、100 mg/L、1000mg/L。DAY2空白注射与逆向训练：重复基线测定的CPP缸清洗操作后放置鱼缸，CPP缸的放置与观察箱环境设置保持不变，控制组与实验组均注射5μL的鱼用生理盐水后放入空白箱关闭观察箱门训练40min。

偏好观测：重复基线测定的操作与参数设置，对偏爱训练结束后的各组成鱼进行观测记录并与基线测定中的表现进行比较，得到的结果见图7。

随着芬太尼浓度的增加，药物配对区(黑点)的斑马鱼数量百分比呈增加趋势(图7B)。100mg/L和1000mg/L浓度组斑马鱼在药物配对侧的平均数量百分比较高，与对照组差异显著(p<0.001和p<0.05)。与对照组相比，10mg/L芬太尼浓度对斑马鱼的位置偏好没有显著提高(p>0.05)。与对照组相比，1000mg/L芬太尼处理的斑马鱼的最近邻距离(NND)显著增加 (p<0.05)。此外，与对照组相比，注射100mg/L和1000mg/L芬太尼后斑马鱼的个体间距离(IID)显著增加(p<0.01和p<0.0001)。与对照组相比，没有观察到芬太尼处理对斑马鱼平均速度的显著改变(图7D)。这些结果表明，芬太尼在100mg/L和1000mg/L由于芬太尼的影响产生了对伴药区的显著偏好且游动能力没有降低，存在明显的药物奖赏效应，同时鱼群整体的凝聚力下降，体现出芬太尼对群体行为产生影响。

实施例3社交模型

向社交测试缸的社交隔离区内加入非实验用的成年健康斑马鱼4尾作为实验斑马鱼的社交对象，再将每尾斑马鱼(每种浓度选取16条斑马鱼) 放置于测试区中。在观察箱中测试5min并记录其活动情况，光强度为100 勒克斯。记录每条被测试的斑马鱼的行为数据。前两分钟的数据用于适应分析，后三分钟的数据用于行为分析，包括斑马鱼在水箱中移动的总距离、在社交区域停留的时间、进入社交区域的潜伏期和进入社交区域的次数，得到的结果见图8。

我们通过观察芬太尼对它们社会偏好的变化来检验芬太尼的神经毒性。与对照相比，芬太尼处理的斑马鱼的游动距离没有显著差异(图8B)(所有浓度p>0.05)。100mg/L和1000mg/L浓度组的斑马鱼在社交区移动的时间明显少于对照斑马鱼(图8C)(两个浓度均p<0.05)，但向社交区域的穿梭次数无显著差异(图8D)(所有浓度p>0.05)。此外，芬太尼处理后斑马鱼进入社会区域的潜伏期随浓度的增加呈增加趋势，但差异不显著(图8E) (所有浓度p>0.05)。结果表明，100mg/L和1000mg/L芬太尼降低了斑马鱼个体的社会偏好。

实施例4探索模型

将各组斑马鱼成鱼逐尾放入至新奇物体探索缸中，在Viewpoint观察箱测试5min并记录各组内个体对于新奇物体的探索情况(每种浓度选取 16条斑马鱼)。光强度为30勒克斯，前2分钟用于适应，后3分钟用于行为数据分析，包括斑马鱼在水箱中移动的总距离、在新物体区域停留的时间、进入新物体区域的延迟时间和进入新物体区域的次数。得到的结果见图9。

通过设置环境友好型绿色新物体，评估芬太尼对斑马鱼认知新物体能力的影响。在测试的5min内，芬太尼处理的斑马鱼的行为能力随着芬太尼浓度的增加有下降的趋势，但与对照组相比差异不显著(图9B)(所有浓度p>0.05)。经高剂量芬太尼1000mg/L处理的斑马鱼在新目标区域的移动时间显著减少(图9C)(p<0.05)，并显示进入新对象区域的穿梭次数显著减少(图9D)(p<0.05)，表明芬太尼导致探究行为偏好的降低。随着芬太尼浓度的增加，进入新目标区域的潜伏期有增加的趋势，但与对照鱼相比差异不显著(图9E)(所有浓度p>0.05)。结果表明，1000mg/L芬太尼在未显著影响斑马鱼活动能力的情况下，降低了斑马鱼个体对新物体的偏好。

实施例5镜像模型

每种浓度选取16条斑马鱼，放入镜像缸中，分析斑马鱼的移动总距离、在镜像区域停留的时间、进入镜像区域的潜伏期以及在镜像区域快速游动的持续时间(速度大于平均速度的60％定义为快速移动)，时间为5 min。

在我们的研究中，与对照组相比，芬太尼处理的斑马鱼的行为能力没有显著差异或趋势(图10B)(所有浓度p>0.05)。在攻击性评价中，芬太尼组的斑马鱼在镜像区域的停留时间均多于对照组斑马鱼，但差异不显著 (图10C)(所有浓度p>0.5)。芬太尼没有导致斑马鱼向镜像区域穿梭次数的显著变化(图10D)(所有浓度p>0.05)。然而，与对照相比，100mg/L和1000mg/L芬太尼处理的斑马鱼在镜像区快速游泳时间的持续时间显著增加(图10E)(p<0.01和p<0.05)。结果表明，100mg/L和1000mg/L芬太尼在未显著影响斑马鱼活动能力的情况下，增加斑马鱼个体对镜面的攻击性。

实施例6潜水模型

将各组斑马鱼成鱼逐尾放入潜水测试缸内，关闭成鱼观察房的所有灯光，保持光照强度为iew30勒克斯。使用动物行为观测装置中的水平观测摄像头记录3min内斑马鱼在缸内的活动。水箱被分成两个高度相等的区域，顶部和底部。分析了斑马鱼在水箱中移动的总距离、在顶部区域停留的时间、进入顶部区域的延迟以及进入顶部区域的次数。得到的结果见图 11。

斑马鱼的潜水测试被证明是一种有效的评估焦虑的方法。斑马鱼顶部区域偏好的增加与焦虑的减少有关。我们评估了每一种浓度下，斑马鱼个体在顶部和底部区域游动的距离，发现在0、10、100和1000浓度组的斑马鱼基本上倾向于底部区域，表现出类似焦虑的行为(图11A)。各芬太尼处理组斑马鱼的行为能力与对照组相比没有显著差异(图11B)(所有浓度 p>0.05)，但1000mg/L芬太尼组斑马鱼花在顶部区域的时间显著增加(图 11C)(p<0.01)，降低了进入顶部区域的潜伏时间(图11D)(p<0.01)。所有芬太尼处理组都表现出明显增加的向顶部区域的穿梭次数(图11E)(p<0.05, p<0.0.01和p<0.05)。结果表明，1000mg/L芬太尼在未显著影响斑马鱼活动能力的情况下，降低了斑马鱼个体的焦虑水平。

实施例7 T迷宫实验

(1)食物位置记忆训练：将缓释鱼粮贴片贴在T迷宫的红色区域内，加入养殖系统用水至水位为2cm。等待鱼粮开始释放后，将各组斑马鱼成鱼集群放入T迷宫的空白区域内。待斑马鱼探索T迷宫至5min后，将其驱赶至红色区域内并用透明隔板隔离20min使其取食。各组重复该操作两次。保持环境光强度30勒克斯。(2)记忆能力测试：训练结束后次日，将 T迷宫放置于Viewpoint观察箱后，设置光照强度为30个单位，将各组斑马鱼成鱼逐尾放入T迷宫的空白区。测试5min内斑马鱼在红臂、绿臂和白臂的游泳时间和距离，以及它们在红臂的首次到达时间，得到的结果见图12。

我们利用颜色偏好的变化来评估食物诱导的空间记忆能力。在我们的研究中，与红臂相比，对照斑马鱼在训练结束时，在移动的距离和花费的时间(没有表现出对绿臂的显著偏好，这表明由于食物诱导，原来的绿色偏好发生了变化(图12A-12C)。然而，经10mg/L、100mg/L和1000mg/L 芬太尼处理的斑马鱼在绿色区域的移动距离明显大于红色区域(图12B)(p <0.05,p<0.01和p<0.05)。此外，芬太尼处理100mg/L和1000mg/L的斑马鱼在绿色区域的时间明显多于红色区域(图12C)(p<0.05,p<0.01)。重要的是，芬太尼组第一次进入红臂的时间比对照组要长得多(图12D)(所有浓度p<0.05)。这些结果表明，条件食物刺激改变了对照组斑马鱼的颜色偏好，而芬太尼组没有改变，提示芬太尼可能损害斑马鱼的学习和记忆。

实施例8芬太尼药物作用后相关神经递质变化的检测

(1)神经递质的提取

将前期行为学实验后的各组斑马鱼使用-80℃冷冻处死，使用镊子与剪刀将斑马鱼脑组织取出并称重，称重结束后放入容量为2mL的离心管中。按照组别将装有脑组织的离心管编号，同时准备两组15mL离心管按照对应的编号进行标记。向分离出的脑组织中加入适量1.89％甲酸水，脑组织与甲酸水的比例为10mg/g。之后向各离心管中加入一颗研磨珠，再使用4℃预冷的冷冻研磨机中研磨700s。完成研磨后将样本放入高速离心机离心40min，转速为14000，温度恒定于4℃。使样本中的杂质充分沉淀。离心结束后使用移液枪将上清液吸取至第一组15mL离心管中，按照 V甲酸乙腈：V上清液＝4:1的比例加入1％甲酸乙腈并摇匀，使样本中的蛋白质充分沉降。再将所有样本二次离心40min，转速为5000rpm，温度为4℃。上述操作过程中，已取出的脑组织、未解剖的斑马鱼、相关溶液、待测样本等均保存在冰水混合物中。

(2)LC-MS法测定神经递质含量

目标化合物为谷氨酰胺、氨基丁酸、盐酸多巴胺、血清素、氢化可的松。将二次离心后的上清液浓缩至2mL，进样。

色谱条件：液相色谱柱的参数为ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm× 100mm×1.8μm)；柱温40℃；流动相A为0.1％甲酸水溶液，B相为甲醇，流速0.25mL/min，程序设定为梯度系统(表2-1)。

质谱条件：电喷雾源ESI(正离子模式)；雾化气：氮气，流量3L/min；干燥气：氮气，流量10L/min；碰撞气：氩气，DL温度250℃；接口温度 300℃，加热块温度400℃；扫描模式：多反应检测模式(MRM)。根据以上条件优化质谱参数，神经递质线性范围如表2-2。

表2-1液相色谱柱梯度系统

表2-2各神经递质的线性范围

得到的结果见图13。

行为学测试后，采用LC-MS/MS法测定斑马鱼脑内Glu、GABA、DA、 5-HT和Cortisol水平。从结果中我们发现，与对照组相比，1000mg/L组斑马鱼大脑中Glu、GABA、DA和5-HT水平显著升高(图13A-13D)。与对照组相比，芬太尼组斑马鱼大脑中皮质醇的平均水平有所降低，但差异不显著(图13E)。高浓度芬太尼对神经递质的破坏与行为改变发生的浓度结果一致。

Claims (6)

1.一种基于鱼群条件位置偏好的芬太尼类药物成瘾性及神经毒性评价方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)斑马鱼成鱼分离单独饲养，然后以腹腔注射的方法进行芬太尼类药物的药物暴露，注射后将整个鱼群隔离至伴药箱中，次日注射生理盐水并隔离至空白箱，重复上述操作两个循环；

(2)通过优化的基于鱼群的条件位置偏好实验对芬太尼类药物的奖赏效应进行评价，通过优化的基于个体行为特征的社交模型实验、探索模型实验、镜像模型实验、潜水模型实验和T迷宫实验分别对芬太尼的神经毒性进行评价；

(3)根据神经递质含量的变化研究芬太尼的神经毒性机制。

2.根据权利要求1所述的成瘾性及神经毒性风险评价方法，其特征在于，步骤(1)中，所述斑马鱼成鱼为5-6月龄的野生AB品系斑马鱼，体长为3cm±0.5cm，体重为0.25g±0.1g。

3.根据权利要求1所述的成瘾性及神经毒性评价方法，其特征在于，步骤(1)中，在进行试验前，将斑马鱼鱼群移出系统独立饲养，饲养环境为28.5℃恒温、每日14h光照10h黑暗，水体的pH值维持在7.0-8.0、盐度保持在0.25‰-0.50‰、电导率维持在500-800μS/cm、总氨氮低于0.02mg/L；每日试验结束后均将养殖缸内的水更新。

4.根据权利要求1所述的成瘾性及神经毒性评价方法，其特征在于，步骤(2)中，所述斑马鱼成鱼鱼群的条件位置偏爱的指标包括，单位时间内由16条斑马鱼组成的鱼群在伴药箱与空白箱中的平均计数、鱼i与其最相邻鱼的间距的平均值、鱼i到其他所有鱼的间距的平均值、所有鱼平均向量的大小或平均速度；

所述社交模型实验、探索模型实验、镜像模型实验、潜水模型实验的指标包括区域持续时间、移动距离、趋触性或行为次数；

所述T迷宫实验的指标包括持续时间、移动距离或首次进入时间。

所述神经递质分析对象为谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、多巴胺或血清素。

5.根据权利要求1所述的成瘾性及神经毒性评价方法，其特征在于，所述斑马鱼成鱼行为学参数差异通过如下方法确定：

所有的参数都以平均值±SEM(平均值的标准误差)或中位数±四分位数表示；

符合正态分布的数据均采用双因素方差分析后进行多重比较，或采用单因素方差分析后进行土耳其事后检验，不符合正态分布的数据采用非参数检验；

显著性水平设为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，****p<0.0001。

6.根据权利要求1所述的成瘾性及神经毒性评价方法，其特征在于，斑马鱼成鱼脑内神经递质的检测采用高效液相色谱与质谱联用的方法，组织样品经过甲酸水、甲酸乙腈处理分离，并通过浓缩和重溶至蛋白沉淀前的体积。

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