PT1389110E - INIBIDORES DE FACTOR INIBITËRIO DE MIGRAÆO DOS MACRËFAGOS E MéTODOS PARA A SUA IDENTIFICAÆO - Google Patents

INIBIDORES DE FACTOR INIBITËRIO DE MIGRAÆO DOS MACRËFAGOS E MéTODOS PARA A SUA IDENTIFICAÆO Download PDF

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PT1389110E
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Federico C A Gaeta
Andrew Baird
Jerry Anchin
Wenbin Ying
Robert Florkiewicz
Jagadish Sircar
Kumar K C Sunil
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Avanir Pharmaceuticals
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Description

ΕΡ 1 389 110 /PT
DESCRIÇÃO "Inibidores de factor inibitório de migração dos macrófagos e métodos para a sua identificação"
Campo do Invento inibidores de factor (MIF), métodos para métodos para tratar administração desses
Este invento refere-se em geral a inibitório de migração dos macrófagos identificar inibidores de MIF, e a distúrbios relacionados com MIF por inibidores.
Antecedentes do Invento A linfoquina, factor inibitório de migração dos macrófagos (MIF), tem sido identificada como um mediador da função dos macrófagos na defesa do hospedeiro e a sua expressão correlaciona-se com hipersensibilidade retardada, imuno-regulação, inflamação, e imunidade celular. Ver Metz e Bucala, Adv. Immunol. 66:197-223, 1997. Têm sido identificados factores inibitórios de migração dos macrófagos (MIFs), com um tamanho entre 12-13 kilodaltons (kDa) em várias espécies de mamíferos e de aves; ver, por exemplo, Galat et al.r Fed. Eur. Biochem. Soc. 319:233-236, 1993; Wistow et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1272-1275, 1993; Weiser et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:7522-7526, 1989; Bemhagen et al., Nature 365:756-759, 1993; Blocki et al., Protein Science 2:2095-2102, 1993; e Blocki et al., Nature 360:269-270, 1992. Embora o MIF tenha sido primeiro caracterizado por ser capaz de bloquear a migração dos macrófagos, o MIF também parece efectuar a aderência dos macrófagos; induzir o macrófago a expressar interleucina-1-beta, interleucina-6, e factor alfa de necrose tumoral; sobre-regular a HLA-DR; aumentar as concentrações de óxido nítrico-sintase e de óxido nítrico; e activar o macrófago para matar células tumorais de Leishmania donovani e inibir o crescimento de Mycoplasma avium, por um mecanismo diferente do efectivado por gama-interferão. Em adição ao seu potencial papel como molécula imunoevasiva, o MIF pode actuar como imunoadjuvante quando dado com albumina de soro bovino ou HIV gpl20 em Freunds incompleto ou lipossomas, eliciando uma 2 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ proliferação induzida por antigénio comparável à do Freunds completo. 0 MIF também tem sido descrito como um regulador contra glucocorticóides e como um factor angiogénico. Como uma das poucas proteínas que é induzida e não inibida pelos glucocorticóides, ele serve para atenuar os efeitos imunossupressores dos glucocorticóides. Como tal, ele é olhado como um poderoso elemento que regula os efeitos imunossupressores dos glucocorticóides. Deste modo, quando as suas actividades/expressão de genes são sobre-induzidas pela administração de glucocorticóides exógenos em excesso (por exemplo quando clinicamente indicado para supressão de inflamação, imunidade e semelhante) , existe toxicidade significativa porque o próprio MIF exacerba a resposta inf lamatória/imune. Ver Buccala et al., Ann. Rep. Med. Chem. 33:243-252, 1998.
Embora também se pense que o MIF actua em células através de um receptor específico, o qual por sua vez activa uma cascata intracelular que inclui a erk fosforilação e MAP quinase e a sobre-regulação de metaloproteases da matriz, c-jun, c-fos, e IL-1 mRNA (ver Onodera et al., J. Biol. Chem. 275:444-450, 2000), ele também possui actividade enzimática endógena como exemplificado pela sua capacidade de tautomerizar os substratos apropriados (e.g., dopacromo). Além disso, não é ainda claro se esta actividade enzimática medeia a resposta biológica a MIF e as actividades desta proteína in vitro e in vivo. Embora a mutagénese sítio-dirigida do MIF tenha gerado mutantes que possuem actividade intrínseca completa, não possuíam contudo actividade enzimática (Hermanowski-Vosatka et al., Biochemistry 38:12841-12849, 1999), Swope et al. descreveram uma ligação directa entre a actividade de citoquina e o sítio catalítico para o MIF (Swope et al., EMBO J. 17 (13):353 4-3541, 1998). Deste modo, não é claro que estratégias para identificar inibidores da actividade de MIF através apenas da inibição da dopacromo tautomerase conduzam a inibidores da actividade de MIF com valor clínico. A capacidade de avaliar a inibição de MIF ao seu receptor da superfície da célula também é limitada, uma vez que não é actualmente conhecido nenhum receptor de elevada afinidade. 3 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Ο interesse em desenvolver inibidores de MIF deriva da observação de que o MIF é conhecido pela sua actividade de citoquina concentrando macrófagos nos sítios de infecção, e imunidade mediada por células. Acresce que, o MIF é conhecido como um mediador da aderência de macrófagos, fagocitose, e actividade tumoricida. Ver Weiser et al., J. Immunol. 147:2006-2011, 1991. Deste modo, a inibição de MIF resulta na inibição indirecta das citoquinas, factores de crescimento, quimioquinas e linfoquinas que o macrófago poderia de outro modo transportar para o sítio da inflamação. O cDNA de MIF humano tem sido isolado de uma linha de células T, e codifica uma proteína possuindo uma massa molecular de cerca de 12.4 kDa com 115 resíduos de aminoácido que formam um homotrímero como forma activa (Weiser et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:7522-7526, 1989). Embora o MIF tenha sido originalmente observado em células T activadas, ultimamente tem sido reportado numa variedade de tecidos incluindo o fígado, pulmão, cristalino, ovário, cérebro, coração, baço, rim, músculo, e outros. Ver Takahashi et al., Microbiol. Immunol. 43(1):61-67, 1999. Outra característica de MIF é a sua falta de uma tradicional sequência líder (i.e., uma proteína sem líder) para dirigir a secreção clássica através da via RE/Golgi.
Um inibidor de MIF (e um método para identificar inibidores de MIF) que actue por neutralização da actividade de citoquina de MIF apresenta vantagens significativas relativamente a outros tipos de inibidores. Por exemplo, a ligação entre a actividade de tautomerase sozinha e a resposta inflamatória é controversa. Acresce que, os inibidores que actuam intracelularmente são frequentemente tóxicos em virtude da sua acção sobre alvos afins ou actividades do alvo dentro das células. Os inibidores de pequena molécula do complexo ligando-receptor já são difíceis de identificar quanto mais de optimizar e desenvolver. O inibidor ideal de uma citoquina como MIF é aquele que altera o próprio MIF de modo que, quando libertado da célula, ele é eficazmente neutralizado. Uma pequena molécula com esta actividade é superior a anticorpos em virtude da diferença fundamental entre proteínas e produtos químicos enquanto fármacos. 4 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Sumário do Invento
Como o MIF tem sido identificado numa variedade de tecidos e tem sido associado a numerosos eventos patológicos, existe a necessidade na arte de identificar inibidores de MIF. Existe também a necessidade de composições farmacêuticas contendo esses inibidores, bem como de métodos relativos ao seu uso para tratar, por exemplo, distúrbios imuno-relacionados ou outros eventos patológicos induzidos por MIF, tais como angiogénese associada a tumor. As concretizações preferidas podem preencher estas necessidades e proporcionar também outras vantagens. 0 invento proporciona inibidores de MIF gue têm as seguintes estruturas gerais (Ia) e (Ib):
incluindo seus estereo isómeros e sais farmaceuticamente aceitáveis, onde n, Ri, ^21 R4, X, Y e Z são definidos como abaixo. 5 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Os inibidores de MIF das concretizações preferidas têm utilidade numa vasta gama de aplicações terapêuticas e podem ser empregues para tratar uma variedade de distúrbios, doenças ou condições patológicas, incluindo, sem lhes estar limitados, uma variedade de respostas imuno-relacionadas, crescimento tumoral (e.g., cancro da próstata, et.), glomerulonefrite, inflamação, anemia malarial, choque séptico, angiogénese associada a tumor, vitreoretinopatia, psoriase, doença do hospedeiro versus enxerto (rejeição de tecido), dermatite atópica, artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino, otite média, doença de Crohn, síndroma da dificuldade respiratória aguda, hipersensibilidade do tipo retardada, e outros. Ver, e.g., Metz e Bucala (supra); Swope e Lolis, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol 139:1-32, 1999; Waeber et al., Diabetes M. Res. Rev. 15(1):47-54, 1999; Nishihira, Int. J. Mol. Med. 2(1):17-28, 1998; Bucala, Ann. N.Y. Acad. Sei 840:74-82, 1998; Bemhagen et al., J. Mol. Med. 76(3-4):151-161, 1998; Donnelly e Bucala, Mol. Med. Today 3(11):502-507, 1997; Bucala et al., FASEB J. 10(14):1607-1613, 1996. Estes métodos incluem administrar uma quantidade eficaz de um ou mais inibidores de MIF como indicado nas concretizações preferidas, preferivelmente sob a forma de uma composição farmacêutica, a um animal que dela necessite. Deste modo, noutra concretização, são proporcionadas composições farmacêuticas contendo um ou mais inibidores de MIF das concretizações preferidas em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável e/ou diluente.
Uma estratégia de uma concretização preferida caracteriza uma molécula que interage com MIF de modo a induzir uma alteração conformacional em MIF e deste modo uma perda de imunorreactividade a um anticorpo monoclonal. Esta alteração, quando identificada por avaliação, identifica inibidores de MIF de pequenas moléculas. Este aspecto particular pode ser estendido a qualquer polipéptido bioactivo em que a perda de imunorreactividade pode actuar como um marcador indirecto ("surrogate") para a actividade (e.g., actividade de citoquina, actividade enzimática, actividade de co-factor ou semelhante). 6 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Numa primeira concretização é proporcionado um composto com uma estrutura:
ou um estereo-isómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde: X é oxigénio; Y é seleccionado de entre o grupo consistindo em -N02, -C (=0) Rs, -C (=0) 0RS, e -C(=0)NR5R6; Z é -CH2-n é 1 ;
Ri é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo Ci-io, aril (alquilo Ci-io), fenilo, naftilo, heterociclo monociclico de 5 a 7 membros, e heterociclo policíclico de 7 a 14 membros, onde Ri é não substituído ou substituído com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto; R2 e R3 são seleccionados, independentemente um do outro, de entre o grupo consistindo em halogéneo, hidrogénio, e alquilo C1-10; R4 é seleccionado de entre o grupo consistindo em -CH2R7, -C(=0)NR5R6, -C(=0)0R7, e -C (=0) R7; cada R5 e Rè é seleccionado, independentemente, de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo C1-10 e aril (alquilo C1-10) ; ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo monociclico de 5 a 7 membros ou um heterociclo policíclico de 7 a 14 membros, onde R5 e R6 são independentemente não substituídos ou substituídos com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo 7 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto; R7 é seleccionado de entre o grupo consistindo em alquilo Ci-io, aril (alquilo Ci-io), fenilo, naftilo, heterociclo monocíclico de 5 a 7 membros, e heterociclo policíclico de 7 a 14 membros, onde R7 é não substituído ou substituído com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto.
Numa segunda concretização é proporcionado um composto com uma estrutura:
ou um estereo-isómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde X é oxigénio; Y é seleccionado de entre o grupo consistindo em -NO2, -C(=0)Rs,-C(=0)0R5, e -C(=0)NR5R6; Z é -CH2-; n é 1;
Ri é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo C1-10, aril (alquilo C1-10), fenilo, naftilo, heterociclo monocíclico de 5 a 7 membros, -NCH2CH2CH2N (CH3) 2 e heterociclo policíclico de 7 a 14 membros, onde Ri é não substituído ou substituído com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto; R2 e R3 são seleccionados, independentemente um do outro, de entre o grupo consistindo em halogéneo, hidrogénio, e alquilo Ci_io; 8 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ R4 é seleccionado de entre o grupo consistindo em -CH2R7, -C(=0)NR5R6, -C(=0)0R7, e -C (=0) R7; cada R5 e R6 é seleccionado, independentemente um do outro, de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo Ci_i0 e aril (alquilo Ci_i0) ; ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo monociclico de 5 a 7 membros ou um heterociclo policíclico de 7 a 14 membros, onde R5 e R6 são independentemente não substituídos ou substituídos com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto; R7 é seleccionado de entre o grupo consistindo em alquilo C1-10, aril (alquilo C1-10) , fenilo, naftilo, heterociclo monociclico de 5 a 7 membros, e heterociclo policíclico de 7 a 14 membros, onde R7 é não substituído ou substituído com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto.
Em aspectos da segunda concretização, Y é -C(=0)OCH2CH3; ou Y é -NO2; ou R4 é
Numa terceira concretização é proporcionado um composto com uma estrutura:
9 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ ou um estereo-isómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde X é oxigénio; Y é -N02 ; Z é —CH2— n é 1, Ri inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído, dialquilo, e R'R"N (CH2) x-, onde x é 2 a 4, e onde R' e R" incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo substituído, e dialquilo; R2 e R3 incluem independentemente halogéneo, -R5, -0R5, -SR5, e -NR5R6; R4 inclui -CH2R7, -C(=0)NR5R6, -C(=0)0R7, -C(=0)R7, e Rs; R5 e R6 incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído; R7 inclui alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; e R6 inclui hidrogénio; alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído.
Em aspectos da terceira concretização, Z é -CH2- e ou R4 é O; ou O;
OU
\
Numa quarta concretização é proporcionado um composto com uma estrutura: 10 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
ou um estereo-isómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde X é oxigénio Y é -C(=0)OCH2CH3; Z é -CH2-; n é 1; Ri inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído, dialquilo, e R'R"N(CH2) x-, onde x é 2 a 4, e onde R' e R" incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo substituído, e dialquilo; R2 e R3 incluem independentemente halogéneo, -R5, -0R5, -SR5, e -NR5R6; R4 inclui -CH2R7, -C(=0)NR5R6, -C(=0)0R7, -C(=0) R7, e R8; R5 e R8 incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído; R7 inclui alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; e R8 inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído.
Em aspectos da quarta concretização, X é oxigénio; ou Z é -CH2- e n é 1; ou R4 é
11 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ OU
Ο;
Numa quinta concretização é proporcionado um composto com uma estrutura:
ou um estereo-isómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde X é oxigénio; Y inclui NCg, -C(=0)R5, -C(=0)0R5, e -C(=0)NR5R6; Z é CH2-; n é 1, Ra, inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído, dialquilo, e R'R"N(CH2) x-, onde x é 2 a 4, e onde R' e R" independentemente incluem hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo substituído, e dialquilo; R2 e R3 incluem independentemente halogéneo, -R5, -0R5, -SR5, e -NR5R6; R4 é \ ou e R5 e R6 incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo 12 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído.
Em aspectos da quinta concretização Y é -C(=0)OCH2CH3; ou Y é -N02.
Numa sexta concretização é proporcionado um composto com uma estrutura:
ou um estereo-isómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde X é oxigénio; Y inclui -N02, -C(=0)R5, -C(=0)0R5, -C(=0)NR5R6; Z é CH2- n é 1; Ri inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído, dialquilo, e R'R"N (CH2) x-, onde x é 2 a 4, e onde R' e R" incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo substituído, e dialquilo; R2 e R3 incluem independentemente halogéneo, -R5, —OR5, —SR5, e -NR5R6; R4 é
OU O; e R5 e R6 incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de 13 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído.
Em aspectos da sexta concretização, Y é -C (=0) OCH2CH3; ou Y é -N02.
Numa sétima concretização é proporcionado um composto com uma estrutura:
ou um estereo-isómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde X é oxigénio; Y inclui -N02, -C(=0)R5, -C(=0)0R5, -C(=0)NR5R6,· Z é -CH2- n é 1; Ri inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído, dialquilo, e R'R"N (CH2) x-, onde x é 2 a 4, e onde R' e R" incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo substituído, e dialquilo; R2 e R3 incluem independentemente halogéneo, -R5; -0R5, -SR5 e -NR5R6; R4 inclui -CH2R7; -C (=0) NR5R6, -C(=0)0R7, -C(=0)R7, e Rs; R5 e R6 incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído; heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; ou R5 e Rõ, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído; R7 inclui alquilo, alquilo substituído, arilo; arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; e R8 inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, 14 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído.
Em aspectos da sétima concretização, Y é -C (=0) OCH2CH3; ou Y é -N02; ou R4 é
Numa oitava concretização, é proporcionada uma composição incluindo um composto da primeira concretização em combinação com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
Numa nona concretização é proporcionado um método para reduzir a actividade de MIF num paciente que disso necessite, incluindo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um composto possuindo a estrutura:
ou um estereo-isómero, um pró-fármaco, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde X é oxigénio; Y inclui -N02, -C(=0)R5, -C(=0)0R5, -C(=0)NR5R6 Z é CH2-; n é 1; Rx inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído, dialquilo, e R'R"N(CH2) x-, onde x é 2 a 4, e onde R' e R" incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo substituído, e dialquilo; R2 e R3 incluem independentemente 15 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ halogéneo, -R5, -0R5, -SR5, e -NR5R6; R4 inclui -CH2R7, —C (=0) NR5R6, -C(=0)0R7, -C(=0)R7, e R8; R5 e R6 incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído; R7 inclui alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; e R8 inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído.
Numa décima concretização é proporcionado um método para tratar inflamação num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz do composto da primeira concretização.
Numa décima primeira concretização é proporcionado um método para tratar choque séptico num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz do composto da primeira concretização.
Numa décima segunda concretização é proporcionado um método para tratar artrite num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz do composto da primeira concretização.
Numa décima terceira concretização é proporcionado um método para tratar cancro num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz do composto da primeira concretização.
Numa décima quarta concretização é proporcionado um método para tratar síndroma da dificuldade respiratória aguda num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz do composto da primeira concretização. 16 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Numa décima quinta concretização é proporcionado um método para tratar uma doença inflamatória num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz do composto da primeira concretização. Em aspectos da décima quinta concretização, a doença inflamatória pode incluir artrite reumatóide, osteoartrite, doença inflamatória do intestino e asma.
Numa décima sexta concretização é proporcionado um método para tratar um distúrbio auto-imune num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz do composto da primeira concretização. Em aspectos da décima sexta concretização, o distúrbio auto-imune inclui diabetes, asma, e esclerose múltipla.
Numa décima sétima concretização é proporcionado um método para suprimir uma resposta imune num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz do composto da primeira concretização.
Numa décima oitava concretização é proporcionado um método para diminuir a angiogénese num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz do composto da primeira concretização.
Numa décima nona concretização é proporcionado um método para tratar uma doença associada a níveis de glucocorticóides em excesso num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz do composto da primeira concretização. Num aspecto da décima nona concretização, a doença é doença de Cushing.
Numa vigésima concretização é proporcionado um método para detectar um agente que modula a actividade de MIF, incluindo contactar uma amostra contendo MIF com um agente; e detectar a capacidade do agente modular MIF por determinação de uma capacidade diferencial de um anticorpo para ligar MIF. Num aspecto da vigésima concretização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Num aspecto da vigésima concretização, MIF inclui proteínas de fusão, seus mutantes ou variantes. 17 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Numa vigésima primeira concretização é proporcionado um método para usar ligação de anticorpo como um marcador indirecto ("surrogate marker") para avaliar um agente que modula a actividade de um polipéptido, incluindo contactar o polipéptido com um agente de modulação suspeito, contactar o polipéptido com um anticorpo monoclonal, e detectar uma actividade diferencial do polipéptido relativamente a um controlo. 17 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Numa vigésima segunda composto com uma estrutura: concretização«?4 é proporcionado um
ou um estereo-isómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde X é oxigénio; Y inclui -NO2, -C(=0)Rs, -C(=0)0R5, -C (=0) NR5R6; Z é -CH2- n é 1; Ri inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído, dialquilo, e R'R"N(CH2) x-, onde x é 2 a 4, e onde R' e R" incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo substituído, e dialquilo; R2 e R3 incluem independentemente halogéneo, -R5, -0R5, -SR5, e -NR5R6; R4 inclui -CH2R7, -C(=0)NR5R6, -C(=0)0R7, -C(=0)R7, e Rg; R5 e R6 incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído; 18 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ R7 inclui alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; e R6 inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído.
Numa vigésima terceira concretização é proporcionado um composto com uma estrutura:
ou um estereo-isómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde X é oxigénio; Y inclui -NO2, -C(=0)R5, -C(=0)0R5, -C (=0) NR5R6; Z é -CH2-; n é 1; Ri inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído, dialquilo, e R'R"N(CH2) x-, onde x é 2 a 4, e onde R' e R" incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo substituído, e dialquilo; R2 e R3 incluem independentemente halogéneo, -R5, -0R5, -SR5, e - NR5R6; R4 inclui -CH2R7, -C(=0)NR5N6, -C(=0)0R7, -C(=0)R7, e Rg; R5 e R6 incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; ou R5 e Rô, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído; R7 inclui alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo 19 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; e R6 inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído.
Em aspectos da vigésima terceira concretização, R2 é -NCH2CH2CH2N(CH3) 2; ou X é oxigénio; ou Y é - C (=0) OCH2CH3; ou Y é -N02; ou R4 é
OU
Numa vigésima quarta concretização composto com uma estrutura: é proporcionado um 94
ou um estereo-isómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde X é oxigénio; Y é -C (=0) OCH2CH3; Z é -CH2-; n é 1; Ri inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído, dialquilo, e R'R"N (CH2) x-, onde x é 2 a 4, e onde R' e R" incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo substituído, e dialquilo; R2 e R3 incluem independentemente halogéneo, -R5, -0R5, -SR5, e -NR5R6;R4 inclui -CH2R7, -C(=0)NR5R6, -C(=0)0R7, -C(=0)R7, e R8; R5 e R6 incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, 20 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído; R7 inclui alquilo, alquilo substituído, arilalquilo substituído, substituído; substituído, arilalquilo substituído, substituído. arilo, arilo substituído, arilalquilo, substituído, heterociclo, heterociclo heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo e R8 inclui hidrogénio, alquilo, alquilo arilo, arilo substituído, arilalquilo, substituído, heterociclo, heterociclo heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo
Em aspectos da vigésima quarta concretização, R4 é
Numa vigésima quinta concretização é proporcionado um composto com uma estrutura:
ou um estereo-isómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde X é oxigénio; Y inclui -NO2, -C(=0)Rs, -C(=0)0R5, -C (=0) NR5R6; Z é -CH2-n é 1; Ri é -NCH2CH2CH2N (CH3) 2; R2 e R3 incluem independentemente halogéneo, -R5, -OR5, -SR5, e -NR5R6: R4 inclui -CH2R7, -C(=0)NR5R6, -C(=0)0R7, -C(=0)R7, e R8; R5 e R5 incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo 21 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ substituído; ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído; R7 inclui alquilo, alquilo substituído, arilalquilo substituído, substituído; substituído, arilalquilo substituído, substituído. arilo, arilo substituído, arilalquilo, substituído, heterociclo, heterociclo heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo e R8 inclui hidrogénio, alquilo, alquilo arilo, arilo substituído, arilalquilo, substituído, heterociclo, heterociclo heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo
Em aspectos da vigésima quinta concretização, Y -C (=0) OCH2CH3; ou Y é NO2; ou R4 é O; / OU 0;
OU T\ é proporcionado um
Numa vigésima sexta concretização composto com uma estrutura:
ou um estereo-isómero ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, onde X é oxigénio; Y é - N02; Z é -CH2- n é 1; Rx inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído, dialquilo, e R'R"N(CH2) x-, onde x é 2 a 4, e onde R' e R" incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo substituído, e dialquilo; R2 e R3 independentemente inclui 22 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ halogéneo, -R5, -0R5, -SR5, e -NR5R6; R4 inclui -CH2R7, alquilo, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído; R7 inclui alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; e R8 inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; com a condição de R4 não ser metilo quando R3 é metilo, R2 e R3 são ambos hidrogénio, e X é oxigénio.
Em aspectos da vigésima sexta concretização, R4 é -NCH2CH2CH2N (CH3) 2} ou X é oxigénio; ou Z é -CH2- e n é 1; ou R4 é ou
r> ou 0.¾. .
Numa vigésima sétima concretização é proporcionado um composto com uma estrutura:
ou ou um estereo-isómero ou um seu sal f armaceuticamente aceitável onde X é oxigénio; Y inclui -N02, -C(=0)Rs, -C(=0)0R5, -C(=0)NR5R6,· Z é -CH2- n é 1; Ri inclui hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo 23 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ heterocicloalquilo substituído, dialquilo, e R'R"N(CH2) x-, onde x é 2 a 4, e onde R' e R" incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, substituído, e halogéneo, -R5, substituído, heterociclo, heterociclo heterocicloalquilo, heterocicloalquilo dialquilo; R2 e R3 incluem independentemente -OR5, —SR5, e -NR5R6,· R4 inclui
U
✓ •Jd R5 e R6 incluem independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo substituído; ou R5 e Re, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído; R7 inclui alquilo, alquilo substituído, arilalquilo substituído, substituído; substituído, arilalquilo substituído, substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, substituído, heterociclo, heterociclo heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo e Rs inclui hidrogénio, alquilo, alquilo arilo, arilo substituído, arilalquilo, substituído, heterociclo, heterociclo heterocicloalquilo, e heterocicloalquilo
Em aspectos da vigésima sétima concretização, R4 é -NCH2CH2CH2N (CH3) 2; ou X é oxigénio; ou Z é -CH2- e n é 1; ou Y é -C(=0)OCH2CH3; ou Y é -N02.
Numa vigésima oitava concretização, é proporcionada uma composição compreendendo um composto do invento em combinação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
Os compostos e composições do invento podem ser utilizados num método para reduzir a actividade de MIF num 24 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ paciente que disso necessite, incluindo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um composto ou composição do invento.
Os compostos ou composições do invento podem ser utilizados no seguinte: (i) um método para tratar inflamação num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de invento. um composto ou composição do (ii) um método para tratar choque séptico num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de invento. um composto ou composição do (iii) um método para tratar artrite num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de invento. um composto ou composição do (iv) um método para tratar cancro num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de invento. um composto ou composição do (V) um método para tratar síndroma da l dificuldade respiratória aguda num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de um composto ou composição do invento. (vi) um método para tratar uma doença inflamatória num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de um composto ou composição do invento. A doença inflamatória inclui artrite reumatóide, osteoartrite, doença inflamatória do intestino e asma. (vii) um método para tratar um distúrbio auto-imune num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de um composto ou composição do invento. 0 distúrbio auto-imune inclui diabetes, asma e esclerose múltipla. (viii) um método para suprimir uma resposta imune num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de um composto ou composição do invento. 25 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ (ix) um método para diminuir a angiogénese num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de um composto ou composição do invento. (x) um método para tratar uma doença associada a níveis em excesso de glucocorticóides num animal de sangue quente, que inclui administrar ao animal uma quantidade eficaz de um composto ou composição do invento. A doença pode ser e.g. doença de Cushing.
Numa vigésima nona concretização é proporcionado um processo para preparar um composto de Fórmula IV incluindo os passos de fazer reagir um composto de Fórmula I
com um composto de Fórmula II:
(Fórmula II) obtendo-se assim um composto de Fórmula III: 26 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
onde R7 é seleccionado de entre o grupo consistindo em alquilo C1-10, aril (alquilo C1-10), fenilo, naftilo, heterociclo monociclico de 5 a 7 membros, e heterociclo policiclico de 7 a 14 membros, onde R7 é não substituído ou substituído com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto; e fazer reagir o composto de Fórmula III com um composto compreendendo X-Ri, onde X é seleccionado de entre o grupo consistindo em Cl, Br, e I, e onde Ri é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo C1-10, aril (alquilo C1-10), fenilo, naftilo, heterociclo monociclico de 5 a 7 membros, e heterociclo policiclico de 7 a 14 membros, onde Ri é não substituído ou substituído com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto, obtendo-se assim um composto de Fórmula IV: 27 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Ο
Ri onde ο composto de Fórmula IV é adequado para uso como um inibidor do factor inibitório de migração dos macrófagos.
Em aspectos da vigésima nona concretização, R7 é
ou /
ou
o
Numa trigésima concretização é proporcionado um processo para preparar um composto de Fórmula AIV incluindo os passos de fazer reagir um composto de Fórmula AI:
com um composto de Fórmula II: 28 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 28 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
(Fórmula II) obtendo-se assim um composto de Fórmula AIII:
N' (Fórmula AIII)
N
O
II
onde R7 é seleccionado de entre o grupo consistindo em alquilo Ci_io, aril (alquilo C1-10) , fenilo, naftilo, heterociclo monociclico de 5 a 7 membros, e heterociclo policiclico de 7 a 14 membros, onde R7 é não substituído ou substituído por pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto; e fazer reagir o composto de Fórmula AIII com um composto compreendendo X-Ri, onde X é seleccionado de entre o grupo consistindo em Cl, Br, e I, e onde Ri é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo Ci_i0, aril (alquilo C1-10), fenilo, naftilo, heterociclo monociclico de 5 a 7 membros, e heterociclo policiclico 7 a 14 membros, onde Ri é não substituído ou substituído com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto, obtendo-se assim um composto de Fórmula AIV:
29 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Q Υ R7 Ν
(Fórmula ΑΝ)
Ν' Ο
Ο
Ο
onde ο composto de Fórmula AIV é adequado para uso como um inibidor do factor inibitório de migração dos macrófagos.
Em aspectos da trigésima concretização, R7 é
Na trigésima primeira concretização, é proporcionada uma composição farmacêutica para tratar uma doença ou distúrbio onde MIF é patogénico, incluindo a composição farmacêutica um composto do invento inibidor de MIF e um fármaco para tratar a doença ou distúrbio, onde o fármaco tem uma actividade inibitória de MIF não mensurável.
Numa trigésima segunda concretização, é proporcionada uma composição farmacêutica para tratar uma doença ou distúrbio onde MIF é patogénico, incluindo a composição farmacêutica um composto do invento inibidor de MIF e um fármaco seleccionado do grupo consistindo em fármacos anti- 30 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ inflamatórios não esteroidais, fármacos anti-infecciosos, beta estimulantes, esteróides, anti-histaminas, fármacos anticancro, fármacos para a asma, fármacos para a sepsia, fármacos para a artrite, e fármacos imunossupressores.
Estas e outras concretizações e seus aspectos serão evidentes por referência à seguinte descrição detalhada. Com esta finalidade, são aqui estabelecidas várias referências que descrevem em maior detalhe certos procedimentos, compostos e/ou composições.
Breve Descrição dos Desenhos
As Figuras 1A-9B são imagens digitalizadas de um auto-radiograma demonstrando a imunoprecipitação de anticorpo com um anticorpo monoclonal anti-MIF (Figura IA) e soros policlonais anti-MIF (Figura 1B) em extractos citosólicos (C) bem como meios condicionados (M) das células THP-1 a seguir a estimulação com LPS e tratamento com várias concentrações micromolares de composto 7e. São também apresentados os resultados de actividade de tautomerase detectada em várias fracções. Sinais mais indicam actividade de tautomerase, sinais menos indicam actividade não detectável, e sinais + /-indicam actividade parcial. A Figura 2 é um gráfico mostrando os resultados do ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) a seguir ao tratamento de células THP-1 estimuladas com LPS com cinco análogos da composição presentemente reivindicada. É mostrada a capacidade de cada análogo inibir a ligação do anticorpo monoclonal e é dependente da dose. A Figura 3 é uma representação gráfica da imunorreactividade de MIF em meio condicionado usando ELISA a seguir à estimulação das células THP-1 com LPS e adição de composto 7e 10 μΜ em tempos diferentes durante a cultura. Nesta Figura, foi adicionada LPS no momento zero, enquanto que o composto 7e foi adicionado 0, 2, 4, e 6 horas a seguir ao tratamento com LPS. Empregaram-se seis grupos de células THP1 nesta experiência, todas cultivadas sob condições de meios padrão. No inicio da experiência, adicionou-se apenas tampão às células do Grupo 1 e adicionou-se tampão contendo 31 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ composto 7e às células do Grupo 2. 0 composto 7e em tampão foi adicionado a cada um dos outros grupos em vários momentos posteriores, Grupo 3 a 2 h, Grupo 4 a 4 h, Grupo 5 a 6 h e Grupo 6 a 22 h. Foram tomadas amostras de cada grupo nos momentos indicados após ter sido adicionado tampão ou tampão mais amostra e avaliaram-se relativamente aos níveis detectáveis de MIF usando anticorpo monoclonal anti-MIF. Na ausência de composto (Grupo 1), o nível de MIF detectável aumentam ao longo do decurso da experiência. Na presença de composto, a detecção de MIF é bloqueada. A Figura 4 é uma representação gráfica de uma experiência com base em ELISA, que segue o efeito do composto 7e na detecção de MIF. Nesta concepção experimental, a amostra de teste são meios de cultura de células pré-condicionados, clarificados de detritos celulares. Calculou-se que a concentração de partida de MIF numa amostra de teste era de aproximadamente 22 ng/ml. 0 composto é adicionado em vários momentos após o início da incubação a 37°C. Cada amostra é em seguida incubada por mais 30 minutos antes do nível detectável de MIF ser de novo determinada. A Figura 5 é um gráfico de barras representando a percentagem relativa de MIF presente em meios condicionados de células RAW 264.7 tratadas com composto 7e e induzidas por LPS quando comparado com uma população celular de controlo que não foi tratada com o composto, medidos por ELISA. O painel de topo mostra "blots" Western das mesmas fracções medidas por ELISA no painel de baixo. A Figura 6 é um gráfico de barras representando a percentagem de MIF presente em meios condicionados de células RAW 264.7 tratadas com composto 7e e induzidas por LPS quando comparado com uma população celular de controlo que não foi tratada com o composto, medidos por ELISA. O painel de topo mostra manchas Western das mesmas fracções medidas por ELISA no painel de baixo.
As Figuras 7A-7B são representações gráficas de detecção por HPLC do composto 7e em soro de ratinho a seguir à administração por injecção intraperitoneal do composto 7e (Figura 7A) ou por gavagem oral de 20 mg do composto 7e 32 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ (Figura 7Β) . Os resultados sao mostrados como uma Média+/-EPM (N=5 ratinhos). A Figura 8 é uma representação gráfica de libertação de MIF em soro de ratinho detectada por ELISA em vários momentos após provocação com LPS/galactosamina. Os resultados são mostrados como Média+/- EPM (N=5).
As Figuras 9A-9B ilustram graficamente os resultados de ELISA das concentrações de MIF no soro em ng/ml, cinco horas depois de uma provocação de 10 mg/kg de LPS (Figura 9A) ou MIF no soro normalizado quatro horas depois de uma provocação de 5 mg/kg de LPS (Figura 9B) na presença ou ausência do composto 7e (0,4 mg/ 20 gramas de ratinho). A Figura 10 é uma representação gráfica de medições por ELISA demonstrando a correlação entre níveis de IL-Ιβ no soro em (pg/ml) versus MIF no soro (ng/ml) cinco horas depois da estimulação com LPS/Galactosamina do ratinho fêmea Balb/c.
As Figuras 11A-11B são gráficos de barras gue ilustram a detecção por ELISA de IL-Ιβ e TNF-α guatro horas depois estimulação com LPS (5 mg/kg) e a presença ou ausência de 20 mg/kg de peso corporal do composto 7e (i.p.).
As Figuras 12A-12C representam a sobrevivência cumulativa versus tempo de sobrevivência (horas) (Kaplan-Meier Assessment of Survival) para ratinhos Balb/c a seguir a doseamento i.p. com 20 mg/kg do composto 7e ou do veículo de controlo no momento do tratamento de LPS (2 mg/kg (12A), 5 mg/kg (Figura 12B), ou 10 mg/kg (Figura 12C)) e D-galactosamina (50 mg/kg). Cada experiência incluiu trinta ratinhos, tendo quinze recebido o veículo de controlo e quinze recebido o composto de interesse. A Figura 13 é um gráfico que ilustra o tempo de sobrevivência de 25% de ratinhos versus concentração de LPS (mg; Sigma 055:B5) e D-galactosamina (50mg/kg) na presença ou ausência do composto 7e (20 mg/kg peso corporal,). Os dados representam a média de seis experiências usando trinta ratinhos cada. 33 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ A Figura 14 representa ο protocolo experimental para testar inibidores de MIF para inibir artrite num modelo de ratinhos com artrite induzida por colagénio. 0 composto 7e foi dado duas vezes ao dia durante quatro dias. A Figura 15 é um gráfico de barras que ilustra as medições com compasso da espessura da pata representativa do edema da pata no dia 74. Os valores são expressos como a Média+/- EPM para dez animais por grupo.
As Figuras 16A-16B são gráficos de barras mostrando os níveis de MIF (Figura 16A) e TNF (Figura 16B) em soros de ratinho com artrite induzida por colagénio medidos por ELISA. Os valores são expressos como a Média+/- EPM de sete animais. Os controlos são ratinhos não tratados com colagénio ou composto, CIA representa ratinhos com artrite induzida por colagénio, e composto 7e representa tratados CIA ratinhos.
Descrição Detalhada da Concretização Preferida A descrição e exemplos que se seguem ilustram em detalhe a concretização preferida do presente invento. Os peritos na especialidade reconhecerão que existem numerosas variantes e modificações deste invento que são abrangidas pelo seu âmbito. Deste modo, a descrição de uma concretização preferida não deve ser entendida como limitando o âmbito do presente invento.
Como auxílio para a compreensão das concretizações preferidas, são aqui proporcionadas certas definições. 0 termo "actividade de MIF," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir uma actividade ou efeito mediado pelo menos em parte por factor inibitório da migração de macrófagos. Deste modo, a actividade de MIF inclui, não lhe estando limitada, inibição da migração de macrófagos, actividade de tautomerase (e.g., usando fenilpiruvato ou dopacromo), choque induzido por endotoxinas, inflamação, regulação contra glucocorticóides, indução de incorporação de timidina em fibroblastos 3T3, indução de fosforilação da erk e actividade da MAP guinase. 34 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Ο termo "exportar," ou "exportação" como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um processo metabolicamente activo, que pode ou não estar dependente de energia, de transportar um produto celular traduzido para a membrana da célula ou para o espaço extracelular por um mecanismo que não a secreção directa da sequência líder convencional via uma sequência líder canónica. Além disso, "exportar," contrariamente à secreção que é dependente da sequência líder, é resistente a brefeldina A (i.e., a proteína exportada não é transportada via RE/Golgi; é expectável que a brefeldina A não tenha efeito directo no tráfico de uma proteína exportada) e a outros compostos similares. Como aqui utilizado, "exportar" também pode ser referido como "secreção não clássica." 0 termo "proteína sem líder," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir a proteína ou polipéptido a que falta uma sequência líder canónica, e é exportada do interior de uma célula para o ambiente extracelular. Proteínas sem líder no ambiente extracelular refere-se a proteínas localizadas no espaço extracelular, ou associadas à superfície exterior da membrana celular. No contexto das concretizações preferidas, proteínas sem líder incluem proteínas de ocorrência natural, tais como factor inibitório de migração dos macrófagos e seus fragmentos bem como proteínas que são produzidas por engenharia às quais falta a sequência líder e são exportadas, ou proteínas que são produzidas por engenharia que incluem uma fusão de uma proteína sem líder, ou sua fracção, com outra proteína. 0 termo "inibidor," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir uma molécula (e.g., composto natural ou sintético) que pode alterar a conformação de MIF e/ou compete com um anticorpo monoclonal para MIF e reduz pelo menos uma actividade de MIF ou a sua exportação de uma célula quando comparada com a actividade ou exportação na ausência do inibidor. Por outras palavras, um "inibidor" altera a conformação e/ou actividade e/ou exportação se 35 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ existir uma alteração estatisticamente significativa na quantidade de MIF medida, na actividade de MIF ou na proteína MIF detectada extracelularmente e/ou intracelularmente num ensaio realizado com um inibidor, quando comparado com o ensaio realizado sem o inibidor. 0 termo "agente de ligação," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir qualquer molécula que ligue MIF, incluindo inibidores.
Em geral, os inibidores de MIF inibem a função fisiológica de MIF, e são assim úteis no tratamento de doenças em que o MIF pode ser patogénico.
Em algumas das concretizações preferidas, são proporcionados inibidores de MIF que têm as seguintes estruturas (Ia) e (Ib):
incluindo estereo-isómeros ou a seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: X é oxigénio; Y é -N02, -C(=0)R5, -C(=0)0R5, 36 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ -C (=0) NR5R6; Ζ é -CH2-; η é 1; Ri é hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído, dialquilo, ou aminoalquilo R'R"N(CH2)X- onde R' e R" são independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo heterociclo substituído, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo substituído, ou dialquilo, e onde x é 2 a 4; R2 e R3 são iguais ou diferentes e são, independentemente, halogéneo, -R5, -0R5, -SR5 ou -NR5R6; R4 é -CH2R7, -C(=0)NR5R6, -C(=0)0R7, -C(=0)R7 ou R3; R5 e R6 são iguais ou diferentes e são, independentemente, hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído; ou Rs e R6, tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído; R7 é alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, 'Ό.'Ό. o heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído; e R8 é hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído.
Numa concretização preferida, são proporcionados métodos para reduzir a actividade de MIF num paciente que necessite, administrando ao paciente uma quantidade eficaz de um composto possuindo a seguinte estrutura (Ia) e/ou (Ib): 37 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
incluindo estereo-isómeros, ou a seus sais farmaceuticamente aceitáveis, onde: X é oxigénio; Y é -N02, -C(=0)R5, -C(=0)0R5, _C (=0) NR5R6; Z é -CH2- n é 1; R2 é hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído, dialquilo, ou aminoalquilo R'R"N(CH2) x- onde R' e R" são independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, substituído, heterocicloalquilo, ou dialquilo, e onde x é 2 a 4; R2 e R3 são iguais ou diferentes e são, independentemente, halogéneo, -R5, -0R5 -SR5 ou -NR5R6; R4 é -CH2R7, - C(=0)NR5R6, -C(=0)0R7, -C(=0)R7 ou R8; R5 e R6 são iguais ou diferentes e são independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído; ou R5 e R6, tomados em conjunto com o átomo de 38 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo ou heterociclo substituído; R7 é alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído; e R8 é hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído,
Como aqui utilizados, os termos acima têm os seguintes significados. 0 termo "alquilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um hidrocarboneto alifático insaturado ou saturado, de cadeia linear ou ramificada, não cíclica ou cíclica, contendo de la 10 átomos de carbono, enquanto o termo "alquilo inferior" tem o mesmo significado que alquilo mas contém 1 a 6 átomos de carbono. Os alquilos de cadeia linear saturados representativos incluem metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, e semelhantes; enquanto que os alquilos ramificados saturados incluem isopropilo, sec-butilo, isobutilo, te_rc-butilo, isopentilo, e semelhantes. Os alquilos cíclicos saturados representativos incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, -CH2ciclopropilo, -CH2CÍclobutilo, -CH2CÍclopentilo, -CH2ciclo-hexilo, e semelhantes; enquanto que os alquilos insaturados cíclicos incluem ciclopentenilo e ciclo-hexenilo, e semelhantes. Os alquilos cíclicos, também designados por "anéis homocíclicos," e incluem di- e poli-anéis homocíclicos tais como decalina e adamantano. Os alquilos insaturados contêm pelo menos uma dupla ou tripla ligação entre átomos de carbono adjacentes (designados por um "alcenilo" ou "alcinilo," respectivamente). Os alcenilos de cadeia linear e ramificada representativos incluem etilenilo, propilenilo, 1- butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2- pentenilo, 3-metil-l-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, e semelhantes; enquanto que os alcinilos de cadeia linear e ramificada representativos incluem acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-l butinilo, e semelhantes. 39 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Ο termo "arilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir uma porção carbociclica aromática tal como fenilo ou naftilo. 0 termo "arilalquilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um alquilo possuindo, pelo menos, um átomo de hidrogénio do alquilo substituído por uma porção arilo, tais como benzilo, -CH2(1 ou 2-naftilo), - (CH2) 2fenilo, - (CH2) 3fenilo, -CH (fenilo) 2, e semelhantes. 0 termo "heteroalquilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um anel heterocíclico aromático de 5- a 10 membros e possuindo pelo menos um heteroátomo seleccionado de entre azoto, oxigénio e enxofre, e contendo pelo menos 1 átomo de carbono, incluindo os sistemas mono- e bicíclico. Os heteroarilos representativos incluem (não lhes estando limitados) furilo, benzofuranilo, tiofenilo, benzotiofenilo, pirrolilo, indolilo, iso-indolilo, aza-indolilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, oxazolilo, isooxazolilo, benzoxazolilo, pirazolilo, imidazolilo, benzimidazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, isotiazolilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, cinolinilo, ftalazinilo, e quinazolinilo. O termo "heteroarilalquilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um alquilo possuindo pelo menos um átomo de hidrogénio do alquilo substituído por uma porção heteroarilo, tais como -CH2piridinilo, -CH2pirimidinilo, e semelhantes.
Os termos "heterociclo" e "anel heterocíclico, " como aqui utilizado, são termos abrangentes e são usados no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um anel heterocíclico de 5 a 7 membros monocíclico, ou de 7- a 14-membros policíclico, que é ou saturado, insaturado ou aromático, e que contém de 1 a 4 heteroátomos independentemente seleccionados de entre azoto, oxigénio e enxofre, e onde os heteroátomos de azoto e enxofre podem ser 40 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ opcionalmente oxidados, e o heteroátomo de azoto pode ser opcionalmente quaternizado, incluindo anéis bicíclicos, nos quais qualquer dos heterociclos anteriores está fundido com um anel de benzeno, bem como anéis heterocíclicos triciclicos (e superiores). O heterociclo pode ser ligado via qualquer heteroátomo ou átomo de carbono. Os heterociclos incluem heteroarilos definidos como anteriormente. Assim, em adição aos heteroarilos aromáticos listados acima, os heterociclos também incluem (não lhes estando limitados) morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetra-hidrofuranilo, tetra-hidropiranilo, tetra-hidropiridinilo, tetra-hidroprimidinilo, tetra-hidrotiofenilo, tetra—hidro-tiopiranilo, tetra-hidropirimidinilo, tetra-hidrotiofenilo, tetra-hidrotiopiranilo, e semelhantes. O termo "heterocicloalquilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um alquilo possuindo, pelo menos, um átomo de hidrogénio do alquilo substituído por um heterociclo, tal como -CH2morfolinilo, e semelhantes. haloalquilo, arilalquilo substituído, substituído, 0 termo "substituído," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir qualquer dos grupos acima (e.g., alquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo ou heterocicloalquilo) onde, pelo menos, um átomo de hidrogénio é substituído por um substituinte. No caso de um substituinte ceto {“-C{=0)~") são substituídos dois átomos de hidrogénio. Quando substituído, "substituintes," no contexto da concretização preferida, incluem halogéneo, hidroxi, ciano, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, alquilo, alcoxi, alquiltio, arilo, arilo substituído, arilalquilo, substituído, heteroarilo, heteroarilo heteroarilalquilo, heteroarilalquilo heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo substituído, -NRaRb, -NRaC(=0)Rb, -NRaC (=0) NRaRb, -NRaC (=0) 0Rb -NRaS02Rb, -0Ra, -C(=0)Ra, -C (=0) 0Ra, -C (=0) NRaRb, -0C (=0) NRaRb, -SH, -SRa, -S0Ra, — S (=0) 2Rar -0S(=0)2Rar -S(=0)20Ra, onde Ra e Rb são iguais ou 41 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ diferentes e independentemente hidrogénio, alquilo, haloalquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, arilalquilo substituído, heteroarilo, heteroarilo substituído, heteroarilalquilo, heteroarilalquilo substituído, heterociclo, heterociclo substituído, heterocicloalquilo ou heterocicloalquilo substituído. 0 termo "halogéneo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir fluoro, cloro, bromo e iodo. 0 termo "haloalquilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um alquilo possuindo pelo menos um átomo de hidrogénio substituído por halogéneo, tal como trifluorometilo e semelhantes. 0 termo "alcoxi," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um porção alquilo ligada através de uma ponte de oxigénio (i.e., -O-alquilo) tal como metoxi, etoxi, e semelhantes. 0 termo "tioalquilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um porção alquilo ligada através de uma ponte de enxofre (i.e., -S-alquilo) tal como metiltio, etiltio, e semelhantes. 0 termo "alquilsulfonilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um porção alquilo ligada através de uma ponte de sulfonilo (i.e., -SO2-alquilo) tal como metilsulfonilo, etilsulfonilo, e semelhantes.
Os termos "alquilamino" e "dialquilamino" como aqui utilizado, são termos abrangentes e são usados no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir uma porção alquilo ou duas porções alquilo, respectivamente, ligadas através de uma ponte de azoto (i.e., -N-alquilo) tais 42 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ como metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, e semelhantes. 0 termo "hidroxialquilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um alquilo substituído com pelo menos um grupo hidroxilo. 0 termo "mono- ou di(cicloalquil)metilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um grupo metilo substituído com um ou dois grupos cicloalquilo, tais como ciclopropilmetilo, diciclopropilmetilo, e semelhantes. 0 termo "alquilcarbonilalquilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um alquilo substituído com um grupo -C(=0)alquilo. 0 termo "alquilcarboniloxialquilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um alquilo substituído com um grupo -C(=0)Oalquilo ou um alquilo grupo -0C(=0). 0 termo "alquiloxialquilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um alquilo substituído com um grupo -0-alquilo. 0 termo "alquiltioalquilo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um alquilo substituído com um grupo -S-alquilo. 0 termo "mono- ou di(alquil)amino," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um amino substituído com um alquilo ou com dois alquilos, respectivamente. 43 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Ο termo "mono- ou di(alquil)aminoalquilo," como aqui utilizado é um termo abranqente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um alquilo substituído com um mono- ou di(alquil)amino.
No contexto das concretizações preferidas usam-se os esquemas de numeração que se seguem:
Dependendo da porção Z, os compostos representativos das concretizações preferidas incluem a seguinte estrutura (II).
Noutras concretizações, n é 0,1, ou 2 representado nas estruturas (IV), (V) e (VI), respectivamente: 44 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Ainda noutras concretizações, os compostos das concretizações preferidas têm a seguinte estrutura (VII) quando X é oxigénio e a estrutura (VIII) quando X é enxofre.
Dependendo do grupo Y, os compostos das concretizações preferidas têm as seguintes estruturas (IX) a (XII)
(IX) (X) 45 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Os compostos das concretizações preferidas podem em geral ser empregues como ácido livre ou base livre. Alternativamente, os compostos das concretizações preferidas podem preferivelmente estar na forma de sais de adição de ácidos ou bases. Sais de adição de ácidos dos compostos de base livre amino das concretizações preferidas podem ser preparados por métodos bem conhecidos na especialidade, e podem ser formados a partir de ácidos orgânicos e inorgânicos. Ácidos orgânicos adequados incluem ácidos maleico, fumárico, benzóico; ascórbico, succinico, metanossulfónico, acético, oxálico, propiónico, tartárico, salicilico, cítrico, glucónico, láctico, mandélico, cinâmico, aspártico, esteárico, palmítico, glicólico, glutâmico, e benzenossulfónico. Ácidos inorgânicos adequados incluem ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico, e nítrico. Sais de adição de bases do ácido livre podem similarmente ser preparados por métodos bem conhecidos na especialidade, e podem ser formados a partir de bases adequadas, tais como catiões escolhidos de entre os metais alcalinos e alcalino-terrosos (e.g., lítio, sódio, potássio, magnésio, bário ou cálcio) bem como o catião amónio. 0 termo "sal farmaceuticamente aceitável" de estrutura (Ia) ou (Ib) destina-se a englobar qualquer e todas as formas de sal aceitáveis.
Os compostos de estrutura (Ia) e (Ib) podem ser produzidos de acordo com as técnicas de síntese orgânica conhecidas dos peritos nesta área, bem como pelos métodos representativos apresentados no Exemplo 1. Em geral, os 46 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ compostos de estrutura (Ia) podem ser produzidos de acordo com os esquemas reaccionais que se seguem.
Esquema Reaccional 1 ci
OH
ii
Em geral, os intermediários de cloro de estrutura iii podem ser preparados a partir do correspondente álcool ii por técnicas conhecidas. 0 álcool intermediário pode, por sua vez, ser preparado a partir do material de partida i por reacção com agentes apropriados. Reagentes e condições representativos são apresentados no Exemplo 1.
Esquema Rsaccional 2 H i4 1 N .N "z S z ·*_ | C1 N | A N n Boc | Boc H Iv V vl
Podem ser preparadas piperazinas N-substituidas de estrutura vi por desprotecção do intermediário protegido v (neste caso, protegido com N-terc-butiloxicarbonilo ou "Boc" para ilustração). 0 intermediário protegido pode ser produzido a partir da piperazina N-protegida iv por adição do desejado grupo R4. 47 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Esquema Reaccional 3 47 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
0 intermediário iii do Esquema Reaccional 1 pode ser feito reagir com o intermediário vi do Esquema Reaccional 3 para dar compostos das concretizações preferidas possuindo a estrutura (Ia).
Esquema Reaccional 4
Alternativamente, o intermediário iii do Esquema Reaccional 1 pode ser feito reagir com o intermediário 48 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ protegido iva, para originar o produto reaccional protegido vii. Este produto reaccional protegido pode depois ser desprotegido para originar o intermediário viii, seguindo-se a adição do desejado grupo R4 para dar compostos das concretizações preferidas possuindo a estrutura (Ia). MIF como Fármaco-Alvo 0 factor inibitório de migração dos macrófagos (MIF) pode ser bastante adequado para análise como alvo para fármaco, uma vez que a sua actividade tem sido implicada numa variedade de condições patofisiológicas. Por exemplo, o MIF tem mostrado ser um mediador significativo tanto nas respostas inflamatórias como na proliferação celular. A este respeito, o MIF tem mostrado desempenhar papéis como uma citoquina, uma hormona pituitária, como imunomodulador induzido por glucocorticóide, e muito recentemente como um neuro-imunomodulador e na função neuronal. Takahashi et ai., Mol. Med. 4:707-714, 1998; Bucala, Ann. N.Y. Acad. Sei. 840:74-82, 1998 ; Bacher et al. , Mol. Med. 4 (4):217-230, 1998. Além disso, foi recentemente demonstrado que os anticorpos anti-MIF têm uma variedade de usos, especialmente crescimento tumoral diminuido, conjuntamente com uma redução observada na angiogénese. Ogawa et al., Cytokine 12(4):309-314, 2000; Metz e Bucala (supra). Deste modo, pequenas moléculas que possam inibir MIF têm um valor significativo no tratamento de respostas inflamatórias, redução de angiogénese, infecção virai, infecção bacteriana, tratamento de cancro (especificamente tumorigénese e apoptose), tratamento da doença do hospedeiro versus enxerto e rejeição de tecido associada. Um inibidor de MIF pode ser particularmente útil numa variedade de respostas imuno-associadas, crescimento tumoral, glomerulonefrite, inflamação, anemia malarial, choque séptico, angiogénese associada a tumor, vitreoretinopatia, psoriase, doença do hospedeiro versus enxerto (rejeição de tecido), dermatite atópica, artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino, distúrbios inflamatórios do pulmão, otite média, doença de Crohn, síndroma da dificuldade respiratória aguda, hipersensibilidade do tipo retardada. Um inibidor de MIF também pode ser útil no tratamento de stress e distúrbios da função glucocorticóide, e.g., na contra-regulação da acção do 49 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ glucocorticóide; ou na ultrapassagem da supressão mediada por glucocorticóide da libertação do araquidonato (actividade catalítica de MIF oxidoreductase com base em Cys-60 ou mecanismo baseado na interacção JABI/CSNS-MIF).
Um exemplo da utilidade de um inibidor de MIF pode ser evidenciado pelo facto de, a seguir à exposição a endotoxinas, as concentrações de MIF detectáveis no soro aumentarem gradualmente durante a fase aguda (1-8 horas), atingirem um pico às 8 horas e persistirem durante a fase pós-aguda (>8 horas) durante até 20 horas. Embora sem nos limitarmos a qualquer teoria de operação, o MIF pode ser provavelmente produzido por células T activadas e macrófagos durante a etapa pró-inflamatória do choque induzido pela endotoxina, e.g., como parte da resposta localizada à infecção. Uma vez libertado por um estímulo pró-inflamatório, e.g., concentrações baixas de LPS, ou por TNF-α e IFN-γ, o MIF derivado de macrófago pode ser a fonte provável de MIF produzido durante a fase aguda do choque endotóxico. Tanto a pituitária, que liberta MIF em resposta a LPS, como os macrófagos são uma fonte provável de MIF na fase pós-aguda do choque endotóxico, quando a infecção já não está confinada a um sítio localizado. Ver, e.g., Patente U.S. No. 6,080,407, aqui incorporada por referência na sua totalidade e que descreve estes resultados com anticorpos anti-MIF.
Como se demonstrou aqui, os inibidores de concretizações preferidas inibem a letalidade em ratinhos a seguir à provocação com LPS e provavelmente atenuam os níveis de IL-Ιβ e TNF-α. Deste modo, uma variedade de condições inflamatórias são susceptíveis de tratamento com um inibidor de MIF. A este respeito, entre outras vantagens, a inibição da actividade e/ou libertação de MIF podem ser empregues para tratar a resposta inflamatória e choque. Podem ser conseguidos efeitos benéficos por intervenção tanto nas etapas precoces como tardias da resposta ao choque. A este respeito, embora não nos limitando a qualquer teoria ou mecanismo responsável pelo efeito protector de inibição de MIF, estudos anti-MIF têm demonstrado que a introdução de anticorpos anti-MIF está associada a uma apreciável redução (até 35-40%) nos níveis de TNF-α no soro circulante. Esta redução é consistente com a actividade indutora de TNF-α de MIF nos macrófagos in vitro e 50 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ sugere que ο MIF pode ser responsável, em parte, pelo pico extremamente elevado do nível de TNF-α no soro que ocorre 1-2 horas após administração de endotoxina, apesar do facto de MIF não poder ser detectado na circulação nesta altura. Assim, a terapia por inibição de MIF pode ser benéfica nas etapas precoces da resposta inflamatória. 0 MIF também desempenha um papel durante a etapa pós-aguda da resposta ao choque, e portanto, oferece uma oportunidade para intervir em etapas tardias onde outros tratamentos, tais como a terapia anti-TNF-α, são ineficazes. A inibição de MIF pode proteger contra choque letal em animais provocados com concentrações elevadas de endotoxina (i.e., concentrações que induzem a libertação de MIF pituitário na circulação), e em animais provocados com TNF-a. Deste modo, a capacidade de inibir MIF e proteger os animais provocados com TNF indica que a neutralização de MIF durante a fase tardia, pós-aguda do choque séptico pode ser eficaz.
Como aqui se evidencia, os níveis de TNF-α e IL-Ιβ estão correlacionados, pelo menos em algumas circunstâncias, com os níveis de MIF. Deste modo, uma molécula pequena anti-MIF pode ser útil numa variedade de estados de doença associados a TNF-α e/ou IL-1β incluindo rejeição de transplante, elementos inflamatórios e imuno-mediados de doença do SNC (e.g., Alzheimer, Parkinson, esclerose múltipla, etc.), distrofia muscular, doenças de hemostase (e.g., coagulopatia, doenças veno-oclusivas, etc.), neurite alérgica, granuloma, diabetes, doença do hospedeiro versus enxerto, dano crónico renal, alopecia (perda de pêlo ou cabelo), pancreatite aguda, doença das articulações, insuficiência cardíaca congestiva, doença cardiovascular (restenose, aterosclerose), doença das articulações, e osteoartrite.
Além disso, evidência adicional da especialidade tem indicado que os esteróides, sendo embora potentes inibidores da produção de citoquina aumentam na realidade a expressão de MIF. Yang et al., Mol. Med. 4 (6):413-424, 1998; Mitchell et al., J. Biol. Chem. 274 (25): 18100-18106, 1999; Calandra e Bucala, Crit Rev. Immunol. 17(1):77-88, 1997; Bucala, FASEB J. 10(14):1607-1613, 1996. Deste modo, pode ser de particular utilidade utilizar inibidores de MIF em combinação com 51 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ terapia esteróide para o tratamento de condições patofisiológicas mediadas por citoquinas, tais como inflamação, choque, e outros estados patológicos mediados por citoquinas, particularmente em estados inflamatórios crónicos tais como artrite reumatóide. Esta terapia de combinação pode ser benéfica mesmo depois do inicio das respostas ao patogénio ou de outras respostas inflamatórias. Por exemplo, em clinica, a administração de esteróides depois do inicio dos sintomas de choque séptico tem-se revelado de pouco beneficio. Ver Bone et al., N. Engl. J. Med. 317: 653-658, 1987; Spring et al., N. Engl. j. Med. 311: 1137-1141, 1984. A terapia de combinação esteróides/inibição de MIF pode ser empregue para superar este obstáculo. Além disso, um perito na especialidade compreenderá que estas terapias podem ser adaptadas para inibir a libertação e/ou actividade de MIF localmente e/ou sistemicamente.
Ensaios A eficácia de um composto como inibidor de MIF pode ser determinada por vários métodos de ensaio. Os inibidores adequados de concretizações preferidas são capazes de diminuir uma ou mais actividades associadas a MIF e/ou a exportação de MIF. Um composto de estrutura (Ia) ou (Ib) ou de qualquer outra estrutura pode ser avaliado quanto à actividade como inibidor de MIF por um ou mais ensaios geralmente aceites para este fim, incluindo (sem lhes estar limitados) os ensaios descritos abaixo.
Os ensaios podem geralmente ser divididos em três categorias, sendo estas, ensaios para monitorizar a exportação; os para monitorizar a ligação do efector ou de molécula pequena, e aqueles para controlar a actividade de MIF. Contudo, deve notar-se que combinações destes ensaios estão no âmbito do presente pedido. Surpreendentemente, parece que mapeamento do epitopo de MIF actua como marcador indirecto ("surrogate") relativamente à actividade biológica. Por exemplo, num ensaio, a presença de um inibidor candidato bloqueia a detecção da exportação de MIF das células (e.g., células THP-1), medida usando um anticorpo monoclonal tal como os disponíveis comercialmente em sistemas R&D (Minneapolis, MN), enquanto que um anticorpo policlonal 52 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ demonstra que ο MIF está presente. Além disso, podem ser empregues ensaios de base celular ou in vitro para demonstrar que estes potenciais inibidores inibem a actividade de MIF. Numa alternativa, estes dois ensaios (i.e., ensaios de ligação e actividade) podem ser combinados num único ensaio que detecta a ligação de um composto teste (e.g., a capacidade de deslocar anticorpos monoclonais ou inibir a sua ligação) ao mesmo tempo que também afecta a actividade de MIF. Estes ensaios incluem a combinação de um ensaio do tipo ELISA (ou ensaio de ligação semelhante) com um ensaio de tautomerismo de MIF ou um ensaio funcional semelhante. Como uma pessoa competente na matéria pode facilmente reconhecer, o ensaio exacto empregue é irrelevante, desde que ele seja capaz de detectar a capacidade do composto de interesse ligar MIF. Além disso, o ensaio preferivelmente detecta a capacidade do composto inibir a actividade de MIF porque selecciona compostos que interagem com MIF biologicamente activo e MIF não inactivo.
Também deve ser entendido que os compostos que demonstram capacidade de inibir a ligação do anticorpo monoclonal a MIF biologicamente activo e não inactivo (e.g., molécula pequena inibida), indicam necessariamente a presença de um composto (e.g., uma molécula pequena) que interage com MIF de uma forma que ou muda a conformação de MIF ou bloqueia um epitopo necessário para a ligação do anticorpo. Noutras concretizações, a actividade inibitória de MIF pode também ser reconhecida como consequência de interferir com a formação de um complexo de polipéptido que inclui MIF; perturbar um tal complexo pode ter como resultado uma alteração conformacional que inibe a detecção. Deste modo, a utilização de ensaios que monitorizem alterações conformacionais em MIF, é vantajosa quando empregues quer adicionalmente aos ensaios de medição da competição entre compostos, tais como pequenas moléculas com mAb quer em substituição a esses ensaios. São conhecidos na especialidade vários desses ensaios e incluem, calorimetria, dicroismo circular, transferência de energia de fluorescência, dispersão da luz, ressonância magnética nuclear (RMN), ressonância de plasmão de superfície, ensaios de proximidade de cintilação (ver Patente U.S. No. 5,246,869), e semelhantes. Ver também W002/07720-A1 e W097/29635-A1. Deste 53 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ modo, um perito na especialidade reconhecerá que pode ser utilizado qualquer ensaio que indique liqação e preferivelmente alteração conformacional ou colocação próximo do local activo de MIF. Adiante são apresentadas descrições de vários dos ensaios de proximidade e ensaios conformacionais mais complicados, esta discussão é meramente exemplificativa e não deve ser, de modo nenhum entendida como limitativa do tipo de técnicas que possa ser utilizado em concretizações preferidas.
Num exemplo, pode ser utilizado dicroismo circular (CD) para determinar a liqação do inibidor candidato. 0 dicroismo circular (CD) baseia-se em parte no facto de muitas macromoléculas biolóqicas de proteína serem constituídas por unidades de monómeros assimétricas, L-aminoácidos, de modo que todas elas possuem o atributo da actividade óptica. Adicionalmente, as estruturas rígidas como o ADN ou um polipéptido alfa helicoidal têm propriedades ópticas que podem ser medidas usando os sistemas espectroscópicos apropriados. De facto, grandes alterações num parâmetro espectroscópico facilmente medido podem proporcionar meios selectivos para identificar estados conformacionais e alterações nos estados conformacionais sob várias circunstâncias, e, por vezes, para observar a perturbação de grupos sozinhos na macromolécula ou ligados à macromolécula. Além disso, a análise por CD tem sido frequentemente empregue para sondar as interacções de várias macromoléculas com pequenas moléculas e ligandos. Ver Durand et al. , Eur. Biophys. J. 2 7 (2):147-151, 1998; Kleifeld et al., Biochem 39(26):7702-7711, 2000; Bianchi et al., Biochem 38(42):13844-13852, 1999; Sarver et al., Biochim Biophys Acta 1434(2):304-316, 1999. O princípio de Pasteur afirma que uma molécula activa tem que ser assimétrica; isto é, a molécula e a sua imagem no espelho não se podem sobrepor. A luz plano-polarizada é uma combinação de luz polarizada circularmente à esquerda e luz polarizada circularmente à direita, viajando em fase. A interacção desta luz com uma molécula assimétrica resulta numa interacção preferencial de um componente circularmente polarizado que, numa região de absorção, é vista como uma absorção diferencial (i.e., um dicroismo). Ver Urry, D. W., 54 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Spectroscopic Approaches to Biomolecular Conformation, American Medicai Association Press, Chicago, III, pp. 33-120 (1969); Berova e Woody, Circular Dichroism: Principies e Applications, John Wiley & Sons, N.Y., (2000). O dicroísmo circular, então, é um fenómeno absortivo que ocorre quando um cromóforo interage com luz plano-polarizada a um comprimento de onda especifico. A banda de absorção pode ser negativa ou positiva dependendo da absorção diferencial dos componentes polarizados circularmente à esquerda ou à direita, para esse cromóforo. Contrariamente à dispersão óptica rotatória (ORD) que mede as contribuições do fundo e o cromóforo de interesse a muitos milimícrons da região de interacção real de luz, o DC oferece a vantagem de medir eventos ópticos ao comprimento de onda em que os eventos ocorrem. O dicroísmo circular, por conseguinte, é específico da transição electrónica do cromóforo. Ver Berova e Woody, Circular Dichroism: Principies e Applications, John Wiley & Sons, N.Y., (2000) . A aplicação de dicroísmo circular a soluções de macromoléculas resultou na possibilidade de identificar estados de conformação (Berova e Woody, Circular Dichroism: Principies e Aplications, John Wiley & Sons, N.Y., (2000)). A técnica pode distinguir estados de conformação em enrolamento aleatório, hélice-alfa, e em cadeia beta de macromoléculas. Em proteínas, as proteínas fibrosas alfa helicoidais mostram curvas de absorção que se assemelham aproximadamente aos de polipéptidos alfa helicoidais, mas em proteínas globulares de estrutura conhecida, tais como lisozima e ribonuclease, as estruturas helicoidais são pouco concordantes com os trabalhos de cristalografia de raios X. Uma outra fonte de dificuldade para proteínas globulares é a prevalência de cromóforos aromáticos nas moléculas próximo de 280 nm. Um exemplo interessante de alterações helicoidais foi mostrado utilizando mioglobina e apomioglobina. Depois da remoção do grupo prostético heme, a apoproteína remanescente tem elipticidade dicróica circular residual reduzida em 25%. Esta perda de hélice é atribuível a um não enrolamento de 10-15 resíduos na molécula. Outros cromóforos não peptídicos, opticamente activos, incluem tirosina, triptofano, fenilalanina, e cisteína quando localizados na sequência de 55 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ aminoácidos primária de uma macromolécula. Exemplos de elipticidades não peptídicas incluem a transição dissulfureto em ribonuclease e as transições cisteina da insulina.
Deste modo, pode ser empregue dicroismo circular para avaliar inibidores candidatos relativamente à capacidade de afectar a conformação de MIF.
Em certas concretizações proporcionadas aqui, a formação do complexo MIF-agente de ligação ou inibidor pode ser determinada por detecção da presença de um complexo incluindo MIF e um agente de ligação detectavelmente marcado. Como se descreve em maior detalhe abaixo, a detecção do sinal da energia de fluorescência, por exemplo por polarização de fluorescência, proporciona determinação dos niveis de sinal que representam a formação de um complexo molecular MIF-agente de ligação. Deste modo, como aqui se proporciona, a comparação com base no sinal de energia de fluorescência da formação do complexo MIF-agente de ligação na ausência e na presença de um inibidor candidato proporciona um método para identificar se o agente altera a interacção entre MIF e o agente de ligação. Por exemplo, o agente de ligação pode ser um substrato de MIF, um anticorpo anti-MIF, ou um inibidor conhecido, enquanto que o inibidor candidato pode ser o composto a ser testado ou vice-versa.
Como se notou acima, certas concretizações preferidas também se referem em parte a determinação da formação do complexo MIF-agente de ligação com base no sinal de energia de fluorescência. A detecção dos sinais de energia de fluorescência pode ser feita, por exemplo, por polarização de fluorescência ou por transferência de energia de ressonância de fluorescência, ou por outros métodos de fluorescência conhecidos na especialidade. Como exemplo de algumas outras concretizações, o polipéptido MIF pode ser marcado, bem como o inibidor candidato, e podem compreender um par doador-aceitador molecular de transferência de energia, e determina-se o nível de transferência de energia de fluorescência por ressonância do doador de energia para o receptor de energia.
Em certas concretizações o inibidor e/ou agente de ligação candidatos é detectavelmente marcado, e em 56 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ concretizações particularmente preferidas o inibidor e/ou agente de ligação candidatos é capaz de gerar um sinal de energia de fluorescência. 0 inibidor e/ou agente de ligação candidatos podem ser detectavelmente marcados, ligando covalentemente ou não covalentemente uma molécula repórter ou porção adequados, por exemplo qualquer de vários materiais fluorescentes (e.g., um fluoróforo) seleccionado de acordo com a técnica de energia de fluorescência particular a ser empregue, como conhecido na especialidade e com base nos métodos descritos aqui. As porções fluorescentes repórter e métodos, como fornecidos aqui, podem ser encontrados, por exemplo em Haugland (1996 Handbook of Fluorescente Probes e Research Chemicals- Sexta Ed., Molecular Probes, Eugene, OU; 1999 Handbook of Fluorescent Probes e Research Chemicals-Sétima Ed., Molecular Probes, Eugene, OU, http://www.probes.com/lit/) e em referências aqui citadas. Particularmente preferidos para utilização como fluoróforo em concretizações preferidas são a fluoresceina, rodamina, Texas Red, AlexaFluor-594, AlexaFluor-488, Oregon Green, BODIPY-FL, e Cy-5. Contudo, pode ser empregue qualquer fluoróforo adequado, e em certas concretizações podem ser preferidos fluoróforos que não os listados.
Como indicado aqui, um sinal de energia de fluorescência inclui qualquer evento de emissão, excitação, transferência de energia, inibição ("quenching") , ou desinibição ("dequenching") ou semelhante. Tipicamente, um sinal de energia de fluorescência pode ser mediado por um inibidor e/ou agente de ligação candidatos marcado detectavelmente fluorescente em resposta à luz com um comprimento de onda apropriado. Resumidamente, e sem querermos ficar ligados a uma teoria, a geração de um sinal de energia de fluorescência geralmente envolve a excitação de um fluoróforo por uma fonte de energia apropriada (e.g., luz com um comprimento de onda adequado para a porção repórter fluorescente seleccionada, ou fluoróforo) que transientemente eleva o estado de energia do fluoróforo de um estado de base para um estado excitado. 0 fluoróforo excitado por sua vez emite energia na forma de luz detectável tipicamente possuindo um comprimento de onda diferente dos preferidos para excitação (e.g., usualmente superiores), e ao fazê-lo retorna ao seu estado de base. Os métodos das concretizações preferidas contemplam a utilização 57 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ de qualquer sinal de energia de fluorescência, dependendo do fluoróforo, método de marcação do substrato e instrumentação de detecção particulares, que podem ser seleccionados facilmente sem necessidade de experimentação, de acordo com critérios com os quais estão familiarizadas as pessoas competentes na matéria.
Em algumas concretizações, o sinal de energia de fluorescência é um sinal de polarização de fluorescência (FP). Em algumas outras concretizações, o sinal de energia de fluorescência pode ser um sinal de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET). Em algumas outras concretizações preferidas o sinal de energia de fluorescência pode ser um sinal de extinção de fluorescência (FQ) ou um sinal de espectroscopia de ressonância de fluorescência (FRS) . (Para detalhes de FP, FRET, FQ e FRS, ver, por exemplo, W097/39326; W099/29894; Haugland, Handbook of Fluorescent Probes e Research Chemicals-6a Ed., 1996, Molecular Probes, Inc., Eugene, OU, p. 456; e referências ai citadas.) FP, uma medida do deslocamento angular médio (devido a difusão rotacional molecular) de um fluoróforo que ocorre entre a sua absorção de um fotão de uma fonte de energia e a sua emissão subsequente de um fotão, depende da extensão e taxa de difusão rotacional durante o estado excitado do fluoróforo, do tamanho e forma molecular, da viscosidade da solução e da temperatura da solução (Perrin, 1926 J. Phys. Rad. 1:390). Quando se mantêm constantes a viscosidade e a temperatura, a FP está directamente relacionada com o tamanho ou volume molecular aparente do fluoróforo. O valor da polarização é uma razão de intensidades de fluorescência medida em planos distintos (e.g., vertical e horizontal) e é portanto uma quantidade adimensional que não é afectada pela intensidade do fluoróforo. Fluoróforos de baixo peso molecular, tais como o inibidor e/ou agente de ligação candidatos detectavelmente marcados, aqui proporcionados, são capazes de rotação molecular rápida em solução (i.e., anisotropia baixa) e dão assim origem a leituras de polarização de fluorescência baixas. Contudo, quando complexado a uma molécula de peso molecular superior tal como o MIF aqui proporcionado, a porção fluoróforo do substrato 58 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ associa-se a um complexo que exibe rotação molecular relativamente baixa em solução (i.e., anisotropia elevada), resultando em leituras de polarização de fluorescência mais elevadas.
Esta diferença no valor de polarização do inibidor e/ou agente de ligação candidatos livre detectavelmente marcado quando comparado com o valor de polarização do complexo MIF:inibidor e/ou agente de ligação candidatos pode ser empregue para determinar a razão de complexado (e.g., ligado) para livre. Esta diferença também pode ser empregue para detectar a influência de uma agente candidato (i.e., inibidor candidato) na formação destes complexos e/ou na estabilidade de um complexo pré-formado, por exemplo por comparação da FP detectada na ausência de um agente com a FP detectada na presença do agente. As medições de FP podem ser realizadas sem separação dos componentes da reacção.
Como se notou acima, um aspecto de uma concretização preferida utiliza a ligação ou deslocamento de um anticorpo monoclonal, inibidor conhecido, ou outro agente de ligação e/ou formação do complexo do inibidor candidato com MIF para proporcionar um método de identificar um inibidor que altera a actividade de MIF. Surpreendentemente, os inibidores das concretizações preferidas foram identificados de uma tal maneira não convencional. A este respeito, uma classe dos compostos demonstrou a capacidade de inibir/diminuir a ligação do anticorpo monoclonal a um MIF biologicamente activo que é naturalmente produzido pelas células, não afectando simultaneamente a capacidade do anticorpo reconhecer MIF inactivo (recombinante) (disponível em fontes comerciais) e demonstrou também modulação pronunciada da actividade de MIF in vivo. Deste modo, pode ser preferida a ligação de anticorpo como um indicador indirecto relativamente à actividade enzimática, eliminando assim a necessidade de realizar ensaios enzimáticos dispendiosos e complexo para cada composto candidato. Como as pessoas competentes na matéria facilmente apreciarão, a capacidade de evitar ensaios enzimáticos conduz a um ensaio que pode ser extremamente adequado para utilização em avaliação de alto desempenho. 59 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Além disso, como as pessoas competentes na matéria podem facilmente apreciar, um tal ensaio pode ser empregue fora do contexto de MIF e sempre que a actividade enzimática ou biológica possa ser substituída por um ensaio de ligação. Por exemplo, qualquer enzima ou outro polipéptido cuja forma biologicamente activa é reconhecida por um anticorpo monoclonal que não reconheça a forma inactiva (e.g., forma inibida de molécula pequena) pode ser preferido. No contexto de uma enzima, o anticorpo monoclonal pode ligar ao sítio activo, mas ser deslocado por uma molécula pequena. Assim, qualquer molécula pequena que desloque o anticorpo pode ser uma pista forte para um potencial inibidor enzimático. Como os peritos na arte apreciarão, o anticorpo pode reconhecer um epítopo que altere a conformação dependendo do estado activo da enzima, e essa ligação de uma molécula pequena de modo que precluda a ligação do anticorpo ao seu epítopo pode também actuar como um marcador indirecto relativamente à actividade enzimática, mesmo que o epítopo não esteja no sítio activo. Deste modo, o tipo de ensaio utilizado aqui pode ser expandido de modo a ser empregue com essencialmente qualquer polipéptido onde o deslocamento do anticorpo seja predictivo da perda de actividade. Assim, na sua forma mais simples qualquer polipéptido, e.g., enzima e o seu anticorpo neutralizador associado pode ser empregue para avaliar pequenas moléculas que deslocam este anticorpo, identificando assim inibidores prováveis. 0 complexo MIF-agente de ligação/inibidor candidato pode ser identificado por qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecida na especialidade para demonstrar uma interacção intermolecular entre MIF e outra molécula como se descreveu acima, por exemplo, co-purificação, co-precipitação, co-imunoprecipitação, ensaios radiométricos ou fluorimétricos, análises de western immunoblot, captura por afinidade incluindo técnicas de afinidade tais como técnicas de sorvente de ligando-contraligando de fase sólida, cromatografia de afinidade e ressonância plasmónica de superfície de afinidade, RMN, e semelhante (ver, e.g., Patente U.S. No. 5,352,660). A determinação da presença de um tal um complexo pode empregar anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais, policlonais, quiméricos, de cadeia 60 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ simples, e semelhante, que se liguem especificamente a MIF ou ao agente de ligação.
Para detectar a presença de um complexo também podem ser empregues MIF marcado e/ou agentes de ligação/inibidores candidatos marcados. A molécula de interesse pode ser marcada ligando covalentemente ou não covalentemente uma molécula ou porção repórter adequadas, por exemplo qualquer de várias enzimas, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, e materiais radioactivos. Exemplos de enzimas adequadas incluem, não lhes estando limitados, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β-galactosidase, e acetilcolinesterase. Exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem, não lhes estando limitados, "umbeliferone", fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansilo, ficoeritrina, Texas Red, AlexaFluor-594, AlexaFluor-488, Oregon Green, BODIPY-FL e Cy-5. Materiais luminescentes apropriados incluem, não lhes estando limitados, luminol e materiais radioactivos adequados incluem fósforo [32P], iodo [1251 ou 131I] ou tritio [3H] radioactivos. O MIF e o agente de ligação e/ou o inibidor candidato são combinados sob condições e durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de um complexo intermolecular entre os componentes. Condições adequadas para a formação de tais complexos são conhecidas na especialidade e podem ser facilmente determinadas com base nos ensinamentos aqui proporcionados, incluindo condições de solução e métodos para detectar a presença de um complexo e/ou para detectar substrato livre em solução. A associação de agente(s) de ligação e/ou inibidor(es) candidato(s) detectavelmente marcado(s) num complexo com MIF, e/ou agente de ligação ou inibidor candidato que não é parte deste complexo, pode ser identificada de acordo com a concretização preferida por detecção de um sinal de energia de fluorescência gerado pelo substrato. Tipicamente, uma fonte de energia para detectar um sinal de energia de fluorescência é seleccionada de acordo com critérios que são familiares à pessoas competentes na matéria, dependendo da porção repórter fluorescente com a qual está marcado o 61 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ substrato. A solução de teste, contendo (a) MIF e (b) o agente de ligação e/ou inibidor candidato detectavelmente marcado, é exposta à fonte de energia para gerar um sinal de energia de fluorescência, que é detectado por qualquer uma de uma variedade de instrumentos bem conhecidos e identificado de acordo com o sinal de energia de fluorescência particular. Em concretizações preferidas, o sinal de energia de fluorescência é um sinal de polarização de fluorescência que pode ser detectado usando espectrofluorimetro equipado com filtros de polarização. Em concretizações particularmente preferidas o ensaio polarização de fluorescência é realizado simultaneamente em cada uma de uma pluralidade de câmaras de reacção que podem ser lidas usando um leitor de placas LJL CRITERION™ Analyst (LJL Biosystems, Sunnyvale, CA), por exemplo, para proporcionar uma avaliação de elevado desempenho (HTS) possuindo componentes ou condições reaccionais diversas nas várias câmaras reaccionais. Exemplos de outros instrumentos adequados para obtenção de leituras de polarização de fluorescência incluem os dispositivos POLARSTAR™ (BMG Lab Technologies, Offenburg, Alemanha), BEACON™ (Panvera, Inc., Madison, WI) e o POLARION™ (Tecan, Inc., Research Triangle Park, NC). A determinação da presença de um complexo que se formou entre MIF e um agente de ligação e/ou um inibidor candidato pode ser realizada por uma variedade de métodos, como se notou acima, incluindo metodologia de sinal de energia de fluorescência como aqui proporcionada aqui e conhecida na especialidade. Estas metodologias podem incluir, apenas com fins ilustrativos e não limitativos, FP, FRET, FQ, outros ensaios fluorimétricos, co-purificação, co-precipitação, co-imunoprecipitação, radiométricos, análise por western immunoblot, captura por afinidade incluindo técnicas de afinidade tais como técnicas de sorvente de ligando-contraligando de fase sólida, cromatografia de afinidade e ressonância plasmónica de superfície de afinidade, dicroismo circular, e semelhantes. Relativamente a estas e outras técnicas de afinidade úteis ver, por exemplo, Scopes, R.K., Protein Purification: Principies and Practice, 1987, Springer-Verlag, NY; Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston; e Hermanson, G.T. et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, 1992, 62 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Academic Press, Inc., Califórnia; que são aqui incorporados por referência na sua totalidade, para detalhes relativos a técnicas para isolar e caracterizar complexos, incluindo técnicas de afinidade. Em várias concretizações, o MIF pode interagir com um agente de ligação e/ou inibidor candidato via ligação especifica se o MIF liga o agente de ligação e/ou inibidor candidato com um Ka superior ou igual a cerca de 104 M 1, preferivelmente superior ou igual a cerca de 105 M_1, mais preferivelmente superior ou igual a cerca de 106 M~4 e ainda mais preferivelmente superior ou igual a cerca de 107 M~7 a 1011 M~7. As afinidades dos parceiros de ligação podem ser facilmente calculadas a partir dos dados gerados de acordo com as metodologias de sinal de energia de fluorescência descritas acima e usando técnicas de manipulação de dados convencionais, por exemplo, as descritas por Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:660 (1949).
Por exemplo, em várias concretizações em que o sinal de energia de fluorescência é um sinal de polarização de fluorescência, a anisotropia de fluorescência (em luz polarizada) do inibidor e/ou agente de ligação candidatos livres, detectavelmente marcados, pode ser determinada na ausência de MIF, e a anisotropia de fluorescência (em luz polarizada) do substrato totalmente ligado pode ser determinada na presença de uma quantidade titulada de MIF. A anisotropia de fluorescência em luz polarizada varia em função da quantidade de movimento rotacional que o inibidor e/ou agente de ligação candidatos marcados sofre durante a vida dos estádios excitados do fluoróforo, de modo que as anisotropias do inibidor e/ou agente de ligação candidatos livres ou totalmente ligados podem ser empregues com utilidade para determinar a fraeção do inibidor e/ou agente de ligação candidatos ligados a MIF num dado conjunto de condições experimentais, por exemplo, aquelas em que está presente um agente candidato (ver, e.g., Lundblad et al., 1996 Molec. Endocrinol. 10:607; Dandliker et al., 1971 Immunochem. 7:799; Collett, E., Polarized Light: Fundamentais e Applications, 1993 Mareei Dekker, New York).
Algumas das concretizações preferidas referem-se em parte à utilização de transferência de energia intermolecular para controlar a formação e a estabilidade do complexo MIF- 63 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ agente de ligação e/ou a formaçao do complexo MIF-inibidor candidato. A transferência de energia (ET) é gerada a partir de uma interacção de ressonância entre duas moléculas: uma molécula "doadora" contribuidora para a energia e uma molécula "aceitadora" receptora de energia. A transferência de energia pode ocorrer quando (1) o espectro de emissão do doador se sobrepõe ao espectro de absorção do aceitador e (2) o doador e o aceitador estão a uma certa distância (por exemplo, menos do que cerca de 10 nm) um do outro. A eficiência da transferência de energia é ditada largamente pela proximidade do doador e aceitador, e diminui numa potência de 6 com a distância. As medidas de ET reflectem assim fortemente a proximidade dos compostos aceitador e doador, e as mudanças na ET reflectem sensivelmente mudanças na proximidade dos compostos tal como, por exemplo, associação ou dissociação do doador e aceitador.
Deste modo, é um aspecto de uma concretização preferida proporciona um método para o ensaio de um inibidor candidato de MIF, na parte pertinente, fazendo contactar MIF ou um complexo MIF-agente de ligação incluindo uma ou mais moléculas doadora de ET e uma aceitadora de ET, excitando o doador de ET para produzir uma molécula doadora de ET excitada e detectando um sinal gerado por transferência de energia do doador de ET para o aceitador de ET. Como também aqui proporcionado, o método pode empregar qualquer molécula doador de ET adequada e molécula aceitadora de ET que possam funcionar como um par doador-aceitador.
Em certas concretizações preferidas, um sinal detectável que é gerado por transferência de energia entre as moléculas doadora e aceitadora de ET resulta da transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), como discutido acima. A FRET ocorre numa molécula, ou entre dois tipos diferentes de moléculas, quando a energia de um fluoróforo doador excitado é transferida directamente para um fluoróforo aceitador (para revisão, ver Wu et al., Analytical Biochem. 218:1-13,1994). 64 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Noutros aspectos das concretizações preferidas, é testada a capacidade do inibidor candidato efectuar a exportação de MIF. 0 primeiro passo de um tal ensaio é realizado para detectar MIF extracelularmente. Para este ensaio, são empregues células de teste expressando MIF (e.g., células THP-1). As células de teste podem tanto produzir naturalmente a proteína como produzi-la a partir de vector de expressão transfectado. As células de teste, preferivelmente, normalmente expressam a proteína, de modo que a transfecção apenas aumenta os níveis expressos. Assim, para expressão de MIF e IL-1, preferem-se células THP1. Quando se ensaiam proteínas derivadas viralmente, tais como HIV tat, se a células de teste não produz "naturalmente" a proteína, elas podem ser facilmente transfectadas usando um vector apropriado, de modo que as células de teste expressem a proteína desejada, como os peritos na especialidade facilmente apreciarão.
Depois da expressão, o MIF é detectado por qualquer um de uma variedade de métodos e procedimentos bem conhecidos. Estes métodos incluem coloração com anticorpos em conjunção com citometria de fluxo, microscopia confocal, análise de imagem, imunoprecipitação de citosol ou meio celular, Western blot de meio celular, ELISA, análise de 1- ou 2-D, HPLC, ou bioensaio. Um ensaio conveniente para a avaliação inicial é ELISA. A exportação de MIF pode ser confirmada por um dos outros ensaios, preferivelmente por imunoprecipitação de meio celular a seguir a marcação metabólica. Resumidamente, as células que expressam proteína MIF são marcadas metabolicamente durante 15 minutos com 35S-metionina e/ou 35S-cisteína em meio isento de metionina e/ou cisteína e "perseguida" ("chased") em meio suplementado com metionina e/ou cisteína em excesso. As fracções de meios são recolhidas e clarificadas por centrifugação, tal como numa microcentrífuga. Adiciona-se tampão de lise contendo 1% NP-40, 0,5% desoxicolato (DOC) , Tris 20 mM, pH 7,5, EDTA 5 mM, EGTA 2 mM, PMSF 10 nM, 10 ng/ml de aprotinina, 10 ng/ml de leupeptina, e 10 de ng/ml pepstatina ao meio clarificado. Adiciona-se um anticorpo ao MIF e a seguir a incubação no frio, adiciona-se um segundo anticorpo precipitante ou 65 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ proteína de ligação a imunoglobulina, tal como proteína A-Sepharose® ou GammaBind™-Sepharose®, para mais incubação. Em paralelo, como controlo, é monitorizada uma proteína citosólica e em imunoprecipitações prefere-se um anticorpo para a proteína citosólica. Os imunocomplexos são peletizados e lavados com tampão de lise gelado. Os complexos são ainda lavados com tampão IP gelado (NaCl 0,15 M, Na-fosfato 10 mM, pH 7,2, 1% DOC, 1% NP-40, 0,1% SDS) . Os imunocomplexos são eluídos directamente em tampão de amostra de gel SDS e submetidos a electroforese de SDS-PAGE. O gel é processado para fluorografia, seco e exposto a película de raios X. Alternativamente as células são construídas por engenharia para produzirem um MIF que é marcado com um repórter de modo que a presença de um MIF activo possa ser detectada através da actividade substitutiva do repórter.
Sem nos querermos ligar a uma teoria, crê-se que os presentes inibidores funcionam por interacção directa como complexo de MIF produzido naturalmente, de forma a alterar suficientemente a conformação da proteína para bloquear a sua actividade biológica. Esta interacção pode ser mapeada por cristalografia de raios X dos co-cristais MIF-composto para determinar o sítio exacto da interacção. Um sítio localiza-se na bolsa que é responsável pela actividade de tautomerase de MIF.
Os ensaios de valiação para a exportação de inibidores de MIF variam de acordo com o tipo de inibidor e a natureza da actividade que está a ser afectada. Os ensaios podem ser realizados in vitro ou in vivo. Em geral, os ensaios in vitro são concebidos para avaliar a actividade de MIF, ou multimerização, e os ensaios in vivo são concebidos para avaliar a actividade de MIF, extracelular, e a localização intracelular num modelo celular ou sistema animal. Em qualquer dos ensaios, um aumento ou diminuição estatisticamente significativa quando comparado com um controlo adequado é indicativo de uma intensificação ou inibição.
Pode ser realizado ensaio in vitro por exame do efeito de um composto candidato sobre a capacidade do MIF inibir a migração dos macrófagos. Resumidamente, prefere-se monócitos 66 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ de sangue periférico humano como células indicadoras num sistema de ensaio da goticula de agarose essencialmente como descrevem Weiser et al., Cell. Immunol. 90:167-178, 1985 e Harrington et al., J. Immunol. 110:752-759, 1973. Podem também ser empregues outros sistemas de ensaio para análise da migração de macrófagos. Um tal ensaio é descrito por Hermanowski-Vosatka et al., Biochem. 38:12841-12849,1999.
Um ensaio in vitro alternativo é concebido para medir a capacidade do MIF catalisar a tautomerização do D-isómero de dopacromo (ver Rosengren et al., Mol. Med. 2:143-149, 1996; Winder et al., J. Cell Sei. 106:153-166, 1993; Aroca et al., Biochem. J. 277:393-397). Resumidamente, neste método, é proporcionado D-dopacromo a MIF na presença e ausência de um inibidor candidato e é monitorizada a capacidade de catalisar a tautomerização para ácido 5,6-di-hidroxiindole-2-carboxilico (DHICA). Contudo, pode ser preferida a utilização de ésteres metilicos de D-dopacromo por ser observada uma taxa de reacção mais rápida. A detecção da tautomerização pode ser realizada por qualquer uma de uma variedade de métodos Standard.
Num ensaio similar, pode ser testada a capacidade de MIF catalisar a tautomerização de fenilpiruvato (ver Johnson et al., Biochem. 38(48):16024-16033, 1999). Resumidamente, neste método, tipicamente a cetonização de fenilpiruvato ou (p-hidroxifenil)piruvato é seguida por espectroscopia. Além disso, a formação de produto pode ser verificada por tratamento destes compostos com MIF e conversão subsequente em malato para análise por 1H RMN.
Os ensaios in vivo podem ser realizados em células transfectadas quer transientemente quer estavelmente com um vector de expressão contendo uma molécula de ácido nucleico de MIF, tal como as aqui descritas. Preferem-se estas células para medir a actividade de MIF (e.g., modulação de apoptose, proliferação, etc.) ou a localização extracelular e intracelular na presença ou ausência de um composto candidato. Quando se ensaia relativamente à apoptose, pode ser empregue uma variedade celulares incluindo, por exemplo, coloração com corante e microscopia para examinar a fragmentação do ácido nucleico e a porosidade das células. 67 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Podem ser realizados outros ensaios em sistemas de modelo de células ou sistemas animais, proporcionando ao sistema uma forma de MIF recombinante ou que ocorra naturalmente ou induzindo a expressão endógena de MIF na presença ou ausência do composto teste, determinando assim um aumento ou diminuição estatisticamente significativos na patologia deste sistema. Por exemplo, pode ser empregue LPS para induzir uma resposta ao choque tóxico.
Os ensaios aqui resumidamente descritos podem ser empregues para identificar um inibidor que é especifico para MIF .
Em qualquer dos ensaios aqui descritos, uma célula teste pode expressar o MIF naturalmente (e.g., células THP-1) ou a seguir à introdução de uma molécula de DNA recombinante codificando a proteína. Os protocolos de transfecção e transformação são bem conhecidos na especialidade e incluem a transfecção mediada por Ca2P04, electroporação, infecção com um vector virai, transfecção mediada por DEAE-dextrano, e semelhantes. Como alternativa às proteínas que se descreveram acima, podem ser empregues proteínas MIF quiméricas (i.e., fusão de proteína MIF com outra proteína ou fragmento de proteína), ou sequências de proteína construídas por engenharia que não tenham uma sequência líder. De uma forma semelhante, pode ser construída uma fusão para dirigir a secreção, exportação, ou retenção citosólica. Qualquer e todas estas sequências podem ser empregues num constructo de fusão com MIF para auxiliar no ensaio de inibidores. A célula hospedeira pode também expressar MIF como resultado de estar doente, infectado com um vírus, e semelhantes. As proteínas segregadas que são exportadas em virtude de uma sequência líder são bem conhecidas e incluem, gonadatropina humana coriónica (hCGa), hormona do crescimento, factor de crescimento de hepatócito, transferrina, factor de crescimento dos nervos, factor de crescimento vascular endotelial, ovalbumina, e factor de crescimento do tipo insulina. Similarmente, as proteínas citosólicas são bem conhecidas e incluem, neomicina fosfotransferase, β-galactosidase, actina e outras proteínas citoesqueléticas, e enzimas, tais como proteína quinase A ou C. As proteínas 68 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ citosólicas ou segregadas mais úteis são aquelas que são facilmente medidas num ensaio conveniente, tal como ELISA. As três proteínas (sem líder, segregada e citosólica) podem ser co-expressas naturalmente, por co-transfecção nas células de teste, ou transfectado separadamente em células hospedeiras separadas. Acresce que, para os ensaios aqui descritos, as células podem ser transformadas estavelmente ou expressar a proteína transientemente. A imunoprecipitação é um desses ensaios que pode ser empregue para determinar a inibição. Resumidamente, células expressando MIF naturalmente ou de um construto vector introduzido são marcadas com 35S-metionina e/ou 35S-cisteína durante um breve período de tempo, tipicamente 15 minutos ou mais, em meio de cultura celular isento de metionina- e/ou cisteína. Depois da "marcação por impulso", as células são lavadas com meio suplementado com metionina e cisteína não marcadas em excesso, mais heparina se a proteína sem líder se liga a heparina. As células são então cultivadas no mesmo "meio de perseguição" durante vários períodos de tempo. Às culturas, adicionam-se inibidores ou intensificadores candidatos a várias concentrações. 0 sobrenadante da cultura é recolhido e clarificado. Os sobrenadantes são incubados com um anticorpo monoclonal ou com soro imune anti-MIF, ou com um anticorpo anti-marca ("anti-tag") se está presente uma marca peptídica, seguido de um reagente de desenvolvimento tal como Staphylococcus aureus Cowan estirpe I, proteína A-Sepharose®, ou Gamma-bind™ G-Sepharose®. Os imunocomplexos são peletizados por centrifugação, lavados num tampão contendo 1% de NP-40 e 0,5% de desoxicolato, EGTA, PMSF, aprotinina, leupeptina, e pepstatina. Os precipitados são então lavados num tampão contendo sódio fosfato pH 7,2, desoxicolato, NP-40, e SDS. Os imunocomplexos são eluídos num tampão de amostra gel de SDS e separadas por SDS-PAGE. O gel é processado por fluorografia, seco, e exposto a uma película de raios X.
Alternativamente, pode preferir-se ELISA para detectar e quantificar a quantidade de MIF em sobrenadantes celulares. Prefere-se ELISA para detecção em avaliação de alto desempenho. Resumidamente, placas de 96 poços são revestidas com um anticorpo anti-MIF ou anticorpo anti-marca, lavadas, e 69 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ bloqueadas com 2% de BSA. O sobrenadante celular é então adicionado aos poços. Depois da incubação e lavagem, é adicionado o segundo anticorpo (e.g., para MIF). 0 segundo anticorpo pode ser acoplado a uma etiqueta ("label") ou reagente de detecção, tal como uma enzima ou a biotina. Após incubação adicional, adiciona-se reagente de revelação e a quantidade de MIF é determinada usando um leitor de placas de ELISA. 0 reagente de revelação é um substrato para a enzima acoplada ao segundo anticorpo (tipicamente um anticorpo anti-isótipo) ou para a enzima acoplada a estreptavidina. Enzimas adequadas são bem conhecidas na especialidade e incluem peroxidase de rábano-silvestre, que actua sobre um substrato (e.g., ABTS) resultando numa reacção colorimétrica. Reconhece-se que em vez de se usar um segundo anticorpo acoplado a uma enzima, o anticorpo anti-MIF pode ser directamente acoplado à peroxidase de rábano-silvestre, ou a outro reagente de detecção equivalente. Se desejado, os sobrenadantes celulares podem ser concentrados para elevar o nivel de detecção. Além disso, métodos de detecção, tais como ELISA e semelhantes podem ser empregue para controlar os níveis de MIF intracelular bem como extracelular. Quando se pretendem níveis intracelulares, prefere-se um lisado celular. Quando se pretendem níveis extracelulares níveis, podem-se rastrear os meios. 0 ELISA pode também ser facilmente adaptado à avaliação de inibidores ou intensificadores candidatos múltiplos de elevado desempenho. Resumidamente, um tal ensaio é convenientemente baseado em células e realizado em placas de 96 poços. As células de teste que expressam MIF, naturalmente ou estavelmente, são colocadas a um nível suficiente para a detecção do produto expresso, como, cerca de 20000 células/poço. Contudo, se as células não expressam naturalmente a proteína, a expressão transiente é conseguida, tal como por electroporação ou transfecção mediada por Ca2P04· Para electroporação, 100 μΐ de uma mistura de células (e.g., 150000 células/ml) e vector de DNA (5 pg/ml) é dispensada em poços de uma placa de 96 poços. As células são electroporadas usando um aparelho com um eléctrodo de 96 poços (e.g., ECM 600 Electroporation System, BTX, Genetronics, Inc.). As condições óptimas para electroporação são determinadas experimentalmente para o tipo de célula 70 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ hospedeira particular. A voltagem, resistência, e duração do impulso ("pulse") são os parâmetros típicos a variar. Directrizes para a optimização da electroporação podem ser obtidas dos fabricantes ou encontradas em manuais de procedimentos, tais como Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. (ed.), Wiley Interscience, 1987). As células são diluídas com um volume igual de meio e incubadas durante 48 horas. A electroporação pode ser realizada em vários tipos de células, incluindo células de mamífero, células de levedura, bactérias, e semelhantes. Depois da incubação, é adicionado meio com ou sem inibidor e as células são incubadas adicionalmente durante 1-2 dias. Nesta altura, é colhido o colhido e a proteína é ensaiada por qualquer dos presentes ensaios. Preferivelmente, é empregue ELISA para detectar a proteína. É testada a concentração inicial de 50 μΜ. Se esta quantidade dá uma redução estatisticamente significativa da exportação ou redução de detecção de Ab monoclonal, o inibidor candidato é ainda testado numa resposta à dose.
Alternativamente, o sobrenadante concentrado pode ser submetido a electroforese num gel de SDS-PAGE e transferido para um suporte sólido, tal como nylon ou nitrocelulose. A MIF é então detectada por um imunofiltro ("immunoblot") (ver Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), usando um anticorpo para MIF contendo um grupo repórter isotópico ou não isotópico. Estes grupos repórteres incluem, não lhes estando limitados enzimas, co-factores, corantes, radioisótopos, moléculas luminescentes, moléculas fluorescentes, e biotina. Preferivelmente, o grupo repórter é 125I ou peroxidase de rábano-silvestre, que pode ser detectada por incubação com ácido 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina-sulfónico. Estes ensaios de detecção descritos acima são facilmente adaptados a serem utilizados se o MIF contiver uma marca peptídica. Nesses casos, o anticorpo liga-se à marca peptídica. Outros ensaios incluem cromatografia com base no tamanho ou carga, incluindo HPLC, e cromatografia de afinidade.
Alternativamente, pode ser empregue um bioensaio para quantificar a quantidade de MIF activo presente no meio celular. Por exemplo, a bioactividade do MIF pode ser medida 71 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ por um ensaio de migração de macrófago. Resumidamente, as células transfectadas com um vector de expressão contendo MIF são cultivadas durante aproximadamente 30 horas, tempo durante o qual é adicionado um intensificador ou inibidor candidato. Depois da incubação, as células são transferidas para meio com pouco soro para mais 16 horas de incubação. O meio é removido e clarificado por centrifugação. O tampão de lise contendo inibidores de protease é adicionado ao meio ou, na alternativa, as células são lisadas e são determinados os níveis internos como se segue. A bioactividade de MIF é então medida por ensaio de migração de macrófago, actividade de isomerase, ou a ensaio de proliferação. Um ensaio de proliferação é realizado por adição de várias quantidades do eluído a células 3T3 cultivadas quiescentes. ao meio é adicionada timidina tritiada e medem-se as contagens de precipitado de TCA aproximadamente 24 horas mais tarde. A redução do corante MTT vital é uma via alternativa para medir a proliferação. Para o padrão, pode ser empregue FGF-2 recombinante humana purificada. Outras funções podem ser ensaiadas noutros bioensaios apropriados disponíveis na especialidade, tais como choque tóxico induzido por CPS, choque tóxico induzido por TSST-1, artrite induzida por colagénio, etc.
Outros ensaios angiogénicos in vitro incluem bioensaios que medem a proliferação de células endoteliais em gel de colagénio (Goto et al., Lab Invest 69:508, 1993), co-cultura de células endoteliais dos capilares cerebrais em geles de colagénio separados por uma câmara das células que exportam a proteína MIF (Okamure et al., B.B.R.C. 186:1471, 1992; Abe et al., J. Clin. Invest. 92:54, 1993), ou um ensaio de migração celular (ver Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789,1995). 72 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Produção de Anticorpos 0 termo "anticorpo," como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir anticorpos policlonais, monoespecificos, e monoclonais, bem como fragmentos de ligação a antigénio destes anticorpos. Relativamente a um anticorpo anti-MIF/alvo das concretizações preferidas, o termo "antigénio" como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir um polipéptido factor inibitório de migração dos macrófagos ou um seu fragmento polipéptido, variante, ou funcional alvo. Um anticorpo anti-MIF/alvo, ou fragmento de ligação a antigénio desse anticorpo, pode ser characterizado como actividade de ligação específica ao polipéptido alvo ou a seu epítopo de pelo menos cerca de 1 x 105 M_1, geralmente pelo menos cerca de 1 x 106 M_1, e preferivelmente pelo menos cerca de 1 x 108 M”1. Os fragmentos Fab, F(ab'>2, Fd e Fv de um anticorpo anti-MIF/alvo, que retêm actividade de ligação específica para um epítopo polipéptido-específico de MIF/alvo, estão no âmbito das concretizações preferidas. Têm particular interesse os anticorpos que ligam polipéptidos activos e são deslocados na ligação de uma molécula pequena inibitória. As pessoas competentes na matéria facilmente compreenderão que esse deslocamento pode ser o resultado de uma alteração conformacional, alterando assim a natureza do epítopo, ligação competitiva como o epítopo ou exclusão estereoquímica do anticorpo do seu epítopo. Num exemplo, o sítio activo de uma enzima pode ser o epítopo para um anticorpo particular e na ligação de uma molécula pequena no ou próximo sítio activo, a imunorreactividade do anticorpo é perdida, permitindo assim a utilização da perda da imunorreactividade com um anticorpo como marcador indirecto relativamente à actividade enzimática.
Além disso, o termo "anticorpo" como aqui utilizado é um termo abrangente e é usado no seu sentido ordinário, incluindo, sem lhe estar limitado, para referir anticorpos que ocorrem naturalmente bem como anticorpos que não ocorrem naturalmente, incluindo, por exemplo, anticorpos de cadeia simples, anticorpos quiméricos, bifuncionais e humanizados, 73 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ bem como seus fragmentos de ligação a antigénio. Estes anticorpos que não ocorrem naturalmente podem ser construídos usando síntese peptídica em fase sólida, podem ser produzidos recombinantemente, ou podem ser obtidos, por exemplo, por rastreamento de bibliotecas combinatoriais incluindo cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis (Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)). Estes e outros métodos de fazer, por exemplo, anticorpos quiméricos, humanizados, CDR-enxertados, de cadeia simples, e bifuncionais são bem conhecidos na especialidade (Winter e Harris, Immunol. Today 14:243-246 (1993); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1992); Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed., Oxford Univ. Press (1995); Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach, IRL Press (1992)) .
Em certas concretizações preferidas, um anticorpo anti-MIF/alvo pode originado usando como imunogénio, por exemplo, um péptido isolado incluindo a região de sítio activo de MIF ou o polipéptido alvo, que pode ser preparado a partir de fontes naturais ou produzido recombinantemente, como se descreveu acima, ou um fragmento imunogénico de um polipéptido MIF/alvo (e.g., sequências imunogénicas incluindo 8-30 ou mais sequências de aminoácido) , incluindo péptidos sintéticos, como se descreveu acima. Uma porção de um péptido não imunogénico de um polipéptido MIF/alvo pode ser tornada imunogénica por acoplamento do hapteno a uma molécula transportadora tal como albumina de soro bovino (BSA) ou hemocianina de lapa (KLH), ou expressando a porção de péptido como uma proteína de fusão. Vários outras moléculas transportadoras e métodos para acoplamento de um hapteno a uma molécula transportadora são bem conhecidos na especialidade (Harlow e Lane, supra, 1992). Métodos para originar anticorpos policlonais, por exemplo, num coelho, cabra, ratinho, ou outro mamífero, são bem conhecidos na especialidade. Além disso, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos usando métodos que são bem conhecidos e rotina na especialidade (Harlow e Lane, supra, 1992) . Por exemplo, células de baço de um mamífero imunizado com polipéptido alvo podem ser fundidas a uma linha de 74 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ células de mieloma apropriada tal como células de mieloma SP/02 para produzir células de hibridoma. As linhas de células de hibridoma clonadas podem ser avaliadas usando polipéptido alvo marcado ou um seu fragmento funcional para identificar clones que segregam anticorpos monoclonais com o polipéptido alvo possuindo a desejada especificidade. Os hibridomas que expressam anticorpos monoclonais com o polipéptido alvo possuindo a desejada especificidade e afinidade podem ser isolados e utilizados como fonte continua dos anticorpos, que são úteis, por exemplo, para preparar kits standardizados. Similarmente, um fago recombinante que expressa, por exemplo, um polipéptido de cadeia simples anti-alvo também proporciona um anticorpo monoclonal que pode ser empregue para preparar kits standardizados.
Aplicações e Métodos que Utilizam Inibidores de MIF
Os inibidores de MIF têm uma variedade de usos de aplicáveis, como se notou acima. Inibidores candidatos de MIF podem ser isolados ou procurados numa variedade de fontes, tais como bactérias, fungos, plantas, parasitas, bibliotecas de produtos químicos (moléculas pequenas) , péptidos ou derivados de péptidos e semelhantes. Além disso, um perito na especialidade reconhecerá que a inibição ocorreu quando é observada uma variação estatisticamente significativa dos níveis do controlo.
Tendo em atenção os vários papéis de MIF em patologia e homeostase, a inibição da actividade de MIF ou localização extracelular de MIF pode ter um efeito terapêutico. Por exemplo, estudos recentes têm demonstrado que MIF é um mediador de endotoxemia, onde anticorpos anti-MIF protegeram completamente ratinhos de letalidade induzida por LPS. Ver Bemhagen et al., Nature 365:756-759, 1993; Calandra et al., J. Exp. Med. 179:1895-1902, 1994; Bemhagen et al., Trends
Microbial. 2:198-201, 1994. Além disso, os anticorpos anti- MIF aumentaram marcadamente a sobrevivência em ratinhos provocados com bactérias gram-positivas que induzem choque séptico. Bemhagen et al., J. Mol. Med. 76:151-161, 1998. Outros estudos têm demonstrado o papel de MIF no crescimento de células tumorais e que a inibição anti-sentido de MIF conduz a resistência a estímulos apoptóticos. Takahashi et 75 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ al., Mol. Med. 4:707-714, 1998; Takahashi et al., Microbiol.
Immuno/. 43(1):61-67,1999. Além disso, a descoberta de que MIF é um contra-regulador da acção dos glucocorticóides indica que métodos de inibição da localização de MIF extracelular podem permitir o tratamento de uma variedade de condições patológicas, incluindo autoimunidade, inflamação, endotoxemia, e síndrome da dificuldade respiratória do adulto, doença inflamatória do intestino, otite média, doença inflamatória das articulações e doença de Crohn. Bemhagen et al., J. Mol. Med. 76:151-161, 1998; Calandra et al., Nature 377:68-71, 1995; Donnelly et al., Nat. Med. 3:320-323, 1997.
Porque também é reconhecido que MIF é angiogénico, a inibição desta citoquina pode ter actividade anti-angiogénico e particular utilidade doenças angiogénicas que incluem, não lhes estando limitados, cancro, retinopatia diabética, psoriase, angiopatias, fertilidade, obesidade e doenças genéticas da disfunção glucocorticóide tal como doença de Cushings e de Addisons.
Os inibidores de actividade ou exportação de MIF podem ser empregues terapeuticamente e também utilizados em conjunção com uma porção alvejante que ligue um receptor de superfície celular específico para células particulares. A administração de inibidores ou intensificadores segue geralmente protocolos estabelecidos. As composições das concretizações preferidas podem ser formuladas para o modo de administração indicado, incluindo por exemplo, para administração oral, nasal, venosa, intracranial, intraperitoneal, subcutânea, ou intramuscular. Noutras concretizações, as composições aqui descritas podem ser administradas como parte de um implante de libertação sustida. Ainda noutras concretizações, as composições das concretizações preferidas podem ser formuladas como liofilizado, utilizando excipientes apropriados que proporcionem estabilidade enquanto liofilizado, e depois da re-hidratação.
Noutra concretização, são proporcionadas composições farmacêuticas contendo um ou mais inibidores de MIF. Tendo em vista a administração, os compostos das concretizações preferidas podem ser formulados em composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas das concretizações preferidas 76 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ compreendem um ou mais inibidores de MIF de concretizações preferidas (i.e., um composto de estrutura (Ia) ou (Ib)) e um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. 0 inibidor de MIF está presente numa composição numa quantidade que é eficaz para tratar um distúrbio particular, isto é, numa quantidade suficiente para alcançar níveis de MIF ou actividade, sintomas diminuídos, e/ou preferivelmente com toxicidade aceitável para o paciente. Preferivelmente, as composições farmacêuticas das concretizações preferidas podem incluir um inibidor de MIF numa quantidade de menos do que cerca de 0,01 mg a mais do que cerca de 1000 mg por dosagem dependendo da via de administração, preferivelmente de cerca de 0, 025 , o, 05 , o , 075, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, O ΟΊ , o, 6, 0,7, O 00 > ou 0,9 mg a cerca de 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ,100, 125, 1 50, 175 , : 200, 225, 250 , 300, 350, 375, 400 , 425, 450, 500, 600 , 700, 80 0, ou 900 mg, e mais ; preferivelmente de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, ou 25 mg a cerca de 30 r 35, 40, 45, 50, 55 , ou 60 mg. Em algumas concretizações, contudo, podem ser preferidas dosagens inferiores ou superiores às mencionadas acima. Concentrações e dosagens apropriadas podem ser facilmente determinadas por um perito na especialidade.
Veículos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis são familiares para os peritos na especialidade. Para composições formuladas em soluções líquidas, veículos e/ou diluentes aceitáveis incluem solução salina e água esterilizada, e podem opcionalmente incluir antioxidantes, tampões, agentes bacteriostáticos, e outros aditivos comuns. As composições também podem ser formuladas em pílulas, cápsulas, grânulos, ou comprimidos que contêm, além de um inibidor de MIF, diluentes, agentes dispersantes e tensio-activos, ligantes, e lubrificantes. Um perito nesta especialidade pode ainda formular o inibidor de MIF de uma maneira apropriada, e de acordo com práticas aceites, tais como as descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1990.
Relativamente aos estereo-isómeros, os compostos de estruturas (Ia) e (Ib) podem ter centros quirais e podem ocorrer como racematos, misturas racémicas e como enantiómeros ou diastereómeros individuais. Todas estas 77 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ formas isoméricas estão incluídas nas concretizações preferidas, incluindo suas misturas. Acresce que, algumas das formas cristalinas dos compostos de estruturas (Ia) e (Ib) podem existir como polimorfos, que são incluídos nas concretizações preferidas. Além disso, alguns dos compostos de estruturas (Ia) e (Ib) podem também formar solvatos com água ou outros solventes orgânicos. Estes solvatos estão similarmente incluídos no âmbito das concretizações preferidas.
Os compostos e composições do invento podem ser utilizados num método para tratar uma variedade de distúrbios ou doenças, incluindo doenças inflamatórias, artrite, distúrbios imuno-relaccionados, e semelhantes. Estes métodos incluem administrar um composto das concretizações preferidas a um animal de sangue quente numa quantidade suficiente para tratar o distúrbio ou doença. Estes métodos incluem a administração sistémica de um inibidor de MIF das concretizações preferidas, preferivelmente sob a forma de uma composição farmacêutica. Como aqui utilizado, administração sistémica inclui métodos de administração oral e parentérica. Para administração oral, composições farmacêuticas adequadas de um inibidor de MIF incluem pós, grânulos, pílulas, comprimidos, e cápsulas bem como líquidos, xaropes, suspensões, e emulsões. Estas composições podem também incluir aromatizantes, conservantes, agentes de suspensão, espessantes e emulsionantes, e outros aditivos farmaceuticamente aceitáveis. For administração parentérica, os compostos das concretizações preferidas podem ser preparados em soluções aquosas para injecção que podem conter, além do inibidor de actividade e/ou exportação de MIF, tampões, antioxidantes, agentes bacteriostáticos, e outros aditivos comummente empregues nestas soluções.
Como se mencionou acima, a administração de um composto das concretizações preferidas pode ser empregue para tratar uma grande variedade de distúrbios ou doenças. Em particular, os compostos das concretizações preferidas podem ser administrados a um animal de sangue quente para o tratamento de inflamação, cancro, imuno-distúrbios imunitários, e semelhantes. 78 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Os compostos que inibem MIF podem ser utilizados em terapias de combinação com outros compostos farmacêuticos. Em concretizações preferidas, o composto que inibe MIF está presente em combinação com fármacos convencionais usados para tratar doenças ou condições onde MIF é patogénico ou onde MIF desempenha um papel fundamental ou outro papel num processo de doença. Em concretizações particularmente preferidas, são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo um ou mais compostos que inibem MIF, incluindo, sem lhes estar limitados compostos de estruturas (la) ou (lb), em combinação com um ou mais compostos farmacêuticos adicionais, incluindo, sem lhes estar limitados fármacos para o tratamento de vários cancros, asma ou outras doenças respiratórias, sepsia, artrite, doença inflamatória do intestino (IBD), ou outras doenças inflamatórias, distúrbios imunitários, ou outras doenças ou distúrbios onde MIF é patogénico.
Em concretizações particularmente preferidas, um ou mais compostos que inibem MIF estão presentes em combinação com um ou mais fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSAIDs) ou outros compostos farmacêuticos para tratar artrite ou outras doenças inflamatórias. Os compostos preferidos incluem, não lhes estando limitados, celecoxib; rofecoxib; NSAIDS, por exemplo, aspirina, celecoxib, tri-salicilato de colina e magnésio, diclofenac de potássio, diclofenac de sódio, diflunisal, etodolac, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolac, ácido melenâmico, nabumetona, naproxeno, naproxeno de sódio, oxaprozina, piroxicam, rofecoxib, salsalato, sulindac, e tolmetina; e corticoesteróides, por exemplo, cortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona, prednisolona, betametesona, dipropionato de beclometasona, budesonida, fosfato de dexametasona e sódio, flunisolida, propionato de fluticasona, acetonido de triamcinolona, betametasona, fluocinolona, fluocinonido, dipropionato de betametasona, valerato de betametasona, desonido, desoximetasona, fluocinolona, triamcinolona, acetonido de triamcinolona, propionato de clobetasol, e dexametasona.
Em concretizações particularmente preferidas, um ou mais compostos que inibem MIF estão presentes em combinação com um ou mais beta-estimulantes, corticoesteróides de inalação, 79 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ anti-histaminas, hormonas, ou outros compostos farmacêuticos para tratar asma, dificuldade respiratória aguda, ou outras doenças respiratórias. Os compostos preferidos incluem, não lhes estando limitados, beta-estimulantes, por exemplo, broncodilatadores comummente prescritos; corticoesteróides de inalação, por exemplo, beclometasona, fluticasona, triamcinolona, mometasona, e formas de prednisona tais como prednisona, prednisolona, e metilprednisolona; anti-histaminas, por exemplo, azatadina, carbinoxamina/pseudoefedrina, cetirizina, cipro-heptadina, dexclorfeniramina, fexofenadina, loratadina, prometazina, tripelenamina, bromfeniramina, colofeniramina, clemastina, difenidramina; e hormonas, por exemplo, epinefrina.
Em concretizações particularmente preferidas, um ou mais compostos que inibem MIF estão presentes em combinação com compostos farmacêuticos para tratar IBD, tais como azatioprina ou corticoesteróides, numa composição farmacêutica.
Em concretizações particularmente preferidas, um ou mais compostos que inibem MIF estão presentes em combinação com compostos farmacêuticos para tratar cancro, tais como paclitaxel, numa composição farmacêutica.
Em concretizações particularmente preferidas, um ou mais compostos que inibem MIF estão presentes em combinação com compostos imunosupresores numa composição farmacêutica. Em concretizações particularmente preferidas, um ou mais compostos que inibem MIF estão presentes em combinação com um ou mais fármacos para tratar um distúrbio auto-imune, por exemplo, doença de Lyme, Lupus (e.g., Lupus Eritematoso Sistémico (SLE)), ou Sindrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA). Estes fármacos podem incluir inibidores de protease, por exemplo, indinavir, amprenavir, saquinavir, lopinavir, ritonavir, e nelfinavir; inibidores nucleósidos da transcriptase inversa, por exemplo, zidovudina, abacavir, lamivudina, idanosina, zalcitabina, e stavudina; inibidores nucleótidos da transcriptase inversa, por exemplo, tenofovir disoproxil fumarato; inibidores não nucleósidos da transcriptase inversa, por exemplo, delavirdina, efavirenz, e nevirapina; modificadores da resposta biológica, por exemplo, 80 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ etanercept, infliximab, e outros compostos que inibem ou interferem com factor necrosante tumoral; antivirais, por exemplo, amivudina e zidovudina.
Em concretizações particularmente preferidas, um ou mais compostos que inibem MIF estão presentes em combinação com compostos farmacêuticos para tratar sepsia, tais como esteróides ou agentes anti-infecciosos. Exemplos de esteróides incluem corticoesteróides, por exemplo, cortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona, prednisolona, betametesona, dipropionato de beclometasona, budesonida, fosfato de dexametasona e sódio, flunisolida, propionato de fluticasona, acetonido de triamcinolona, betametasona, fluocinolona, fluocinonida, dipropionato de betametasona, valerato de betametasona, desonida, desoximetasona, fluocinolona, triamcinolona, acetonido de triamcinolona, propionato de clobetasol, e dexametasona. Exemplos de agentes anti-infecciosos incluem anti-helmínticos (mebendazol), antibióticos incluindo aminoglicosideos (gentamicina, neomicina, tobramicina), antibióticos antifúngicos (anfotericina b, fluconazol, griseofulvina, itraconazol, cetoconazol, nistatina, micatina, tolnaftato), cefalosporinas (cefaclor, cefazolina, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona, cefuroxima, cefalexina), antibióticos beta-lactama (cefotetano, meropenem), cloranfenicol, macrólidos (azitromicina, claritromicina, eritromicina), penicilinas (penicilina G, dicloxacilina, tetraciclinas saquinavir, zidovudina; sulfonamidas (dapsona) ; sal de sódio, amoxicilina, ampicilina, nafcilina, piperacilina, ticarcilina), (doxiciclina, minociclina, tetraciclina), bacitracina; clindamicina; colistimetato de sódio; sulfato de polimixina b; vancomicina; antivirais incluindo aciclovir, amantadina, didanosina, efavirenz, foscamet, ganciclovir, indinavir, lamivudina, nelfinavir, ritonavir, estavudina, valaciclovir, valganciclovir, quinolonas (ciprofloxacina, levofloxacina); (sulfadiazina, sulfisoxazol); sulfonas furazolidona; metronidazol; pentamidina; sulfanilamidum crystallinum; gatifloxacina; e sulfametoxazoltrimetoprim.
No tratamento de certas doenças, pode ser benéfico tratar o paciente com um inibidor de MIF em combinação com um anestético, por exemplo, etanol, bupivacaina, cloroprocaína, 81 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ levobupivacaína, lidocaína, mepivacaína, procaína, ropivacaína, tetracaína, desflurano, isoflurano, cetamina, propofol, sevoflurano, codeína, fentanilo, hidromorfona, marcaína, meperidina, metadona, morfina, oxicodona, remifentanilo, sufentanilo, butorfanol, nalbufina, tramadol, benzocaína, dibucaína, cloreto de etilo, xilocaína, e fnazopiridina.
EXEMPLOS
Os inibidores de MIF das ser preparados pelos método Exemplo 2 apresenta um ensai das concretizações preferida: actividade ou exportação.Exemplo 1 concretizações preferidas podem 3 descritos no Exemplo 1. 0 i para avaliação dos compostos ; relativamente à inibição da Síntese de Compostos Representativos
O OH
Uma solução de nitroacetato de etilo (6,70 ml, 60,1 mmol) em N,N-dimetilacetamida (35 ml) foi tratada com NaH a 95% (1,52 g, 60,2 mmol) em porções. Depois da libertação de hidrogénio cessar, a mistura reaccional foi aquecida a 80°C durante 15 minutos. Uma solução de anidrido N-metilisatóico 1 (11,1 g, 62,5 mmol) em N, N-dimetilacetamida (65 ml) foi adicionada ao longo de um período de 15 minutos, após o que a reacção foi aquecida a 120°C durante 18 horas. O solvente foi removido por destilação, o resíduo foi dissolvido em água, e acidificado com HC1 6 N. 0 precipitado resultante foi recolhido e lavado com água. A recristalização do resíduo remanescente em CH2Cl2/éter deu a quinolona 2a (5,75 g, 43%) sob a forma de um sólido amarelo. 82 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
ΟΗ Ο
OEt
Uma solução de malonato de dietilo (18,8 ml, 111 mmol) em N,N-dimetilacetamida (35 ml) foi tratada com NaH a 95% (2,80 g, 111 mmol) em porções. Depois da libertação de hidrogénio cessar, a mistura reaccional foi aquecida a 80°C durante 15 minutos. Uma solução de anidrido N-metilisatóico 1 (22,0 g, 124 mmol) em N, N-dimetilacetamida (140 ml) foi adicionada ao longo de um período de 15 minutos, após o que a reacção foi aquecida a 120°C durante 18 horas. O solvente foi removido por destilação, o resíduo foi dissolvido em água, e acidificado com HC1 6 N. O precipitado resultante foi recolhido e lavado com água. A recristalização do resíduo remanescente em CH2Cl2/éter deu a quinolina 2b (11,7 g, 40%) sob a forma de um sólido branco.
OH
Cl
3a Y = N02 3b Y = C02Et 2a Y = N02 2b Y = C02Et
Dissolveu-se álcool 2 (6,2g 2a; 11,1 2b) em POCI3 (70mL para 2a; 140mL para 2b) e a solução foi aquecida a 95°C durante três horas. O POCI3 foi removido por destilação e a mistura reaccional foi vertida em 500mL de água gelada. A solução aquosa foi neutralizada usando NaHCCh saturado, o precipitado foi recolhido por filtração, redissolvido em cloreto de metileno, seco sobre Na2S04 e o solvente foi removido in vacuo. 0 produto reaccional em bruto foi purificado por recristalização em éter etílico proporcionando 3,5g de 3a (52%) ou 7,8g de 3b (65%). 83 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ H 1 N R4 i T* | ^ΪΓ 1 ti Boc Boc 1 H 4 5a R4 = CO(2-tienilo) 6a R4 — CO(2-tienilo) 5bR4 = CO(fenilo) 6b R4 = CO (fenilo) 6c R4 = CO(2-furanilo)
Dissolveu-se N-BOC piperazina 4 (5,0g; 27mmol) em piridina (15mL) e adicionaram-se 20mg de DMAP. Adicionou-se ácido clorídrico puro a uma solução a 0-5°C lentamente ao longo de um período de 5 minutos. A pasta espessa resultante foi agitada durante a noite (15 horas) à temperatura ambiente antes de ser vertida sobre gelo. 0 precipitado branco cristalino foi recolhido por filtração, seco ao ar e seco in vacuo para dar a correspondente N-BOC-N-Acil piperazina 5a (6,5g; 83%) ou 5b (4,8g; 94%). 0 produto reaccional em bruto foi imediatamente empregue no passo seguinte dissolvendo o composto em lOOmL de cloreto de metileno e adicionando TFA puro (lOmL). Após 3 horas à temperatura ambiente, a solução foi evaporada, o resíduo dissolvido em cloreto de metileno e lavado com NaHCCq (saturado). A camada aquosa foi extractada 10 vezes com cloreto de metileno, a camada orgânica combinada foi seca sobre Na2S04 e o solvente foi evaporado in vacuo proporcionando o composto 6a (4,5g; 91%; 75% em dois passos) ou o composto 6b (2,95g; 70%; 66% em dois passos), ou o composto 6c, tal como está comercialmente disponível em Lancaster Synthesis (catálogo no. 18698). ?4 84 ΕΡ 1 389 110/ΡΤΝ
N *
3a Υ = NC^ 6a R4 = CO (2-tien ilo) 3b Y = C02Et 6b R4 = CO(fenilo) 6c R4 = CO (2-furanilo) 7a Y - N02, R4 = CO (2-tienilo) 7b Y = N02s R4 = CO (fen ilo) 7c Y = CC^Et, R4 = COi (2-tien ilo) 7d Y = C02Et, R4 = CO (fenilo) 7e Y = NO2, R4 = CO (2-furanilo) A uma solução de cloroquinolona 3 em tolueno foi adicionada piperazina 6 seguindo-se 10 gotas de piridina antes de se aquecer a 100°C durante 12 a 14 horas. A mistura foi arrefecida à temperatura ambiente, evaporada até à secura, redissolvida em cloreto de metileno e lavada com salmoura. O solvente orgânico foi seco sobre Na2SC>4 e removido in vacuo. A cromatografia (sílica, CHCI3 : MeOH 85 : 15) proporcionou o produto CBX 7, conjuntamente com material de partida recuperado (30-40%). Rendimentos de produto para a reacção são proporcionados no Quadro 1.
Quadro 1 N-Acil Piperazina Cloroquinolona Aducto CBX Piperazina Quinolona 6a l,9g 3a 1, 8g 7a 0, 9g 28% 6a l,6g 3b 1,5g 7b 0, 9g 34% 6b 2,6g 3a 2,5g 7c 1,3g 32% 6b 2, 7g 3b 2,4g 7d 1 r 5g 35% 6c 2, 7g 3a 3,2g 7e 2, 8g 55% 85 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Dados analíticos 7a. pf 167-159°C; ΤΗ RMN (CDC13, 300 MHz) δ 7,95 (dd, 1H), 7,70 (dt, 1H), 7,49 (d, 1H), 7,44 (d, 1H) 7,35 (m, 2H),
7,08 (m, 1H) , 3,95 (bs, 4H) , 3,75 (s, 3H) , 3,3 (t, 4H); HRMS (FAB) calculado para Ci9H1904N4S 399,1127, encontrado 399,1117; Anal, Calculado para Ci9H18N404S: C, 57, 28; H, 4,55; N, 14,06; O, 16,06; S, 8,05 Encontrado: C, 56,78; H, 4,50; N, 13,73. 7b. pf 215-217°C; ΤΗ RMN (CDC13, 300 MHz) δ 7,85 (dd, 1H), 7,70 (m, 1H), 7,44 (m, 5H), 7,42 (m, 1H), 3,74 (m, 4H), 3,28 (m, 4H) ; HRMS (FAB) calculado para C2iH2iN404 393, 1563, encontrado 393, 1540; Anal, Calculado para C2iH2oN404; C, 64, 28; H, 5,14; N, 14,28; O, 16,31 Encontrado; C, 64,84; H, 5,16; N, 13,78. 7c. pf 183-185°C; ΤΗ RMN (CDC13, 300 MHz) δ 7,95 (dd, 1H), 7,61 (m, 1H), 7,48 (m, 1H) , 7,38 (d, 1H) 7,32(m, 1H) , 7,25 (Μ, 1H), 7,07 (Μ, 1H), 4,44 (q, 2H) 3,95 (bs, 4H), 3,70 (s, 3H) 3,35 (bs, 4H) , 1,44 (t, 3H) ; HRMS (FAB) calculado para C22H24N304S, 426, 1488 encontrado 426, 1487; Anal, Calculado para C22H23N304S: C, 62,10; H, 5,45; N, 9,88; O, 15,04; S, 7,54 Encontrado: C, 62,08; H, 5,45; N, 9,77. 7d. pf 164-166°C; ΤΗ RMN (CDC13, 300 MHz) δ 7.92 (dd, 1H), 7,60 (m, 1H), 7,44 (m, 5H), 7,37 (m, 1H), 7,27 (m, 1H), 4,45 (q, 2H), 3,65 (bs, 7H) , 3,20 (bs, 4H) , 1,45 (t, 3H) ; HRMS (FAB) calculado para C24H26N03, 420, 1923, encontrado 420,1934; Anal, Calculado para C24H25N304; C, 69, 72; H, 6,01; N, 10,02; 0, 15,26 Encontrado: C, 66,32; H, 6,01; N, 9,66. 7e. pf 189-191 °C; ΤΗ RMN (CDC13, 300 MHz) δ 7,96 (dd, 1H), 7,71 (dt, 1H), 7,51 (bd, 1H) , 7,44 (bd, 1H) , 7,37 (bt, 1H), 7,09 (d, 1H), 6,51 (m, 1H), 4,03 (bm, 4H), 3,74 (s, 3H), 3,33 (t, 4H) ; HRMS (FAB) calculado para CigH^N^s 383,1355, encontrado 383, 1358; Anal, Calculado para Ci9H18N405 : C, 59,68; H, 4,74; N, 14,65 Encontrado: C, 59,39, H, 4,79, N, 14,36. 86 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Exemplo 2
Ensaio de Migração de Macrófagos A migração de macrófagos é medida usando o ensaio de goticulas de agarose e método capilar tal como descrito por Harrington e Stastny et al. , J. Immunol. 110 (3):752-759, 1973. Resumidamente, amostras contendo macrófagos são adicionadas a tubos para hematócrito, com 75 mm de comprimento e com um diâmetro interior de 1,2 mm. Os tubos são selados a calor e centrifugados a 100 x G durante 3 minutos, cortados na interface célula-fluido e embebidos numa gota de gordura de silicone em câmaras de cultura de Sykes-Moore. As câmaras de cultura contêm ou uma proteína de controlo (BSA) ou amostras. As áreas de migração são determinadas após 24 e 48 horas de incubação a 37°C traçando uma imagem projectada dos leques de macrófagos e medindo as áreas da migração por planimetria.
Alternativamente, cada poço de uma placa com 96 poços é pré-revestida com um microlitro de agarose liquida SeaPlaque a 0,8% (p/v) em água dispensada no meio de cada poço. A placa é em seguida suavemente aquecida numa caixa leve até que as gotas de agarose estejam secas. Adicionam-se, aos poços da placa pré-revestida, dois microlitros de suspensões celulares contendo macrófagos de até 25% (v/v) em meios (com ou sem MIF ou outros controlos), contendo 0,2% de agarose (p/v) e aquecidos a 37°C, e arrefece-se a 4°C durante 5 min. Cada poço é em seguida cheio com meios e incubado a 37°C sob 5% de CO2 -95% de ar durante 48 h. A migração das goticulas de agarose é medida a 24 e 48h determinando a distância a borda da gotícula à periferia da migração.
Ensaio de migração
As actividades inibitórias de migração de monócitos de MIF recombinante murino e humano do tipo selvagem e murino mutante são analisadas por utilização de células mononucleares de sangue periférico humano ou células mononucleares esgotadas em células T num formato modificado de câmara de Boyden. Os monócitos marcados com calceina AM são suspensos a 2,5 a 5 x 106/mL em meio RPMI 1640, com 87 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ L-glutamina (sem vermelho de fenol) e 0,1 mg/mL de albumina de soro humano ou albumina de soro bovino. Uma alíquota (200 pL) de suspensão celular é adicionada a poços de uma placa de cultura de 96 poços de fundo em U (Costar, Cambridge, MA) pré-aquecida a 37°C MIF em RPMI 1640 é adicionado à suspensão celular para originar concentrações finais de 1, 10, 100, e 1000 ng/mL. A placa de cultura é colocada na câmara de um leitor de placas a temperatura controlada, misturada durante 30 s, e incubada a 37°C durante 10-20 min. Durante a incubação, 28 pL de pré-aquecida proteína quimiotáctica de monócitos 1 humana (MCP-1; Pepro Tech., Inc., Rocky Hill, NJ) a 10 ou 25 ng/mL ou RPMI 1640 com 0,1 mg/mL de HSA são adicionados ao fundo do poço de uma placa ChemoTX (Neuro Probe Inc., Gaithersburg, MD; diâmetro do poço de 3 mm, tamanho de poro do filtro de 5 pM) . A placa de filtração é cuidadosamente adicionada à placa base. As suspensões celulares tratadas são removidas da incubadora e são adicionados 30 pL a cada poço da placa de filtração. A placa reunida é incubada durante 90 min. a 37°C numa câmara humidificada com 5% de CO2. Depois da incubação, a suspensão celular é aspirada da superfície do filtro e o filtro é subsequentemente removido da placa base e lavado três vezes por adição de 50 pL de IX HBSS- a cada segmento de filtro. Entre lavagens, é empregue um rodo (NeuroProbe) para remover HBSS- residual. 0 filtro é seco ao ar e em seguida lido directamente no leitor de placas fluorescente, com excitação a 485 nm e emissão a 535 nm. Os índices de migração aleatória ou quimiotáctica são definidos como fluorescência média ligada ao filtro para um dado conjunto de poços dividido pela fluorescência média dos filtros nos poços não contendo MCP-1 nem MIF. A titulação das células marcadas fluorescentemente revelou que os níveis de fluorescência detectados neste ensaio têm uma relação linear com o número de células (não apresentado).
Exemplo 3
Ensaio de Tautomerase A reacção de tautomerização é realizada essencialmente como descrevem Rosengren et al., Mol. Med. 2 (1):143-149, 1996. A conversão de D-dopacromo em ácido 5,6-di- 88 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ hidroxiindole-2-carboxílico é avaliada. São preparadas tinas de 1 ml de amostra contendo substrato 0,42 mM e 1,4 pg de MIF numa solução de amostra contendo EDTA 0,1 mM e tampão de fosfato de sódio 10 mM, pH 6,0 e a taxa de diminuição na absorvância de iminocromo é seguida a 475 nm. É empregue L-dopacromo como controlo. Além disso, os produtos reaccionais podem ser seguidos usando uma HPLC, utilizando uma fase móvel incluindo tampão de KH2P04 20 mM (pH 4,0) e 15% de metanol com um caudal de 1,2 ml/min. A detecção fluorimétrica é seguida a 295/345 nm.
Alternativamente, a reacção de tautomerização utilizando fenilpiruvato ou (p-hidroxifenil)piruvato é realizada essencialmente como descrevem Johnson et al., Biochem. 38:16024-16033, 1999. Nesta versão, a cetonização de
fenilpiruvato é monitorizada a 288 nm (ε= 17300 M”1 cm-1) e a cetonização de (p-hidroxifenil)piruvato é monitorizada a 300 nm (ε= 21600 M”1 cm”1). A mistura de ensaio contém tampão de Na2HP04 50 mM (1 mL, pH 6,5) e uma alíquota de uma solução de MIF suficientemente diluída (0,5 -1,0 pL de uma solução 2,3 mg/mL, concentração final de 93-186 nM) para originar uma taxa de revestimento inicial. O ensaio é iniciado pela adição de uma pequena quantidade (1-3,3 pL) de ou fenilpiruvato ou (p-hidroxifenil)piruvato de soluções caldo reconstituídas em etanol. As formas cristalinas de fenilpiruvato e (p-hidroxi-fenil)piruvato existem exclusivamente como isómeros enol (Larsen et al., Acta Chem. Scand. B 28:92-96, 1974). A concentração de substrato pode variar entre 10 e 150 M, sem inibição significativa da actividade de MIF por etanol observada a menos de 0,5% v/v.
Exemplo 4
Imunoprecipitação e Análise Western Blot
Foram concebidas experiências de cultura de células para caracterizar a actividade de compostos candidatos, a expressão de MIF, o tráfico, e a exportação. São preparadas fracções de células e meio condicionado para imunoprecipitação essencialmente como se descreveu anteriormente (Florkiewicz et al., Growth Factors 4:265-275, 1991; Florkiewicz et al., Ann. N.Y. Acad. Scl. 638:109-126) 89 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ com excepção de terem sido adicionados 400 μΐ de tampão de lise (1% NP-40, 0,5% desoxicolato, Tris 20 mM pH 7,5, EDTA 5 mM, EGTA 2 mM, fluoreto de f enilmetilsuf onilo 0,01 mM, 10 ng/ml de aprotinina, 10 ng/ml de leupeptina, 10 ng/ml de peptstatina) à fracção de meio após clarificação por centrifugação numa microcentrifuga durante 15 minutos. As células ou fracções de meio são incubadas com anticorpos monoclonais ou policlonais para MIF e adicionou-se GammaBind™ G Sepharose® (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden) para uma incubação adicional de 30 minutos. Os imunocomplexos são sedimentados por centrifugação em microcentrifuga, lavados três vezes com tampão de lise, e quatro vezes com tampão de lavagem de imunoprecipitação, gelado (NaCl 0,15M, Na-fosfato 0,01 M pH 7,2, 1% desoxicolato, 1% NP-40, 0,1% dodecilsulfato de sódio). Os imunocomplexos são dissociados directamente em tampão de amostra em gel SDS Tris 125 mM, pH 6,8, 4% SDS, 10% glicerol, 0, 004% azul de bromofenol, EGTA2 mM, e separadas por SDS-PAGE 12%. 0 gel é processado para fluorografia, seco, e exposto a uma película de raios X a -70°C. Quando a neomicina fosfotransferase imunoprecipitou, empregou-se um anticorpo anti-NPT de coelho (5Prime-3Prime, Boulder, CO).
Para análise por Western blot, as proteínas são transferidas do gel 12% SDS-PAGE para uma membrana de nitrocelulose (tamanho de poro 0,45 pm em tampão frio contendo ácido 3-[dimetil(hidroximetil)metilamino]-2- hidroxipropano-sulfónico 25 mM, pH 9,5, metanol 20% durante 90 minutos a 0,4 amps. Para análise Western blotting, de meios celulares condicionados, os meios foram centrifugados (10 minutos a 800 g) e os sobrenadantes concentrados 10 vezes por filtração em membrana (lOkDa cut-off, Centricon-10 Amicon). As amostras foram então resolvidas em gel Tris-glicina 16% SDS (Novex, San Diego, CA) sob condição redutora e transferidas para membrana de nitrocelulose (Novex) a 20V durante 3 horas. A membrana foi incubada com anticorpos policlonais anti-rato de coelho (1:1000) (Torrey Pines Biolab, San Diego, CA), e em seguida com conjugado de peroxidase rábano silvestre (1 : 1000) (Pierce, Rockford, IL) . O MIF foi visualizado por revelação com cloronaftol/H202 · O MIF recombinante (2 ng, adquirido a R&D systems, Minneapolis) foi submetido a electroforese e transferido como padrão. As 90 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ membranas são bloqueadas em Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NaN3 5 mM, polioxietileno-monolaurato de sorbitano 0,35%, e leite magro em pó 5% (Carnation Co., Los Angeles, CA) durante 1 hr à temperatura ambiente. As membranas são incubadas com um anticorpo monoclonal (Catalog Number MAB289, adquirido a R&D Systems, Minneapolis, MN) ou policlonal (soro policlonal de cabra, R&D Systems cat#AF-289-PB). Depois da incubação, as membranas são lavadas à temperatura ambiente com 10 mudanças de tampão contendo NaCl 150 mM, fosfato de sódio 500 mM pH 7,4, NaN3 5 mM, e polioxietileno-monolaurato de sorbitano 0,05%. Quando se usam anticorpos monoclonais, as membranas são em seguida incubadas tampão de bloqueio contendo IgG antiratinho de coelho 1 pg/ml (H+L, affinipure, Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Para a análise policlonal, a incubação empregou anti-cabra de coelho (Sigma, Catalog Number G5518). As membranas são subsequentemente lavadas em 1 L de tampão descrito acima, e incubadas durantel hr em 100 ml de tampão de bloqueio contendo 15 pCi 125I-proteínas A (ICN Biochemicals, Costa Mesa, CA), e lavadas com 1 L de tampão. 0 radio-sinal é visualizado por autorradiografia.
Numa experiência, meios condicionados durante a noite foram recolhidos de células THP-1 tratadas com LPS (10 pg/ml) e também tratadas com quantidades variáveis de compostos candidatos, tais como composto 7e e analisados por imunoprecipitação com anticorpos monoclonais ou policlonais para detectar ligação de MIF. Como demonstrado na Figura 1, os meios condicionados mostram uma perda significativa de MIF detectável usando anticorpo monoclonal na presença de 10 μΜ do composto 7e que não foi observada com o anticorpo policlonal. Esta resposta espelha os efeitos do composto 7e sobre a actividade enzimática de MIF. Deste modo, esta experiência demonstra que a reactividade monoclonal pode actuar como um marcador indirecto relativamente à actividade enzimática.
Noutra experiência (Figura 2), concentrações variáveis de cinco análogos de inibidor diferentes foram adicionados a células THP-1 estimuladas por LPS e deixados incubar durante a noite. No dia seguinte, avaliou-se por ELISA a quantidade de MIF imunoreactivo detectada. O composto 7e inibiu a 91 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ capacidade do anticorpo reconhecer MIF de uma forma dependente da dose com uma ED50 de 2 μΜ, similar à resposta obtida com análogos composto 7b e composto 7d. Em contraste, os análogos composto 7a e composto 7c foram quase 100 vezes mais activos.
Numa outra experiência (Figura 3), foi determinada a capacidade do composto 7e diminuir a imunorreactividade de MIF produzido por células THP-1. Foram tratadas células THP-1 com 10 pg/ml de LPS e foram adicionados 10 μΜ do composto 7e em vários momentos post-estimulação com LPS e a imunorreactividade foi monitorizada com um monoclonal anti-MIF. Como mostrado, Depois da adição de composto 7e a imunorreactividade é rapidamente perdida. Assim, esta experiência mede a actividade dos compostos ou dos controlos apenas com tampão na detecção de MIF quando os compostos são inicialmente adicionados em vários momentos a culturas celulares e depois as correspondentes amostras em meios condicionados são de uma forma dependente do tempo em seguida.
Na experiência anterior (Figura 3), foi analisada a capacidade do composto 7e modular a ligação de anticorpo à proteína MIF, na presença de células THP1 estimuladas por LPS. Contudo, na experiência apresentada na Figura 4, foi examinada a capacidade do composto 7e modular o reconhecimento de MIF pelo anticorpo usando meios pré-condicionados, na ausência de células vivas. Nesta experiência, adicionou-se LPS a células THP1 em cultura como se descreve acima. Seis horas depois, o meio condicionado foi removido, clarificado de detritos celulares e determinou-se que a quantidade de MIF era de 22 ng/ml. Este meio pré-condicionado foi então dividido em dois grupos. Ambos os grupos foram incubados a 37° C durante períodos de tempo variáveis, antes de ser adicionado composto 7e ou apenas tampão (controlo) para uma incubação adicional de 30 minutos a 37° C. O nível de MIF detectável foi então determinado por ELISA usando anticorpo monoclonal anti-MIF para detecção. A perda rápida de sinal ELISA especifico de MIF é dependente da presença de composto 7e. Os níveis de controlo de MIF não se alteram. Deste modo, esta experiência demonstra que o composto 7e interage com MIF, e bloqueia a capacidade do 92 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ anticorpo interagir subsequentemente com MIF, mesmo na ausência de células. Como esta interacção ocorre no sitio catalítico, ou constrange a actividade catalítica, a perda de imunorreactividade correlaciona-se com a actividade enzimática e/ou actividades associadas a MIF perdidas.
Exemplo 5
Ensaio de Localização Extracelular
De modo a avaliar ainda a actividade in vitro do composto 7e para modular a exportação de MIF, foram seleccionadas células RAW 264.7 de macrófagos de ratinho (American Type Culture Collection, Manassas, VA).
Macrófagos Raw 264.7 (3xl06 células por poço) foram colocados em placas de cultura de tecidos de 12 poços (Costar) e cultivados em RPM1/1% soro de bovino fetal (FBS) inactivado pelo calor (Hyclone Laboratories, Logan, UT). Após três horas de incubação a 37°C numa atmosfera humidificada com 5% CO2, foram removidas células não aderentes e os poços foram lavados duas vezes com RPM1/1% FBS. As células foram em seguida incubadas durante 24 horas com LPS (0111:B4) ou TSST-1 (Toxin Technology, Sarasota, FL), que tinham uma pureza de aproximadamente 95% e ressuspensas em água isenta de pirogénio, a uma concentração variando entre 1 pg/ml e 1000 ng/ml (experiência para a resposta à dose). Para experiências no decurso do tempo, meios condicionados de culturas paralelas foram removidos a intervalos de 0,5, 1, 2, 4, 8 e 24 horas após estimulação com 1 ng/ml TSST-1 ou LPS. Para estudos de inibição, foram incubadas células RAW 264.7 (3xl06
células por poço) durante 24 horas com lng/ml de LPS (0111 :B4) ou 1 ng/ml de TSST-1 na presença de composto 7e 0,01 M a 10 M ou tampão (como controlo). 0 MIF em meios celulares condicionados foi concentrado em filtros e 0 MIF remanescente nas amostras foi analisado por Western blotting e as densidades de MIF nas bandas foram também medidas por Stratagene Eagle Eye™.
As células RAW podem ser induzidas a expressar MIF por adição quer de 1 ng/ml TSST-1 quer de LPS e ser cultivadas durante 24 horas. O MIF em meios condicionados foi medido 93 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ como se descreveu acima. Como demonstrado na Figura 5, o composto 7e reduziu os níveis immunodetectáveis de MIF em meios condicionados de uma maneira dependente da concentração com um IC5o de aproximadamente a 0,04 μΜ, quando comparado com células incubadas apenas com tampão. O nível de MIF detectado na presença do composto 7e a seguir à estimulação com TSST-1 de células RAW é ilustrado na Figura 6, com um IC50 de aproximadamente 0,3 μΜ quando comparado com células incubadas apenas com tampão.
Exemplo 6
Cultura de Células, Transfecção, e Marcação Metabólica
As células alvo obtidas da American Type Culture Collection (ATCC No. CRL 1650) são cultivadas durante a noite numa placa de 48 poços em DMEM suplementado com 10% de soro de bovino fetal, L-glutamina2 mM, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais 100 nM, e gentamicina 50 pg/ml. As células alvo são então transfectadas com 2 pg/ml de CsCl-ADN de plasmídeo purificado em tampão de transfecção (NaCl 140 mM, KC1 3 mM, CaCl2l mM, MgCl2 0,5 mM, Na2HP04 0,9 mM, Tris 25 mM, pH 7,4. A cada poço, adicionam-se 300 μΐ do DNA em tampão de transfecção. As células são incubadas durante 30 minutos a 37°C, e o tampão é aspirado. Adiciona-se meio suplementado quente com 100 pm cloroquina durante 1,5 hr. Este meio é removido e as células são lavadas duas vezes com meio completo. As células são em seguida incubadas durante 40-48 hr. O plasmídeo de interesse é co-transfectado com pMAMneo (Clontech, Paio Alto, CA), que contém o marcador seleccionável neomicina-fosfotransferase. Quando são co-transf ectados 2 pg do plasmídeo de interesse com 10 pg de pMAMneo, mais do que 70% das células transfectadas expressam tanto MIF como neo, como determinado por microscopia de imunofluorescência.
Para ensaios de imunoprecipitação as células alvo são metabolicamente marcadas por impulso ("pulse-labeled") durante 15 minutos com 100 pCi de 35S-metionina e 35S-cisteína (Trans 35S-marca, ICN Biomedicals, Irvine, CA) em 1 ml de DMEM isento de metionina e cisteína. A seguir à marcação, as monocamadas celulares são lavadas uma vez com DMEM 94 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ suplementado com cisteína e metionina em excesso (10 mM) não marcadas durante 1-2 minutos. As células são então cultivadas em 2 ml deste meio durante os intervalos de tempo indicados e os sobrenadantes celulares são imunoprecipitados para determinação da presença de proteína sem líder. Para as culturas indicadas, o "meio de perseguição" ("chase médium") é suplementado com modulador às concentrações indicadas.
Alternativamente, para análise por ELISA, as células alvo são lavadas uma vez com 250 μΐ de carbonato de sódio 0,1 M, pH 11,4, durante 1 a 2 minutos e imediatamente aspiradas. Alternativamente pode ser preferida uma solução salina elevada. As células são lavadas com meios contendo 0,5% FBS mais 25 pg/ml de heparina e em seguida as células são incubadas no mesmo meio durante os intervalos de tempo indicados. Para as culturas indicadas, o "meio de perseguição" é suplementado com um modulador. Para células transfectadas com vector codificando uma proteína contendo uma sequência líder, tais como hCG-α ou qualquer outra proteína de ligação não heparínica, a lavagem com carbonato e o meio contendo heparina podem ser omitidos.
Exemplo 7
Ensaio de Avaliação de Alto Desempenho para Inibidores de MIF um O ensaio de avaliação de alto desempenho para inibidores de MIF é realizado num formato de 96 poços usando MIF produzido por células THP-1 e é realizado como se segue. Os ensaios de MIF são realizados por ELISA como indicado acima. As células THP-1 são ressuspensas a aprox. 5 x 106 células/ml em meio RPMI contendo 20 pg/ml de LPS bacteriano e as células são incubadas durante 18-20 horas. Subsequentemente, o sobrenadante celular é recolhido e incubado com inibidores putativos. Resumidamente, uma placa, placa de ELISA com 96 poços (Costar Number 3590) é revestida com um anticorpo monoclonal para MIF (R&D Systems Catalog Number MAB289) a uma concentração de 4yg/ml durante duas horas a 37°C. Sobrenadante da cultura não diluído é adicionado à placa de ELISA para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente. Os poços são então lavados, adiciona-se 95 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ anticorpo policlonal biotinilado para MIF (R&D Systems #AF-289-PB) seguindo-se a estreptavidina-HRP e um substrato cromogénico. A quantidade de MIF é calculada por interpolação de uma curva padrão de MIF.
Exemplo 8
Análise por HPLC dos Inibidores Candidatos em Soro
Antes de avaliar os efeitos de qualquer molécula pequena in vivo, é desejável ser-se capaz de detectar, de um modo quantitativo, o composto num fluido corporal como o sangue. Foi estabelecido um método analítico para primeiro detectar reprodutivelmente compostos de teste, tais como inibidores de MIF incluindo composto 7e, e depois medir a sua concentração em fluido biológico. A RP-HPLC foi realizada com uma unidade Hewlett-Packard Model HP-1100 usando Symmetry Shield RP-8 (4,6 x 75 mm id, Waters, Milford, MA). A fase móvel era uma solução isocrática de acetonitrilo 35% /água contendo ácido trifluoroacético 0,1%. A absorvância foi monitorizada a 235 nm. Para calcular a quantidade de composto teste no soro, as proteínas do soro da amostra foram primeiro separadas usando 50% acetonitrilo (4°C durante a noite) seguindo-se a centrifugação a 14000 rpm durante 30 minutos. O sobrenadante foi depois analisado pela RP-HPLC e a concentração do composto calculada com base numa curva de calibração de padrão conhecido. De acordo com este procedimento, foi empregue HPLC de fase inversa para detectar composto 7e num intervalo linear de 1,5-800 ng (R2=l) usando amostras de teste fortificadas (não apresentadas). Quando a técnica analítica anterior é aplicada a soro de sangue de animais que receberam composto 7e (0,4mg/20 gramas de ratinho), as concentrações do composto 7e em circulação são medidas quantitativamente.
Com o desenvolvimento dos métodos anteriores para quantificar composto 7e, é possível avaliar a eficácia de diferentes vias de administração do composto e caracterizar a bioactividade. Para testar a biodisponibilidade no soro dependente do tempo T, os animais foram tratados com composto 96 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 7e por injecção intraperitoneal (i.p.) (Figura 7A) , e oralmente por gavagem (Figura 7B).
Exemplo 9
Inibição In Vivo de MIF A finalidade das experiências in vivo que se seguem foi confirmar os resultados do ensaio in vitro inicial usando o composto 7e para inibir MIF. A toxicidade induzida por LPS parece estar relacionada com uma sobreprodução de MIF bem como TNF-α e IL-1 β. Uma vez que os animais podem estar protegidos do choque por endotoxina por neutralização ou inibição desses mediadores de inflamação. 0 presente modelo foi escolhido porque proporciona modelos reprodutíveis e de letalidade rápida de sepsia e choque séptico.
Antes de cada experiência fizeram-se doses frescas de lipopolissacárido (LPS). 0 LPS (Escherichia Coli 0111:B4, Sigma) foi reconstituído por adição de TEA a 0,5% (1 ml USP água + 5 ml Trietilamina (Pierce) ) num frasco de 5 mg endotoxina. Uma vez reconstituída, a solução foi incubada a 37°C durante 30 minutos. Subsequentemente, a solução foi submetida a sonicação num sonicador de banho a 56-60°C durante 30 segundos 3 vezes. A seguir à sonicação, a mistura foi submetida a vórtex continuamente durante 3 minutos. A solução caldo de LPS estava então pronta a usar.
Detecção de IL-Ιβ e TNF-ot e MIF em sangue
Dez ratinhos fêmea BALB/c com 10 semanas de idade (20 ±2 gramas) (Charles River Laboratories, Kingston, NY) foram alojados num grupo de 5 por gaiola com acesso livre a alimentos e água e foram climatizados durante pelo menos uma semana antes da experimentação. No dia da experiência, os ratinhos foram pesados e foram distribuídos aleatoriamente em grupos de 10 animais de igual peso corporal médio. Os ratinhos foram injectados i.p. com 200 pL de composto 7e formulado ou apenas tampão imediatamente antes da injecção i.p. de LPS (Escherichia coli 0111:B4, 10 mg/kg ou 5 mg/kg de peso corporal) e -D-galactosamina (50 mg/kg de peso corporal). Cada dose de LPS (0,2 ml por 20 gramas de ratinho) 97 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ foi administrada intraperitonealmente e misturada com uma concentração final de -D-galactosamina de 50 mg por ml. Após recolha de amostras de sangue colhidas por punção cardíaca, o animal foi sacrificado. Realizaram-se colheitas típicas a 4 horas pós tratamento com LPS. O soro foi separado num separador de soro (Microtainer(R) Becton Dickinson,
Minneapolis, NJ) de acordo com o protocolo do fabricante. O I1-1 e TNF- soro de ratinho foram medidos por ELISA usando um estojo "mouse IL 1β immunoassay or mouse TNF-α, immunoassay" (R&D System Minneapolis, MN), seguindo as indicações do fabricante. As concentrações de MIF no soro, em soro de ratinho, foram quantificadas por um ELISA em sanduíche (ChemiKine MIF Kit, Chemicon, San Diego, CA) . As amostras foram analisadas em duplicado, e calculou-se a média dos resultados.
Modelo LPS Murino
Dez ratinhos fêmea BALB/c com 8 alO semanas de idade (20 ±2 gramas) foram alojados e climatizados como se descreveu acima. No dia das experiências, os ratinhos foram pesados e foram distribuídos aleatoriamente em grupos de 5 animais de igual peso corporal médio. Os ratinhos foram injectados com 200 1 de composto 7e formulado ou seu Tampão (média 20 mg/kg de composto) a seguir a injecção i.p. de LPS (E. Coli 055B5, Sigma) (40, 10, 5, 2 ou 0,5 mg/kg peso corporal) e 50 mg/kg de -D-galactosamina. Os ratinhos foram observados a cada duas horas durante as primeiras 18 horas e duas vezes ao dia durante sete dias. Para estes estudos empregaram-se métodos de estimativa de Kaplan-Meier para avaliar a sobrevivência dos animais.
Para todos os estudos in vivo, foram realizadas comparações estatísticas padrão entre os grupos de tratamento usando o teste de Fisher para dados categorizados e o tese de Mantel-Cox para variáveis contínuas. Para determinar se os níveis de soro IL-1 se correlacionam com MIF no soro, foi aplicado um teste de Fisher. As análises foram realizadas usando Stat View 5.0 Software (Abacus Concepts, Berkeley, CA) . Todos os valores p reportados que eram duplos ("two-sided") e que tinham um valor inferior a 0,05 foram considerados indicativos de significância estatística. 98 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Foi conduzida uma experiência de controlo inicial para determinar os niveis da linha de base do MIF endógeno no sistema do modelo murino (ratinho fêmea Balb/c), e ainda para determinar a taxa e extensão do aumento em MIF endógeno a seguir ao tratamento com LPS (10 mg/kg). Ratinhos Balb/c fêmea foram tratados com LPS (Sigma 0111:B1) misturado com β-D-galactosamina 50 mg/kg. O nivel de MIF em soro foi medido por HPLC como se descreveu acima 0, 2, 5 e 6 horas depois do tratamento com LPS/galactosamina. No começo desta experiência representativa, o nivel da linha de base do MIF endógeno era de aproximadamente 45 ng/ml. Contudo, no decurso desta experiência de seis horas, houve um aumento dependente do tempo no nivel de MIF detectada nas amostras de soro colhidas. Quando os ratinhos foram tratados com composto 7e (formulado em solução aguosa 50%) e lOmg/kg de LPS houve um abaixamento significativo no nivel de MIF circulante (p=0,05) gue podia ser detectado. Na experiência apresentada na Figura 9A, ratinhos BALB/c (n=20) foram injectados i.p. com 20 mg/kg peso corporal do composto 7e no momento da administração de LPS. Foram colhidas amostras de sangue 5,5 horas depois. Os resultados demonstram que os animais tratados com o inibidor têm uma capacidade diminuída de responder a LPS e são detectados niveis de MIF mais baixos. Num outro estudo, em que se administraram aos ratinhos metade da dosagem de LPS (5 mg/kg), determinou-se o MIF no soro quatro horas depois do tratamento. Estes dados revelam um diminuição em MIF estatisticamente muito significativa (p=0,0003) 60% (Figura 9B). Numa outra experiência, tanto MIF como IL-Ιβ foram medidos em soro de ratinho via ELISA. Como mostrado na Figura 10, existe uma correlação entre os dois directa e muito significante. Esta correlação também foi observada entre MIF e TNF-α (dados não apresentados). Numa similar experiência, foram observadas reduções do nivel de IL-Ιβ no soro e do nivel de TNF-α no soro depois da administração de 20mg/kg de composto 7e (Figura 11).
Estudos de choque tóxico experimental induzido por LPS têm revelado um papel central para MIF e TNF-α. O facto de LPS estimular células do tipo macrófago a produzir MIF, que por sua vez induz secreção de TNF-α secreção células do tipo macrófago sugere um papel potencial para MIF na patogénese de LPS. Para testar se o composto 7e pode prevenir o choque por 99 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ LPS, foi empregue um modelo de choque letal mediado por LPS em ratinhos BALB/c sensibilizados com β-D-galactosamina. 0 tratamento com composto 7e ao tempo da injecção de uma dose letal de LPS (2, 5 e 10 mg/kg) aumentou a sobrevivência de 6% para 47% (p=0,0004) (Figura 12). Os efeitos são modulados pela concentração de LPS empregue, demonstrando que quando se utiliza uma concentração mais elevada de LPS, o efeito composto 7e é saturável e portanto especifico. O Quadro 2 é um sumário de várias experiências de sobrevivência (um total de 210 ratinhos), que indica que o composto 7e protege ratinhos de tóxico choque induzido por LPS de uma forma dependente da concentração. A Figura 13 também representa estes dados de uma forma gráfica com 25% de tempo de sobrevivência no eixo da esquerda.
Quadro 2
Dosagem de LPS 75% de Morte dos Animais (horas) (mg/kg) Veiculo Composto 7e 40 10,2 11,6 10 9,9 18,0 5 10, 0 32,0 2 10,2 >100 0,5 22,0 >100 O > 1—1 >100 >100 MIF Ultrapassa os efeitos do composto 7e O MIF recombinante humano exógeno quando administrado com composto 7e, pode reverter os efeitos benéficos do composto, suportando a hipótese de o composto 7e actuar no sentido de aumentar a resistência do animal a LPS modulando os niveis de MIF no soro dos ratinhos. Neste exemplo, os ratinhos foram tratados com o protocolo Standard de LPS com excepção de além de lmg/kg de LPS e 20mg/kg do composto inibidor 7e, alguns animais terem também recebido 300 yg/kg de MIF recombinante humano. Às 12 horas, significativamente mais (p<0,01) ratinhos sobrevivem ao LPS com composto 7e, mas 100 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ esta sobrevivência é neutralizada pela administração de MIF (dados não apresentados).
Exemplo 10
Inibidor de MIF num Modelo de Artrite Induzida por Colagénio
Vinte ratinhos DBA/ILacJ, com 10-12 semanas de idade, foram imunizados no dia 0 na base da cauda com colagénio de bovino tipo II (CII 100 g) emulsionado em adjuvante completo de Freund (FCA; GibcoBRL) . No dia 7, a segunda dose de colagénio foi administrada pela mesma via (emulsionada em adjuvante incompleto de Freund). No dia 14, os ratinhos foram injectados subcutaneamente com 100 mg de LPS (055:B5). No dia 70, os ratinhos foram injectados intraperitonealmente com 40 g de LPS (0111:B4). Os grupos foram divididos de acordo com a espessura da pata, que foi medida com um compasso, após randomização, para criar um grupo inicial equilibrado. Aos ratinhos foi dado composto em tampão nos dias 71, 72, 73, e 74 (oito doses no total a 0,4 mg/dose, aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal). Os ratinhos foram em seguida examinados, relativamente à espessura da pata, no dia 74, por dois observadores. A Figura 14 estabelece o cronograma da experiência. Nesta experiência, os ratinhos que cederam (declínio no desenvolvimento completo da artrite) foram tratados com uma injecção i.p. final de LPS no dia 70, para estimular a produção de citoquina bem como a inflamação aguda. A Figura 15 demonstra que os ratinhos tratados com composto 7e desenvolvem um edema da pata ligeiramente reduzido (1,87 mm) quando comparados com os controlos tratados apenas com veículo (1,99 mm), p <0,05. Neste último ponto temporal, os animais no grupo dos tratados não atingiram uma expressão de desenvolvimento completo da artrite induzida por colagénio quando comparados com os seus controlos (dados não apresentados).
Noutra experiência, quinze ratinhos DBA/1J, com 10-12 semanas de idade foram imunizados no dia 0 na base da cauda com colagénio de bovino tipo II (CII 100 g) , emulsionado em adjuvante completo de Freunds (FCA; GibcoBRL). No dia 21, a segunda dose de colagénio foi administrada pela mesma via, 101 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ emulsionada em adjuvante incompleto de Freunds. No dia 28, os ratinhos foram injectados subcutaneamente com 100 pg de LPS (055:B5). No dia 71, os ratinhos foram injectados i.p. com 40 g de LPS (0111 :B4) . Os grupos e o protocolo de tratamento foram os mesmos descritos acima. No dia 74, foram recolhidas amostras de sangue e mediram-se as citoquinas. A Figura 16 indica que o composto 7e reduziu os níveis de MIF no soro quando comparado com amostras de CIA não tratadas. Foi detectada uma inibição mesmo mais significativa dos níveis de TNF-α no soro.
Exemplo 11
Os seguintes inibidores de MIF foram preparados pelos métodos descritos no Exemplo 1. Cada um destes inibidores de MIF pertence à classe de compostos de estrutura (la) descrita acima, e incorpora a porção que se segue:
Os resultados dos ensaios de tautomerase indicaram que cada um dos compostos inibidores de MIF exibiu significativa inibição de actividade de MIF. 102 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 13
103 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 17 Composto 19
Composto 15
CHj
Composto 20
Composto 22 Composto 24
104 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 21
Composto 26
105 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 37
106 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 41
Composto 44 Composto 46
Composto 48
Composto 45
107 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 50
Composto 52
Composto 54
Composto 51
Composto 56
Composto 58
Composto 60
108 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 57
Composto 59
Composto 61
Composto 62
Composto 64
Composto 66
Composto 63
Composto 67
109 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 70 Composto 72
Composto 68
ι CH,
Composto 69
CH, HjU CHj
Composto 71
Composto 73
Composto 87
110 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 88
Composto 90
Composto 91
111 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 97 112 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 105
Composto 108
Composto 107
Composto 108
113 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 109
Composto 110 Composto 112 Composto 114
114 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 113
Composto 115
Composto 116 Composto 118
Composto 120
115 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 117
Composto 121
CH3
Composto 122 Composto 124
Composto 126
! CH3 116 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 123
Composto 128
Composto 130
Composto 132
117 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 129
Composto 131
Composto 133
Composto 134 Composto 138
Composto 138
118 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 135 Composto 137
Composto 139
CHj
Composto 140
Composto 142
Composto 144
119 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 141
Composto 143
Composto 145
Composto 148 Composto 150
120 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto Ϊ47
Composto 154 Composto 156
121 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 153
Composto 155
Composto 157
hjc' CH,
Composto 158
CH3
Composto 160
Composto 162
HjC CHj 122 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
123 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 165
Composto 167
Composto 169
124 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 170
ΗΡ (Η
Composto 172
Composto 174
Composto 171
Composto 173
Composto 175
CH, 125 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 176
Composto 178
Composto 180
Composto 177
Composto 179
Composto 181
126 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 182 Composto 184
Composto 186
KjCT ^CHj
Composto 185
Composto 187
127 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 188 Composto 190
Composto 192
Composto 189
128 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 194
Composto 196
Composto 198
HP" 'CH,
Composto 195
Composto 197
Composto 199
CH* 129 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 200
Composto 202 Composto 204
Composto 201
130 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 206
Composto 208 Composto 210
131 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 213 Composto 215 Composto 217
132 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 218
Composto 220 Composto 222
Composto 223
133 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 228
134 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 230
Composto 232
Composto 234
Composto 233
Composto 235
135 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
136 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 243
Composto 245
Composto 247
137 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 248
Composto 249
Composto 250
Composto 251
Composto 252
138 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 254 Composto 256 Composto 258
Composto 259
139 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 260
I CHj
Composto 261
Composto 263
Composto 265
140 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 266
Composto 268
Composto 270
Composto 267
141 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 272 Composto 274 Composto 276
Composto 275
142 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 278 Composto 280
Composto 282
Composto 283
i CH* 143 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 286
Composto 284
Ν.
Composto 288
Composto 289
144 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
145 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 297
Composto 299
Composto 301
Composto 302 Composto 304
Composto 306
146 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 303
Composto 308 Composto 310
147 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 314
Composto 316
Composto 318
148 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 320
Composto 319
149 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 321
Composto 325
Composto 326
Exemplo 12
Os resultados dos ensaios de tautomerase indicaram que os seguintes compostos do Exemplo 11 exibiram níveis particularmente elevados de inibição de actividade de MIF. 150 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Quadro 3
Classificaçao Composto EC5 0 Tautomerase (mM) THP- 1/MIF Estrutura 1 34 0,01 <0,008 γΟ Oo d 2 126 0,01 <0,008 °γΟ Oo 1 CH, 3 164 0,01 yO 0. "35X·· \ ,-N HSC CHj 151 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
152 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
153 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
154 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
155 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
156 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
157 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Exemplo 13
Foram preparados os seguintes inibidores de MIF. Cada um destes inibidores de MIF pertence à classe de compostos possuindo a estrutura (Ib) descrita acima:
onde Ri, R2, R3, R4. X, Y, Z e n sao definidos como para a estrutura (Ib) acima. Os resultados dos ensaios de 158 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ tautomerase indicaram que cada um dos compostos inibidores de MIF exibiu inibição significativa de actividade de MIF.
Composto 327 Composto 329 Composto 331
Composto 328
159 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto 333
Κ,ο' VcHj
Composto 335
Composto 337
Composto 334
HjC
Composto 336
Composto 338
160 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Composto 339 Composto 341 Composto 343
Composto 340
1 CH,
Exemplo 14
Inibidores de MIF de certas concretizações podem ser preparados de acordo com os esquemas reaccionais que se seguem, Esquema 5 e Esquema 6. Cada um destes inibidores de MIF pertence à classe de compostos de estrutura (la) descrita acima.
Esquema Reaccional 5
Neste esquema, o anidrido isatóico é feito reaqir com malonato de dietilo numa solução de NaH em N,N-dimetil-acetamida. 0 intermediário resultante (designado por "1M00") é em seguida clorado por reacção com POCI3 para originar um 161 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ intermediário (designado por "1M00(C12)") . O 1M00(C12) é em seguida feito reagir com NH4OAC em ácido acético para originar um intermediário (designado por "1M00(C1)"). 0 IM00(C1) é em seguida feito reagir com uma N-acilpiperazina em DMF. 0 grupo acilo do composto piperazina inclui como um substituinte (designado por "R3") ou um grupo furanilo ou um grupo tienilo, como ilustrado no Esquema 5, ou outros grupos, como enumerados nos exemplos subsequentes. 0 intermediário resultante é em seguida feito reagir com um composto de halogéneo. 0 substituinte ligado ao átomo de halogéneo (designado por "R4"), pode incluir vários grupos, como enumerados nos exemplos subsequentes. 0 composto resultante tem a estrutura (la) descrita acima. Os passos neste esquema reaccional são descritos em detalhe, abaixo. Os compostos preparados de acordo com o Esquema 5 são referidos abaixo por números de referência contendo um "M" e incorporam uma porção -COOEt.
Esquema Reaccional 6
Neste esquema, 4-hidroxi-2(1H)-quinolona é feita reagir com uma mistura de ácidos nítrico e acético. 0 intermediário resultante é em seguida clorado por reacção com POCI3 para originar outro intermediário. Esse intermediário é em seguida feito reagir com uma N-acilpiperazina em DMF. 0 grupo acilo do composto piperazina inclui como um substituinte um grupo R3 tal como referido na descrição do Esquema 5. 0 intermediário resultante é em seguida feito reagir com um composto de halogéneo incluindo como um substituinte um grupo 162 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ R4 tal como referido na descrição do Esquema 5. 0 composto resultante tem a estrutura (la) descrita acima. Os passos neste esquema Reaccional são descritos abaixo, em detalhe. Os compostos preparados de acordo com o Esquema 6 são referidos abaixo por números de referência contendo um "N" e incorporam uma porção -N02 · OH I OH I 0 m ci 0 HN03 Γ*τ 'N"0~ TOa» IU H 5-0 HOAc" H TEBAC. CHjCN 1 N noh
ot O^R3 n R4-Hig ò ÇSj DMF CÇt H íu NaH, NMP cút lí. 1 'V "0 R4 R3= 0 -*> Vários inibidores de MIF pertencentes R1R2R3R4 à classe de compostos possuindo a acordo com o Esquema uma lista estrutura I(a) foram preparados de 5 ou com o Esquema 6. 0 Quadro 4 proporciona uma lista de números de referência para os compostos preparados. A designação "1M1##" indica que o composto foi preparado pelo Esquema 5, e incorpora uma porção -COOEt e uma porção furano como R3. a designação "1M2##" indica que o composto foi preparado pelo Esquema 5, e incorpora uma porção -COOEt e uma porção tiofeno como R3. A designação "INI##" indica que o composto foi preparado pelo Esquema 6, e incorpora uma porção -N02 e uma porção furanilo como R3. A designação "1 N2##" indica que o composto foi preparado pelo Esquema 6, e incorpora uma porção -N02 e uma porção tiofeno como R3. Os dois dígitos no final de uma designação identificam o grupo R4 do composto. 163 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Quadro 4
Halogéneo -R4 M(COOEt) N(NQ2) 1M1 (Furano) 1M2 (Tiofeno) INI (Furano) 1N2 (Tiofeno) 06 1M106 1 M2 0 6 INI 0 6 1 N206 07 1M107 1M2 0 7 INI 0 7 1N207 08 ;-L·* 1M108 1M2 0 8 INI 0 8 1N208 09 D"» 10 1M110 1M210 INI 10 1N210 11 cv 1M111(1) 1M211(1) INI11(1) 1N211(1) 12 CX-^Br 1M112 1M212 INI 12 1N212 13 O-'0 1M113 1M213 INI 13 1N213 14 1M114 1M214 INI 14 1N214 15 'X^‘ 1M115 1M215 INI 15 1N215 16 1M116 1M216 INI 16 1N216 17 CV'6' o 1M117 1M217 INI 1 7 1N217 164 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Halogéneo -R4 M(COOEt) N(N02) 1M1 (Furano) 1M2 (Tiofeno) INI (Furano) 1N2 (Tiofeno) 18 oy 1M118 1M218 INI 18 1N218 19 1 Ml 19 1 M219 INI19 *HC1 1 N219 20 <y 1M120 1M220 INI 2 0 1N220 22 cr* 1M122 1M222 1N122 1N222 Ο grupo R4 halogenado "09" é divulgado em MARCHAS ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, Reactions, Mechanisms, and Structure, 5a Ed., Michael B. Smith e Jerry March, Eds., A Wiley-Interscience Publication, John Wiley & Sons, Inc., p. 437 (2001) . Para preparar inibidores de MIF incorporando esta porção, são usados Esquemas Reaccionais ligeiramente diferentes, os Esquemas 7 e 8.
Esquema Reaccional 7
+ch2=ch~ch2
ch2=ch-ch2-y
Esquema Reaccional 8
165 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Vários inibidores de MIF pertencentes à classe de compostos possuindo a estrutura I(a) foram preparados de acordo com o Esquema 9 ou o Esquema 10.
Esquema Reaccional 9
Esquema Reaccional 10
R2= COOEt, N02
CFjCOOH 166 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Ο Quadro 5 proporciona uma lista de números de referência para os compostos preparados. A designação "1M##1" indica gue o composto foi preparado pelo Esguema 9, e incorpora uma porção —COOEt. A designação "1M##2 indica gue o composto foi preparado pelo Esguema 9, e incorpora uma porção —N02 · A designação "1N##1" indica que o composto foi preparado pelo Esguema 10, e incorpora uma porção -COOEt. A designação "1N##2" indica gue o composto foi preparado pelo Esguema 10, e incorpora uma porção -N02. Os dois dígitos a seguir à letra M ou N correspondem ao número gue identifica a porção R3.
Quadro 5 # R3 R3 1M##1 (COOEt) 1N##1 (N02) 1 07 ςκ 1M071*HC1 1N071*HC1 2 08 1M0 81 1N081 3 09 ÇhÍ o 0 1M091 1N091 4 10 cw N H ° 1M101 INI 01 5 11 Oy 0 1M111(2) INI11(2) 6 12 1M121 INI 21 7 13 Ου 0 1M131 1N131 8 14 1M141 INI 41 167 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ # R3 R3 1Μ##1 (COOEt) 1N##1 (N02) 9 15 k ην—r V 1Μ151*HC1 INI51*HC1 10 16 "CK 1Μ161 INI 61 11 17 1Μ171 INI 71 12 18 1Μ181 INI 81 13 19 1Μ191*HC1 INI 91 14 20 J~\ ,ο 1 M2 01 1 N201 15 21 CH Η 0 1M211(2)*HC1 1N211(2)*HC1 16 22 cv ^ ι 1M221 1N221 17 23 Qy 0 1M231 1N231 18 24 ΌτΤ 0 1M241 1N241 19 27 1M271 1N271 20 28 ακ 1M2 81 1 N281 21 29 Bi 1M2 91 1N291 168 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ # R3 R3 1M##1 (COOEt) 1N##1 (N02) 22 30 H,C_HNTT^— VN 1 M3 01 1 N3 01 23 31 & 1 M311 1N311 24 32 & 1 M3 21 1 N321 25 33 & 1M331 1N331 26 34 1M3 41 1N341 27 35 & 1 M3 51 1N351 Vários inibidores de MIF pertencentes à classe de compostos possuindo a estrutura I(a) foram preparados de acordo com os seguintes esquemas.
Esquema Reaccional 11
OH O
POCj,
NHtOAc AcOH
A suspensão de 1M00 (33,0 g; 0,14 mole) em tolueno (40 ml) foram adicionados 108 g de POCI3 (0,7 mole) . A solução resultante foi aquecida sob refluxo durante 1,5 horas. O solvente foi destilado sob pressão reduzida e o óleo residual foi sucessivamente extractado com heptano (controlo por TLC). 169 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
As fracções de heptano combinadas foram evaporadas e o resíduo foi aquecido com 200 ml de água e retirado por filtração. O rendimento foi de 27 g (70%).
Após secagem à temperatura ambiente durante 18 horas, o composto dicloro obtido foi transferido para um balão de fundo redondo de 250 ml e foram-lhe adicionados 150 ml de ácido acético e 24,0 g de acetato de amónio. A mistura reaccional foi aquecida sob refluxo durante aprox. 6 h (controlo por LCMS e TLC) . Quando não se conseguia detectar material de partida na mistura reaccional, a solução quente foi vertida em água e o precipitado resultante foi retirado por filtração. O Quadro 6 fornece dados sobre o rendimento (g e%); ponto de fusão; razão entre massa e carga (M/Z), onde M/Z = 754, 1 [3xM]+, 503,3 [2xM]+; τ (passagem de 8 min.), e pureza determinada por LCMS.
Quadro 6
Composto Rendimento, g Rendimento, o, "0 p.f., °C M/Z t , min (passagem de 8 min.) Pureza, O, "o (LCMS) IMO 0(Cl) 23, 0 92 198- 754,1; 2, 97 >96 200 503,3; 252,2; 206, 0
Esquema Reaccional 12
R 2 =COOEt (1 MOO(CI)). N02 ONOOÍCI)
AV-0010, (0020) x= o,s
NMP/DA8CO 100 °C
170 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ À solução de 1M00(C1) (3,27 g; 13,0 irunol) em 20 ml de NMP foram adicionados sequencialmente acilpiperazina (2,34 g; 13.0 mmol) e DABCO (1,46 g; 13,0 mmol). A mistura reaccional foi agitada a 100-120°C durante 15 horas. A reacção foi extinta com solução de NH4C1 a 20% e o precipitado resultante foi retirado por filtração e lavado com água. O produto foi seco num exsicador em P2O5 à temperatura ambiente sob pressão reduzida. O produto foi usado na reacção seguinte sem qualquer outra purificação.
Uma mistura de cloroquinolona 1N00(C1) (2,9 g; 13,0 mmol), trifluoroacetato de acilpiperazina AV-0020 (4,0 g; 13.0 mmol) e DABCO (2,91 g; 26,0 mmol) em 25 ml de NMP foi agitada a 100°C durante a noite. A mistura foi vertida em 50 ml de salmoura, o sólido obtido foi retirado por filtração, lavado com água e seco num exsicador em P2O5 à temperatura ambiente sob pressão reduzida. O produto foi usado na reacção seguinte sem qualquer outra purificação.
Os rendimentos e informação adicional para os compostos obtidos são fornecidos no Quadro 7. Para o composto designado por 1M1, X é O e R2 é COOEt. Para o composto designado por 1M2, X é S e R2 é COOEt. Para o composto designado por INI, X é O e R2 é NO2. Para o composto designado por 1 N2, X é S e R2 é N02.
Quadro 7
Rendimento, g Rendimento,% p.f. °C M/Z τ, min Pureza, % (LCMS) 1M1 4, 7 92 223- 226 dec, 396,2; 350,2 2,67 >94 1M2 4, 9 92 220- 222 366,2; 412,3 2,84 >94 INI 4,5 95 266- 267 dec, 369,0 2, 73 >92 1N2 4, 7 95 265 dec, 385,2 2,89 >92 171 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Esquema Reaccional 13 171 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
R2 = COOEt (1M1, 1M2), NO2 0N1, 1N2)
x=o,s 1M106-1N222 A suspensão de NaH (0,04 g; 1,0 mmol) em NMP seco (3 ml) foi adicionado composto 1M1 (ou 1M2) ou INI (ou 1 N2) (0,8 mmol). Após a libertação do gás ter cessado, adicionou-se o brometo (06 - 20) (1, 0 mmol) . A mistura reaccional foi agitada até não se poderem detectar vestígios de material de partida (controlo por LCMS) . Uma solução a 10% de NH4C1 (20 ml) foi adicionada à reacção e a mistura resultante foi extractada com DCM. Os compostos 1M1 e 1 M2 foram isolados e purificados por HPLC preparativa (Coluna de sílica C-18, 150 mm x 41 mm, 40 ml/min, gradiente: água-acetonitrilo = de 60 : 40 a 5 : 95, 20 min) . Os compostos preparados de acordo com esta via são identificados pelo expoente "A" que se segue à designação do composto no Quadro 5. A uma solução de composto 1M1 (ou 1 M2) ou INI (ou 1 N2) (1,0 mmol) em DMF seca (5 ml) foi adicionado o brometo (06-20) (2, 0 mmol) e K2CO3 (200 mg) . Os compostos 1M122; 1 M222; 1N122; 1 N222 foram obtidos em 1,4-dioxano com 4,0 mmol de brometo de ciclopentilo. A mistura reaccional foi agitada a 80-100 °C durante 20-40 horas (controlo por LCMS). Adicionou-se à reacção a solução a 10% de NH4C1 (20 ml) e mistura resultante foi extractada com DCM. Os compostos 1M106-1 N220 foram isolados e purificados por HPLC preparativa (coluna de sílica C-18, 150 mm x 41 mm, 40 ml/min, gradiente: água-acetonitrilo = de 80: 20 a 5:95,40 min) . O Quadro 5 proporciona dados de pureza e outros dados para os compostos resultantes. O composto 1N119*HC1 foi purificado por HPLC preparativa (coluna de sílica C-18, 150 mm x 41 mm, 40 ml/min, gradiente: água-acetonitrilo-HCl 172 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 5 : 95, 40 min) . Os compostos sta via são identificados pelo designação do composto no Quadro dos compostos são fornecidas no incluindo "(1)" indicam que o (0,001%) = de 80 : 20 a preparados de acordo com e expoente "B" que se segue à 8. As propriedades físicas Quadro 8. As designações composto é um regio-isómero.
Quadro 8
Compostos Rendimento, mg Rendimento, o, 0 p.f. °C M/Z T, min UV (Comprimento de onda 254 nm, passagem de 10 min. ) Pureza, O, "0 (LCMS) 1M112a 78 19 151- 152,5 506,2; 460,4 6,46 >97 1M115a 96 23 177,5 -179 516,4; 470,5 5, 09 >97 1N110a 99 29 163- 166 423,2 4,96 >99 1M214a 116 29 180.5 182.5 508,3; 462,1 5, 26 >99 1M106a 98 27 141- 143 452,3; 406,3 5,13 >97 1N106a 152 45 114- 116 425, 1 5,13 >99 INI14a 97 26 216- 217 465, 4 5, 08 >96 1N206a 148 42 72-74 441,6 5, 41 >97 INI11 (1)B 137 29 99- 100 465,4; 447, 4 5, 91 >99 1N115b 157 32 105- 110 489,4 5, 14 >92x 1N116 A 143 34 205- 208 527,3 5, 69 >99 1N211(1)A 107 22 83-85 481,3 6,21 >98 1N212A 96 24 73-75 495, 5 6,78 >97 1N215a 87 22 220- 221 505,3 5,38 >932 1N216b 207 38 228- 230 543,2 5, 90 >943 173 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Compostos Rendimento, mg Rendimento, ο, 0 p.f . °C M/Z T, min UV (Comprimento de onda 254 nm, passagem de 10 min. ) Pureza, o, 0 (LCMS) 1Ν217β 107 21 251- 252 503,3 5,23 >9 44 1Ν218β 207 39 95-97 525,5 5,92 >96 1Μ118β 104 19 159- 161 536,4; 490,3 5,64 >97 1Μ215β 107 20 87-88 532,3; 486,3 5,34 >99 1Μ218β 147 27 110- 112 552,4; 506,3 5, 89 >99 1Ν120β 92 19 179- 181 473,4; 455,3 5, 49 >98 1Ν210Β 99 23 187- 190 439,4 5,22 >96 1Μ10 7β 138 30 70-72 465,5; 420,3 5,31 >95 1Μ10 8β 213 45 71-73 478,3; 432,2 4, 79 >96 1Μ110β 142 32 161- 162 450,3; 404,3; 350,1 4, 84 >97 1Μ111(1)Β 185 38 174- 175 492,4; 446,2 5, 84 >93 1Μ2 0 7β 131 27 65-6 7 482,4; 436,4 3,88 >99 1Μ2 0 8Β 189 38 71-72 494,5; 448,2 5,05 >97 1Μ211(1)Β 148 29 161- 163 462,3; 508,5 6,19 >99 1Μ212Β 105 20 163- 165 522,7; 476,3 6,74 >98 1Ν10 7β 114 35 103- 107 439,5 5, 40 >99 1Ν10 8β 301 59 200- 203 451,2 4, 83 >97 1Ν2 0 7Β 187 27 70-72 455,2 5,69 >98 1Ν214β 146 38 172- 175 481, 1 5,31 >97 174 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Compostos Rendimento, mg Rendimento, ο, 0 p.f . °C M/Z T, min UV (Comprimento de onda 254 nm, passagem de 10 min. ) Pureza, o, 0 (LCMS) 1Μ113β 152 32 147- 150 476,3; 430,2 4, 71 >99 1Μ114β 202 41 170- 172 492,4; 446,2 4,97 >99 1Μ116β 227 41 185- 187 554,4; 508,4 5,67 >98 1Μ117β 147 29 96-98 514,5; 468,6 4,92 >98 1Μ119α 107 27 65-6 7 487,4; 441,6; 413,3 2,95 >96 1Μ120β 137 27 165,5 -167 500,5; 454,2 5, 46 >99 1Μ206β 167 36 157- 158 468,6; 422,3 5,31 >98 1Μ210Β 107 23 157- 158 466,3; 420,2 5, 13 >99 1Μ213β 107 42 60-63 492,4; 446,3 5, 01 >98 1Μ216β 157 28 177- 179 570,3; 524,5 5, 87 >96 1Μ217β 102 19 134- 135 530,4; 484,3 5, 18 >97 1Μ219α 192 48 74-76 503,4; 457,3 3,14 >97 1Μ220β 92 18 143- 145 516,4; 470,5 5,69 >98 INI12α 182 48 65-68 479,2 6,52 >9 45 1Ν113 82 18 95-97 449, 1 4, 83 >97 INI17β 124 25 233,5 -235 487,2 4,99 >98 INI18β 107 21 163- 163,5 509,5 5, 73 >99 1N119*HC1a 27 5 251- 252 460,3 3,10 >98 1Ν2 0 8β 179 38 204- 205 467,5 5, 11 >96 175 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Compostos Rendimento, mg Rendimento, 0, 0 p.f. °C M/Z T, min UV (Comprimento de onda 254 nm, passagem de 10 min. ) Pureza, 0, 0 (LCMS) 1N219a 107 28 258.5 260.5 476,3 3,14 >94 1N220b 202 41 231.5 232.5 489,3; 471,5 5, 75 >98 1M122 107 23 157- 158 464,4; 418,4; 350,2 5,28 >986 1N122 207 47 210- 211 437,4; 5,38 >9 87 1 M2 2 2 129 27 166 — 167 480,3; 434,4; 366,2 5,56 >998 1 N222 103 23 110- 112 453,2 5,67 >969 1 HPLC >96% 2 HPLC UV-254 >94% 3 HPLC >97% 4 HPLC >96% 5 HPLC (UV254) pureza > 95%, 6 HPLC=100% 7 HPLC > 94% 8 HPLC = 100% 9 HPLC >96
Esquema Reaccional 14
OH
Cl
POCI3TEBAC, CH3CN
1N01 1N01(CI)
Rj = COO Et (Séries M), N02 (Séries N), 176 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ A uma solução da quinolona 1N01 (ou 1M01) (14,08 g; 63,94 mmol) e cloreto de trietilbenzilamónio (58,4 g; 256,5 mmol) em MeCN (235 ml) foram adicionados 26 ml de POCI3 (282,4 mmol). A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente, o solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi agitado em água (335 ml) durante 2 horas. O precipitado foi retirado por filtração, lavado com água, seco, lavado com ciclo-hexano quente, e seco. As propriedades físicas dos compostos preparados são fornecidas no Quadro 9.
R2 »COOE1(1MOO(CI)), NQ2(1NOO(C0 ΟγΟ
NMP/DABCO 100 "C
IMBocPI lNBocPI
TFA
1MPITFA 1NPITFA
Quadro 9
Rendimento, g Rendimento, p.f. M/Z T, min Pureza, 0, O °C % (LCMS) 1N01(Cl) 5,59 89 258-259 239; 193 3,34 > 95 IMO 1(Cl) 8,63 51 95,5-98 266,1; 220,1 3,34 > 98
Esquema Reaccional 15 A uma solução de 1N01(C1) (640 mg; 2,68 mmol) em 3 ml de DMF adicionou-se sequencialmente t-butiloxicarbonilpiperazina (500 mg; 2,68 mmol) e DABCO (300 mg; 2,68 mmol). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. (Para 1M01(C1), a reacção foi agitada a 60°C durante a noite ). A reacção foi extinta com água (15 ml) e o precipitado resultante foi retirado por filtração e lavado com água. (Para 1M01(C1), a reacção foi extinta com solução de NH4CI a 20% (15 ml), extractada com DCM (3x3 ml), seca sobre Na2S04, o solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo foi triturado com hexano. O precipitado obtido foi retirado por filtração e lavado com hexano). O produto foi 177 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ seco num exsicador em P2O5 à temperatura ambiente sob pressão reduzida. Dissolveu-se em 1 ml TFA e manteve-se 1 hora. A solução foi triturada com 20 ml de éter, o precipitado foi retirado por filtração, lavado com éter e seco ao ar. As propriedades físicas dos compostos preparados são fornecidas no Quadro 10. 177 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
R2 = COOEt (1M0G(CI)), N02 (1N00(CI)
TFA
DMF/DABCO
Quadro 10
Rendimento, G Rendimento, 0, O Ό Hi 0 0 M/Z T, min Pureza, % (LCMS) 1MP1TFA 0,84 59 214-215 dec, 316,1; 270, 1 1,98 > 97 1NP1TFA 1,01 75 234-234 dec, 589,2; 241,2 1,98 > 98
Esquema Reaccional 16 1NR2! A uma solução de 1N01(C1) (50 mg; 0,419 mmol) em 3 ml de DMF foi adicionada sequencialmente trifluoroacetato de 3-tienoilpiperazina (69 mg; 0,440 mmol) e DABCO (47 mg; 0,419 mmol) . A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A reacção foi extinta com água (15 ml) e o precipitado resultante foi retirado por filtração e lavado com água. 0 produto foi seco num exsicador em P2O5 à temperatura ambiente sob pressão reduzida. Os produtos preparados de acordo com este esquema são designados no Quadro 11 pelo expoente “A" que se segue à designação do composto. 178 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Esquema Reaccional 17
Uma mistura de ácido pirrolo-2-carboxílico (91 mg; 0,82 mmol) e CDI (133 mg; 0,82 mmol) em 2 ml DMF foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. (No caso de 1M081, IMO 91,1M2 21, 1M271, 1N081, 1N211 - em NMP (1 ml); 1M071, 1M151, 1M181, 1M191, 1M211, 1N071,1N151, 1N181, 1N271 - em DMSO (lml)). Em seguida adicionou-se 1NP1TFA e a mistura foi agitada a 60 °C durante 6 horas. (No caso de 1M181, 1N181 - à temperatura ambiente). A mistura foi diluída com salmoura 5 ml e extractada com CH2CI2 (3x 2 ml) . Os extractos combinados foram lavados com água (1 ml), secos sobre Na2S04 e evaporados sob pressão reduzida. (No caso de 1M071, 1M151, 1M191, 1M211, 1N071, 1N151, 1N191, 1N211, a mistura foi diluída com água, o pó precipitado foi retirado por
filtração, lavado com água, seco ao ar e dissolvido em solução 5-6N de HC1 em i-PrOH. A solução foi aquecida sob refluxo durante 10 min. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, o resíduo foi triturado com éter ou acetona. O precipitado obtido foi retirado por filtração para dar cloridrato do composto alvo). Os resíduos obtidos eram produtos alvo. Os produtos preparados de acordo com este esquema são designados no Quadro 11 pelo expoente "B" que se segue à designação do composto. Os dados de rendimento e propriedades dos compostos preparados de acordo com os
Esquemas 16 e 17 são fornecidas no Quadro 11. As designações incluindo "(2)" indicam que o composto é um regio-isómero. 179 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Quadro 11
Composto Rendimento, g Rendimento, ο, 0 p.f. °C M/Z T, min (passagem de 10 min,) Pureza, % (LCMS) 1Μ31Ia 82 53 113-115 406,3; 361,4 2,381 > 97 1Ν111α 62 77 182 383,1 3,011 > 99 1Ν13Ia 68 81 252-254 399,0 3,011 100 1Ν31Ia 138 87 212-214 379,1 2,381 > 97 1Μ101Ββ 146 77 225,5- 227 409,2; 270,3 4,11 > 97 INI2Ia 87 82 227-230 428,2 4,57 > 94 1Ν161β 88 93 157,5- 160 383,2 3,46 > 99 1Ν2 01Β 162 84 215-217 461,2 4, 81 >97 1Ν3 01Β 121 100 227-230 430,3 5, 08 >97 1Ν341β 87 85 225-227 413,0 4,56 >932 1Ν171Β 122 41 175-177 398,0 4,36 >95 1Ν221β 238 81 187-188 394,1; 348,2 3,69 >98 1 Ν241β 175 60 258-260 394, 1 2,89 >96 1Ν351β 210 74 229-231 383,0; 337,3 2, 72 >97 1Μ111(2)Β 174 91 155,5- 158 410,2; 364,2 4, 01 >97 1Μ131Β 186 94 137,5- 140 426,1; 380,1 4,22 >97 1Μ161β 170 89 189-190 410,1; 364,2; 346,1 3,43 >96 1Μ2 01Β 221 97 176-178 490,1; 442,4; 416, 0 4,67 >95 1Μ291β 212 97 210-211 471,3; 425,2 4,22 >98 1Ν091β 227 79 84-87 387,3; 369,2 3,70 >98 1Ν141Β 124 36 223- 224,5 467,3 5, 41 >98 180 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto Rendimento, g Rendimento, ο, 0 p.f. °C M/Z T, min (passagem de 10 min,) Pureza, % (LCMS) 1Μ121Β 146 69 52-54 455,3; 409,1; 381,2 4, 45 >9 43 1 Μ241 Β 116 59 209-210 421,3; 375, 1 3,01 >95 1Μ281 χ 1.5 222 98 164—166 459,4; 413,1 4, 86 >97 η20β 1Μ3 01Β 168 79 67-70 457,3; 411,0; 383,1 4,94 >9 44 1 Μ351β 119 62 206-208 409,9; 364,3; 336,4 2,76 >98 1Ν101β 228 80 218-221 382,2; 289,2 4, 19 >98 1N191*HC1b 250 77 270-273 400,1 2, 74 >96 1Ν231Β 256 87 217-219 394, 1 2,99 >95 1Ν2 81Β 249 77 283-285 432,2 4,99 >99 1Ν291β 254 77 293,5- 294 444, 4 4,30 >97 1Ν321α 392 84 146,5- 149 369,0 2,85 >99 1Ν33Ia 455 94 189-190 385, 1 2,99 >99 1Μ141β 103 45 130-131 494,5; 448,2 5,31 >97 1Μ171β 129 65 125-127 425,0; 379,2; 351,4 4,22 >96 1Μ231Β 149 76 49-52 375,1; 421,1 3,01 >96 1Μ321α 247 55 130,5- 131,5 396,3; 350,2; 269,3 3,04 >98 1Μ33Ia 276 59 113- 114,5 412,3; 366,2 2,91 >99 1Μ341β 114 56 225-227 440,5; 394,1; 270,3 4,39 >99 181 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto Rendimento, g Rendimento, o, 0 p.f. °C M/Z T, min (passagem de 10 min,) Pureza, % (LCMS) IMO 71*HC1 233 56 43-45 413,4; 367,1; 270,1 2,76 >97 IMO 81 65 15 143-145 427,2; 270,2 3,09 >99 1 M091 171 39 60-62 414,4; 270,0 3,59 >99 1M151*HC1 147 27 108-111 431,3; 385,1; 270,3 2,18 >99 1M181 124 43 6 7-69 411,5; 365,3; 337, 4 3,97 .99 1M191*HC1 327 76 105-107 427,3; 270,3 2,13 >98 1 M211 (2) 70 14 427,3; 381,4; 270,0 2,79 >96 1 M2 21 247 56 160- 160,5 421,4; 375,1; 357,1; 347,3 3,60 >93 1 M2 71 135 31 65-67 422,3; 376,2; 348,0 3,56 >94 1N0 71*HC1 141 34 83-86 386,2 3,14 >96 1 NO 81 85 14 263-265 400,2 3,12 >97 1N151*HC1 227 69 198-200 404,2 2,82 >95 INI 81 246 86 200-201 384, 1 4, 00 >97 1N211(2)*H Cl 71 11 78-80 400,2 2,36 >95 1 N271 247 84 214-215 395,1; 349,2; 242,3 3,65 >99 1 Passagem de 8 min. 2HPLC > 98% 3HPLC>96% 4HPLC > 97% 182 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ se é ou Ο rendimento dos inibidores de MIF preparados como descreveu nos esquemas seleccionados anteriores proporcionado no Quadro 12. As designações incluindo "(1)" "(2)" indicam que o composto é um regio-isómero.
Quadro 12
No. Composto Peso, mg Ηί O O 1 1M071*HC1 226 43-45 2 1 MO 81 58 143-145 3 1M091 164 60-62 4 1M101 139 225,5-227 5 1M106 84 141-143 6 1M107 131 70-72 7 1M108 196 71-73 8 1M110 135 161-162 9 1M111(1) 178 174-175 10 1M111(2) 167 155,5-158 11 1M112 72 151-152,5 12 1M113 145 147-150 13 1M114 195 170-172 14 1M115 91 177,5-179 15 1M116 220 185-187 16 1M117 140 96-98 17 1M118 97 159-161 18 1M119 100 65-67 19 1M120 130 165,5-167 20 1M121 139 52-54 21 1M122 100 157-158 22 1M131 179 137,5-140 23 1M141 96 130-131 24 1M151*HC1 140 108-111 25 1M161 163 189-190 26 1M171 122 125-127 27 1M181 117 67-69 28 1M191*HC1 320 105-107 29 1M2 01 214 176-178 183 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Νο. Composto Peso, mg p·f·, (°C) 30 1 Μ2 06 160 157-158 31 1 Μ2 0 7 124 65-6 7 32 1 Μ2 0 8 182 71-72 33 1Μ210 100 157-158 34 1Μ211(1) 141 161-163 35 1Μ211(2)*HC1 112 80-81 36 1 Μ212 98 163-165 37 1Μ213 200 60-63 38 1 Μ214 109 180,5-182,5 39 1 Μ215 100 87-88 40 1 Μ216 150 177-179 41 1 Μ217 95 134-135 42 1 Μ218 140 110-112 43 1 Μ219 185 258,5-260,5 44 1 Μ2 2 0 85 143-145 45 1 Μ221 240 160-160,5 4 6 1 Μ2 2 2 122 166—167 47 1 Μ231 142 49-52 48 1 Μ2 41 109 209-210 49 1 Μ2 71 128 65-6 7 50 1 Μ2 81 215 164—166 51 1 Μ291 205 210-211 52 1Μ3 01 161 67-70 53 1Μ311 75 113-115 54 1 Μ321 230 130,5-131,5 55 1 Μ331 258 113-114,5 56 1 Μ3 41 107 225-227 57 1 Μ351 112 206-208 58 1Ν0 71*HC1 134 83-86 59 1N081 78 263-265 60 1N091 220 84-87 61 INI 01 221 218-221 62 1N106 145 114-116 63 INI 0 7 107 103-107 6 4 INI 0 8 294 200-203 184 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Νο. Composto Peso, mg p·f·, (°C) 65 INI 10 90 163-166 66 INI11(1) 130 99-100 67 INI11(2) 56 182 68 1N112 175 65-68 69 INI 13 75 95-97 70 INI 14 90 216-217 71 1N115 150 105-110 72 1N116 133 205-208 73 INI 17 117 233,5-235 74 INI 18 100 163-163,5 75 INI19 *HC1 42 251-252 76 1N120 85 179-181 77 1N121 80 227-230 78 1N122 200 210-211 79 1N131 60 252-254 80 1N141 117 223-224,5 81 INI51*HC1 220 198-200 82 1N161 81 157,5-160 83 1N171 115 175-177 84 INI 81 239 200-201 85 INI91*HC1 243 270-273 86 1N201 155 215-217 87 1 N206 141 72-74 88 1 N207 180 70-72 89 1N208 172 204-205 90 1N210 92 187-190 91 1N211(1) 100 83-85 92 1N211(2)*HC1 64 78-80 93 1N212 89 73-75 94 - - - 95 1N214 139 172-175 96 1 N215 80 220-221 97 1 N216 200 228-230 98 1 N217 100 251-252 99 1 N218 200 95-97 185 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
No. Composto Peso, mg p.f., (°C) 100 1 N219 100 258,5-260,5 101 1 N220 195 231,5-232,5 102 1 N221 231 187-188 103 1 N222 96 110-112 104 1N231 246 217-219 105 1N241 168 258-260 106 1N271 240 214-215 107 1 N281 242 283-285 108 1N291 247 293,5-294 109 1N301 114 227-230 110 1N311 131 212-214 111 1N321 385 146,5-149 112 1N331 448 189-190 113 1 N341 80 225-227 114 1N351 202 229-231
Exemplo 15
Os esquemas que se seguem proporcionam um procedimento geral para sintetizar Boc-derivados de ácidos.
Esquema Reaccional 20
Uma mistura de ácido L-tiazolidina-4-carboxílico (lg; 7,51 mmol, 98% de pureza, AVOCADO, # 15033), Na2C03 (1,75 g; 16,5 mmol) em H20 (9 ml) e i-PrOH (1 ml) foi agitada até se dissolver. Em seguida adicionou-se Boc20 (1.967 g; 9.01 mmol) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A suspensão obtida foi diluída com água (10 ml) e extractada com hexano (5 ml) . A fase menor foi separada, adicionou-se EtOAc (20 ml) e a mistura em agitação foi 186 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ acidificada para ajustar a pH 2-3. A fase de EtOAc foi separada, a fase aquosa foi extractada com EtOAc (3x10 ml) . Os extractos combinados foram lavados com água (10 ml), secos sobre Na2S04 e evaporados sob pressão reduzida. O resíduo foi cristalizado em éter e o precipitado obtido foi retirado por filtração para dar após secagem em vácuo, ácido N-Boc-tiazolidina-4-carboxílico (1,03 g; 59%).
Exemplo 16
As alquilpiperazinas podem ser sintetizadas de acordo com os seguintes esquemas.
Esquema Reaccional 21 CL1 soeu
,0 -~—fí W .Cl 'S' N(Et)3, CH2CL2 V / \ N N.........Ov y v_/ γ; N(Et)3, CI-^CLj
N N-^
TFA
.<> - TFA
Uma solução de cloreto de tionilo recém-destilado (3,9 ml; 0,053 mol) em dicloreto de metileno (5 ml) foi adicionada gota-a-gota a uma solução agitada de 2-tiofenometanol (4,2 ml; 0,044 mol) e trietilamina (7,4 ml; 0,05 mol) em dicloreto de metileno (25 ml); manteve-se a temperatura abaixo de 20°C. A temperatura foi em seguida elevada para 40°C durante lh, verteu-se em gelo moído, a fase de CH2CI2 foi separada e seca sobre MgS04. Em seguida foi adicionada gota-a-gota a uma solução agitada de N-Boc-piperazina (2 g; 0,011 mol) e trietilamina (1,5 ml; 0,011 mol) em CH2CI2 (45 ml). Ver Nicholas A. Meanwell, Piyasena Hewawasam, Jeanine A. Thomas, J.J. Kim Wright, John W. Russel, Marianne Gamberdella, Harold J. Goldenberg, Steven M. Seiler, e George B. Zavoico, Inhibitors of Blood Platelet cAMP Phosphodiesterase. 4. Structural Variation of the Side-Chain Terminus of Water-Soluble 1,3-Di-hydro-2H-imidazo [4,5 -b] quinolin-2-one 187 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Derivatives, J. Med. Chem. (1993) Vol. 36., pp. 3251-3264; Elena Carceller, Manuel Merlos, Marta Girai, Carmen Almansa, Javier Bartroli, Julian Garcia-Rafanell, e Javier Fom, Synthesis and Structure-Activity Relationships of l-Acyl-4-((2-methyl-3-pyridyl)cianomethyl)piperazines as PAF
Antagonists, J. Med. Chem. (1993) No. 36, pp. 2984-2997. A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente, o solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo foi extractado com éter. A solução de éter foi evaporada sob pressão reduzida, o resíduo dissolvido em TFA (3,3 ml; 0,043 mol) e mantido durante 30 min. O TFA foi removido sob pressão reduzida, o resíduo foi triturado com éter, o precipitado foi retirado por filtração e seco ao ar para dar ditrifluoroacetato de 1-(2-tienilmetil)piperazina (3,16 g; 72%) . Ver William J. Archer, Robert Cook, e Roger Taylor, Electrophilic Aromatic Substitution. Part 34. Partial Rate Factors for Detritiation of Dithieno[1,2-b:4,3-b']benzene, Dithieno[1,2-b:3,4-b']benzene, and Dithieno[2,1-b:3,4- b']benzene, J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. (1983) pp. 813-819 .
Esquema Reaccional 22 SOCI, N(Et)3, CH2CL2 N(Et)3. CH2CL2 N N—^ \_/ O—|—
TFA · TFA b
Uma solução de cloreto de tionilo recém-destilado (3,9 ml; 0,053 mol) em dicloreto de metileno (5 ml) foi adicionada gota-a-gota a uma solução agitada de álcool furfurílico (3,8 ml; 0,044 mol) e trietilamina (7,4 ml; 0,05 mol) em dicloreto de metileno (25 ml); manteve-se a temperatura abaixo de 20°C. A mistura foi agitada durante lh. Em seguida o solvente foi evaporado, o resíduo dissolvido em CH2CI2 (150 ml). A solução obtida foi adicionada gota-a-gota a uma solução agitada de 188 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ N-Boc-piperazina (2 g; 0,011 mol) e trietilamina (4 ml; 0,029 mol) em CH2CI2 (45 ml). A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente, o solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo foi extractado com éter. A solução de éter foi evaporada sob pressão reduzida, o resíduo dissolvido em TFA (3,3 ml; 0,0 43 mol) e mantido durante 3 0 min. O TFA foi removido sob pressão reduzida, o resíduo foi titulado com éter, e o precipitado negro obtido foi retirado por filtração. Em seguida, dissolveu-se o precipitado em 200 ml de MeOH, adicionou-se carvão activado, e a mistura foi aquecida sob refluxo durante 30 min. O carvão foi retirado por filtração, o solvente foi evaporado, o resíduo foi triturado com éter. O precipitado branco obtido foi retirado por filtração e seco ao ar para dar ditrifluoroacetato de 1-(2-furilmetil)piperazina (1,64 g; 40%). Ver R. Lukes e V. Dienstbierova, Synthese von cx-methylfural, Collection Czechoslov. Chem. Commun. (1954) Vol.19, pp. 609-610.
Exemplo 17
As sulfonamidas podem ser sintetizadas de acordo com os seguintes esquemas. 4-Hidroxi-l-metil-3-nitro-l.ff-quinolin-2-ona (designado por 595-01)
Uma solução de etilnitroacetato (15,96 g, 120 mmol) foi adicionada lentamente a uma suspensão de hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 5,28 g, 132 mmol) em dimetilacetamida sob atmosfera de N2. A mistura foi deixada agitar à temperatura ambiente até a libertação de gás hidrogénio ter cessado, em seguida aqueceu-se a 90°C durante 30 min. e arrefeceu-se à temperatura ambiente. Adicionou-se lentamente solução de anidrido N-metilisatóico (23,38 g, 132 mmol) em dimetilacetamida e aqueceu-se durante a noite a 120°C. A mistura foi arrefecida à temperatura ambiente, vertida em água com gelo, e acidificada com HC1 a 10% frio. Os sólidos formados foram filtrados e lavados várias vezes com água para originar 7,1 g (27%) de sólidos amarelos. Pf 193°C. 1H RMN (DMSO-d6) : δ 3,60 (s, 3H) , 7,37 (t, J= 7,6 Hz, 1H) , 7,58 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,77 (t, J = 7,5 Hz, 1H) , 8,12 (d, J = 7,9 189 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Hz, 1Η) . EIMS m/z 221 (Μ+1), 243 (Μ+23). Anal. (Ci0H8N2O4) C, Η, Ν.
4-Cloro-l-metil-3-nitro-l.ff-quinolin-2-ona (Designado por 595-02)
Uma suspensão de 595-01 (6,2 g, 28,18 mmol) em 70 ml de oxicloreto fosforoso foi aquecida a 90°C durante 3 h. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi suspenso em água com gelo e neutralizado com bicarbonato de sódio. Os sólidos formados foram filtrados e secos para se obter 4,91 g (73%) de sólidos castanhos. Pf 235 °C. ‘‘H RMN (DMSO-de): δ 3,72 (s, 3H) , 7,56 (t, J= 7,5 Hz, 1H) , 7,78 (d, J= 8,6 Hz, 1H), 7,92 (t, J= 8,6 Hz, 1H) , 8,12 (d, J= 7,9 Hz, 1H), EIMS m/z 239 (M+l), 261 (M+23). Anal. (C10H7N2O3CI) C, Η, N. Éster terc-butílico do ácido 4-(tiofeno-2-carbonil)-piperazina-l-carboxílico (Designado por 595-03) 2-Tiofenocarbonilcloreto (2,04 g, 1,49 mL) foi adicionado a uma solução de terc-butil-1- piperazinacarboxilato (2,5 g,13,4 mmol) e DMAP (20 mg) em piridina (15 mL) a 0°C sob atmosfera de N2 e agitou-se à temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi vertida em água com gelo, o precipitado foi filtrado, lavado várias vezes com água, e seco para originar sólidos brancos (3,5 g, 88%). Pf 76 °C. ΤΗ RMN (DMSO-de): δ 1,42 (s, 12H) , 3,40 (m, 4H) , 3,61 (m, 4H) , 7,12 (m, 1H) , 7,43 (d, J = 4,1 Hz, 1H) , 7,77 (d, J = 4,8 Hz, 1H) . EIMS m/z 297 (M+l), 319 (M+23). Anal. (C14H2oN203S) C, Η, N. 190 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
595-03 595-04
Piperazina-l-il-tiofen-2-il-metanona (Designado por 595-04) A uma solução de 595-03 (3.5 g, 11,8 mmol) em diclorometano (50 mL) adicionou-se ácido trifluoroacético (10 mL) . A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 3 h. 0 solvente foi evaporado sob vácuo e o resíduo dissolvido em clorofórmio. A fase orgânica foi lavada com solução saturada de bicarbonato de sódio, seca sobre Na2S04 e evaporada para se obter 2,20 g (94%) de óleo castanho viscoso. 1H RMN (DMSO-de): δ 2,78 (m, 4H), 3,59 (m, 4H) , 7,12 (t, J= 4,1, 1H), 7,38 (d, J= 4,1 Hz, 1H) , 7,74 (d, J= 4,8
Hz, 1H). EIMS m/z 197 (M+l). l-Metil-3-nitro-4-[4-(tiofeno-2-carbonil)-piperazina-l-il]-lH-quinolin-2-ona (Designado por 595-06) 595-04 (1 g, 5,5 mmol) e diisopropiletilamina (1,74 mL, 10 mmol) foram adicionados a uma solução de 595-02 (1,2 g, 5 mmol) em tolueno (100 mL) e aqueceu-se a 100°C durante 15 h. 0 solvente foi removido sob vácuo. A purificação do resíduo por cromatografia flash (CH2Cl2/MeOH, 49:1) proporcionou 1,05 g (53%) de sólidos amarelos. Pf 105°C. 1H RMN (DMSO-de): δ 3,19 (m, 4H) , 3,65 (s, 3H) , 3,90 (m, 4H) , 7,14 (t, J = 4,5 Hz, 1H), 7,43 (t, J= 7,5 Hz, 1H), 7,48 (d, J= 4,1 Hz, 1H), 7,67 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 7,80 (m, 2H), 8,05 (d, J= 8,5 Hz, 1H) . EIMS m/z 399 (M+l), 421 (M+23). Anal. (C19H18N4O4S) C, H, N. 191 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Cl
595-02
3-Amino-l-metil-4-[4-tiofeno-2-carbonil)-piperazina-l-il]-1H-quinolon-2-ona (Designado por 595-091 A uma suspensão de 595-06 (600 mg, 1,5 mmol) em etanol adicionou-se Pd/C (10%, 75 mg) . A suspensão foi agitada sob atmosfera de H2 a 60°C durante 4 h. A mistura quente foi filtrada através de Celite e o filtrado foi evaporado até à secura. O resíduo foi recristalizado em etanol para originar 490 mg (88%) de sólidos brancos. Pf 202°C. 1H RMN (CDC13): δ 3,20 (lg, 2H), 3,49 (lg, 2H) , 3,65 (lg, 2H) , 3,79 (s, 3H) , 4,13 (lg, 2H), 4,71 (lg, 2H) , 7,08 (t, J= 4,3 Hz, 1H) , 7,22-7,26 (m, 3H), 7,34-7,37 (m, 3H) , 7,48 (d, J = 4,9 Hz, 1H) , 7,79 (d, J = 8,0 Hz, 1H) . EIMS m/z 369 (M+l), 391 (M+23). Anal. (C19H20N4O2S) C, Η, N. N-{l-Metil-2-oxo-4-[4-(tiofeno-2-carbonil)-piperazin-1-il]-1,2-di-hidro-quinolin-3-il}-metanossulfonamida (Designado por 595-15)
Adicionou-se gota-a-gota cloreto de metanossulfonilo (0,1 mL, 1,3 mmol) a uma solução de 595-09 (120 mg, 0,32 mmol) em piridina (2 mL) sob atmosfera de N2 e agitou-se ainda à temperatura ambiente durante a noite. 0 solvente foi evaporado sob vácuo e o resíduo dissolvido em acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada sucessivamente com solução saturada de NaHCCé, água e salmoura. A fase orgânica foi seca sobre Na2SC>4 e evaporada até se obter um resíduo que foi lavado com éter para originar 103 mg (73%) de sólidos brancos . Pf 223 °C. XH RMN (DMSO-de) : δ 3,08 (s, 3H) , 3,31 (m, 4H) , 3, 64 (s, 3H), 31 , 95 (m, 4H) , 7,15 (t, J= = 4,0 Hz, 1H) , 7, 33 (t , J = 7,6 Hz r 1 1H) , 7, 44 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 7,56 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7, , 66 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7, 79 (d, J = 4, 9 192 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Hz, 1Η), 7,98 (d, J = 8,2 Hz, 1Η), 8,84 (s, 1Η). EIMS m/z 447 (M+l) , 469 (Μ+23) . Anal. (C20H22N4O4S2) C, Η, Ν.
595-06 5Θ5-Θ9 595-15
Outras sulfonamidas podem ser preparadas de acordo com vias sintéticas similares.
Exemplo 18
Os sulfonilos podem ser sintetizados de acordo com os seguintes esquemas. Éster etílico do ácido p-tolilsulfanil-acético (Designado por 595-29)
Uma solução de 4-metilbenzenotiol (5 g, 40,25) em THF seco foi adicionada gota-a-gota a uma suspensão de NaH (60% em óleo mineral, 1,98 g, 48,30) em THF à temperatura ambiente e agitada durante 30 min. sob atmosfera de N2. Adicionou-se lentamente etilbromoacetato (4,9 mL, 44,27) a esta solução e agitou-se ainda à temperatura ambiente durante 3 h. O solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi dissolvido HC1 dil. e extractado com acetato de etilo. A fase orgânica combinada foi lavada sucessivamente com solução saturada de
NaHCCg, água e salmoura, em seguida seca sobre Na2S04 · A evaporação da fase orgânica rendeu 8,46 g (99%) óleo incolor. ΤΗ RMN (CDCI3) : δ 1,22 (t, J = 7, 2 Hz , 3H), 2,32 (s, 3H), 3,57 (s, 2H), 4,14 (q, J = 7,2 Hz, 2H) , 7,11 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 8,0 Hz , 2H) . EIMS m/z 210 (M+l), 233 (M+23). 193 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Éster etílico do ácido (tolueno-4-sulfonil)-acético (Designado por 595-35) A uma solução de 595-29 (10 g, 47, 55 mmol) em diclorometano foi adicionado ácido m-cloroperbenzóico (21,31 g, 95,10 mmol) em porção a 0°C. A mistura foi aquecida à temperatura ambiente e agitada durante a noite. Os sólidos formados foram filtrados e o filtrado foi lavado sucessivamente com NaOH IN, água e salmoura. A fase orgânica foi seca sobre Na2S04 e evaporada para originar 9,8 g (85%) de óleo incolor. 1H RMN (CDCI3) : δ 1,22 (t, J = 7,2 Hz, 3H) , 2,45 (s, 3H), 4,08 (s, 2H) , 4,17 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 7,37 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,83 (d, J= 8,0 Hz, 2H) . EIMS m/z 243 (M+l), 265 (M+23).
Br^COOEt
NaH.THF RT, 3h
,COOEt 595-29
m-CPBA, CH2CI RT Durante a noite
COOEt 595-35 4-Hidroxi-l-metil-3-(tolueno-4-sulfonil)-l.ff-quinolin-2-ona (Designado por 595-36)
Uma solução de 595-35 (9,8 g, 40,49 mmol) foi adicionada lentamente numa suspensão de hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 1,78 g, 44,52 mmol) em dimetilacetamida sob atmosfera de N2. A mistura foi agitada à temperatura ambiente
até a libertação de gás hidrogénio ter cessado, em seguida aqueceu-se a 90°C durante 30 min. e arrefeceu-se à temperatura ambiente. Adicionou-se lentamente uma solução de anidrido N-metilisatóico (7,88 g, 44,52 mmol) em dimetilacetamida e aqueceu-se durante a noite a 120°C. A mistura foi arrefecida à temperatura ambiente, vertida em água com gelo e acidificada com HC1 a 10% frio. Os sólidos formados foram filtrados e lavados várias vezes com água para originar 5,7 g (43%) de sólidos brancos. Pf 191°C.1H RMN (DMSO-d6) : δ 2,39 (s, 3H) , 3,44 (s, 3H) , 7,36 (t, J= 7,5 Hz, 1H), 7,42 (d, J= 8,2 Hz, 2H), 7,55 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 7,81 (t, J= 7,1 Hz, 1H), 7,95 (d, J= 8,2 Hz, 2H) , 8,11 (d, J = 8,0 Hz, 1H) . EIMS m/z 330 (M+l), 352 (M+23). Anal. (C17H15NO4S) C, Η, N. 194 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
4-Cloro-l-metil-3- ( tolueno -4-sulfonil)-l.ff-quinolin-2-ona (Designado por 595-46)
Uma suspensão de 595-36 (5,2 g, 5,9 mmol) em 30 mL de oxicloreto fosforoso foi aquecida a 130°C durante 30 h. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi suspenso em água com gelo e neutralizado com bicarbonato de sódio. Os sólidos formados foram filtrados e secos para originar 2,3 g (43%) de sólidos brancos. Pf 193°C. 1H RMN (DMSO-de) : δ 2,38 (s, 3H) , 3,52 (s, 3H), 7,39 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 7,48 (t, J= 7,5 Hz, 1H) , 7,64 (d, J= 8,4 Hz, 1H) , 7,84 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 7,94 (d, J = 8,2 Hz, 2H) , 8,32 (d, J = 8,0 Hz, 1H) . EIMS m/z 348 (M+l), 370 (M+23). Anal. (Ci7H14N03SC1) c, h, n. l-Metil-4-[4-(tiofeno-2-carbonil)-piperazin-l-il]-3-(tolueno-4-sulfonil)-lif-quinolin-2-ona (Designado por 595-48)
Adicionou-se diisopropiletilamina (0,38 mL, 2,22 mmol) a uma solução de 595-46 (289 mg, 0,83 mmol) e 595-04 (195 mg, 0,99 mmol) em tolueno e aqueceu-se durante a noite a 105°C. A solução foi arrefecida e o solvente foi evaporado sob vácuo. Adicionou-se água ao resíduo oleoso e sonicou-se. Os sólidos formados foram filtrados e lavados com água e éter para originar sólido amarelos, 360 mg (86%), pf 213°C. 1H RMN (DMSO-de): δ 2,37 (s, 3H) , 3,37 (s, 3H) , 3,65 (m, 4H) , 3,94 (m, 4H), 7,16 (t, J= 4,3 Hz, 1H), 7,32 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 7,39 (t, J= 7,6 Hz, 1H), 7,49 (d, J= 4,0 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 8,0 Hz, 2H) , 7,80 (d, J = 4,5
Hz, 1H) , 8,15 (d, J = 8,2 Hz, 1H) . EIMS m/z 508 (M+l), 530 (M+23). Anal. (C26H25N3O4S2) C, Η, N. 195 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
595-46 595-04 595-48 4-Hidroxi-3-metanossulfonil-l-metil-lfl-quinolin-2-ona (Designado por 595-05)
Uma solução de etilmetanosulfonilacetato (3,78 g, 22,74 mmol) foi adicionada lentamente numa suspensão de hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 1,07 g, 25 mmol) em dimetilacetamida sob atmosfera de N2. A mistura foi deixada agitar à temperatura ambiente até a libertação de gás hidrogénio ter cessado, em seguida aqueceu-se a 90°C durante 30 min e arrefeceu-se à temperatura ambiente. Adicionou-se lentamente uma solução de anidrido N-metilisatóico (4,43 g, 25 mmol) em dimetilacetamida e aqueceu-se durante a noite a 120°C. A mistura foi arrefecida à temperatura ambiente, vertida em água com gelo e acidificada com HC1 a 10% frio. Os sólidos formados foram filtrados e lavados várias vezes com água para originar 2,76 g (48%) de sólidos brancos. Pf 170°C. RMN (DMSO-de) : δ 3,51 (s, 3H) , 3,59 (s, 3H), 7,39 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,84 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 8,09 (d, J= 8,0 Hz,1H). EIMS m/z 254 (M+l), 276 (M+23). Anal. ( CuHuNOíS) C, Η, N. 4-Cloro-3-metanossulfonil-l-metil-l.ff-quinolin-2-ona (Designado por 595-14)
Uma suspensão de 595-05 (1,5 g, 5,9 mmol) em 30 mL de
oxicloreto fosforoso foi aquecida a 130°C durante 30 h. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida. 0 resíduo foi suspenso em água com gelo e neutralizado com bicarbonato de sódio. Os sólidos formados foram filtrados e secos para originar 773 mg (48%) de sólidos brancos. Pf 221 °C; 1H RMN (DMSO-d6) : δ 3,48 (s, 3H) , 3,68 (s, 3H) , 7,49 (t, J= 7,8 Hz, 1H), 7,72 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 7,89 (t, J= 8,6 Hz, 1H), 8,29 196 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ (d, J = 8,5 Hz, 1H) . EIMS m/z 272 (M+l), 294 (M+23). Anal. (C11H10CINO3S) C, Η, N. λ
595-05 595-14 3-Metanossulfonil-l-metil-4-[4-(tiofeno-2-carbonil)-piperazin-l-il]-lH-quinolin-2-ona (Designado por 595-16)
Adicionou-se diisopropiletilamina (0,38 mL, 2,22 mmol) a uma solução de 595-14 (300 mg, 1,11 mmol) e 595-04 (239 mg, 1,21 mmol) em tolueno e aqueceu-se durante a noite a 105°C. A solução foi arrefecida e o solvente foi evaporado sob vácuo. Adicionou-se água ao resíduo oleoso e sonicou-se. Os sólidos formados foram filtrados e lavados com água e éter para originar sólidos amarelos, 384 mg (81%), pf 224°C. XH RMN (DMSO-ds) : δ 3,36 (s, 3H) , 3,52 (m, 4H) , 3,60 (s, 3H) , 3,91 (m, 4H) , 7,16 (t, J= 3,5 Hz, 1H), 7,37 (t, J= 7,5 Hz, 1H), 7,47 (d, J= 3,5 Hz, 1H), 7,61 (d, J= 8,5 Hz, 1H) , 7,57 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 4,8 Hz, 1H) , 8,10 (d, J= 8,5 Hz, 1H) . EIMS m/z 432 (M+l), 454 (M+23). Anal. (C20H21N3O4S2) C, Η, N.
595-14 595-04 595-16
Exemplo 19
Ester etílico do ácido 4-hidroxi-2-oxo-l,2-di-hidro-quinolina-3-carboxílico (Designado por 595-68)
Uma solução de dietilmalonato (80 g, 0,50 mol) foi adicionada lentamente a uma suspensão de hidreto de sódio 197 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ (60% em óleo mineral, 22 g, 0,55 mol) em dimetilacetamida sob atmosfera de N2. A mistura foi deixada agitar à temperatura ambiente até a libertação de gás hidrogénio ter cessado, em seguida aqueceu-se a 90°C durante 30 min. e arrefeceu-se à temperatura ambiente. Adicionou-se lentamente uma solução de anidrido isatóico (89,72 g, 0,55 mmol) em dimetilacetamida e aqueceu-se a 120°C durante 15 h. A mistura foi arrefecida à temperatura ambiente, vertida em água com gelo e acidificada com HC1 a 10% frio. Os sólidos formados foram filtrados e lavados várias vezes com água para originar 55 g (47%) de sólidos brancos. Pf 173°C. 1H RMN (DMSO-de) : δ 1,30 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 4,33 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 7,18 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,26 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 7,62 (t, J= 7,2 Hz, 1H), 7,93 (d, J = 8,0 Hz, 1H) 11,50 (s,1H), 13,5 (s,lH). EIMS m/z 234 (M+l) , 256 (M+2 3) . Anal. (C12H11NO4) C, Η, N. Éster etílico do ácido 2,4-dicloro-quinolina-3- carboxílico (Designado por 595-72)
Uma suspensão de 595-68 (35 g, 150 mmol) em 200 mL oxicloreto fosforoso foi aquecida a refluxo durante 30 min. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi suspenso em água com gelo e neutralizado com bicarbonato de sódio. Os sólidos formados foram filtrados e secos para originar 39 g (97%) de sólidos brancos. Pf 93°C. 1H RMN (DMSO-de) : δ 1,37 (t, J = 6,9 Hz, 3H) , 4,49 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 7,89 (t, J = 8,5 Hz, 1H), 8,02 (t, J= 7,2 Hz, 1H) , 8,10 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,28 (d, J = 8,0 Hz, 1H) ; EIMS m/z 270 (M+l), 292 (M+2 3) . Anal. (Ci2H9Cl2N02) C, Η, N. Éster etílico do ácido 4-cloro-2-oxo-l,2-di-hidro-quinolina-3-carboxílico (Designado por 595-76)
Acetato de amónio (12,6 g, 164 mmol) foi adicionado a uma solução de 595-72 (40,17 g, 149 mmol) em ácido acético (150 mL) . A mistura foi aquecida a 140°C durante 4 h. A solução foi arrefecida e vertida em água com gelo. Os sólidos formados foram filtrados, lavados com água e secos para originar sólidos brancos (34 g, 91%), Pf 186°C. 1H RMN (DMSO-d6) : δ 1,37 (t, J = 6,9 Hz, 3H) , 4,50 (q, J = 6,9 Hz, 2H) , 7,87 (t, J= 7,2 Hz, 1H), 8,01 (t, J= 7,0 Hz, 1H) , 8,08 (d, 198 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ J = 8,4 Hz, 1Η) , 8,26 (d, J = 8,2 Hz, 1Η) . EIMS πι/ζ 252 (Μ+1) . Anal. (Ci2H10C1NO3) C, Η, Ν. 198 ΕΡ 1 389 110/ΡΤnr% * Τ 120 °C, 15 h
595-68 595-72 AcOH, NHjOAc, 140 “C cd COOEt
H 595-76
Ester etílico do ácido 2-oxo-4-[4-(tiofeno-2-carbonil)-piperazina-l-il]-1,2-di-hidro-quinolina-3-carboxílico (Designado por 595-77) A uma solução de dimetilacetamida adicionou-se (6,23 g, 55,6 mmo1) e 595-04 (6 g,
aquecida a 115°C durante 15 h. A arrefecida e vertida na água com gelo. foram filtrados, lavados com água e sólidos brancos (7g, 62%), pf 198°C. 1H (t, J = 6,9 Hz, 3H), 3,12 (m, 6,9 Hz, 2H), 7,15 (t, J = 4,3 1H), 7,31 (d, J= 8,1 Hz, 1H), (t, J = 7,4 Hz, 1H) , 7, 79 (d, 8,0 Hz, 1H) . EIMS m/z 412 (C21H21N3O4S. 0,5 H20) C, Η, N. 595-76 (7g, 27,8 mmol) em l,4-diazabiciclo[2,2,2]octano 30,6 mmol). A solução foi mistura reaccional foi Os sólidos formados secos para originar RMN (DMSO-de) : δ 1,2 8 (m, 4H), 4,28 (q, J = 7,23 (t, J = 7,5 Hz, J = 3,1 Hz, 1H), 7,54 Hz, 1H), 7,87 (d, J= (M+l), 434 (M+23) . Anal. 4H), 3,87 Hz, 1H), 7,45 (d, J = 4,9
Ester etílico do ácido 1-(4-fluorobenzil)-2-oxo-4-[4-(tiofeno-2-carbonil)-piperazina-l-il]-1,2-di-hidro-quinolina-3-carboxílico (Designado por 595-78) A uma suspensão de hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 0,78 g, 19,46 mmol) em DMF adicionou-se lentamente uma solução de 595-77 (7g, 17,03 mmol) em DMF. A suspensão foi agitada à temperatura ambiente durante 30 min. Adicionou- 199 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ se lentamente 4-flurobenzilbrometo a esta solução e agitou-se mais durante 2 h. A mistura foi vertida em água com gelo e acidificada com HC1 a 10% frio. Os sólidos formados foram separados, lavados com água e purificados por cromatografia flash (CH2Cl2/MeOH, 49:1) para originar 5,9 g (67%) de sólidos brancos. Pf 52°C; 1H RMN (DMSO-d6) : δ 1,30 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 3,16 (m, 4H), 3,89 (m, 4H) , 4,32 (q, J= 6,9 Hz, 2H), 7,14 - 7,17 (m, 3H) , 7, 24 - 7, 27 (m, 2H) , 7,31 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7, 44 - 7, 47 (m, 2H) , 7,58 (t, J= 8,5 Hz, 1H) , 7,79 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 8,5 Hz, 1H). EIMS m/z 520 (M+l) , 542 (M+23). Anal. (C28H26FN304S. H20) C, Η, N.
Exemplo 20 O texto que se segue descreve a sintese de uma biblioteca de compostos de estrutura geral l(a) e 1 (b) como representadas acima. Compostos incluindo um "M" na designação incorporam uma porção -COOEt. Compostos incorporando um "N" na designação incorporam uma porção -N02. Os dois digitos que se seguem a "M" ou "N" correspondem à designação numérica do grupo funcional R2 e R3 respectivamente, proporcionada abaixo. O digito que precede "M" ou "N" corresponde à designação numérica do grupo funcional RI. Os compostos têm as seguintes estruturas, excepto para aqueles com designações incluindo " + i".
200 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Em compostos que têm designações incluindo “+i", R3 é um substituinte no átomo de oxigénio do grupo quinolona em vez de no átomo de azoto, i.e., um composto de estrutura 1 (b) , como representado abaixo. A designação "i" surge em qualquer lado nas concretizações preferidas, e refere-se a um substituinte no átomo de oxigénio do grupo quinolona em vez de no átomo de azoto. 200 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Designações numéricas para Grupos Funcionais RI
Hidrogénio Metilo Cloro 1 2 3
Designações numéricas para Grupos Funcionais R2
1 2 3 4 5 6
Designações numéricas para Grupos Funcionais R3 Ma
? £. 7 Z
1 2 â 4 S
As designações numéricas dos inibidores de MIF preparados são fornecidas no Quadro 13. 201 201 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Quadro 13 R3 = l R3 = R3 = R3 = R3 = Metilo .9 $ 7 z 6 ^ INI 1 INI 2 1N13 INI 4 INI 5 1N21 1N22 1N23 1N2 4 1N25 1N31 1N32 1N33 1N3 4 1N35 1N41 1N42 1N43 1N44 1N45 1N51 1N52 1N53 1N5 4 1N55+Í 1N61 1N62 1N63 1N6 4 1N65 2N11 2N12+Í 2N13 2N14 2N15 2N21 2N22 2N23 2N2 4 2N25 2N31 2N32 2N33 2N3 4 2N35 2N41 2N42 2N43 2N44 2N45 2N51 2N52 2N53 2N54 2N55+Í 2N61 2N62 2N63 2N6 4 2N65 1M11 1M12 1M13 1M14 1M15+Í 1M21 1M22 1M23 1M2 4 1M25+Í 1M31 1M32 1M33 1M3 4 1M35+Í 1M41 1M42 1M43 1M4 4 1M45+Í 1M51 1M52 1M53 1M5 4 1M55 1M61 1M62 1M63 1M6 4 1M65 2M11 2M12 2M13 2M14 2M15 2M21 2M22 2M23 2M2 4 2M25+Í 2M31 2M32 2M33 2M3 4 2M35+Í 2M41 2M42 2M43 2M4 4 2M45+Í 2M51 2M52 2M53 2M54 2M55 2M61 2M62 2M63 2M6 4 2M65+Í 3M11 3M12 3M13 3M14 3M15+Í 3M21 3M22 3M23 3M2 4 3M25 3M31 3M32 3M33 3M3 4 3M35+Í 3M41 3M42 3M43 3M44 3M45+Í 3M51 3M52 3M53 3M54 3M55+Í 202 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 202 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ R3=l Metilo R3 = ,9 R3 = $ R3 = 7 R3 = z 6 3M61 3M62 3M63 3M6 4 3M65+Í para preparar proporcionados
Os detalhes Ηη„ u°s esquemas reaccionais intermediários ou i _ , . , , ..xc, inibidores de MIF sao abaixo.
Esquema reaccional 21
NÉiDMr RUHCHXO w
κι-Ηοβ,α
Todos os compostos que se seguem foram obtidos usando o mesmo procedimento ou procedimentos similares: Composto 1 M21: rendimento 176 mg, 56,56%; Composto 1 M31: rendimento 64 mg, 20,60%; Composto 1 M41: rendimento 110 mg, 35,48%; Composto 1M51: rendimento 139 mg, 44,18%; Composto 1M61: rendimento 88 mg, 28,37%; Composto 2M13 rendimento 144 mg, 38,09%; Composto 2M21: rendimento 113 mg, 36,73%; Composto 2M23: rendimento 137 mg, 36,16%; Composto 2M31: rendimento 27 mg, 8,67%; Composto 2M33: rendimento 141 mg, 37,45%; Composto 2M41: rendimento 72 mg, 23,30%; Composto 2M43: rendimento 117 mg, 31,54%; Composto 2M51: rendimento 65 mg, 21,20%; Composto 2M53 rendimento 91 mg, 24,87%; Composto 2M61: rendimento 113 203 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ mg, 36,94%; Composto 2Μ63: rendimento 127 mg, 33,99%; Composto 3M11: rendimento 58 mg, 19,00%; Composto 3M21: rendimento 134 mg, 43,32%; Composto 3M31: rendimento 117 mg, 37,50%; Composto 3M41: rendimento 141 mg, 45,83%; Composto 3M51 rendimento 119 mg, 38,42%; Composto 3M61: rendimento 142 mg, 45,85%; e Composto 3M63: rendimento 40 mg, 11,00%.
Esquema reaccional 22 tt) >M*kO •Μ-Μ,α
κι·ΚΜο.α
Exemplo 21
Prepararam-se Boc-derivados de ácidos de acordo com o esquema reaccional que se segue. 204 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Esquema reaccional 23
CF/»OH Αν*00(1^βΚ> π ' Γ -- 0 cHC^so^»<e Ντ ^McWWhi «Ao AV-«X1.J6)0(BOC) ρ ggj* Ο- AV-0010
AV-0020
AV-0040 AV-0060
AV-C030
AV-00SQ 0 rendimento e a pureza para os compostos preparados de acordo com o Esquema 25 são fornecidos no Quadro 13.
Quadro 13 AMOSTRA Rendimento, g Rendimento, % Pureza, % CMS AV-0010 25, 0 55 >90 AV-0020 42,0 52 >90 AV-0030 39,0 79 >90 AV-0040 49, 0 86 >90 AV-0050 36,0 82 >90 AV-0060 43,0 88 >90
Exemplo 22
Uma série de inibidores de MIF foi preparada de acordo com os esquemas reaccionais que se sequem. Os reaqentes são abreviados como se seque: DCM - = Diclorometano; DMA =
Dimetilacetamida; DMF = N-Dimetilformamida; HOAc = Ácido 205 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ acético; MeCN = Acetonitrilo; DABCO = Trietilenodiamina; TEBAC = Cloreto de benziltrietilamónio; NMP = l-Metil-2-pirrolidinona; BOC = terc-BuOCO; PPA = Ácido polifosfórico; TFA =Ácido trifluoroacético. 205 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Atórlch lancaster 2000 A uma solução intensivamente agitada de ácido 2-amino-5-metilbenzóico (67,7 g, 0,45 mole) numa mistura de 250 ml de dioxano e 150 ml de tolueno, adicionou-se gota-a-gota uma solução de difosgénio (97,6 g, 0,49 mole) em 80 ml de dioxano. A mistura reaccional foi agitada durante 12 horas e depois disso o precipitado foi retirado por filtração e lavado com éter. O filtrado e as fracções de éter foram combinados e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi titulado com hexano e o precipitado resultante foi retirado por filtração, lavado com hexano e seco à temperatura ambiente durante a noite. Composto 2000: rendimento 66,5 g (84%), pureza 93% (LCMS).
A uma suspensão agitada de NaH (18,9 g, 0,47 mole) em DMA seca, adicionou-se gota-a-gota um éster malónico. A mistura reaccional foi agitada durante 20 min e arrefecida a 30°C. O anidrido isatóico foi adicionado em porções à solução resultante. A mistura reaccional foi aquecida a 130-150°C durante 10 horas e depois disso, a DMA foi retirada por destilação. 0 resíduo foi titulado com água e acidificado usando HC1 a 10% a pH = 3. O precipitado resultante foi retirado por filtração e lavado com água. O material sólido foi colocado num balão cónico de 2 L, adicionou-se 1 L de água e o pH foi ajustado a 12-13 usando K2CO3. A solução resultante foi filtrada e filtrado foi acidificado com HC1 a 206 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 10% a pH = = 2-3. 0 precipitado foi retirado por filtraçao, lavado com éter e cristalizado em dioxano. Composto 2M00: rendimento 23,3 g (24%), pureza; 90% (LCMS). À suspensão de 2M00 (23,0 g, 0,093 mole) em tolueno (40 ml) adicionaram-se 71,3 g de POCI3 (43 ml, 0,465 mole) . A solução resultante foi aquecida sob refluxo durante 1,5 horas. O solvente foi destilado sob pressão reduzida e o óleo residual foi sucessivamente extractado com heptano (controlo por TLC) . As fracções de heptano combinadas foram evaporadas e o resíduo foi aquecido com 200 ml de água e retirado por filtração. Após secagem à temperatura ambiente durante 18 horas, o composto de dicloro obtido foi transferido para um balão de fundo redondo de 250 ml e adicionaram-se-lhe 90 ml de ácido acético e 8,0 g de acetato de amónio. A mistura reaccional foi aquecida sob refluxo durante aprox. 2 h (controlo por LCMS e TLC) . Quando não se conseguia detectar material de partida na mistura reaccional, a solução quente foi vertida em água e o precipitado resultante foi retirado por filtração. O rendimento e a pureza para os compostos preparados de acordo com o esquema acima são fornecidos no Quadro 14.
Quadro 14.
Composto Rendimento, g Rendimento, % Pureza, %LCMS AV-1M00(Cl) 50,00 70 >90 AV-2M00(Cl) 10,96 44 >90 AV-3M00(Cl) 30,00 70 >90
2MOt> 2M00(CI2) 2M00(eq
207 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ Método A: À solução de 2M00 1,0 g (3,77 mmol) em DMA adicionou-se sequencialmente acilpiperazina 0,75 g (4,16 mmol) e DABCO 0,84 g (7,5 mmol). A mistura reaccional foi agitada a 100-120°C durante 15 horas. A reacção foi extinta com solução de NH4C1 a 20% e o precipitado resultante foi retirado por filtração e lavado com água. O produto foi seco em exsicador sobre P2O5 à temperatura ambiente, sob pressão reduzida. O produto foi usado na reacção seguinte sem qualquer outra purificação. Método B: Uma mistura de cloroquinolona 2M00 1,0 g (3,77 mmol), trifluoroacetato de acilpiperazina, AV-0050 1,55 g (4,14 mmol) e DABCO 0,84 g (7,53 mmol) em DMF 3 ml foi agitada a 101°C durante a noite, a mistura foi vertida em 50 ml de salmoura, o sólido obtido foi retirado por filtração, lavado com água, e seco em exsicador sobre P2O5 à temperatura ambiente sob pressão reduzida. 0 produto foi usado na reacção seguinte sem qualquer outra purificação
Os rendimentos dos compostos obtidos são fornecidos no Quadro 15.
Quadro 15
Composto Método Rendimento, g Rendimento, % Pureza, %CMS 1M10 A 1,38 88 >90 1M2 0 A 1,47 90 >90 1M30 A 1,49 89 >90 1M40 A 1,67 95 >90 1M50 A 1,78 94 >90 1M60 A 1,58 91 >90 2M10 A 1,16 75 >90 2M2 0 A 1,22 76 >90 2M30 A 1,24 76 >90 2M40 A 1,34 78 >90 2M50 B 1,83 99 >90 2M60 A 1,31 78 >90 3M10 A 1,05 70 >90 3M2 0 A 1,21 78 >90 208 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Composto Método Rendimento, g Rendimento, % Pureza, %CMS 3M30 A 1,26 79 >90 3M40 A 1, 41 85 >90 3M50 A 1,64 92 >90 3M6 0 A 1,28 78 >90 A suspensão de NaH 0,03 g (0,8 mmol) em DMF seca (1 ml) adicionou-se composto 2M10 0,30 g (0,7 mmol). Após a libertação do gás ter cessado, adicionou-se o benzilbrometo 0,19 g (1,1 mmol). A mistura reaccional foi agitada até não se poderem detectar vestígios de material de partida (controlo por LCMS) . A solução a 20% de NH4C1 (2 ml) foi adicionada à reacção e mistura resultante foi extractada com DCM. O composto 2M12 foi isolado e purificado por HPLC preparativa (Coluna de sílica C-18, 150 mm x 41 mm, 40 ml/min, gradiente: água acetonitrilo = de 60 : 40 a 5 : 95, 20 min). Composto 2M12: rendimento 114 mg (31%), pureza> 99% (HPLC):
Método A: À suspensão de NaH 0,03 g (0,8 mmol) em DMF seca (2 ml) adicionou-se composto 1M60 300 mg (0,7 mmol). Após a libertação do gás ter cessado (-30 min), adicionou-se a solução de dimetilaminocloreto de etilo (2,1 mmol) em éter.
209 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
A mistura reaccional foi aquecida a 100' °C (0 éter foi removido por destilação) durante 12 h. A solução foi arrefecida à temperatura ambiente e PH da mistura foi ajustado a pH 9 com solução a 1% de AcOH em água. A mistura foi extractada com DCM (3 x 3 ml) e As fracçoes de DCM combinadas foram lavadas com salmoura e secas sobre MgS04. 0 DCM foi removido num evaporador rotativo e o produto foi purificado por TLC prep (Sílica gel AnalTech GF, 1000 gm, eluente: CHCI3 : EtOH = 4:1) . Composto 1 M64: rendimento 84 mg (24%), pureza> 99% (HPLC). Método B: A uma suspensão de NaH 0,114 g (2,84 mmol; de dispersão a 60% em óleo mineral) em 3 ml de NMP adicionou-se, em porções, a quinolona 2M50 0,33 g (0,676 mmol). Depois da libertação do gás ter cessado (-30 min), a mistura foi agitada durante 30 min à temperatura ambiente e adicionou-se cloridrato de dimetilaminoetilcloreto 0,195 g (1,35 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 100°C durante a noite. A mistura reaccional foi arrefecida e vertida em água (25 ml) e o sólido obtido foi retirado por filtração, lavado com água e seco a 85°C durante a noite. 0 isómero alvo foi isolado por TLC prep. (Sílica gel AnalTech GF, 1500 gm, eluente: 10% de trietilamina em EtOAc, "lower spot"). Composto 2M54: rendimento 68 mg (18%).
A suspensão de NaH (0,03 g, 0,8 mmol) em DMF seca (2 ml) adicionou-se composto 1 M60 (300 mg, 0,7 mmol). Após a libertação do gás ter cessado (-30 min), adicionou-se a solução de dimetilaminocloreto de etilo (2,1 mmol) em éter. A mistura reaccional foi aquecida a 100°C (o éter foi removido por destilação) durante 12 h. A solução foi arrefecida à temperatura ambiente e o pH da mistura foi ajustado a pH = 9 com uma solução a 1% de AcOH em água. A mistura foi extractada com DCM (3 x 3 ml) e a fracção de DCM combinada foi lavada com salmoura e seca sobre MgS04. O DCM foi 210 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ removido num evaporador rotativo e o produto foi purificado por TLC prep. (Sílica gel AnalTech GF, 1000 gm, eluente: CHCI3 = EtOH = 4:1). Composto 1M64: rendimento 57 mg, pureza> 99% (HPLC). Todos os compostos que se seguem foram obtidos usando o mesmo procedimento ou procedimentos similares: Composto 1M34: rendimento 77 mg, 22,00%; Composto 1M54: rendimento 58 mg, 16,88%; Composto 1M64: rendimento 84 mg, 24,00%; Composto 2M14: rendimento 57 mg, 16,25%; Composto 2M34: rendimento 63 mg, 17,95%; e Composto 2M64: rendimento 42 mg, 12,00%.
Esquema Reaccional 24 Compostos 1 M15...3M65: Todos os compostos listados abaixo foram obtidos usando o procedimento descrito acima para o composto 1M64: Composto 3M15: 36 mg; 13%; Composto 3M65: 5 mg; 1%; Composto 1M65: 31 mg; 9%; Composto 1 M45 : 34 mg; 10%; Composto 1 M55: 51 mg; 15%; Composto 1 M35: 51 mg; 14%; Composto 3M45: 52 mq; 15%; Composto 3M25: 2 4 mg ; / 0 f Composto 3M35: 71 mg; 20%; Composto 3M35i; 16 mg; "i O , Composto 3M15Í; 22 mg; 8%; Composto 1M65Í: 2 0 mg; 6%; Composto 1M45Í: 27 mg; 8%; Composto 1 M35i: 2 8 mg; 8%; Composto 3M65i: 23 mg; 6%. Esquema reaccional 25
»
ti*OH
TyA.
WA
M
ml) 10 À solução de p-toluidina em DCM (100 ml) adicionou-se' g (93,3 mmol) e EtsN (13,6 211 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ OyR-
R: 1) Η: 21 Ma: 1)0 •ζ
NaH DMF
1Μ15...3Μ65 (18 Crtlpdo)
OyR'
gota-a-gota, cloreto de monoetilmalonato (17,72 ml) a 0-5°C (banho de gelo-água). Depois da reacção estar completa (controlo por TLC) a mistura reaccional foi vertida em água (300 ml) e o pH foi ajustado a 2 com HC1 (c.) . A camada orgânica foi separada e a fase aquosa foi extractada com DCM (3 x 50 ml). Os extractos de DCM combinados foram lavados com salmoura (50 ml) e secos sobre sulfato de sódio. 0 DCM foi removido num evaporador rotativo e dissolveu-se um resíduo numa mistura de 600 ml de MeOH e 400 ml de NaOH IN. A mistura reaccional foi aquecida sob refluxo durante 3 horas, arrefecida à temperatura ambiente e acidificada com HC1 2N a pH 2. 0 MeOH foi removido sob pressão reduzida e a água foi extractada com EtOAc (3 x 100 ml). A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca sobre sulfato de sódio e o solvente foi removido sob pressão reduzida. Ao resíduo foram adicionados 40 g de PPA e a mistura foi agitada num agitador magnético e aquecida a 170°C durante 3 horas. A mistura reaccional foi arrefecida à temperatura ambiente e foi lentamente diluída com 500 ml de HC1 IN. 0 pH da solução resultante foi ajustado com uma solução de NaOH a 20% em água a pH 4. O precipitado formado foi retirado por filtração, lavado com água e seco num exsicador em NaOH durante a noite. O rendimento de 05 foi de 13,2 g (81%) . A uma solução de 5-metil-2,4-di-hidroxiquinolina 13,2 g em ácido acético glacial (200 ml) adicionaram-se lentamente 25 ml de HNO3 (63%). A mistura reaccional foi aquecida a 90°C durante 30 min, arrefecida à temperatura ambiente e vertida em água ( 700 ml) . O precipitado formado foi retirado por filtração e lavado com água. O composto obtido foi seco sobre NaOH em exsicador durante a noite. 0 rendimento de 06 foi de 7,68 g (44%). 212 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
01 (ΙΏ) 1 ΝΟΟ A suspensão agitada de di-hidroxiquinolona 01 (50 g) em ácido acético glacial (600 ml) foram adicionados 98 ml de HNO3 (63%). A mistura reaccional foi aquecida a 90°C durante 30 min e arrefecida à temperatura ambiente. 0 precipitado formado foi retirado por filtração e lavado com água (5 x 100 ml) . O composto obtido foi seco sobre P2O5 num exsicador, durante a noite. O rendimento de 1 NOO foi de 52,7 g (82%).
Esquema reaccional 26
A uma solução de anidrido de 5-cloro-isatóico 3000 15 g (75,91 mmol) em DMF (75 ml) adicionou-se carbonato de potássio anidro (8,85 g) e iodeto de metilo 14,46 g (114 mmol). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 18 h e vertida em água com gelo. O precipitado foi retirado por filtração, lavado com água e seco sobre P2O5 num exsicador, durante a noite. Composto 213 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 3001: rendimento 15,3 g (95%), pureza > 90% (LCMS). Composto 3003: rendimento 18,2 g (79%), pureza > 90% (LCMS). Todos os compostos que se seguem foram obtidos usando o mesmo procedimento ou procedimentos similares: Composto 3002: 16,1 g, 74% rendimento, pureza >90% (LCMS); Composto 3003: 18,2 g, 78,5% rendimento, pureza >90% (LCMS)
À solução agitada de nitroacetato de etilo 7,5 ml (68 mmol) em 50 ml de DMF adicionaram-se, em porções, 2,85 g de NaH. Depois da libertação de hidrogénio cessar, a mistura foi aquecida a 80 °C durante 15 min. A solução de anidrido N-met ilisatóico 3001 15 g (71 mmol) em 60 ml de DMF foi adicionada ao longo de um período de 15 min., após o que a reacção foi aquecida a 120°C durante 18 h. O solvente foi removido por destilação, o resíduo dissolvido em água e acidificado com HC1 6 N a pH = 4. O precipitado foi recolhido, lavado com água e seco num exsicador em NaOH durante a noite. Composto 3N01: rendimento 16,6 g (92%), pureza > 90% (LCMS). Composto 3N03: rendimento 18,5 g (89%), pureza> 90% (LCMS). Composto 3N03: rendimento 18,5 g (89%) pureza> 90% (LCMS). 214 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
Esquema reaccional 27 214 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
poci3 α r °
-► TCftA&CHjCN
NO,
3WQ 3H00(Cf) A uma solução de quinolona 3N00 18,8 g (78,1 mmol) e cloreto de trietilbenzilamónio 71 g (312 mmol) em MeOH (290 ml) , adicionou-se POCI3 32 ml (344 mmol) . A mistura foi agitada durante a noite. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi agitado em água (290 ml) durante 3 h. O sólido precipitado foi retirado por filtração, lavado com água, seco, lavado com ciclo-hexano guente, seco e duplamente cristalizado em THF-hexano. Composto 3N00 (Cl): rendimento 5,59 g (28%), pureza > 95% (LCMS).
Uma mistura de cloroquinolona 3NOO(CI) 0,30 g (1,16 mmol), trifluoroacetato de acilpiperazina AV-0050 0,45 g (1,22 mmol) e DABCO 0,26 g (2,32 mmol) em 2 ml de DMF foi agitada durante a noite. Em seguida verteu-se a mistura em água (15 ml), o sólido obtido foi retirado por filtração, lavado com água e seco sobre P2O5 em exsicador, durante a noite. O produto foi usado na reacção seguinte sem gualguer outra purificação. Composto 3N50: rendimento 0,50 g (90%), pureza > 95% (LCMS).
As concretizações preferidas foram descritas relativamente a suas concretizações especificas.
Lisboa, 2010-07-01

Claims (73)

  1. ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 1/25 REIVINDICAÇÕES 1. Composto com uma estrutura:
    ou um estereo-isómero, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde: X é oxigénio; Y é seleccionado de entre o grupo consistindo em -NO2, -C(=0)RS, -C(=0)0R5, e -C(=0)NR5R6; Z é -ch2-, n é 1 ; Ri é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo C1-10, aril (alquilo C1-10) , fenilo, naftilo, heterociclo monocíclico de 5 a 7 membros, e heterociclo policiclico de 7 a 14 membros, onde Ri é não substituído ou substituído com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto; R2 e R3 são seleccionados, independentemente um do outro, de entre o grupo consistindo em halogéneo, hidrogénio, e alquilo C1-10; R4 é seleccionado de entre o grupo consistindo em -CH2R7, -C(=0)NR5R6, -C(=0)0R7 e -C(=0)R7; cada R5 e R6 é seleccionado, independentemente um do outro, de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo Ci-10 e aril (alquilo C1-10); ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo monocíclico de 5 a 7 membros ou um heterociclo policiclico de 7 a 14 membros, onde R5 e R6 são independentemente não substituídos ou substituídos com pelo menos um substituinte seleccionado de ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 2/25 entre ο grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto; R7 é seleccionado de entre o grupo consistindo em alquilo Ci-io, aril (alquilo Ci-io), fenilo, naftilo, heterociclo monociclico de 5 a 7 membros, e heterociclo policiclico de 7 a 14 membros, onde R7 é não substituído ou substituído com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto.
  2. 2. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, ou um estereo-isómero ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde: Y é -N02.
  3. 3. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, ou um estereo-isómero, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde: Y é -C(=0)OCH2CH3.
  4. 4. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, ou um estereo-isómero, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, onde: \
    Λ
  5. 5. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, ou um estereo-isómero, ou um seu sal f armaceut icamente aceitável, onde: \
    OU
  6. 6. Composto com uma estrutura: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 3/25
    ou um estereo-isómero, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde: X é oxigénio; Y é seleccionado de entre o grupo consistindo em -N02, -C(=0)R5, -C(=0)0R5, e -C(=0)NR5R6; Z é -CH2-; n é 1; Ri é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alguilo Ci_i0, aril(alguilo Ci_i0), fenilo, naftilo, heterociclo monociclico de 5 a 7 membros, -NCH2CH2CH2N (CH3) 2 e heterociclo policíclico de 7 a 14 membros, onde Ri é não substituído ou substituído com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto; R2 e R3 são seleccionados, independentemente um do outro, de entre o grupo consistindo em halogéneo, hidrogénio, e alquilo C1-10; R4 é seleccionado de entre o grupo consistindo em -CH2R7, -C(=0)NR5R6, -C(=0)0R7, e -C (=0) R7; cada R5 e R6 é seleccionado, independentemente um do outro, de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo Ci-10 e aril (alquilo C1-10) ; ou R5 e R6, tomados em conjunto com um átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um heterociclo monociclico de 5 a 7 membros ou um heterociclo policíclico de 7 a 14 membros, onde R5 e Rç são independentemente não substituídos ou substituídos com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto; R7 é seleccionado de entre o grupo consistindo em alquilo Ci-10, aril (alquilo Ci_i0) , fenilo, naftilo, ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 4/25 heterociclo monocíclico de 5 a 7 membros, e heterociclo policíclico de 7 a 14 membros, onde R7 é não substituído ou substituído com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialguilamino, e ceto.
  7. 7. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, ou um estereo-isómero, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, onde: Y é -C(=0)OCH2CH3.
  8. 8. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, ou um estereo-isómero, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde: Ri é -NCH2CH2 CH2N(CH3)2.
  9. 9. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, ou um estereo-isómero, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde: Y é -NO2.
  10. 10. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, ou um estereo-isómero, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde: R4 é seleccionado de entre o grupo consistindo em
    0 e
  11. 11. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, onde a estrutura compreende:
    3 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 5/25 onde
  12. 12. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  13. 13. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  14. 14. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  15. 15. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 6/25 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
    onde
  16. 16. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  17. 17. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  18. 18. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 7/25 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
    onde
  19. 19. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  20. 20. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  21. 21. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 8/25 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
    onde
  22. 22. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  23. 23. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  24. 24. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 9/25 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
    onde
  25. 25. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  26. 26. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  27. 27. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 10/25 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
    onde
  28. 28. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  29. 29. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende:
    onde
  30. 30. Composto tal como reivindicado na reivindicação 1, a estrutura compreende: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 11/25
    onde
  31. 31. Composto tal como reivindicado a estrutura compreende: na reivindicação 1,
    onde
  32. 32. Composto tal como reivindicado a estrutura compreende: na reivindicação 1,
    onde
  33. 33. Composto tal como reivindicado a estrutura compreende: na reivindicação 1, ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 12/25
    onde
  34. 34. Composto tal como reivindicado a estrutura compreende: na reivindicação 1,
    onde
  35. 35. Composto tal como reivindicado a estrutura compreende: na reivindicação 6, F O. N.
    CH. ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 13/25 onde
  36. 36. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende:
    onde
  37. 37. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende:
    onde
  38. 38. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 14/25 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
    onde
  39. 39. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende:
    onde
  40. 40. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende:
    ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 15/25 onde
  41. 41. Composto tal como reivindicado a estrutura compreende: na reivindicação 6,
    onde
  42. 42. Composto tal como reivindicado a estrutura compreende: na reivindicação 6,
    onde
  43. 43. Composto tal como reivindicado a estrutura compreende: na reivindicação 6, ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 16/25 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
    onde
  44. 44. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende:
    onde
  45. 45. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 17/25 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
    onde
  46. 46. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende:
    onde
  47. 47. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende:
    \ CH3 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 18/25 onde
  48. 48. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende:
    onde
  49. 49. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende:
    onde
  50. 50. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 19/25 ΕΡ 1 389 110/ΡΤ
    onde
  51. 51. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende:
    ch3 onde
  52. 52. Composto tal como reivindicado na reivindicação 6, a estrutura compreende:
    ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 20/25
  53. 53. Composição que compreende um composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 em combinação com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
  54. 54. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização na redução da actividade de factor inibitório de miqração dos macrófagos num paciente que dele necessite.
  55. 55. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização no tratamento de inflamação num animal de sangue quente.
  56. 56. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização no tratamento de choque séptico num animal de sangue quente.
  57. 57. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização no tratamento de artrite num animal de sangue quente.
  58. 58. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização no tratamento de cancro num animal de sangue quente.
  59. 59. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização no tratamento de síndroma da dificuldade respiratória aguda num animal de sangue quente.
  60. 60. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização no tratamento de uma doença inflamatória num animal de sangue quente. ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 21/25
  61. 61. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização no tratamento de uma doença inflamatória seleccionada de entre o grupo consistindo em artrite reumatóide, osteoartrite, doença inflamatória do intestino e asma.
  62. 62. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização no tratamento de um distúrbio auto-imune num animal de sangue quente.
  63. 63. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização no tratamento de um distúrbio auto-imune seleccionado de entre o grupo consistindo em diabetes, asma e esclerose múltipla.
  64. 64. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização na supressão de uma resposta imune num animal de sangue quente.
  65. 65. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização na diminuição da angiogénese num animal de sangue quente.
  66. 66. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização no tratamento de uma doença associada a niveis elevados de glucocorticóides num animal de sangue quente.
  67. 67. Composto como reivindicado em qualquer uma da reivindicações 1 a 52 ou composição tal como reivindicada na reivindicação 53, para utilização no tratamento de doença de Cushing.
  68. 68. Método in vitro para detectar um agente que modula a actividade de factor inibitório de migração dos macrófagos, compreendendo: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 22/25 contactar uma amostra contendo factor inibitório de migração dos macrófagos com um agente; e detectar a capacidade do agente modular factor inibitório de migração dos macrófagos por determinação de uma capacidade diferencial de um anticorpo ligar factor inibitório de migração dos macrófagos.
  69. 69. Método tal como reivindicado na reivindicação 68, onde o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
  70. 70. Método tal como reivindicado na reivindicação 68 onde factor inibitório de migração dos macrófagos inclui proteínas de fusão, mutantes ou suas variantes.
  71. 71. Método in vitro para utilizar ligação de anticorpo como um marcador clínico para avaliar um agente que modula a actividade de um polipéptido, que compreende: contactar o polipéptido com um agente de modulação suspeito, contactar o polipéptido com um anticorpo monoclonal , e detectar uma actividade diferencial do polipéptido relativamente a um controlo.
  72. 72. Processo para preparar um composto de Fórmula IV compreendendo os passos de: fazer reagir um composto de Fórmula I:
    (Fórmula I) com um composto de Fórmula II: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 23/25
    (Fórmula II) Ν obtendo-se assim um composto de Fórmula III:
    Ri como onde o composto de Fórmula IV é adequado para uso inibidor do factor inibitório de migração dos macrófagos AI V,
  73. 73. Processo para preparar um composto de Fórmula que compreende os passos de: fazer reagir um composto de Fórmula AI:
    com um composto de Fórmula II: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 24/25
    (Fórmula II) obtendo-se assim um composto de Fórmula AIII: O. R 7
    (Fórmula AIII)
    + Ό
    onde R7 é seleccionado de entre o grupo consistindo em alquilo Ci-ιολ aril (alquilo Ci-io), fenilo, naftilo, heterociclo monociclico de 5 a 7 membros, e heterociclo policiclico de 7 a 14 membros, onde R7 é não substituído ou substituído por pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto; e fazer reagir o composto de Fórmula AIII com um composto compreendendo X-R7, onde X é seleccionado de entre o grupo consistindo em Cl, Br, e I, e onde Ri é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, alquilo Ci_io, aril (alquilo Ci-io)f fenilo, naftilo, heterociclo monociclico de 5 a 7 membros, e heterociclo policiclico de 7 a 14 membros, onde Ri é não substituído ou substituído com pelo menos um substituinte seleccionado de entre o grupo consistindo em halogéneo, alcoxi, alquilamino, dialquilamino, e ceto, obtendo-se assim um composto de Fórmula AIV: ΕΡ 1 389 110/ΡΤ 25/25 (X ,η7
    Ò (Fórmula AIV) R1 como onde ο composto de Fórmula AIV é adequado para uso inibidor do factor inibitório de migração dos macrófagos Lisboa, 2010-07-01 EP 1 389 110/PT 1/14 Mecanismo de Acção e Detecção
    EP 1 389 110/PT 2/14 Efeitos de Composto 7e e Seus Análogos Ό
    o o o o o o ò (oiojíuoq ep %) dllfll O o o 1(S o n c Vo co o FIG. 2 EP 1 389 110/PT 3/14
    Composto 7e Inactiva MIF Produzido por Células THP1
    RJ 3 υ <D Ό OQ.E,a> FIG.3 LD —i— o 1 in 1 o —i— m —i— o rO K) cg CN (|lu/6u) EP 1 389 110/PT 4/14 Composto 7e Inactiva MIF em Meios Condicionados
    Tempo de Incubação (hrs) (|ui/6u) dllAI EP 1 389 110/PT Inibição de MIF Induzido por LPS Libertado de Inibição de MIF Induzido por TSST-1 Libertado de Células RAW 264.7 pelo Composto 7e Células RAW 264.7 pelo Composto 7e 5/14
    (OIOJIUOQ ΘΡ %) dlIAI
    1¾
    (oiojiuoo ΘΡ %) dll/\l EP 1 389 110/PT Detecção de Composto 7e em soro de Ratinho 6/14
    (|iu/6u) ojos uie ei FIG.7
    (3S + ueai/y) (|Ul/6u) OJOS UJO 3Z EP 1 389 110/PT 7/14 Correlação entre IL-1(3> em Soro e MIF em Soro
    ιn (O LD _ m o IO N"> o o m O cn cn oo LO ll' CNI < cc σ> c Xa h E ^ 0) ro U.I + CM o ι- Ο II >- O E o o ΙΌ o m o o o in o o CM CM (|lu/6u) {fí O O ma àv-ll
    (|iu/6u) ojos uie jii/\| EP 1 389 110/PT Composto 7e Inibe MIF Induzido por LPS em Ratinhos 8/14
    (|iu/6u) ojos uie JI1A1 EP 1 389 110/PT 9/14 Efeitos Múltiplo de Composto 7e em Citoquinas no Soro
    FIG. 11 (oinojaA ap %) ojos iua $ i--\\ EP 1 389 110/PT Efeito de Composto 7e em Ratinhos Tratados com LPS Avaliação Kaplan-Meier da Sobrevivência 10/14
    o fO O cg _ o eAjieiniuno eioufAmejqos to õ c <tU > > d) £ o (A O T3 O Q. E d) Ι Ο Õ3 c « CL
    o o to o c <tu > o CSl _ O - O eM.ieiniuno ejoueAjASjqos (0 to > £ o Ui Φ Ό O Q. E tu OQ ω c 'cõ0. (N
    o •"ί ο ΙΌ ο CM _ ο to to o s: o c «u > > tuu. n o Ui 0) o o Q. E tu t- tu c Έo. EP 1 389 110/PT 11/14 Efeito Protector de Composto 7e na Toxicidade Induzida por LPS
    co i-H oEH EP 1 389 110/PT 12/14 α o —' •1 * «S £0 Efeito do Composto 7e na Artrite Induzida por Colagénio w _ ã o o ·-a. οι S α o □
    <cc 0 Ό <no 0 T5 O E 0 LL
    0 T3 O 10 ΈΈ 0 i- 0 Q. 0 C 0E 0 Ω. X Uioo o 4-1o 1- FIG. 14 0. EP 1 389 110/PT 13/14 Efeito do Composto 7e no Modelo de Artrite Induzida por Colagénio (CIA) em Ratinhos
    (lues -/+ wui) Bjnssadsg EP 1 389 110/PT Níveis de Citoquina em Ratinhos com CIA 14/14
    0) I"- o í—< (A O O. Ξ o o < o (|iu/Bd) ojos uie jn! ffl ω c 'ίο CL o o L. w c o o VO
    Φ r> o *-< (0 o Ω. ε o o < o (|iu/6u) ojos uie dll/M
    Ph < õ> c 'to0. o o i- c o o
PT02731971T 2001-05-24 2002-05-24 INIBIDORES DE FACTOR INIBITËRIO DE MIGRAÆO DOS MACRËFAGOS E MéTODOS PARA A SUA IDENTIFICAÆO PT1389110E (pt)

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