ES2342877T3 - Inhibidores del factor inhibidor de la migracion de macrofagos y metodos para su identificacion. - Google Patents
Inhibidores del factor inhibidor de la migracion de macrofagos y metodos para su identificacion. Download PDFInfo
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Abstract
Un compuesto con estructura: **(Ver fórmula)** o un estereoisómero, o una sal farmacéuticamente aceptable de él, donde: X es oxígeno; Y se selecciona entre el grupo formado por -NO2, -C(=O)R5, -C(=O)OR5 y -C(=O)NR5R6; Z es -CH2-; n es 1; R1 se selecciona entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo C1-10, arilo C1-10 alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo monocíclico de 5 a 7 miembros y heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros, donde R1 está sustituido o no con al menos un sustituyente seleccionado del grupo formado por halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto; R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo formado por halógeno, hidrógeno y alquilo C1-10; R4 se selecciona del grupo formado por -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 y -C(=O)R7; cada R5 y R6 se selecciona independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo C1-10 y arilo C1-10 alquilo; o R5 y R6 conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo monocíclico de 5 a 7 miembros o un heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros, donde R5 y R6 están independientemente sustituidos o no con al menos un sustituyente seleccionado del grupo formado por halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto; R7 se selecciona del grupo formado por alquilo C1-10, arilo C1-10 alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo monocíclico de 5 a 7 miembros y heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros, donde R7 está sustituido o no con al menos un sustituyente seleccionado del grupo formado por halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto.
Description
Inhibidores del factor inhibidor de la migración
de macrófagos y métodos para su identificación.
Esta invención se refiere generalmente a los
inhibidores del factor inhibidor de la migración (MIF por sus siglas
en inglés) de macrófagos, los métodos de identificación del MIF y
los métodos de tratamiento de trastornos relacionados con el MIF
mediante la administración de dichos inhibidores.
Se ha identificado la linfoquina, factor
inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), como un mediador de
la función de los macrófagos en la defensa del huésped y su
expresión se relaciona con la hipersensibilidad retrasada,
inmunorregulación, inflamación e inmunidad celular. Véase Metz y
Bucala, Adv. Immunol. 66:197-223, 1997. Se
han identificado los factores inhibidores de la migración de
macrófagos (MIFs), que tienen un tamaño de 12-13
kilodaltons (kDa), en diversas especies mamíferas y aves; véase por
ejemplo, Galat et al, Fed. Eur. Biochem. Soc.
319:233-236, 1993; Wistow et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:1212-1275, 1993; Weiser et
al, Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:7522-7526,
1989; Bemhagen et al., Nature 365:156-159,
1993; Blocki et al, Protein Science
2:2095-2102, 1993; y Blocki et al, Nature
360:269-210, 1992. Aunque el MIF se caracterizó
inicialmente como capaz de bloquear la migración de macrófagos,
también parece que el MIF lleva a cabo la adherencia macrófaga;
induce a los macrófagos a expresar interleucina-1
-beta, interleucina-6 y el factor de necrosis
tumoral alfa; hace la regulación positiva de HLA-DR;
aumenta las concentraciones de óxido nítrico sintasa y de óxido
nítrico; y activa los macrófagos para destruir las células tumorales
de Leishmania donovani e inhibir el crecimiento de
Mycoplasma avium, mediante un mecanismo diferente al seguido
por el interferon-gama. Además de su papel potencial
como molécula inmunoevasiva, el MIF puede actuar como un
inmunoadyuvante cuando se administra con albúmina de suero bovino o
VIH gp120 en Freunds incompletos o liposomas, provocando una
proliferación inducida por antígenos comparable con la de los
Freunds completos. Además, se ha descrito el MIF como un regulador
del recuento de glucocorticoides y factor angiogénico. Como una de
las pocas proteínas que los glucocorticoides inducen y no inhiben,
sirve para atenuar los efectos inmunosupresores de los
glucocorticoides. Como tal, se considera un elemento poderoso que
regula los efectos inmunosupresores de los glucocorticoides. Por
esto, cuando se sobreinducen sus actividades/expresión genética
mediante la administración de glucocorticoides exógenos en exceso
(por ejemplo, cuando clínicamente está indicado para suprimir la
inflamación, inmunidad y similares), se observa una toxicidad
significativa ya que el MIF en sí mismo exacerba la respuesta
inflamatoria/inmune. Véase Buccala et al., Ann. Rep. Med. Chem.
55:243-252, 1998.
Mientras que también se piensa que el MIF actúa
sobre las células a través de un receptor específico que a su vez
activa una cascada intracelular que incluye la fosforilación de Erk
y la quinasa MAP y la regulación positiva de las metaloproteasas de
matriz, c-jun, c-fos e
IL-1 mARN (véase Onodera et al., J. Biol. Chem.,
275:444-450, 2000), también posee una actividad
enzimática endógena como se ilustra por su habilidad para
tautomerizar los sustratos apropiados (por ej., dopacromo). Además,
no está claro si esta actividad enzimática actúa como mediador de la
respuesta biológica al MIF y las actividades de esta proteína in
vitro e in vivo. Mientras que la mutagénesis
sitio-dirigida de MIF ha generado mutantes que
poseen una actividad intrínseca completa, pero no poseen actividad
enzimática (Hermaiiowski-Vosatka et al.,
Biochemistry 38:12841-12849, 1999), Swope et
al. han descrito un enlace directo entre la actividad citoquina
y el sitio catalítico para MIF (Swope et al., EMBO J.
17(13):3534-3541, 1998). En consecuencia, no
está claro si las estrategias para identificar inhibidores de la
actividad de MIF a través de la inhibición de dopacromo tautomerasa
por sí misma producen inhibidores de la actividad del MIF de valor
clínico. La habilidad de evaluar la inhibición de MIF con su
receptor de superficie celular también es limitada, ya que se
desconoce en la actualidad un receptor de alta afinidad.
El interés en el desarrollo de inhibidores MIF
proviene de haberse observado que el MIF se conoce por su actividad
citoquínica de concentrar macrófagos en los sitios de infección, e
inmunidad citomediada. Más aún, se conoce al MIF como un mediador de
la adherencia de macrófagos, fagocitosis y actividad tumoricida.
Véase Weiser et al., J. Immunol.
147:2006-2011, 1991. Así, la inhibición de MIF
produce la inhibición indirecta de citoquinas, factores de
crecimiento, quimioquinas y linfoquinas que el macrófago podría
llevar a un sitio de inflamación. Se ha aislado cADN de MIF humano
de una línea celular T, que codifica una proteína que tiene una masa
molecular de aproximadamente 12,4 kDa con 115 residuos aminoácidos
que forman un homotrímero como la forma activa (Weiser et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7522-7526, 1989).
Mientras que originalmente se observó MIF en linfocitos T activados,
en la actualidad se ha descubierto en diversos tejidos, incluidos el
hígado, los pulmones, la lente del ojo, el ovario, el cerebro, el
corazón, el bazo, el riñón, los músculos y otros. Véase Takahashi
et al, Microbiol. Immunol. 43(1):61-67, 1999.
Otra característica del MIF es su falta de una secuencia líder
tradicional (esto es, una proteína sin líder) que dirija la
secreción clásica a través de la ruta ER/Golgi.
Un inhibidor MIF (y un método para identificar
inhibidores MIF) que actúan mediante la neutralización de la
actividad citoquínica del MIF presenta ventajas significativas sobre
otros tipos de inhibidores. Por ejemplo, el enlace entre la
actividad tautomerasa sola y la respuesta inflamatoria es polémico.
Más aún, frecuentemente tos inhibidores que actúan intracelularmente
son tóxicos debido a su acción sobre los objetivos relacionados o
las actividades del objetivo dentro de las células. Las pequeñas
moléculas inhibidoras del complejo ligando receptor son difíciles de
identificar y más aún de optimizar y desarrollar. El inhibidor ideal
de una citoquina como MIF es uno que altera el MIF en sí de forma
que cuando se libera de la célula se ha neutralizado efectivamente.
Una pequeña molécula con esta actividad es superior a los
anticuerpos debido a la diferencia fundamental entre proteínas y
sustancias químicas como fármacos.
Ya que el MIF se ha identificado en diversos
tejidos y se ha asociado con numerosos sucesos patológicos, existe
la necesidad dentro del campo de identificar inhibidores del MIF.
También se tiene la necesidad de obtener composiciones farmacéuticas
que contengan dichos inhibidores, así como métodos relacionados con
su empleo para tratar, por ejemplo, trastornos inmunorrelacionados u
otros sucesos patológicos inducidos por MIF, como la angiogénesis
asociada a tumores. Las realizaciones preferidas pueden cubrir estas
necesidades y ofrecer también otras ventajas.
La invención presenta inhibidores de MIF que
tienen las siguientes estructuras generales (Ia) y (Ib):
incluyendo estereoisómeros y sales
farmacéuticamente aceptables de ellos, donde n, R_{1},
R_{2}, R_{3}, R_{4}, X, Y y Z se definen
posteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inhibidores MIF de realizaciones preferidas
tienen utilidad en una amplia gama de aplicaciones terapéuticas, y
pueden emplearse para tratar una variedad de trastornos,
enfermedades o condiciones patológicas, incluyendo, pero sin
limitarse a ellas, una variedad de respuestas inmunorrelacionadas,
crecimiento tumoral (por ej., cáncer de próstata, etc.),
glomerulonefritis, inflamación, anemia palúdica, choque séptico,
angiogénesis asociada al tumor, vitreorretinopatía, psoriasis,
enfermedad injerto contra huésped (rechazo de tejidos), dermatitis
atópica, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal,
otitis media, enfermedad de Crohn, síndrome de dificultad
respiratoria aguda, hipersensibilidad de tipo retrasado y otros.
Véanse, por ejemplo, Metz y Bucala (dado anteriormente);
Swope y Lolis, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol.
139:1-32, 1999; Waeber et al., Diabetes M.
Res. Rev. 15(1):47-54, 1999; Nishihira, Int.
J. Mol. Med. 2(1): 17-28, 1998; Bucala, Ann.
N.Y. Acad. Sci. 840:14-S2, 1998; Bernhagen
et al, J. Mol. Med. 76(3-4):
151-161, 1998; Donnelly y Bucala, Mol. Med. Today
3(11):502-507, 1997; Bucala et al., FASEB J.
10(14):1607-1613, 1996. Dichos métodos incluyen
la administración de una cantidad efectiva de uno o más inhibidores
de MIF como se indica en las realizaciones preferidas,
preferiblemente en la forma de una composición farmacéutica, a un
animal que la requiere. En consecuencia, en otra realización, se dan
las composiciones farmacéuticas que contienen uno o más inhibidores
del MIF de realizaciones preferidas en combinación con un vehículo
y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En una estrategia de realizaciones preferidas se
caracterizan las moléculas que interactúan con el IMF para inducir
un cambio de conformación en el mismo, tal como una pérdida de
inmunorreactividad a un anticuerpo monoclonal. Con este cambio,
cuando se identifica mediante examen, se identifican pequeñas
moléculas inhibidoras de MIF. Este aspecto particular puede
extenderse a cualquier polipéptido bioactivo donde la pérdida de
inmunorreactividad puede actuar como sustituto de la actividad (por
ej., actividad citoquínica, actividad enzimática, actividad del
cofactor, o similares).
En una primera realización, se proporciona un
compuesto con una estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo,
donde:
X es oxígeno;
Y se selecciona del grupo formado por -NO_{2},
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y
-C(=O)NR_{5}R_{6};
Z es -CH_{2}-
n es 1;
R_{1} se selecciona del grupo formado por
hidrógeno, alquilo C_{1-10}, arilo
C_{1-10} alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo
monocíclico de 5 a 7 miembros y heterociclo policíclico de 7 a 14
miembros, donde R_{1} está sustituido o no con al menos un
sustituyente seleccionado del grupo formado por halógeno, alcoxilo,
alquilamino, dialquilamino y ceto;
R_{2} y R_{3} se seleccionan
independientemente del grupo formado por halógeno, hidrógeno y
alquilo C_{1-10};
R_{4} se selecciona del grupo formado por
-CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6},
-C(=O)OR_{7} y -C(=O)R_{7};
cada R_{5} y R_{6} se selecciona
independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo
C_{1-10} y arilo C_{1-10}
alquilo;
o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo
de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo monocíclico
de 5 a 7 miembros o un heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros,
donde R_{5} y R_{6} están independientemente sustituidos o no
con al menos un sustituyente seleccionado del grupo formado por
halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto;
R_{7} se selecciona del grupo formado por
alquilo C_{1-10}, arilo C_{1-10}
alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo monocíclico de 5 a 7 miembros
y heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros, donde R_{7} está
sustituido o no con al menos un sustituyente seleccionado del grupo
formado por halógeno, alcoxilo, alquilamino, dialquilamino y
ceto;
\newpage
En una segunda realización, se proporciona un
compuesto con una estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo,
donde:
X es oxígeno;
Y se selecciona del grupo formado por -NO_{2},
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y
-C(=O)NR_{5}R_{6};
Z es -CH_{2}-
n es 1;
R_{1} se selecciona del grupo formado por
hidrógeno, alquilo C_{1-10}, arilo
C_{1-10} alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo
monocíclico de 5 a 7 miembros,
-NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N(CH_{3})_{2} y un
heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros, donde R_{1} está
sustituido o no con al menos un sustituyente seleccionado del grupo
formado por halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto;
R_{2} y R_{3} se seleccionan
independientemente del grupo formado por halógeno, hidrógeno y
alquilo C_{1-10};
R_{4} se selecciona del grupo formado por
-CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6},
-C(=O)OR_{7} y -C(=O)R_{7};
cada R_{5} y R_{6} se selecciona
independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo
C_{1-10} y arilo C_{1-10}
alquilo;
o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo
de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo monocíclico
de 5 a 7 miembros o un heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros,
donde R_{5} y R_{6} están independientemente sustituidos o no
con al menos un sustituyente seleccionado del grupo formado por
halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto;
R_{7} se selecciona del grupo formado por
alquilo C_{1-10}, arilo C_{1-10}
alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo monocíclico de 5 a 7 miembros
y heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros, donde R_{7} está
sustituido o no con al menos un sustituyente seleccionado del grupo
formado por halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos de la segunda realización, Y
es -C(=O)OCH_{2}CH_{3}; o Y es -NO_{2}; o R_{4}
es
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
En una tercera realización, se proporciona un
compuesto con una estructura:
o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es oxígeno; Y es
-NO_{2}; Z
es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{6} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{6} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
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En ciertos aspectos de la tercera realización, Z
es -CH_{2}-y o R_{4} es
En una cuarta realización, se proporciona un
compuesto con una estructura:
o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es oxígeno; Y es
-C(=O))CH_{2}CH_{3}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1}
incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo
sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo,
heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo
sustituido, dialquilo y
R'R''N(CH_{2})_{x}-,
donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6},
-C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{3} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6},
-C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{3} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos de la cuarta realización, X
es oxígeno; o Z es -CH_{2}- y n es 1; o R_{4}
En una quinta realización, se proporciona un
compuesto que tiene una estructura:
o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es oxígeno; Y
incluye NO_{2},
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} es
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} es
y R_{5} y R_{6}
independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido,
arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido,
heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y
heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con
un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o
heterociclo
sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos de la quinta realización Y
es C(=O)OCH_{2}CH_{3}; o Y es -NO_{2}.
En una sexta realización, se proporciona un
compuesto que tiene una estructura:
o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es oxígeno; Y
incluye -NO_{2},
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} es
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} es
y R_{5} y R_{6}
independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido,
arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido,
heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y
heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con
un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o
heterociclo
sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos de la sexta realización Y es
C(=O)OCH_{2}CH_{3}; o Y es -NO_{2}.
En una séptima realización, se proporciona un
compuesto que tiene una estructura:
o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es oxígeno; Y
incluye -NO_{2},
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{6} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{6} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos de la séptima realización, Y
es -C(=O)OCH_{2}CH_{3}; o Y es -NO_{2}; o R_{4}
es
En una octava realización, se proporciona una
composición que incluye un compuesto de la primera realización en
combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
En una novena realización, se proporciona un
método para reducir la actividad MIF en un paciente que la necesite,
incluyendo la administración a un paciente de una cantidad efectiva
de un compuesto que tiene la estructura:
o un estereoisómero, un profármaco
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es
oxígeno; Y incluye -NO_{2}, -C(=O)R_{5},
-C(=O)OR_{5}- y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es
-CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo,
alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo,
arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido,
heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y
R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R'
y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo
sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo,
heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo
sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente
incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y
-NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7},
-C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7},
-C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente
incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo
sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo,
heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo
sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de
nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo
sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo,
arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo,
heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo
sustituido; y R_{8} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo
sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo
sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo
y heterocicloalquilo
sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
En una décima realización, se proporciona un
método para el tratamiento de la inflamación en un animal de sangre
caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad
efectiva del compuesto de la primera realización.
En una decimoprimera realización, se proporciona
un método para el tratamiento de choque séptico en un animal de
sangre caliente, incluyendo la administración al animal de una
cantidad efectiva del compuesto de la primera realización.
En una decimosegunda realización, se proporciona
un método para el tratamiento de artritis en un animal de sangre
caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad
efectiva del compuesto de la primera realización.
\newpage
En una decimotercera realización, se proporciona
un método para el tratamiento de cáncer en un animal de sangre
caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad
efectiva del compuesto de la primera realización.
En una decimocuarta realización, se proporciona
un método para el tratamiento del síndrome de dificultad
respiratoria aguda en un animal de sangre caliente, incluyendo la
administración al animal de una cantidad efectiva del compuesto de
la primera realización.
En una decimoquinta realización, se proporciona
un método para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un
animal de sangre caliente, incluyendo la administración al animal de
una cantidad efectiva del compuesto de la primera realización. En
ciertos aspectos de la decimoquinta realización, la enfermedad
inflamatoria podría incluir artritis reumatoide, osteoartritis,
enfermedad inflamatoria intestinal y asma.
En una decimosexta realización, se proporciona
un método para el tratamiento de una enfermedad antiinmune en un
animal de sangre caliente, incluyendo la administración al animal de
una cantidad efectiva del compuesto de la primera realización. En
ciertos aspectos de la decimosexta realización, la enfermedad
autoinmune incluye diabetes, asma y esclerosis múltiple.
En una decimoséptima realización, se proporciona
un método para suprimir una respuesta inmune en un animal de sangre
caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad
efectiva del compuesto de la primera realización.
En una decimoctava realización, se proporciona
un método para la disminución de angiogénesis en un animal de sangre
caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad
efectiva del compuesto de la primera realización.
En una decimonovena realización, se proporciona
un método para el tratamiento de una enfermedad asociada con niveles
excesivos de glucocorticoides en un animal de sangre caliente,
incluyendo la administración al animal de una cantidad efectiva del
compuesto de la primera realización. En un aspecto de la
decimonovena realización, la enfermedad es la enfermedad de
Cushing.
En una vigésima realización, se proporciona un
método para la detección de un agente que modula la actividad del
MIF, incluyendo la puesta en contacto de una muestra que contiene
MIF con un agente; y la detección de la capacidad del agente para
modular el MIF determinando una capacidad diferencial de un
anticuerpo de enlazarse al MIF. En un aspecto de la vigésima
realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En un
aspecto de la vigésima realización, MIF incluye proteínas de fusión,
mutaciones o variantes de ellas.
En una vigésimo primera realización, se
proporciona un método para el empleo del enlace con anticuerpos como
un marcador sustituto para el examen con un agente que modula la
actividad de un polipéptido, incluyendo la puesta en contacto del
polipéptido con un agente modulador sospechado, la puesta en
contacto del polipéptido con un anticuerpo monoclonal, y la
detección de una actividad diferencial del polipéptido en relación
con un control.
En una vigésimo segunda realización, se
proporciona un compuesto que tiene una estructura:
o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es oxígeno; Y
incluye -NO_{2},
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6}, independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6}, conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{8} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6}, independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6}, conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{8} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
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En una vigésimo tercera realización, se
proporciona un compuesto que tiene una estructura:
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o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es oxígeno; Y
incluye -NO_{2},
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{8} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{8} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos de la vigésimo tercera
realización, R_{1} es
-NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N(CH_{3})_{2}; o X es
oxígeno; o Y es C(=O)OCH_{2}CH_{3}; o Y es -NO_{2}; o
R_{4} es
\vskip1.000000\baselineskip
En una vigésimo cuarta realización, se
proporciona un compuesto que tiene una estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es oxígeno; Y es
-C(=O)OCH_{2}CH_{3}; Z es -CH_{2}-; n es 1;
R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo
sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo,
heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo
sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde
x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno,
alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo
sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo,
heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3}
independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5}
y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7},
-C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7},
-C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente
incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo
sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo,
heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo
sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de
nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo
sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo,
arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo,
heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo
sustituido; y R_{8} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo
sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo
sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo
y heterocicloalquilo
sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos de la vigésimo cuarta
realización, R_{4} es
En una vigésimo quinta realización, se
proporciona un compuesto que tiene una estructura:
o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es oxígeno; Y
incluye -NO_{2},
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} es -NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N(CH_{3})_{2}; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{8} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} es -NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N(CH_{3})_{2}; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{8} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos de la vigésimo quinta
realización, Y es -C(=O)OCH_{2}CH_{3}; o Y es NO_{2}; o
R_{4} es
\newpage
En una vigésimo sexta realización, se
proporciona un compuesto que tiene una estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es oxígeno; Y es
-NO_{2}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye
hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo
sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido,
dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-,
donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{8} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido, siempre y cuando R_{4} no sea metilo cuando R_{1} sea metilo, tanto R_{2} como R_{3} son hidrógeno y X es oxígeno.
donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye -CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7}, -C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} independientemente incluyen hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7} incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y R_{8} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido, siempre y cuando R_{4} no sea metilo cuando R_{1} sea metilo, tanto R_{2} como R_{3} son hidrógeno y X es oxígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos de la vigésimo sexta
realización, R_{1} es
-NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N(CH_{3})_{2}; o X es
oxígeno; o Z es -CH_{2}; y n es 1; o R_{4} es
\vskip1.000000\baselineskip
En una vigésimo séptima realización, se
proporciona un compuesto que tiene una estructura:
o un estereoisómero o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es oxígeno; Y
incluye -NO_{2};
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye
-C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y -C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1; R_{1} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido, dialquilo y R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde x es 2 a 4, y donde R' y R'' incluyen independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido y dialquilo; R_{2} y R_{3} independientemente incluyen halógeno, -R_{5}, -OR_{5}, -SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} incluye
\vskip1.000000\baselineskip
R_{5} y R_{6} independientemente incluyen
hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo
sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; o
R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo de nitrógeno al que
están unidos forman un heterociclo o heterociclo sustituido; R_{7}
incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo
sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido; y
R_{8} incluye hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo
sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo,
heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo
sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos de la vigésimo séptima
realización, R_{1} es
-NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N(CH_{3})_{2}; o X es
oxígeno; o Z es -CH_{2}; y n es 1; o Y es
-C(=O)OCH_{2}CH_{3}; o Y es NO_{2}.
En una vigésimo octava realización, se
proporciona una composición que está formada por un compuesto de la
invención en combinación con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
Los compuestos y composiciones de la invención
pueden emplearse en un método para la reducción de la actividad del
MIF en pacientes que lo necesitan, incluyendo la administración al
paciente de una cantidad efectiva de un compuesto o composición de
la invención.
Los compuestos o composiciones de la invención
pueden usarse en los siguientes casos:
- (i)
- un método para el tratamiento de inflamación en un animal de sangre caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la invención.
- (ii)
- un método para el tratamiento de choque séptico en un animal de sangre caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la invención.
- (iii)
- un método para el tratamiento de artritis en un animal de sangre caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la invención.
- (iv)
- un método para el tratamiento de cáncer en un animal de sangre caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la invención.
- (v)
- un método para el tratamiento de síndrome de dificultad respiratoria aguda en un animal de sangre caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la invención.
- (vi)
- un método para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un animal de sangre caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la invención. La enfermedad inflamatoria incluye artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad inflamatoria intestinal y asma.
\newpage
- (vii)
- un método para el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un animal de sangre caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la invención. La enfermedad autoinmune incluye diabetes, asma y esclerosis múltiple.
- (viii)
- un método para la supresión de una respuesta inmune en un animal de sangre caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la invención.
- (ix)
- un método para disminuir la angiogénesis en un animal de sangre caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la invención.
- (x)
- un método para el tratamiento de una enfermedad asociada con niveles excesivos de glucocorticoides en un animal de sangre caliente, incluyendo la administración al animal de una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la invención. La enfermedad podría ser, por ejemplo, la enfermedad de Cushing.
\vskip1.000000\baselineskip
En una vigésimo novena realización, se
proporciona un proceso para la preparación de un compuesto de
fórmula IV, incluyendo los pasos de reacción de un compuesto de
fórmula I
\vskip1.000000\baselineskip
con un compuesto de fórmula
II:
\vskip1.000000\baselineskip
obteniendo así un compuesto de
fórmula
III:
\vskip1.000000\baselineskip
donde R_{7} se selecciona del
grupo formado por alquilo C_{1-10}, arilo
C_{1-10} alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo
monocíclico de 5 a 7 miembros y heterociclo policíclico de 7 a 14
miembros, donde R_{7} está sustituido o no con al menos un
sustituyente seleccionado del grupo formado por halógeno, alcoxi,
alquilamino, dialquilamino y ceto; y la reacción del compuesto de
Fórmula III con un compuesto que incluye X-R_{1},
donde X se selecciona del grupo formado por Cl, Br y I, y donde
R_{1} se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo
C_{1-10}, arilo C_{1-10}
alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo monocíclico de 5 a 7 miembros
y heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros, donde R_{1} está
sustituido o no con al menos un sustituyente seleccionado del grupo
formado por halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto,
obteniendo así un compuesto de fórmula
IV:
en donde el compuesto de fórmula IV
es adecuado para el empleo como un inhibidor del factor inhibidor de
la migración de un macrófago. En ciertos aspectos de la vigésimo
novena realización, R_{7}
es
\vskip1.000000\baselineskip
En una trigésima realización, se proporciona un
procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula AIV,
incluyendo los pasos de reacción de un compuesto de fórmula AI:
\vskip1.000000\baselineskip
con un compuesto de fórmula
II:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
obteniendo así un compuesto de
fórmula
AHI:
\vskip1.000000\baselineskip
donde R_{7} se selecciona del
grupo formado por alquilo C_{1-10}, arilo
C_{1-10} alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo
monocíclico de 5 a 7 miembros y heterociclo policíclico de 7 a 14
miembros, donde R_{7} está sustituido o no con al menos un
sustituyente seleccionado del grupo formado por halógeno, alcoxi,
alquilamino, dialquilamino y ceto; y la reacción del compuesto de
Fórmula Allí con un compuesto que incluye X-R_{1},
donde X se selecciona del grupo formado por Cl, Br y I, y donde
R_{1} se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo
C_{1-10}, arilo C_{1-10}
alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo monocíclico de 5 a 7 miembros
y heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros, donde R_{1} está
sustituido o no con al menos un sustituyente seleccionado del grupo
formado por halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto,
obteniendo así un compuesto de fórmula
AIV:
\vskip1.000000\baselineskip
donde el compuesto de fórmula AIV
es adecuado para el empleo como un inhibidor del factor inhibidor de
la migración de un
macrófago.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos de la trigésima realización,
R_{7} es
En la trigésimo primera realización, se
proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una
enfermedad o trastorno donde MIF es patógeno, la composición
farmacéutica incluye un compuesto inhibidor del MIF de la invención
y un fármaco para el tratamiento de la enfermedad o trastorno, en
donde el fármaco no posee una actividad inhibidora mensurable del
MIF.
En la trigésimo segunda realización, se
proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una
enfermedad o trastorno donde MIF es patógeno, la composición
farmacéutica incluye un compuesto inhibidor del MIF de la invención
y un fármaco seleccionado entre el grupo formado por los fármacos
antiinflamatorios no esteroides, fármacos contra la infección,
beta-estimulantes, esteroides, antihistaminas,
fármacos anticancerígenos, fármacos contra el asma, fármacos contra
la sepsis, fármacos contra la artritis y fármacos
inmunosupresores.
Estas y otras realizaciones y aspectos de las
mismas serán aparentes consultando la siguiente descripción
detallada. Para ello, se presentan varias referencias que describen
en mayor detalle ciertos procedimientos, compuestos y/o
composiciones.
Las Figuras 1A-1B son imágenes
escaneadas de un autorradiograma que demuestra la
inmunoprecipitación de anticuerpos con un anticuerpo monoclonal
anti-MIF (Figura 1A) y sueros policlonales
anti-MIF (Figura 1B) en extractos citosólicos (C),
así como medios acondicionados (M) de células THP-1
después de la estimulación con LPS y tratamiento con diversas
concentraciones micromolares del compuesto 7e. También se presentan
los resultados de la actividad de la tautomerasa detectada en las
diferentes fracciones. Los signos "más" indican actividad de la
tautomerasa, los signos "menos" indican actividad no detectable
y los signos "\pm" indican actividad parcial.
La Figura 2 es un gráfico en el que se muestran
los resultados del ensayo inmunoenzimático absorbente (ELISA, por
sus siglas en inglés) después del tratamiento de células
THP-1 estimuladas con LPS con cinco análogos de la
composición reivindicada en el presente. Se muestra la capacidad de
cada análogo para inhibir el enlace de los anticuerpos monoclonales
y depende de la dosis.
La Figura 3 es una representación gráfica de la
inmunorreactividad del MIF en un medio acondicionado usando ELISA
después de la estimulación de células THP-1 con LPS
y adición de 10 \muM de compuesto 7e a tiempos diferentes durante
el cultivo. En esta Figura se añadió LPS en el punto de tiempo cero,
mientras que se añadió el compuesto 7e a las 0, 2, 4 y 6 horas
después del tratamiento con LPS. En este experimento se emplearon
seis grupos de células THP1, todos ellos cultivados bajo condiciones
estándar de medios. Al inicio del experimento, sólo se añadió tampón
a las células del Grupo 1 y se añadió un tampón que contenía el
compuesto 7e a las células del Grupo 2. Posteriormente, se añadió el
compuesto 7e en tampón a todos los demás grupos a diversos tiempos,
el Grupo 3 a las 2 horas, el Grupo 4 a las 4 horas, el Grupo 5 a las
6 horas y el Grupo 6 a las 22 horas. Se tomaron muestras de cada
grupo en los tiempos indicados después de la adición del tampón o
del tampón más la muestra y se hizo el ensayo para los niveles
detectables del MIF usando el anticuerpo monoclonal
anti-MIF. En ausencia de compuesto (Grupo 1), el
nivel de MIF detectable aumentó con el paso del tiempo del
experimento. En presencia del compuesto, se bloquea la detección de
MIF.
La Figura 4 es una representación gráfica de un
experimento usando ELISA, siguiendo el efecto del compuesto 7e sobre
la detección del MIF. En este diseño experimental, la muestra de
ensayo es un medio de cultivo de células preacondicionado, del que
se han eliminado los restos celulares. Se calculó que la
concentración inicial de MIF en la muestra de ensayo es
aproximadamente 22 ng/ml. Se añadió el compuesto en diferentes
tiempos después de iniciarse la incubación a 37ºC. Cada una de las
muestra se incuba entonces durante 30 minutos más antes de
determinarse nuevamente el nivel detectable de MIF.
La Figura 5 es un gráfico de barras que
representa el porcentaje relativo de MIF presente en los medios
acondicionados de células RAW 264.7 tratadas con compuesto 7e e
inducidas con LPS en comparación con una población de células de
control que no se trató con el compuesto, determinado con ELISA. El
área superior muestra los Western blots de las mismas fracciones que
las determinadas con ELISA en el área inferior.
La Figura 6 es un gráfico de barras que
representa el porcentaje de MIF en los medios acondicionados de
células RAW 264.7 tratadas con compuesto 7e e inducidas con
TSST-1 en comparación con una población de células
de control que no se trató con el compuesto, determinado con ELISA.
El área superior muestra los Western blots de las mismas fracciones
que las determinadas con ELISA en el área inferior.
Las Figuras 7A-7B son
representaciones gráficas de la detección mediante HPLC del
compuesto 7e en suero de ratón después de la inyección
intraperitoneal del compuesto 7e (Figura 7A) o administración oral
por gavaje de 20 mg del compuesto 7e (Figura 7B). Los resultados se
muestran como una Media +/- EEM (n = 5 ratones).
La Figura 8 es una representación gráfica de la
liberación de MIF detectada por ELISA en suero de ratón a diferentes
tiempos después de la estimulación con LPS/galactosamina. Los
resultados se muestran como una Media +/- EEM.
Las Figuras 9A-9B ilustran
gráficamente los datos obtenidos con ELISA de las concentraciones de
MIF en suero en ng/ml cinco horas después de un estímulo con 10
mg/kg LPS (Figura 9A) o MIF en suero normalizado cuatro horas
después de un estímulo con 5 mg/kg de LPS (Figura 9B) en presencia o
ausencia del compuesto 7e (0,4 mg/ratón 20 gramos).
\newpage
La Figura 10 es una representación gráfica de
las mediciones hechas con ELISA para demostrar la correlación entre
los niveles de suero IL-1\beta en (pg/ml) contra
MIF en suero (ng/ml) cinco horas después del estímulo con
LPS/galactosamina de ratones hembra Balb/c.
Las Figuras 11A-1 IB son
gráficos de barras que ilustran la detección con ELISA de
IL-1\beta y TNF-\alpha cuatro
horas después del estímulo con LPS (5 mg/kg) y la presencia o
ausencia de 20 mg/kg peso corporal del compuesto 7e (i.p.).
Las Figuras 12A-12C muestran el
tiempo de supervivencia acumulativo contra el tiempo de
supervivencia (horas) (evaluación de Kaplan-Meier de
la supervivencia) con ratones Balb/c después de la dosificación i.p.
con 20 mg/kg del compuesto 7e o tratamiento con vehículo de control
al tiempo de LPS (2 mg/kg (12A), 5 mg/kg (Figura 12B), o 10 mg/kg
(Figura 12C)) y D-galactosamina (50 mg/kg). Todos
los experimentos incluyeron treinta ratones, de los cuales quince
recibieron el vehículo de control y quince recibieron el compuesto
de interés.
La Figura 13 es un gráfico que ilustra el tiempo
de supervivencia de 25% de los ratones contra la concentración de
LPS (mg; Sigma 055:B5) y D-galactosamina (50 mg/kg)
en presencia o ausencia del compuesto 7e (20 mg/kg peso corporal).
Los datos representan el promedio de seis experimentos usando
treinta ratones en cada uno.
La Figura 14 representa el protocolo
experimental para las pruebas con los inhibidores MIF en la
inhibición de artritis en un modelo de artritis inducida con
colágeno en ratones. Se administró el compuesto 7e dos veces al día
durante cuatro días.
La Figura 15 es un gráfico de barras que ilustra
las mediciones con un calibrador de los grosores de las patas como
representante del edema de las patas el día 74. Los valores se
expresan como la Media +/- EEM para diez animales por grupo.
Las Figuras 16A-16B son gráficos
de barras que ilustran los niveles de MIF (Figura 16A) y TNF (Figura
16B) en sueros de ratón de ratones con artritis inducida con
colágeno determinados con ELISA. Los valores se expresan como la
Media +/- EEM de siete animales. Los controles son ratones no
tratados con colágeno o compuesto, CIA representa los ratones con
artritis inducida con colágeno y el compuesto 7e representa los
ratones tratados con CIA.
La siguiente descripción y ejemplos ilustran
detalladamente una realización preferida de la invención actual.
Aquellos versados en las técnicas reconocerán que existen muchas
variaciones y modificaciones de esta invención que están incluidas
dentro de su ámbito. En consecuencia, no deberá considerarse que la
descripción de una realización preferida limita el ámbito de la
invención actual.
Para ayudar a entender las realizaciones
preferidas, en el presente se suministran ciertas definiciones.
El término "actividad MIF", tal y como se
utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a una
actividad o efecto mediado al menos en parte por el factor inhibidor
de la migración del macrófago. Por consiguiente, la actividad MIF
incluye, pero sin limitarse a ello, la inhibición de la migración
del macrófago, la actividad de la tautomerasa (por ej., el empleo de
fenilpiruvato o dopacromo), el choque inducido por endotoxinas, la
inflamación, la contrarregulación de glucocorticoides, la inducción
de la incorporación de timidina a fibroblastos 3T3, la inducción de
la fosforilación erk y la actividad de las MAP quinasas.
El término "exportar", tal y como se
utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un
proceso activo metabólicamente, que puede o no depender de la
energía, para transportar un producto celular traducido a la
membrana celular o el espacio extracelular mediante un mecanismo
diferente al de la secreción dirigida por la secuencia líder
estándar mediante una secuencia canónica líder. Más aún,
"exportar", a diferencia de una secreción que depende de la
secuencia del líder, es resistente a brefeldina A (esto es, la
proteína exportada no se transporta mediante el ER/Golgi; se espera
que brefeldina A no tenga efecto directo sobre el tráfico de una
proteína exportada) y otros compuestos similares. En la forma usada
aquí, "exportar" también puede llamarse "secreción no
clásica".
El término "proteína sin líder" en la forma
empleada en el presente es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a una
proteína o polipéptido que no posee una secuencia canónica líder, y
se exporta del interior de una célula al entorno extracelular. Las
proteínas sin líder en el entorno extracelular se refieren a las
proteínas ubicadas en el espacio extracelular, o asociadas con la
superficie externa de la membrana celular. En el contexto de las
realizaciones preferidas, las proteínas sin líder incluyen las
proteínas de ocurrencia natural, como el factor inhibidor de la
migración de macrófagos y fragmentos del mismo, así como proteínas
sintetizadas de manera que no posean una secuencia líder y se
exportan, o proteínas que se sintetizan para incluir una fusión de
una proteína sin líder, o una fracción de ella, con otra
proteína.
El término "inhibidor" en la forma empleada
en el presente es un término amplio y se emplea en su sentido
normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a una molécula
(por ej., compuesto natural o sintético) que puede alterar la
conformación de MIF y/o competir con un anticuerpo monoclonal por
MIF y disminuir al menos una actividad de MIF o su exportación desde
una célula en comparación con la actividad o exportación en ausencia
del inhibidor. En otras palabras, un "inhibidor" altera la
conformación y/o actividad y/o exportación si ocurre una cambio
estadísticamente significativo en la cantidad de MIF medido,
actividad MIF o en la proteína MIF detectada extracelular y/o
intracelularmente en un ensayo hecho con un inhibidor, en
comparación con un ensayo hecho sin el inhibidor.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El término "agente enlazante" en la forma
empleada en el presente es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a una
molécula que enlaza MIF, incluyendo inhibidores.
En general, los inhibidores del MIF inhiben la
función fisiológica de MIF, y por lo tanto son útiles en el
tratamiento de enfermedades donde el MIF podría ser patógeno.
En algunas de las realizaciones preferidas, se
proporcionan inhibidores del MIF que tienen las siguientes
estructuras (Ia) y (Ib):
incluyendo estereoisómeros o sales
farmacéuticamente aceptables del mismo, donde: X es oxígeno; Y es
-NO_{2}; -C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y
-C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1;
R_{1} es hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo
sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo,
heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo
sustituido, dialquilo o aminoalquilo
R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde R' y R'' son
independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo,
ariloalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo
sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, o
dialquilo, y donde x es 2 a 4; R_{2} y R_{3} son iguales o
diferentes e independientemente son halógeno, -R_{5}, -OR_{5},
-SR_{5} y -NR_{5}R_{6}; R_{4} es -CH_{2}R_{7},
-C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7},
-C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} son iguales o
diferentes e independientemente son hidrógeno, alquilo, alquilo
sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo
sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo
y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente
con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo
o heterociclo sustituido; R_{7} es alquilo, alquilo sustituido,
arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido,
heterociclo, heterociclo
sustituido,
heterocicloalquilo, o
heterocicloalquilo sustituido; y R_{8} es hidrógeno, alquilo,
alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo,
arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido,
heterocicloalquilo y heterocicloalquilo
sustituido.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, se proporcionan
métodos para reducir la actividad del MIF en un paciente que lo
necesita mediante la administración al paciente de una cantidad
efectiva de un compuesto que tiene la siguiente estructura (Ia) y/o
(Ib):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
incluyendo estereoisómeros o una
sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: X es oxígeno; Y es
-NO_{2}; -C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y
-C(=O)NR_{5}R_{6}; Z es -CH_{2}-; n es 1;
R_{1} es hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo
sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo,
heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo
sustituido, dialquilo, o monoalquilo
R'R''N(CH_{2})_{x}-, donde R' y R'' son
independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo,
arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo
sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido o
dialquilo; y donde x es 2 a 4; R_{2} y R_{3} son iguales o
diferentes e independientemente son halógeno, -R_{5}, -OR_{5},
-SR_{5} o -NR_{5}R_{6}; R_{4} es -CH_{2}R_{7},
-C(=O)NR_{5}R_{6}, -C(=O)OR_{7},
-C(=O)R_{7} y R_{8}; R_{5} y R_{6} son iguales o
diferentes e independientemente son hidrógeno, alquilo, alquilo
sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo
sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo
y heterocicloalquilo sustituido; o R_{5} y R_{6} conjuntamente
con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo
o heterociclo sustituido; R_{7} es alquilo, alquilo sustituido,
arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido,
heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, o
heterocicloalquilo sustituido; y R_{8} es hidrógeno, alquilo,
alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo,
arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido,
heterocicloalquilo y heterocicloalquilo
sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
En la forma usada aquí, los términos indicados
anteriormente tienen el siguiente significado. El término
"alquilo", tal y como se utiliza en el presente, es un término
amplio y se emplea en su sentido normal, incluyendo, sin limitación,
para referirse a un hidrocarburo alifático de cadena lineal o
ramificada, cíclico o no, saturado o insaturado que contiene de 1 a
10 átomos de carbono, mientras que el término "alquilo
inferior" tiene el mismo significado que alquilo, pero contiene
de 1 a 6 átomos de carbono. Los alquilos de cadena lineal saturados
representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo,
n-butilo, n-pentilo,
n-hexilo y similares; mientras que los alquilos
ramificados saturados incluyen isopropilo, sec-butilo,
isobutilo, ter-butilo, isopentilo y similares. Los alquilos
cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo,
ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, -CH_{2}ciclopropilo,
-CH_{2}ciclobutilo, -CH_{2}ciclopentilo, -CH_{2}ciclohexilo y
similares; mientras que los alquilos cíclicos insaturados incluyen
ciclopentenilo, ciclohexenilo y similares. Los alquilos cíclicos, a
los que también nos referiremos como "anillos homocíclicos",
incluyen anillos di- y poli-homocíclicos como
decalina y adamantano. Los alquilos insaturados contienen al menos
un enlace doble o triple entre átomos de carbono adyacentes
(llamados "alquenilo" o "alquinilo", respectivamente). Los
alquenilos de cadena lineal o ramificada representativos incluyen
etilenilo, propilenilo, 1-butenilo,
2-butenilo, isobutilenilo,
1-pentenilo, 2-pentenilo,
3-metil-1-butenilo,
2-metil-2-butenilo,
2,3-dimetil-2-butenilo
y similares; mientras que los alquinilos de cadena lineal y
ramificada representativos incluyen acetilenilo, propinilo,
1-butinilo, 2-butinilo,
1-pentinilo, 2-pentinilo,
3-metil-1-butinilo y
similares.
El término "arilo", tal y como se utiliza
en el presente, es un término amplio y se emplea en su sentido
normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un grupo
carbocíclico aromático como fenilo o naftilo.
El término "arilalquilo", tal y como se
utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un
alquilo que contiene al menos un átomo de hidrógeno alquílico
reemplazado por un grupo arilo, como bencilo, -CH_{2}(1 o
2-naftilo), (-CH_{2})_{2}fenilo,
(-CH_{2})_{3}fenilo, -CH(fenilo)_{2} y
similares.
El término "heteroalquilo", tal y como se
utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un
anillo heterocíclico aromático de 5 a 10 miembros y que tiene al
menos un heteroátomo seleccionado entre nitrógeno, oxígeno y azufre,
y que contiene al menos 1 átomo de carbono, incluyendo sistemas
anulares mono- y bicíclicos. Los heteroarilos representativos
incluyen (pero sin limitarse a ellos) furilo, benzofuranilo,
tiofenilo, benzotiofenilo, pirrolilo, indolilo, isoindolilo,
azaindolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo,
isooxazolilo, benzoxazolilo, pirazolilo, imidazolilo,
benzimidazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, isotiazolilo,
piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, cinolinilo,
ftalazinilo y quinazolinilo.
El término "heteroarilalquilo", tal y como
se utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un
alquilo que tiene al menos un átomo de hidrógeno alquílico
reemplazado por un grupo heteroarilo, como -CH_{2}piridinilo,
-CH_{2}pirimidinilo y similares.
Los términos "heterociclo" y "anillo
heterociclo", tal y como se utilizan en el presente, son términos
amplios y se emplean en su sentido normal, incluyendo, sin
limitación, para referirse a un anillo heterocíclico monocíclico con
5 a 7 miembros, o policíclico con 7 a 14 miembros, que es saturado,
insaturado o aromático, y que contiene de 1 a 4 heteroátomos
seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno y azufre,
y donde los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden opcionalmente
estar oxidados, y el heteroátomo de nitrógeno puede estar
opcionalmente cuaternizado, incluyendo anillos bicíclicos en donde
cualquiera de los heterociclos indicados anteriormente está unido a
un anillo de benceno, así como anillos heterocíclicos tricíclicos (o
superiores). El heterociclo puede estar unido mediante cualquier
heteroátomo o átomo de carbono. Los heterociclos incluyen
heteroarilos, como se definió anteriormente. Por lo tanto, además de
los heteroarilos aromáticos enumerados anteriormente, los
heterociclos también incluyen (pero sin limitarse a ellos)
morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo,
hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo,
tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo,
tetrahidroprimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo,
tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo y
similares.
El término "heterocicloalquilo", tal y como
se utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un
alquilo que tiene al menos un átomo de hidrógeno alquílico
reemplazado con un heterociclo, como -CH_{2}morfolinilo y
similares.
El término "sustituido", tal y como se
utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a
cualquiera de los grupos indicados anteriormente (por ej., alquilo,
arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo o
heterocicloalquilo) que tiene al menos un átomo de hidrógeno
reemplazado con un sustituyente. En el caso de un sustituyente ceto
("-C=O)-") se reemplazan dos átomos de hidrógeno. Cuando
sustituidos, los "sustituyentes" en el contexto de la
realización preferida, incluyen halógeno, hidroxi, ciano, nitro,
amino, alquilamino, dialquilamino, alquilo, alcoxi, alquiltio,
haloalquilo, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo
sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroarilalquilo,
heteroarilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido,
heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, -NR_{a}R_{b},
-NR_{a}C(=O)R_{b},
-NR_{a}C(=O)NR_{a}R_{b},
-NR_{a}C(=O)OR_{b}, -NR_{a}SO_{2}R_{b}, -OR_{a}, -C(=O)R_{a}, -C(=O)OR_{a}, -C(=O)NR_{a}R_{b}, -OC(=O)OR_{a}R_{b}, -SH, -SR_{a}, -SOR_{a},
-S(=O)_{2}R_{a}, -OS(=O)_{2}R_{a}, -S(=O)_{2}R_{a}, donde R_{a} y R_{b} son iguales o diferentes e independientemente son hidrógeno, alquilo, haloalquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroarilalquilo, heteroarilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
-NR_{a}C(=O)OR_{b}, -NR_{a}SO_{2}R_{b}, -OR_{a}, -C(=O)R_{a}, -C(=O)OR_{a}, -C(=O)NR_{a}R_{b}, -OC(=O)OR_{a}R_{b}, -SH, -SR_{a}, -SOR_{a},
-S(=O)_{2}R_{a}, -OS(=O)_{2}R_{a}, -S(=O)_{2}R_{a}, donde R_{a} y R_{b} son iguales o diferentes e independientemente son hidrógeno, alquilo, haloalquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroarilalquilo, heteroarilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo y heterocicloalquilo sustituido.
El término "halógeno", tal y como se
utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a floro,
cloro, bromo y yodo.
El término "haloalquilo", tal y como se
utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un
alquilo que tiene al menos un átomo de hidrógeno reemplazado con
halógeno, como trifluorometilo y similares.
El término "alcoxi", tal y como se utiliza
en el presente, es un término amplio y se emplea en su sentido
normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un grupo
alquilo unido a través de un puente de oxígeno (esto es,
-O-alquilo) como metoxi, etoxi y similares.
El término "tioalquilo", tal y como se
utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un
grupo alquilo unido a través de un puente de azufre (esto es,
-S-alquilo) como metiltio, etiltio y similares.
El término "alquilsulfonilo", tal y como se
utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un
grupo alquilo unido a través de un puente sulfonilo (esto es,
-SO_{2}-alquilo) como metilsulfonilo,
etilsulfonilo y similares.
Los términos "alquilamino" y
"dialquilamino", tal y como se utilizan en el presente, son
términos amplios y se emplean en su sentido normal, incluyendo, sin
limitación, para referirse a un grupo alquilo o dos grupos alquilos,
respectivamente, unidos a través de un puente de nitrógeno (esto es,
-N-alquilo) como metilamino, etilamino,
dimetilamino, dietilamino y similares.
El término "hidroxialquilo", tal y como se
utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un
grupo alquilo sustituido con al menos un grupo hidroxilo.
El término "mono- o
di(cicloalquil)metilo", tal y como se utiliza en el
presente, es un término amplio y se emplea en su sentido normal,
incluyendo, sin limitación, para referirse a un grupo metilo
sustituido con uno o dos grupos cicloalquilo, como
ciclopropilmetilo, diciclopropilmetilo y similares.
El término "alquilcarbonilalquilo", tal y
como se utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en
su sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un
grupo alquilo sustituido con un grupo -C(=O)alquilo.
El término "alquilcarboniloxialquilo", tal
y como se utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea
en su sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a
un grupo alquilo sustituido con un grupo -C(=O)Oalquilo o un
grupo -OC(=O)alquilo.
El término "alquiloxialquilo", tal y como
se utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un
grupo alquilo sustituido con un grupo
-O-alquilo.
El término "alquiltioalquilo", tal y como
se utiliza en el presente, es un término amplio y se emplea en su
sentido normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a un
grupo alquilo sustituido con un grupo
-S-alquilo.
El término "mono- o
di(alquil)amino", tal y como se utiliza en el
presente, es un término amplio y se emplea en su sentido normal,
incluyendo, sin limitación, para referirse a un grupo amino
sustituido con uno o dos grupos alquilo, respectivamente.
El término "mono- o
di(alquil)aminoalquil", tal y como se utiliza en el
presente, es un término amplio y se emplea en su sentido normal,
incluyendo, sin limitación, para referirse a un grupo alquilo
sustituido con un mono- o di(alquil)amino.
Los siguientes esquemas de numeración se emplean
en el contexto de las realizaciones preferidas:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Dependiendo del grupo Z, los compuestos
representativos de las realizaciones preferidas incluyen la
siguiente estructura (II)
En realizaciones adicionales, n es 0, 1,
ó 2 como se representa en las estructuras (IV), (V) o (VI),
respectivamente.
En otras realizaciones adicionales, los
compuestos de las realizaciones preferidas tienen la siguiente
estructura (VII) cuando X es oxígeno y la estructura VIII) cuando X
es azufre.
Dependiendo del grupo Y, los compuestos de las
realizaciones preferidas tienen las siguientes estructuras (IX) a
(XII):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de las realizaciones preferidas
pueden emplearse generalmente como el ácido libre o la base libre.
Alternativamente, los compuestos de las realizaciones preferidas
pueden preferentemente adoptar la forma de sales de adición ácidas o
alcalinas. Las sales de adición ácidas de los compuestos amino de
base libre de realizaciones preferidas pueden prepararse mediante
métodos reconocidos en este campo y pueden formarse con ácidos
orgánicos e inorgánicos. Entre los ácidos orgánicos apropiados
figuran: maleico, fumárico, benzoico, ascórbico, succínico,
metansulfónico, acético, oxálico, propiónico, tartárico, salicílico,
cítrico, glucónico, láctico, mandélico, cinámico, aspártico,
esteárico, palmítico, glicólico, glutámico y bencenosulfónico. Entre
los ácidos inorgánicos adecuados figuran los ácidos clorhídrico,
bromhídrico, sulfúrico, fosfórico y nítrico. Las sales de adición
alcalinas del ácido libre pueden igualmente prepararse mediante
métodos reconocidos en este campo, y pueden formarse a partir de
bases adecuadas, como por ejemplo cationes seleccionados entre los
metales alcalinos y alcalinotérreos (por ej., litio, sodio, potasio,
magnesio, bario o calcio), así como el catión amonio. El término
"sal farmacéuticamente aceptable" de estructura (Ia) o (Ib)
incluirá cualquiera y todas las sales aceptables.
Los compuestos de estructura (Ia) y (Ib) pueden
preparase siguiendo las técnicas de síntesis orgánica conocidas
entre los especialistas versados en este campo, así como mediante
los métodos representativos dados en el Ejemplo 1. En general, los
compuestos de la estructura (Ia) pueden prepararse mediante los
siguientes esquemas de reacción.
\newpage
Esquema de reacción
1
En general, los intermediarios cloro de la
estructura iii pueden prepararse a partir del alcohol
correspondiente ii mediante técnicas conocidas. El intermediario
alcohol puede, a su vez, prepararse a partir de la materia prima i
mediante la reacción con los agentes apropiados. En el Ejemplo 1 se
muestran los reactantes y condiciones representativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema de reacción
2
Las piperazinas N-sustituidas de
estructura iv pueden prepararse mediante la desprotección del
intermediario protegido v (en este caso, como ilustración, protegido
con N-ter-butoxicarbonilo o "Boc"). El intermediario
protegido puede prepararse a partir de la piperazina
N-protegida iv mediante la adición del grupo R_{4}
deseado.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema de reacción
3
El intermediario III en el esquema de reacción 1
puede hacerse reaccionar con el intermediario vi del esquema de
reacción 3 para obtener compuestos de las realizaciones preferidas
que tienen estructura (Ia).
\newpage
Esquema de reacción
4
Alternativamente, el intermediario iii del
esquema de reacción 1 puede hacerse reaccionar con el intermediario
protegido iva para dar el producto de reacción protegido vii. Este
producto de reacción protegido puede entonces desprotegerse para
producir el intermediario viii, seguido por la adición del grupo
R_{4} deseado para obtener los compuestos de las realizaciones
preferidas que tienen la estructura (Ia).
\vskip1.000000\baselineskip
El factor inhibidor de la migración de
macrófagos (MIF) puede ser muy adecuado para el análisis como
fármaco diana ya que su actividad ha estado involucrada en diversas
condiciones patofisiológicas. Por ejemplo, se ha demostrado que MIF
es un mediador importante en las respuestas inflamatorias y en la
proliferación celular. En este sentido, se ha demostrado que MIF
actúa como citoquina, hormona pituitaria, inminomodulador inducido
por glucocorticoide y recientemente como neuroinmunomodulador y en
la función neuronal. Takahashi et al, Mol Med.
4:707-714, 1998; Bucala, Ann. N.Y. Acad. Sci
840:74-82, 1998; Bacher et al, Mol. Med.
4(4):217-230, 1998. Más aún, se ha demostrado
recientemente que los anticuerpos anti-MIF tienen
una gran variedad de usos, notablemente crecimiento tumoral
reducido, conjuntamente con la reducción observada en angiogénesis.
Ogawa et al, Cytokine 12(4):309-314, 2000;
Metz y Bucala (véase anteriormente). En consecuencia, las
pequeñas moléculas que pueden inhibir MIF son de gran valor en el
tratamiento de las respuestas inflamatorias, reducción de la
angiogénesis, infección viral, infección bacteriana, tratamiento del
cáncer (específicamente tumorigénesis y apoptosis), tratamiento de
la enfermedad injerto contra huésped y el rechazo asociado de
tejidos. Un inhibidor del MIF podría ser especialmente útil en
diversas respuestas inmunorrelacionadas, crecimiento tumoral,
glomerulonefritis, inflamación, anemia palúdica, choque séptico,
angiogénesis asociada al tumor, vitreorretinopatía, psoriasis,
enfermedad injerto contra huésped (rechazo de tejidos), dermatitis
atópica, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal,
otitis media, enfermedad de Crohn, síndrome de dificultad
respiratoria aguda, hipersensibilidad de tipo retrasado,. Un
inhibidor MIF también puede ser útil en el tratamiento de estrés y
trastornos de la función glucocorticoide, por ejemplo,
contrarregulación de la acción glucocorticoide; o anulación de la
supresión mediada por glucocorticoides de la emisión de araquidonato
(actividad oxidoreductasa MIF catalítica de Cys-60 o
mecanismo basado en la interacción
JABI/CSNS-MIF).
Un ejemplo de la utilidad de un inhibidor del
MIF puede verse después de la exposición a endotoxinas, las
concentraciones detectables en suero de MIF gradualmente aumentan
durante la fase aguda (1-8 horas), alcanzan un
máximo a las 8 horas y persisten durante la fase postaguda (> 8
horas) hasta un periodo máximo de 20 horas. Aunque no se limita a
cualquier teoría de operación, es probable que MIF sea producido por
linfocitos T y macrófagos durante la etapa pro inflamatoria del
choque inducido por endotoxinas, por ej., como parte de la respuesta
localizada a la infección. Una vez liberado por un estímulo
proinflamatorio, por ej., bajas concentraciones de LPS, o por
TNF-\alpha e IFN-\gamma, el MIF
derivado de macrófagos podría ser la fuente probable de MIF
producido durante la fase aguda del choque endotóxico. Tanto la
glándula pituitaria, que produce MIF como respuesta a LPS, como los
macrófagos son la fuente probable de MIF en la fase postaguda del
choque endotóxico, cuando la infección ya no está limitada a un
sitio localizado. Véase, por ej., la Patente estadounidense
nº 6.080.407, incorporada aquí en su totalidad como referencia y
donde se describen estos resultados con los anticuerpos
anti-MIF.
Como aquí se demuestra, los inhibidores de las
realizaciones preferidas inhiben la letalidad en ratones después del
reto con LPS y es probable que atenúen los niveles de
IL-1\beta y TNF-\alpha. En
consecuencia, podría ser posible el tratamiento de diversas
condiciones inflamatorias mediante el tratamiento con un inhibidor
de MIF. En este sentido, entre otras ventajas, la inhibición de la
actividad y/o producción de MIF puede emplearse en el tratamiento de
la respuesta inflamatoria y choque. Pueden obtenerse efectos
benéficos interviniendo tanto durante las etapas tempranas como
tardías de la respuesta de choque. En este sentido, aunque no
limitadas a cualquier teoría o mecanismo responsable del efecto
protector de la inhibición del MIF, los estudios
anti-MIF han demostrado que la introducción de
anticuerpos anti-MIF está asociada con una reducción
apreciable (hasta 35-40%) en los niveles de
TNF-\alpha en el suero en circulación. Esta
reducción coincide con la actividad inductora de
TNF-\alpha del MIF sobre los macrófagos in
vitro y sugiere que MIF podría ser responsable, parcialmente,
del pico extremadamente alto del nivel en
TNF-\alpha en suero que ocurre 1-2
horas después de la administración de endotoxinas, a pesar de que el
MIF no puede detectarse en la circulación en este punto. Así, la
terapia de inhibición del MIF podría ser beneficiosa en las etapas
tempranas de la respuesta inflamatoria.
El MIF también actúa durante la etapa postaguda
de la respuesta de choque y, por lo tanto, ofrece la oportunidad de
intervenir en las etapas tardías cuando otros tratamientos, como la
terapia anti-TNF-\alpha, no son
efectivos. La inhibición de MIF podría proteger contra el choque
mortal en animales tratados con altas concentraciones de endotoxinas
(esto es, concentraciones que inducen la producción de MIF
pituitario a la circulación), y en animales tratados con
TNF-\alpha. En consecuencia, la capacidad de
inhibir el MIF y proteger a los animales tratados con TNF indica que
la neutralización de MIF durante la fase postaguda final del choque
séptico podría ser eficaz.
Como aquí se indica, los niveles de
TNF-\alpha e IL-1\beta se
correlacionan al menos en algunos casos con los niveles de MIF. En
consecuencia, una pequeña molécula anti-MIF podría
ser útil en diversos estados de enfermedades asociadas con el
TNF-\alpha y/o IL-1\beta,
incluyendo el rechazo de trasplantes, elementos inmunomediados e
inflamatorios de las enfermedades del sistema nervioso central (por
ej., Alzheimer, Parkinson, esclerosis múltiple, etc.), distrofia
muscular, enfermedades de la hemostasis (por ej., coagulopatía,
enfermedades veno-oclusivas, etc.), neuritis
alérgica, granuloma, diabetes, enfermedad injerto contra huésped,
lesiones renales crónicas, alopecia (pérdida del cabello),
pancreatitis aguda, enfermedades de las articulaciones,
insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedades cardiovasculares
(restenosis, ateroesclerosis), enfermedades de las articulaciones y
osteoartritis.
Más aún, pruebas adicionales en este campo
indican que, aunque los esteroides son inhibidores potentes de la
producción de citoquina, éstos aumentan la expresión de MIF. Yang
et al., Mol. Med. 4(6):413-424, 1998;
Mitchell et al., J. Biol. Chem. 274(25):
18100-18106, 1999; Calandra y Bucala, Crit. Rev.
Immunol. 17(1):77-88, 1997; Bucala, FASEB J.
10(14): 1607-1613, 1996. En consecuencia, el
empleo de inhibidores del MIF podría ser de utilidad especial en
combinación con la terapia esteroide para el tratamiento de
condiciones patofisiológicas mediadas por citoquina, como
inflamación, choque y otros estados patológicos mediados por
citoquina, especialmente en estados inflamatorios crónicos como
artritis reumatoide. Esta terapia de combinación podría ser
beneficiosa aun después del inicio de las respuestas patogénicas u
otras respuestas inflamatorias. Por ejemplo, en la situación
clínica, se ha demostrado que la administración de esteroides
después del inicio de los síntomas de choque séptico tiene pocos
beneficios. Véase Bone et al, N. Engl. J. Med.
317:653-658, 1987; Spring et al., N. Engl. J.
Med. 311:1137-1141, 1984. Puede emplearse la
terapia de combinación esteroide-inhibición del MIF
para superar este obstáculo. Además, aquellos versados en el área
entenderán que dichas terapias podrían diseñarse específicamente
para inhibir la producción y/o actividad de MIF local y/o
sistemáticamente.
\vskip1.000000\baselineskip
La efectividad de un compuesto como inhibidor
del MIF puede determinarse mediante diversos métodos de ensayo. Los
inhibidores adecuados de las realizaciones preferidas pueden
disminuir una o más actividades asociadas con el MIF y/o la
exportación del mismo. Puede evaluarse la actividad como inhibidor
del MIF de un compuesto con estructura (Ia) o (Ib) o cualquier otra
estructura mediante uno o más ensayos generalmente aceptados para
ello, incluyendo (pero sin limitarse a ello) los ensayos descritos a
continuación.
Los ensayos pueden dividirse generalmente en
tres categorías: los que monitorizan la exportación, los que
monitorizan el enlace efector o moléculas pequeñas y los que
monitorizan la actividad del MIF. Sin embargo, debe señalarse que
las combinaciones de estos ensayos se encuentran dentro del ámbito
del documento actual. Sorprendentemente, parece que el mapeo de
epítopes del MIF actúa como sustituto de la actividad biológica. Por
ejemplo, en un ensayo la presencia de un inhibidor candidato bloquea
la detección de la exportación del MIF de las células (por ej.,
células THP-1) medida usando un anticuerpo
monoclonal como el que puede obtenerse comercialmente en R&D
Systems (Minneapolis, Minnesota, EE.UU.), mientras que un anticuerpo
policlonal demuestra la presencia del MIF. Más aún, pueden emplearse
ensayos celulares o in vitro para demostrar que estos
inhibidores potenciales inhiben la actividad del MIF.
Alternativamente, estos dos ensayos (esto es, ensayos de enlace y
actividad) pueden combinarse en un análisis único que detecta el
enlace de un compuesto de prueba (por ej., la capacidad de desplazar
anticuerpos monoclonales o inhibir su enlace), mientras que también
afectan la actividad del MIF. Estos ensayos incluyen la combinación
de un ensayo de tipo ELISA (o un ensayo de enlace similar) con un
ensayo de tautomería del MIF o un ensayo funcional similar. Como
cualquiera con conocimientos normales en este campo podrá reconocer
fácilmente, el ensayo exacto empleado es irrelevante, siempre y
cuando pueda detectarse la capacidad del compuesto de interés de
unirse al MIF. Además, el ensayo preferiblemente detectará la
capacidad de un compuesto de inhibir una actividad del MIF debido a
que selecciona compuestos que interactúan con el MIF biológicamente
activo y no con el MIF inactivo.
También deberá entenderse que los compuestos que
demuestran la capacidad de inhibir el enlace de anticuerpos
monoclonales al MIF biológicamente activo y no al inactivo (por ej.,
molécula pequeña inhibida), necesariamente indican la presencia de
un compuesto (por ej., una molécula pequeña) que está interactuando
con el MIF, ya sea de una manera que cambia la conformación del MIF
o que bloquea un epítope necesario para el enlace a anticuerpos. En
otras realizaciones, también puede reconocerse la actividad
inhibidora del MIF como consecuencia de interferir con la formación
de un complejo polipeptídico que incluye al MIF; la perturbación de
un complejo de este tipo podría resultar en un cambio en la
conformación que inhibe la detección. Por consiguiente, el empleo de
ensayos que monitorizan los cambios en la conformación del MIF
presenta ventajas cuando se emplea en adición a los ensayos que
miden la competencia entre compuestos, como pequeñas moléculas con
mAb o como reemplazo de un ensayo como éste. Se conocen en este
campo diversos ensayos de este tipo, entre los que figuran la
calorimetría, el dicroísmo circular, la transferencia de energía
fluorescente, la dispersión luminosa, la resonancia magnética
nuclear (RMN), la resonancia de plasmón superficial, los ensayos de
centelleo por proximidad (véase Patente estadounidense nº 5,246,869)
y similares. Véase también WO02/07720-A1 y
WO97/29635-A1. Por consiguiente, una persona versada
en el campo reconocerá que puede emplearse cualquier ensayo que
indique enlace y preferentemente un cambio en la conformación o
posicionamiento cerca del sitio activo del MIF. A continuación se
suministran descripciones de varios de los ensayos de proximidad y
de conformación más complejos, esta discusión sirve simplemente como
ejemplo y no deberá interpretarse de manera alguna como limitante
del tipo de técnicas que pueden emplearse en las realizaciones
preferidas.
En un ejemplo, podrá emplearse el dicroísmo
circular para determinar el enlace inhibidor del candidato. El
dicroísmo circular (DC) se basa parcialmente en que la mayoría de
las macromoléculas de las proteínas biológicas están formadas por
unidades monoméricas asimétricas, L-aminoácidos, de
manera que todas poseen el atributo de la actividad óptica. Además,
las estructuras rígidas como el ADN o un polipéptido helicoidal alfa
poseen propiedades ópticas que pueden medirse empleando el sistema
espectroscópico apropiado. De hecho, los grandes cambios en un
parámetro espectroscópico fácilmente mensurable pueden ofrecer
medios selectivos para la identificación de estados conformacionales
y cambios en los estados conformacionales en diversas
circunstancias, y algunas veces para observar la perturbación de
grupos únicos en la macromolécula o unidos a ella. Más aún, se han
empleado frecuentemente los análisis por DC para determinar las
interacciones de diversas macromoléculas con pequeñas moléculas y
ligandos. Véase Durand et al, Eur. Biophys. J.
27(2):147-151, 1998; Kleifeld et al, Biochem.
39(26):7702-7711, 2000; Bianchi et al.,
Biochem. 38(42): 13844-13852, 1999; Sarver et
al., Biochim. Biophys. Acta 1434(2):304-316,
1999.
El principio de Pasteur establece que una
molécula ópticamente activa puede ser asimétrica; es decir, la
molécula y su imagen especular no pueden superponerse. La luz
polarizada plana es una combinación de luz polarizada circularmente
a la izquierda y luz polarizada circularmente a la derecha que
viajan en fase. La interacción de esta luz con una molécula
asimétrica produce una interacción preferencial de un componente
polarizado circularmente que, en una región de absorción, se ve como
una absorción diferencial (esto es, un dicroísmo). Véase Urry, D.W.,
Spectroscopic Approaches to Biomolecular Conformation, American
Medical Association Press, Chicago, III, págs.
33-120 (1969); Berova y Woody, Circular Dichroism:
Principies and Applications, John Wiley & Sons, N.Y.,
(2000).
Por consiguiente, el dicroísmo circular es un
fenómeno de absorción que ocurre cuando un cromóforo interacciona
con una luz polarizada plana con una longitud de onda específica. La
banda de absorción puede ser negativa o positiva, dependiendo de la
absorción diferencial de los componentes derecho e izquierdo de la
luz circularmente polarizada para ese cromóforo. A diferencia de la
dispersión óptica rotatoria (DOR) en donde se determinan las
contribuciones del fondo y el cromóforo de interés a muchas
milimicras de la región verdadera de interacción de la luz, el DC
ofrece la ventaja de medir los eventos ópticos a la longitud de onda
a la que el evento ocurre. Por consiguiente, el dicroísmo circular
es específico para la transición electrónica del cromóforo. Véase
Berova y Woody, Circular Dichroism: Principies and Applications,
John Wiley & Sons, N.Y., (2000).
La aplicación del dicroísmo circular a
soluciones de macromoléculas permite identificar los estados
conformacionales (Berova y Woody, Circular Dichroism: Principies and
Applications, John Wiley & Sons, N.Y., (2000)). La técnica puede
distinguir entre estados conformacionales de espiral aleatoria,
hélice alfa y cadena beta de las macromoléculas. En las proteínas,
las proteínas fibrosas con conformación helicoidal alfa muestran
curvas de absorción que se parecen bastante a las de los
polipéptidos helicoidales alfa; mientras que en las proteínas
globulares de estructura conocida, como lisozima y ribonucleasa, las
estructuras helicoidales no coinciden bien con los resultados
obtenidos por cristalografía de rayos X. Una fuente adicional de
dificultad en las proteínas globulares es la preponderancia de
cromóforos aromáticos en las moléculas alrededor de 280 nm. Se ha
demostrado un ejemplo interesante de cambios helicoidales usando
mioglobina y apomioglobina. Después de eliminar el grupo prostético
heme, la apoproteína restante presenta una reducción de la
elipticidad residual del dicroismo circular del 25%. Esta pérdida de
la hélice se atribuye a la apertura de 0-15 residuos
en la molécula. Otros cromóforos ópticamente activos no peptídicos
incluyen: tirosina, triptofano, fenilalanina y cisteína, cuando se
encuentran localizados en la secuencia primaria de aminoácidos de
una macromolécula. Los ejemplos de elipticidades no peptídicas
incluyen la transición disulfuro en la ribonucleasa y las
transiciones cisteína en la insulina.
Por consiguiente, puede emplearse el dicroísmo
circular para investigar la capacidad de los inhibidores candidatos
de afectar la conformación del MIF.
En ciertas realizaciones proporcionadas en el
presente, el agente de enlace del MIF o formación del complejo
inhibidor podría determinarse detectando la presencia de un complejo
que incluye MIF y un agente de enlace detectablemente marcado. Como
se describe más detalladamente a continuación, la detección de la
señal de energía fluorescente, por ejemplo, por polarización
fluorescente, proporciona la determinación de los niveles de señal
que representan la formación de un complejo molecular del agente de
enlace del MIF. En consecuencia, y como aquí se indica, la
comparación basada en la señal de energía fluorescente de la
formación del complejo del agente de enlace al MIF en ausencia y
presencia de un inhibidor candidato ofrece un método de
identificación para determinar si el agente altera la interacción
entre el MIF y el agente de enlace. Por ejemplo, el agente de enlace
podría ser un sustrato del MIF, un anticuerpo
anti-MIF o un inhibidor conocido, mientras que el
inhibidor candidato podría ser el compuesto a analizarse o
viceversa.
Como se indicó anteriormente, ciertas
realizaciones preferidas también están relacionadas en parte con la
determinación basada en la señal de energía fluorescente de la
formación del complejo del agente de enlace al MIF. La detección de
la señal de la energía fluorescente podría ser, por ejemplo,
mediante polarización fluorescente o por transferencia de la energía
de resonancia fluorescente, o por algún otro método de fluorescencia
reconocido en el campo. Como un ejemplo de algunas otras
realizaciones, el polipéptido MIF podría marcarse, al igual que el
inhibidor candidato, y podría comprender un par
donador-aceptor de una molécula de transferencia de
energía, y se determinaría el nivel de transferencia de la energía
de resonancia fluorescente entre el donador de energía y el aceptor
de la misma.
En ciertas realizaciones, el inhibidor candidato
y/o el agente de enlace se marca detectablemente, y en especial, en
las realizaciones particularmente preferidas el inhibidor candidato
y/o agente de enlace puede generar una señal de energía
fluorescente. El inhibidor candidato y/o agente de enlace pueden
marcarse detectablemente mediante el enlace covalente o no covalente
de una molécula o grupo marcador adecuado, por ejemplo cualquiera de
varios materiales fluorescentes (por ej., un fluoróforo)
seleccionado dependiendo de la técnica particular de energía
fluorescente que va a emplearse, como se reconoce en el campo y
basándose en los métodos descritos en el presente. Los grupos
marcadores fluorescentes y los métodos suministrados aquí pueden
encontrarse, por ejemplo, en Haugland (1996 Handbook of
Fluorescent Probes and Research Chemicals - Sexta edición,
Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.; 1999 Handbook of
Fluorescent Probes and Research Chemicals - Séptima edición,
Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.,
http:///www.probes.com/lit/), y las referencias citadas en el mismo.
Particularmente preferidas para el empleo como fluoróforo en las
realizaciones preferidas son: fluoresceína, rodamina, rojo de Tejas,
AlexaFluor-594, AlexaFluor-488,
Oregon Green, BODIPY-FL y Cy-5. Sin
embargo, podrá emplearse cualquier fluoróforo adecuado, y en ciertas
realizaciones podrán usarse fluoróforos diferentes a los enumerados
anteriormente.
Como se indica en el presente, una señal de
energía fluorescente incluye cualquier evento de emisión,
excitación, transferencia de energía, extinción y su proceso inverso
(quenching y dequenching) de la fluorescencia o similares.
Típicamente, una señal de energía fluorescente puede mediarse
mediante un inhibidor candidato detectablemente marcado fluorescente
y/o un agente de enlace como respuesta a la luz de una longitud de
onda apropiada. Brevemente, y sin querer estar restringidos por la
teoría, la generación de una señal de energía fluorescente
generalmente implica la excitación de un fluoróforo por una fuente
apropiada de energía (por ej., luz de una longitud de onda apropiada
para el grupo marcador fluorescente seleccionado, o fluoróforo) que
transitoriamente eleva el estado de energía del fluoróforo de un
estado basal a un estado excitado. El fluoróforo excitado a su vez
emite energía en la forma de luz detectable que típicamente tiene
una longitud de onda diferente (por ej. generalmente más larga) que
la preferida para la excitación, y al así hacerlo regresa a su
estado basal de energía. Los métodos de las realizaciones preferidas
consideran el empleo de cualquier señal de energía fluorescente,
dependiendo del fluoróforo particular, el método de marcado del
sustrato y los instrumentos de detección, que pueden seleccionarse
fácilmente y sin experimentación excesiva según los criterios con
los que están familiarizados aquellos versados en el campo.
En ciertas realizaciones, la señal de energía
fluorescente es una señal de polarización fluorescente (PF). En
otras realizaciones, la señal de energía fluorescente puede ser una
señal de transferencia de energía de resonancia fluorescente (TERF).
En otras realizaciones preferidas, la señal de energía fluorescente
puede ser una señal de extinción de la fluorescencia (EF) o una
señal de espectroscopia de resonancia fluorescente (ERF). (Para
mayor información sobre PF, TERF, EF y ERF véase, por ejemplo,
WO97/39326; WO99/29894; Haugland, Handbook of Fluorescent Probes
and Research Chemicals, 6ª edición, 1996, Molecular Probes,
Inc., Eugene, OR, pág. 456; y las referencias citadas en los
mismos).
PF, una medida del desplazamiento angular
promedio (debido a la difusión rotacional molecular) de un
fluoróforo que ocurre entre su absorción de un fotón de una fuente
de energía y su emisión posterior de un fotón, depende del grado y
tasa de la difusión rotacional durante el estado excitado del
fluoróforo, del tamaño y forma moleculares, de la viscosidad de la
solución y de la temperatura de la solución (Perrin, 1926, J.
Phys. Rad. 1:390). Cuando se mantienen constantes la viscosidad
y temperatura, PF está directamente relacionada con el volumen
molecular aparente o tamaño del fluoróforo. El valor de polarización
es una relación de las intensidades de la fluorescencia medidas en
planos diferentes (por ej., vertical y horizontal) y por lo tanto es
una cantidad adimensional que no es afectada por la intensidad del
fluoróforo. Los fluoróforos de bajo peso molecular, como el
inhibidor candidato detectablemente marcado y/o el agente de enlace
aquí proporcionados, son capaces de una rotación molecular rápida en
solución (esto es, baja anisotropía) y por lo tanto producen bajas
lecturas de polarización fluorescente. Sin embargo, cuando se unen
para formar complejos con moléculas de peso molecular más alto como
el MIF, como aquí se indica, el grupo fluoróforo del sustrato se
asocia con un complejo que exhibe una rotación molecular
relativamente lenta en solución (esto es, alta anisotropía),
produciendo lecturas de polarización fluorescente más altas.
Esta diferencia en el valor de la polarización
del inhibidor candidato detectablemente marcado libre y/o agente de
enlace en comparación con el valor de polarización del complejo del
MIF:inhibidor candidato y/o agente de enlace puede emplearse para
determinar la relación entre los que han formado complejos (esto es,
unidos) y los libres. También puede emplearse esta diferencia para
detectar la influencia de un agente candidato (esto es, inhibidor
candidato) sobre la formación de estos complejos y/o sobre la
estabilidad de un complejo pre-formado, por ejemplo,
comparando el PF detectado en ausencia de un agente con el PF
detectado en presencia de dicho agente. Pueden hacerse las
mediciones de PF sin separación de los componentes de reacción.
Como se señaló anteriormente, en un aspecto de
una realización preferida se emplea el enlace o desplazamiento de un
anticuerpo monoclonal, inhibidor conocido u otro agente de enlace
y/o formación de un complejo del inhibidor candidato con MIF para
proporcionar un método de identificación de un inhibidor que altera
la actividad del MIF. Sorprendentemente, los inhibidores de las
realizaciones preferidas se identificaron de esta forma tan poco
convencional. En este sentido, una clase de compuestos demostró la
capacidad de inhibir/disminuir el enlace de anticuerpos monoclonales
a un MIF biológicamente activo que se produce naturalmente en
células, sin afectar la capacidad del anticuerpo para reconocer al
MIF inactivo (recombinante) (a la venta en fuentes comerciales) y
también demuestra una modulación pronunciada de la actividad del MIF
in vivo. Por consiguiente, podría preferirse el enlace de
anticuerpos como sustituto de la actividad enzimática, eliminando
así la necesidad de hacer ensayos enzimáticos complejos y caros con
cada compuesto candidato. Como aquellos versados en el campo podrán
apreciar fácilmente, la posibilidad de evitar hacer ensayos
enzimáticos lleva a un ensayo que podría ser muy adecuado para el
uso abundante en la producción.
Asimismo, aquellos con conocimientos normales en
este campo podrán apreciar fácilmente que un ensayo de este tipo
podría emplearse fuera del contexto del MIF y cualquier actividad
enzimática o biológica podría reemplazarse con un ensayo de enlace.
Por ejemplo, podría preferirse cualquier enzima u otro polipéptido
cuya forma biológicamente activa sea reconocida por un anticuerpo
monoclonal que no reconozca la forma inactiva (por ej., forma
inhibida de una molécula pequeña). Dentro del contexto de una
enzima, el anticuerpo monoclonal puede enlazarse al sitio activo,
pero ser desplazado por una molécula pequeña. Así, cualquier
molécula pequeña que desplace al anticuerpo podría ser un líder
importante como inhibidor enzimático. Como aquellos versados en el
campo podrán apreciar, el anticuerpo podría reconocer un epítope que
cambia conformación dependiendo del estado activo de la enzima, y
que el enlace de una molécula pequeña de manera que evite el enlace
del anticuerpo a este epítope también podría actuar como sustituto
de la actividad enzimática aún cuando el epítope podría no estar en
el sitio activo. Por consiguiente, el tipo de ensayo empleado en el
presente podría expandirse para fundamentalmente emplearse con
cualquier polipéptido donde el desplazamiento del anticuerpo predice
la pérdida de actividad. Así, en su forma más sencilla, podría
emplearse cualquier polipéptido, por ej., la enzima y su anticuerpo
neutralizante asociado, para detectar moléculas pequeñas que
desplazan este anticuerpo, identificándolas así como inhibidores
probables.
Podrá identificarse un complejo inhibidor agente
de enlace del MIF usando diversas técnicas conocidas en el campo
para demostrar la interacción intermolecular entre MIF y otra
molécula como se ha descrito anteriormente, por ejemplo,
co-purificación, co-precipitación,
co-inmunoprecipitación, ensayos radiométricos o
fluorométricos, análisis por inmunoblot Western, captura por
afinidad, incluyendo técnicas de afinidad como técnicas de ligando
en fase sólida-sorbente contraligando, cromatografía
de afinidad y resonancia de plasmón superficial de afinidad, RMN y
similares (véase por ej., patente estadounidense nº 5.352.660). Para
la determinación de la presencia de un complejo de este tipo se
pueden emplear anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales,
policlonales, quiméricos y de cadena sencilla y similares, que
específicamente se enlazan al MIF o al agente de enlace.
También pueden emplearse inhibidores del MIF y/o
agentes de enlace marcados/inhibidores candidatos para detectar la
presencia de un complejo. La molécula de interés puede marcarse
mediante el enlace covalente o no covalente a una molécula o grupo
marcado adecuadamente, por ejemplo una de varias enzimas, materiales
fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos.
Entre los ejemplos de enzimas adecuadas figuran, pero sin limitarse
a ellos, peroxidasa del rábano picante, fosfatasa alcalina,
\beta-galactosidasa y acetilcolinesterasa. Entre
los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados figuran, pero sin
limitarse a ellos, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro
de dansilo, ficoeritrina, rojo de Tejas,
AlexaFluor-594, AlexaFluor-488,
Oregon green, BODIPY-FL y Cy-5. Los
materiales luminiscentes apropiados incluyen, pero sin limitarse a
ellos, luminol y los materiales radioactivos adecuados incluyen
fósforo [^{32}P], yodo [^{125}I o ^{131}I] o tritio [^{3}H]
radioactivos.
El MIF y el agente de enlace y/o el candidato
inhibidor se combinan bajo condiciones y por un tiempo suficiente
para permitir la formación de un complejo intermolecular entre los
componentes. Las condiciones adecuadas para la formación de dichos
complejos se conocen en el campo y pueden determinarse fácilmente
basándose en los principios que se muestran en el presente,
incluyendo las condiciones de solución y los métodos de detección de
la presencia de un complejo y/o la detección del sustrato libre en
solución.
La asociación de un agente(s) de enlace
detectablemente marcado y/o un inhibidor(es) candidato en un
complejo con MIF, y/o agente de enlace o inhibidor candidato que no
es parte de dicho complejo, podría identificarse según una
realización preferida mediante la detección de una señal de energía
fluorescente generada por el sustrato. Típicamente, se selecciona
una fuente de energía para la detección de una señal de energía
fluorescente siguiendo los criterios con los que están
familiarizados los expertos con conocimientos normales del campo,
dependiendo del grupo marcado fluorescente con el que se ha marcado
el sustrato. La solución de prueba, que contiene (a) MIF y (b) el
agente de enlace detectablemente marcado y/o inhibidor candidato, se
expone a la fuente de energía para generar una señal de energía
fluorescente, que se detecta por cualquiera de varios de los
instrumentos reconocidos y se identifica según la señal de energía
fluorescente particular. En realizaciones preferidas, la señal de
energía fluorescente es una señal de polarización fluorescente que
puede detectarse usando un espectrofluorímetro equipado con filtros
polarizadores. En realizaciones particularmente preferidas, el
ensayo de polarización fluorescente se hace simultáneamente en cada
una de las muchas cámaras de reacción que pueden leerse usando un
lector de placas LJL CRITERION^{TM} Analyst (LJL Biosystems,
Sunnyvale, California, EE.UU.), por ejemplo, para proporcionar una
pantalla de alta producción (HTS) que tenga componentes o
condiciones variados de reacción entre las diferentes cámaras de
reacción. Entre los ejemplos de otros instrumentos adecuados para
obtener lecturas de polarización de la fluorescencia se encuentran
POLARSTAR^{TM} (BMG Lab Technologies, Offenburg, Alemania),
BEACON^{TM} (Panvera, Inc., Madison, Wisconsin, EE.UU.) y los
instrumentos POLARION^{TM} (Teean Inc., Research Triangle Park,
Carolina del Norte, EE.UU.).
Puede hacerse la determinación de la presencia
de un complejo que se ha formado entre MIF y un agente de enlace y/o
un inhibidor candidato usando diversos métodos, como se indicó
anteriormente, incluyendo la metodología de la señal de energía
fluorescente aquí indicada y como se reconoce en el campo. Estas
metodologías pueden incluir, como ilustración y no como limitación,
PF, TERF y EF, otros ensayos fluorimétricos,
co-purificación, co-precipitación,
co-inmunoprecipitación, análisis radiométrico, por
inmunoblot Western, de captura de afinidad incluyendo técnicas de
afinidad tales como técnicas de ligando de fase
sólida-sorbente contraligando, cromatografía por
afinidad y resonancia de plasmón superficial de afinidad, dicroismo
circular y similares. Sobre éstas y otras técnicas de afinidad
útiles, consultar, por ejemplo, Scopes, R.K., Protein
Purification: Principies and Practice, 1987,
Springer-Verlag, NY; Weir, D.M., Handbook of
Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston; y
Hermanson, G.T. et al, Immovilized Affinity Ligand
Techniques, 1992, Academic Press, Inc. California; los que se
incorporan en el presente como referencia en su totalidad, con
respecto a la información sobre las técnicas de aislamiento y
caracterización de complejos, incluyendo las técnicas de afinidad.
En varias realizaciones, el MIF puede interaccionar con un agente de
enlace y/o inhibidor candidato a través de un enlace específico si
el MIF se une al agente de enlace y/o inhibidor candidato con un
K_{a} mayor o igual a aproximadamente 10^{4} M^{-1},
preferiblemente mayor o igual a aproximadamente 10^{5} M^{-1},
más preferiblemente mayor o igual a aproximadamente 10^{6}
M^{-1}, y aún más preferiblemente mayor o igual a aproximadamente
10^{7} M^{-1} a 10^{11} M^{-1}. Las afinidades de las
entidades de enlace pueden calcularse fácilmente a partir de los
datos generados según las metodologías de señal de energía
fluorescente descritas anteriormente y usando técnicas
convencionales de procesamiento de datos, por ejemplo, las descritas
en Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci.
51:660(1949).
Por ejemplo, en varias realizaciones donde la
señal de energía fluorescente es una señal de polarización
fluorescente, puede determinarse la anisotropía fluorescente (en luz
polarizada) del inhibidor candidato detectablemente marcado libre
y/o agente de enlace, en ausencia del MIF, y puede determinarse la
anisotropía fluorescente (en luz polarizada) del sustrato
completamente enlazado en presencia de una cantidad titulada de MIF.
La anisotropía fluorescente en luz polarizada varía como función de
la cantidad de movimiento rotacional que el inhibidor candidato
marcado y/o el agente de enlace padece durante el período de vida
del estado excitado del fluoróforo, de manera que las anisotropías
del inhibidor candidato libre y completamente enlazado y/o agente de
enlace pueden emplearse con éxito para determinar la fracción del
inhibidor candidato y/o agente de enlace unido al MIF en una serie
definida de condiciones experimentales, por ejemplo, aquellas donde
está presente un agente candidato (ver, por ej., Lundblad et
al, 1966, Molec. Endocrinol. 10:607; Dandliker et
al., 1971, Immunochem. 7:799; Collett, E., Polarized
Light: Fundamentáis and Applications, 1993 Marcel Dekker, Nueva
York).
Algunas de las realizaciones preferidas se
refieren en parte al empleo de la transferencia de energía
intermolecular para monitorizar la formación y estabilidad del
complejo entre el MIF y el agente de enlace y/o formación del
complejo entre el MIF y el inhibidor candidato.
La transferencia de energía (TE) se genera a
partir de una interacción de resonancia entre dos moléculas: una
molécula "donadora" que contribuye a la energía y una molécula
"aceptora" que recibe energía. La transferencia de energía
puede ocurrir cuando (1) el espectro de emisión del donador coincide
en parte con el espectro de absorción del aceptor y (2) el donador y
el aceptor están dentro de cierta distancia (por ejemplo, menos de
unos 10 nm) entre sí. La eficiencia de la energía de transferencia
está dictada en gran medida por la proximidad entre el donador y el
aceptor, y disminuye como una potencia de 6 con la distancia. Por lo
tanto, las mediciones de TE reflejan decididamente la proximidad
entre los compuestos aceptor y donador, y los cambios en la
sensibilidad de TE reflejan los cambios en la proximidad de los
compuestos, tales como, por ejemplo, la asociación o disociación del
donador y el aceptor.
Por consiguiente, es un aspecto de una
realización particularmente preferida ofrecer un método para el
ensayo de un inhibidor candidato del MIF, en la parte pertinente,
mediante el contacto del MIF o complejo MIF con el agente de enlace,
incluyendo una o más moléculas donadoras de TE y una molécula
aceptora de TE, excitando el donador de TE para producir una
molécula donadora TE excitada y detectando una señal generada
mediante la transferencia de energía del donador TE al aceptor TE.
Como también se indica aquí, se puede emplear en el método cualquier
molécula donadora TE y molécula aceptora TE adecuadas que puedan
funcionar como un par donador-aceptor.
En ciertas realizaciones preferidas, una señal
detectable que es generada por la transferencia de energía entre las
moléculas donador y aceptor de TE proviene de la transferencia de
energía de resonancia fluorescente (TERF), como se discutió
anteriormente. TERF ocurre dentro de una molécula, o entre dos tipos
diferentes de molécula, cuando la energía de un fluoróforo donador
excitado se transfiere directamente a un fluoróforo aceptor (véase
una revisión sobre el tema en: Wu et al., Analytical Biochem.
218:1-13, 1994).
En otros aspectos de las realizaciones
preferidas, se ensaya la capacidad de un inhibidor candidato de
llevar a cabo la exportación del MIF.
El primer paso de un ensayo de este tipo se hace
con el fin de detectar el MIF extracelularmente. Para este ensayo,
se emplean células de ensayo que expresan el MIF (por ej., células
THP-1). Las células de ensayo pueden producir
naturalmente la proteína o producirla a partir de un vector de
expresión transfectado. Las células de ensayo preferiblemente
expresan normalmente la proteína, de manera que la transfección
simplemente aumenta los niveles expresados. Por lo tanto, para la
expresión del MIF e ILP-1 se prefieren las células
THP1. Cuando se ensayan las proteínas derivadas de un virus, como
tat del VIH, si las células de ensayo no producen
"naturalmente" la proteína, pueden transfectarse fácilmente
usando un vector apropiado, de manera que las células de ensayo
expresen la proteína deseada, como lo apreciarán fácilmente aquellos
versados en este campo.
Después de la expresión, se detecta MIF mediante
uno de los muchos métodos y procedimientos reconocidos. Dichos
métodos incluyen la tinción con anticuerpos en conjunción con la
citometría de flujo, microscopía confocal, análisis de la imagen,
inmunoprecipitación del citosol o medio celular, Western blot del
medio celular, ELISA, análisis 1- ó 2-D del gel,
HPLC, o bioensayo. Un ensayo conveniente para la investigación
inicial es ELISA. La exportación del MIF puede confirmarse mediante
uno de los otros ensayos, preferiblemente por inmunoprecipitación de
medio celular después del marcado metabólico. Brevemente, las
células que expresan la proteína MIF se marcan por pulso radioactivo
durante 15 minutos con ^{35}S-metionina y/o
^{35}S-cisteína en un medio que no contiene
metionina y/o cisteína y después en medio suplementado con un exceso
de metionina y/o cisteína. Se recogen las fracciones del medio y se
clarifican por centrifugación, como por ejemplo en una microfuga. Al
medio clarificado se añade un tampón de lisis que contiene 1%
NP-40, 0,5% desoxicolato (DOC), 20 mM Tris, pH 7,5,
5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 10 nM PMSF, 10 ng/ml aprotinina, 10 ng/ml
leupeptina y 10 ng/ml pepstatina. Se añade un anticuerpo del MIF y,
después de la incubación en frío, se añade un segundo anticuerpo
precipitante o proteína inmunoglobulina de enlace, como una proteína
A-Sepharose® o
GammaBind^{TM}-Sepharose®, para incubar
nuevamente. Al mismo tiempo, como control, se monitoriza una
proteína citosólica y se prefiere un anticuerpo a la proteína
citosólica en las inmunoprecipitaciones. Se hacen píldoras con los
inmunocomplejos y se lavan con tampón de lisis helado. Los complejos
se lavan adicionalmente con tampón IP helado (0,15 M NaCl, 10 mM
fosfato de sodio, pH 7,2, 1% DOC, 1% NP-40, 0,1%
SDS). Se eluyen directamente los inmunocomplejos en el tampón de
SDS-gel de la muestra y se someten a electroforesis
en SDS-PAGE. Se procesa el gel para la fluorografía,
se seca y se expone a una película radiográfica. Alternativamente,
las células pueden ser modificadas genéticamente para producir un
MIF que se marca con un marcador que en presencia de un MIF activo
puede detectarse a través de la actividad sustituta del
marcador.
Sin desear estar limitados por la teoría, se
piensa que los inhibidores actuales funcionan mediante la
interacción directa con el complejo MIF producido naturalmente hasta
alterar la conformación de la proteína lo suficiente como para
bloquear su actividad biológica. Puede asignarse esta interacción
mediante cristalografía de rayos X de los
co-cristales de MIF-compuesto para
determinar el sitio exacto de la interacción. Un sitio se encuentra
en el área responsable de la actividad tautomerasa del MIF.
Los ensayos de investigación de los inhibidores
de la exportación del MIF varían dependiendo del tipo del inhibidor
y la naturaleza de la actividad que está siendo afectada. Los
ensayos pueden hacerse in vitro o in vivo. En general,
los ensayos in vitro se diseñan para evaluar la actividad del
MIF, o multimerización, y los ensayos in vivo se diseñan para
evaluar la actividad del MIF, extracelular, y localización
intracelular en un modelo celular o sistema animal. En cualquiera de
los ensayos, un aumento o disminución estadísticamente significativo
en comparación con un control apropiado es indicativo de la mejora o
inhibición.
Puede hacerse un ensayo in vitro mediante
el examen del efecto de un compuesto candidato sobre la capacidad
del MIF de inhibir la migración de macrófagos. Brevemente, se
prefieren los monocitos de la sangre periférica humana como células
indicadoras en un sistema de ensayo de gotitas de agarosa
fundamentalmente como se describe en Weiser et al, Cell. Immunol
90:167-178, 1985 y Harrington et al, J.
Immunol 110:152-159, 1973. También pueden
emplearse otros sistemas de ensayo para el análisis de la migración
de macrófagos. Un ensayo de este tipo se describe en Hermano
wski-Vosatka et al., Biochem.
38:12841-12849, 1999.
Un ensayo in vitro alternativo se diseño
para determinar la capacidad del MIF de catalizar la tautomerización
del isómero D de dopacromo (véase Rosengren et al., Mol. Med.,
2:143-149, 1996; Winder et al, J. Cell Sci.
106:153-166, 1993; Aroca et al, Biochem. J.,
277:393-397). Brevemente, en este método, el
D-dopacromo se suple al MIF en presencia y ausencia
de un inhibidor candidato y se monitoriza la capacidad de catalizar
la tautomerización al ácido
5,6-dihidroxiindol-2-carboxílico
(DHICA). Sin embargo, podría preferirse el empleo de ésteres
metílicos de D-dopacromo, ya que se observa una
velocidad de reacción más rápida. Puede detectarse la
tautomerización usando uno de varios métodos estándar.
En un ensayo parecido, puede determinarse la
capacidad del MIF de catalizar la tautomerización del fenilpiruvato
(véase Johnson et al, Biochem. 38(48):
16024-16033, 1999). Brevemente, en este método se
sigue por espectroscopia la cetonización típica del fenilpiruvato o
(p-hidroxifenil)piruvato. Adicionalmente,
podrá verificarse la formación de un producto mediante el
tratamiento de estos compuestos con MIF y la conversión posterior al
malato para el análisis por ^{1}H RMN.
Los ensayos in vivo pueden hacerse en
células transfectadas de forma transitoria o estable con un vector
de expresión que contiene una molécula de ácido nucleico MIF, como
las que se describen en el presente. Se prefieren estas células para
medir la actividad del MIF (por ej., modulación de la apoptosis,
proliferación, etc.) o localización extracelular e intracelular en
presencia o ausencia de un compuesto candidato. Al hacerse el ensayo
por apoptosis, pueden emplearse varios análisis celulares,
incluyendo, por ejemplo, tinción y microscopia para examinar la
fragmentación del ácido nucleico y la porosidad de las células.
Pueden hacerse otros ensayos en sistemas
celulares modelo o animal, proporcionando al sistema una forma
recombinante o de ocurrencia natural del MIF o induciendo la
expresión endógena del MIF en presencia o ausencia del compuesto de
prueba, determinando así un aumento o disminución significativamente
estadístico en la patología de ese sistema. Por ejemplo, puede
emplearse LPS para inducir una respuesta de choque tóxico.
Los ensayos que se han descrito brevemente en
este documento pueden emplearse para identificar un inhibidor que es
específico para el MIF.
En cualquiera de los ensayos aquí descritos, una
célula de prueba puede expresar naturalmente el MIF (por ej.,
células THP-1) o después de la introducción de una
molécula recombinante de ADN que codifica la proteína. Los
protocolos para la trasfección y transformación se reconocen en el
campo e incluyen la transfección mediada por Ca_{2}PO_{4},
electroporación, infección con un vector viral, transfección mediada
por DEAE-dextrano y similares. Como alternativa a
las proteínas descritas anteriormente, pueden emplearse proteínas
MIF quiméricas (esto es, la fusión de la proteína MIF con otra
proteína o fragmento proteínico) o secuencias de proteína
modificadas genéticamente para que no contengan una secuencia líder.
Igualmente, puede construirse una fusión para que dirija la
secreción, exportación o retención citosólica. Cualquiera y todas
estas secuencias pueden emplearse en un constructo de fusión con MIF
para ayudar a ensayar los inhibidores. La célula huésped puede
también expresar MIF como resultado de estar enferma, infectada con
un virus y similares. Se conocen bien las proteínas secretadas que
se exportan en virtud de una secuencia líder e incluyen la
gonadotropina coriónica humana (hCG\alpha), hormona de
crecimiento, factor de crecimiento hepatocito, transferrina, factor
de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular,
ovalbúmina y factor de crecimiento de tipo insulínico. Similarmente,
se conocen bien las proteínas citosólicas e incluyen neomicina,
fosfotransferasa, \beta-galactosidasa, actina y
otras proteínas citoesqueléticas y enzimas, como la proteína quinasa
A o C. Las proteínas citosólicas o secretadas más útiles son las que
se miden fácilmente en un ensayo conveniente, como ELISA. Las tres
proteínas (sin líder, secretadas y citosólicas) pueden
co-expresarse naturalmente, mediante
co-transfección en las células de prueba, o
transfectarse por separado en células huéspedes separadas. Más aún,
para los ensayos aquí descritos, las células pueden transformarse
establemente o expresar transitoriamente la proteína.
La inmunoprecipitación es un ensayo de este tipo
que puede emplearse para determinar la inhibición. Brevemente, las
células que expresan MIF naturalmente o a partir de un constructo de
vector introducido se marcan con ^{35}S-metionina
y/o ^{35}S-cisteína durante un tiempo corto,
típicamente 15 minutos o más, en medio de cultivo celular sin
metionina y/o cisteína. Después de marcarse por pulsos, se lavan las
células con medio suplementado con un exceso de metionina y cisteína
sin marcar más heparina si la proteína sin líder se enlaza a la
heparina. Las células se cultivan entonces en el mismo medio no
radioactivo (chase) durante diversos tiempos. Los inhibidores o
activadores candidatos se añaden a los cultivos en varias
concentraciones. Se recoge y clarifica el sobrenadante. Los
sobrenadantes se incuban con suero inmune anti-MIF o
un anticuerpo monoclonal, o con un anticuerpo
anti-tag si está presente un tag peptídico, seguido
de un reactivo de desarrollo como la cepa Cowan I de
Staphylococcus aureus, proteína A-Sepharose®,
o
Gamma-bind^{TM}-G-Sepharose®.
Se forman píldoras con los inmunocomplejos por centrifugación, se
lavan en un tampón que contiene 1% NP-40, 0,5%
desoxicolato, EGTA, PMSF, aprotinina, leupeptina y pepstatina.
Después, los precipitados se lavan con un tampón que contiene
fosfato de sodio pH 7,2, desoxicolato, NP-40 y SDS.
Los inmunocomplejos se eluyen con un tampón de muestra de gel SDS y
se separan con SDS-PAGE. El gel se procesa por
fluorografía, se seca y se expone a una película radiográfica.
Alternativamente, podría preferirse ELISA para
detectar y cuantificar la cantidad de MIF en los sobrenadantes
celulares. ELISA se prefiere para la detección en el examen de alto
rendimiento. Brevemente, las placas con 96 pocillos se recubren con
un anticuerpo anti-MIF o anticuerpo
anti-tag, se lavan y se bloquean con BSA al 2%.
Después, se añade el sobrenadante celular a los pocillos. Después de
la incubación y lavado, se añade un segundo anticuerpo (por ej., al
MIF). El segundo anticuerpo puede acoplarse a un reactivo de marcado
o detección, como una enzima o biotina. Después de la incubación
adicional, se añade un reactivo de revelado y se determina la
cantidad de MIF usando un lector de placas de ELISA. El reactivo de
revelado es un sustrato para la enzima acoplada al segundo
anticuerpo (típicamente un anticuerpo antiisótopo) o para la enzima
acoplada a estreptavidina. Las enzimas adecuadas son muy conocidas
en el campo e incluyen peroxidasa del rábano picante, que actúa
sobre un sustrato (por ej., ABTS), lo que ocasiona una reacción
colorimétrica. Se reconoce que en lugar de usar un segundo
anticuerpo acoplado a una enzima, el anticuerpo
anti-MIF podría acoplarse directamente a la
peroxidasa del rábano picante, u otro reactivo de detección
equivalente. Si se desea, los sobrenadantes celulares pueden
concentrarse para aumentar el nivel de detección. Más aún, los
métodos de detección, tales como ELISA y similares, pueden emplearse
para monitorizar los niveles intracelulares y extracelulares de MIF.
Cuando se desean los niveles intracelulares, se prefiere un lisado
celular. Cuando se desean los niveles extracelulares, pueden
revisarse los medios.
ELISA también puede adaptarse fácilmente para la
detección de muchos inhibidores o activadores candidatos con alto
rendimiento. Brevemente, un ensayo de este tipo se basa
convenientemente en las células y se hace con placas de 96 pocillos.
Las células de prueba que expresan natural o establemente el MIF se
ponen en las placas en un nivel suficiente para la detección del
producto expresado, como por ejemplo, unas 20.000 células/pocillo.
Sin embargo, si las células no expresan naturalmente la proteína, se
logra la expresión transitoria, como la electroporación o
transfección mediada por Ca_{2}PO_{4}. Para la electroporación,
se distribuyen 100 \mul de una mezcla de células (por ej., 150.000
células/ml) y ADN vector (5 \mug/ml) en pocillos individuales de
una placa de 96 pocillos. Se someten las células a electroporación
usando un aparato con un electrodo de 96 pocillos (por ej., ECM 600
Electroporation System, BTX, Genetronics, Inc.). Las condiciones
óptimas para la electroporación se determinan experimentalmente para
el tipo particular de célula huésped. Los parámetros típicos que se
varían son el voltaje, resistencia y longitud del pulso. Pueden
obtenerse directrices para la optimización de la electroporación de
los fabricantes o pueden encontrarse en los manuales de protocolo,
como Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et
al, (ed.), Wiley Interscience, 1987). Las células se diluyen con
un volumen igual de medio y se incuban por 48 horas. La
electroporación puede hacerse con diversos tipos de células,
incluyendo células mamíferas, células de levaduras, bacterias y
similares. Después de la incubación, se añade el medio con o sin
inhibidor y las células se incuban durante 1-2 días
más. En este momento, se colecta el medio de cultivo y se analiza la
proteína usando cualquiera de los ensayos suministrados en el
presente. Preferentemente, se emplea ELISA para detectar la
proteína. Se analiza una concentración inicial de 50 \muM. Si esta
cantidad proporciona una reducción estadísticamente significativa de
la exportación o reducción de la detección del Ab monoclonal, se
analiza adicionalmente al inhibidor candidato en una respuesta de
dosis.
Alternativamente, el sobrenadante concentrado
puede someterse a electroporación en un gel SDS-PAGE
y transferirse a un soporte sólido, como nylon o nitrocelulosa.
Entonces, se detecta el MIF mediante un inmunoblot (véase Harlow,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988), usando un anticuerpo al MIF que contiene un grupo
marcador isotópico o no isotópico. Estos grupos marcadores incluyen,
pero sin limitarse a ellos, enzimas, cofactores, colorantes,
radioisótopos, moléculas luminescentes, moléculas fluorescentes y
biotina. Preferiblemente, el grupo marcador es ^{125}I o
peroxidasa de rábano picante, que puede detectarse por incubación
con ácido
2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolinsulfónico.
Los ensayos de detección descritos anteriormente pueden adaptarse
fácilmente para el empleo si MIF contiene un tag peptídico. En este
caso, el anticuerpo se enlaza a dicho tag. Otros ensayos incluyen
cromatografía por tamaño o carga, incluyendo HPLC y cromatografía
por afinidad.
Alternativamente, puede emplearse un bioensayo
para cuantificar la cantidad de MIF activo presente en el medio
celular. Por ejemplo, la bioactividad del MIF puede medirse mediante
un ensayo de migración del macrófago. Brevemente, se cultivan las
células transfectadas con un vector de expresión que contiene MIF
durante unas 30 horas, y durante este tiempo se añade un inhibidor o
activador candidato. Después de la incubación, se transfieren las
células a un medio bajo en suero durante 16 horas adicionales de
incubación. Se elimina el medio y se clarifica por centrifugación.
Se añade al medio un tampón de lisis que contiene inhibidores de la
proteasa o, alternativamente, se lisan las células y se determinan
los niveles internos de la siguiente manera. La bioactividad del MIF
se determina mediante un ensayo de migración del macrófago,
actividad de la isomerasa, o un ensayo de proliferación. Se hace un
ensayo de proliferación añadiendo diversas cantidades del eluato a
células 3T3 inactivas cultivadas. Se añade timidina tritiada al
medio y, aproximadamente 24 horas después, se determinan los
recuentos precipitables de TCA. Un método alternativo para medir la
proliferación es la reducción del colorante vital MTT. Para un
patrón, puede emplearse FGF-2 humano recombinante
purificado. Otras funciones pueden analizarse mediante otros
bioensayos apropiados disponibles en el campo, como choque tóxico
inducido por CPS, choque tóxico inducido por TSST-1,
artritis inducida por colágeno, etc.
Otros ensayos angiogénicos in vitro
incluyen bioensayos que miden la proliferación de células
endoteliales dentro de gel de colágeno (Goto et al., Lab. Invest.
69:508, 1993), co-cultivo de células
endoteliales de capilares cerebrales sobre geles de colágeno
separados por una cámara de células que exportan la proteína MIF
(Okamure et al., B.B.R.C. 186:1471, 1992; Abe et al., J.
Clin. Invest. 92:54, 1993), o un ensayo de migración celular
(véase Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789, 1995).
\vskip1.000000\baselineskip
El término "anticuerpo" en la forma usada
en el presente es un término amplio y se emplea en su sentido
normal, incluyendo, sin limitación, a los anticuerpos policlonales,
monoespecífico y monoclonales, así como los fragmentos de unión al
antígeno de dichos anticuerpos. Con respecto a un anticuerpo
anti-MIF/diana de las realizaciones preferidas, el
término "antígeno" en la forma aquí usada es un término amplio
y se emplea en su sentido normal, incluyendo, sin limitación, para
referirse a un polipéptido factor inhibidor de migración de un
macrófago o un polipéptido diana, variante, o fragmento funcional
del mismo. Un anticuerpo anti-MIF/diana, o fragmento
de unión al antígeno de dicho anticuerpo, podrá caracterizarse como
poseedor de una actividad específica de unión para el polipéptido
diana o epítope de al menos 1 x 10^{5} M^{-1}, generalmente de
alrededor de 1 x 10^{6} M^{-1}, y preferiblemente de al menos 1
x 10^{8} M^{-1}. Los fragmentos Fab, F(ab')_{2}, Fd y
Fv de un anticuerpo anti-MIF/diana, que retienen
actividad específica de unión para un epítope específico al
polipéptido MIF/diana, se incluyen entre las realizaciones
preferidas. De interés especial son los anticuerpos que unen
polipéptidos activos y se desplazan durante el enlace de una pequeña
molécula inhibidora. Las personas versadas en este campo podrán
apreciar fácilmente que ese desplazamiento podría ser el resultado
de un cambio conformacional, cambiando así la naturaleza del
epítope, el enlace competitivo con el epítope o la exclusión
estérica del anticuerpo de su epítope. En un ejemplo, el sitio
activo de una enzima puede ser el epítope para un anticuerpo
particular y al enlazarse a una pequeña molécula en o cerca del
sitio activo, se pierde la inmunorreactividad del anticuerpo,
permitiendo así el uso de la pérdida de inmunorreactividad con un
anticuerpo como marcador sustituto de la actividad de la enzima.
Además, el término "anticuerpo" en la forma
usada en el presente es un término amplio y se emplea en su sentido
normal, incluyendo, sin limitación, para referirse a anticuerpos que
ocurren naturalmente, así como los anticuerpos que no ocurren
naturalmente, incluyendo por ejemplo los anticuerpos de cadena
sencilla, quiméricos, bifuncionales y humanizados, así como los
fragmentos de enlace al antígeno de ellos. Dichos anticuerpos que no
ocurren naturalmente pueden construirse usando la síntesis de
péptidos en fase sólida, pueden producirse recombinantemente, o
pueden obtenerse, por ejemplo, mediante la detección de bibliotecas
combinatorias, incluyendo cadenas pesadas variables y cadenas
ligeras variables (Huse et al., Science
246:1275-1281 (1989)). Estos y otros métodos de
preparación, por ejemplo, de anticuerpos quiméricos, humanizados,
unidos a regiones determinantes de la complementariedad (CDR), de
cadena sencilla y bifuncionales se reconocen en el campo (Winter y
Harris, Immunol. Today 14:243-246 (1993);
Ward et al., Nature 341:544-546 (1989);
Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Nueva York (1992); Borrabeck, Antibody
Engineering, 2ª edición. Oxford Univ. Press (1995); Hilyard
et al., Protein Engineering: A practical Approach, IRL Press
(1992)).
En ciertas realizaciones preferidas, puede
provocarse un anticuerpo anti-MFI/diana usando como
un inmunógeno, por ejemplo, un péptido aislado que incluye la región
del sitio activo del MIF o el polipéptido diana, el cual puede
prepararse a partir de fuentes naturales o de manera recombinante,
como se describe anteriormente, o un fragmento inmunogénico de un
polipéptido del MIF/diana (por ej., secuencias inmunogénicas que
incluyen 8-30 o más secuencias aminoácidas
contiguas), incluyendo péptidos sintéticos, como se describe
anteriormente. Una porción peptídica no inmunogénica de un
polipéptido MIF/diana puede volverse inmunogénica mediante el
acoplamiento del hapteno a una molécula portadora como una albúmina
de suero bovino (BSA, de sus siglas en inglés) o una hemocianina de
la lapa californiana (KLH de sus siglas en inglés), o mediante la
expresión de la porción péptida como una proteína de fusión. Se
reconocen en el campo varias otras moléculas portadoras y métodos de
acoplamiento de un hapteno a una molécula portadora (Harlow y Lañe,
supra, 1992).
Son bien conocidos en este campo los métodos
para provocar los anticuerpos policlonales, por ejemplo, en conejos,
cabras, ratones u otros mamíferos. Además, los anticuerpos
monoclonales pueden obtenerse usando métodos bien conocidos y
rutinarios en el campo (Harlow y Lañe, supra, 1992). Por
ejemplo, pueden fusionarse las células del bazo de un mamífero
inmunizado con un polipéptido diana a una línea celular de mieloma
apropiada como las células de mieloma SP/02 para producir células
hibridomas. Las líneas celulares hibridomas clonadas pueden
seleccionarse usando un polipéptido diana marcado o un fragmento
funcional del mismo para identificar clones que secretan anticuerpos
monoclonales del polipéptido diana que poseen la especificidad
deseada. Pueden aislarse anticuerpos monoclonales del polipéptido
diana que expresan hibridomas con una especificidad y afinidad
deseables y emplearse como una fuente continua de los anticuerpos,
que son útiles, por ejemplo, para la preparación de equipos
estandarizados. Igualmente, un fago recombinante que expresa, por
ejemplo, un polipéptido anti-diana de cadena
sencilla proporciona también un anticuerpo monoclonal que puede
emplearse para preparar equipos estandarizados.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inhibidores del MIF pueden emplearse de
diversas formas, como se ha indicado anteriormente. Los inhibidores
candidatos del MIF pueden aislarse u obtenerse de muchas fuentes,
como bacterias, hongos, plantas, parásitos, quimiotecas (moléculas
pequeñas), péptidos o derivados peptídicos y similares. Más aún, un
especialista en este campo reconocerá que ha ocurrido la inhibición
cuando se observa una variación estadísticamente significativa de
los niveles de control.
Dados los diversos papeles del MIF en la
patología y homeostasis, la inhibición de la actividad del MIF o
localización extracelular del MIF podría tener un efecto
terapéutico. Por ejemplo, en estudios recientes se ha demostrado que
MIF es un mediador de la endotoxemia, donde los anticuerpos
anti-MIF protegieron completamente a ratones de la
mortalidad inducida con LPS. Véanse Bernhagen et al, Nature
365:756-759, 1993; Calandra et al, J. Exp.
Med., 179:1895-1902, 1994; Bernhagen et al,
Trends Microbiol. 2:198-201, 1994. Más aún, los
anticuerpos anti-MIF han aumentado marcadamente la
supervivencia en ratones tratados con bacterias
Gram-positivas que inducen choque séptico. Bernhagen
et al, J. Mol Med. 76:151-161, 1998. En otros
estudios se ha demostrado el papel del MIF en el crecimiento de
células tumorales y que la inhibición antisentido de MIF causa la
resistencia a los estímulos apoptóticos. Takahashi et al, Mol
Med. 4:707-714, 1998; Takahashi et al,
Microbiol Immunol. 43(1):61-67, 1999. Además, el
descubrimiento de que MIF es el contrarregulador de la acción
glucocorticoide indica que los métodos de inhibición de la
localización extracelular del MIF podrían permitir el tratamiento de
diversas condiciones patológicas, incluyendo autoinmunidad,
inflamación, endotoxemia y síndrome de dificultad respiratoria en
adultos, enfermedad intestinal inflamatoria, otitis media,
enfermedad articular inflamatoria y enfermedad de Crohn. Bernhagen
et al, J. Mol Med. 76:151-161, 1998; Calandra
et al, Nature 377:68-71, 1995; Donnelly et
al, Nat. Med. 3:320-323, 1997. Ya que también se
reconoce que el MIF es angiogénico, la inhibición de esta citoquina
podría tener actividad anti- angiogénica y una utilidad especial en
las enfermedades angiogénicas que incluyen, pero sin limitarse a
ellas, cáncer, retinopatía diabética, psoriasis, angiopatias,
fertilidad, obesidad y enfermedades genéticas de disfunción
glucocorticoide, como las enfermedades de Cushing y Addison.
Los inhibidores de la actividad o exportación
del MIF pueden emplearse terapéuticamente y también emplearse
conjuntamente con un grupo dirigido que enlaza un receptor de la
superficie celular específico a células particulares. La
administración de inhibidores o potenciadores generalmente sigue
protocolos establecidos. Las composiciones de las realizaciones
preferidas pueden formularse para la ruta de administración
indicada, incluyendo por ejemplo, para la administración oral,
nasal, venosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o
intramuscular. Entre otras realizaciones, las composiciones aquí
descritas pueden administrarse como parte de un implante de
liberación sostenida. Entre otras realizaciones, pueden formularse
composiciones de las realizaciones preferidas como un liofilizado,
empleando excipientes apropiados que ofrecen estabilidad como un
liofilizado, y a la rehidratación posterior.
En otra realización, se presentan composiciones
farmacéuticas que contienen uno o más inhibidores del MIF. Para la
administración, los compuestos de las realizaciones preferidas
pueden formularse como composiciones farmacéuticas. Las
composiciones farmacéuticas de las realizaciones preferidas
consisten en uno o más inhibidores del MIF de realizaciones
preferidas (esto es, un compuesto de estructura (Ia) o (Ib) y un
vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. El inhibidor del
MIF está presente en la composición en una cantidad que es efectiva
para tratar una enfermedad particular; esto es, en una cantidad
suficiente para obtener una reducción en los niveles o actividad del
MIF, o síntomas y/o preferiblemente con una toxicidad aceptable al
paciente. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de las
realizaciones preferidas pueden incluir un inhibidor del MIF en una
cantidad de menos de aproximadamente 0,01 mg hasta más de
aproximadamente 1000 mg por dosis dependiendo de la ruta de
administración, preferiblemente unos 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,2,
0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, ó 0,9 mg hasta aproximadamente 65, 70,
75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350,
375, 400, 425, 450, 500, 600, 700, 800, ó 900 mg, y más
preferiblemente de entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, ó 25
mg hasta aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, ó 60 mg. Sin
embargo, en ciertas realizaciones podrían preferirse dosis más bajas
o más altas que las aquí mencionadas. Las concentraciones y dosis
apropiadas pueden determinarse fácilmente por un especialista en el
campo.
Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente
apropiados son familiares para aquellas personas versadas en este
campo. Para las composiciones formuladas como soluciones líquidas,
los vehículos y/o diluyentes aceptables incluyen solución salina y
agua estéril, y opcionalmente pueden incluir antioxidantes,
tampones, bacteriostatos y otros aditivos comunes. Las composiciones
también pueden formularse como grageas, cápsulas, gránulos o
comprimidos que contienen, además de un inhibidor del MIF,
diluyentes, agentes dispersantes y tensoactivos, aglomerantes y
lubricantes. Los especialistas en este campo podrán formular
adicionalmente el inhibidor del MIF en una forma apropiada y
siguiendo las prácticas aceptadas como las descritas en
Remington's Pharmaceulical Sciences, Gennaro, Ed., Mack
Publishing Co., Easton, PA, 1990.
Con respecto a los estereoisómeros, los
compuestos con estructuras (Ia) y (Ib) pueden tener centros quirales
y pueden presentarse como racematos, mezclas racémicas y como
enantiómeros individuales o diastereomeros. Todas estas formas
isoméricas se incluyen dentro de las realizaciones preferidas,
incluyendo las mezclas de las mismas. Más aún, algunas de las formas
cristalinas de los compuestos de estructuras (Ia) y (Ib) pueden
existir como polimorfos, que se incluyen en las realizaciones
preferidas. Además, algunos de los compuestos con estructuras (Ia) y
(Ib) pueden también formar solvatos con agua y otros disolventes
orgánicos. Dichos solvatos se incluyen similarmente dentro del
ámbito de las realizaciones preferidas.
Los compuestos y composiciones de la invención
pueden usarse en un método para tratar diversos trastornos o
enfermedades, incluyendo enfermedades inflamatorias, artritis,
trastornos inmunorrelacionados y similares. Estos métodos incluyen
la administración de un compuesto de las realizaciones preferidas a
un animal de sangre caliente en una cantidad suficiente para tratar
el trastorno o enfermedad. Dichos métodos incluyen la administración
sistémica de un inhibidor del MIF de las realizaciones preferidas,
preferiblemente en la forma de una composición farmacéutica. En la
forma aquí usada, la administración sistémica incluye los métodos de
administración oral y parenteral. Para la administración oral, las
composiciones farmacéuticas adecuadas de un inhibidor del MIF
incluyen polvos, gránulos, comprimidos, grageas y cápsulas, así como
líquidos, jarabes, suspensiones y emulsiones. Estas composiciones
pueden incluir también aromas, conservadores, agentes de suspensión,
espesamiento y emulsificantes, y otros aditivos farmacéuticamente
aceptables. Para la administración parenteral, los compuestos de las
realizaciones preferidas pueden prepararse en soluciones inyectables
acuosas que pueden contener, además del inhibidor de la actividad
y/o exportación del MIF, tampones, antioxidantes, bacteriostatos y
otros aditivos empleados comúnmente en dichas soluciones.
Como se mencionó anteriormente, la
administración de un compuesto de las realizaciones preferidas puede
emplearse en el tratamiento de una variedad de trastornos o
enfermedades. En especial, los compuestos de las realizaciones
preferidas pueden administrarse a un animal de sangre caliente para
el tratamiento de inflamación, cáncer, trastornos inmunes y
similares.
Los compuestos inhibidores del MIF pueden usarse
en terapias de combinación con otros compuestos farmacéuticos. En
las realizaciones preferidas, el compuesto inhibidor del MIF está
presente en combinación con fármacos convencionales usados en el
tratamiento de enfermedades o condiciones donde el MIF es patogénico
o donde juega un papel fundamental u de otro tipo en el proceso de
la enfermedad. En realizaciones particularmente preferidas, se
presentan composiciones farmacéuticas que contienen uno o más
compuestos inhibidores del MIF, incluyendo, pero sin limitarse a los
compuestos con estructuras (Ia) o (Ib), en combinación con uno o más
compuestos farmacéuticos adicionales, incluyendo pero sin limitarse
a fármacos para el tratamiento de varios cánceres, asma u otras
enfermedades respiratorias, sepsis, artritis, enfermedad intestinal
inflamatoria (EII) u otras enfermedades inflamatorias, trastornos
inmunes, u otras enfermedades o trastornos donde el MIF es
patogénico.
En las realizaciones particularmente
preferibles, uno o más compuestos inhibidores del MIF están
presentes en combinación con uno o más fármacos antiinflamatorios no
esteroides (AINES) u otros compuestos farmacéuticos para el
tratamiento de artritis u otras enfermedades inflamatorias. Los
compuestos preferidos incluyen, pero sin limitarse a ellos,
celecoxib; rofecoxib; AINES, por ejemplo, aspirina, celecoxib,
trisalicilato de colina y magnesio, diclofenaco potasio, diclofenaco
sodio, diflunisal, etodolac, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno,
indometacina, cetoprofeno, cetorolac, ácido melenámico. nabumetona.
naproxeno, naproxeno sodio, oxaprozina, piroxicam, rofecoxib,
salsalato, sulindac y tolmetin; y corticosteroides, por ejemplo,
cortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona,
prednisolona, betametesona, dipropionato de beclometasona,
budesonida, dexametasona, fosfato de sodio de dexametasona,
flunisolida, propionato de flutieasona, triameinolona acetonida,
betametasona, fluoeinolona, fluocinonida, dipropionato de
betametasona, valerato de betametasona, desonida, dexosimetasona,
fluoeinolona, triameinolona, triameinolona acetonida, propionato de
clobetasol y dexametasona.
En realizaciones particularmente preferidas, uno
o más compuestos inhibidores del MIF están presentes en combinación
con uno o más beta-estimulantes, corticosteroides
inhalados, antihistaminas, hormonas u otros compuestos farmacéuticos
para el tratamiento del asma, síndrome de dificultad respiratoria
aguda u otras enfermedades respiratorias. Los compuestos preferidos
incluyen, pero sin limitarse a ellos,
beta-estimulantes, por ejemplo, los
broncodilatadores recetados comúnmente; corticosteroides inhalados,
por ejemplo, beclometasona, flutieasona, triameinolona, mometasona y
formas de prednisona como prednisona, prednisolona y
metiprednisolona; antihistaminas, por ejemplo, azatadina,
carbinoxamina/seudoefedrina, cetirizina, ciproheptadina,
dexclorfeniramina, fexofenadina, loratadina, prometazina,
tripelenamina, bromfeniramina, clorofeniramina, clemastina,
difenhidramina; y hormonas, por ejemplo, epinefrina.
En realizaciones particularmente preferidas, uno
o más compuestos inhibidores del MIF están presentes en combinación
con compuestos farmacéuticos para el tratamiento de la enfermedad
inflamatoria intestinal, como azatioprina o corticosteroides, en una
composición farmacéutica.
En realizaciones particularmente preferidas, uno
o más compuestos inhibidores del MIF están presentes en combinación
con compuestos farmacéuticos para el tratamiento del cáncer, como
paclitaxel, en una composición farmacéutica.
En realizaciones particularmente preferidas, uno
o más compuestos inhibidores del MIF están presentes en combinación
con compuestos inmunosupresores en una composición farmacéutica. En
realizaciones particularmente preferidas, uno o más compuestos
inhibidores del MIF están presentes en combinación con uno o más
fármacos para el tratamiento de un trastorno autoinmune, por
ejemplo, la enfermedad de Lyme, Lupus (por ejemplo, lupus
eritematoso sistémico (LES)) o el síndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA). Estos fármacos pueden incluir inhibidores de la
proteasa, por ejemplo, indinavir, amprenavir, saquinavir, lopinavir,
ritonavir y nelfinavir; inhibidores nucleósidos de la transcriptasa
inversa, por ejemplo, zidovudina, abacavir, lamivudina, idanosina,
zalcitabina y estavudina; inhibidores nucleótidos de la
transcriptasa inversa, por ejemplo, fumarato de disoproxilo de
tenofovir; inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa,
por ejemplo, delavirdina, efavirenz y nevirapina; modificadores de
la respuesta biológica, por ejemplo, etanercept, infliximab y otros
compuestos que inhiben o interfieren con el factor necrotizante
tumoral; antivirales, por ejemplo, amivudina y zidovudina.
En realizaciones particularmente preferidas, uno
o más compuestos inhibidores del MIF están presentes en combinación
con compuestos farmacéuticos para el tratamiento de sepsis, como
esteroides o agentes antiinfección. Entre los ejemplos de esteroides
figuran: corticosteroides, por ejemplo, cortisona, hidrocortisona,
metilprednisolona, prednisona, prednisolona, betametesona,
dipropionato de beclometasona, budosenida, fosfato sódico de
dexametasona, flunisolida, propionato de fluticasona, triamcinolona
acetonida, betametasona, fluocinolona, fluocinonida, diproponato de
betametasona, valerato de betametasona, desonida. desoximetasona,
fluoeinolona, triameinolona, triameinolona acetonida, propionato de
clobetasol y dexametasona. Entre los ejemplos de agentes
antiinfecciosos figuran: antelmínticos (mebendazol), antibióticos
que incluyen aminoclicosidos (gentamicina, neomicina, tobramicina),
antibióticos antifungicos (anfotericina b, fluconazol,
griseofulvina, itraconazol, cetoconazol, nistatina, micatina,
tolnaftato), cefalosporinas (cefaclor, cefazolina, cefotaxima,
cefitazidima, ceftriaxona, cefuroxima, cefalexina), antibióticos
beta-lactama (cefotetan, meropenem), cloranfenicol,
macrólidos (azitromicina, claritromicina, eritromicina), penicilina
(sal sódica de la penicilina G, amoxicilina, ampicilina,
dicloxacilina, nefeilina, piperacilina, ticarcilina), tetraciclinas
(doxiciclina, minociclina, tetraciclina), bacitracina; clindamicina;
colistimetato sódico; sulfato de polimixina b; vancomicina;
antivirales que incluyen aciclovir, amantadina, didanosina,
efavirenz, foscamet, ganciclovir, indinavir, lamivudina, nelfinavir,
ritonavir, saquinavir, estavudina, valaciclovir, valganciclovir,
zidovudina; quinolonas (ciprofloxacina, levofloxacina); sulfonamidas
(sulfadiazina, sulfisoxazol); sulfonas (dapsona); furazolidona;
metronidazol; pentamidina; sulfanilamidum crystallinum;
gatifloxacina; y sulfametoxazol/trimetoprim.
En el tratamiento de ciertas enfermedades,
podría ser beneficioso tratar al paciente con un inhibidor del MIF
en combinación con un anestésico, por ejemplo, etanol, bupivacaina,
cloroprocaina, levobupivacaina, lidocaina, mepivacaina, procaina,
ropivacaina, tetracaina, desflurano, isoflurano, cetamina, propofol,
sevoflurano, codeína, fentanilo, hidromorfona, marcaína, meperidina,
metadona, morfina, oxicodona, remifentanil, sufentanil, butorfanol,
nalbufina, tramadol, benzocaína, dibucaína, cloruro de etilo,
xilocaína y fenazopiridina.
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Los inhibidores del MIF de realizaciones
preferidas pueden prepararse mediante los métodos descritos en el
Ejemplo 1. En el Ejemplo 2 se presenta un ensayo para la
investigación de compuestos de realizaciones preferidas para la
inhibición de la actividad o exportación.
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Se trató una solución de nitroacetato de etilo
(6,70 ml, 60,1 mmol) en N,N-dimetilacetamida (35
ml) con NaH al 95% (1,52 g, 60,2 mmol) en porciones. Después de que
se detuvo la producción de hidrógeno, se calentó la mezcla de
reacción a 80ºC durante 15 minutos. Se añadió una solución de
anhídrido N-metilisatoico 1 (11,1 g, 62,5 mmol) en
N,N-dimetilacetamida (65 ml) durante un período de
15 minutos, después de lo cual se calentó la reacción a 120ºC
durante 18 horas. Se eliminó el disolvente por destilación, el
residuo se disolvió en agua y se aciduló con HCl 6N. El precipitado
producido se recogió y se lavó con agua. La recristalización del
residuo restante con CH_{2}Cl_{2}/éter produjo quinolinona 2a
(5,75 g, 43%) como un sólido de color amarillo.
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Se trató una solución de malonato de dietilo
(18,8 ml, 111 mmol) en N,N-dimetilacetamida (35 ml)
con NaH al 95% (2,80 g, 111 mmol) en porciones. Después de que se
detuvo la producción de hidrógeno, se calentó la mezcla de reacción
a 80ºC durante 15 minutos. Se añadió una solución de anhídrido
N-metilisatoico 1 (22,0 g, 124 mmol) en
N,N-dimetilacetamida (140 ml) durante un período de
15 minutos, después de lo cual se calentó la reacción a 120ºC
durante 18 horas. Se eliminó el disolvente por destilación, el
residuo se disolvió en agua y se aciduló con HCl 6N. El precipitado
producido se recogió y se lavó con agua. La recristalización del
residuo restante con CH_{2}Cl_{2}/éter produjo quinolina 2b
(11,7 g, 40%) como un sólido de color blanco.
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Se disolvió el alcohol 2 (6,2 g 2a; 11,1 g 2b)
en POCl_{3} (70 ml para 2a; 140 ml para 2b) y se calentó la
solución a 95ºC durante tres horas. Se elimino el POCl_{3}
mediante destilación y se vertió la mezcla de reacción sobre 500 ml
de agua con hielo. Se neutralizó la solución acuosa usando
NaHCO_{3} acuoso, el precipitado se recogió por filtración, se
redisolvió en cloruro de metileno, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y
se eliminó el disolvente al vacío. El producto de reacción crudo se
purificó por recristalización con éter etílico para obtener 3,5 g de
3a (52%) o 7,8 g de 3b (65%).
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Se disolvió N-BOC piperazina
(5,0 g; 27 mmol) en piridina (15 ml) y se añadieron 20 mg de DMAP.
Se añadió lentamente cloruro ácido puro a la solución a
0-5ºC durante un período de 5 minutos. La pasta
espesa obtenida se agitó durante toda la noche (15 horas) a
temperatura ambiente antes de verterse sobre hielo. El precipitado
cristalino de color blanco se separó por filtración; se secó al aire
y se secó al vacío para obtener la
N-BOC-N-acilo
piperazina correspondiente 5a (6,5 g; 85%) o 5b (4,8 g; 94%). El
producto de reacción crudo se empleó inmediatamente en el siguiente
paso disolviéndolo en 100 ml de cloruro de metileno y añadiendo TFA
puro (10 ml). Después de 3 horas a temperatura ambiente, se evaporó
la solución, se disolvió el residuo en cloruro de metileno y se lavó
con NaHO_{3} (saturado). Se extrajo la capa acuosa 10 veces con
cloruro de metileno, la capa orgánica combinada se secó sobre
Na_{2}SO_{4} y se evaporó el disolvente al vacío produciendo el
compuesto 6a (4,5 g; 91%; 75% entre los dos pasos) o el compuesto 6b
(2,95 g; 70%; 66% entre los dos pasos) o el compuesto 6c, que se
puede obtener comercialmente en Lancaster Synthesis (nº de catálogo
18698).
A una solución de cloroquinolona 3 en tolueno se
añadió piperazina 6 seguida de 10 gotas de piridina antes de
calentarse a 100ºC durante 12 a 14 horas. Se enfrió la mezcla a
temperatura ambiente, se evaporó a sequedad, se redisolvió en
cloruro de metileno y se lavó con solución salina. Se secó el
disolvente orgánico sobre Na_{2}SO_{4} y se eliminó al vacío. La
cromatografía (sílice, CHCl_{3}:MeOH 85:15) produjo CBX, el
producto 7 y materia prima recuperada (30-40%). Se
indican los rendimientos del producto para la reacción en la Tabla
1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
7a. p.f. 167-159ºC; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 300 MHz): \delta 7,95 (dd, 1H), 7,70 (dt, 1H), 7,49
(d, 1H), 7,44 (d, 1H), 7,35 (m, 2H), 7,08 (m, 1H), 3,95 (ha, 4H),
3,75 (s, 3H), 3,3 (t, 4H). HRMS (FAB) calculado para
C_{19}H_{19}O_{4}N_{4}S 399,1127, encontrado 399,1117; Anál.
Calculado para C_{19}H_{18}N_{4}O_{4}S, C, 57,28; H, 4,55;
N, 14,06; O, 16,06; S, 8,05 Encontrado: C, 56,78; H, 4,50; N,
13,73.
7b. p.f. 215-217ºC; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 300 MHz): \delta 7,85 (dd, 1H), 7,70 (m, 1H), 7,44
(m, 5H), 7,42 (m, 1H), 3,74 (m, 4H), 3,28 (m, 4H). HRMS (FAB)
calculado para C_{21}H_{21}N_{4}O_{4} 393,1563, encontrado
393,1540; Anál. Calculado para C_{21}H_{20}N_{4}O_{4}, C,
64,28; H, 5,14; N, 14,28; O, 16,31 Encontrado: C, 64,84; H, 5,16; N,
13,78.
7c. p.f. 183-185ºC; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 300 MHz): \delta 7,95 (dd, 1H), 7,61 (m, 1H), 7,48
(m, 1H), 7,38 (d, 1H), 7,32 (m, 1H), 7,25 (M, 1H), 7,07 (M, 1H),
4,44 (q, 2H), 3,95 (ha, 4H), 3,70 (s, 3H); 3,35 (ha, 4H), 1,44 (t,
3H). HRMS (FAB) calculado para C_{22}H_{24}N_{3}O_{4}S,
426,1488 encontrado 426,1487; Anál. Calculado para
C_{22}H_{23}N_{3}O_{4}S C, 62,10; H, 5,45; N, 9,88; O,
15,04; S, 7,54 Encontrado: C, 62,08; H, 5,45; N, 9,77.
7d. p.f. 164-166ºC; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 300 MHz): \delta 7,92 (dd, 1H), 7,60 (m, 1H), 7,44
(m, 5H), 7,37 (m, 1H), 7,27 (m, 1H), 4,45 (q, 2H), 3,65 (ha, 7H),
3,20 (ha, 4H), 1,45 (t, 3H). HRMS (FAB) calculado para
C_{24}H_{26}NO_{3}, 420,1923 encontrado 420,1934; Anál.
Calculado para C_{24}H_{25}N_{3}O_{4}: C, 69,72; H, 6,01; N,
10,02; O, 15,26 Encontrado: C, 66,32; H, 6,01; N, 9,66.
7e. p.f. 189-191ºC; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 300 MHz): \delta 7,96 (dd, 1H), 7,71 (dt, 1H), 7,51
(ha, 1H), 7,44 (ha, 1H), 7,37 (ta, 1H), 7,09 (d, 1H), 6,51 (m, 1H),
4,03 (ma, 4H), 3,74 (s, 3H), 3,33 (t, 4H). HRMS (FAB) calculado para
C_{19}H_{19}N_{4}O_{5} 383,1355 encontrado 383,1358; Anál.
Calculado para C_{19}H_{19}N_{4}O_{5}: C, 59,68; H, 4,74; N,
14,65; Encontrado: C, 59,39; H, 4,79; N, 14,36.
\vskip1.000000\baselineskip
La migración de macrófagos se determina usando
el ensayo de la gota de agarosa y el método capilar descrito por
Harrington y Stastny et al, J. Immunol.
110(3):752-759, 1973. Brevemente, las muestras
que contienen los macrófagos se añaden a los tubos de hematocrito,
75 mm de longitud y 1,2 mm de diámetro interno. Los tubos se sellan
por calor y se centrifugan a 100 x G durante 3 minutos, se cortan en
la interfase de célula-fluido y se insertan en una
gota de grasa de silicona en cámaras de cultivo de
Sykes-Moore. Las cámaras de cultivo contienen una
proteína de control (albúmina de suero bovino) o muestras. Se
determinan las áreas de migración después de 24 y 48 horas de
incubación a 37ºC trazando una imagen proyectada de los abanicos de
los macrófagos y midiendo las áreas de la migración por
planimetría.
Alternativamente, cada pocillo de una placa de
96 pocillos se prerrecubre con un microlitro de agarosa líquida
SeaPlaque al 0,8% (p/v) en agua dispensada en el centro de cada
pocillo. Entonces, la placa se calienta lentamente sobre una caja
luminosa hasta que las gotas de agarosa están casi secas. Se añaden
dos microlitros de suspensiones celulares que contienen macrófagos
de hasta un 25% (v/v) en medio (con o sin MIF u otros controles),
que contienen 0,2% de agarosa (p/v) y calentados a 37ºC a los
pocillos de la placa prerrecubierta y se enfrían a 4ºC durante 5
min. Entonces, se llena cada pocillo con medio y se incuba a 37ºC
bajo 5% CO_{2}-95% aire durante 48 h. La migración
de las gotitas de agarosa se mide a las 24 y 48 h determinando la
distancia desde el borde de la gotita hasta la periferia de
migración.
\vskip1.000000\baselineskip
Las actividades inhibidoras de la migración de
monocitos de MIF murino recombinante y humano de tipo salvaje y
murino mutante se analizan usando células mononucleares sanguíneas
periféricas humanas o células mononucleares con proporción reducida
de linfocitos T en un formato modificado de cámara de Boyden. Se
suspenden monocitos marcados con calceina-AM en 2,5
a 5 x 10^{6}/ml en medio RPMI 1640, con
L-glutamina (sin rojo de fenol) y 0,1 mg/ml de
albúmina de suero humano o albúmina de suero bovino. Se añade una
alícuota (200 \mul) de suspensión celular a los pocillos de una
placa de cultivo de 96 pocillos con fondo en U (Costar, Cambridge,
Massachusetts, EE.UU.) precalentados a 37ºC, se añade MIF en RPMI
1640 a la suspensión celular para producir concentraciones finales
de 1, 10, 100 y 1000 ng/ml. Se coloca la placa de cultivo en la
cámara de un lector de placas a temperatura controlada, se mezcla
durante 30 s y se incuba a 37ºC durante 10-20 min.
Durante la incubación, 28 \mul de proteína 1 quimiotáctica de
monocito humano precalentada (MCP-1; Pepro Tech.,
Inc., Rocky Hill, Nueva Jersey, EE.UU.) a 10 ó 25 ng/ml o RPMI 1640
con 0,1 mg/ml de HSA se añaden al fondo del pocillo de una placa
ChemoTX (Neuro Probé Inc., Gaithersburg, Maryland, EE.UU.; diámetro
del pocillo 3 mm, tamaño del poro 5 \mum). La placa filtro se
añade cuidadosamente a la placa base. Se sacan las suspensiones
celulares tratadas del incubador y se añaden 30 \mul a cada
pocillo de la placa filtro. La placa armada se incuba durante 90
min. a 37ºC en una cámara humidificada con 5% CO_{2}. Después de
la incubación, se aspira la suspensión celular de la superficie del
filtro y después se quita el filtro de la placa base y se lava tres
veces añadiendo 50 \mul de IX HBSS a cada segmento del filtro.
Entre lavadas, se emplea una rasqueta (squeegee/NeuroProbe)) para
eliminar el HBSS residual. El filtro se seca al aire y se lee
directamente en el lector de fluorescencia en placas, con excitación
a 485 nm y emisión a 535 nm. Los índices de migración quimiotáctica
o aleatoria se definen como la fluorescencia promedio unida al
filtro para una serie dada de pocillos dividida por la fluorescencia
promedio de los filtros en los pocillos que no contienen
MCP-1 o MIF. La titulación de las células marcadas
por fluorescencia reveló que los niveles detectados de fluorescencia
en este ensayo tienen una relación lineal con el número de células
(no se muestra).
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de tautomerización se lleva a cabo
fundamentalmente en la forma descrita por Rosengren et al., Mol.
Med. 2(1): 143-149, 1996. Se evaluó la
conversión de D-dopacromo al ácido
5,6-dihidroxiindol-2-carboxílico.
Se prepararon cubetas de muestra de 1 ml que contenían sustrato 0,42
mM y 1,4 \mug de MIF en la solución de la muestra que contenía
EDTA 0,1 mM y tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 6,0 y se siguió
la velocidad de disminución en la absorbancia de iminocromo a 475
nm. Se empleó L-dopacromo como control. Además, los
productos de reacción pueden seguirse usando un HPLC, empleando una
fase móvil que incluye tampón de KH_{2}PO_{4} 20 mM (pH 4,0) y
metanol 15% con una velocidad de flujo de 1,2 ml/min. Se siguió la
detección fluorimétrica a 295/345 nm.
\newpage
Alternativamente, se lleva a cabo la reacción de
tautomerización usando fenilpiruvato o
(p-hidroxifenil)piruvato fundamentalmente
como se describe en Johnson et al, Biochem.
38:16024-16033, 1999. En esta versión, se
monitoriza la cetonización del fenilpiruvato a 288 nm (\varepsilon
= 17300 M^{-1} cm^{-1}) y se monitoriza la cetonización de
(p-hidroxifenil)piruvato a 300 nm
((\varepsilon = 21600 M^{-1} cm^{-1}). La mezcla de ensayo
contiene tampón de Na_{2}HPO_{4} (1 ml, pH6,5) y una alícuota de
una solución de MIF suficientemente diluida (0,5-1,0
\mul de una solución de 2,3 mg/ml, concentración final de
93-186 nm) para producir una velocidad lineal
inicial. El ensayo se inicia mediante la adición de una pequeña
cantidad (1-3,3 \mul) de fenilpiruvato o
(p-hidroxifenil)piruvato de soluciones madre
preparadas en etanol. Las formas cristalinas del fenilpiruvato y
(p-hidroxifenil)piruvato existen
exclusivamente como los isómeros enol (Larsen et al., Acta Chem.
Scand. B 28:92-96, 1974). La concentración del
sustrato puede variar entre 10 y 150 M, sin observarse una
inhibición significativa de la actividad MIF por etanol a menos de
0,5% v/v.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñaron experimentos con cultivos celulares
para caracterizar la actividad de los compuestos candidatos,
expresión del MIF, tráfico y exportación. Se prepararon fracciones
celulares y de medio acondicionado para la inmunoprecipitación,
fundamentalmente en la forma descrita anteriormente (Florkiewicz
et al, Groth Factors 4:265-275, 1991;
Florkiewicz et al, Ann. N. Y. Acad. Sci.
638:109-126) excepto que se añadieron 400 \mul
de tampón para lisis (NP-40 1%, desoxicolato 0,5%,
Tris 20 mM pH 7,5, EDTA 5 mM, EGTA 2 mM, fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 0,01 mM, aprotinina 10 ng/ml, leupeptina 10
ng/ml, peptestatina 10 ng/ml) a la fracción del medio después de la
clarificación por centrifugación en una microfuga durante 15
minutos. Las fracciones celulares o del medio se incuban con
anticuerpos monoclonales o policlonales al MIF y se añade
Gammabind^{TM} G Sepharose® (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala,
Suecia) para hacer una incubación durante 30 minutos más. Los
inmunocomplejos se sedimentan mediante centrifugación en una
microfuga, se lavan tres veces con tampón de lisis y cuatro veces
con tampón de inmunoprecipitación de lavado helado (NaCl 0,15M,
Na-fosfatasa 0,01M pH 7,2%, desoxicolato 1%,
NP-40 1%, dodecil sulfato de sodio 0,1%). Los
inmunocomplejos se disocian directamente en tampón de muestra de gel
de SDS 125 mM Tris, pH 6,8, SDS 4%, glicerol 10%, azul de bromofenol
0,004%, EGTA 2 mM, y se separan con SDS-PAGE 12%. El
gel se procesa por fluorografía, se seca y se expone a una película
de rayos X a -70ºC. Cuando se inmunoprecipita la fosfotransferasa de
neomicina, se emplea un anticuerpo anti-NPT de
conejo (5Prime-3-Prime, Boulder,
Colorado, EE.UU.).
Para el análisis por Western blot. se
transfirieron las proteínas del gel SDS-PAGE al 12%
a una membrana de nitrocelulosa (tamaño del poro 0,45 \mum en
tampón frío que contenía ácido
3-[dimetil(hidroximetil)metilamino]-2]hidroxipropano-sulfónico
25 mM. pH 9,5, metanol al 20% durante 90 minutos a 0,4 amps. Para el
análisis por Western blot del medio celular acondicionado, se
centrifugó el medio (10 minutos a 800 g) y se concentraron los
sobrenadantes 10 veces por filtración en membrana (tamaño de corte
10 kDA, Centricon-10 Amicon). Se resolvieron las
muestras en gel SDS Tris-glicina al 16% (Novex, San
Diego, California, EE.UU.) bajo condiciones reductoras y se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Novex) a 20 V durante
3 horas. La membrana se incubó con anticuerpos antirrata
policlonales de conejo (1:1000) (Torrey Pines Biolab, San Diego,
California, EE.UU.) y después con conjugados de peroxidasa de rábano
picante (1:1000) (Pierce, Rockford, Illinois, EE.UU.). Se visualizó
el MIF mediante desarrollo con cloronaftol/H_{2}O_{2}. El MIF
recombinante (2 ng, comprado en R&D systems, Minneapolis,
EE.UU.) se sometió a electroforesis y se transfirió como un patrón.
Las membranas se bloquearon en Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM,
NaN_{3} 5 mM, monolaurato de polioxietilen sorbitán al 0,35% y
leche en polvo desnatada al 5% (Carnation Co., Los Ángeles,
California, EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. Las
membranas se incubaron con un anticuerpo monoclonal (número de
catálogo MAB289, comprado en R&D Systemas, Minneapolis,
Minnesota, EE.UU.) o policlonal (suero policlonal de cabra, R&D
Systems, no. cat. AF-289-PB).
Después de la incubación, se lavaron las membranas a temperatura
ambiente con 10 alícuotas nuevas de tampón que contenía NaCl 150 mM,
fosfato de sodio 500 mM pH 7,4, NaN_{3} 5 mM y monolaurato de
polioxietilen sorbitán al 0,05%. Al usar anticuerpos monoclonales,
las membranas se incubaron entonces con tampón de bloqueo que
contenía 1 \mug/ml de IgG antirratón de conejo (H+L, affinipure,
Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, Pennsylvania,
EE.UU.) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para el sondeo
policlonal, se empleó en la incubación anticabra de conejo (Sigma,
no. catálogo G5518). Posteriormente las membranas se lavaron con 1
litro del tampón descrito anteriormente, se incubaron durante 1 hora
en 100 ml de tampón de bloqueo que contenía 15 \muCi de
^{125}I-proteína A (ICN Biochemicals, Costa Mesa,
California, EE.UU.) y se lavaron con 1 litro de tampón. Se visualizó
la señal de radio por autorradiografía.
En un experimento, se recogió durante toda la
noche un medio acondicionado de células THP-1
tratadas con LPS (10 \mug/ml), también tratadas con diversas
cantidades de los compuestos candidatos, como el compuesto 7e e
investigado por inmunoprecipitación con anticuerpos monoclonales o
policlonales para detectar el enlace con MIF. Como se demuestra en
la Figura 1, los medios acondicionados mostraron una pérdida
significativa de MIF detectable usando el anticuerpo monoclonal en
presencia de 10 \muM de compuesto 7e que no observó con el
anticuerpo policlonal. Esta respuesta refleja los efectos del
compuesto 7e sobre la actividad enzimática del MIF, Por
consiguiente, este experimento demuestra que la reactividad
monoclonal puede actuar como un marcador sustituto de la actividad
enzimática.
En otro experimento (Figura 2), se añadieron
diferentes concentraciones de cinco diferentes análogos de
inhibidores a células THP-1 estimuladas con LPS y se
dejaron incubar durante toda la noche. Al día siguiente, se empleó
ELISA para evaluar la cantidad de MIF inmunorreactivo. El compuesto
7e inhibió la capacidad del anticuerpo de reconocer el MIF de manera
dependiente de la dosis con una DE_{50} de 2 \muM, similar a la
respuesta obtenida con los compuestos análogos 7b y 7d. En
comparación, los compuestos análogos 7a y 7c fueron casi 100 veces
más activos.
En otro experimento (Figura 3), se determinó la
capacidad del compuesto 7e de disminuir la inmunorreactividad del
MIF producido por células THP-1. Las células
THP-1 se trataron con 10 \mug/ml de LPS y se
añadieron 10 \muM del compuesto 7e después de transcurridos
diferentes tiempos después de la estimulación con LPS, y se
monitorizó la inmunorreactividad con un monoclonal
anti-MIF. Como se muestra, después de la adición del
compuesto 7e se perdió rápidamente la inmunorreactividad. Por
consiguiente, este experimento mide la actividad de los controles de
compuestos o tampón sólo sobre la detección del MIF cuando se añaden
los compuestos inicialmente a diferentes tiempos a cultivos
celulares y posteriormente los medios acondicionados
correspondientes se procesan de manera dependiente en el tiempo.
En el experimento anterior (Figura 3) se analizó
la capacidad del compuesto 7e de modular el enlace de los
anticuerpos a la proteína MIF en presencia de las células
THP-1 estimuladas con LPS. Sin embargo, en el
experimento mostrado en la Figura 4 se examinó la capacidad del
compuesto 7e de modular el reconocimiento de los anticuerpos del MIF
usando medios preacondicionados en ausencia de células vivas. En
este experimento, se añadió LPS a las células THP-1
en el cultivo, como se ha descrito anteriormente. Seis horas
después, se eliminó el medio acondicionado, se clarificó de los
desechos celulares y se determinó que la cantidad de MIF era 22
ng/ml. Este medio preacondicionado se dividió en dos grupos. Los dos
grupos se incubaron a 37ºC durante diferentes tiempos antes de
añadir el compuesto 7e o el tampón sólo (control) durante 30 minutos
más de incubación a 37ºC. Se determinó entonces el nivel de MIF
detectable mediante ELISA usando el anticuerpo monoclonal
anti-MIF para la detección. La rápida pérdida de la
señal ELISA específica para el MIF depende de la presencia del
compuesto 7e. Los niveles de control de MIF no varían. Por
consiguiente, este experimento demuestra que el compuesto 7e
interactúa con MIF y bloquea la capacidad del anticuerpo de
interactuar posteriormente con MIF, aún en la ausencia de células.
Ya que esta interacción ocurre en el sitio catalítico o limita la
actividad catalítica, la pérdida de inmunorreactividad se relaciona
con la actividad enzimática perdida y/o las actividades asociadas
del MIF.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de evaluar adicionalmente la
actividad in vitro del compuesto 7e para modular la
exportación de MIF, se seleccionaron las células RAW 264.7 de
macrófago de ratón (American Type Culture Collection, Manassas,
Virginia, EE.UU.).
Se pusieron macrófagos Raw 264.7 (3 x 10^{6}
células por pocillo) en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos
(Costar) y se desarrolló el cultivo en suero fetal bovino (FBS)
inactivado por calentamiento RPMI/1% (Hyclone Laboratories, Logan,
Utah, EE.UU.). Después de incubarse durante 3 horas a 37ºC en una
atmósfera humidificada con 5% CO_{2} se eliminaron las células no
adherentes y se lavaron los pocillos dos veces con RPMI/1% FBS. Las
células se incubaron durante 24 horas con LPS (0111 :B4) o
TSST-1 (Toxin Technology, Sarasota, Florida,
EE.UU.), que tenían aproximadamente una pureza del 95% y se
resuspendieron en agua sin pirógenos, a una concentración entre 1
pg/ml y 1000 ng/ml (para el experimento de respuesta a la dosis).
Para los experimentos de tiempo, se eliminó el medio acondicionado
de cultivos paralelos a las 0,5, 1, 2, 4, 8 y 24 horas después de la
estimulación con 1 ng/ml de TSST-1 o LPS. Para los
estudios de inhibición, se incubaron células RAW 264.7 (3 x 10^{6}
células por pocillo) durante 24 horas con 1 ng/ml de LPS (0111 :B4)
o 1 ng/ml de TSST-1 en presencia de 0,01 M a 10 M
del compuesto 7e o tampón (como control). El MIF en el medio celular
acondicionado se concentró sobre filtros y el MIF restante en las
muestras se analizó mediante el ensayo por Western blot y también se
midieron las densidades de la banda MIF mediante Stratagene Eagle
Eye^{TM}.
Las células RAW pueden inducirse a expresar MIF
mediante la adición de 1 ng/ml TSST-1 o LPS y el
cultivo durante 24 horas. Se midió el MIF en medio acondicionado en
la forma indicada anteriormente. Como se demuestra en la Figura 5,
el compuesto 7e redujo los niveles inmunodetectables del MIF en
medio acondicionado en una relación dependiente de la concentración
con un CI_{50} de aproximadamente 0,04 \muM, en comparación con
las células incubadas sólo con tampón. El nivel de MIF detectado en
presencia del compuesto 7e después de la estimulación con
TSST-1 de células RAW se ilustra en la Figura 6, con
un CI_{50} de aproximadamente 0,3 \muM en comparación con las
células incubadas sólo con tampón.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células diana obtenidas de la American Type
Culture Collection (ATCC nº CRL 1650) se cultivan durante toda la
noche en una placa de 48 pocillos en DMEM suplementado con suero
fetal bovino al 10%, L-glutamina 2 mM, piruvato de
sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 100 nM y gentamicina 50
\mug/ml. Las células diana se transfectaron con 2 \mug/ml de ADN
plásmido purificado con CsCl en tampón de transfección (NaCl 140 mM,
KCl 3 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 0,5 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,9
mM, Tris 25 mM, pH 7,4. A cada pocillo se añadieron 300 \mul del
ADN en el tampón de transfección. Se incubaron las células durante
30 min a 37ºC y se aspira el tampón. Se añade el medio tibio
suplementado con 100 \mum de cloroquina durante 1,5 h. Este medio
se elimina y las células se lavan dos veces con el medio completo.
Las células se incuban durante 40-48 h. El plásmido
de interés se cotransfecta con pMAMneo (Clontech, Palo Alto,
California, EE.UU.), el cual contiene el marcador seleccionable
fosfotransferasa de neomicina. Cuando se cotransfectan 2 \mug del
plásmido de interés con 10 \mug de pMAMneo, un número mayor del
70% de células transfectadas expresan tanto MIF como neo,
determinándose mediante microscopía por inmunofluorescencia.
Para los ensayos de inmunoprecipitación, se hace
un mareaje metabólico por pulsos de las células diana durante 15
minutos con 100 \muCi de ^{35}S-metionina y
^{35}S-cisteina (Trans
^{35}S-label, ICN Biomedicals, Irvine, California,
EE.UU.) en 1 ml de DMEM sin metionina ni cisteina. Después del
marcado, las monocapas celulares se lavan una vez con DMEM
suplementado con un exceso (10 mM) de metionina y cisteina sin
marcar durante 1-2 minutos. Se cultivan las células
en 2 ml de este medio durante los tiempos indicados y los
sobrenadantes celulares se inmunoprecipitan para determinar la
presencia de la proteína sin líder. Para los cultivos indicados, el
medio no reactivo (chase) se suplementa con modulador a las
concentraciones indicadas.
Alternativamente, para el análisis por ELISA, se
lavaron las células diana una vez con 250 \mul de carbonato de
sodio 0,1M, pH 11,4 durante 1 ó 2 minutos y se aspiraron
inmediatamente. Podría preferirse alternativamente una solución con
alto contenido de sal. Las células se lavan con medio que contiene
FBS 0,5% más 25 \mug/ml de heparina y después se incuban las
células en este mismo medio durante los tiempos indicados. Para los
cultivos indicados, el medio no reactivo (chase) se suplementa con
un modulador. Para las células transfectadas con un vector que
codifica una proteína que contiene una secuencia líder, como
hCG-\alpha o cualquier otra proteína de enlace no
heparínica, pueden omitirse el lavado con carbonato y el medio que
contiene heparina.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de detección de alto rendimiento para
los inhibidores del MIF se hace en un formato de 96 pocillos usando
MIF producido por células THP-1 y se lleva a cabo
como sigue. Los ensayos del MIF se hacen con ELISA en la forma
indicada anteriormente. Las células THP-1 se
resuspenden en aproximadamente 5 x 10^{6} células/ml en medio RPMI
que contiene 20 \mug/ml de LPS bacteriano y las células se incuban
durante 18-20 horas. Posteriormente, se recoge el
sobrenadante celular y se incuba con inhibidores supuestos.
Brevemente, una placa de 96 pocillos (Costar número 3590) placa
ELISA se recubre con un anticuerpo monoclonal MIF (R&D Systems
no. cat. MAB289) a una concentración de 4 \mug/ml durante dos
horas a 37ºC. Se añade el sobrenadante del cultivo sin diluir a la
placa ELISA durante una incubación de dos horas a temperatura
ambiente. Los pocillos se lavan, se añade un anticuerpo policlonal
de MIF biotinilado (R&D Systems no.
AF-289-PB) seguido por
estreptavidina-HRP y un sustrato cromogénico. Se
calcula la cantidad de MIF por interpolación usando una curva patrón
de MIF.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de evaluar los efectos de cualquier
pequeña molécula in vivo, es deseable poder detectar
cuantitativamente el compuesto en un fluido corporal como la sangre.
Se estableció un método analítico para primero detectar
reproduciblemente los compuestos de prueba, como los inhibidores del
MIF, incluyendo el compuesto 7e, y después medir su concentración en
fluidos biológicos.
Se hizo un RP-HPLC con una
unidad Hewlett-Packard modelo
HP-1100 usando un Symmetry Shield
RP-8 (4,6 x 75 mm di, Waters, Milford,
Massachusetts, EE.UU.). La fase móvil fue una solución isocrática de
acetonitrilo/agua al 35% que contenía 0,1% de ácido
trifluoroacético. Se monitorizó la absorbancia a 235 nm. Para medir
la cantidad de compuesto de prueba en suero se separaron
inicialmente las proteínas del suero de la muestra usando
acetonitrilo al 50% (4ºC durante toda la noche), seguido por
centrifugación a 14000 rpm durante 30 minutos. Después, se analizó
el sobrenadante usando el RP-HPLC y se calculó la
concentración del compuesto usando una curva de calibración de un
patrón conocido. Siguiendo este procedimiento, se empleó HPLC en
fase inversa para detectar el compuesto 7e en un intervalo lineal de
1,5-800 ng (R2=1) usando muestras de prueba cargadas
(no se muestra). Cuando se aplicó la técnica analítica anterior al
suero sanguíneo de animales tratados con el compuesto 7e (0,4 mg/20
gramos ratón), se midieron cuantitativamente las cantidades en
circulación del compuesto 7e.
Con el desarrollo de los métodos anteriores para
cuantificar el compuesto 7e, es posible evaluar la eficacia de
diferentes rutas de administración del compuesto y caracterizar la
bioactividad. Para determinar la biodisponibilidad del suero
dependiente del tiempo se trataron animales con el compuesto 7e
mediante inyección intraperitoneal (i.p.) (Figura 7A) y oralmente
por gavaje (Figura 7B).
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de los siguientes experimentos in
vivo fue confirmar los resultados iniciales del ensayo in
vitro usando el compuesto 7e para inhibir el MIF. Parece que la
toxicidad inducida por LPS está relacionada con la sobreproducción
de MIF y de TNF-\alpha e
IL-1\beta. Ya que pueden protegerse los animales
del choque endotoxínico mediante la neutralización o inhibición de
estos mediadores de la inflamación. Se seleccionó el modelo actual
debido a que proporciona modelos reproducibles y mortales rápidos de
la sepsis y el choque séptico.
Se prepararon dosis de lipopolisacárido (LPS)
antes de iniciar cada experimento Se reconstituyó LPS
(Escherichia coli 0111:B4, Sigma) añadiendo 0,5% TEA (1 ml de
agua USP + 5 ml de trietilamina (Pierce)) a un vial de 5 mg de
endotoxina. Una vez reconstituida, la solución se incubó a 37ºC
durante 30 minutos. Posteriormente, la solución se sometió a
ultrasonido en un baño ultrasonido a 56-60ºC durante
30 segundos 3 veces. Después del ultrasonido, se sometió la mezcla a
agitación vorticial durante 3 minutos continuamente. La solución
madre de LPS quedó entonces lista para usarse.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pusieron ratones BALB/c hembras de diez
semanas de edad (20 \pm 2 gramos) (Charles River Laboratories,
Kingston, Nueva York, EE.UU.) en grupos de 5 por jaula con acceso
libre a alimentos y agua y se aclimataron durante al menos una
semana antes del experimento. El día del experimento, se pesaron los
ratones y se distribuyeron aleatoriamente en grupos de 10 animales
con el mismo peso corporal medio. Los ratones se inyectaron i.p. con
200 \mul del compuesto formulado 7e o tampón sólo inmediatamente
después de la inyección i.p. de LPS (Escherichia coli
0111:B4, 10 mg/kg o 5 mg/kg peso corporal) y
D-galactosamina (50 mg/kg de peso corporal). Cada
una de las dosis de LPS (0,2 ml para un ratón de 20 gramos) se
administró por vía intraperitoneal y se mezcló con una concentración
final de D-galactosamina de 50 mg por ml. Después de
tomarse muestras de sangre mediante punción cardiaca, se sacrificó
el animal. Típicamente se tomaron las muestras a las 4 horas después
del tratamiento con LPS. Se separó el suero en un separador de suero
(Microtainer® Becton Dickinson, Minneapolis, Nueva Jersey, EE.UU.)
siguiendo el protocolo del fabricante. Se midió el suero de ratón
II-1 y TNF- mediante ELISA usando un equipo de
"inmunoensayo con 1L-1\beta de ratón o un
inmunoensayo con TNF-\alpha de ratón" (R&D
System Minneapolis, Minnesota, EE.UU.) siguiendo las instrucciones
del fabricante. Las concentraciones séricas de MIF en el suero de
ratón se cuantificaron mediante un sándwich ELISA (equipo Chemikine
MIF, Chemicon, San Diego, California, EE.UU.). Se analizaron las
muestras por duplicado y se obtuvo un promedio de los
resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pusieron ratones BALB/c hembras de 8 a 10
semanas de edad (20 \pm 2 gramos) en jaulas y se aclimataron en la
forma descrita anteriormente. El día de los experimentos, los
ratones se pesaron y distribuyeron aleatoriamente en grupos de 5
animales con el mismo peso corporal medio. Los ratones se inyectaron
con 200 1 del compuesto formulado 7e o su tampón (promedio 20 mg/kg
compuesto) después de la inyección i.p. de LPS (E. coli
055B5, Sigma) (40, 10, 5, 2 ó 0,5 mg/kg de peso corporal) y 50 mg/kg
de -D-galactosamina. Se observaron los ratones cada
dos horas durante las primeras 18 horas y dos veces al día durante
siete días. En estos estudios se emplearon los métodos de estimación
de Kaplan-Meier para evaluar la supervivencia de los
animales.
Para todos los estudios in vivo, se
hicieron comparaciones estadísticas estándar entre los grupos de
tratamiento usando la prueba de Fisher para datos categóricos y la
prueba de Mantel-Cox para variables continuas. Para
determinar si los niveles de suero IL-1 están
correlacionados con el MIF sérico, se empleó la prueba de Fisher.
Los análisis se hicieron usando el software Stat View 5.0 (Abacus
Concepts, Berkeley, California, EE.UU.). Todos los valores p
declarados bilaterales y con un valor menor de 0,05 se consideraron
indicativos de significancia estadística.
Se realizó un experimento inicial de control
para determinar los niveles de la línea base del MIF endógeno en el
sistema del modelo murínico (ratones Balb/c hembras) y para
determinar además la velocidad y grado de aumento del MIF endógeno
después del tratamiento con LPS (10 mg/kg). Se trataron los ratones
Balb/c hembras con LPS (Sigma 0111:B1) mezclado con 50 mg/kg de
\beta-D-galactosamina. El nivel
del MIF en suero se determinó mediante HPLC como se describió
anteriormente a las 0, 2, 5 y 6 horas después del tratamiento con
LPS/galactosamina. Al iniciarse este experimento representativo, el
nivel de la línea base del MIF endógeno era aproximadamente 45
ng/ml. Sin embargo, durante el curso de este experimento de seis
horas, se observó un aumento dependiente del tiempo en el nivel de
MIF detectado en las muestras obtenidas de suero. Cuando los ratones
se trataron con el compuesto 7e (formulado en una solución acuosa al
50%) y 10 mg/kg de LPS, se observó una disminución significativa en
el nivel del MIF en circulación (p=O,05) que puede detectarse. En el
experimento que se muestra en la Figura 9A, se inyectaron ratones
BALB/c (n=20) por vía i.p. con 20 mg/kg de peso de compuesto 7e al
hacerse la administración de LPS. Se obtuvieron muestras de sangre
5,5 horas después. Los resultados demuestran que los animales
tratados con el inhibidor presentan una capacidad disminuida de
respuesta al LPS y se detectaron niveles reducidos de MIF. En otro
estudio, en donde los ratones recibieron la mitad de la dosis de LPS
(5 mg/kg), se determinó el MIF en suero cuatro horas después del
tratamiento. Estos datos revelan una disminución muy
estadísticamente significativa (p=O,0003) del 60% en MIF (Figura
9B). En otro experimento, se determinaron el MIF y el
IL-1\beta en suero de ratón usando ELISA. Como se
muestra en la Figura 10, existe una correlación directa y muy
significativa entre los dos. También se observó esta correlación
entre MIF y TNF-\alpha (no se muestran los datos).
En un experimento parecido, se observaron reducciones en los niveles
en suero de IL-1\beta y
TNF-\alpha después de la administración de 20
mg/kg del compuesto 7e (Figura 11).
En estudios de choque tóxico experimental
inducido por LPS se ha revelado un papel central para el MIF y
TNF-\alpha. El hecho de que LPS estimula la
producción de MIF por parte de las células del tipo de los
macrófagos, lo que a su vez induce una secreción de
TNF-\alpha por las células del tipo macrófago,
sugiere un papel potencial del MIF en la patogénesis del LPS. Para
determinar si el compuesto 7e puede prevenir el choque LPS, se
empleó un modelo de choque mortal mediado por LPS en ratones BALB/c
sensibilizados con
\beta-D-galactosamina. El
tratamiento con el compuesto 7e al hacerse la inyección de una dosis
mortal de LPS (2, 5 y 10 mg/kg) aumentó la supervivencia del 6% al
47% (p=O,0004) (Figura 12). Los efectos están modulados por la
concentración de LPS empleada, lo que demuestra que al usar una
concentración más alta de LPS, el efecto del compuesto 7e es
saturable y, por lo tanto, específico. En la Tabla 2 se presenta un
resumen de varios experimentos de supervivencia (total de 210
ratones), que indican que el compuesto 7e protege a los ratones del
choque tóxico inducido con LPS de manera dependiente de la
concentración. En la Figura 13 se muestran estos datos gráficamente
con un tiempo de supervivencia del 25% en el eje izquierdo.
La administración de MIF humano recombinante
exógeno con el compuesto 7e puede invertir los efectos benéficos del
compuesto, apoyando la hipótesis de que el compuesto 7e actúa
aumentando la resistencia animal a LPS mediante la modulación de los
niveles del MIF en suero de ratón. En este ejemplo, se trataron
ratones con el protocolo estándar de LPS excepto en que se añadió 1
mg/kg de LPS y 20 mg/kg del compuesto inhibidor 7e. Algunos animales
también fueron tratados con 300 \mug/kg de MIF recombinante
humano. A las 12 horas, un número significativamente mayor
(p<0,01) de ratones sobrevivió el LPS con el compuesto 7e, pero
esta supervivencia se vio neutralizada por la administración de MIF
(no se muestran los datos).
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Se inmunizaron veinte ratones DBA/1LacJ, de
10-12 semanas de edad, el día 0 en la base de la
cola con colágeno bovino tipo II (CII 100 g) emulsionado en
adyuvante completo de Freunds (FCA; GibcoBRL). El día 7, se
administró una segunda dosis de colágeno por la misma ruta
(emulsionado en adyuvante incompleto de Freunds). El día 14, los
ratones se inyectaron por vía subcutánea con 100 mg de LPS (055:B5).
El día 70, se inyectaron los ratones con 40 g de LPS (0111:B4) por
vía intraperitoneal. Los grupos se dividieron según el grosor de las
patas, medido con pinzas calibradoras, después de la aleatorización,
para crear un grupo inicial equilibrado. Se administró a los ratones
el compuesto en tampón los días 71, 72, 73 y 74 (un total de ocho
dosis de 0,4 mg/dosis, aproximadamente 20 mg/kg de peso). Dos
observadores examinaron el grosor de las patas de los ratones el día
74. En la Figura 14 se muestra el calendario experimental. En este
experimento, los ratones atenuados (disminución de la artritis
completa) se trataron con una inyección i.p. final de LPS el día 70
para estimular la producción de citoquina y una inflamación aguda.
En la Figura 15 se demuestra que los ratones tratados con el
compuesto 7e desarrollan un edema ligeramente reducido de la pata
(1,87 mm) en comparación con los controles sólo tratados con el
vehículo (1,99 mm), p < 0,05. En el último punto de tiempo, los
animales en el grupo tratado no alcanzaron la expresión completa de
la artritis inducida por colágeno en comparación con su control (no
se muestran los datos).
En otro experimento, se inmunizaron quince
ratones DBA/1J, de 10-12 semanas de edad, el día 0
en la base de la cola con colágeno bovino tipo II (CII 100 g)
emulsionado en adyuvante completo de Freunds (FCA; GibcoBRL). El día
21 se administró una segunda dosis de colágeno por la misma ruta,
emulsionada en adyuvante incompleto de Freunds. El día 28, los
ratones se inyectaron por vía subcutánea con 100 \mug de LPS
(055:B5). El día 71, se inyectaron los ratones con 40 g de LPS (0111
:B4) por vía intraperitoneal. Los grupos y el protocolo de
tratamiento fueron iguales a los descritos anteriormente. El día 74
se tomaron muestras de sangre y se midieron las citoquinas. La
Figura 16 indica que el compuesto 7e redujo los niveles de MIF en
suero en comparación con las muestras CIA sin tratar. Se detectó una
inhibición aún más significativa de los niveles de
TNF-\alpha en suero.
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Se prepararon los siguientes inhibidores del MIF
usando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Cada uno de estos
inhibidores del MIF pertenece a la clase de compuestos de estructura
(Ia) descritos anteriormente e incorpora el siguiente grupo:
Los resultados de los ensayos con tautomerasa
indican que cada uno de los compuestos inhibidores del MIF presenta
una inhibición significativa de la actividad del MIF.
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Los resultados de los ensayos de tautomerasa
indican que los siguientes compuestos del Ejemplo 11 presentan
niveles especialmente altos de inhibición de la actividad del
MIF.
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Se prepararon los siguientes inhibidores del
MIF. Cada uno de estos inhibidores del MIF pertenece a la clase de
compuestos que tienen la estructura (Ib) descrita anteriormente:
donde R_{1}, R_{2}, R_{3},
R_{4}, X, Y, Z y n están definidos para la estructura (Ib)
mostrada anteriormente. Los resultados del ensayo de tautomerasa
indican que cada uno de los compuestos inhibidores del MIF exhibe
una inhibición significativa de la actividad del
MIF.
\newpage
Los inhibidores del MIF de ciertas realizaciones
pueden prepararse siguiendo los siguientes esquemas de reacción,
Esquemas 5 y 6. Todos estos inhibidores del MIF pertenecen a la
clase de compuestos con la estructura (Ia) descrita
anteriormente.
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\vskip1.000000\baselineskip
Esquema de reacción
5
En este esquema, se hace reaccionar anhídrido
isatoico con malonato de dietilo en una solución de NaH en
N,N-dimetilacetamida. El compuesto intermedio
resultante (conocido como "1M00") se clora mediante la reacción
con POCl_{3} para producir un compuesto intermedio (conocido como
"1M00(CI2)"). 1M00(CI2) se hace reaccionar con
NH_{4}OAC en ácido acético para producir un compuesto intermedio
(conocido como "1M00(CI)"). Se hace reaccionar
1M00(CI) con una N-acil piperazina en DMF. El
grupo acilo del compuesto de piperazina incluye un sustituyente
(conocido como "R3") que es un grupo furanilo o un grupo
tienilo, como se muestra en el Esquema 5, u otros grupos, como se
indica en ejemplos posteriores. El compuesto intermedio obtenido se
hace reaccionar con un compuesto halogenado. El sustituyente unido
al átomo de halógeno (conocido como "R4") podría incluir
diversos grupos, como se indica en ejemplos posteriores. El
compuesto obtenido tiene la estructura (Ia) descrita anteriormente.
Los pasos de este esquema de reacción se describen a continuación en
detalle. Nos referiremos a los compuestos preparados siguiendo el
Esquema 5 usando los números de referencia que incluyen una "M"
y contienen un grupo -COOEt.
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\newpage
Esquema de reacción
6
En este esquema, se hace reaccionar
4-hidroxi-2(1H)-quinolona
con una mezcla de ácidos nítrico y acético. El compuesto intermedio
obtenido se clora mediante la reacción con POCl_{3} para obtener
otro compuesto intermedio. Ese compuesto intermedio se hace
reaccionar con una N-acil piperazina en DMF. El
grupo acilo del compuesto de piperazina incluye como sustituyente un
grupo R3 al que nos referimos en la descripción del Esquema 5. El
compuesto intermedio obtenido se hace reaccionar con un compuesto
halogenado que incluye como sustituyente un grupo R4 como el
indicado en el Esquema 5. El compuesto obtenido tiene la estructura
(Ia) descrita anteriormente. Los pasos de este esquema de reacción
se describen a continuación en detalle. Nos referiremos a los
compuestos preparados siguiendo el Esquema 6 usando los números de
referencia que incluyen una "N" y contienen un grupo
-NO_{2}.
Se preparan diversos inhibidores del MIF que
pertenecen a la clase de compuestos que tienen la estructura (Ia)
siguiendo el Esquema 5 o el Esquema 6. En la Tabla 4 se proporciona
una lista de los números de referencia de los compuestos preparados.
La designación "1M1\alm{2}" indica que el compuesto se
preparó siguiendo el Esquema 5, e incorpora un grupo -COOEt y un
grupo forano como R3. La designación "1M2\alm{2}" indica que
el compuesto se preparó siguiendo el Esquema 5, e incorpora un grupo
-COOEt y un grupo tiofeno como R3. La designación
"1N1\alm{2}" indica que el compuesto se preparó siguiendo el
Esquema 6, e incorpora un grupo -NO_{2} y un grupo furanilo como
R3. La designación "1N2\alm{2}" indica que el compuesto se
preparó siguiendo el Esquema 6 e incorpora un grupo -NO_{2} y un
grupo tiofeno como R3. Los dos dígitos al final de la designación
identifican el grupo R4 del compuesto.
\newpage
El grupo R4 halogenado "09" se revela en
MARCH'S ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, Reactions, Mechanisms and
Structure, 5ª edición, Michael B. Smith y Jerry March, Eds.,
A-Wiley-Interscience Publication,
John Wiley & Sons, Inc., pág. 437 (2001). Se emplean esquemas de
reacción ligeramente diferentes, Esquemas 7 y 8, para preparar
inhibidores del MIF que contienen este grupo.
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Esquema de reacción
7
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Esquema de reacción
8
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Se prepararon varios inhibidores del MIF que
pertenecen a la clase de compuestos con estructura (Ia) siguiendo el
Esquema 9 o el Esquema 10.
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Esquema de reacción
9
\newpage
Esquema de reacción
10
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En la Tabla 5 se proporciona una lista de
números de referencia de los compuestos preparados. La designación
"1M\alm{2}1" indica que se preparó el compuesto siguiendo el
Esquema 9, y contiene un grupo -COOEt. La designación
"1M\alm{2}2" indica que el compuesto se preparó siguiendo el
Esquema 9, y contiene un grupo -NO_{2}. La designación
"1N\alm{2}1" indica que el compuesto se preparó siguiendo el
Esquema 10 y contiene un grupo -COOEt. La designación
"1N\alm{2}2" indica que el compuesto se preparó siguiendo el
Esquema 10 y contiene un grupo -NO_{2}. Los dos dígitos después de
la letra M o N corresponden al número que identifica al grupo
R3.
\newpage
Se prepararon varios inhibidores del MIF que
pertenecen a la clase de compuestos con estructura (Ia) siguiendo
los siguientes Esquemas.
Esquema de reacción
11
A una suspensión de 1M00 (33,0 g; 0,14 mol) en
tolueno (40 ml) se añadieron 108 g de POCl_{3} (0,7 mol). Se
calentó la solución obtenida bajo reflujo durante 1,5 horas. El
disolvente se destiló a presión reducida y el aceite residual se
extrajo sucesivamente con heptano (control por cromatografía en capa
fina (CCF)). Las fracciones combinadas de heptano se evaporaron y el
residuo se calentó con 200 ml de agua y se filtró. El rendimiento
fue de 27 g (70%).
Después de secarse a temperatura ambiente
durante 18 horas, el compuesto dicloro obtenido se transfirió a un
matraz de fondo redondo de 250 ml y se añadieron 150 ml de ácido
acético y 24,0 g de acetato de amonio. Se calentó la mezcla de
reacción bajo reflujo durante unas 6 h (control mediante
cromatografía líquida/espectrometría de masas (LCMS por sus siglas
en inglés) y CCF). Cuando no pudo detectarse materia prima en la
mezcla de reacción, se vertió la solución caliente en agua y se
filtró el precipitado así obtenido. En la Tabla 6 se proporcionan
los datos de rendimiento (g y %), punto de fusión, cociente de la
masa a la carga (M/Z), donde M/Z = 754,1 [3xM]^{+}, 503,3
[2xM]^{++},
\tau (8 min; ejecución), y pureza determinada por LCMS.
\tau (8 min; ejecución), y pureza determinada por LCMS.
Esquema de reacción
12
A la solución de 1M00(Cl) (3,27 g; 13,0
mmol) en 20 ml de NMP se añadieron en secuencia acilpiperazina (2,34
g; 13,0 mmol) y DABCO (1,46 g; 13,0 mmol). Se agitó la mezcla de
reacción a 100-120ºC durante 15 horas. La reacción
se detuvo mediante la adición de una solución de NH_{4}Cl al 20% y
el precipitado producido se filtró y se lavó con agua. El producto
se secó en un desecador sobre P_{2}O_{5} a temperatura ambiente
a presión reducida. Se empleó este producto en la siguiente reacción
sin purificación adicional.
Se agitó toda la noche una mezcla de
cloroquinolona 1N00(Cl) (2,9 g; 13,0 mmol), trifluoroacetato
de acilpiperazina AV-0020 (4,0 g; 13,0 mmol), y
DABCO (2,91 g; 26,0 mmol) en 25 ml de NMP a 100ºC. Se vertió la
mezcla en 50 ml de solución salina, el sólido obtenido se filtró, se
lavó con agua y se secó en un desecador sobre P_{2}O_{5} a
temperatura ambiente a presión reducida. Se empleó este producto en
la siguiente reacción sin purificación adicional.
Se proporcionan los rendimientos e información
adicional para los compuestos obtenidos en la Tabla 7. Para el
compuesto designado 1M1, X es O y R2 es COOEt. Para el compuesto
designado 1M2, X es S y R2 es COOEt. Para el compuesto designado
1N1, X es O y R2 es NO_{2}. Para el compuesto designado 1N2, X es
S y R2 es NO_{2}.
Esquema de reacción
13
A la suspensión de NaH (0,04 g; 1,0 mmol) en NMP
anhidro (3 ml) se añadió el compuesto 1M1 (o 1M2) o 1N1 (o 1N2) (0,8
mmol). Después de que cesó la producción de gas, se añadió el
bromuro (06-20) (1,0 mmol). Se agitó la mezcla de
reacción hasta que no pudieron detectarse trazas de la materia prima
(control por LCMS). Se añadió a la reacción una solución de
NH_{4}Cl al 10% (20 ml) y la mezcla resultante se extrajo con DCM.
Se aislaron los compuestos 1M1 y 1M2 y se purificaron mediante HPLC
preparativo (columna C-18 de sílice, 150 mm x 41 mm,
40 ml/min, gradiente: agua-acetonitrilo = de 60:40 a
5:95, 20 min). En la Tabla 5, los compuestos preparados mediante
esta ruta se designaron con el superíndice "A" después de la
designación del compuesto.
A la solución del compuesto 1M1 (o 1M2) o 1N1 (o
1N2) (1,0 mmol) en DMF anhidro (5 ml) se añadieron el bromuro
(06-20) (2,0 mmol) y K_{2}CO_{3} (200 mg). Se
obtuvieron los compuestos 1M122; 1M222; 1N122; 1N222 en
1,4-dioxano con 4 mmol de bromuro de ciclopentilo.
Se agitó la mezcla de reacción a 80-100ºC durante
20-40 horas (control por LCMS). Se añadió a la
reacción la solución de NH_{4}Cl al 10% (20 ml) y la mezcla
resultante se extrajo con DCM. Se aislaron los compuestos
1M106-1N220 y se purificaron mediante HPLC
preparativo (columna C-18 de sílice, 150 mm x 41 mm,
40 ml/min, gradiente: agua-acetonitrilo = de 80:20 a
5:95, 40 min). En la Tabla 5 se proporcionan los datos de pureza y
otros datos para los compuestos obtenidos. El compuesto 1N119*HCl se
purificó mediante HPLC preparativo (columna C-18 de
sílice, 150 mmx41 mm, 40 ml/min, gradiente:
agua-acetonitrilo-HCl (0,001%) = de
80:20 a 5:95, 40 min). En la Tabla 8, los compuestos preparados
siguiendo esta ruta se designaron con el superíndice "B"
después de la designación del compuesto. En la Tabla 8 se muestran
las propiedades físicas de los compuestos. Las designaciones que
contienen "(1)" indican que el compuesto es un
regioisómero.
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Esquema de reacción
14
A una solución de la quinolona 1N01 (o 1M01)
(14,08 g; 63,94 mmol) y cloruro de trietilbencilamonio (58,4 g;
256,5 mmol) en MeCN (235 ml) se añadieron 26 ml de POCl_{3} (282,4
mmol). La mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura
ambiente. Se eliminó el disolvente a presión reducida y se agitó el
residuo en agua (335 ml) durante 2 horas. Se filtró el precipitado,
se lavó con agua, se secó, lavó con ciclohexano caliente, y se secó.
En la Tabla 9 se muestran las propiedades físicas de los compuestos
preparados.
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Esquema de reacción
15
A una solución de 1N01(Cl) (640 mg; 2,68
mmol) en 3 ml de DMF se añadieron en secuencia
t-butiloxicarbonilpiperazina (500 mg; 2,68 mmol) y
DABCO (300 mg; 2,68 mmol). Se agitó la mezcla de reacción durante
toda la noche a temperatura ambiente. (Para 1M01(Cl), se
agitó la mezcla de reacción durante toda la noche a 60ºC). Se detuvo
la reacción con agua (15 ml) y el precipitado obtenido se filtró y
se lavó con agua. (Para 1M01(Cl), se detuvo la reacción con
solución de NH_{4}Cl al 20% (15 ml), se extrajo con DCM (3x3 ml),
se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se eliminó el disolvente a presión
reducida, y se trituró el residuo con hexano. Se filtró el
precipitado obtenido y se lavó con hexano). El producto se secó en
un desecador sobre P_{2}O_{5} a temperatura ambiente a presión
reducida. Se disolvió en 1 ml de TFA y se dejó reposar durante 1
hora. Se trituró la solución con 20 ml de éter, se filtró el
precipitado, se lavó con éter y se secó al aire. En la Tabla 10 se
muestran las propiedades físicas de los compuestos preparados.
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Esquema de reacción
16
A una solución de 1N01(Cl) (50 mg; 0,419
mmol) en 3 ml de DMF se añadieron en secuencia trifluoroacetato de
3-tienoilpiperazina (69 mg; 0,040 mmol) y DABCO (47
mg; 0,419 mmol). Se agitó la mezcla de reacción durante toda la
noche a temperatura ambiente. Se detuvo la reacción con agua (15 ml)
y el precipitado obtenido se filtró y se lavó con agua, El producto
se secó en un desecador sobre P_{2}O_{5} a temperatura ambiente
a presión reducida. Los productos preparados siguiendo este esquema
se designan en la Tabla 11 mediante el superíndice "A" después
de la designación del compuesto.
Esquema de reacción
17
Se agitó durante toda la noche a temperatura
ambiente una mezcla de ácido
pirrol-2-carboxílico (91 mg; 0,82
mmol) y CDI (133 mg; 0,82 mmol) en 2 ml de DMF. (En el caso de
1M081, 1M091, 1M221, 1M271, 1N081, 1N211 - en NMP (1 ml); 1M071,
1M151, 1M181, 1M191, 1M211, 1N071, 1N151, 1N181, 1N271 - en DMSO (1
ml)). Después se añadió 1NP1TFA y se agitó la mezcla a 60ºC durante
6 horas. (En el caso de 1M181, 1N181 - a temperatura ambiente). La
mezcla se diluyó con 5 ml de solución salina y se extrajo con
CH_{2}Cl_{2} (3 x 2 ml). Los extractos combinados se lavaron con
agua (1 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporaron a
presión reducida. (En el caso de 1M071, 1M151, 1M191, 1M211, 1N071,
1N151, 1N191, 1N211, la mezcla se diluyó con agua, el polvo
precipitado se filtró, se lavó con agua, se secó al aire y se
disolvió en una solución 5-6N de HCl en
i-PrOH. Se calentó la solución a reflujo durante 10
min. Se evaporó el disolvente a presión reducida, el residuo se
trituró con éter o acetona. El precipitado obtenido se filtró para
obtener el clorhidrato del compuesto diana). Los residuos obtenidos
fueron productos diana. Los productos preparados bajo este esquema
se han designado en la Tabla 11 mediante el superíndice "B"
después de la designación del compuesto. Los datos sobre el
rendimiento y las propiedades de los compuestos preparados siguiendo
los Esquemas 16 y 17 se muestran en la Tabla 11. Las designaciones
que incluyen "(2)" indican que el compuesto es un
regioisómero.
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El rendimiento de los inhibidores del MIF
preparados como se describe en los esquemas seleccionados
anteriormente se muestra en la Tabla 12. Las designaciones que
incluyen "(1)" o "(2)" indican que el compuesto es un
regioisómero.
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Los siguientes esquemas ofrecen un procedimiento
general de síntesis de los derivados Boc de ácidos.
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Esquema de reacción
20
Se agitó hasta la disolución una mezcla de ácido
L-tiazolidina-4-carboxílico
(1 g; 7,51 mmol; pureza del 98%; AVOCADO, # 15033), Na_{2}CO_{3}
(1,75 g; 16,5 mmol) en H_{2}O (9 ml) e i-PrOH (1
ml). Después se añadió Boc_{2}O (1,967 g; 9,01 mmol) y la mezcla
se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La suspensión
obtenida se diluyó con agua (10 ml) y se extrajo con hexano (5 ml).
Se separó la fase inferior, se añadió EtOAc (20 ml) y la mezcla se
aciduló con agitación hasta ajustar el pH a 2-3. Se
separó la fase del EtOAc, se extrajo la fase acuosa con EtOAc (3x10
ml). Se lavaron los extractos combinados con agua (10 ml), se
secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporaron a presión reducida.
El residuo se cristalizó con éter y el precipitado obtenido se
filtró para obtener, después de secarse al vacío, ácido
N-Boc-tiazolidina-4-carboxílico
(1,03 g; 59%).
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Pueden sintetizarse las alquilpiperazinas
mediante el siguiente esquema:
Esquema de reacción
21
Se añadió gota a gota una solución de cloruro de
tionilo recién destilada (3,9 ml; 0,053 mol) en dicloruro de
metileno (5 ml) a una solución bajo agitación de
2-tiofenmetanol (4,2 ml; 0,044 mol) y trietilamina
(7,4 ml; 0,05 mol) en dicloruro de metileno (25 ml), manteniéndose
la temperatura a menos de 20ºC. Se elevó entonces a 40ºC durante 1
h, se vertió sobre hielo triturado, se separó la fase
CH_{2}Cl_{2} y se secó sobre MgSO_{4}. Después se añadió gota
a gota a una solución bajo agitación de
N-Boc-piperazina (2 g; 0,011 mol) y
trietilamina (1,5 ml; 0,011 mol) en CH_{2}Cl_{2} (45 ml). Véase
Nicholas A. Meanwell, Piyasena Hewawasam, Jeanine A. Thomas, J.J.
Kim Wright, John W. Russel, Marianne Gamberdella, Harold J.
Goldenberg, Steven M. Seiler, y George Zavoico, Inhibitors of Blood
Platelet cAMP Phosphodiesterase, 4. Structural Variation of the
Side-Chain Terminus of Water-Soluble
1,3-Dihydro-2H-imidazo-[4,5-b]quinolin-2-one
Derivatives, J. Med. Chem. (1993) Vol. 36, págs.
3251-3264; Elena Carceller, Manuel Merlos, Marta
Giral, Carmen Almansa, Javier Bartroli, Julián
García-Rafanell y Javier Forn, Synthesis and
Structure-Activity Relationships of
1-Acyl-4-((2-methyl-3-pyridyl)cyanomethyl)piperazines
as PAF Antagonists, J. Med. Chem. (1993) No. 36, págs.
2984-2997. La mezcla se agitó durante toda la noche
a temperatura ambiente, el disolvente se eliminó a presión reducida,
y el residuo se extrajo con éter. Se evaporó la solución de éter a
presión reducida, se disolvió el residuo en TFA (3,3 ml; 0,043 mol)
y se dejó en reposo durante 30 min. Se eliminó el TFA a presión
reducida, se trituró el residuo con éter, se filtró el precipitado y
se secó al aire produciendo ditriofluoroacetato de
l-(2-tienilmetil)piperazina (3,16 g; 72%).
Véase William J. Archer, Robert Cook, y Roger Taylor, Electrophilic
Aromatic Substitution. Parte 34. Partial Rate Factors for
Detritiation of
Dithieno[1,2-b:4,3-b']benzene,
Dithieno[1,2-b:3,4-b']benzene,
and
Dithieno[2,1-b:3,4-b']benzene,
J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. (1983), págs.
813-819.
Esquema de reacción
22
Se añadió gota a gota una solución de cloruro de
tionilo recién destilada (3,9 ml; 0,053 mol) en dicloruro de
metileno (5 ml) a una solución bajo agitación de alcohol furfurílico
(3,8 ml; 0,044 mol) y trietilamina (7,4 ml; 0,05 mol) en dicloruro
de metileno (25 ml); manteniéndose la temperatura a menos de 20ºC.
Se agitó la mezcla durante 1 h. Después se evaporó el disolvente y
se disolvió el residuo en CH_{2}Cl_{2} (150 ml). Se añadió la
solución obtenida gota a gota a una solución bajo agitación de
N-Boc-piperazina (2 g; 0,011 mol) y
trietilamina (4 ml; 0,029 mol) en CH_{2}Cl_{2} (45 ml). La
mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente, el
disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se extrajo con
éter. Se evaporó la solución de éter a presión reducida, se disolvió
el residuo en TFA (3,3 ml; 0,043 mol) y se dejó en reposo durante 30
min. Se eliminó el TFA a presión reducida, se trituró el residuo con
éter y se filtró el precipitado negro obtenido. Después, el
precipitado se disolvió en 200 ml de MeOH, se añadió carbón activado
y se calentó la mezcla bajo reflujo durante 30 min. Se filtró el
carbón activado, se evaporó el disolvente y el residuo se trituró
con éter. El precipitado blanco obtenido se filtró y se secó al aire
produciendo ditrifluoroacetato de
1-(2-furilmetil)piperazina (1,64 g; 40%).
Véase R. Lukes y V. Dienstbierova, Syntheses von
\alpha-methylfural, Collection Czechoslov.
Chem. Commun. (1954), vol. 19, págs.
609-610.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sulfonamidas pueden sintetizarse según los
siguientes esquemas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió lentamente una solución de
etilnitroacetato (15,96 g, 120 mmol) a una suspensión de hidruro de
sodio (60% en aceite mineral, 5,28 g, 132 mmol) en dimetilacetamida
bajo atmósfera de N_{2}. Se dejó la mezcla bajo agitación a
temperatura ambiente hasta que se detuvo la producción de hidrógeno
gaseoso, después se calentó a 90ºC durante 30 min. y se enfrió a
temperatura ambiente. Se añadió lentamente una solución de anhídrido
N-metilisatoico (23,38 g, 132 mmol) en
dimetilacetamida y se mantuvo durante toda la noche a 120ºC. La
mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se vertió sobre agua con
hielo y se aciduló con HCl al 10% frío. Se filtraron los sólidos
formados y se lavaron varias veces con agua produciendo 7,1 g (27%)
de sólidos amarillos. Punto de fusión 193ºC. ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 3,60 (s, 3H), 7,37 (t,
J =7,6 Hz, 1H), 7,58 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,77 (t,
J =7,5 Hz, 1H), 8,12 (d, J = 7,9 Hz, 1H). EIMS m/z 221
(M+1), 243 (M+23). Anál. (C_{10}H_{8}N_{2}O_{4}) C, H,
N.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentó a 90ºC una suspensión de
595-01 (6,2 g, 28,18 mmol) en 70 ml de oxicloruro de
fósforo durante 3 h. Se evaporó el disolvente a presión reducida. El
residuo se suspendió en agua con hielo y se neutralizó con
bicarbonato de sodio. Los sólidos formados se filtraron y secaron
para obtener 4,91 g (73%) de sólidos de color marrón. Punto de
fusión 235ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta
3,72 (s, 3H), 7,56 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,78 (d, J =
8,6 Hz, 1H), 7,92 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 8,12 (d, J =
7,9 Hz, 1H). EIMS m/z 239 (M+1), 261 (M+23). Anál.
(C_{10}H_{7}N_{2}O_{3}Cl) C, H, N.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió cloruro de
2-tiofencarbonilo (2,04 g, 1,49 ml) a una solución
de ter-butil-1- piperazincarboxilato (2,5 g,
13,4 mmol) y DMAP (20 mg) en piridina (15 ml) a 0ºC bajo atmósfera
de N_{2} y se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente.
La mezcla se vertió sobre agua con hielo, se filtró el precipitado y
se lavó varias veces con agua, y se secó para obtener sólidos
blancos (3,5 g, 88%). Punto de fusión 76ºC. ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 1,42 (s, 12H), 3,40 (m,
4H), 3,61 (m, 4H), 7,12 (m, 1H), 7,43 (d, J = 4,1 Hz, 1H),
7,77 (d, J = 4,8 Hz, 1H). EIMS m/z 297 (M+1), 319 (M+23).
Anál. (C_{14}H_{20}N_{2}O_{3}S) C, H, N.
A una solución de 595-03 (3,5 g,
11,8 mmol) en diclorometano (50 ml) se añadió ácido trifluoroacético
(10 ml). Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 3 h. Se
evaporó el disolvente al vacío y se disolvió el residuo en
cloroformo. Se lavó la fase orgánica con una solución saturada de
bicarbonato de sodio, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporó
para obtener 2,20 g (94%) de un aceite viscoso de color marrón.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 2,78 (m, 4H),
3,59 (m, 4H), 7,12 (t, J = 4,1 Hz, 1H), 7,38 (d, J =
4,1 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 4,8 Hz, 1H). EIMS m/z 197
(M+1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 595-04 (1 g, 5,5
mmol) y diisopropiletilamina (1,74 ml, 10 mmol) a una solución de
595-02 (1,2 g, 5 mmol) en tolueno (100 ml) y se
calentó a 100ºC durante 15 h. Se eliminó el disolvente al vacío. La
purificación del residuo por cromatografía flash
(CH_{2}Cl_{2}/MeOH, 49:1) produjo 1,05 g (53%) de sólidos
amarillos. Punto de fusión 105ºC. ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 3,19 (m, 4H), 3,65 (s, 3H),
3,90 (m, 4H), 7,14 (t, J = 4,5 Hz, 1H), 7,43 (t, J =
7,5 Hz, 1H), 7,48 (d, J =4,1 Hz, 1H), 7,67 (d, J = 8,5
Hz, 1H), 7,80 (m, 2H), 8,05 (d, J = 8,5 Hz, 1H). EIMS m/z 399
(M+1), 421 (M+23). Anál. (C_{19}H_{18}N_{4}O_{4}S) C, H,
N.
A una suspensión de 595-06 (600
mg, 1,5 mmol) en etanol se añadió Pd/C (10%, 75 mg). Se agitó la
suspensión bajo una atmósfera de H_{2} a 60ºC durante 4 h. Se
filtró la mezcla caliente a través de Celite y se evaporó el
filtrado a sequedad. Se recristalizó el residuo en etanol
obteniéndose 490 mg (88%) de sólidos blancos. Punto de fusión 202ºC.
^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 3,20 (an, 2H), 3,49 (an, 2H),
3,65 (an, 2H), 3,79 (s, 3H), 4,13 (an, 2H), 4,71 (an, 2H), 7,08 (t,
J = 4,3 Hz, 1H), 7,22-7,26 (m, 3H),
7,34-7,37 (m, 3H), 7,48 (d, J = 4,9 Hz, 1H),
7,79 (d, J = 8,0 Hz, 1H). EIMS m/z 369 (M+1), 391 (M+23).
Anál. (C_{19}H_{20}N_{4}O_{2}S) C, H, N.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió gota a gota cloruro de metansulfonilo
(0,1 ml, 1,3 mmol) a una solución de 595-09 (120 mg,
0,32 mmol) en piridina (2 ml) bajo una atmósfera de N_{2} y se
agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. Se evaporó el
disolvente al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo. Se
lavó la fase orgánica sucesivamente con solución saturada de
NaHCO_{3}, agua y solución salina. Se secó la fase orgánica sobre
Na_{2}SO_{4} y se evaporó hasta obtener un residuo que se lavó
con éter para producir 103 mg (73%) de sólidos blancos. Punto de
fusión 223ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta
3,08 (s, 3H), 3,31 (m, 4H), 3,64 (s, 3H), 3,95 (m, 4H), 7,15 (t,
J = 4,0 Hz, 1H), 7,33 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,44 (d,
J = 4,0 Hz, 1H), 7,56 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,66 (t,
J = 7,4 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,98 (d,
J = 8,2 Hz, 1H), 8,84 (s, 1H). EIMS m/z 447 (M+1), 469
(M+23). Anál. (C_{20}H_{22}N_{4}O_{4}S_{2}) C, H, N. 1
Se pueden preparar otras sulfonamidas mediante
rutas sintéticas similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo los esquemas siguientes se pueden
sintetizar sulfonilos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió gota a gota una solución de
4-metilbencentiol (5 g, 40,25) en THF anhidro a una
suspensión de NaH (60% en aceite mineral, 1,98 g, 48,30) en THF a
temperatura ambiente y se agitó durante 30 min. bajo una atmósfera
de N_{2}. Se añadió lentamente etilbromoacetato (4,9 ml, 44,27) a
esta solución y se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Se
eliminó el disolvente al vacío. Se disolvió el residuo en HCl
diluido y se extrajo con etilacetato. La fase orgánica combinada se
lavó sucesivamente con solución saturada de NaHCO_{3}, agua y
solución salina, y se secó sobre Na_{2}SO_{4}. La evaporación de
la fase orgánica produjo 8,46 g (99%) de un aceite incoloro. ^{1}H
RMN (CDCl_{3}): \delta 1,22 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,32 (s,
3H), 3,57 (s, 2H), 4,14 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 7,11 (d,
J = 8,0 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 8,0 Hz, 2H). EIMS m/z
210 (M+1), 233 (M+23).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de 595-29 (10 g,
47,55 mmol) en diclorometano se añadió ácido
m-cloroperbenzoico (21,31 g, 95,10 mmol) en
porciones a 0ºC. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se
agitó durante toda la noche. Los sólidos formados se filtraron y el
filtrado se lavó sucesivamente con NaOH 1N, agua y solución salina.
La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporó para
producir 9,8 g (85%) de un aceite incoloro. ^{1}H RMN
(CDCl_{3}): \delta 1,22 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,45 (s,
3H), 4,08 (s, 2H), 4,17 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 7,37 (d,
J = 8,0 Hz, 2H), 7,83 (d, J = 8,0 Hz, 2H). EIMS m/z
243 (M+1), 265 (M+23).
A una solución de 595-35 (9,8 g,
40,49 mmol) se añadió lentamente una suspensión de hidruro de sodio
(60% en aceite mineral, 1,78 g, 44,52 mmol) en dimetilacetamida bajo
una atmósfera de N_{2}. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente
hasta que se detuvo la producción de hidrógeno gaseoso, después se
calentó a 90ºC durante 30 min. y se enfrió a temperatura ambiente.
Se añadió lentamente una solución de anhídrido
N-metilisatoico (7,88 g, 44,52 mmol) en
dimetilacetamida y se calentó durante toda la noche a 120ºC. La
mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se vertió sobre agua con
hielo y se aciduló con HCl al 10% frío. Se filtraron los sólidos
formados y se lavaron varias veces con agua para obtener 5,7 g (43%)
de sólidos blancos. Punto de fusión 191ºC. ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 2,39 (s, 3H), 3,44 (s, 3H),
7,36 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,42 (d, J = 8,2 Hz, 2H),
7,55 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,81 (t, J = 7,1 Hz, 1H),
7,95 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 8,11 (d, J = 8,0 Hz, 1H).
EIMS m/z 330 (M+1), 352 (M+23). Anál. (C_{17}H_{15}NO_{4}S) C,
H, N.
Se calentó a 130ºC una suspensión de
595-36 (5,2 g, 5,9 mmol) en 30 ml de oxicloruro de
fósforo durante 30 h. Se evaporó el disolvente a presión reducida.
El residuo se suspendió en agua con hielo y se neutralizó con
bicarbonato de sodio. Los sólidos formados se filtraron y se secaron
para obtener 2,3 g (43%) de sólidos blancos. Punto de fusión 193ºC.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 2,38 (s, 3H),
3,52 (s, 3H), 7,39 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,48 (d, J =
7,5 Hz, 1H), 7,64 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,84 (t, J =
7,1 Hz, 1H), 7,94 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 8,32 (d, J =
8,0 Hz, 1H). EIMS m/z 348 (M+1), 370 (M+23). Anál.
(C_{17}H_{14}NO_{3}SCl) C, H, N.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió diisopropiletilamina (0,38 ml, 2,22
mmol) a una solución de 595-46 (289 mg, 0,83 mmol) y
595-04 (195 mg, 0,99 mmol) en tolueno y se calentó
durante toda la noche a 105ºC. Se enfrió la solución y se evaporó el
disolvente al vacío. Se añadió agua al residuo óleo y se sometió a
ultrasonido. Se filtraron los sólidos formados y se lavaron con agua
y éter para producir sólidos amarillos, 360 mg (86%). Punto de
fusión 213ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta
2,37 (s, 3H), 3,37 (s, 3H), 3,65 (m, 4H), 3,94 (m, 4H), 7,16 (t,
J = 4,3 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,39 (t,
J = 7,6 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 7,54 (d,
J = 8,5 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,80 (d,
J =4,5 Hz, 1H), 8,15 (d, J = 8,2 Hz, 2H). EIMS m/z 508
(M+1), 530 (M+23). Anál. (C_{26}H_{25}N_{3}O_{4}S_{2}) C,
H, N.
Se añadió lentamente una solución de acetato de
etilemetansulfonilo (3,78 g, 22,74 mmol) a una suspensión de hidruro
de sodio (60% en aceite mineral, 1,07 g, 25 mmol) en
dimetilacetamida bajo una atmósfera de N_{2}. Se agitó la mezcla a
temperatura ambiente hasta que se detuvo la producción de hidrógeno
gaseoso, después se calentó a 90ºC durante 30 min. y se enfrió a
temperatura ambiente. Se añadió lentamente una solución de anhídrido
N-metilisatoico (4,43 g, 25 mmol) en
dimetilacetamida y se calentó durante toda la noche a 120ºC. La
mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se vertió sobre agua con
hielo y se aciduló con HCl 10% frío. Se filtraron los sólidos
formados y se lavaron varias veces con agua para obtener 2,76 g
(48%) de sólidos blancos. Punto de fusión 170ºC. ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 3,51 (s, 3H), 3,59 (s, 3H),
7,39 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,62 (d, J= 8,5 Hz, 1H),
7,84 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 8,09 (d, J = 8,0 Hz, 1H).
EIMS m/z 254 (M+1), 276 (M+23). Anál. (C_{11}H_{11}NO_{4}S) C,
H, N.
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentó a 130ºC una suspensión de
595-05 (1,5 g, 5,9 mmol) en 30 ml de oxicloruro de
fósforo durante 30 h. Se evaporó el disolvente a presión reducida.
El residuo se suspendió en agua con hielo y se neutralizó con
bicarbonato de sodio. Los sólidos formados se filtraron y se secaron
para obtener 773 mg (48%) de sólidos blancos. Punto de fusión 221ºC.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 3,48 (s, 3H),
3,68 (s, 3H), 7,49 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,72 (d, J =
8,5 Hz, 1H), 7,89 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 8,29 (d, J =
8,5 Hz, 1H). EIMS m/z 272 (M+1), 294 (M+23). Anál.
(C_{11}H_{10}ClNO_{3}S)C, H,N.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió diisopropiletilamina (0,38 ml, 2,22
mmol) a una solución de 595-14 (300 mg, 1,11 mmol) y
595-04 (239 mg, 1,21 mmol) en tolueno y se calentó
durante toda la noche a 105ºC. Se enfrió la solución y se evaporó el
disolvente al vacío. Se añadió agua al residuo óleo y se sometió a
ultrasonido. Se filtraron los sólidos formados y se lavaron con agua
y éter para producir sólidos amarillos, 384 mg (81%). Punto de
fusión 224ºC. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta
3,36 (s, 3H), 3,52 (m, 4H), 3,60 (s, 3H), 3,91 (m, 4H), 7,16 (t,
J = 3,5 Hz, 1H), 7,37 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,47 (d,
J = 3,5 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,57 (t,
J = 8,1 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 8,10 (d,
J = 8,5 Hz, 1H). EIMS m/z 432 (M+1), 454 (M+23). Anál.
(C_{20}H_{21}N_{3}O_{4}S_{2}) C, H, N.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió lentamente una solución de
dietilmalonato (80 g, 0,50 mmol) a una suspensión de hidruro de
sodio (60% en aceite mineral, 22 g, 0,55 mol) en dimetilacetamida
bajo una atmósfera de N_{2}. Se agitó la mezcla a temperatura
ambiente hasta que se detuvo la producción de hidrógeno gaseoso,
después se calentó a 90ºC durante 30 min. y se enfrió a temperatura
ambiente. Se añadió lentamente una solución de anhídrido isatoico
(89,72 g, 0,55 mmol) en dimetilacetamida y se calentó durante 15 h a
120ºC. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se vertió sobre
agua con hielo y se aciduló con HCl 10% frío. Se filtraron los
sólidos formados y se lavaron varias veces con agua para obtener 55
g (47%) de sólidos blancos. Punto de fusión 173ºC. ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 1,30 (t, J = 6,9 Hz,
3H), 4,33 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 7,18 (t, J = 7,5 Hz,
1H), 7,26 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,62 (t, J = 7,2 Hz,
1H), 7,93 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 11,50 (s, 1H), 13,5 (s, 1H).
EIMS m/z 234 (M+1), 256 (M+23). Anál. (C_{12}H_{11}O_{4}) C,
H, N.
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentó a reflujo una suspensión de
595-68 (35 g, 150 mmol) en 200 ml de oxicloruro de
fósforo durante 30 min. Se evaporó el disolvente a presión reducida.
El residuo se suspendió en agua con hielo y se neutralizó con
bicarbonato de sodio. El sólido formado se filtró y se secó para
obtener 39 g (97%) de sólidos blancos. Punto de fusión 93ºC. ^{1}H
RMN (DMSO-d_{6}): \delta 1,37 (t, J = 6,9
Hz, 3H), 4,49 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 7,89 (t, J = 8,5
Hz, 1H), 8,02 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 8,10 (d, J = 8,3
Hz, 1H), 8,28 (d, J = 8,0 Hz, IH). EIMS m/z 270 (M+1), 292
(M+23). Anál. (C_{12}H_{9}Cl_{2}NO_{2}) C, H, N.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió acetato de amonio (12,6 g, 164 mmol) a
una solución de 595-72 (40,17 g, 149 mmol) en ácido
acético (150 ml). Se calentó la mezcla a 140ºC durante 4 h. La
solución se enfrió y se vertió en agua con hielo. Los sólidos
formados se filtraron, se lavaron con agua y se secaron para obtener
sólidos blancos (34 g, 91%). Punto de fusión 186ºC. ^{1}H RMN
(DMSO- d_{6}): \delta 1,37 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 4,50 (q,
J = 6,9 Hz, 2H), 7,87 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 8,01 (t,
J = 7,0 Hz, 1H), 8,08 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,26 (d,
J = 8,2 Hz, 1H). EIMS m/z 252 (M+ 1). Anál.
(C_{12}H_{10}ClNO_{3}) C, H, N.
A una solución de 595-76 (7 g,
27,8 mmol) en dimetilacetamida se añadió
1,4-diazabiciclo(2,2,2)octano (6,23 g,
55,6 mmol) y 595-04 (6 g, 30,6 mmol). Se calentó la
solución a 115ºC durante 15 h. Se enfrió la mezcla de reacción y se
vertió en agua con hielo. Se filtraron los sólidos formados, se
lavaron con agua y se secaron para producir sólidos blancos (7 g,
62%), Punto de fusión 198ºC. ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): \delta 1,28 (t, J = 6,9 Hz,
3H), 3,12 (m, 4H), 3,87 (m, 4H), 4,28 (q, J = 6,9 Hz, 2H),
7,15 (t, J = 4,3 Hz, 1H), 7,23 (t, J = 7,5 Hz, 1H),
7,31 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,45 (d, J = 3,1 Hz, 1H),
7,54 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 4,9 Hz, 1H),
7,87 (d, J = 8,0 Hz, 1H). EIMS m/z 412 (M+1), 434 (M+23).
Anál. (C_{21}H_{21}N_{3}O_{4}S.0,5H_{2}O) C, H, N.
\vskip1.000000\baselineskip
A una suspensión de hidruro de sodio (60% en
aceite mineral, 0,78 g, 19,46 mmol) en DMF se añadió lentamente una
solución de 595-77 (7 g, 17,03 mmol) en DMF. La
suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. A esta
solución se añadió lentamente 4- fluorobencilbromuro y se agitó
durante 2 h más. Se vertió la mezcla en agua con hielo y se aciduló
con HCl al 10% frío. El sólido formado se separó, lavó con agua y
purificó por cromatografía flash (CH_{2}Cl_{2}/MeOH, 49:1) para
producir 5,9 g (67%) de sólidos blancos. Punto de fusión 52ºC.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 1,30 (t,
J = 6,9 Hz, 3H), 3,16 (m, 4H), 3,89 (m, 4H), 4,32 (q,
J = 6,9 Hz, 2H), 7,14-7,17 (m, 3H),
7,24-7,27 (m, 2H), 7,31 (t, J = 7,6 Hz, 1H),
7,44-7,47 (m, 2H), 7,58 (t, J = 8,5 Hz, 1H),
7,79 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 8,5 Hz, 1H).
EIMS m/z 520 (M+1), 542 (M+23). Anál.
(C_{28}H_{26}FN_{3}O_{4}S.H_{2}O) C, H, N.
A continuación se describe la síntesis de una
biblioteca de compuestos de estructura general (Ia) y (Ib) como se
muestra anteriormente. Los compuestos que incluyen una "M" en
la designación contienen un grupo -COOEt. Los compuestos que
incluyen una "N" en la designación contienen un grupo
-NO_{2}. Las dos cifras después de la "M" o "N"
corresponden a la designación numérica para el grupo funcional R2 y
R3, respectivamente, suministrados a continuación. El número que
precede la "M" o "N" corresponde a la designación numérica
para el grupo funcional R1. Los compuestos tienen las siguientes
estructuras, excepto aquellos con designaciones que incluyen
"+i".
En compuestos con la designación donde se
incluye "+i", R_{3} es un sustituyente en el átomo de oxígeno
del grupo quinolona en lugar de en el grupo de nitrógeno, esto es,
un compuesto con la estructura (Ib) indicada abajo. La designación
"i" aparece en otras partes de las realizaciones preferidas y
se refiere a un sustituyente en el átomo de oxígeno del grupo
quinolona en lugar del átomo de nitrógeno.
Designaciones numéricas para los
grupos funcionales
R1
Designaciones numéricas para los
grupos funcionales
R2
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Designaciones numéricas para los grupos
funcionales R3
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En la Tabla 13 se muestran las designaciones
numéricas de los inhibidores del MIF.
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A continuación se detallan los esquemas de
reacción para la preparación de compuestos intermedios o inhibidores
del MIF.
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Esquema de reacción
21
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\newpage
Todos los siguientes compuestos se obtuvieron
usando el mismo procedimiento o uno parecido. Compuesto 1M21:
rendimiento 176 mg 56,56%; Compuesto 1M31: rendimiento 64 mg,
20,60%; Compuesto 1M41: rendimiento 110 mg 35,48%; Compuesto 1M51:
rendimiento 139 mg 44,18%; Compuesto 1M61: rendimiento 88 mg 28,37%;
Compuesto 2M13: rendimiento 144 mg 38,09%; Compuesto 2M21:
rendimiento 113 mg 36,73%; Compuesto 2M23: rendimiento 137 mg,
36,16%; Compuesto 2M31: rendimiento 27 mg 8,67%; Compuesto 2M33:
rendimiento 141 mg 37,45%; Compuesto 2M41: rendimiento 72 mg 23,30%;
Compuesto 2M43: rendimiento 117 mg, 31,54%; Compuesto 2M51:
rendimiento 65 mg 21,20%; Compuesto 2M53: rendimiento 91 mg 24,87%;
Compuesto 2M61: rendimiento 113 mg 36,94%; Compuesto 2M63:
rendimiento 127 mg, 33,99%; Compuesto 3M11: rendimiento 58 mg
19,00%; Compuesto 3M21: rendimiento 134 mg 43,32%; Compuesto 3M31:
rendimiento 117 mg 37,50%; Compuesto 3M41: rendimiento 141 mg,
45,83%; Compuesto 3M51: rendimiento 119 mg 38,42%; Compuesto 3M61:
rendimiento 142 mg 45,85%; Compuesto 3M63: rendimiento 40 mg
11,00%.
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Esquema de reacción
22
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(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Se preparan derivados de Boc de ácidos mediante
el siguiente esquema de reacción.
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Esquema de reacción
23
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En la Tabla 13 se muestran los rendimientos y
pureza de los compuestos preparados siguiendo el Esquema 25.
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\newpage
Se preparó una serie de inhibidores del MIF
mediante los siguientes esquemas de reacción. Se usan las siguientes
abreviaciones para los reactivos: DCM = diclorometano, DMA
-dimetilacetamida; DMF = N-dimetilformamida; HOAc =
ácido acético; MeCN = acetonitrilo; DABCO = trietilendiamina; TEBAC
= cloruro de benciltríetilamonio; NMP =
1-metil-2-pirrolidinona;
BOC = ter-BuOCO; PPA = ácido polifosfórico; TFA =
ácido trifluoroacético.
A una solución bajo agitación intensa de ácido
2-amino-5-metilbenzoico
(67,7 g, 0,45 mol) en una mezcla de 250 ml de dioxano y 150 ml de
tolueno se añadió gota a gota una solución de difosgeno (97,6 g,
0,49 mol) en 80 ml de dioxano. La mezcla de reacción se mantuvo bajo
agitación durante 12 horas y después se filtró el precipitado y se
lavó con éter. Se combinaron el filtrado y las fracciones etéreas y
se eliminó el disolvente a presión reducida. Se tituló el residuo
con hexano y el precipitado resultante se filtró, se lavó con hexano
y se secó a temperatura ambiente durante toda la noche. Compuesto
2000: rendimiento 66,5 g (84%), pureza 93% (LCMS).
A una suspensión bajo agitación de NaH (18,9 g,
0,47 mol) en DMA anhidro, se añadió gota a gota éster malónico. La
mezcla de reacción se agitó durante 20 min y se enfrió a 30ºC. Se
añadió anhídrido isatoico en porciones a la solución obtenida. La
mezcla de reacción se calentó a 130-150ºC durante 10
horas y después se destiló el DMA. El residuo se tituló con agua y
se aciduló usando HCl al 10% hasta un pH = 3. El precipitado
resultante se filtró y se lavó con agua. El material sólido se puso
en un matraz de Erlenmeyer de 2 1, se añadió 1 1 de agua y se ajustó
el pH a 12-13 usando K_{2}CO_{3}. Se filtró la
solución obtenida y el filtrado se aciduló con HCl al 10% hasta un
pH = 2-3. El precipitado se filtró, se lavó con éter
y se cristalizó con dioxano. Compuesto 2M00: rendimiento 23,3 g
(24%), pureza: 90% (LCMS).
A la suspensión de 2M00 (23,0 g, 0,093 mol) en
tolueno (40 ml) se añadieron 71,3 g de POCl_{3} (43 ml, 0,465
mol). La solución obtenida se calentó a reflujo durante 1,5 horas.
El disolvente se destiló a presión reducida y el aceite residual se
extrajo sucesivamente con heptano (control mediante CCF). Se
evaporaron las fracciones combinadas de heptano y el residuo se
calentó con 200 ml de agua y se filtró. Después de secarse a
temperatura ambiente durante 18 horas, el compuesto dicloro obtenido
se transfirió a un matraz de fondo redondo de 250 ml y se añadieron
90 ml de ácido acético y 8,0 g de acetato de amonio. Se calentó la
mezcla de reacción al reflujo durante aproximadamente 2 horas
(control por LCMS y TLC). Una vez que no pudo detectarse la materia
prima en la mezcla de reacción, se vertió la solución caliente en
agua y el precipitado resultante se filtró. En la Tabla 14 se
muestran el rendimiento y la pureza de los compuestos preparados
siguiendo el esquema anterior.
Método A: A la solución de 1,0 g de 2M00 (3,77
mmol) en DMA, se añadieron en secuencia 0,75 g de acilpiperazina
(4,16 mmol) y 0,84 g de DABCO (7,5 mmol). Se agitó la mezcla de
reacción a 100-120ºC durante 15 horas. La reacción
se detuvo con una solución de NH_{4}Cl al 20% y el precipitado
producido se filtró y se lavó con agua. El producto se secó en un
desecador sobre P_{2}O_{5} a temperatura ambiente a presión
reducida. El producto se empleó en la siguiente reacción sin
purificación adicional.
Método B: Se agitó una mezcla de 1,0 g de
cloroquinolona 2M00 (3,77 mmol), 1,55 g de trifluoroacetato de
acilpiperazina AV-0050 (4,41 mmol) y 0,84 g de DABCO
(7,53 mmol) en 3 ml de DMF a 101ºC durante toda la noche. La mezcla
se vertió en 50 ml de solución salina, el sólido obtenido se filtró,
se lavó con agua, y se secó en un desecador sobre P_{2}O_{5} a
temperatura ambiente y a presión reducida. El producto se empleó en
la siguiente reacción sin purificación adicional.
En la Tabla 15 se muestran los rendimientos de
los compuestos obtenidos.
A la suspensión de 0,03 g de NaH (0,8 mmol) en
DMF anhidro (1 ml) se añadieron 0,30 g del compuesto 2M10 (0,7
mmol). Después de que se detuvo la producción de gas se añadieron
0,19 g de bromuro de bencilo (1,1 mmol). Se agitó la mezcla de
reacción hasta que no pudieron detectarse trazas de la materia prima
(control mediante LCMS). Se añadió la solución de NH_{4}Cl al 20%
(2 ml) a la reacción y la mezcla obtenida se extrajo con DCM. Se
aisló el compuesto 2M12 y se purificó mediante HPLC preparativa
(columna de sílice C-18, 150 mm x 41 mm, 40 ml/min,
gradiente: agua-acetonitrilo = de 60:40 a 5:95, 20
min). Compuesto 2M12: rendimiento 114 mg (31%), pureza>99%
(HPLC):
Método A: A la suspensión de 0,03 g de NaH (0,8
mmol) en DMF anhidro (2 ml) se añadieron 300 mg (0,7 mmol) del
compuesto 1M60. Después de que se detuvo la producción de gas
(\sim30 min), se añadió la solución de cloruro de
dimetilaminoetilo (2,1 mmol) en éter. Se calentó la mezcla de
reacción a 100ºC (se eliminó el éter por destilación) durante 12 h.
Se enfrió la solución a temperatura ambiente y se ajustó el pH de la
solución a pH 9 con solución de AcOH al 1% en agua. La mezcla se
extrajo con DCM (3x3 ml) y las fracciones combinadas de DCM se
lavaron con solución salina y se secaron sobre MgSO_{4}. Se
eliminó el DCM en un rotavapor y el producto se purificó mediante
CCF preparativa (gel de sílice GF AnalTech, 1000 g, eluyente:
CHCl_{3}:EtOH = 4:1). Compuesto 1M64: rendimiento 84 mg (24%),
pureza>99% (HPLC).
Método B: A una suspensión de 0,114 g de NaH
(2,84 mmol; de dispersión al 60% en aceite mineral) en 3 ml de NMP,
se añadió en porciones 0,33 g (0,676 mmol) de quinolona 2M50.
Después de que se detuvo la producción de gas (\sim30 min), se
agitó la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente y se añadieron
0,195 g de clorhidrato de dimetilaminoetilcloruro (1,35 mmol). Se
calentó la mezcla obtenida a 100ºC durante toda la noche. La mezcla
de reacción se enfrió y se vertió en agua (25 ml) y el sólido
obtenido se filtró, se lavó con agua y se secó a 85ºC durante toda
la noche. El isómero diana se aisló mediante CCF preparativa (gel de
sílice GF AnalTech, 1500 g, eluyente: 10% de trietilamina en EtOAc,
mancha inferior). Compuesto 2M54: rendimiento 68 mg (18%).
A la suspensión de NaH (0,03 g, 0,8 mmol) en DMF
anhidro (2 ml) se añadió el compuesto 1M60 (300 mg, 0,7 mmol).
Después de que se detuvo la producción de gas (\sim30 min), se
añadió la solución de cloruro de dimetilaminoetilo (2,1 mmol) en
éter. Se calentó la mezcla de reacción a 100ºC (se eliminó el éter
por destilación) durante 12 h. Se enfrió la solución a temperatura
ambiente y se ajustó el pH de la mezcla a pH = 9 con solución de
AcOH al 1% en agua. La mezcla se extrajo con DCM (3x3 ml) y las
fracciones combinadas de DCM se lavaron con solución salina y se
secaron sobre MgSO_{4}. Se eliminó el DCM en un rotavapor y el
producto se purificó mediante CCF preparativa (gel de sílice GF
AnalTech, 1000 g, eluyente: CHCl_{3}:EtOH = 4:1). Compuesto 1M64:
rendimiento 57 mg, pureza>99% (HPLC). Todos los siguientes
compuestos se obtuvieron usando el mismo procedimiento o uno
parecido. Compuesto 1M34: rendimiento 77 mg, 22,00%; Compuesto 1M54:
rendimiento 58 mg, 16,88%; Compuesto 1M64: rendimiento 84 mg 24,00%;
Compuesto 2M14: rendimiento 57 mg 16,25%; Compuesto 2M34:
rendimiento 63 mg 17,95% y Compuesto 2M64: rendimiento 42 mg,
12,00%.
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Esquema de reacción
24
Compuesto 1M15...3M65: Todos los compuestos
enumerados a continuación se obtuvieron usando el procedimiento
descrito anteriormente para el compuesto 1M64. Compuesto 3M15: 36
mg, 13%; Compuesto 3M65: 5 mg, 1%; Compuesto 1M65: 31 mg, 9%;
Compuesto 1M45: 34 mg, 10%; Compuesto 1M55: 51 mg, 15%; Compuesto
1M35: 51 mg, 14%; Compuesto 3M45: 52 mg, 15%; Compuesto 3M25: 24 mg,
7%; Compuesto 3M35: 71 mg, 20%; Compuesto 3M35i: 16 mg, 4%;
Compuesto 3M15i: 22 mg, 8%; Compuesto 1M65Í: 20 mg, 6%; Compuesto
1M45i: 27 mg, 8%; Compuesto 1M35Í: 28 mg, 8%; Compuesto 3M65i: 23
mg, 6%.
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Esquema de reacción
25
\newpage
A la solución de 10 g de
p-toluidina (93,3 mmol) y Et_{3}N (13,6 ml) en
DCM
(100 ml) se añadió gota a gota
cloruro de monoetilmalonato (17,72 ml) a 0-5ºC (baño
de agua con hielo). Después de terminarse la reacción (control por
CCF), la mezcla de reacción se vertió en agua (300 ml) y se ajustó
el pH a 2 con HCl(c.). Se separó la capa orgánica y se
extrajo la capa acuosa con DCM (3 x 50 ml). Los extractos de DCM
combinados se lavaron con solución salina (50 ml) y se secaron sobre
sulfato de sodio. Se eliminó el DCM en un rotavapor y el residuo se
disolvió en una mezcla de 600 ml de MeOH y 400 ml de NaOH 1N. Se
calentó la mezcla de reacción al reflujo durante 3 horas, se enfrió
a temperatura ambiente y se aciduló con HCl 2N a pH 2. Se eliminó el
MeOH a presión reducida y se extrajo el agua con EtOAc (3 x 100 ml).
La fase orgánica se lavó con solución salina, se secó sobre sulfato
de sodio y el disolvente se eliminó a presión reducida. Al residuo
se añadieron 40 g de PPA y la mezcla se agitó con un agitador
magnético y se calentó a 170ºC durante 3 horas. Se enfrió la mezcla
de reacción a temperatura ambiente y se diluyó lentamente con 500 ml
de HCl 1N. Se ajustó el pH de la solución obtenida con una solución
de NaOH al 20% en agua hasta pH 4. Se filtró el precipitado
producido, se lavó con agua y se secó en un desecador sobre NaOH
durante toda la noche. El rendimiento de 05 fue 13,2 g
(81%).
A la solución de 13,2 g de
5-metil-2,4-dihidroxiquinolina
en ácido acético glacial (200 ml) se añadieron lentamente 25 ml de
HNO_{3} (63%). Se calentó la mezcla de reacción a 90ºC durante 30
min, se enfrió a temperatura ambiente y se vertió sobre agua (700
ml). Se filtró el precipitado producido y se lavó con agua. El
compuesto obtenido se secó sobre NaOH en un desecador durante toda
la noche. El rendimiento de 06 fue 7,68 g (44%).
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A la suspensión bajo agitación de
dihidroxiquinolinona 01 (50 g) en ácido acético glacial (600 ml) se
añadieron 98 ml de HNO_{3} (63%). Se calentó la mezcla de reacción
a 90ºC durante 30 min. y se enfrió a temperatura ambiente. Se filtró
el precipitado producido y se lavó con agua (5 x 100 ml). El
compuesto obtenido se secó sobre P_{2}O_{5} en un desecador
durante toda la noche. El rendimiento de 1NOO fue 52,7 g (82%).
\newpage
Esquema de reacción
26
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A una solución de 15 g de anhídrido
5-cloroisatoico 3000 (75,91 mmol) en DMF (75 ml) se
añadieron carbonato de potasio anhidro (8,85 g) y 14,46 g de yoduro
de metilo (114 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura
ambiente durante 18 h y se vertió en agua con hielo. Se filtró el
precipitado, se lavó con agua y se secó sobre P_{2}O_{5} en un
desecador durante toda la noche. Compuesto 3001: rendimiento 15,3 g
(95%), pureza > 90% (LCMS). Compuesto 3003: rendimiento 18,2 g
(79%), pureza > 90% (LCMS). Todos los compuestos dados a
continuación se obtuvieron usando el mismo procedimiento o uno
similar: Compuesto 3002: 16,1 g, rendimiento 74%, pureza > 90%
(LCMS); Compuesto 3003: 18,2 g; rendimiento 78,5%, pureza > 90%
(LCMS).
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(Esquema pasa a página
siguiente)
A la solución bajo agitación de 7,5 ml de
nitroacetato de etilo (68 mmol) en 50 ml de DMF se añadieron 2,85 g
de NaH en porciones. Después de que la producción de hidrógeno se
detuvo, se calentó la mezcla a 80ºC durante 15 min. Se añadió la
solución de 15 g (71 mmol) de anhídrido
N-metilisatoico 3001 en 60 ml de DMF durante 15
min., después de lo cual se calentó la reacción a 120ºC durante 18
h. Se eliminó el disolvente por destilación, el residuo se disolvió
en agua y se aciduló con HCl 6N a pH = 4. Se recogió el precipitado,
se lavó con agua y se secó en un desecador sobre NaOH durante toda
la noche. Compuesto 3N01: rendimiento 16,6 g (92%), pureza > 90%
(LCMS). Compuesto 3N03: rendimiento 18,5 g (89%), pureza > 90%
(LCMS). Compuesto 3N03: rendimiento 18,5 g (89%), pureza > 90%
(LCMS).
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Esquema de reacción
27
A una solución de 18,8 g de quinolona 3N00 (78,1
mmol) y 71 g de cloruro de trietilbencilamonio (312 mmol) en MeOH
(290 ml), se añadieron 32 ml de POCl_{3} (344 mmol). Se agitó la
mezcla durante toda la noche. Se eliminó el disolvente a presión
reducida y se agitó el residuo en agua (290 ml) durante 3 h. Se
filtró el precipitado sólido, se lavó con agua, se secó, se lavó con
ciclohexano caliente, se secó y se cristalizó dos veces con
THF-hexano. Compuesto 3N00(Cl): rendimiento
5,59 g (28%), pureza > 95% (LCMS).
Se agitó durante toda la noche una mezcla de
0,30 g de cloroquinolona 3N00(Cl) (1,16 mmol), 0,45 g de
trifluoroacetato de acilpiperazina AV-0050 (1,22
mmol) y 0,26 g de 15 DABCO (2,32 mmol) en 2 ml de DMF. Después, la
mezcla se vertió en agua (15 ml), se filtró el sólido obtenido, se
lavó con agua y se secó sobre P_{2}O_{5} en un desecador durante
toda la noche. El producto se usó en la siguiente reacción sin
purificación adicional. Compuesto 3N50: rendimiento 0,50 g (90%),
pureza > 95% (LCMS).
Se han descrito las realizaciones preferidas con
respecto a las realizaciones específicas.
Claims (73)
1. Un compuesto con estructura:
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o un estereoisómero, o una sal
farmacéuticamente aceptable de él,
donde:
X es oxígeno;
Y se selecciona entre el grupo formado por
-NO_{2}, -C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y
-C(=O)NR_{5}R_{6};
Z es -CH_{2}-;
n es 1;
R_{1} se selecciona entre el grupo formado por
hidrógeno, alquilo C_{1-10}, arilo
C_{1-10} alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo
monocíclico de 5 a 7 miembros y heterociclo policíclico de 7 a 14
miembros, donde R_{1} está sustituido o no con al menos un
sustituyente seleccionado del grupo formado por halógeno, alcoxi,
alquilamino, dialquilamino y ceto;
R_{2} y R_{3} se seleccionan
independientemente del grupo formado por halógeno, hidrógeno y
alquilo C_{1-10};
R_{4} se selecciona del grupo formado por
-CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6},
-C(=O)OR_{7} y -C(=O)R_{7};
cada R_{5} y R_{6} se selecciona
independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo
C_{1-10} y arilo C_{1-10}
alquilo;
o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo
de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo monocíclico
de 5 a 7 miembros o un heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros,
donde R_{5} y R_{6} están independientemente sustituidos o no
con al menos un sustituyente seleccionado del grupo formado por
halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto;
R_{7} se selecciona del grupo formado por
alquilo C_{1-10}, arilo C_{1-10}
alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo monocíclico de 5 a 7 miembros
y heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros, donde R_{7} está
sustituido o no con al menos un sustituyente seleccionado del grupo
formado por halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, o un estereoisómero, o una sal farmacéuticamente
aceptable de él, donde:
Y es -NO_{2}.
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3. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, o un estereoisómero, o una sal farmacéuticamente
aceptable de él, donde:
Y es -C(=O)OCH_{2}CH_{3}.
\newpage
4. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, o un estereoisómero, o una sal farmacéuticamente
aceptable de él, donde:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, o un estereoisómero, o una sal farmacéuticamente
aceptable de él, donde:
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6. Un compuesto con estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
o un estereoisómero, o una sal
farmacéuticamente aceptable de él,
donde:
X es oxígeno;
Y se selecciona entre el grupo formado por
-NO_{2}, -C(=O)R_{5}, -C(=O)OR_{5} y
-C(=O)NR_{5}R_{6};
Z es -CH_{2}-;
n es 1;
R_{1} se selecciona entre el grupo formado por
hidrógeno, alquilo C_{1-10}, arilo
C_{1-10} alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo
monocíclico de 5 a 7 miembros,
-NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N(CH_{3})_{2} y
heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros, donde R_{1} está
sustituido o no con al menos un sustituyente seleccionado del grupo
formado por halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto;
R_{2} y R_{3} se seleccionan
independientemente del grupo formado por halógeno, hidrógeno y
alquilo C_{1-10};
R_{4} se selecciona del grupo formado por
-CH_{2}R_{7}, -C(=O)NR_{5}R_{6},
-C(=O)OR_{7} y -C(=O)R_{7};
cada R_{5} y R_{6} se selecciona
independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo
C_{1-10} y arilo C_{1-10}
alquilo;
o R_{5} y R_{6} conjuntamente con un átomo
de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo monocíclico
de 5 a 7 miembros o un heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros,
donde R_{5} y R_{6 } están independientemente sustituidos o no
con al menos un sustituyente seleccionado del grupo formado por
halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto;
R_{7} se selecciona del grupo formado por
alquilo C_{1-10}, arilo C_{1-10}
alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo monocíclico de 5 a 7 miembros
y heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros, donde R_{7} está
sustituido o no con al menos un sustituyente seleccionado del grupo
formado por halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, o un estereoisómero, o una sal farmacéuticamente
aceptable de él, donde:
Y es -C(=O)OCH_{2}CH_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, o un estereoisómero, o una sal farmacéuticamente
aceptable de él, donde:
R_{1} es
-NCH_{2}CH_{2}CH_{2}N(CH_{3})_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, o un estereoisómero, o una sal farmacéuticamente
aceptable de él, donde:
Y es -NO_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, o un estereoisómero, o una sal farmacéuticamente
aceptable de él, donde:
R_{4} se selecciona del grupo formado por:
\vskip1.000000\baselineskip
11. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
\newpage
12. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
13. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
14. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
15. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
16. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
17. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
\newpage
18. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
19. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
20. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
\newpage
21. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
22. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
23. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
24. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
25. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
26. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
\newpage
27. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
28. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
29. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
30. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
31. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
32. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
33. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
34. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 1, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
35. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
\newpage
36. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
37. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
38. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
39. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
40. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
41. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
42. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
\newpage
43. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
44. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
45. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
\newpage
46. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
47. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
48. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
49. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
50. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
51. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
\vskip1.000000\baselineskip
52. Un compuesto como el indicado en la
reivindicación 6, donde la estructura comprende:
53. Una composición que comprende un compuesto
como el descrito en cualquiera de las reivindicaciones comprendidas
entre la 1 y la 52 en combinación con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
54. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
la reducción de la actividad del factor de migración de macrófagos
en un paciente que lo necesita.
55. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
el tratamiento de la inflamación en un animal de sangre
caliente.
56. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
el tratamiento de choque séptico en un animal de sangre
caliente.
57. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
el tratamiento de artritis en un animal de sangre caliente.
58. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
el tratamiento de cáncer en un animal de sangre caliente.
59. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
el tratamiento del síndrome de dificultad respiratoria aguda en un
animal de sangre caliente.
60. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un animal de sangre
caliente.
61. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
el tratamiento de una enfermedad inflamatoria seleccionada entre el
grupo formado por artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad
intestinal inflamatoria y asma.
62. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un animal de sangre
caliente.
63. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
el tratamiento de una enfermedad autoinmune seleccionada entre el
grupo formado por diabetes, asma y esclerosis múltiple.
64. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
la supresión de una respuesta inmune en un animal de sangre
caliente.
65. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
la disminución de la angiogénesis en un animal de sangre
caliente.
66. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
el tratamiento de una enfermedad asociada con niveles excesivos de
glucocorticoide en un animal de sangre caliente.
67. Un compuesto como el descrito en cualquiera
de las reivindicaciones comprendidas entre la 1 y la 52 o una
composición como la descrita en la reivindicación 53 para su uso en
el tratamiento de la enfermedad de Cushing.
68. Un método in vitro para la detección
de un agente que modula la actividad del factor inhibidor de la
migración de los macrófagos, el cual comprende:
el contacto de una muestra que contiene el
factor inhibidor de la migración de los macrófagos con un agente;
y
la detección de la capacidad del agente para
modular el factor inhibidor de la migración de los macrófagos
mediante la determinación de la capacidad diferencial de un
anticuerpo para unirse al factor inhibidor de la migración de los
macrófagos.
\vskip1.000000\baselineskip
69. Un método como el que se describe en la
reivindicación 68, donde el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
70. Un método como el que se describe en la
reivindicación 68, donde el factor inhibidor de la migración de los
macrófagos incluye las proteínas de fusión, mutaciones o variaciones
de ellas.
71. Un método in vitro para el empleo del
enlace de anticuerpos como marcador sustituto para la revisión de un
agente que modula la actividad de un polipéptido, el cual
comprende:
el contacto del polipéptido con un agente
modulador sospechado,
el contacto del polipéptido con un anticuerpo
monoclonal, y
la detección de una actividad diferencial del
polipéptido en relación a un control.
\newpage
72. Un proceso para la preparación de un
compuesto de Fórmula IV que comprende los pasos de:
reacción de un compuesto de Fórmula I:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
con un compuesto de Fórmula
II:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
obteniéndose así un compuesto de
Fórmula
III:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde el compuesto de Fórmula IV es
adecuado para el empleo como un inhibidor del factor inhibidor de la
migración de los
macrófagos.
\newpage
73. Un proceso para la preparación de un
compuesto de Fórmula AIV que comprende los pasos de:
reacción de un compuesto de la Fórmula AI:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
con un compuesto de Fórmula
II:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
obteniéndose así un compuesto de
Fórmula
Allí:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde R_{7} se selecciona del
grupo formado por alquilo C_{1-10}, arilo
C_{1-10} alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo
monocíclico de 5 a 7 miembros y heterociclo policíclico de 7 a 14
miembros, donde R_{7} está sustituido o no con al menos un
sustituyente seleccionado del grupo formado por halógeno, alcoxi,
alquilamino, dialquilamino y ceto;
y
se hace reaccionar el compuesto de Fórmula Allí
con un compuesto formado por X-R_{1}, donde X se
selecciona entre el grupo formado por Cl, Br, e I, y donde R_{1}
se selecciona entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo
C_{1-10}, arilo C_{1-10}
alquilo, fenilo, naftilo, heterociclo monocíclico de 5 a 7 miembros
y heterociclo policíclico de 7 a 14 miembros, donde R_{1} está
sustituido o no con al menos un sustituyente seleccionado del grupo
formado por halógeno, alcoxi, alquilamino, dialquilamino y ceto,
obteniéndose así un compuesto con Fórmula AIV:
donde el compuesto de Fórmula AIV
es adecuado para el empleo como un inhibidor del factor inhibidor de
la migración de los
macrófagos.
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