CZ20033503A3 - Inhibitory faktoru inhibice migrace makrofágů a metoda jejich identifikace - Google Patents

Inhibitory faktoru inhibice migrace makrofágů a metoda jejich identifikace Download PDF

Info

Publication number
CZ20033503A3
CZ20033503A3 CZ20033503A CZ20033503A CZ20033503A3 CZ 20033503 A3 CZ20033503 A3 CZ 20033503A3 CZ 20033503 A CZ20033503 A CZ 20033503A CZ 20033503 A CZ20033503 A CZ 20033503A CZ 20033503 A3 CZ20033503 A3 CZ 20033503A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
substituted
heterocycle
arylalkyl
alkyl
heterocycloalkyl
Prior art date
Application number
CZ20033503A
Other languages
English (en)
Inventor
Gaetaáfedericoác@Áa
Biardáandrew
Anchinájerry
Yingáwenbin
Florkiewiczárobert
Sircarájagadish
Kumarák@Ác@Ásunil
Original Assignee
Avanirápharmaceuticals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Avanirápharmaceuticals filed Critical Avanirápharmaceuticals
Publication of CZ20033503A3 publication Critical patent/CZ20033503A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A61P5/08—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the anterior pituitary hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/46—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones for decreasing, blocking or antagonising the activity of glucocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/38—Nitrogen atoms
    • C07D215/42—Nitrogen atoms attached in position 4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/48—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C07D215/54—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen attached in position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Description

INHIBITORY FAKTORU INHIBICE MIGRACE MAKjOFÁGŮ A METODA JEJICH IDENTIFIKACE
Předmět vynálezu
Tento vynález se obecně vztahuje na inhibitory faktoru inhibice migrace makrofágů (MIF), metody identifikace inhibitorů MIF a způsob léčení nemoci vztahující se k MIF podáváním takových inhibitorů.
Dosavadní stav techniky
Lymfokinin, inhibitor faktoru inhibice migrace makrofágů (MIF), byl identifikován jako mediátor funkce makrofágů v obraně hostitele a jeho exprese korelující s pozdrženou hypersenzitivitou, imunoregulací, záněty, a buněčnou imunitou. Viz Metz a Bucala, Adv. Imunol. 66:197-223,1997. Faktory inhibice migrace makrofágů (MIF), jež mají moiámí hmotnost mezi 12 000 a 13 000, byly identifikovány v některých druzích savců a ptáků, viz například Galat etal., Fed. Eur. Biochem. Soc. 319:223-236,1993; Wistow etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:7522-7526,1989; Bernhagen etal., Nátuře 365:756-79,1993; Blocki etaí, Protein Science 2:2095-2102,1993; a Blocki etal., Nátuře 360:269-270, 1992. Ačkoliv MIF byl nejprve charakterizován svou schopností blokovat migraci makrofágů, zdá se, že MiF působí i na adherenci makrofágů; indukuje makrofágy k exprimaci interleukinu-1-beta, interleukinu-6, a faktoru alfa nekrózy tumoru; reguluje růst HLA-DR; zvyšuje množství syntázy oxidu dusičného a koncentrace oxidu dusičného; a aktivuje makrofágy k zabíjení nádorových buněk Leishmannia donovania inhibuje růst Mycoplasma avium mechanismem odlišným od působnosti interferonu gama. Navfc k jeho potenciálnf roli jako imunoinvazívni molekule MIF může působit jako imunoadjuvans, pokud je dán s hovězím sérovým albuminem nebo HIV gp12O v nekompletních Freundech nebo lipozómech, vyvolávaje indukovanou proliferaci srovnatelnou s kompletními Freundy. MIF také byl popsán jako regulátor hladiny giukokortikoidů a faktor angiogeneze. Jako jeden z mála proteinů, který je indukován a neni inhibován glukokortikoidy, slouží k zesíleni imunosupresívních efektů giukokortikoidů. Na něj jako takový je pohlíženo jako na silný prvek, který reguluje imunosupresívni efekty giukokortikoidů. Proto, jestliže jeho aktivity/genová exprese jsou nadměrně indukovány podáváním nadbytku exogenních giukokortikoidů (například jestliže lékař indikoval potlačení zánětu, imunity a podobně), je • · · · • · • · · · ···· · · · « • ···· · · · · · · ····· • · · · ···· • · · · · ····· · · · zjištěna závažná toxicita, protože MIF sám zhoršuje zánětiivou/imunitní odpověď. Viz Buccala etal., AnnRep. Med. Chem. 33:243-252,1998.
Zatímco o MIF se často myslí, že působí na buňky přes specifický receptor, který na druhé straně aktivuje intracelulární kaskádu, která zahrnuje erk fosforylaci a MAP kinázu a regulaci maticových metaloproteáz, c-jun, c-fos, a IL-1 mRNA (viz Onodera etal., J. Bio!. Chem. 275:444-450,2000), má také endogenní enzymatickou aktivitu, jak je doloženo jeho schopností tautomerizovat vhodné substráty <tj. dopachrom). Zůstává dále nejasné, zda tato enzymatická aktivita zprostředkovává biologickou odpověď na MIF a aktivity tohoto proteinu in vitro a in vivo. Kdežto místně směrovaná mutageneze MIF generovala mutanty, kteří měli plnou vnitřní aktivitu, neměli enzymatickou aktivitu (Hermanowski-Vosatka etal., S/ochem/sfry 38:12841-12849,1999), Swope etal. popsali přímý vztah mezi cytokinovou aktivitou a katalytickým místem pro MIF (Swope et al., EMBO J. 17(13):3534-3541,1998). Podle toho není jasné, že strategie identifikace inhibitorů aktivity MIF přes inhibici samotné tautomerázy dopachromu poskytne inhibitory aktivity MIF klinického významu. Schopnost vyhodnotit inhibici MIF k jeho povrchovému buněčnému receptoru je rovněž omezená, protože v současné době není znám žádný receptor s vysokou afinitou.
Zájem o vývoj inhibitorů MIF se odvozuje od pozorováni, že MIF je znám pro jeho cytokinovou aktivitu koncentrující makrofágy na místech infekce, a imunitu zprostředkovanou buňkami. MIF je navíc znám jako mediátor adherence makrofágů, fagocytózy a tumorcidní aktivity. Viz Weiser et al., J. Imunol, 147:2006-2011,1991. Z tohoto důvodu z inhibice MIF vzniká nepřímá inhibice cytokinů, růstových faktorů, chemokininů a lymfokininů, které makrofágy mohou jinak dopravit na místo zánětu. Lidská MIF cRNA byla izolována z kmene T- buněk, a kóduje protein o molární hmotnosti asi 12 400 se 115 aminokyselinovými zbytky, ze kterého vzniká homotrimer jako aktivní forma (Weiser etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:7255-7526,1989). Zatímco MIF byl původně pozorován v aktivovaných T-buňkách, byla o něm nyní podána zpráva v nejrůznějších tkáních včetně jater, plic, očnich čoček, vaječnicích, mozku, srdci, slezině, ledvinách, svalech a jiných. Viz Takashi etal., Microbiol. Immunol. 43(1):61-67,1999. Další charakteristikou MIF je to, že postrádá tradiční vůdčí sekvenci pro směřování klasické sekrece cestou ER/Golgi.
Inhibitory MIF (a metody pro identifikaci inhibitorů MIF), které působí • ······ neutralizací cytokinové aktivity MIF, představují podstatnou výhodu proti ostatním typům inhibitorů. Například vztah mezi tautomerázovou aktivitou samotnou a zánětlivou odpovědi je kontroverzní. Mimoto inhibitory, které působí intracelulárně, jsou často toxické na základě jejich působení na příbuzné cíle nebo aktivity cílů uvnitř buňky. Inhibitory s malými molekulami komplexu ligandového receptoru je obtížné identifikovat, natož optimalizovat a rozvíjet. Ideální inhibitor cytokinu jako MIF je takový, který mění MIF samotný tak, že když je uvolněn z buňky, je efektivně neutralizován. Malá molekula s touto aktivitou je nadřazená nad protilátkami pro jejich fundamentální rozdíl mezi proteiny a chemikáliemi jako léčivy.
Podstata vynálezu
Když byl MIF identifikován v nejrůznějších tkáních a byl spojen s početnými patologickými stavy, existuje potřeba odborníků identifikovat inhibitory MIF. Objevila se rovněž potřeba farmaceutických kompozic, obsahujících takový inhibitor, stejně jako metod vztahujících se k jejich použití k léčení, například chorob souvisejících s imunitou nebo jiných patologických událostí indukovaných MIF, jako angiogeneze spojená s nádory. Výhodná provedení vynálezu mohou splnit tyto potřeby, a poskytnout rovněž další výhody.
Ve výhodných provedeních mají inhibitory MIF následující obecné vzorce la a Ib:
• φ φφφ φ φφφφ φφφφ
včetně stereoizomerů, prekurzorů, a jejich farmaceuticky přijatelných solí, kde n, Ri, R2,
Ra, R», X, Y a Z jsou definovány níže.
Inhibitory MIF výhodného provedení jsou užitečné při velkém rozsahu terapeutických aplikaci, a mohou být využity pro léčení různých stavů, nemocí a patologických podmínek, včetně, ale ne omezených různými imunitními odpověďmi, růstem nádorů (tj. rakovina prostaty atd.), glomerulonefritidou, záněty, maiarickou anémií, septickým šokem, angiogenezí spojenou s nádory, vitreoretinopatií, psoriázou, odmítnotím transplantovaného štěpu, atopickou dermatitidou, rheumatoidní artritidou, břišními záněty, záněty středního ucha, Crohnovou chorobou, akutním respiračním syndromem, opožděnou přecitlivělostí a dalšími chorobami. Viz Metz a Bucala (výše); Swope and Lolis, Rev. Physioí Biochem. Pharmacol 139:1-32,1999; Waeber etal, Diabetes M. Res. Rev. 15(1):47-54,1999; Nishira, int. J. Mol. Med. 2(1):17-28,1998; Bucala, Ann. N. Y. Acad. Sci. 840:74-82,1998; Bernhagen et al, J. Mot. Med. 76(3-4):151-161,1998; Donnely a Bucala, Moi. Med. Today3(11):502-507,1997; Bucala etal., FASEB J. 10(14):1607-1613, 1996. Tyto metody zahrnují podávání efektivního množství jednoho nebo více inhibitorů MIF zvířeti v případě potřeby, jak je uvedeno ve výhodných provedeních, přednostně ve formě farmaceutické kompozice. Podle toho v jiném provedení jsou farmaceutické kompozice obsahující jeden nebo více inhibitorů MIF z výhodných provedení v kombinaci s farmaceuticky akceptovatelným nosičem, popřípadě ředidlem.
Jedna strategie výhodného provedeni charakterizuje molekuly, které interagují s MIF tak, že indukují konformační změnu v MIF a tím ztrátu imunoreaktivity k monoklonální protilátce. Tato změna, pokud je identifikována screeningem, identifikuje malé molekuly inhibitorů MIF. Tento konkrétní aspekt může být rozšířen na jakékoliv bioaktivní • 44 4 4444 4 444
4444 44 4 444 4 4444
4 44 444·
4444 · 44444 44 · polypeptidy, kde ztráta imunoreaktivity může působit jako náhrada aktivity (tj. Aktivita cytokinů, enzymatická aktivita, aktivita kofaktorů apod.).
V prvním provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo síra; Y je vybráno ze skupiny, zahrnující -NO, -NO2, -C(=O)R5, -C(=O)OR5, -C(=O)NR5R6, -NR5C(=O)R5i -NR5SO2R5i a -S(O)mR5; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2; n je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; Ri je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R’R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R’ a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5, -SR5 a -NR5R6; R< je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7, -C(=O)NR5Re, -C(-O)R7, -C(=O)OR7i a R8; R5 a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; Re je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že R4 není vodík nebo metyl, jestliže R1 je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -C(=O)OCH2CH3; R4 • · • * · • · • · φ · ···· · · · · • φφφφ φ φ φ φφφ φ φφφφ φ φ φφ φφφφ φφφφ φ φφφφφ φφ φ není methyl, když R1 je methyl, R2a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -NO2; R4 není -CH2CH2OH, když Ri je vodík nebo methyl, R2 je je 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a R4 není methyl, když R1 je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3
V druhém provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo síra; Y je vybráno ze skupiny zahrnující -NO, -NO2, -C(=O)RS, -C(=O)OR5, -C(=O)NR5R6, -NR5C(=O)R5, -NR5SO2R5i a -S(O)mR5; Z je -CH2-; m je 0,1 nebo 2; n je 1;
R1 je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylaikyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R'R“N(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R’ a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5, -SRs a -NR5R6; R4 je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7, -C(=O)NR5Re, -<X=O)R7, -C(=O)OR7, a R^ R5 a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; Re je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že Rt není vodík nebo • · · · • 44 4 · 4 · · ·
4·· 4 4444 4 444
4444 444 4444 4444 • · 44 4444
4444 4 44444 44 4 metyl, jestliže Ri je fenyl, R2 a Ra jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -C(=O)OCH2CH3; R4 není methyl, když R1 je methyl, R2a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -NO2; R4 není -CH2CH2OH, když R1 je vodík nebo methyl, R2 je je 7-chlor, Rs je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a R4 není methyl, když R1 je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3
Se zřetelem na druhé provedení, X je kyslík; nebo Y je -C(=O)OCH2CH3; nebo Y je -NO2; nebo R4 je
Ve třetím provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo síra; Y je -NO2; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2; n je 0,1, nebo 2, za podmínky, že n je O, Z je -C(=0)-; R1 je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R’R“N(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5, -SR5 a -NRsRe! R4 je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7, -C^OJNRsRe, -C(=O)R7, -C(=O)OR7, a Rs ’, R5 a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo Rs a R6 společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoři heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je ··« 0 0 0 0 0 0 000 0 0000 00 0 000 · 0···
0 00 0 0 0 0 0000 0 00*00 00 0 vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; Re je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že R4 není methyl, když R1 je methyl, R2 a Rs jsou oba vodík, X je kyslík a Y je -NO2
Se zřetelem na třetí provedení, X je kyslík; nebo Z je -CH2- a n je 1; nebo R4 je
Ve čtvrtém provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo síra; Y je -C(=O)OCH2CH3; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2; n je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; Rí je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R’R“N(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5, -SR5 a -NRsR6; R4 je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)R7, -C(=O)OR7, a R8; Rs a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; Rs je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že R4 není vodík nebo metyl, jestliže R1 je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Z je -0(=Ο)Ο0Η20Η3; R4 není methyl, když R1 je methyl, R2 a R3 jsou oba vodík, a X je kyslík; R4 není -CH2CH2OH, když R1 je vodík nebo methyl, R2 je je 7-chlor, R3 je vodík, a X je kyslík; a R4 není methyl, když R1 je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, a X je kyslík
Se zřetelem na čtvrté provedeni, X je kyslík; nebo Z je -CH2a n je 1; nebo R4 je
nebo o
nebo nebo o
V pátém provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo síra; Y je vybráno ze skupiny, která zahrnuje -NO, -NO2, -C(=O)R5, -C(=O)OR5, -C^OJNRsRe, -NR5C(=O)R5, -NR5SO2R5, a -S(O)mRs; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; mje 0,1 nebo 2; n je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; R1 je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R'RN(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R’ a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny ·· · • · · • · · • 11·· ·
1
1··· · • · ·
• · • · · • ··*<
zahrnující halogen, -R5, -OR5, -SRs a -NR5R6; R4 je ?Ά
R5 a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl.
Se zřetelem na páté provedení, X je kyslík; nebo Z je -CH2 a n je 1; nebo Y je -C (=O)OCH2CH3; nebo Y je -NO2.
V šestém provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo sira; Y je vybráno ze skupiny, která zahrnuje -NO, -NO2, -C(=O)R5, -C(=O)OR5, ~C(=O)NR5R6, -NR5C(=O)R5i -NR5SO2R5, a -S(O)mR5; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2; n je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; R1 je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R'R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R’ a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5, -SR5 a -NR5R6; R4 je
O;
nebo
O;
4
Z · · 4 4 444 4 4 4 4
4444 · 4 · · · · · ··?·
4 ·· * * * í
999· · ·· ·«· ·· *
R5 a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl
Se zřetelem na šesté provedení, X je kyslík; nebo Z je -CH2a n je 1; nebo Y je -C(=O)OCH2CH3; nebo Y je -NO2.
V sedmém provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekuizor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík; Y je vybráno ze skupiny, která zahrnuje -NO, -NO2, -C(=O)R5, -C(=O)OR5, -C(=O)NRsR6, -NR5C(=O)R5, -NR5SO2R5i a -S(O)mR5; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; mje 0,1 nebo 2; n je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; Ri je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R'R“N(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5, -SR5 a -NR5R6; Rí je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7i -C(=O)NR5R6, -C(=O)R7i -C(=O)OR7j a R8; R5 a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo Rs a Re společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný
4 4 • · ·· · • 4 arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloaikyl a substituovaný heterocykloalkyl; Re je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že R4 není vodík nebo metyl, jestliže R1 je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -C(=O)OCH2CH3; R4 není methyl, když R1 je methyl, R2a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -NO2; R4 není -CH2CH2OH, když R1 je vodík nebo methyl, R2 je je 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík, a Y je -C(=O)OCH2CH3; a R4 není methyl, když Ri je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, Rs je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3,
Se zřetelem na osmé provedení, Z je -CH2- a n je 1; nebo Y je -C(=O)OCH2CH3 nebo Y je -NO2; nebo R4 je
V osmém provedení má sloučenina strukturu shodnou s prvním provedením v kombinaci s farmaceuticky akceptovatelným nosičem nebo ředidlem.
V devátém provedení se jedná o metodu snížení aktivity MIF pacienta, jestliže je taková potřeba, zahrnující podání pacientovi efektivního množství sloučeniny mající strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo sira; Y je vybráno ze skupiny, která zahrnuje -NO, -NO2, -C(=O)RS, -C(-O)OR5, -C^OJNRsRe, -NR5C(=O)R5, -NR5SO2R5i a -S(O)mR5; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0, 1 nebo 2; n je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; Ri je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný ··· ······ · · · φφφ φφφ φφφ
9 9 · ΦΦΦΦ Φ ΦΦΦ • ···· · * · · · · ····· • · ·· · · · · ···· * ·» ··· ·· · arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R‘R“N(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5, -SRs a -NR5R6; R4 je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7 -C(=O)NR5Re, -C(=O)RZ, -C(=O)OR7, a R8; R5 a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; Rs je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že R4 není vodík nebo metyl, jestliže R1 je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -C(=O)OCH2CH3; R4 není methyl, když R1 je methyl, R2a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -NO2; R4 není -CH2CH2OH, když R1 je vodík nebo methyl, R2 je je 7-chlor, Rs je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a R4 není methyl, když R1 je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, Rs je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3
V desátém provedení se jedná o metodu léčení zánětů u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle prvního provedení zvířeti.
V jedenáctém provedení se jedná o metodu léčení septického šoku u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle prvního provedení zvířeti.
Ve dvanáctém provedení se jedná o metodu léčení artritidy u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle prvního provedení zvířeti.
Ve třináctém provedení se jedná o metodu léčení rakoviny u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle prvního provedení zvířeti.
• · • ft ft • ftft ftftft · · • ······ · • · · · •ftftft · *· • ft · • · • ftftft • ft · · ftftftft • ftftft
Ve čtrnáctém provedení se jedná o metodu léčení akutního respiračního syndromu u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle prvního provedení zvířeti.
V patnáctém provedení se jedná o metodu léčení zánětlivého onemocnění u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle prvního provedení zvířeti. Se zřetelem na patnácté provedení, zánětlivé onemocnění může zahrnovat reumatoidní artritidu, osteoartritidu, zánětlivé onemocnění střev a astma.
V šestnáctém provedení se jedná o metodu léčení autoimunních onemocnění u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle prvního provedení zvířeti. Se zřetelem na šestnácté provedení, autoimunní onemocnění může zahrnovat diabetes, astma, a sklerózu multiplex.
V sedmnáctém provedení se jedná o metodu potlačení imunitní odpovědi u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle prvního provedení zvířeti.
V osmnáctém provedení se jedná o metodu snížení angiogeneze šoku u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle prvního provedení zvířeti.
V devatenáctém provedení se jedná o metodu léčení nemoci spojené s nadměrnou hladinou glukokortikoidů u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle prvního provedení zvířeti. Se zřetelem na devatenácté provedení je nemocí Cushingova choroba.
Ve dvacátém provedení se jedná o metodu detekce účinné látky modulující aktivitu MIF, včetně kontaktování vzorku obsahujícího MIF a účinnou látku; a detekci schopnosti účinné látky modulovat MIF určením diferenciální schopnosti protilátky vázat se na MIF. Se zřetelem na dvacáté provedení MIF zahrnuje fúzní proteiny, mutanty nebo varianty MIF.
Ve dvacátém prvním provedení se jedná o metodu použití protilátky k navázání jako náhradního markéru pro screening aktivní látky, která moduluje aktivitu polypeptidů,
4
4 4
4444 • ···<
4
4 včetně kontaktování polypeptidů s domnělou modulující aktivní látkou, kontaktování polypeptidů s monoklonální protilátkou, a detekce diferenciální aktivity polypeptidů vzhledem ke kontrole.
Ve dvacátém druhém provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo síra; Y je vybráno ze skupiny, která zahrnuje -NO, -NO2, -C(=O)R5, -C(=O)ORS, -C(=O)NR5R6, -NR5C(=O)R5i -NR5SO2R5, a -S(O)mR5; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2; n je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; Ri je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryi, arylalkyi, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R'R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R’ a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5, -SR5 a -NR5R6; R4 je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)R7i -C(=O)OR7i a R8; Rs a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a Re společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnujíc! alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; R8 je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že: R4 není vodík nebo metyl, jestliže R1 je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -C(=O)OCH2CH3; R4 ·· ·♦··
Φ ·
Φ
Φ Φ Φ
Φ Φ Φ • ····
Φ Φ
ΦΦ·· Φ
·· Φ Φ Φ · • Φ Φ Φ • Φ ΦΦΦ·
Φ Φ Φ
ΦΦ Φ není methyl, když Ri je methyl, R2a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -NO2; R4 není -CH2CH2OH, když Ri je vodík nebo methyl, R2 je je 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a R4 není methyl, když Ri je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3
Ve dvacátém třetím provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo síra; Y je vybráno ze skupiny, která zahrnuje -NO, -NO2, -C(=O)R5, -C(=O)OR5, -C(=O)NR5Re, -NR5C(=O)R5, -NR5SO2R5i a -S(O)mR5; Z je -CH2-; m je 0,1 nebo 2; π je 1; Ri je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R'R“N(CH2)x-. kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5) -OR5, -SR5 a -NR5R6; Rt je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7, -C(=O)NRGRe, -C(=O)R7, -C(=O)OR7i a R8; R5 a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; Re je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že Rt není vodík nebo · 44 ···· 44 · • · 4 ··· 4 4 4 • 4 4 4 4 4«4 4 4 4 · • 4444 44 4 · 4 4 4·♦·· • « 44 4444 ···< 4 44 444 44 4 metyl, jestliže Ri je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -C(=O)OCH2CH3; R4 není methyl, když R1 je methyl, R2a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -NO2; Rt není -CH2CH2OH, když R1 je vodík nebo methyl, R2 je je 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a R4 není methyl, když R1 je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3
Se zřetelem k dvacátému třetímu provedení, Ri je nebo
X je kyslík; nebo Y je -C(=O)OCH2CH3; nebo Y je -NO2; nebo R4 je
Ve dvacátém čtvrtém provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo síra; Y je -C(=O)OCH2CH3; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2; π je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; R1 je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R'R“N(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a 1¾ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5, -SR5 a -NR5Re; R4 je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7, -C(=O)NRsR6, -C(=O)R7, -C(=O)OR7, a R8; R5 a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společně s dusíkovým
9 9999 • · atomem, ke kterému jsou pňpojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; R8 je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že: R4 není vodík nebo metyl, jestliže Ri je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík a X je kyslík; R4 není -CH2CH2OH, když Ri je vodík nebo methyl, R2 je je 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík; a R4 není methyl, když R1 je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík
Se zřetelem k dvacátému čtvrtému provedení, X je kyslík; nebo Z je -CH2- a n je 1; nebo R4 je
O:
nebo o;
nebo nebo O;
Ve dvacátém pátém provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo síra; Y je vybráno ze skupiny, která zahrnuje -NO, -NO2, -C(=O)R5, -C(=O)OR5, -C(=O)NRSR6, -NR5C(=O)R5, -NR5SO2R5i a -S(O)mR5; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; roje 0,1 nebo 2; n je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; R1 je -NCH2CH2CH2N(CH3)2; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -ORs, -SR5 a -NRsRe', R» je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)R7, -C(=O)OR7, a R8; R5 a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společné s dusíkovým • · · · · · · ··· · · · · «······ · · · · : ···· .:.. : ·..* :
atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoři heterocykl nebo substituovaný heterocyki; R7 je vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; Re je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl.
Se zřetelem k dvacátému pátému provedení, Z je-CH2- a n je 1; nebo Y je -C(=O)OCH2CH3; nebo Y je -NO2; nebo R4 je
Z nebo
nebo nebo O;
Ve dvacátém šestém provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo síra; Y je -NO2; Z je -CHz- nebo -C(=O)-; zn je 0,1 nebo 2; z? je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; R1 je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R'R“N(CH2)x~, kde x je 2 až 4, a kde R’ a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a Ra jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5, -SR5 a -NRsRe! Ra je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)R7, -C(=O)OR7, a Rg; Rs a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnujíc! vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, . . · · · · ··· • · · · ···· · ··· • ······ · ··· ····· • · ·· ····
.... . ·· ··· ·· * heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylaikyl, substituovaný arylaikyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; Rs je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylaikyl, substituovaný arylaikyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že: R4 není vodík nebo metyl, jestliže R1 je methyl, R2a R3 jsou oba vodík, X je kyslík.
Se zřetelem k dvacátému šestému provedení, R1 je -NCH2CH2CH2N(CH3)2; nebo X je kyslík; nebo Z je -CH2- a n je 1; nebo R4 je
Ve dvacátém sedmém provedení má sloučenina strukturu:
nebo stereoizomer, prekurzor, nebo její farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde X je kyslík nebo síra; Y je vybráno ze skupiny, která zahrnuje -NO, -NO2, -C(=O)R5, -C(=O)OR5, -C(=O)NR5R6, -NR5C(=O)R5, -NR5SO2R5i a -S(O)mR5; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2; n je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; R1 je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylaikyl, substituovaný arylaikyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R’R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R’ a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylaikyl, substituovaný arylaikyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5, -SR5 a -NR5R6; R4 je vybráno ze skupiny, zahrnující
Rs a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný ary,alkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; Re je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl.
Se zřetelem k dvacátému sedmému provedení, R1 je -NCH2CH2CH2N(CH3)2; nebo X je kyslík; nebo Z je -CH2- a n je 1; nebo Y je -C(=O)OCH2CH3; nebo Y je -NO2
Ve dvacátém osmém provedení se jedná o metodu omezení aktivity MIF v případě takové potřeby u pacienta, včetně podání pacientovi efektivního množství sloučeniny mající strukturu:
nebo stereoizomeru, prekurzoru, nebo její farmaceuticky akceptovatelné soli, kde X je kyslík nebo síra; Y je vybráno ze skupiny, která zahrnuje -NO, -NO2, -C(=O)R5, -C(=O)OR5,
-C(=O)NR5R6, -NR5C(=O)R6, -NR5SO2R5, a -S(O)mR5; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 • · nebo 2; n je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; R, je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R'R,‘N(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl; R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5> -SRs a -NR5R6; R4 je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7l -C(=O)NR5R6, -C(=O)R7, -C(=O)OR7i a R8; R5 a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; Re je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že R4 není vodík nebo metyl, jestliže R1 je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -C(=O)OCH2CH3; R4 není methyl, když R1 je methyl, R2a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -NO2; R4 není -CH2CH2OH, když R1 je vodík nebo methyl, R2 je je 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a R4 není methyl, když R1 je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3
V dvacátém devátém provedení se jedná o metodu léčení zánětů u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle prvního provedení zvířeti.
Ve třicátém provedení se jedná o metodu léčení septického šoku u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle dvacátého osmého provedení zvířeti.
Ve třicátém prvním provedení se jedná o metodu léčení artritidy u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle dvacátého osmého provedení zvířeti.
4·· <
• ·
4 4
4444
Ve třicátém druhém provedení se jedná o metodu léčení rakoviny u teplokrevných zvířat, zahrnujicf podání efektivního množství sloučeniny podle dvacátého osmého provedení zvířeti.
Ve třicátém třetím provedení se jedná o metodu léčení akutního respiračního syndromu u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle dvacátého osmého provedení zvířeti.
Ve třicátém čtvrtém provedení se jedná o metodu léčení zánětlivého onemocnění u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle dvacátého osmého provedení zvířeti. Se zřetelem na patnácté provedení, zánětlivé onemocnění může zahrnovat reumatoidní artritidu, osteoartritidu, zánětlivé onemocněni střev a astma.
Ve třicátém pátém provedení se jedná o metodu léčení autoimunních onemocnění u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle dvacátého osmého provedení zvířeti. Se zřetelem na šestnácté provedení, autoimunní onemocnění může zahrnovat diabetes, astma a sklerózu multiplex.
Ve třicátém šestém provedení se jedná o metodu potlačení imunitní odpovědi u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle dvacátého osmého provedení zvířeti.
Ve třicátém sedmém provedení se jedná o metodu snížení angiogeneze u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle dvacátého osmého provedení zvířeti.
Ve třicátém osmém provedení se jedná o metodu léčení nemoci spojené s nadměrnou hladinou glukokortikoidů u teplokrevných zvířat, zahrnující podání efektivního množství sloučeniny podle dvacátého osmého provedení zvířeti. Se zřetelem na devatenácté provedení je nemocí Gushingova choroba.
Ve třicátém devátém provedení se jedná o metodu přípravy sloučeniny, zahrnující kroky reagování sloučeniny vzorce I:
se sloučeninou vzorce II:
o.
R3 (vzorec II)
N čímž vznikne sloučenina vzorce III:
kde R3 včetně R4 je vybráno ze skupiny zahrnující aminoskupinu, monosubstituovanou aminoskupinu, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; a reakci sloučeniny vzorce IH se sloučeninou X-Ri, kde X je vybráno ze skupiny zahrnující Cl, Br a I, a kde R> je vybráno ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R’R“N(CH2)x-, kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl, kde x je 2 až 4, čímž • · ··*· • · · • · · • ···« • · • · · · · vznikne sloučenina vzorce IV:
CK ^R·,
'N O
(vzorec IV)
R4 kde sloučenina vzorce IV je vhodná jako inhibitor MIF.
Se zřetelem na třicáté deváté provedení, Rt je ?Λ nebo o. A / nebo
Z nebo
Ve čtyřicátém provedení se jedná o přípravu sloučeniny, zahrnující kroky reakce sloučeniny vzorce AI:
(vzorec Al):
-N.
(vzorec II)
Ί\Γ čímž vznikne sloučenina vzorce AlII:
«· ···· ·» · ·· ·
kde R3 včetně R4 je vybráno ze skupiny zahrnující aminoskupinu, monosubstituovanou aminoskupinu, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; a reakci sloučeniny vzorce AIH se sloučeninou X-R4, kde X je vybráno ze skupiny zahrnující Cl, Br a I, a kde R< je vybráno ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R'R“N(CH2)x-, kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl, kde x je 2 až 4, čímž vznikne sloučenina vzorce AIV:
ck /R3
o (vzorec AIV) ·· 1 ·
• ·
kde sloučenina vzorce AIV ie vhodná jako inhibitor MIF. Vzhledem ke čtyřicátému provedení, R4 je
O
Z nebo o
nebo °
Ve čtyřicátém prvním provedení se jedná o farmaceutickou kompozici pro léčení nemoci nebo stavu, kde je MIF patogenní, farmaceutická kompozice zahrnuje sloučeninu inhibující MIF a lék pro léčení nemoci nebo stavu, kde lék nemá měřitelnou aktivitu inhibující MIF.
Ve čtyřicátém druhém provedení se jedná o farmaceutickou kompozici pro léčeni nemoci nebo stavu, kde je MIF patogenní, farmaceutická kompozice zahrnuje sloučeninu inhibující MIF a lék vybraný ze skupiny, skládající se z nesteroidních protizánětlivých léčiv, antiinfekčnlch léčiv, β-stimulantů, steroidů, antihistaminik, protirakovinných léčiv, antiastmatických léčiv, léčiv proti sepsi, proti artritidě a imunosupresívnfch léčiv.
Tyto a další provedení a jejich aspekty budou zřejmé podle následujícího detailního popisu. S tím cílem jsou v tomto dokumentu udány různé reference, které popisují ve více detailech určité procedury, sloučeniny a/nebo kompozice, a jsou tím začleněny odkazy ve své celosti.
Stručný popis obrázků
Obrázky 1A a 1B jsou skenované obrázky autoradiogramu, ukazujícího imunoprecipitaci protilátky s monoklonálni protilátkou anti-MIF (obrázek 1A) a polyklonálním sérem anti-MIF (obrázek 1B) v extraktech cytosolu (C), stejně jako kondicionovaného média (M) buněk THP-1, který vznikl stimulací LPS a ošetřením různými mikromolárními koncentracemi sloučeniny 7e. Rovněž jsou znázorněny výsledky tautomerázové aktivity, detekované v různých frakcích. Znaménka plus indikují tautomerázovou aktivitu, minus žádnou detekovatelnou aktivitu, a znaménka +/- indikuji částečnou aktivitu.
Obrázek 2 jsou graficky znázorněné výsledky enzymatické imunosorpční • 4 4 • · · • ···· ·
• 444 · metody ELISA po působení pěti analogů nárokované kompozice na buňky THP-1 stimulované LPS. Je znázorněna schopnost každého analogu inhibovat navázání monoklonální protilátky a je závislá na dávce.
Obrázek 3 je grafickým znázorněním imunoreaktivity MIF v kondicionovaném médiu použitím metody ELISA po stimulaci buněk THP-1 pomocí LPS a přidání 10 μΜ sloučeniny 7e v různých časech během kultivace. Na tomto obrázku se LPS přidalo v čase nula, zatímco sloučenina 7e se přidala 0, 2,4, a 6 hodin po působení LPS. Do tohoto experimentu bylo začleněno šest skupin buněk THP1, všechny kultivované ve standardním médiu. Na začátku experimentu byl přidán pufr pouze k buňkám skupiny 1 a pufr obsahující sloučeninu 7e byl přidán k buňkám skupiny 2. Sloučenina 7e v pufru se přidala ke každé další skupině v různých časech poté, ke skupině 3 po 2 hodinách, ke skupině 4 po 4 hodinách, ke skupině 5 po 6 hodinách a ke skupině 6 po 22 hodinách. V indikovaných časech po přidání pufru nebo pufru a testované látky se odebraly vzorky každé skupiny a testovaly se na detekovatelné hodnoty MIF za použití monoklonální protilátky anti-MIF. Za nepřítomnosti sloučeniny (skupina 1) hladina detekovatelného MIF rostla v průběhu doby experimentu. Za přítomnosti sloučeniny je detekce MIF blokována.
Obrázek 4 je grafickým znázorněním experimentu založeného na metodě ELISA po působení sloučeniny 7e na detekci MIF. V tomto návrhu experimentu je testovaný vzorek prekondiciované buněčné médium, vyčištěné od částí buněk. Počáteční koncentrace MIF v testovaném vzorku byla kalkulována přibližně na 22 ng/ml. Sloučenina se přidala v různých časech po počátku kultivace při 37 *C. Každý vzorek se poté inkuboval dalších 30 minut předtím, než byla znovu určena detekovatelná hladina MIF.
Obrázek 5 je sloupcový graf představující relativní procento MIF, přítomného v kondiciovaném médiu z buněk RAW 264.7, idukovaných LPS a ošetřených sloučeninou 7e, ve srovnáni s kontrolními buňkami, které nebyly ošetřeny, měřeno metodou ELISA. Horní panel ukazuje Western blot těchže frakcí, které byly měřeny metodou ELISA na spodním panelu.
Obrázek 6 je sloupcový graf představující procento MIF, přítomného v kondiciovaném médiu z buněk RAW 264.7, idukovaných TSST-1 a ošetřených sloučeninou 7e ve srovnání s kontrolními buňkami, které nebyly ošetřeny, měřeno metodou ELISA. Horní panel ukazuje Western blot těchže frakcí, které byly měřeny metodou ELISA na spodním panelu.
φφ ΦΦΦ· » φ · • · · · · φ φφφφ φ φ • ΦΦΦ φ
φ« φφ >
Obrázky 7Α a 7Β jsou grafickými znázorněními detekce sloučeniny 7e v myším séru pomocí HPLC po intraperitonální injekci sloučeniny 7e (obrázek 7A) a orálním podání 20 mg sloučeniny 7e (obrázek 7B). Výsledky jsou znázorněny jako střední +/- SEM (N=5).
Obrázek 8 je grafickým znázorněním detekce uvolňováni v myším séru pomocí ELISA po stimulaci LPS/glaktosaminem. Výsledky jsou znázorněny jako střední +/- SEM (N=5).
Obrázky 9A a 9B graficky znázorňují data ELISA koncentrace sérového MIF v ng/ml pět hodin po podání 10 mg/kg ce LPS (obrázek 9A) a nebo MIF normalizovaného séra čtyři hodiny po stimulaci 5 mg/kg LPS (obrázek 9B) v přítomnosti nebo nepřítomnosti sloučeniny 7e (0,4 mg/20 g myš).
Obrázek 10 je grafickým znázorněním měření ELISA, demonstrujícím korelaci mezi sérovými hladinami IL-1 β v pg/mi proti sérovému MIF (ng/ml) pět hodin po po stimulaci samic myší Baib/c LPS/galaktosaminem.
Obrázky 11A a 11B jsou sloupcové grafy, ukazujíc! detekci IL-1 β a TNF-a metodou ELISA čtyři hodiny po stimulaci LPS (5 mg/kg) a přítomnosti nebo nepřítomnosti 20 mg/kg tělesné hmotnosti sloučeniny 7e (i.p.).
Obrázky 12A až 12C znázorňují kumulativní přežití proti době přežití (hodiny) (Kaplan-Maierovo hodnocení přežití) pro myši Balb/c po i.p. dávce 20 mg/kg sloučeniny 7e nebo kontrolního prostředku v čase ošetření LPS 2 mg/kg (obrázek 12A), 5 mg/kg (12B), nebo 10 mg/kg (obrázek 12C) a D-galaktosaminem (50 mg/kg). Každý experiment zahrnoval třicet myší s patnácti, které dostaly kontrolní prostředek a patnácti, které dostaly předmětnou sloučeninu.
Obrázek 13 je graf ilustrující dobu přežití 25 % myší proti koncentraci LPS (mg; Sigma 055:B5) a D-galaktosaminu (50 mg/kg) za přítomnosti nebo nepřítomnosti sloučeniny 7e (20 mg/kg tělesné hmotnosti). Data představují průměr šesti pokusů, v každém bylo použito třicet myší.
Obrázek 14 představuje experimentální protokol pro testování inhibitorů MIF pro inhibici artritidy v myším modelu artritidy indukované kolagenem. Sloučenina 7e byla ·· ···· • · • ··· ·· · v · · • · * <* ···· • · ···· ·
«4 *
4 · • · · · • · ····· • · · • 4 · podávána dvakrát denně po dobu čtyř dní.
Obrázek 15 je sloupcový graf, ilustrující kalibrační měření tloušťky tlapky jako reprezentace edému tlapky 74. den. Hodnoty jsou vyjádřeny jako střední +/- SEM pro deset zvířat na skupinu.
Obrázky 16A a 16B jsou sloupcové grafy, znázorňující hladiny MIF (obrázek 16A) a TNF (obrázek 16B) v séru myší s artritidou vyvolanou kolagenem, měřeno metodou ELISA. Hodnoty jsou vyjádřeny jako střední +/- SEM pro sedm zvířat. Kontrola jsou myši neošetřené kolagenem nebo předmětnou sloučeninou, CIA jsou myši s artritidou vyvolanou kolagenem, a označení „sloučenina 7e“ jsou ošetřené CIA myši.
Detailní popis výhodného provedení
Následující popis a příklady ilustrují výhodné provedení předmětného vynálezu v detailu. Odborník v oboru pozná, že jsou četné varianty a modifikace vynálezu, které jsou zahrnuty v tomto rámci. Podle toho popis výhodného provedení nemá být považován za omezení rámce předmětného provedení.
Zde jsou určité definice jako pomůcka k porozumění výhodných provedení.
Termín „aktivita MIF“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v jeho obvyklém smyslu, včetně, ale bez omezeni, odkazu na aktivitu nebo efekt zprostředkovaný alespoň částečně inhibičním faktorem migrace makrofágů. V tom smyslu aktivita MIF zahrnuje, ale není na to omezena, inhibici migrace makrofágů, tautomerázovou aktivitu (tj. za použití fenylpyruvátu nebo dopachromu) šok indukovaný endotoxiny, záněty, regulaci hladiny glukokorttikoidů, inhibici inkorporace thymidinu do fibroblastů 3T3, indukci fosfory,ace erk a kinázovou aktivitu MAP.
Termín „export“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na metabolicky aktivní proces transportu přeměněných buněčných produktů k buněčné membráně nebo do mezibuněčného prostoru mechanizmem jiným, než je standardní sekrece řízená vůdčí sekvencí prostřednictvím kanonické vůdčí sekvence, a který může a nemusí být závislý na energii. Dále „export“, na rozdíl od sekrece, která je závislá na vůdčí sekvenci, je rezistentní vůči •'» brefeldinu A (tj. exportovaný protein není transportovaný prostřednictvím ER/Golgi; od brefeldinu A očekává se, že nebude mít přímý efekt na zacházení s exportovaným proteinem) a vůči ostatním podobným sloučeninám. Tak jak je použit zde, „export“ se může rovněž vztahovat na „neklasickou sekreci“.
Termín „bezvůdčí protein“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na protein nebo polypeptid, který postrádá kanonickou vůdčí sekvenci, a je exportován zevnitř buňky do mezibuněčného prostředí. Bezvůdčí protein v mezibuněčném prostředí se vztahuje k proteinům v mezibuněčném prostředí, nebo asociovaným s vnějším povrchem buněčné membrány.
V kontextu výhodných provedení bezvůdčí protein zahrnuje přirozeně se vyskytující proteiny, jako faktor inhibice migrace makrofágů a jeho fragmenty, stejně jako proteiny, které jsou zkonstruovány tak, že postrádají vůdčí sekvenci a jsou exportovány, nebo proteiny zkonstruované tak, že zahrnují fúzi bezvůdčího proteinu, nebo jeho frakce, s jiným proteinem.
Termín „inhibitor“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na molekulu (tj. přírodní nebo syntetickou sloučeninu), která může měnit konformaci MIF a/nebo konkurovat monoklonálni protilátce pro MIF a snižovat nejméně jednu aktivitu MIF nebo export z buňky ve srovnání s aktivitou nebo exportem bez přítomnosti inhibitoru. Jinými slovy „inhibitor“ mění konformaci a/nebo aktivitu a/nebo export, jestliže je statisticky významná změna ve změřeném množství MIF, aktivitě MIF nebo v extrabuněčně a/nebo nitrobuněčně detekovaném proteinu MIF v kvantitativním rozboru provedeném s inhibitorem ve srovnání s rozborem provedeném bez inhibitoru.
Termín „vazebné činidlo“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na jakoukoliv molekulu, která se váže na MIF, včetně inhibitorů.
Všeobecně vzato, inhibitory MIF inhibují fyziologickou funkci MIF a proto jsou užitečné při léčení chorob, kde MIF může být patogenní.
V jistých výhodných provedeních se jedná o inhibitory MIF, které mají následující strukturu la a Ib:
(Ib) nebo stereoizomery, prekuizory, nebo jejich farmaceuticky akceptovatelné soli, kde X je kyslík nebo síra; Y je vybráno ze skupiny, která zahrnuje -NO, -NO2, -C(=O)R5l -C(=O)OR5, -C(=O)NR5Re, -NR5C(=O)R5, -NR5SO2R5, a -S(O)mRs; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2; n je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je O, Z je -C(=O)-; Ri je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R’R“N(CH2)X-, kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl, a kde x je 2 až 4; R2 a R3 jsou stejné nebo různé a jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -Rs, -OR5, -SR5 a -NRsRe; Rt je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7, -C(=O)NR5Re, -C(-O)R7, -C(=O)OR7i a R8; R5 a R6 jsou stejné nebo různé a jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a Re společně s dusíkovým • · • · · · · · • · · · ···· · · · · « ΙΜ* · · · · · · · ···· • · ·· · · · · ···· · ····· · · · atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnující alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl,
heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; Rs je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že R4 není vodík nebo metyl, jestliže Ri je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -C(=O)OCH2CH3; R4 není methyl, když R1 je methyl, R2a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -NO2; R4 není -CH2CH2OH, když R1 je vodík nebo methyl, R2 je je 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a R4 není methyl, když Ri je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3. V určitých provedeních nemusí být aplikována jeden nebo více podmínek.
Ve výhodném provedení se jedná o metody pro redukci aktivity MIF v pacientovi v případě potřeby podáním účinného množství sloučeniny mající následující strukturu la a/nebo lb:
(la) (|b>
e·· ······ ··· ··· ··· · · · ··· · ···· · ··· • ···· · · 9 · · · 9 9999
9 99 9999
9999 9 99999 99 9 včetně stereoizomerů, prekurzorů, nebo jejich farmaceuticky akceptovatelných soli, kde X je kyslík nebo síra; Y je vybráno ze skupiny, která zahrnuje -NO, -NO2, -C(=O)R5, -C(=O) OR5, -C(=O)NR5R6, -NR5C(=O)R5i -NR5SO2R5, a -S(O)mR5; Z je -CH2- nebo -C(=O)-; roje 0, 1 nebo 2; n je 0,1 nebo 2; za podmínky, že n je 0, Z je -C(=O)-; Ri je vybrán ze skupiny zahrnujíc! vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný heterocykloalkyl, dialkyl, a R’R“N(CH2)X-, kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnujíc! vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl a dialkyl, a kde x je 2 až 4; R2 a R3 jsou stejné nebo různé a jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující halogen, -R5, -OR5l -SR5 a -NR5Re; R4 je vybráno ze skupiny, zahrnující -CH2R7i -C(=O)NR5R6, -C(=O)R7, -C(=O)OR7i a R8; R5 a R6 jsou stejné nebo různé a jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; nebo R5 a R6 společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocykl nebo substituovaný heterocykl; R7 je vybrán ze skupiny zahrnujíc! alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl,heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; R8 je vybrán ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl a substituovaný heterocykloalkyl; za podmínek, že R4 není vodík nebo metyl, jestliže R1 je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -C(=O)OCH2CH3; R4 není methyl, když R1 je methyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík, a Y je -NO2; R4 není -CH2CH2OH, když R1 je vodík nebo methyl, R2 je je 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a R4 není methyl, když Rt je methyl, R2 je vodík nebo 7chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3. V určitých provedeních nemusí být aplikována jedna nebo více podmínek.
Tak jak jsou použity zde, výše uvedené terminy mají následující význam.
Termín „alkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alifatický uhlovodík s přímým řetězcem nebo rozvětvený, necyklický nebo cyklický, nenasycený nebo nasycený, obsahujíc! 1 až 10 uhlíkových atomů, kde termín „nižší alkyl má stejný význam jako alkyl,ale obsahuje 1 až 6 uhlíkových atomů. Představitelé nasycených alkylů s přímým řetězcem jsou methyl, ethyl, n-propyl, nbutyl, n-pentyl, n-hexyl apod.; zatímco nasycené větvené alkyly představují izopropyl, sek35 butyl, izobutyl, terc-butyl, izopentyl apod.. Představitelé nasycených cyklických alkylů jsou cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, -CH2cyklopropyl, -CH2cykJobutyl, -CH2cyklopentyl, -CH2cyklohexyl apod.. Cyklické alkyly, rovněž označované „homocyklické kruhy“, rovněž zahrnují di- a polyhomocyklické kruhy jako dekalin nebo adamantan. Nasycené alkyly obsahují nejméně jednu dvojnou nebo trojnou vazbu mezi sousedními uhlíkovými atomy (označované jako „alkenyl“, respektive „alkynyl“). Představitelé alkenylů s přímým a větveným řetězcem jsou ethenyl, propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, izobutenyl, 1pentenyl, 2-pentenyl, 3-methyl-1-butenyl, 2-methyl-2-butenyl, 2,3-dimethyl-2-butenyl apod., zatímco představitelé alkynylů s přímým nebo rozvětveným řetězcem jsou ethynyl, propynyl, 1-butynyl, 2-butynyl, 1-pentynyl, 2-pentynyl, 3-methyl-1-butynyl apod..
Termín „aryl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezeni se vztahuje na na aromatickou karbocykiickou skupinu jako fenyl nebo naftyl.
Termín „arylalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alkyl mající alespoň jeden vodíkový atom nahrazený arylskupinou, jako benzyl, -CH2(1- nebo 2-naftyl), -(CH2)2fenyl, -(CH2)3fenyl, -CH(fenyl)2 apod..
Termín „heteroalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na aromatický heterocyklický kruh s 5 až 10 členy a mající alespoň jeden heteroatom vybraný ze skupiny, skládající se z dusíku, kyslíku a síry, včetně mono- a bicyklických kruhů. Představitelé heteroarylů jsou (ale nejsou tímto výčtem omezeni) furyl, benzofuranyl, thiofenyl, benzothiofenyl, pyrolyl, indolyl, izoindolyl, azaindolyl, pyridyl, chinolinyl, izochinoiinyl, oxazolyl, izooxazolyi, benzoxazolyl, pyrazolyl, imidazolyl, benzimidazolyl, thiazolyl, benzothiazolyl, izothiazolyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, triazinyl, cinnolinyl, ftalazinyl a chinazoiinyl.
Termín „heteroarylalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alkyl, mající alespoň jeden alkylový vodíkový atom nahrazen heteroaromatickou skupinou, jako -CH2pyridinyl,
-CH2pyrimidinyl apod..
Termín „heterocykl“ nebo „heterocyklický kruh“, jak je zde použit, je široký « · · ··· · · · ··· • · · · · · · · · · · ·
444444 4 444 44444 • · · · · · · · • 444 4 · 4 4 4 4 4· 4 termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na 5- až 7-členné monocyklické, nebo na 7- az 14-členné polycyklické heterocyklické kruhy, které jsou nasycené, nenasycené nebo aromatické, a které obsahují 1 až 4 heteroatomy nezávisle vybrané ze skupiny, skládající se z dusíku, kyslíku a síiy, a kde dusíkové a sírové heteroatomy jsou případně oxidované a dusíkový heteroatom může být případně kvarternizovaný, včetně bicyklických kruhů, ve kterých je kterýkoliv z uvedených heterocyklů spojen s benzenovým kruhem, stejně jako tricyklické (a vyšší) heterocyklické kruhy. Heterocykl může být připojen přes jakýkoliv heteroatom nebo uhlíkový atom. Heterocyky zahrnují heteroaryly popsané výše. A tak, navíc k aromatickým heterocyklům uvedeným výše, heterocykly rovněž zahrnují (ale nejsou tím omezeny) morfolinyl, pyrolidinonyl, pyrolidinyl, piperidinyl, hydantoinyl, valerolaktamyl, oxiranyl, oxetanyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydropyranyl, tetrahydropyridinyl, tetrahydropyrimidinyl, tetrahydrothiofenyl, tetrahydrothiopyranyl apod..
Termín „heterocykloalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alkyl majíc! nejméně jeden alkylový vodíkový atom nahrazen heterocyklem, jako -CH2morfolinyl apod..
Termín „substituovaný“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na jakoukoliv z výše uvedených skupin (tj. alkyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl, heteroarylalkyl, heterocykl nebo heterocykloalkyl), kde je nejméně jeden vodíkový atom nahrazen substituentem. V případě ketosubstituentu („-C (=0)-“) jsou nahrazeny dva vodíkové atomy. Pokud je substituováno, „substituenty“ v kontextu výhodného provedení zahrnují halogen, hydroxy, kyano, nitro, amino, alkylamino, dialkylamino, alkyl, alkoxy, alkylthio, halogenalkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heteroaryl, substituovaný heteroaryl, heteroarylalkyl, substituovaný heteroarylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl, substituovaný hetrocykloalkyl, -NraRb, -NraC(=O)Rb, -NRaC(=O)NRaRb, -NRaC(=O)ORb, -NRaSO2Rb, -0Ra, -C(=O)Ra, -C(=O)ORa, -C(=O)NRaRb, -OC(«O)NRaRb, -SH, -SRa, -SORa, -S(=O)2Ra, -OS (=0)2Ra, -S(=O)2ORa, kde Ra a Rb jsou stejné nebo různé a jsou nezávisle vodík, alkyl, halogenalkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heteroaryl, substituovaný heteroaryl, heteroarylalkyl, substituovaný heteroarylalkyl, heterocykl, substituovaný heterocykl, heterocykloalkyl nebo substituovaný hetrocykloalkyl.
Termín „halogen“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém • · · • · · · · · ··· • · · · · · · · · · · · • ······ · · · · ····· • · ·· ···· ···· · ·· ··· ·· · smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na fluor, chlor, brom a jod.
Termín „halogenalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alkyl mající alespoň jeden vodíkový atom nahrazený halogenem, jako trifluormethyl apod..
Termín „alkoxy“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezeni se vztahuje na allkylovou skupinu připojenou přes kyslíkový můstek (tj. -O-alkyl), jako methoxy, ethoxy apod..
Termín „thioalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alkylovou skupinu připojenou přes sírový můstek (tj. -S-alkyl), jako methylthio, ethylthio apod..
Termín „alkysulfonyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alkylovou skupinu připojenou přes sulfonylový můstek (tj. -SO2-alkyl), jako methylsulfonyl, ethylsufonyl apod..
Termín „aikylamino“ a „dialkyiamino“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na jednu alkylovou skupinu nebo dvě alkylové skupiny samostatně, připojené přes dusíkový můstek (tj. -N-alkyl), jako methylamino, ethylamino, dimethylamino, diethylamino apod..
Termín „hydroxyalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alíkyl substituovaný alespoň jednou hydroxylovou skupinou.
Termín „mono- nebo di(cykloaikyl)methyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na methylovou skupinu substituovanou jednou nebo dvěma cykloalkylovými skupinami, jako cyklopropymethyl, dicyklopropylmethyl apod..
Termín „aikylkarbonylalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alkyl substituovaný -C(=0)alkylovou skupinou.
« · • · · · ···· · · · · • ···· · · · · · · · ···· • · ·· · · · · ···· 9 ·9> ··· ·· ·
Termín „alkylkarbonyloxyalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alkyl substituovaný -C(=O)Oalkylovou skupinou nebo -OC(=O)alkylovou skupinou.
Termín „alkyloxyalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alkyl substituovaný -O-alkylovou skupinou.
Termín „alkylthioalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alkyl substituovaný -S-aikylovou skupinou.
Termín „alkylkarbonylalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na alkyl substituovaný -C(=O)alkylovou skupinou.
Termín „mono- nebo di(alkyl)amino“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na amino substituovaný jedním nebo dvěma alkyly.
Termín „mono- nebo di(alkyl)aminoalkyl“, jak je zde použit, je široký termín a je použit v obvyklém smyslu, včetně a bez omezení se vztahuje na amino substituovaný mono- nebo di(alkyl)amino.
Ve výhodných provedeních jsou použita následující schémata číslování:
V závislosti na skupině Z reprezentativní sloučeniny výhodných provedení zahrnují následující strukturu Ji, kde Z je methylen (-CH2-) a strukturu Jit, kde Z je karbonyl (-C(=O)-):
V dalších provedeních je n 0,1 a VJ v tomto pořadí:
2, jak je reprezentováno strukturami IV, V
(IV)
(V)
Ra
(VI)
V ještě dalších provedeních mají sloučeniny ve výhodných provedeních následující strukturu VII. jestliže X je kyslík, a strukturu VIN., jestliže X je síra:
V závislosti na skupině Y mají sloučeniny výhodných provedení následující obecný vzorec IX až XIII:
(XII) (XIII) • · · • · · · · · • · ···· · ·· ···· • · • ··· • · • · · • · · · · • ·
Sloučeniny výhodných provedení se mohou obecně používat jako volná kyselina nebo volná báze. Nebo sloučeniny výhodných provedení mohou být výhodně ve formě adičních solí kyselin nebo bází. Adiční soli kyselin a volných bází aminosloučenin výhodných provedení se mohou připravit metodami dobře známými ze stavu techniky, a mohou být tvořeny organickými nebo anorganickými kyselinami. Vhodné kyseliny zahrnují kyselinu jablečnou, fumarovou, benzoovou, askorbovou, jantarovou, methansulfonovou, octovou, šťavelovou, propionovou, vinnou, salicylovou, citrónovou, glukonovou, mléčnou, mandlovou, skořicovou, asparagovou, stearovou, palmitovou, glykolovou, glutamovou, a benzensulfonovou. Vhodné anorganické kyseliny zahrnují kyselinu chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sírovou, fosforečnou a dusičnou. Bázické adiční soli volných kyselin se mohou připravit podobně metodami dobře známými ze stavu techniky, a mohou být tvořeny z vhodných bází, jako kationtů vybraných z alkalických kovů a kovů alkalických zemin (tj. lithium, sodík, draslík, hořčík, baryum nebo vápník), stejně jako amonného kationtů. Termínem „farmaceuticky akceptovatelná sůl1' sloučenin obecného vzorce la a Ib jsou míněny jakékoliv a všechny akceptovatelné formy solí.
Sloučeniny obecného vzorce la a Ib se mohou připravit technikami organické syntézy, známými odborníkům v tomto oboru, stejně jako ukázkovými metodami vysvětlenými v příkladu 1. Všeobecně se mohou sloučeniny obecného vzorce la připravit podle následujících reakčních schémat.
Reakční schéma 1
Všeobecně se mohou chlorové intermediáty obecného vzorce iii připravit z odpovídajícího alkoholu ii známými technikami. Alkoholický intermediát se může naopak připravit z výchozího materiálu i reakcí s vhodnými činidly. Reprezentativní reaktanty a podmínky jsou vysvětleny v příkladu 1.
4 • 4 4444 ·· ·
4 4 4 4444 4 444
4444 44 4 444 4·444
4 44 4444
4444 4 44444 44 4
Reakční schéma 2
Η
I
Boc iv
R4
I
Boc
vi
N-substituované piperaziny obecného vzorce vi se mohou připravit odblokováním chráněných intermediátů v (v tomto případě chráněné N-tercbutoxykarbonylem nebo „Boc“ pro účely znázornění). Chráněný intermediát se může připravit z N-chráněného piperazinu iv adicí požadované skupiny R4.
Intermediát Iii z reakčního schématu 1 může zreagovat s intermediátem vi z reakčního schématu 3 za vzniku sloučenin výhodného provedení, majících strukturu la.
Reakční schéma 4
Y iii
X
Boc
I
N
Z
H iva
X
Nebo může intermediát iii z reakčního schématu 1 zreagovat s chráněným intermediátem iva za vzniku chráněného reakčního produktu vii. Tento chráněný reakční produkt se pak může odblokovat za vzniku intermediátu viii, následovaného adicí požadované skupiny R», aby vznikla sloučenina výhodného provedení, majíc! strukturu Ia.
MIF jako cil léčiva
Faktor inhibice migrace makrofágů (MIF) se může dobře hodit pro analýzu jako cíl léčiv, protože jeho aktivita je zapletena do různých patofyziologických podmínek. Ukázalo se například, že MIF je významným mediátorem jak při zánětlivých odpovědích, tak při proliferaci buněk. Pokud se tohoto týče, o MIF se ukázalo, že hraje roli jako cytokin, hormon hypofýzy, imunomodulátor indukovaný glukokortikoidem, a právě v současné době jako neuroimunomodulátor a v neuronové funkci. Takashi etal., Mol. Med. 4:707714,1998; Bucala, AnnN. Y. Acad. Sci. 840:74-82,1998; Bacher etal., Mol. Med. 4(4). 217-230,1998. Dále bylo v současnosti ukázáno, že protilátky proti MIF majf nejrůznější použití, zejména inhibice růstu nádorů, současně s pozorovanou redukcí angiogeneze. Ogawa etal., Cytokine 12(4):309-914,2000; Metz a Bucala (výše). Proto malé molekuly, které mohou inhibovat MIF, mají významnou hodnotu při léčení zánětlivých odpovědí, redukci angiogeneze, virové infekci, bakteriální infekci, léčení rakoviny (konkrétně geneze tumoru a apoptóze), léčení nemoci štěp versus hostitel a asociovaného odmítnutí tkáně. Inhibitor MIF může být zvláště užitečný v různých odpovědích vztahujících se k imunitě, růstu nádorů, glomerulonefritidě, zánětech, malarické anémii, septickém šoku, angiogenezi související s nádorem, vitreoetinopatii, psoriáze, nemoci štěp versus hostitel (odmítnutí tkáně), atopické dematitidě, revmatické artritidě, zánětu střev, zánětlivých onemocnění plic, otitis media, Crohnově nemoci, syndromu akutních respiračních potíží, • · φφφφ φφ φφφ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φφφ φ • φ φ φφφ φ φφ φφφ φφ φφ φφφφ φ φ φφφφ zpožděné hypersenzitivitě. Inhibitor MIF může být také užitečný při léčení stresu a funkčních poruch glukokortikoidů, tj. regulace působení glukokortikoidu, nebo převaze suprese uvolňování arachidonátu, zprostředkované glukokortikoidem (katalytická aktivita oxidoreduktázy MIF, založená na Cys-60 nebo mechanismus založený na interakci JABI/CNS-MIF).
Jeden příklad užitečnosti inhibitoru MIF může být doložen faktem, že detekovatelná sérová koncentrace MIF, která následuje po expozici endotoxinem, postupně roste během akutní fáze (1 až hodin), vrchol! po 6 hodinách a přetrvává během post-akutní gáze (> 8 hodin) až 20 hodin. Bez omezení jakoukoliv teorií operace, MIF může být produkován pravděpodobně aktivovanými T-buňkami a makrofágy během předzánětlivého stadia šoku indukovaného endotoxinem, tj. jako část lokalizované odpovědi na infekci. Jednou uvolněný předzánětlivým stimulem, tj. nízkou koncentrací LPS, nebo TNF-α a IFN-γ, MIF odvozený z makrofágů může být možným zdrojem MIF produkovaného během akutní fáze endotoxického šoku, když infekce není dále omezena na lokalizované místo. Viz US patent 6.080.407, zahrnutý zde odkazem ve své úplnosti a popisující tyto výsledky s protilátkami proti MIF.
Jak je zde ukázáno, inhibitory výhodného provedení inhibují letalitu myši po ošetření LPS a pravděpodobně snižují hodnoty IL-1 β a TNF-α. Proto mohou být nejrůznější zánětlivé stavy přístupné léčení inhibitorem MIF. Co se toho týká, inhibice aktivity MIF a/nebo jeho uvolňování mohou být mezi jinými přednostmi použity k léčení zánětlivé odpovědi a šoku. Prospěšných účinků může být dosaženo při raných i pozdních stadiích šokové odpovědi. S ohledem na to, bez omezení jakoukoli teorií nebo mechanismem odpovědným za ochranný efekt inhibice MIF, anti-MIF studie ukázaly, že zavedeni anti-MIF protilátek je spojeno se zjevným snížením (až k 35 až 40 %) hodnot TNF-α v cirkulujícím séru. Toto snížení je v souladu s aktivitou MIF indukující TNF-α u makrofágů in vitro, a naznačuje, že je asi částečně odpovědné za extrémně vysoké vrcholové hodnoty TNF-α v séru, které se objevují 1 až 2 hodiny po podání endotoxinu navzdory faktu, že MIF nemůže být v tomto čase detekováno v oběhu. Tudíž terapie inhibici MIF může být prospěšná v raných stádiích zánětlivé odpovědi.
MIF také často hraje roli během post-akutní fáze šokové odpovědi, a proto nabízí možnost intervenovat v pozdních stadiích, kde jiné způsoby léčení, jako anti-TNF-a terapie, jsou neúčinné. Inhibice MIF může chránit proti letálnímu šoku zvířata, která mají ·· 9 99 9999 99 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 999 9 9 9 9
9999 99 9 999 9 9999
9 9 9 9 9 9 9
9999 9 99 999 99 9 vysokou koncentraci endotoxinu (tj. koncentrace, které indukují uvolnění hypofyzárního MIF do oběhu) a u zvířat s TNF-α. Proto schopnost inhbovat MIF a chránit zvířata před TNF indikuje, že neutralizace MIF během pozdější, post-akutní fáze septického šoku může být efektivní.
Jak je zde doloženo, hladiny TNF-α a IL-1 β jsou korelovány přinejmenším v některých příkladech k hodnotám MIF. Proto malé molekuly anti-MIF mohou být užitečné při různých chorobných stavech spojených s TNF-α a/nebo IL-1 β, včetně odmítnutí transplantátu, imunitně zprostředkované a zánětlivé prvky onemocnění CNS (tj. Alzheimerova a Parkinsonova choroba, roztroušená skleróza atd.), svalová dystrofie, onemocněni hemostázy (tj. koagulopatie, onemocnění véno occlusive atd.), alergická neuritis, granulom, diabetes, odmítnutí štěpu hostitelem, chronické poškození ledvin, alopecie (ztráta vlasů), akutní pankreatitida, onemocnění kloubů, selhání srdce, kardiovaskulární onemocnění (restenóza, ateroskleróza) a osteoartritida.
Další důkazy ve stavu techniky indikovaly, že steroidy jako mocné inhibitory produkce cytokinu skutečně zvyšují expresi MIF. Yang etal., Mol. Med. 4(6):413-424,
1998; Mitchell etal., J. Biol. Chem. 274(25):18100-18106,1999; Calandra a Bucala, Crit. Rev. Immunol. 17(1):7-88,1997; Bucala, FASEB J. W(14):1607-1613,1996. Proto může být zvlášť užitečné použití inhibitorů MIF v kombinaci se steroidní terapií pro léčení patofyziologických stavů zprostředkovaných cytokiny, jako zánět, šok a jiné patofyziologické stavy zprostředkované cytokiny, zvláště při chronických zánětlivých stavech, jako je rheumatoidní artritida. Taková kombinační terapie může být prospěšná po začátku patogenních nebo jiných zánětlivých odpovědí. Například v klinickém prostředí se ukázalo, že podáni steroidů po počátku symptomů septického šoku poskytuje malý prospěch. Viz Bone et al., N. Engl. J. Med. 317:653-658,1987; Spring et al., N. Engl. J. Med. 311:1137-1141,1984. Kombinace steroidy/inhibiční terapie MIF může být použita k překonání tohoto problému. Odborník v oboru může dále pochopit, že takové terapie mohou být ušity na míru k inhibici uvolňování a/nebo aktivity MIF lokálně a/nebo systémově.
Metody zkoumáni
Efektivita sloučeniny jako MIF může být určována různými metodami zkoumání. Vhodné inhibitory výhodného provedení jsou schopny snížit jednu nebo více aktivit • · · · · · · · · • · · · · ··· · · · · • ······ · ··· · ··· · • · · · · · · · ···· · · · · · · · · · například spojených s MIF a vylučováním MIF. Aktivita sloučeniny obecného vzorce la nebo [b nebo jakékoliv jiné struktury jako inhibitoru MIF může být stanovena jednou nebo více všeobecně akceptovanými metodami zkoumání, včetně, (ale ne limitováno tímto), metodami popsanými níže.
Metody zkoumání mohou být všeobecně rozděleny do třech kategorií, což jsou metody, které monitorují vylučování, metody, které monitorují efekt navazování malých molekul, a metody, které monitorují aktivitu MIF. Avšak je třeba poznamenat, že kombinace těchto metod zkoumání jsou mimo rozsah předmětného vynálezu. Překvapivě se zdá, že mapování epitopu MIF působí jako zástupce pro biologickou aktivitu. Například v jedné metodě přítomnost potenciálního inhibitoru blokuje detekci vylučování MIF z buněk (tj. THP-1 buněk), měřeno za použití takových monoklonálních protilátek, které jsou komerčně dostupné z výzkumných a vývojových systémů (Minneapolis, MN, USA), zatímco polyklonální protilátka ukazuje, že MIF je přítomen. Metody zkoumání založené na buňkách nebo in vitro mohou být dále použity k demonstrování toho, že tyto potenciální inhibitory inhibují aktivitu MIF. Alternativně mohou být tyto dvě metody (tj. vazebné a aktivitní metody zkoumání) kombinovány do jediné metody, která detekuje navázání testovací sloučeniny (tj. schopnost odstranit monoklonální protilátky z vazebných míst nebo inhibovat jejich aktivitu), zatímco rovněž působí na aktivitu MIF. Takové metody zahrnují kombinaci metody zkoumání typu ELISA (nebo podobné vazebné metody) s metodou tautomerizace MIF nebo podobnou funkční metodou. Jak může odborník v oboru snadno poznat, použití exaktní metody je bezvýznamné, pokud není schopná detekovat schopnost předmětné sloučeniny vázat se na MIF. Metoda zkoumání navíc výhodně detekuje schopnost sloučeniny inhibovat aktivitu MIF, protože je vybrána pro sloučeniny, které interagují s biologicky aktivním MIF a ne s inaktivním MIF.
Je třeba chápat, že sloučeniny, které vykazují schopnost inhibovat monoklonální protilátky navázané na biologicky aktivní, ale ne inaktivní MIF (tj. inhibovaný malou molekulou) nutně indikuje přítomnost sloučeniny (tj. malé molekuly), která interaguje s MIF způsobem, který buď mění konformaci MIF, nebo blokuje epitop nutný pro navázáni protilátky. Aktivita inhibice MIF v jiných provedeních může být pozorována také jako následek interakce s formací polypeptidového komplexu, který zahrnuje MIF; porušení takového komplexu může mít důsledek ve změně konformace inhibující detekci.
V souladu s tím je výhodné použití metod zkoumání, které monitorují konformační změny v MIF, když je použito buď jako další k metodám měřícím kompetici mezi sloučeninami, • φ φ φ φ φ φφφφφ φ φ φ φ φ φ • ΦΦΦ jako malými molekulami s mAb, nebo jako náhrada takové metody. Různé takové metody jsou známy ze stavu techniky a zahrnují kalorimetriii, cirkulární dichroismus, fluorescenční přenos energie, rozptyl světla, nukleární magnetickou rezonanci (NMR), povrchovou plazmonovou rezonancí, scintilační přibližovací metody (viz US patent č. 5.246.869) a podobně. Viz také WO 02/07720-A1 a WO 97/29635-A1. V souladu s tím může odborník v oboru poznat, že může být užitečná jakákoliv metoda zkoumání, která indikuje vazbu a výhodně konformační změnu nebo umístění blízko aktivního místa MIF. Popisy několika komplikovanějších přibližovacích metod a konformačnich metod jsou uvedeny níže, diskuse je pouze exemplární a žádným způsobem není stavěna jako omezujíc! pro typ technik, které mohou být použity ve výhodných provedeních.
V jednom případě může být použit cirkulární dichroismus k určení možné vazby inhibitoru. Cirkulární dichroismus (CD) je částečně založen na faktu, že většina biologických proteinových makromolekul je vybudována z asymetrických monomerních jednotek, L-aminokyselin, takže všechny máji atribut optické aktivity. V souladu s tím mají rigidní struktury, jako DNA nebo alfa-helixové polypeptidy optické vlastnosti, které mohou být měřeny vhodným spektroskopickým systémem. Ve skutečnosti velké změny ve snadno měřitelném spektroskopickém parametru mohou poskytnout selektivní způsoby k identifikaci konformačnich stavů a změn v konformačnich stavech za různých okolností, a někdy k pozorování perturbace jednotlivých skupin uvnitř nebo připojených k makromolekule. Dále byla analýza CD často používána ke zjišťování interakcí různých makromolekul s malými molekulami a ligandy. Viz Durand etal., Eur. Biophys. J. 27(2): 147-151,1988; Kleifeld etal., Biochem 39(26):7702-7711,2000; Bianchi etal., Biochem 38(42):13844-13852,1999; Sarver etal., Biochim Biophys Acta 1434(2):304-316,1999.
Pasteurův princip praví, že opticky aktivní molekula musí být asymetrická: to je, že molekula a její zrcadlový obraz nemohou být zaměnitelné. Světlo polarizované v rovině je kombinaci vlevo cirkulárně polarizovaného světla a vpravo cirkulámě polarizovaného světla ve stejné fázi. Interakcí tohoto světla s asymetrickou molekulou vzniká přednostní interakce jedné cirkulárně polarizované složky, která je v absorpčním regionu patrná jako diferenciální absorpce (tj. dichroismus). Viz Urry, D.W. Spectroscopic Approaches to Biomolecular Conformation, American Medical Association Press, Chicago, III., pp. 33-120 (1969); Bérova a Woody, Circular Dichroism: Principles and Applications, John Willey and Sons, N.Y., (2000).
··· ······ ··· • · · · · · · · · ··· · · · · · · ··· • ···· · · · · · · · ···· • · · · ···· ·· · β < ····· ·· ·
Cirkulární dichroismus je tak absorpční jev, který vzniká, když chromofor interaguje s rovinně polarizovaným světlem při určité vlnové délce. Absorpční pás může být buď negativní nebo pozitivní v závislosti na diferenciální absorpci vpravo a vlevo cirkulámě polarizovaných složek pro tento chromofor. Na rozdíl od optické rotační disperze (ORD), která měří příspěvky pozadí a předmětného chromoforu mnoho milimikronů od oblasti aktuální světelné interakce, CD nabizí výhodu měření optických událostí při vlnových délkách, při kterých se událost koná. Cirkulární dichroismus je pak specifický k elektronovým přechodům chromoforu. Viz Bérova a Woody, Circular Dichroism: Principles and Applications, John Willey and Sons, N.Y., (2000).
Aplikace cirkulárního dichroismu na roztoky makromolekul poskytla možnost identifikovat konformační stavy (Bérova a Woody, Circular Dichroism: Principles and Applications, John Wiiley and Sons, N.Y., (2000)).Tato technika může rozlišovat konformační stavy makromolekul náhodné klubko, alfa helix a beta řetězec. V proteinech alfa helixové vláknité proteiny vykazují absorpční křivky blízce podobné křivkám alfa helixových polypeptidů, ale v globulárních proteinech známé struktury, jako je lysozym a ribonukleáza, helixové struktury spíše méně souhlasí s pracemi rentgenové krystalografie. Dalším zdrojem potíží v globulárních proteinech je převaha aromatických chromoforů na molekulách okolo 280 nm. Zajímavý příklad helixových změn byl demonstrován použitím myoglobinu a apomyoglobinu. Po odstranění prosthetické skupiny hernu má zbývající apoprotein reziduální cirkulární dichroickou eiipticitu redukovanou o 25 %. Tato ztráta helixu odpovídá odvinutí 10 až 15 zbytků v molekule. Jiné nepeptidické opticky aktivní chromofory zahrnují tyrosin, tryptofan, fenylalanin a cystein, pokud jsou umístěny v primární aminokyselinové sekvenci makromolekuly. Příklady nepeptidických elipticit zahrnují disulfidický přechod v ribonukleáze a cysteinové přechody inzulínu.
V souladu s tím může být cirkulární dichroismus použit ke zjišťování možných kandidátů na inhibitory schopnosti působit na konformaci MIF.
V určitých provedeních zde uvedených může být MIF inhibitor určen detekováním přítomnosti komplexu zahrnujícím MiF a detekovatelné označeného vazebného činidla. Jak je popsáno detailněji niže, detekce signálu fluorescenční energie, například fluorescenční polarizací, určuje hodnoty signálu, které reprezentují tvorbu molekulárního komplexu vazebného činidla MIF. V souladu s tím a jak je zde dáno, srovnání fluorescenční energie založené na signálu tvorby komplexu vazebného činidla
MIF v přítomnosti a bez přítomnosti možného inhibitoru poskytuje metodu identifikující, zda činidlo mění interakci mezi MIF a vazebným činidlem. Vazebné činidlo může být například substrát MIF, nebo protilátka MIF, nebo známý inhibitor, zatímco možný inhibitor může být sloučenina určená pro testováni nebo naopak.
Jak je poznamenáno výše, jistá výhodná provedení také se také částečně týkají detekce signálu fluorescenční energie tvorby komplexu vazebného činidla MIF. Detekce signálu fluorescenční energie může být například fluorescenční polarizací nebo přenosem fluorescenční rezonanční energie, nebo jinou fluorescenční metodou známou ze stavu techniky. Jako přiklad jistých jiných provedení může být polypeptid MIF značen stejně jako možný inhibitor a může obsahovat donor-akceptorový pár molekulového přenosu energie, a určuje se hodnota přenosu energie fluorescenční rezonance z donoru energie na akceptor energie. V jistých provedeních je možný inhibitor, popřípadě vazebné činidlo, detekovatelně označeno, a ve zvláště výhodných provedeních je možný inhibitor, popřípadě vazebné činidlo, schopno generovat signál fluorescenční energie. Možný inhibitor, popřípadě vazebné činidlo mohou být detekovatelně značeny kovalentním nebo nekovalentním připojením vhodnou značkovací molekulou nebo skupinou, například kterýmkolivz různých fluorescenčních materiálů (tj. fluoroforem) vybraným podle jednotlivé techniky fluorescenční energie, která se má použít, jak je známo ve stavu techniky a založeno na metodách zde popsaných. Fluorescenční skupiny a metody, jak jsou použity zde, se mohou nalézt například v publikaci Haugland (1996 Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals - Sixth Ed., Molecular Probes, Eugene, OR; 1999 Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals - Seventh Ed., Molecular Probes, Eugene, OR, http://www.probes.com/lit/) a v tam citovaných odkazech. Zvlášť upřednostňovány pro použití jako takovéto fluorofory ve výhodných provedeních jsou fluorescein, rhodamin, Texaská červeň, AlexaFluor-594, Oregonská zeleň, BODIPY-FL a Cy-5. Avšak může se použít jakýkoliv vhodný fluorofor, a v jistých provedeních se může dát přednost jiným fluoroforům než zde uvedeným.
Jak je zde uvedeno, signál fluorescenční energie zahrnuje jakoukoliv fluorescenční emisi, excitaci, přenos energie, zhášení nebo potlačení zhášení a podobně. Signál fluorescenční energie může být typicky zprostředkován fluorescenčně detekovatelně značeným potenciálním inhibitorem a/nebo vazebným činidlem ve vztahu ke světlu vhodné vlnové délky. Stručně a bez požadavku být vázáni teorií, generování signálu fluorescenční energie zahrnuje excitaci fluoroforu vhodným zdrojem energie (tj.
• · · • · ·· • · • · » světlem vhodné vlnové délky pro vybranou fluorescenční skupinu nebo fluorofor), který tranzitně zvýší energetický stav fluoroforu ze základního stavu do excitovaného stavu. Excitovaný fluorofor naopak emituje energii ve formě detekovatelného světla, typicky majícího odlišnou (tj. obvykle delší) vlnovou délku od vlnové délky preferované pro excitaci, a tak dojde k návratu do energeticky základního stavu. Pro metody výhodných provedení se uvažuje o použití jakéhokoliv signálu fluorescenční energie, závislém na jednotlivém fluoroforu, metodě značení substrátu a detekční instrumentaci, která může být vybrána snadno a bez přílišného experimentování podle kritérií, s kterými je ten který odborník v oboru dobře seznámen.
V jistých provedeních signál fluorescenční energie je signál fluorescenční polarizace (FP). V jistých dalších provedeních může být signál fluorescenční energie přenos fluorescenční rezonanční energie (FRET). V jistých dalších provedeních může být signál fluorescenční energie signál zhášeni fluorescence (FQ) nebo signál fluorescenční rezonanční spektroskopie (FRS). (Pro detaily týkající se FP, FRET, FQ a FRS viz např. WO 97/39 326, WO 99/29 894; Haugland, Handbbok of Fluorescent Probes and Research Chemicals - 6th Ed., 1996, Molecular Probes, lne., Eugene, OR, P. 456; a reference tam uvedené).
FP, měření průměrné průměrného úhlového pohybu (způsobený molekulární rotační difúzí) fluoroforu, ke kterému dochází mezi jeho absorpcí fotonu ze zdroje energie a jeho následnou emisí fotonu, závisí na rozsahu a četnosti rotační difúze během excitovaného stavu fluoroforu, na velikosti a tvaru molekuly, viskozitě roztoku a teplotě roztoku ((Perrin, 1926 J. Phys. Rad. 1:390). Pokud je viskozita a teplota konstantní, FP se přímo vztahuje ke zdánlivému objemu molekuly nebo velikosti fluoroforu. Polarizační hodnota je poměr je poměr intenzit fluorescence měřených v kolmých rovinách (tj. vertikální a horizontální) a je to proto bezrozměrná hodnota, která není ovlivněna intenzitou fluoroforu. Fluorofory s nízkou molární hmotností, jako detekovatelně značené potenciální inhibitory a/nebo vazebná činidla uvedená zde, jsou schopna rychlé molekulární rotace v roztoku (tj. nízká anizotropie) a tím rostou nízké fluorescenční polarizační hodnoty. Avšak jestliže jsou v komplexu s molekulami vyšší molární hmotnosti, jako MIF, jak je uvedeno zde, skupina fluoroforu substrátu asociovaného s komplexem, který vykazuje relativně pomalou rotaci molekul v roztoku (tj. vysokou anizotropii), dochází k vyšším hodnotám odečtu fluorescenční polarizace.
« · · ♦ · · c · · · · · • •ft · · · · · · · · · • ·«···· · · ft · ····· • · ·· ···· ···· · ····· · · ft
Tento rozdíl v hodnotách polarizace volného detekovatelně značeného potenciálního inhibitoru a/nebo vazebného činidla ve srovnání s polarizační hodnotou komplexu MIF:potenciální inhibitor a/nebo vazebné činidlo může být použito k určení poměru komplexovaného (tj. vázaného) k volnému. Tento rozdíl může být také použit k detekci vlivu potenciálního činidla (tj. potenciálního inhibitoru) ve formaci těchto komplexů a/nebo na stabilitu předpřipravených komplexů, například srovnáním FP detekované za nepřítomnosti činidla a FP detekované za přítomnosti činidla. Měření FP mohou být provedena bez separace reakčních komponent.
Jak je poznamenáno výše, jeden aspekt výhodného provedení využívá navázání nebo nahrazení monoklonální protilátky, známého inhibitoru nebo jiného vazebného činidla a/nebo komplexní formace potenciálního inhibitoru s MIF v metodě identifikace inhibitoru, který mění aktivitu MIF. Inhibitory výhodných provedení byly překvapivě identifikovány tímto nekonvenčním způsobem. V tomto ohledu třída sloučenin demonstrovala schopnost inhibovat/snížit vazbu monoklonální protilátky biologicky aktivního MIF, který je přirozeně produkován buňkami, ale neovlivnila schopnost protilátky rozeznat neaktivní (rekombinantní) MIF (jak je dostupný z komerčních zdrojů) a také demonstrovala zdůrazněnou modulaci aktivity MIF in vivo. Navázání protilátky může být podle toho preferováno jako zástupce aktivity enzymu, a tím eliminovat potřebu uskutečňovat drahé a komplexní enzymatické výzkumy pro každou potenciální sloučeninu. Jak může odborník v oboru snadno rozeznat, možnost obejít enzymatické zkoušky vede ke zkouškám, které mohou být extrémně vhodné pro použití s vysokou efektivností.
Jak může odborník v oboru dále snadno zjistit, takový výzkum může být prováděn mimo kontext MIF a kdekoliv může být enzym nebo biologická aktivita nahrazena vazebnou zkouškou. Například by měl být preferován jakýkoliv enzym nebo jiný polypeptid, jehož biologicky aktivní forma je rozeznávána monoklonální protilátkou, která nerozezná inaktivní formu (tj. formu inaktivovanou malou molekulou). V kontextu enzymu by měla být monoklonální protilátka navázána na aktivní místo, ale bude vytěsněna malou molekulou. Tak jakákoliv malá molekula, která vytěsní protilátku, by měla být považována za pravděpodobný inhibitor enzymu. Jak oceňuje odborník v oboru, protilátka může rozpoznat epitop, který mění konformaci v závislosti na aktivním stavu enzymu, a který navázáním malé molekuly takové, která zabrání navázání protilátky na tento epitop, může působit jako zástupce enzymatické aktivity, dokonce když epitop nemusí být aktivním místem. Podle toho zde použitý typ zkoušky může být rozšířen k použití s v podstatě
444 >44 444
444 4 4444 4 444
4444 44 » 4 4 4 44444
4 4 · 4 4 4 4
4444 4 44444 <4 4 jakýmkoliv polypeptidem, kde vytěsnění protilátky je předpovědí pro ztrátu aktivity. Tak v její nejjednodušší formě, jakýkoliv polylpeptid, tj. enzym a jeho neutralizující! protilátka, mohou být použity ke zjišťování malých molekul, které vytěsňují tuto protilátku, a tím identifikovat možné inhibitory.
Komplex činidla vázajícího MIF/potenciálního inhibitoru může být identifikován kteroukoliv z různých technik známých ze stavu techniky pro demonstrování intermolekulární interakce mezi MIF a jinou molekulou, jak je popsáno výše, například společnou purifikací, spolusrážením, společnou imunoprecipitací, radiometrickými a fluorimetrickými metodami, analýzami Western Imunoblot, afinitním zachycením včetně afinitních technik jako sorbentové techniky ligand-kontraligand na pevné fázi, afinitní chromatografií a povrchovou afinitní plazmonovou rezonanci, NMR a podobně (viz US patent č. 5 352 660). K určení přítomnosti takového komplexu se mohou použít protilátky, včetně monoklonálních, polyklonálních, chimérních a jednořetězcových protilátek a podobně, které se specificky vážou k MIF nebo k vazebnému činidlu.
Značený MIF a/nebo značená vazebná činidla/potenciální inhibitory mohou být použity k detekování přítomnosti komplexu. Molekula může být značena kovalentně nebo nekovalentně připojením vhodné značkovací molekuly nebo skupiny, například jakýmkoliv z různých enzymů, fluorescenčních materiálů, luminiscenčních materiálů a radioaktivních materiálů. Příklady vhodných enzymů zahrnují, ale nejsou tím omezeny, křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu, β-galaktosidázu a acetylchol i neste rázu. Příklady vhodných fluorescenčních materiálů zahrnují, ale nejsou tím omezeny, umbreliferon, fluorescein, izothiokyanát fluoresceinu, rhodamin, dichlortriazinylaminfluorescein, dansylchlorid, fykoerythrin, texaskou červeň, AlexaFluor-594, oregonskou zeleň, BODIPYFL a Cy-5. Vhodné luminiscenční materiály zahrnují, ale nejsou tím omezeny, luminol a vhodné radioaktivní materiály zahrnující radioaktivní fosfor [32P], jód [125l nebo 131l] nebo tricium [3Hj.
MIF a vazebné činidlo a/nebo potenciální inhibitor jsou kombinovány za podmínek a po dobu dovolující vznik intramolekulárního komplexu mezi složkami. Vhodné podmínky pro tvorbu takových komplexů jsou známy ze stavu techniky a mohou být snadno určeny na základě zde uvedených poznatků, včetně podmínek rozpustnosti a metod detekce přítomnosti komplexu a/nebo pro detekci volného substrátu v roztoku.
• · · · · ♦ « · « · · · • · φ · ·♦·· · • ·«···· · · » · • · · · 9 9 9 9
9999 · 99 999 99 9
Asociace detekovatelně značených vazebných činidel a/nebo potenciálních inhibitorů v komplexu s MIF, které nejsou součástí komplexu, mohou být identifikovány podle výhodného provedení detekcí signálu fluorescenční energie generované substrátem. Zdroj energie pro detekci signálu fluorescenční energie je vybírán podle kritérií, se kterými jsou odborníci dobře seznámeni, v závislosti na fluorescenční skupině, kterou je substrát označen. Testovaný roztok, obsahující (a) MIF a (b) detekovatelně značené vazebné činidlo a/nebo potenciální inhibitor, je vystaven zdroji energie tak, aby generoval signál fluorescenční energie, který je detekován jakýmkoliv z různých dobře známých přístrojů a identifikován podle konkrétního signálu fluorescenční energie. Signál fluorescenční energie je ve výhodných provedeních fluorescenční polarizační signál, který může být detekován spektrofluorimetrem vybaveným polarizačními filtry. Fluorescenční polarizační metoda je ve zvláště výhodných provedeních prováděna zároveň v každé z mnoha reakčních komor, které mohou být odečítány například pomocí LJL CRITERION™ Analyst (LJL Biosystems, Sunnyvale. CA, USA) deskovým měřičem, aby se obdrželo měření s vysokou propustností (HTS) pro různé reakční podmínky v různých reakčních komorách. Příklady dalších vhodných přístrojů pro měření flourescenčnl polarizace zahrnují zařízení POLARSTAR™ (BMG Lab Technologies, Offenburg, Německo), BEACON™ Panvera, lne., Madison, Wl, USA) a POLARION™ Tecan, lne., Research Triangle Park, NC, USA).
Určení přítomnosti komplexu, který byl vytvořen mezi MIF a vazebným činidlem a/nebo potenciálním inhibitorem se může provádět řadou metod, jak je uvedeno výše, včetně metodiky signálu fluorescenční energie, jak je zde popsána a známa ze stavu techniky. Takové metodiky mohou zahrnovat,jak je výčtem ilustrováno, ale ne omezeno, FP, FRET, FQ, jiná fluorimetrická měření, spolučištění, spolusrážení, společná imunoprecipitace, radiometrické a Western Immunoblot analýzy, afinitnf zachycování včetně afinitních technik, jako sorbentových technik ligand-counterligand na pevné fázi, afinitní chromatografií a povrchovou afinitní plazmonovou rezonanci, cirkuiárním dichroismem a podobně. Pro tyto a jiné užitečné afinitní techniky viz například Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and the Practice, 1987, Springer-Verlag, NY; Weir, D.M. Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston; a Hermanson, G.T. etai., Immobilized Affínity Ligand Techniques, 1992, Academie Press, lne., California; které jsou tím začleněny referencemi v jejich úplnosti pro podrobnosti týkající se technik pro izolaci a charakterizaci komplexů včetně afinitních technik. V různých provedeních může MIF interagovat s vazebným činidlem a/nebo potenciálním • · 4 4 4 4·*4 ·4 4 · 4 4 4 4 444 ··· · ···· · ··· • 4«·4 · · · 4 4 · 4«·44 · ·· 4 · · 4 ···· · 44··· ·· · inhibitorem specifickou vazbou, jestliže MIF váže vazebné činidlo a/nebo potenciální inhibitor s Ka větší nebo rovnou 104 M1, výhodně větší nebo rovnou 105 M1, ještě výhodněji větší nebo rovnou 106 M1 a nejvýhodněji větší nebo rovnou 107 M1 až 1011 M1. Afinita vazebných partnerů může být snadno spočítána podle metodik signálu fluorescenční energie popsaných výše a za použití konvenčních technik zpracování dat, popsaných například v Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci. 51:660 (1949).
Například v různých provedeních, kde signál fluorescenční energie je fluorescenční polarizační signál, fluorescenční anizotropie (v polarizovaném světle) volně detekovatelného potenciálního inhibitoru a/nebo vazebného činidla může být určena bez přítomnosti MIF, a fluorescenční anizotropie (v polarizovaném světle) plně vázaného substrátu může být určena v přítomnosti titrovaného množství MIF. Fluorescenční anizotropie v polarizovaném světle se mění jako funkce množství rotačního pohybu, který může značený potenciální inhibitor a/nebo vazebné činidlo vykonat během doby existence excitovaného stavu fluoroforu k určeni podílu frakce potenciálního inhibitoru a/nebo vazebného činidla vázaného na MIF v dané sestavě experimentálních podmínek, například v těch, ve kterých je potenciální činidlo přítomno (viz Lundblad eř a/., 1986 Molec. Endocrinol. 10:607; Dandliker etal., 1971 Immunochem, 7:799; Collett, E., Polarized Light: Fundamental and Applications, 1993 Marcel Dekker, New York).
Některé z výhodných provedení zčásti náležejí k použití intramolekuiárního přenosu energie k monitorování tvorby komplexu MIF-vazebné činidlo a stability a/nebo tvorby komplexu MIF-vazebné činidlo.
Přenos energie (ET) je generován z rezonanční interakce mezi dvěma molekulami: energii poskytující molekula „donoru“ a energii přijímající molekula „akceptoru“. Přenos energie se může uskutečnit, jestliže (1) emisní spektrum donoru překrývá absorpční spektrum akceptoru a (2) donor a akceptor jsou v určité vzdálenosti (například méně než 10 nm) jeden od druhého. Účinnost přenosu energie je diktována převážně blízkostí donoru a akceptoru a klesá s šestou mocninou vzdálenosti. Měření ET proto silně odráží blízkost sloučenin donoru a akceptoru, a změny v ET citlivě odrážejí blízkost sloučenin, jako je například asociace nebo disociace donoru a akceptoru.
Je proto aspektem výhodného provedení poskytnout metodu zkoumání potenciálního inhibitoru MIF v předmětné části kontaktováním MIF nebo komplexu MIF···♦ vazebné činidlo včetně molekul jednoho nebo více donoru ET a akceptoru ET, excitováním donoru ET za vzniku excitované molekuly donoru ET a detekováním signálu generovaného přenosem energie z donoru ET na akceptor ET. Jak je zde rovněž uvedeno, pro metoda může být použita jakákoliv vhodná molekula donoru ET a molekula akceptoru ET, která může fungovat jako donor-akceptorový pár.
V jistých výhodných provedeních detekovatelný signál, který je generován přenosem energie mezi molekulami donoru ET a akceptoru ET, vzniká z přenosu energie fluorescenční rezonance (FRET), jak je diskutováno výše, kFRET dochází uvnitř molekuly, nebo mezi dvěma různými typy molekul, kde je energie z excitovaného donorového fluoroforu přenášena přímo na akceptorový fluorofor (pro přehled viz Wu et al., AnalyticalBiochem. 278:1-13,1994).
V jiných aspektech výhodného provedení je testována schopnost potenciálního inhibitoru působit na export MIF.
První krok takové metody je detekovat MIF extrabuněčné. Pro tuto metodu jsou použity testovací buňky exprimující MIF (tj. buňky THP-1). Testovací buňky buď mohou produkovat MIF přirozeně, nebo z přeneseného expresního vektoru. Testovací buňky výhodně exprimují protein normálně, takže transfekce pouze zvyšuje exprimované hladiny. Takže pro expresi MIF a a IL-1 jsou preferovány buňky THP-1. Pokud se zkoumají virálně odvozené proteiny, jako je HIV tat, jestliže testovací buňky neprodukují protein „přirozeně”, mohou být snadno transfekovány použitím vhodného vektoru, takže testovací buňky exprimují požadovaný protein, jak si může snadno uvědomit odborník v oboru.
Po expresi je MIF detekován jakoukoliv z různých metod a procedur. Tyto metody zahrnují značeni protilátkami ve spojení s průtokovou cytometrií, konfokální mikroskopii, analýzu podobnosti, imunoprecipitaci buněčného cytosolu nebo média, Western Blot buněčného média, ELISA, jedno- nebo dvourozměrnou gelovou analýzu, HPLC nebo bioassay. Vhodnou metodou pro úvodní analýzu je ELISA. Export MIF může být potvrzen některou z ostatních metod, výhodně imunoprecipitaci buněčného média po metabolickém značení. Stručně, buňky exprimující protein MIF jsou pulzně značeny 15 minut pomocí 35S-methioninu a/nebo 35S-cysteinu v methioninu a/nebo médiu bez cysteinu a následně převedeny do média s nadbytkem methioninu a/nebo cysteinu. Frakce média se spojí a vyčistí centrifugací, například v mikrocentrifuze. Lýzní pufr obsahující 1 % NP• · ·
911 ·· » « · * ·
111 * • ····«>· · • 119
1919 1 ·· ··*
40,0,5 deoxycholátu (DOC), 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 10 nM PMSF, 10 ng/ml aprotininu, 10 ng/ml leupeptinu a 10 ng/ml pepstatinu se přidá k vyčištěnému médiu. Přidá se protilátka proti MIF a následně se médium inkubuje v chladu, a přidá se druhá srážecí protilátka nebo imunoglobulin vázající protein, jako protein A-Sepharose® nebo GammaBind™-Sepaharose®, pro další inkubaci. Paralelně jako kontrola se monitoruje protein cytosolu a protilátka proti proteinu cytosolu je upřednostňována při imunoprecipitacích. Komplexy jsou dále promyty ledově chladným pufrem IP (0,15 M NaCI, 10 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2,1 % DOC, 1 % NP-40, 0,1 % SDS). Imunitní komplexy se eluují přímo do vzorkového pufru gelu SDS a podrobí se elektroforéze v SDS-PAGE. Gel se použije při fluorografii, vysuší se a exponuje na rentgenový film. Buňky mohou být alternativně navrženy tak, aby produkovaly MIF, který je označen značkovačem, takže přítomnost aktivního MIF může být zjišťována pomocí náhradní aktivity značkovače.
Aniž by bylo žádoucí být vázán teorií, očekává se, že předmětné inhibitory fungují prostřednictvím přímé interakce s přirozeně produkovaným komplexem MIF takovým způsobem, že dostatečně pozmění konformaci proteinu, aby zablokoval jeho biologickou aktivitu. Tato interakce může být mapována rentgenovou krystalografií společných krystalů MIF se sloučeninou, aby se určilo přesné místo interakce. Jedno místo lokalizuje kapsu, která je odpovědná za tautomerázovou aktivitu MIF.
Screeningové analýzy inhibitorů exportu MIF se mění podle typu inhibitoru MIF a povahy aktivity, která je ovlivněna. Zkoušky mohou být prováděny in vitro nebo in vivo. Zkoušky in vitro jsou všeobecně navrhovány pro vyhodnocení aktivity MIF, nebo pro hromadné analýzy, a zkoušky in vivo jsou navrhovány pro vyhodnocení aktivity MIF, extracelulární nebo intracelulární lokalizaci na modelovém buněčném nebo zvířecím systému. Při jakékoliv z těchto analýz je staticky významný přírůstek nebo pokles ve srovnání s řádnou kontrolou indikativní pro zvýšení inhibice.
Jedna analýza in vitro může být provedena zjišťováním efektu potenciální sloučeniny na schopnost MIF inhibovat migraci makrofágů. Stručně, jako indikátorové buňky jsou v podstatě upřednostňovány lidské monocyty z periferální krve v systému kapičkové analýzy na agaróze, jak je popsáno v publikaci Weiser et al., Cell. Immunol, 90:167-178,1985 a Harrington etaí, J. Immunol. 110:752-759,1973. Mohou být použity i jiné systémy zkoušek analyzování migrace makrofágů. Taková analýza je popsána «· · •» · ·· · · · · ««· ♦ · · ··« · φ Λ ···· · · · · • ·«·· · · · · · · · »999 » · ·· *··· ···» 9 99999 99 9 v publikaci Hermanowski-Vosatka etal., Biochem. 38:12841-12849,1999.
Alternativní analýza in vitro je navržena pro měření schopnosti MIF katalyzovat tautomerizaci D-izomeru dopachromu (viz Rosengren etal., Mol. Med. 2:143-149,1996; Winder etal., J. Cell. Sci. 166:153-166,1983; Aroca etal, Biochem J. 277:393-397). Stručně, v této metodě je D- dopachrom poskytnut MIF v přítomnosti nebo nepřítomnosti potenciálního inhibitoru a monitoruje se schopnost katalyzovat tautomerizaci na 5,6dihydroxyindol-2-karboxylovou kyselinu. Avšak výhodnější může být použití methylesterů D-dopachromu, neboť je pozorován rychlejší průběh reakce. Detekce tautomerizace se může provádět kteroukoliv z množství standardních metod.
Při podobné analýze může být testována schopnost MIF katalyzovat tautomerizaci fenylpyruvátu (viz Johnson et al., Biochem 38(48):16024-16033,1999). Stručně, při této metodě je typicky ketonizace fenylpyruvátu nebo (p-hydroxyfenyl)pyruvátu následována spektroskopií. Tvorba produktu může být ověřována působením MIF na tyto sloučeniny a následná konverze na malát analýzou 1H NMR.
Analýzy in vivo se mohou provádět v buňkách transfekovaných buď tranzientně nebo stabilně expresním vektorem obsahujícím molekulu nukleové kyseliny MIF takovou jako je popsána zde. Těmto buňkám je dávána přednost při měření aktivity MIF (tj. modulaci apoptózy, proiiferace apod.) nebo při extracelulárnf nebo intracelulární lokalizaci za přítomnosti nebo nepřítomnosti potenciální sloučeniny. Při analýze na apoptózu se může použít řada buněčných analýz pro zjišťování fragmentace nukleové kyseliny a porozity buněk, včetně např. barvení a mikroskopie.
Jiné analýzy se mohou provádět v modelových buněčných nebo zvířecích systémech vystavením systému rekobinantnímu nebo přirozeně se vyskytujícímu MIF nebo indukováním exprese endogenního MIF za přítomnosti nebo nepřítomnosti sloučeniny, tím se určí statisticky významné zvýšení nebo snížení patologie systému. Například pro vyvolání odpovědi na toxický šok může být použit LPS.
Zde stručně popsané metody mohou být použity pro identifikaci inhibitoru specifického pro MIF.
V jakékoliv analýze zde popsané mohou testované buňky exprimovat MIF ···· přirozeně (tj. buňky THP-1) nebo po zavedení rekombinantní molekuly DNA kódující protein. Transfekční a transformační protokoly jsou dobře známé ze stavu techniky a zahrnují tranfekci zprostředkovanou Ca2PO4, elektroporci, infekci virovým vektorem, transfekci zprostředkovanou DEAE-dextranem apod.. Jako alternativa k proteinům popsaným výše mohou být použity chimérické proteiny MIF (tj. fůze proteinu MIF s jiným proteinem nebo proteinovým fragmentem), nebo proteinové sekvence zkonstruované tak, že postrádají leader sekvenci. V podobném stylu může být zkonstruována fúze k přímé sekreci, exportu nebo retenci v cytosolu. Kterákoliv z těchto sekvencí může být použita ve fúznfm konstruktu s MIF k asistování při zkoumání inhibitorů. Hostitelská buňka může také exprimovat MIF jako důsledek onemocnění, infekce virem apod.. Vylučované proteiny, které jsou exportovány na základě leader sekvence, jsou dobře známy a zahrnují lidský chorionový gonadotropin (hGCa), růstový hormon, růstový faktor hepatocytů, transferin, růstový faktor nervů, vaskulární endotheliální růstový faktor, ovalbumin, a inzulínu podobný růstový faktor. Podobně jsou dobře známy cytosolové proteiny a zahrnují neomycinfosfotransferázu, β-galaktosidázu, aktin a ostatní cytoskelektální proteiny, a enzymy, jako proteinkinázu A nebo C. Nejužitečnější cytosolové nebo vylučované proteiny jsou ty, které se snadno měří běžnými technikami, jako je ELISA. Tři skupiny proteinů (leaderless, vylučované a cytosolové) mohou být přirozeně exprimovány společně, společnou transfekci v testovaných buňkách, nebo transfekované odděleně do oddělených hostitelských buněk. Pro analýzy zde popsané mohou být buňky transformované stabilně nebo exprimovat protein tranzientně.
Imunoprecipitace je jednou z metod, které mohou být použity k určení inhibice. Stručně, buňky exprimující MIF přirozeně nebo z konstruktu introdukovaného vektoru jsou značeny 35S-methioninem a/nebo 35S-cysteinem po kratší dobu, typicky 15 minut nebo déle, v kultivačním médiu bez cysteinu a/nebo methioninu. Po pulzním značení jsou buňky promyty médiem s přidaným nadbytkem neznačeného methioninu a cysteinu a heparinem, pokud ho leaderless protein váže. Buňky se poté kultivují v tomtéž médiu po různou dobu. Do kultivace se přidají různé koncentrace potenciálních inhibitorů nebo zlepšovačů. Supernatant z kultivace se sbírá a vyčistí. Supernatanty se inkubují s anti-MIF imunitním sérem nebo monoklonální protilátkou, nebo s protilátkou proti značkovači, jestliže je peptidový značkovač přítomen, následuje působení rozvojovým reagentem jako je Cowanův kmen I Staphyllococcus aureus, proteinová A-Sepharose® nebo GammaBind™ G-Sepharose®. Imunitní komplexy se granulují centrifugací, promyjí pufrem obsahujícím 1 % NP-40 a 0,5 % deoxycholátu, EGTA, PSMF, aprotinin, leupeptin a • · ·
4
4444 >4 « * ř · · «4 ·4 4 pepstatin. Sraženiny se pak promyjí pufrem obsahujícím fosforečnan sodný pH 7,2, deoxycholát, NP-40 a SDS. Imunitní komplexy se eluujf do vzorkového pufru gelu SDS a separují metodou SDS-PAGE. Gel se zpracuje fluorografií, exponuje na rentgenový film.
Alternativně se může dát přednost metodě ELISA pro detekci a kvantifikaci množství MIF v buněčných supernatantech. Metodě ELISA se dává přednost při analýzách velkého počtu vzorků. Stručně, 96-jamkové desky se povlečou protilátkou proti MIF nebo proti značkovači, omyjí, a blokují 2% BSA. Buněčný supernatant se pak přidá do jamek. Po následovně inkubaci se přidá druhá protilátka (tj. proti MIF). Druhá protilátka by měla být spojena s se značkou nebo detekčním činidlem, jako enzymem nebo činidlem na biotin. Po další inkubaci se přidá vývojové činidlo a množství MIF se určí za požití čítače desek ELISA. Vývojové činidlo je substrát pro enzym navázaný na druhou protilátku (typicky protilátka proti izotypu) nebo pro enzym navázaný na streptavidin. Vhodné enzymy jsou dobře známy ze stavu techniky a zahrnují křenovou peroxidázu, která působí na substrát (tj. ABTS) za vzniku kolorimetrické reakce. Je zjištěno, že spíše než použití druhé protilátky navázané na enzym by měla být protilátka proti MIF přímo navázána na křenovou peroxidázu nebo jiné ekvivalentní detekční činidlo. Je-li to požadováno, buněčné supernatanty se mohou koncentrovat pro zvýšení detekční hladiny. Dále mohou být použity detekční metody jako ELISA apod. k monitorování intracelulární stejně jako extracelulární hladiny MIF. Jestliže jsou požadovány intracelulární hladiny, dává se přednost buněčnému lyzátu. Jestliže jsou požadovány extracelulární hladiny, může se analyzovat médium.
ELISA může být snadno adaptována pro zkoumání mnoha potenciálních inhibitorů nebo zlepšovačů s vysokým výkonem. Stručně, taková analýza je vhodně založena na buňkách a provádí se na 96-jamkových deskách. Testované buňky, které přirozeně nebo stabilně exprimují MIF, jsou umístěny na desku v množstvích vhodných pro vyjádření detekce produktu, jako je 20 000 buněk na jamku. Avšak jestliže buňky neexprimují protein přirozeně, dosáhne se tranzientní exprimace, jako elektroporcí nebo transfekcí zprostředkovanou Ca2PO4. Pro elektroporaci se umístí 100 μΙ směsi buněk (tj. 150 000 buněk/ml) a vektor DNA (5 pg/ml) do jednotlivých jamek 96-jamkové desky. Buňky se elektroporují za použití přístroje s 96 jamkovými elektrodami (tj. ECM 600 Electroporation systém, BTX, Genetronics, lne.). Optimální podmínky pro elektroporaci se určí experimentálně pro jednotlivý typ hostitelských buněk. Napětí, odpor a délka pulzu jsou typické proměnné parametry. Vodítka pro optimalizaci elektroporace by měla být ···· ·· · · obdržena od výrobce nebo nalezena v protokolových manuálech, jako je Current Protocols in Molecular Biology (Ausbuel et ai. (ed.), Willey Interscience, 1987).Buňky se zředí stejným objemem média a inkubují 48 hodin. Elektroporace se může provádět na různých typech buněk, včetně savčích buněk, kvasinek, bakteriích apod.. Po inkubaci se přidá médium s inhibitorem nebo bez něj a buňky se dále inkubují 1 až 2 dny. Po této době se médium sebere a protein se analyzuje jakoukoliv z metod zde uvedených. Pro detekci proteinu se výhodně použije ELISA. Testuje se výchozí koncentrace 50 pM. Jestliže toto množství dává statisticky významnou redukci exportu nebo redukci detekce monoklonální protilátky, potenciální inhibitor se dále testuje na odpověď na dávku.
Alternativně se může koncentrovaný supernatant podrobit elektroforéze na gelu SDS-PAGE a převést na pevný nosič, jako je nylon nebo nitrocelulóza. MIF se pak detekuje imunoblotem (viz Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) s použitím protilátky proti MIF obsahující izotopovou nebo neizotopovou značkovací skupinu. Tyto značkovací skupiny zahrnují, ale nejsou tím omezeny, enzymy, kofaktory, barviva, radioizotopy, luminiscenční molekuly, fluorescenční molekuly a biotin. Značkovací molekula je výhodně 125l nebo křenová peroxidáza, která může být detekována inkubací s 2,2'-azinodi-3-ethybenzthiazolinsulfonovou kyselinou. Tyto detekce popsané výše se snadno přizpůsobí pro použiti, jestliže MIF obsahuje peptidový přívěsek.
V takovém případě se protilátka váže na peptidový přívěsek. Jiné metody zahrnují chromatografií založenou na velikosti částic nebo na náboji, včetně HPLC a aflnitní chromatografie.
Alternativně se se může použít bioassay ke kvantifikaci množství aktivního MIF, přítomného v buněčném médiu. Například bioaktivita MIF se může měřit zjišťováním migrace makrofágů. Stručně, buňky transfekované expresním vektorem obsahujícím MIF se kultivují přibližně 30 hodin, a během této doby se přidá potenciální inhibitor nebo ziepšovač. Po inkubaci se buňky převedou do média s nízkým obsahem séra pro dalších 16 hodin inkubace. Médium se odstraní a vyčisti centrifugací. K médiu se přidá lýzní pufr obsahující inhibitory proteázy, nebo alternativně se buňky lýzují a vnitřní hodnoty se určí následujícím způsobem. Bioaktivita MIF se pak měří metodou migrace makrofágů, aktivitou izomerázy, nebo proliferační metodou. Proliferační metoda se provádí přidáním různých množství eluátu ke kultivovaným neaktivním buňkám 3T3. Triciovanýthymidin se přidá k médiu a množství sraženiny TCA se měří o 24 hodin později. Redukce vitálního barviva MTT je alternativní cestou k měření proliferace. Jako standard se může použít
9« 9···
9
999
9
9 9
9999
9 čištěný rekombinantní lidský FGF-2. Jiné funkce se mohou měřit jinými vhodnými biometodami dostupnými ve stavu techniky, jako toxickým šokem indukovaným CPS, toxickým šokem indukovaným TSST-1, artritidou indukovanou kolagenem atd..
Jiné angiogenní metody in vitro zahrnují bioassaye, které měří proliferaci endoteliálních buněk v kolagenovém gelu (Goto etal., Lab. Invest. 69:508,1993), společnou kultivaci mozkových kapilárních endoteliálních buněk na kolagenových gelech, oddělených komůrkou od buněk exportujících protein MIF(Okamure etal., B.B.R.C. 186:1471,1992; Abe etal., J. Clin. Invest. 92:54,1993), nebo zkoumání migrace buněk (viz Warren etal., J. Clin. Invest. 95:1789,1995).
Produkce protilátek
Termín „protilátky“, jak je použit zde, je široký termín a používá se v jeho obvyklém smyslu, týkajíc! se včetně, bez omezení, polyklonálních, monospecifických a monoklonálních protilátek, stejně jako antigen vázajících fragmentů takovýchto protilátek. Pokud jde o protilátky proti MIF/cíli výhodných provedení, termín „antigen“, jak je použit zde, je široký termín a používá se v jeho obvyklém smyslu, týkající se včetně a bez omezení polypeptidů faktoru inhibice migrace makrofágů nebo cílového polypeptidů, varianty nebo jeho funkčního fragmentu. Protilátka proti MIF/cíli, nebo antigen vázající fragment takové protilátky může být charakterizován specifickou vazebnou aktivitou k cílovému polypeptidů nejméně 1 x 105 M1, obecně nejméně 1 x 106 M1, a výhodně nejméně 1 x 10® M1. Fragmenty Fab, F(ab')2, Fd a Fv protilátky proti MIF/cíli, které si udržují specifickou vazebnou aktivitu pro epitop specifický k polypeptidů MIF/cít, jsou zahrnuty ve výhodných provedeních. Zvláštní zájem se věnuje těm protilátkám, které vážou aktivní polypeptidy a jsou vytěsněny navázáním malé molekuly inhibitoru. Odborník v oboru snadno rozpozná, že takové vytěsnění může být důsledkem konformační změny, tím změny charakteru epitopu, kompetitivního navázání na epitop, nebo sterického vyloučení protilátky z jejího epitopu. V jednom příkladu může být aktivní místo enzymu epitopem pro konkrétní protilátku a navázáním malé molekuly přímo nebo v blízkosti aktivního místa se ztrácí imunoreaktivita protilátky a tím je umožněno použití ztráty imunoreaktivity s protilátkou jako náhradního značkovače pro enzymovou aktivitu.
Navíc je termín „protilátka“, tak, jak je zde použit, široký termín a používá se v jeho obvyklém smyslu, týkající se včetně a bez omezení přirozeně se vyskytujících *· ···· • · • ··· ·· · • · · » ··· ·· · • · · • · · · • · ···· « · · ·· · protilátek a protilátek, které se porozené nevyskytují, včetně například jednořetězcových protilátek, chimérních, bifunkčních a humanizovaných protilátek, stejně jako jejich antigen vázajících fragmentů. Takové protilátky, které se přirozeně nevyskytují, mohou být konstruovány za použití syntézy peptidů na pevné fázi, mohou být vyrobeny rekombinantně, nebo mohou být získány například prozkoumáváním kombinatorických knihoven včetně variabilních těžkých řetězců a variabilních lehkých řetězců (Huse etal., Science 246:1275-1281 (1989)). Tyto a další metody přípravy například chimérních, humanizovaných, CDR-roubovaných, jednořetězcových a bifunkčních protilátek jsou dobře známy ze stavu techniky (Winter a Harris, Immunol. Today 14:243-246 (1993); Ward et al., Nátuře 341:544-546 (1989); Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manuai, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1992); Borrabeck, Antibody Engineering, 2. vyd., Oxford Univ. Press (1995) Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach, IRL Press (1992)).
V jistých výhodných provedeních se může získat protilátka proti MIF/cíli použitím imunogenu, jako je například izolovaný peptid zahrnující oblast aktivního místa MIF nebo cílového polypeptidů, která se může připravit z přírodních zdrojů nebo se získat rekombinantně, jak je popsáno výše, nebo imunogenní fragment MIF/cílového polypeptidů (tj imunogenní sekvence zahrnující 8 až 30 nebo více sousedících aminokyselinových sekvencí), včetně syntetických peptidů, jak je popsáno výše, Neimunogennl peptidová část MIF/cílového polypeptidů se může stát imunogenní náhodným spojením s molekulou jako je bovinní sérový albumin (BSA) nebo .záklopka klíčové dírky“ hemocyanin (KLH), nebo exprimací peptidové části jako fúzní protein. Různé další molekuly nosičů a metody pro připojování haptenu k molekule nosiče jsou dobře známy ve stavu techniky (Harlow a Lané, supra, 1992).
Metody pro pěstování polyklonálních protilátek, například na králících, kozách, myších nebo jiných savcích jsou dobře známy ve stavu techniky. Navíc se mohou monoklonální protilátky získat za použiti metod, které jsou dobře známy ve stavu techniky a rutinní (Harlow a Lané, supra, 1992). Například buňky sleziny ze savce imunizovaného cílovým polypeptidem mohou být spojeny s vhodnou buněčnou linií myelomu, jako jsou buňky myelomu SP/02 k produkci hybridomových buněk. Klonované hybridomové buněčné linie se mohou zkoumat pomoci značeného cílového polypeptidů nebo jeho funkčního fragmentu, aby se identifikovaly klony, které vylučují monoklonální protilátky proti cílovému polypeptidů, mající požadovanou specificitu. Hybridomy exprimující
4444
4
4 4 4
4
4 4 4 4
4444 • ·
444 · •
· ♦
• 4 4
4 4 • 4 4 4 • 4 4444 · · «4 4 monoklonální protilátky proti cílovému polypeptidu, které mají požadovanou specificitu a afinitu, se mohou izolovat a používat jako kontinuální zdroj protilátek, které jsou vhodné například pro přípravu standardizovaných souprav. Podobně rekombinantní fág, který vylučuje například jednořetězcový polypeptid proti cíli, také poskytuje monoklonální protilátku, která se může použít pro přípravu standardizovaných souprav.
Aplikace a metody používající inhibitory MIF
Inhibitory MIF mají různá aplikovatelná použití, jak je poznamenáno výše. Potenciální Inhibitory MIF se mohou izolovat nebo získat z různých zdrojů, jako jsou bakterie, houby, rostliny, paraziti, knihovny chemikálií (malé molekuly), peptidy nebo peptidové deriváty a podobně. Odborník v oboru může dále uznat, že k inhibici dochází, když je pozorována statisticky významná odchylka od kontrolních hodnot.
Tím, že MIF hraje různé role v patologii a homeostázi, inhibice aktivity MIF nebo extracelulární lokalizace MIF může mít terapeutický účinek. Současné studie například ukázaly, že MIF je mediátorem endotoxémie, kde protilátky proti MIF plně ochránily myši proti letalitě indukované LPS. Viz Bernhagen etai, Nátuře 365:756-759,1993; Calandra etai, J. Exp. Med. 779:1895-1902,1994; Bernhagen etai, Trends Microbiol. 2:198-201, 1994. Protilátky proti MIF dále zřetelně zvýšily přežití u myší napadených grampozitivními baktériemi, které indukují septickýšok. Bernhagen etal., J. Mol. Med. 76:151-161,1998. Jiné studie demonstrovaly roli MIF v růstu nádorových buněk a tato znecitiivujfcí inhibice MIF vede k rezistenci ke stimulům apoptózy. Takahashi etal., Mol. Med. 4:707-714,1998; Takahashi etal., Microbiol. Immunol. 43 (1):61-67,1999. Navíc zjištění, že MIF je měřící regulátor působení glukokortikoidů, indikuje, že metody inhibice extracelulární lokalizace MIF mohou umožnit léčení různých patologických stavů, včetně autoimunity, zánětů, endotoxémie, a syndromu respiračních potíží dospělých, zánětllvých onemocnění střev, otitis media, zánětlivých onemocnění kloubů a Crohnovy choroby. Bernhagen etal., J.
Mol. Med. 76:151-161,1998; Calandra etal., Nátuře 377:68-71,1995; Donelly et al., Nat. Med. 3:320-323,1997. Protože o MIF je zjištěno, že je angiogenní, inhibice tohoto cytokinu může mít anitangiogenní aktivitu a zvláštní důležitost v angiogenních onemocněních, které zahrnují, ale nejsou tím omezeny, rakovinu, diabetickou retinopatii, psoriázu, angiopatii, neplodnost, obezitu a genetické choroby dysfunkce glukokortikoidů jako Cushlngova a Addisonova choroba.
4
4 4
4 4 4 • · 4 444
4 4 • 4 4
4 4 • 4 4 • ···· 4 • 4 • •♦4 4 ·« ·4»4 • · · · 4·4
4 4
4 · • 4 4··
Inhibitory aktivity nebo exportu MIF se mohou použit terapeuticky a také použit ve spojení se skupinou, zaměřujíc! se na cíl, která se váže na povrchový buněčný receptor specifický pro konkrétní buňky. Podávání inhibitorů nebo zlepšovačů se všeobecně děje podle pevně stanovených protokolů. Sloučeniny podle výhodných provedení se mohou formulovat pro indikovaný způsob podávání, včetně například orálního, nasálního, venózního, intrakraniálniho, intraperitonálního, subkutánního nebo intramuskulárního podávání. Mezi jinými provedeními se mohou podávat kompozice zde popsané jako implantáty s trvalým uvolňováním. Mezi ještě jinými provedeními se mohou formulovat kompozice podle výhodných provedení jako lyofylizáty za použití vhodných excipientů, které dodávají lyofylizátu stabilitu, a následně se rehydratují.
V jiném provedení se stanoví farmaceutické kompozice obsahující jeden nebo více inhibitorů MIF. Pro účely podávání mohou být formulovány sloučeniny podle výhodného provedeni jako farmaceutické kompozice. Farmaceutické kompozice podle výhodných provedení obsahují jeden nebo více inhibitorů MIF podle výhodných provedení (tj. sloučeniny obecného vzorce la a lb)a farmaceuticky akceptovatelný nosič a/nebo ředidlo. Inhibitor MIF je přítomen v kompozici v množství, které je účinné pro léčení konkrétního onemocnění, tj. v množství, dostatečném pro dosažení snížené hladiny nebo aktivity MIF, symptomů, a/nebo přednostně s akceptovatelnou toxicitou pro pacienta. Farmaceutické kompozice podle výhodných provedení mohou výhodně zahrnovat inhibitor MIF v množstvích od 0,01 mg do více než 1000 mg na dávku v závislosti na způsobu podávání, výhodně 0,025,0,05, 0,075,0,1,0,2, 0,3, 0,4,0,5,0,6, 0,7,0,8 nebo 0,9 mg až 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150,175, 200, 225, 250, 300, 350, 375, 400, 425,
450, 500,600, 700, 800 nebo 900 mg, a ještě výhodněji od 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10,15, 20 nebo 25 mg až 30, 35,40,45, 50,55 nebo 60 mg. Avšak v jistých provedeních se může dát přednost vyšším nebo nižším dávkám než těm, které jsou uvedeny výše.
Vhodné koncentrace a dávky mohou být snadno určeny odborníkem v oboru.
Farmaceuticky akceptovatelné nosiče a/nebo ředidla jsou dobře známy odborníkům v oboru. Akceptovatelné nosiče pro kompozice formulované jako kapalné roztoky zahrnují slanou a sterilní vodu, a mohou volitelně zahrnovat antioxidanty, pufry, bakteriostatika a jiná obecná aditiva. Kompozice se mohou formulovat jako pilulky, kapsle, granuláty nebo tablety, které obsahují navíc vedle inhibitoru MIF ředidla, disperzní a povrchově aktivní činidla, pojivá a lubrikanty. Odborník v tomto oboru může dále formulovat inhibitor MIF vhodným způsobem a v souladu s akceptovanými praktikami, jak • · 9 • 9 9 • · · • 9999 • 999 • · · ··· ·
• · · • 9 9 9 • · 9 9 9 9
9 ·
9* · jsou popsány v Remingtoris Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, USA 1990.
Do kontextu výhodných provedení jsou navíc zahrnuty prekurzory. Prekurzory jsou jakékoliv kovalentně vázané nosiče, které uvolňují sloučeninu obecného vzorce Ia nebo Ib in vivo, když je takovýto prekurzor podán pacientovi. Prekurzory se všeobecně připravují modifikací funkčních skupin takovým způsobem, aby byla modifikace štěpena buď rutinní manipulací nebo in vivo za vzniku rodičovské sloučeniny.
S ohledem na stereoizomery mohou mít sloučeniny obecného vzorce Ia a Ib chirální centra a mohou se vyskytovat jako racemáty, racemické směsi a jako individuální enantiomery nebo diastereoizomery. Všechny tato izomerní formy jsou zahrnuty ve výhodných provedeních, včetně jejich směsí. Některé krystalické formy sloučenin Ia a Ib mohou dále existovat jako krystalové modifikace, které jsou zahrnuty ve výhodných provedeních. Navíc některé sloučeniny obecného vzorce fa a jb mohou také tvořit solváty s vodou nebo jinými organickými rozpouštědly. Takovéto solváty jsou podobně zahrnuty v rozsahu výhodných provedení.
V jiném provedení se jedná o metodu léčení různých onemocnění a stavů, včetně zánětlivých onemocnění, artritidy, onemocnění se vztahem k imunitě a podobně. Takové metody zahrnují podávání sloučeniny podle výhodného provedení teplokrevnému zvířeti v množství dostatečném k léčení nemoci nebo stavu. Takové metody zahrnují systémové podávání inhibitoru MIF podle výhodného provedení, výhodně ve formě farmaceutické kompozice. Jak je použito zde, systémové podávání zahrnuje orální a parenterální metody podávání. Vhodné farmaceutické kompozice pro orální podávání inhibitoru MIF zahrnují prášky, granule, pilulky, tablety a kapsle stejně jako kapaliny, syrupy, suspenze a emulze. Tyto kompozice také mohou zahrnovat ochucovadla, konzervační přísady, suspendující, zahušťující a emulgační činidla a ostatní farmaceuticky akceptovatelná aditiva. Sloučeniny podle výhodného provedení pro parentální aplikaci se mohou připravit ve vodných injekčních roztocích, které mohou obsahovat vedle inhibitoru aktivity MIF exportní, pufrovaci, antioxidační, bakteriostatická a jiná aditiva, běžně používaná v takovýchto roztocích.
Jak je uvedeno výše, podáváni sloučenin podle výhodných provedení se může použít k léčení nejrůznějších onemocnění nebo stavů. Sloučeniny podle výhodných •Φ ···· • · • · · • · · ·« • · • · • · · > ·· · · provedení mohou být podávány zvláště teplokrevným zvířatům pro léčení zánětů, rakoviny imunitních onemocnění a podobně.
Sloučeniny inhibující MIF se mohou použít v kombinačních terapiích s jinými farmaceutickými sloučeninami. Sloučenina inhibující MIF je ve výhodných provedeních přítomná v kombinaci s konvenčními léčivy, používanými při onemocněních nebo stavech, kde MIF je patogenní, nebo kde MIF hraje klíčovou nebo jinou roli v procesu onemocnění. Ve zvláště výhodných provedeních se jedná o farmaceutické kompozice obsahující jednu nebo více sloučenin inhibujících MIF, včetně, ale bez omezení na sloučeniny obecného vzorce la a Ib, v kombinaci s jednou nebo více farmaceutickými sloučeninami, včetně, ale bez omezení na léčiva pro léčení různých rakovin, astmatu nebo jiných respiračních onemocnění, sepse, artritidy, zánětlivého onemocnění střev (IBD) nebo jiných zánětlivých onemocnění, imunitních onemocnění, a jiných nemocí nebo stavů, kde MIF je patogenní.
Ve zvláště výhodných provedeních je přítomna jedna nebo více sloučenin inhibujících MIF v kombinaci s jednou nebo více nesteroidnímí protízánětlivými léčivy (NSAIDs) nebo jinými farmaceutickými sloučeninami pro léčení artritidy nebo jiných zánětlivých onemocnění. Upřednostňované sloučeniny zahrnuji, ale nejsou tím omezeny, celecoxib, rofecoxib, NSAIDS, například aspirin, celecoxib, cholin-magnesiumtrisalycilát, kalium diclofenac, natrium diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, flurbiprofen, ibuprofen, indomethacin, ketoprofen, ketorolac, kyselina melenamová, nabumeton, naproxen, sodium naproxen, oxaprozin, piroxicam, rofexocib, salsalát, sulindac a tolmetin, a kortikosteroidy, například kortizon, hydrokortizon, methylprednisolon, prednison, prednisolon, betamethezon, beclomethazon dipropionát, budenosid, dexamethazon natriumfosfát, flunisolid, fluticason propionát, triamcinolon acetonid, betamethazon, fluocinolon, fluocinonid, betamethazon dipropionát, betamethazon valerát, desonid, desoximethazon, triamcinolon, clobetazol propionát a dexamethazon.
Ve zvláště výhodných provedeních je jedna nebo více sloučenin inhibujících MIF přítomna v kombinaci s jedním nebo více beta-stimulanty, inhalačními kortikosteroidy, antihistaminiky, hormony nebo jinými farmaceutickými sloučeninami pro léčení astmatu, akutního respiračního syndromu nebo jiných respiračních chorob. Upřednostňované sloučeniny zahrnují, ale nejsou tím omezeny na beta-stimulanty, například obecně předepisované bronchodilatancia, inhalační kortikosteroidy, například beclomethazon, fluticazon, triamcinolon, mometazon a formy prednisonu, jako je prednison, prednisolon a • · ♦
Φ · · ·
Φ • Φ ···· methylprednisolon, antihistaminika, například azatadin, cabixonamin/pseudoefedrin, cetirizin, cyproheptadin, dexchlorfeniramin, fexofenadin, loratadin, promethazin, tripelenamin, bromfenyramin, cholofeniramin, clemastin, difenhydramin, a hormony, například epinefrin.
Ve zvláště výhodných provedeních je ve farmaceutické kompozici přítomna jedna nebo více sloučenin inhibujících MIF s farmaceutickými sloučeninami pro léčení IBD, jako je azathioprin nebo kortikosteroidy.
Ve zvláště výhodných provedeních je ve farmaceutické kompozici přítomna jedna nebo více sloučenin inhibujících MIF v kombinaci s farmaceutickými sloučeninami pro léčení rakoviny, jako je paclitaxel.
Ve zvláště výhodných provedeních je ve farmaceutické kompozici přítomna jedna nebo více sloučenin inhibujících MIF v kombinaci s imunosupresívními sloučeninami. Ve zvláště výhodných provedeních je ve farmaceutické kompozici přítomna jedna nebo více sloučenin inhibujících MIF v kombinaci s léčivy pro léčení autoimunitního onemocnění, například Lymovy choroby, lupénky (tj, systémové lupus erythematosus (SLE)) nebo AIDS. Taková léčiva mohou zahrnovat inhibitory proteáz, například indinavir, amprenavir, saquinavir, lopinavir, ritonavir a nelfinavir, nukleosidové inhibitory reverzních transkriptáz, například zidovudin, abacavir, lamivudin, idanosin, zalcitabin a stavudin, nukleotidové inhibitory reverzních transkriptáz, například tefonovir disoproxilfumarát, nenukleosidové inhibitory reverzních transkriptáz, například delaviridin, efavirenz a nevirapin, modifikátory biologických odpovědí, například etanrecept, infliximab, a jiné sloučeniny, které ínhibují nebo interferují s faktorem nekróz tumorů, virostatika, například amivudin a zidovudin.
Ve zvláště výhodných provedeních je přítomna jedna nebo více sloučenin inhibujících MIF v kombinaci s farmaceutickými sloučeninami pro léčení sepse, jako steroidy nebo protiinfekční účinné látky. Příklady steroidů zahrnují kortikosteroidy, například kortizon, hydrokortizon, methylprednisolon, prednison, prednisolon, betamethezon, beclomethazon dipropionát, budenosid, dexamethazon natríumfosfát, flunisolid, fluticason propionát, triamcinolon acetonid, betamethazon, fluocinolon, fluocinonid, betamethazon dipropionát, betamethazon vaierát, desonid, desoximethazon, triamcinolon, clobetazol propionát a dexamethazon. Příklady protiinfekčních účinných látek ·· ···· • · • ··· « · • · ··♦ ·· • · • · · • ♦·* • « zahrnují antihelmintika (mebendazol) antibiotika včetně aminocyklozidů (gentamycin, neomycin, tobramycin), fungicidní antibiotika (amfotericin b, fluconazol, griseofulvin, itraconazol, ketoconazol, nystatin, tolnaftát), cefalosporiny (cefaclor, cefazolin, cefotaxim, ceftazidim, ceftriaxon, cefuroxim, cefalexin), β-laktamová antibiotika (cefotetan, meropenem), chloramfenikol, makrolidy (azitromycin, claritromycin, erytromycin), peniciliny (penicilín G sodná sůl, amoxicilin, ampicilin, diclocaxilin, nafciiin, piperacilin, ticarcilin) tetracykliny (doxycyklin, minocyklin, tetracyklin) bacitracin, clindamycin, coiistmethát sodný, polymyxin b sulfát, vancomycin, virostatika včetně acykloviru, amantadinu, didanosinu, efavirenzu, foscametu, gancykloviru, indinaviru, lamivudinu, neifinaviru, ritonaviru, saquinaviru, stavudinu, vaiacykloviru, vaigancykloviru, zidovudinu, chinolony (cíprofioxacin, ievofloxacin), sulfonamidů (sulfadiazin, suifisoxazoi), sulfonů (dapson), furazolidonu, metronidazolu, pentamidinu, krystalického sulfanilamidu, gatifloxatinu a sulfamethoxazol/trimethoprimu.
Při léčení určitých nemocí může být prospěšné léčit pacienta inhibitorem MIF v kombinaci s anestetikem, například etanolem, buvipakainem, chiorprokainem, levobuvipakainem, lidokainem, mevipakainem, prokainem, ropivakainem, tetrakainem, desfluranem, izofluranem, ketaminem, propofolem, sevofluranem, kodeinem, fentanylem, hydromorfonem, markainem, meperidinem, metadonem, morfinem, oxykodonem, remifentanylem, su,fentanylem, butorfanolem, nalbufinem, tramadolem, benzokainem, dibukainem, chiorethanem, xylokainem a fenazopyridinem.
PŘÍKLADY
Inhibitory MIF podle výhodného provedeni se mohou připravit metodami popsanými v přikladu 1, Přiklad 2 ukazuje metodu prověřováni na inhibici aktivity nebo exportu pro sloučeniny podle výhodného provedení.
·· • · • · • · • ♦ *· ·· ···· ·· • · ···· • · ···· • · ···· • β • ···
Příklad 1
Syntéza reprezentativní sloučeniny
Na roztok ethylnitroacetátu (6,7 ml, 60,1 mmol) v N,N'-dimethylacetamidu (35 ml) se působilo 95% NaH (1,52 g, 60,2 mmol) po dávkách. Když ustal vývoj vodíku, reakční směs se zahřívala na 80 °C po 15 minut. Roztok N-methylisatoového anhydridů 1 (11,1 g, 62,5mmol) v N,N'-dimethylacetamidu (65 ml) se přidával po dobu 15 minut, po které se reakční směs zahřívala na 120 °C po 18 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo destilací, zbytek se rozpustil ve vodě a okyselil 6N HCI. Vzniklá sraženina se shromáždila a promyla vodou. Rekrystalízace zbytku z CH2CI2/éter poskytla chinolin 2a (5,75 g, 43 %) jako žlutou pevnou látku.
OEt
Na roztok diethylmalonátu (18,8 ml, 111 mmol) v N,N'-dimethylacetamidu (35 ml) se působilo 95% NaH (2,80 g, 111 mmol) po dávkách. Když ustal vývoj vodíku, reakční směs se zahřívala na 80 °C po 15 minut. Roztok N-methylisatoového anhydridů 1 (22 g, 124mmol) v N,N'-dimethylacetamidu (140 ml) se přidával po dobu 15 minut, po které se reakční směs zahřívala na 120 °C po 18 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo destilací, zbytek se rozpustil ve vodě a okyselil 6N HCI. Vzniklá sraženina se shromáždila a promyla vodou. Rekrystalízace zbytku z CH2CI2/éter poskytla chinolin 2b (11,7 g, 40 %) jako bílou pevnou látku.
ch3
I ch3
2a Y = NO2 2b Y ~- CO2Et
3a Y = NO2 3b Y - CO2Et
Alkohol 2_(6,2 g 2a, 11,1 g 2b) se rozpustil v POCI3 (70 ml pro 2a, 140 ml pro 2b) a roztok se zahříval na 95 ®C po tři hodiny. POCI3 se odstranil destilací a reakční směs se vlila do 500 ml ledové vody. Vodný roztok se neutralizoval použitím nasyceného roztoku NaHCO3, sraženina se shromáždila filtrací, znovu rozpustila v dichlormethanu, vysušila nad Na2SO4 a rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu. Tuhý reakční produkt byl přečištěn rekrystalizací z ethyléteru a získalo se 3,5 g 3a (52 %) nebo 7,8 g 3b (65 %).
H
I
Boc
5a R4 = CO(2-thienyl) 5b R4 = CO(phenyl)
6a R4 = CO(2-thienyl) 6b R4 = CO(phenyl) 6c R4 = CO(2-furanyl)
N-BOC piperazin 4 (5,0 g, 27 mmol) se rozpustil v pyridinu (15 ml) a přidalo se 20 mg DMAP. Neředěný chlorid kyseliny se přidával k roztoku při 0 až 5 °C pomalu po dobu 5 minut. Vzniklá hustá pasta se míchala přes noc (15 hodin) při teplotě místnosti předtím, než se nalila na led. Bílá krystalická sraženina se shromáždila filtraci, vysušila na vzduchu a vysušila ve vakuu a poskytla odpovídající N-BOC-N-acylpiperazin 5a (6,5 g,
%) nebo 5b (4,8 g, 94 %). Pevný reakční produkt se ihned použil v dalším stupni, sloučenina se rozpustila ve 100 ml dichlormethanu a přidala se neředěná TFA (10 ml). Po 3 hodinách při teplotě místnosti se roztok odpařil, zbytek se rozpustil v dichlormethanu a promyl NaHCO3 (nasyceným). Vodná vrstva se 10x extrahovala dichlormethanem, spojená organická vrstva se vysušila nad Na2SO4 a rozpouštědlo se odpařilo ve vakuu za vzniku sloučeniny 6a (4,5 g, 91 %, 75 % přes dva stupně) nebo sloučeniny 6b (2,95 g,
•. . ······ ··· • · · ·«· · ·: .
. · * « ···· · · · · • .... · · · · · · · ···· • · ·· * * * i ···· » ·· ··· ·· · %, 66 % přes dva stupně), nebo sloučeniny 6c, jak je komerčně dostupná od Lancaster
Synthesis (katalogové č
18698).
I
CHj
I
H
3a Y = NO2 3b Y = CO2Et
6a R4 = CO(2-thienyl) 6b R4 = CO(phenyl) 6c R4 = CO(2-fúranyI)
7a Y - NO2, R, = CO(2-thienyl) 7b Y = NO2, R, = CO(phenyl)
7c Y - CO2Et, R4 = CO(2-thienyl) 7d Y = CO2Et, R4 = CO(phenyl) 7e Y = NO2, R, = CO(2-fúranyl)
K roztoku chlorchinolonu 3 v toluenu se přidal piperazin 6 a poté 10 kapek pyridinu před zahříváním na 100 eC po 12 až 14 hodin. Směs se ochladila na teplotu místnosti, odpařila se dosucha, znovu se rozpustila v dichlormethanu a promyla solankou. Organické rozpouštědlo se vysušilo nad Na2SO4 a odstranilo ve vakuu. Chromatografie (silikagel, CHCI3:MeOH 85:15) poskytla produkt CBX 7 vedle znovuzískaného výchozího materiálu (30 až 40 %). Výtěžky produktu pro rekci jsou ukázány v tabulce 1.
Tabulka 1
N-acylpiperazin Chlorchinolon Adukt piperazin-chlorchinolin CBX
6a 1.θ9 3a 1,8 g 7a 0,9 g 28%
6a 1,6 g 3b 1,5 g 7b 0,9 g 34%
6b 2,6 g 3a 2,5 g 7c 1,3 g 32%
6b 2,7 g 3b 2,4 g 7d 1,5g 35%
6c 2,7 g 3a 3,2 g 7e 2,8 g 55%
Analytické údaje
7a. B.t. 167 -159 °C; Ή NMR (CDCI3, 300 Mhz) 6 7,85 (dd, 1H), 7,70 (dt, 1H), 7,49 (d, 1H), 7,35 (m, 2H), 7,08 (m, 1H), 3,95 (bs, 4H) 3, 75 (s, 3H), 3,3 (t, 4H); HRMS (FAB) počítáno pro C19H19N4O4S 399,1127, nalezeno 399,1117; analýza počítána pro
C19H19N4O4S: C, 57,28; H, 4,55; N, 14,06; O, 16,06; S, 8,05; nalezeno: C, 56,78; H, 4,50;
N, 13,73.
• · ·
7b. B.t. 215-217 °C; Ή NMR (CDCI3, 300 Mhz) 6 7,95 (dd, 1H), 7,70 (m, 1H)), 7,44 (m, 5H), 7,42 (m, 1H), 3,74 (m, 4H), 3,28 m,5H); HRMS (FAB) počítáno pro C21H20N4O4 399,1127, nalezeno 399,1117; analýza počítána pro C21H20N4O4 C, 64,28; H, 5,14; N, 14,28; 0,16,31; nalezeno C, 64,84;H, 5,16; N, 13,78.
7c. B.t. 183-185 °C; Ή NMR (CDCI3, 300 Mhz) δ 7,95 (dd, 1H), 7,61 (m, 1H), 7,48 (m, 1H) 7,38 (d, 1H) 7,32 (m, 1H), 7,25 (Μ, 1H) 7,07 (Μ, 1H), 4,44 (q, 2H), 3,95 (bs, 4H, 3,70 (s, 3H), 3,35 (bs, 4H, 1,44 (t, 3H); HRMS (FAB) počítáno pro C^H^N.C^S 426,1488, nalezeno 426,1487; analýza počítána pro C22H24N3O4S: C, 62,10; H, 5,45; N, 9,88; 0,15,04; S, 7,54; nalezeno; C, 62,08; H, 5,45; N, 9,77.
7d. B.t. 164-166 °C; Ή NMR (CDCI3, 300 Mhz) δ 7,92 (dd, 1H), 7,60 (m, 1H), 7,44 (m, 5H), 7,37 (m, 1H), 7,27 (m, 1H), 4,45 (q, 2H), 3,65 (bs, 7H), 3,20 (bs, 4H), 1,45 (t, 3H); HRMS (FAB) počítáno pro C19H19N4O5 383,1355, nalezeno 383,1358; analýza počítána pro C19H19N4O5: C, 59,68; H, 4,74; N, 14,65; nalezeno; C, 59,39; H, 4,79; N, 14,36.
Příklad 2
Rozbor pohyblivosti makrofágů
Pohyblivost makrofágů se měří metodou agarózových kapiček a kapilární metodou, jak je popsáno Harringtonem a Statným et al., J. Immunol. //0(3):752-759,
1973. Stručně, vzorky obsahující makrofágy se přidají do hematokritových trubiček, 75 mm dlouhých s vnitřním průměrem 1,2 mm. Trubičky se zataví a centrifugují při 100 x G po 3 minuty, rozříznou na rozhraní buňky - kapalina a vloží do kapky silikonového tuku v Sykes Mooreových kultivačních komůrkách. Kultivační komůrky obsahují buď kontrolní protein (BSA), nebo vzorky. Migrační oblast se určí po 24 a 48 hodinách inkubace při 37 °C obkreslením promítnutého obrazu makrofágových vějířů a plochy migrace se změří planimetril.
Alternativně se každá jamka 96jamkové desky povlékne jedním mikrolitrem kapalné 0,8 % (hmotn.) Sea Plaque Agarose ve vodě kápnuté do středu každé jamky. Deska se potom jemně zahřívá ve světelném boxu, až agarózové kapičky právě uschnou. Dva mikrolitry buněčné suspenze obsahující makrofágy s obsahem 25 % (obj.) (s nebo bez MIF nebo jiných kontrolních látek), obsahující 0,2 % (hmotn.) agarózy a zahřáté na 37 °C se přidají do povlečených deskových jamek a ochladí se na 4 °C po 5 min.. Každá • · jamka se naplní médiem a inkubuje se při 37 °C pod 5 % CO2 - 95 % vzduch po 48 hod.. Migrace z agarózových kapiček se měří po 24 a 48 hod. určením vzdálenosti od okraje kapičky k vnějšímu okraji migrace.
Měření migrace
Inhibiční aktivity migrace monocytů rekombinantního murinního a lidského přirozeného a murinního mutantního MIF se analyzují použitím mononukleárních buněk z lidské periferální krve nebo mononukleárních buněk oslabených T-buňkami v modifikované Boydenově komůrce. Kalceinové AM-značené monocyty se suspendují při
2,5 až 5 x 1O6 /ml v mědiu RPM11460, s L-glutaminem (bez fenolové červeně) a 0,1 mg/ml lidského sérového albuminu nebo bovinního sérového albuminu. Alikvótní část (200 μΙ) buněčné suspenze se přidá do jamek 96jamkové desky s U-dnem (Costar, Cambridge, MA, USA) předehřáté na 37 °C. MIF v RPMI 1460 se přidá do buněčné suspenze tak, aby finální koncentrace byla 1,10,100 a 1000 ng/ml. Kultivační deska se umístí do komory odečítače desek s kontrolovanou teplotou, míchá se 30 s a inkubuje se při 37 °C po 10 až 20 min.. Během inkubace se přidá 28 μΙ předehřátého lidského monocytového chemotaktického proteinu 1 (MCP-1; Pepro Tech., lne., Rocky Hill, NJ, USA) při 10 nebo 25 ng/ml nebo RPM11640 s 0,1 mg/ml HSA na dno jamky desky ChemoTX (Neuro Probe lne., Gaithersburg, MD, USA; průměr jamky 3 mm, velikost pórů filtru 3 pm). Filtrační deska se pečlivě umístí na základní desku. Ošetřené buněčné suspenze se vyjmou z inkubátoru a 30 μΙ se přidá do každé jamky filtrační desky. Složená deska se inkubuje po 90 min. při 37 eC ve zvlhčované komoře s 5 % CO2. Po inkubaci se odsaje buněčná suspenze z povrchu filtru a poté se filtr odstraní ze základní desky a promyje třikrát přidáním 50 μΙ 1X HBSS na každý segment filtru. Mezi promytími se použije stěrka (Neuro Probe) k odstranění zbytkového HBSS. Filtr se vysuší na vzduchu a pak se přímo odečítá na fluorescenčním odečítači desek, s excitací při 485 nm a emisí při 535 nm. Chemotaktické nebo náhodné migrační ukazatele jsou definovány jako průměrná fluorescence navázaná na filtr pro danou sadu jamek, dělená průměrnou fluorescencí filtru v jamkách neobsahujících ani MCP-1, ani MIF. Titrace fluorescenčně značených jamek odhalila, že hodnoty fluorescence detekované při tomto měření jsou v lineárním vztahu k počtu buněk (není ukázáno).
Přiklad 3
Měřeni tautomerázv
Tautomerizačnl reakce se provádí v podstatě tak, jak popsal Rosengren etal.,
Mol. Med. 2(1):143-149,1996. Hodnotí se konverze D-dopachromu na 5,6-dihydroxyindol-2-karboxylovou kyselinu. Připraví se 1 ml vzorkové kyvety obsahující 0,42 mM substrátu a
1,4 pg MIF v roztoku vzorku obsahujícím 0,1 mM EDTA a 10 mM fosfátového sodného pufru, pH 6,0 a sleduje se poměr snížení absorbance iminochromu při 475 nm. L-dopachrom se použije jako kontrola. Navíc se mohou sledovat reakční produkty pomocí HPLC, s použitím mobilní fáze zahrnující 20 mM pufr KH2PO4 (pH 4,0) a 15 % methanolu s průtokem 1,2 ml/min.. Fluorimetrická detekce se sleduje při 295/435 nm.
Alternativně se provádí tautomerizační reakce s použitím fenylpyruvátu nebo (phydroxyfenyl)pyruvátu v podstatě tak, jak je popsáno Johnsonem et al., Biochem. 38:16024-16033,1999. V této verzi se monitoruje ketonizace fenylpyruvátu při 288 nm (ε=17300 M'1cm'1) a ketonizace (p-hydroxyfenyl)pyruvátu se monitoruje při 300 nm (ε=21600 M 1cm‘1). Zkoumaná směs obsahuje 50 mM pufr Na2HPO4 (1 ml, pH 6,5) a alikvótní podíl roztoku MIF dostatečně zředěného (0,5 až 1,0 μΙ roztoku 2,3 mg/ml, konečná koncentrace 93 až 186 nM), aby vznik, počáteční vložený poměr. Měřeni se zahájí přidáním malého množství (1 až 3,3 μ,) buď fenylpyruvátu, nebo (p-hydroxyfenyl)pyruvátu ze zásobních roztoků připravených v ethanolu. Krystalické formy fenylpyruvátu a (p-hydroxyfenyl)pyruvátu existují výlučně v enolové formě (Larrsen etal., Acta Chem. Scand. B 28:92-96,1974). Koncentrace substrátu by měla být v rozsahu 10 až 150 M, se žádnou podstatnou inhibici aktivity MIF ethanolem, pozorovanou při méně než 0,5 % hmotn..
Přiklad 4
Imunoprecipitace a analýza Western Btot
Experimenty s buněčnou kulturou byly navrženy tak, aby charakterizovaly aktivitu potenciálních sloučenin, expresi MIF, jeho pohyb a export. Buňky a připravené frakce médii se připravily pro imunoprecipitaci v podstatě tak, jak bylo popsáno dříve (Florkiewicz etal., Growth Factors 4:265-273,1991; Florkiewicz etal., Ann. N. Y. Acad. Sci. 638:109-126) s tou výjimkou, že 400 μΙ lýzního pufru (1 % NP-40,0,5 % deoxycholátu, 20 mM Tris pH 7,5,5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,01 mM fenylmethylsulfonylfluoridu, 10 ng/ml aprotininu, 10 ng/ml leupeptinu, 10 ng/ml pepstatinu) se přidá k frakci média po vyčištění centrifugací v mikrocentrifuze po dobu 15 minut. Buněčná nebo střední frakce se inkubuje s monokionálni nebo polyklonálnf protilátkou proti MIF a přidá se GammaBind™ G Sepharose® (Pharmacia LKB Bioechnology, Uppsala, Švédsko) na dalších 30 minut inkubace. Imunitní komplexy se sedimentujf odstředěním na mikrocentifuze, promyjí třikrát lýzním pufrem a čtyřikrát ledově chladným imunoprecipitačním promývacím pufrem (0,15 M NaCI, 0,01 M Na-fosfát pH 7,2,1 % deoxycholátu, 1 % NP-40, 0,1 % dodecylsíranu sodného). Imunitní komplexy se disociují přímo ve vzorkovém gelovém pufru SDS 125 mM Tris, pH 6,8, 4 % SDS, 10 % glycerinu, 0,004 % bromfenolové modři, 2 mM EGTA, a odděleno 12 % SDS-PAGE. Tento gel se zpracuje pro fluorografii, vysuší a exponuje na rentgenový film při -70 °C. Když dojde k imunoprecipitaci neomycinfosfotransferázy, použije se králičí protilátka proti NPT (5Prime3Prime, Boulder, CO, USA).
Pro analýzu Western Blot se přenesou proteiny z 12% gelu SDS-PAGE na nitrocelulózovou membránu (velikost pórů 0,45 pm ve studeném pufru obsahujícím 25 mM kyselinu 3-[dimethyl(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropansulfonovou, pH 9,5, 20% methanol po 90 minut při 0,4 A. Pro Western Blot analýzu médií upravených buňkami se média centrifugovala (10 minut při 800 g) a supernatanty se koncentrovaly 10 x membránovou filtrací (oddělování mol. hmotnosti 10k, Centricon-10 Amicon). Vzorky se poté znovu rozpustily v 16% SDS Tris-glycin Gel (Novex, San Diego, CA, USA) za redukčních podmínek a přenesly se na nitrocelulózovou membránu (Novex) při 20 V na 3 hodiny. Membrány se inkubovaiy s králičí polykionální protilátkou proti krysám (1:1000) (Torrey Pines Biolab, San Diego, CA, USA) a poté s konjugátem křenové peroxidázy (1:1000) (Pierce, Rockford, IL, USA). MIF se vizualizovalo vyvíjením s chlornaftnolem/ H2O2. Rekombinantní MIF (2 ng, zakoupeno od R&D Systems, Minneapolis, USA) se podrobilo elektroforéze a přeneslo jako standard. Membrány se blokovaly v 10 mM Tris, pH 7,5,150 mM NaCI, 5 mM NaN3, 0,35 % polyoxyethylensorbitanmonolaurát, a 5 % odtučněného sušeného mléka (Carnation Co., Los Angeles, CA, USA) po 1 hod. Při teplotě místnosti. Membrány se inkubovaiy s monoklonálni protilátkou (katalogové číslo MAB289, zakoupeno od R&D Systems, Minneapolis, USA) nebo polykionální (kozí polykionální sérum, R&D Systems kat.č. AF-289-PB). Po inkubaci se membrány promyly při teplotě místnosti 10 výměnami pufru obsahujícím 150 mM NaCI, 500 mM fosforečnanu sodného pH 7,4,5 mM NaN3,0,35 % poiyoxyethylensorbitanmonoiaurátu. Pokud byly použity monoklonálni protilátky, membrány se poté inkubovaiy v blokovacím pufru obsahujícím 1 pg /ml králičí protilátky proti myším IgG (H+L, affinipure, Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA) po 30 minut při teplotě místnosti. Pro zkoušení polyklonálních protilátek se k inkubaci použila králičí protilátka proti kozám (Sigma, katalogové číslo G5518). Membrány se poté promyly v + I pufru popsaném výše, a inkubovaiy se po 1 hod. Ve 100 ml blokovacího pufru obsahujícím 15 pCi 125l-proteinu A (len Biochemicals, Costa Mesa, CA, USA) a promyly se 11 pufru. Radioaktivní signál se vizualizoval autoradiografií.
V jednom experimentu se sebralo přes noc připravované médium z buněk THP-1 ošetřených LPS (10 pg/ml), ošetřených rovněž různými množstvími potenciálních sloučenin, jako je sloučenina 7e, a zkoumalo se imunoprecipitací s monoklonálními nebo polyklonálními protilátkami, aby se určilo navázáni MIF. Jak je ukázáno na obr. 1, ošetřená média ukazují podstatnou ztrátu detekovateiného MIF za použití monoklonální protilátky v přítomnosti 10 μΜ sloučeniny 7e, která nebyla pozorována s polyklonální protilátkou. Tato odpověď zrcadlí efekt sloučeniny 7e na enzymatickou aktivitu MIF. Podle toho tento experiment ukazuje, že monoklonální reaktivita se může chovat jako zástupný značkovač enzymatické aktivity.
V jiném experimentu (obr. 2) se přidaly různé koncentrace pěti různých analogů inhibitorů k buňkám THP-1 stimulovaným LPS a nechaly se inkubovat přes noc. Následující den se detekoval imunoreaktivní MIF pomocí ELISA. Sloučenina 7e inhibovala schopnost protilátky rozeznat MIF v závislosti na dávce s ED50 2 μΜ, podobě jako odpovědí získané s analogickou sloučeninou 7b a sloučeninou 7d. V kontrastu ktomu byla analogická sloučenina 7a a sloučenina 7c téměř 100x aktivnější.
V dalším experimentu (obr. 3) se určovala schopnost sloučeniny 7e snížit imunoreaktivitu MIF, vyrobeného buňkami THP-1. Buňky THP-1 se ošetřily 10 pg/ml LPS a přidalo se 10 μΜ sloučeniny 7e v různých časech po stimulaci LPS, a imunoreaktivita se monitorovala monoklonální protilátkou proti MIF. Jak je ukázáno, po přidání sloučeniny 7e se imunoreaktivita rapidně ztrácela. Tak tento experiment měří aktivitu sloučenin nebo kontrol pouze s pufrem na detekci MIF, když se sloučeniny se zpočátku přidají v různých časech k buněčným kulturám a pak se zpracují odpovídající zpracované vzorky médií v závislosti na čase.
V předešlém experimentu (obr. 3) se analyzovala schopnost sloučeniny 7e modulovat navázání na protein MIF za přítomnosti buněk THP-1 stimulovaných LPS. Avšak v experimentu ukázaném na obr. 4 byla zkoumána schopnost sloučeniny 7e modulovat rozeznávání MIF protilátkou za použití předpřipravených médií, za nepřítomnosti živých buněk. V tomto experimentu se přidal LPS k buňkám THP-1 v kultuře, jak bylo popsáno výše. O šest hodin později bylo připravené médium odstraněno, ·· · . ; . . . J
.... . ..... ·· * η
vyčištěno od buněk a jejich částí a množství MIF se určilo na 22 ng/ml. Toto předpřipravené médium se poté rozdělilo na dvě skupiny. Obě skupiny se inkubovaly při 37 °C po různou dobu předtím, než se přidala sloučenina 7e nebo samotný pufr (kontrola) na dalších 30 minut inkubace při 37 °C. Hladina detekovatelného MIF se poté určila pomocí ELISA za požití monoklonální protilátky proti MIF pro detekci. Rapidní ztráta signálu ELISA specifického pro MIF je závislá na přítomnosti sloučeniny 7e. Kontrolní hodnoty MIF se nemenl. Podle toho pokus dokazuje, že sloučenina 7e interaguje s MIF a blokuje schopnost protilátky následně interagovat s MIF, dokonce bez přítomnosti buněk. Protože interakce probíhá na katalytickém místě, nebo ovlivňuje katalytickou aktivitu, ztráta imunoreaktivíty koreluje se ztrátou enzymatické aktivity a/nebo asociovanými aktivitami MIF.
Přiklad 5
Zkoumáni extracelulární lokalizace
Aby se dále zkoumala aktivita sloučeniny 7e modulovat export MIF in vitro, byly vybrány myši makrofágové buňky RAW 264.7 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA).
Makrofágy RAW 264.7 (3x106 buněk na jamku) se umístilo na 12jamkovou desku pro tkáňové kultury (Costar) a kultivivalo v RPMI/1 % tepelně inaktivovaného fetálního bovinního séra (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA). Po třech hodinách inkubace při 37 °C ve vlhčené atmosféře s 5 % CO2 se odstranily neadherované buňky a jamky se dvakrát promyly RPMI/1 % FBS. Buňky se potom inkubovaly po 24 hodin s LPS (0111 :B4) nebo TSST-1 (Toxin Technology, Sarasota, FL, USA), které byly z 95 % čisté a resuspendované v apyrogenní vodě při koncenraci měnící se od 1 pg/ml po 1000 ng/ml (pro experiment odpovědi na dávku). Pro experimenty závislosti na čase se odstranila média z paralelních kultur v intervalech 0,5,1,2,4, 8 a 24 hodim po stimulaci 1 ng/ml TSST-1 nebo LPS. Pro inhibičnf studia se inkubovaly buňky RAW 264.7 (3x106 buněk na jamku)po 24 hodin s 1 ng/ml LPS (0111 :B4) nebo 1 ng/ml TSST-1 za přítomnosti 0,01 M až 10 M sloučeniny 7e nebo pufru (jako kontroly). MIF v médiích upravených buňkami se koncentroval na filtrech a MIF zůstávajíc! ve vzorcích se analyzoval metodou Western Blot a pásmové hustoty MIF se také měřily pomoci Stratagene Eagle Eye™.
Buňky RAW se mohou indukovat k exprimaci MIF přidáním buď 1 ng/ml
TSST-1 nebo LPS a kultivovat po 24 hodin. MIF v upravených médiích se měřilo výše popsaným způsobem. Jak je ukázáno na obr. 5, sloučenina 7e redukovala imunodetekovatelné hodnoty MIF v upravených médiích v závislosti na koncentraci s IC50 přibližně při 0,04 μΜ ve srovnání s buňkami inkubovanými pouze s pufrem. Hladina MIF detekovaná v přítomnosti sloučeniny 7e po stimulaci RAW buněk TSST-1 je zobrazena na obr. 6, s IC50 přibližně 0,3 μΜ ve srovnání s buňkami inkubovanými pouze s pufrem.
Příklad 6
Buněčná kultura, transfekce a metabolické značení
Cílové buňky, získané z American Type Culture Collection (ATCC No. CRL 1650) se kultivovaly přes noc na 48jamkové desce v DMEM doplněném 10 % fetálního bovinního séra, 2 mM L-glutaminu, 1 mM pyruvátu sodného, 100 mM neesenciálních aminokyselin a 50 pg /ml gentamycinu. Cílové buňky se poté transfekovaly 2 pg/ml plazmidové DNA čištěné CsCI v transfekčnlm pufru (140 mM NaCI, 3 mMKCI. 1 mM CaCI2, 0,5 mM MgCI2, 0,9 mM Na2HPO4, 25 mM Tris pH 7,4. Do každé jamky se přidalo 300 pl DNA v transfekčnlm pufru. Buňky se inkubovaly po 30 minut při 37 °C a pufr se odsál. Teplé médium doplněné 100 pM chlorochinu se přidalo na 1,5 hod.. Toto médium se odstranilo a buňky se dvakrát promyjly kompletním médiem. Buňky se poté inkubovaly po 40 až 48 hodin. Předmětný plazmid se kotransfekoval pomocí pMAMneo (Clontech, Palo Alto, CA, USA), který obsahuje volitelnou značkovací neomycinfosfotransferázu. Když jbyly kotransfekovány 2 pg předmětného plazmidů, více než 70 % transfekovaných buněk exprimovalo společně MIF a neo, jak se určilo imunofluorescenční mikroskopií.
Pro imunoprecipitační analýzy se cílové buňky metabolicky označí po 15 minut pomocí 100 pCi 35S-methioninu a 35S-cysteinu (Trans 35S-label, Biomedicals, Irvine, CA, USA) v 1 ml DMEM bez obsahu methioninu a cysteinu. Po označení se jednobuněčné vrstvy promyjí jednou DMEM doplněného nadbytkem (10 mM) neznačeného methioninu a cysteinu po 1 až 2 minuty. Buňky se poté kultivují ve 2 ml tohoto média po indikované doby a buněčné supernatanty se podrobí imunoprecipitaci na přítomnost leaderless proteinu. Pro označené kultury se sledované médium doplní modulátorem ve sledovaných koncentracích.
Alternativně pro analýzu pomocí ELISA se cílové buňky promyjí jednou 250 pl 0,1 M uhličitanu sodného, pH 11,4, po 1 až 2 minuty a ihned se odsají. Alternativně se • · · • · · · · · může dát přednost roztoku s vysokým obsahem soli. Buňky se promyjí médiem obsahujícím 0,5 % FBS a 25 pg heparinu a pak se buňky inkubujf v tomtéž médiu po indikovanou dobu. Pro buňky transfekované vektorem kódujícím protein obsahující leader sekvenci, jako je hCG-aneboo jakýkoliv jiný protein nevázající heparin, se může vynechat promývání uhličitanem a médiem obsahujícím heparin.
Příklad 7
Vvsokokapacitnl analýza inhibitorů MIF
Vysokokapacitní analýza inhibitorů MIF se provádí na 96jamkovém formátu za použití MIF produkovaného buňkami ΊΉΡ-1 a provádí se následujícím způsobem. Analýzy MIF se provádějí pomocí ELISA, jak je uvedeno výše. Buňky THP-1 se suspendují na 5x106 buněk/ml v médiu RPMI, obsahujícím 20 pg/ml bakteriální LPS a buňky se inkubují 18 až 20 hodin. Následně se odebere supernatant a inkubuje se s domnělými inhibitory. Stručně, 96jamková ELISA deska (Costar číslo 3590) se povleče monoklonální protilátkou proti MIF (R&D Systems katalogové číslo MAB289) při koncentraci 4 pg/ml po 2 hodiny při 37 °C. Neředěná buněčná suspenze se přidá na desky ELISA na dvouhodinouvou inkubaci při teplotě místnosti. Jamky se poté promyjí, přidá se polyklonální protilátka proti MIF se sníženou bioaktivitou (R&D Systems č. AF-389-PB) a poté Streptavidin-HRP a chromogenní substrát. Množství MIF se počítá interpolací ze standardní křivky MIF.
Příklad 8
Analýza potenciálních inhibitorů v séru pomocí HPLC
Před hodnocením působení jakékoliv malé molekuly in vivo je vhodné detekovat kvantitativním způsobem sloučeninu v tělní tekutině, jako je krev. Byla vytvořena analytická metoda za prvé pro reprodukovatelnou detekci testovaných sloučenin, jako jsou inhibitory MIF včetně sloučeniny 7e, a za druhé pro měření jejich koncentrace v biologických kapalinách.
Používala se HPLC na reverzní fázi (RP-HPLC) na jednotce Hewlett-Packard Model 1100 s použitím Symmetry Shield RP-8 (4,6 x 75 mm id, Waters, Milford, MA,
USA). Mobilní fáze byla izokratický roztok 35 % acetonitril / voda obsahující 0,1 % kyseliny trifluoroctové. Absorbance se monitorovala při 235 nm. Pro měření množství testované sloučeniny v séru se nejprve vzorkové sérové proteiny separovaly za použití 35 % acetonitrilu (4 °C přes noc) a poté centrifugovaly při 14000 ot/min po 30 minut.
Supernatant se poté analyzoval pomocí RP-HPLC a koncentrace sloučeniny se ·· φ kalkulovala na základě kalibrační křivky známého standardu. Podle tohoto postupu se používala RP-HPLC k detekci sloučeniny 7e v lineárním rozsahu 1,5 až 800 ng (R2=1) s použitím testovaných vzorků (není ukázáno). Když se uvedená analytická technika použije na krevní sérum zvířat, které dostaly dávku sloučeniny 7e (0,4 mg na 20gramovou myš) kvantitativně se měří obíhající koncentrace sloučeniny 7e.
S rozvojem uvedených metod kvantifikace sloučeniny 7e je možné vyhodnocovat efektivitu různých způsobů podávání sloučeniny a charakterizovat bioaktivitu. Pro testování časově závislé bioaktivity v séru byla zvířata ošetřena sloučeninou 7e injekcí (i.p.) (obr. 7A) a orálně sondou (obr. 7B).
Přiklad 9
Inhibice MIF in vivo
Účelem následujících experimentů in vivo bylo potvrdit úvodní výsledky výzkumů in vitto za použiti sloučeniny 7e k inhibici MIF. Toxicita indukovaná LPS se objevuje ve vztahu k nadprodukci MIF, stejně jako TNF-α a IL-1 β. Poté mohou být zvířata ochráněna před endotoxickým šokem neutralizací nebo inhibici těchto mediátorů zánětů. Tento model byl vybrán, protože poskytuje reprodukovatelný a rychlý letální model sepse a septického šoku.
Dávky lipopolysacharidu (LPS) byly vyrobeny čerstvé před každým pokusem. LPS (Escherichia coli 0111 :B4, Sigma) se rekonstituoval přidáním 0,5 % TEA (1 ml triethylamine (Pierce)) k ampulce s 5 mg endotoxinu. Po rekonstituci se roztok inkuboval při 37 °C po 30 minut. Následně se roztok ošetřil v ultrazvukové lázni při 56 až 60 *C 3x po 30 vteřin. Po sonifikaci se směs nechala vířit kontinuálně 3 minuty. Zásobní roztok byl připraven k použití.
Detekce IL-18 . TNF-α a MIF v krvi
Deset samičích myši BALB/c Charles River Laboratories, Kingston, NY, USA), 10 týdnů starých (20 ±2 g) bylo rozděleno do klecí po 5 s volným přístupem k potravě a vodě a nechaly se aklimatizovat nejméně týden před pokusem. V den pokusu se myši zvážily a náhodně rozdělily do skupin po 10 zvířatech stejné průměrné tělesné hmotnosti. Myším byla dána injekce i.p. 200 μΙ formulované sloučeniny 7e nebo samotný pufr bezprostředně před injekcí LPS (Escherichia coli 0111 :B4,10 mg/kg nebo 5 mg/kg tělesné hmotnosti) a D-galaktosamin (50 mg/kg tělesné hmotnosti). Každá dávka LPS (0,2 ml pro ·· ···»
20g myš) se podala intraperitonálně a smísila se s finální koncentrací D-galaktosaminu 50 mg/ml. Po odebrání vzorků krve z punkce srdce byla zvířata usmrcena. Typický odběr se prováděl 4 hodiny po ošetření LPS. Sérum se oddělilo v separátoru (Microtainer®, Becton Dickinson, Minneapolis, NJ, USA) podle protokolu výrobce. TNF-α a IL-1 β myšího séra se měřily technikou ELISA za použití sad „myšího imunoassaye IL-1 p“ nebo „myšího imunoassaye TNF-α“ (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) podle předpisu výrobce. Sérové koncentrace MIF v myším séru se kvantifikovaly pomocí sandwichové ELISA (ChemiKine MIF Kit, Chemico, San Diego, CA, USA). Vzorky se analyzovaly dvakrát a výsledky se zprůměrovaly.
Murinní model LPSI
Deset 8 až 10 týdnů starých samiček myší BALB/C (20 ±2g) se rozdělilo do skupin a aklimatizovalo, jak je popsáno výše. V den pokusů se myši zvážily a náhodně rozdělily do skupin o stejné průměrné tělesné hmotnosti. Myši se injikovaly 200 pl formulované sloučeniny 7e nebo jejím pufrem (průměrně 20 mg sloučeniny/kg) a poté se injikovaly LPS (£. coli 055B5, Sigma) (40, 20,10, 5,2 nebo 0,5 mg/kg tělesné hmotnosti) a 50 mg/kg D-galaktosaminem. Myši se pozorovaly každé dvě hodiny během prvních 18 hodin a a dvakrát denně po sedm dni. Pro tyto studia se použila Kaplan-Meierova metoda hodnocení odhadu přežití zvířat.
Pro všechny studia in vivo se prováděly standardní statistická srovnávání mezi ošetřenými skupinami s použitím Fischerova testu pro rozhodné údaje a Mantel-Coxova testu pro průběžné proměnné. K určení, jestli hodnoty sérového IL-1 korelují se sérovým MIF se aplikoval Fischerův test. Analýzy se prováděly s použitím Stát View 5.0 Software (Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA). Všechny hodnoty p, které byly dvoustranné a hodnoty menší než 0,05 se považovaly za indikující statistickou významnost.
Úvodní kontrolní experiment se vedl k určení hodnot základní linie endogenního MIF v murinním modelovém systému (samice myší Baib/c), a dále k určení poměru a stupně přírůstku endogenního MIF po ošetření LPS (10 mg/kg). Samice myší Balb/c se ošetřily LPS (Sigma 0111 :B1) s přídavkem 50 mg/kg β-D-galaktosaminu. Hodnota MIF v séru se měřila pomocí HPLC, jak je popsáno výše, po 0, 2, 5 a 6 hodinách po ošetřeni LPS/galaktosaminem. Na počátku tohoto reprezentativního pokusu byla klidová hodnota MIF přibližně 45 ng/ml. Avšak v průběhu tohoto šestihodinového experimentu došlo v odebraných vzorcích séra k vzrůstu detekované hladiny MIF závislém na čase. Když byly ··♦· • · ···· myši ošetřeny sloučeninou 7e (formulovanou v 50% vodném roztoku) a 10 mg/kg LPS, došlo k podstatnému sníženi hladiny cirkulujícího MIF (p=0,05), které se mohlo zjistit.
V pokusu ukázaném na obr. 9A se myši Balb/c (n=20) injikovaly i.p. 20 mg/kg tělesné hmotnosti sloučeniny 7e v čase podání LPS. Krevní vzorky se odebraly o 5,5 hodiny později. Výsledky ukazují, že zvířata léčená inhibitorem mají sníženou schopnost odpovědi na LPS a detekovaly se snížené hladiny MIF. V další studii, ve které se myším podala polovina dávky LPS (5 mg/kg), se určil sérový MIF čtyři hodiny po ošetření. Tyto údaje ukazují vysoce statisticky významné (p=0,0003) 60% snížení MIF (obr. 9B). V dalším experimentu se měřilo zároveň MIF a IL-1 β v myším séru metodou ELISA. Jak je ukázáno na obr. 10, je přímá a vysoce signifikantní korelace mezi těmito dvěma hodnotami. Tato korelace byla rovněž pozorována mezi MIF a TNF-α (údaje nejsou ukázány). V podobném experimentu se pozorovalo snížení hladiny IL-Ιβν séru a hladiny TNF-α v séru po podání 20 mg/kg sloučeniny 7e (obrázek 11).
Studie experimentálního toxického šoku indukovaného LPS prozradily ústřední roli MIF a TNF-α. Ft, že LPS stimuluje buňky podobné makrofágům k produkci MIF, která naopak indukuje sekreci TNF-α buněk podobných makrofágům svědč! o potenciální roli MIF v patogenezi LPS. K testování, zda sloučenina 7e může předejít šoku LPS, se použil model letálního šoku zprostředkovaného LPS u myši Balb/c senzibilizovaných β-Dgalaktosaminem. Ošetření sloučeninou 7e v době injekce letální dávky LPS (2, 5 a 10 mg/kg) zvýšilo přežití z 6 % na 47 % (p=0,0004) (obr. 12). Účinky se mění podle použité koncentrace LPS, demonstrující, že jestliže se použije větší koncentrace LPS, účinek sloučeniny 7e je nasytitelný a proto specifický. Tabulka 2 je souhrnem několika pokusů s přežitím (celkově 210 myší), ukazující, že sloučenina 7e chrání myši před toxickým šokem indukovaným MIF způsobem závislým na koncentraci. Obr. 13 také znázorňuje tyto údaje v grafické formě s časem přežití 25 % na levé ose.
Tabulka 2
Dávka LPS 75 % zvířat usmrceno (hodin)
(mg/kg) Nosič Sloučenina 7e
40 10,2 11,6
10 9,9 18
5 10 32
2 10,2 >100
0,5 22 >100
0,1 >100 >100
MIF překonává působení sloučeniny 7e
Exogenní rekombinantní lidský MIF podaný se sloučeninou 7e může zvrátit prospěšný účinek sloučeniny, čímž podporuje hypotézu, že sloučenina 7e zvyšuje zvířecí odolnost proti LPS změnou hodnoty MIF v myším séru. V tomto přikladu se myši ošetřily podle standardního protokolu LPS, kromě toho, že navíc k 1 mg/kg LPS a 20 mg/kg inhibiční sloučeniny 7e některá zvířata dostala také 300 pg/kg lidského rekombinantního MIF. Po 12 hodinách podstatně více (p>0,01) myší přežívá LPS se sloučeninou 7e, ale toto přežití se neutralizuje podáním MIF (údaje nejsou ukázány).
Přiklad 10 inhibitor MIF a model artritidy vyvolané kolagenem
Dvacet myší DBA/1Lac, stáří 10 - 12 týdnů, se imunizovalo v den 0 u kořene ocasu bovinním kolagenem typu II Cli 100 g), emulgovaným ve Freundově kompletním adjuvans (FCA; GibcoBRL). V den 7 se podala druhá dávka kolagenu stejnou cestou (emulgovaném ve Freundově kompletním adjuvans). V den 14 se myši injikovaly subkutánně 100 mg LPS 05:B5). V den 70 se myši injikovaly 40 g LPS (0111 :B4) intraperitonálně. Skupiny se rozdělily podle tloušťky tlapek, které se měřily kalibrem, po náhodném rozdělení, aby vznikla vyrovnaná startovní skupina. Sloučenina se podala myším ve dnech 71,72, 73 a 74 (celkem osm dávek po 0,4 mg/dávka, přibližně 20 mg/kg tělesné hmotnosti). Dva pozorovatelé poté prověřovali myši 74. den na tloušťku tlapek. Obr. 14 vyjasňuje experimentální průběh. V tomto experimentu se myši, u kterých otok odezněl (na rozdíl od plně nateklé artritidy) ošetřily finální i.p. injekcí LPS 70. den, aby se simulovala produkce cytokinu a rovněž akutní zánět. Obr. 15 demonstruje, že u myší ošetřených sloučeninou 7e se vyvinul středně redukovaný edém tlapky (1,87 mm) ve srovnání s kontrolou ošetřenou pouze vehikulem (1,99 mm) p<0,05. Na konci zvířata v léčené skupině nedosáhla plně oteklého vyjádření artritidy indukované kolagenem ve srovnání s kontrolou (data nejsou ukázána).
V jiném experimentu patnáct myši DBA/1J o stáří 10 až 12 týdnů se 0. den imunizovalo na kořeni ocasu bovinnfm kolagenem typu II (Cil 100 g), emulgovaném ve Freundově kompletním adjuvans (FCA; GibcoBRL). 21. den se podala druhá dávka kolagenu stejnou cestou, emulgovaná ve Freundově nekompletním adjuvans. 28. den se myši injikovaly subkutánně 100 pg LPS (0111 :B4). Skupiny a ošetřovací protokol byly stejné, jako je popsáno výše. 74. den se odebraly krevní vzorky a změřily se cytokiny.
999· ·
· · · · ·
9··· ·
9 ·
9··· · *
Obrázek 16 ukazuje, že sloučenina 7e redukovala sérové hladiny MIFve srovnání s neošetřenými vzorky CIA. Detekovala se dokonce ještě signifikantnější inhibice sérové TNF-a.
Příklad 11
Připravily se následující inhibitory MIF metodami popsanými v příkladu 1. Každý z těchto inhibitorů MIF patří ke třídě sloučenin struktury (1a) popsané výše, a zahrnuje následující skupinu:
Výsledky analýzy tautomerázové aktivity indikují, že každá ze sloučenin inhibujlcí MIF vykazuje signifikantní inhibřci aktivity MIF.
.••.Σ’·· : :···..: ::
4
4 ·
4444 ·
4444 ·
Sloučenina 12
I
CH3 • · • ·· ···*
Sloučenina 16
• 4
4 4
4444 ·
4444 ' · ♦ ··· 444
Sloučenina ' 21
· • * * 9 9 * • 9 9 9 9
99·· • · • 9 9 ♦
Sloučenina 46
I
OL
• · • · · · · · • · · • ·
WO 02/094203 * · ···· · ··· :· ·: : : ·: :*·:* • ····· ·· ·
PCT/US02/16963
• · • · · • ·· · ·
Sloučenina 61
'N O
I
CH, • · · · » • · • · · ·
Sloučenina 66
O,
• · · • · · · « ·
• ·
Sloučenina 76
Sloučenina 78
Sloučenina 75
Sloučenina 77
· • 9
9 9
9 9 9
99999 ·· *
999 9
9 999 9 • · • 9 · ·
Sloučenina 82
I
CH3
Sloučenina 84
I o
• • · * • ···· • · • · · 4 4 • 4
• · *
9··· A ·
Sloučenina 9θ
hjz ch, • ♦ ·· φφφφ
Ο
I <*3
Ν Ό
I
101
CH.
I
CH.
4 4
102
Sloučenina 112
Sloučenina 114 •4 4444
4
4 4 • 4···
Sloučenina 113
103 • φ • φ φ » φφφ· φ
Sloučenina 116 Sloučenina 118 Sloučenina 120
Ν
Ο • · · • ····
104 • · * · • · • · ··
Sloučenina
O
N
I
OL
Sloučenina 127
Sloučenina 133
CA. /A
·· ·
107
• 9 9 • 9 ···· ·
• · 9 · ·
9999 9 · · · ·'.·
9999 9 ·♦···
9
9 9
9 9 9 « 9 9 · 9999 · * · ·
108
Sloučenina 146
Sloučenina 147
4«
109 • 4 • 4 ·
4«·· •
•4 ·*·· • 4 • 444 ·
• 4 9
4 4 4 • 4>444
4.4 ·
4
4 4
4444
4444
110 •4 4444
4 4 444 .·· ·
I ί ·44
• · • ·' ·'
Ί Ί Ί · · · ·
• ·
112 • · · • ····-.
Sloučenina 170
• 4.
·. · ' '4 '
Β 4 4 4 4
113 ·· ·44· ► 4 4
Sloučenina 179
114 • ····
·· · ♦ ♦ · · · · • ♦ · i ζ · · · · · · : ·: :··:· : ..........
115
Sloučenina 190
I • · · • ···· • · ·· ····
116 ·· ♦··· ···
·· · ·· ···· ····
117
Sloučenina 203
« φ φφφ φ φφφφ φ φ φ φ • · · • φφφφ • · ·»·· * • Φ φ φ φ · φ φ φ · φφ φφφφ φφφ φφφ
118
• · •· · · · ···· ··· ··« ··· • · · · · ··· · · · · • ···· ······ · ···
H9’:” : ’··*···* ’··’ :
N
I «ί,
• ·
120·· *
Sloučenina 222
Sloučenina 220
I
Sloučenina 219
Sloučenina 221
O
·· · • ♦ · · · ·
Sloučenina 227
O
I
CH,
·· 0000 • · 0 0 0 • · · · · 00 0 • · .· · · 0 · 0 0 • 0 0 0 0 • 00 00 * ·
0 0 · • · · 0 • ···· 0 · • · · ···· · 00 122
CHa
Sloučenina 233
123 • · • · · ·*·· ··- ···
Sloučenina 236
Sloučenina 241
124 ·· t
125
• · · · • · tt 9
126
Sloučenina 258
« · 99 9
127
Sloučenina 265
N
I
CH, » · · · ·
128
Sloučenina 270
• · e · · • · » • ··· • * • · · · .: e
129 • · · · · · • ···· · · · · • · · · · ····· • · · · · · • · · · · ·? ·
I
CHa
Sloučenina 1275
O
·· · ·· • · * · · · • · · 9 ···· « · · · ♦ ······· »·· ····· * · · · · . « « ···· · · · · * «I · · ·
130
• 0 0 0 · 0 ··· 0 0 ··· 0 0 0 0 • ···· 0 · · 0 0 0 0 0000 • · ·0 · · · 0 · · · ' · 0 0 0 t( ,
131
Sloučenina 287
N
I
CH3 • ·
132 • ·
• ·
Sloučenina 297
Sloučenina 299
• ····♦· ·/
134
I
CH,
ο
Sloučenina 307
I
CH, • r · φ > φφφφ •φ ···· φφ » • · · φφφ • φφφφ · φφ* • · · φφφ φ »φφφ • · φφφ» ·· φφφ φφ φ
Sloučenina 308
ΟΙ
135
Sloučenina 310
O
·· · '
136
• 9-.9--9 9 99
9 9 9 9 • 999 9
137
9 9 9 9 9 • 9 9
9 9·· • · 9 9
Sloučenina 322
Sloučenina 323
·· ·· · · • · · · · • · • · · ♦ ·
138
Sloučenina 326
·· ····
9 9 • 9999 • ·
9 9 9 9
139
Přiklad 12
Výsledky tautomerázové analýzy indikovaly, že následující sloučeniny příkladu 12 vykazují zvláště vysoké hodnoty inhibice MIF.
Tabulka 3
č. Sloučenina EC50 tautomeráza (mM) THP-1/MIF Struktura
1 34 0,01 <0,008 ojí
ΰ N 3
O
2 126 0,01 <0,008 /ΓΛ
Ύ
CK o lk r%-
l I CH,
3 164 0,01
H,Cx ú N có L A>-
1 H,C^ CH,
» 4 4 • 4 4 • 4444
4 »•44 4 ···· • · • 44 4 ····
140
č. Sloučenina EC50 tautomeráza (mM) THP-1/MIF Struktura
4 178 0,013 — Λ
0 N 0
II. %-
L 0
1 xCHj N
t CH,
5 51 0,016 <0,008 n >
ů 0 1 II
ΊΎ O^Crt,
n
T
6 50 0,018 <0,008 Ií Λ
V
A
0
II ^o^ch3
|l 1
CH3
·· 4444
4 4
4 4 4 4 « · 4 4 • 4 4
4
4 4
4 4 4
4 4444 •4*
4 • « • ••4 ·
141
č. Sloučenina ECSO tautomeráza (mM) THP-1/MIF Struktura
7 177 0,019 o, b F
8 40 0,02 <0,008 °γθ 0o xčtb' ,b
9 202 0,023 O T »♦ Vn°’ O \^CH, I CH,
♦ · ·
9 9
9 9 9
9 9999
9 9
9 • · » • ···· ·· ···· • · • ··· • · ·· ·· 9
·· · • · · • 9 9 9
9 99999
9 9
·· ····
143
č. Sloučenina EC50 tautomeráza (mM) THP-1/MIF Struktura
13 147 0,04 Ογί
a 0 o
A· ó
•ί Ap
14 163 0,04 — 0 1 3
'S
ú N ΓΥί
u II.
tAA 'o
15 176 0,045 Ý Q
0 11
ρΛ 11+ r%-
%
CH,
·· · • · ♦ • · · · • · ·· · · • ♦ · ·· · • >
• · · ► ···· ·· ···· • · · • · ··· • · · • · · ·· · + «
144
č. Sloučenina EC50 tautomeráza (mM) THP-1/MIF Struktura
16 92 0,049 ΟγΌ 0 Η,ίΑ^
17 200 0,010 0. XČC b
18 107 0,063 <0,008 0. ^n^ch, I CH,
·· · * · · • · · • ·*·· • · ···· · ·· ···· • · · • · ··· • · · · f*
9 · ·· ··· ·· e • 9 9 • 9 9 9
9 9999
9 9
9
145
č. Sloučenina ECSO tautomeráza (mM) THP-1/MIF Struktura
19 26 0,07 Ύ 0
a
j 0 ||
HSC <A^ch3
L |
ch3
20 105 0,075 V 0
Q o ||
h3c^ a>^3
l
i Yh3
21 16 0,08 0,03
(0,02-0,04) s-
ů Ϊ o II
Ij vf ^o^ch3
I! I Ό
jí 'V
146
č. Sloučenina EC50 tautomeráza (mM) THP-1/MIF Struktura
22 27 0,08 yO 0. '“TO· d
23 129 0,08 .γσ' 0o TO’ d
I · · · · • · • · · ·
147
148
150
Přiklad 13
Připravily se následující inhibitory MIF. Každý z těchto inhibitorů MIF patří ke třídě sloučenin majících strukturu 1b popsanou výše:
kde Ri, R2, R3, R4, X, Y, Z a n jsou definovány pro strukturu 1b definovanou výše. Výsledky tautomerázové aktivity ukazují, že každý inhibitor MIF vykazuje podstatnou inhibici aktivity MIF.
Přiklad 14
Inhibitory MIF jistých provedení se mohou připravit podle následujících reakčních schémat, schématu 5 a schématu 6. Každý z těchto inhibitorů MIF patří ke třídě sloučenin struktury la popsané výše.
Reakční schéma 5
V tomto schématu reaguje isatoový anhydrid s diethylmalonátem v roztoku NaH v Ν,Ν-dimethyiacetamidu. Vzniklý meziprodukt (označený 1M00) se pak chlóruje reakcí s POCI3 za vzniku meziproduktu (označeného 1M00(CI2)). 1 M00(CI2) poté reaguje s NH4OAc v kyselině octové za vzniku meziproduktu (označeného 1M00(Cň). 1M0Q(Ci) poté reaguje s N-acylpiperazinem v DMF. Acylová skupina piperazinové sloučeniny zahrnuje jako substituent (označený R3)buď furanviovou. nebo thienylovou skupinu, jak je popsáno ve schématu 5, nebo jiné skupiny, jak je jmenovitě uvedeno v následujících příkladech. Výsledný meziprodukt poté reaguje s halogenovou sloučeninou. Substituent vázaný na halogenový atom (označený R4) může zahrnovat různé sloučeniny, jak je uvedeno v následujících příkladech. Výsledná sloučenina má pak strukturu 1a popsanou výše. Kroky této reakce jsou popsány v detailech níže. Sloučeniny připravené podle schématu 5 jsou označeny níže referenčním číslem obsahujícím M a zahrnují skupinu -COOEt.
• 9 • 99 999 9·9
99· 9 9999 · 999
9999 99 9 999 9 9999
Reakční schéma 6
V tomto schématu reaguje 4-hydroxy-2(1 H)-chinolon se směsí kyselin dusičné a octové. Vzniklý meziprodukt se poté chlóruje reakcí s POCI3 za vzniku jiného meziproduktu. Tento intermediát poté reaguje s N-acylpiperazinem v DMF. Acylová skupina piperazinové sloučeniny zahrnuje jako substituent skupinu R3, jak je uvedeno v popisu schématu 5. Výsledný intermediát poté reaguje s halogenovou sloučeninou zahrnující jako substituent skupinu R4, jak je uvedeno v popisu schématu 5. Výsledná sloučenina má strukturu 1a popsanou výše. Kroky reakce jsou popsány v detailu níže. Sloučeniny připravené podle schématu 6 jsou označeny níže referenčním číslem obsahujícím „N“ a zahrnuji skupinu -NO2.
Různé inhibitory MIF, patříc! k třídě sloučenin majících strukturu 1a. se připravily podle schématu 5 nebo schématu 6. Tabulka 4 poskytuje seznam referenčních
152 čísel připravených sloučenin. Označení „1M1##“ indikuje, že sloučenina byla připravena podle schématu 5, a zahrnuje skupinu -COOEt a furanovou skupinu jak R3. Označení 1M2## indikuje, že sloučenina byla připravena podle schématu 5, a zahrnuje skupinu -COOEt a thiofenovou skupinu jak R3. Označení „1N1##“indikuje, že sloučenina byla připravena podle schématu 6, a zahrnuje skupinu -NO? a furanovou skupinu jak R3. Označení „1N2##“indikuje, že sloučenina byla připravena podle schématu 6, a zahrnuje skupinu -NO2 a thiofenovou skupinu jak R3. Dvě cifry na konci označení identifikují skupinu R4 sloučeniny.
Tabulka 4
Halogen -R4 M (COOEt) N(NO2)
1M1 (Furan) 1M2 (Thiopben) 1N1 (Furan) 1N2 (Thiophen)
06 1M106 1M206 1N106 1N206
07 1M107 1M207 1N107 1N207
08 1M108 1M208 1N108 1N208
09 A - - • -
10 A,.»· 1M110 1M210 1N110 1N210
11 1M111(1) 1M211(1) 1N111(1) 1N211(1)
12 1M112 1M212 1N112 1N212
13 0-° 1M113 1M213 1N113 1N213
14 O- 1M114 1M214 1N114 1N214
15 1M115 1M215 1N115 1N215
16 1M116 1M216 1N116 1N216
17 0 1M117 1M217 1N117 1N217
18 1M118 1M218 1N118 1N218
19 1M119 1M219 1N119*HCI 1N219
20 o-r 1M120 1M220 1N120 1N220
22 CrBr 1M122 1M222 1N122 1N222
···· ··· · ···· · · · · • ···· · · · · · · 1 1191
1 9 9 9 1 1 9
1199 1 11 111 11 9
153
Halogenovaná skupina R4 „09“ je popsána v MARCH’S ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, Reactions, Mechanisms, and Structure, 5. vyd., Michael Smith and Jerry March, Eds., John Willey & Sons, lne., p. 437 (2001). Poněkud odlišná reakční schémata, schéma 7 a 8, byla použita k přípravě inhibitorů MIF zahrnujících tuto skupinu.
Reakční schéma 7
+ ch2=ch-ch2 ch2=ch-ch2-y
Reakční schéma 8
R3yO
Různé inhibitory MIF patřící ke třídě sloučenin majících strukturu 1a se připravily podle schématu 9 a schématu 10.
Reakční schéma 9
CHJ
Na,CO,, DMF
O
R3
O
R2 • 4 4 44 4444 44 4
444 444 4·4
444 4 4444 4 444
4444 444 4444 4444
4 44 4444
4444 4 44444 44 4
154
Reakční schéma 10
Tabulka 5 poskytuje seznam referenčních čísel pro připravené sloučeniny. Označení 1M##1 indikuje, že sloučenina se připravila podle schématu 9, a zahrnuje skupinu -COOEt. Označení 1M##2 indikuje, že sloučenina se připravila podle schématu 9, a zahrnuje skupinu -NH2. Označení 1N##1 indikuje, že sloučenina se připravila podle schématu 10, a zahrnuje skupinu -COOEt. Označení 1N##2 indikuje, že sloučenina se připravila podle schématu 10, a zahrnuje skupinu -NH2 Dvě cifry za písmenem M nebo N odpovídají číslu identifikujícím skupinu R3.
Tabulka 5
# R3 R3 1M##1 (COOEt) 1N##1 (NO2)
1 07 Qá 1Μ07ΓΗΟΙ 1N071*HCI
2 08 1M081 1N081
3 09 úl 1M091 1N091
4 10 ch H U 1M101 1N101
·· ····
155
5 11 ου ο 1Μ111(2) 1Ν111(2>
6 12 1Μ121 1Ν121
7 13 Ογ ο 1Μ131 1Ν131
8 14 1Μ141 1Ν141
9 15 1M15VHCI 1Ν15ΓΗΟ
10 16 «CH, 1Μ161 1Ν161
11 17 V 1Μ171 1Ν171
12 18 ΟΥ 1Μ181 1Ν181
13 19 <Η° 1M19VHCI 1Ν191
1Μ201 1Ν201
14 20
15 21 Ον Η Ο 1Μ211(2)*ΗΟ 1N211(2)*HCI
16 22 Ον 1Μ221 1Ν221
17 23 Ον Ο 1Μ231 1Ν231
18 24 Ου Ο 1Μ241 1Ν241
19 27 Ου 1Μ271 1Ν271
20 28 ΟΟ 1Μ281 1Ν281
21 29 3~< '-Η », 1Μ291 1Ν291
22 30 «jc ΗΝ // ι\-^~ 1Μ301 1Ν301
23 31 ď 1Μ311 1Ν311
24 32 ,ο^ί ÍJ 1Μ321 1Ν321
25 33 ζεΟ 1Μ331 1Ν331
Φ· · • t ···· ·· · • · · · · · ··· • · · · · · · · · · · · • ···· · · · · · · · ···· • · ·· «··· ···· · ·· ··· ·· ·
156
26 34 % 1M341 1N341
27 35 H 1M351 1N351
Různé inhibitory MIF, patřících ke třídě sloučenin majících strukturu 1a. se připravily podle následujících schémat.
Reakční schéma 11
ΊΜϋϋ 1M00(CI2) 1M00(CI)
K suspenzi 1M00 (33,0 g, 0,14 mol) v toluenu (40 ml) se přidalo 108 g POCI3 (0,7 mol).Výsledný roztok se zahříval pod refluxem 1,5 hodiny. Rozpouštědlo se oddestilovalo za sníženého tlaku a zbylý olej se postupně extrahoval heptanem (kontrola pomoci TLC). Spojené heptanové frakce se odpařily a zbytek se zahříval s 200 ml vody a odfiltroval. Výtěžek byl 27 g (70 %).
Po vysušení při teplotě místnosti po 18 hodin se převedla získaná dichlorsloučenina do 250 ml baňky s kulatým dnem a přidalo se 150 ml kyseliny octové a 24,0 g octanu amonného. Reakční směs se zahřívala pod refluxem asi 6 hodin (kontrola pomocí LCMS a TLC). Když nebylo možno v reakční směsi detekovat žádný výchozí materiál, horký roztok se nalil do vody a vzniklá sraženina se odfiltrovala. Tabulka 6 poskytuje údaje o výtěžku (g a %), bod táni, poměr hmotnost/náboj (M/Z),kde M/Z « 754,1 [3xM]+, 503,3 [2xM]+, τ (8 min. běh), a čistota určená pomocí LCMS.
Tabulka 6
Výtěžek, g Výtěžek, % B.t., °C M/Z t, min Čistota, % (LCMS)
1M00(CI) 23 92 198-200 754,1; 503,3; 252,2; 206,0 2,97 >96
«· • · · · · ·
·· · «·· · · · ··· • · · · · · · · · ··· • ···· · · · · · · · >··· • · · · · · · · ·· ·· · ····· ·· ·
157
Reakční schéma 12
R 2 =COOEt (1 MOO(CI)), AV-0010, (0020)
NO2(1N00(CI) Υ=η ς
NMP/DABCO
100 °C
K roztoku 1M00(CI) (3,27 g, 13,0 mmol) ve 20 ml NMP se přidal postupně acylpiperazin (2,34 g, 13,0 mmol) a DABCO (1,46 g, 13,0 mmol). Reakční směs se míchala při 100 -120 °C po 15 hodin. Reakce se ukončila 20% roztokem NH4CI a vzniklá sraženina se odfiltrovala a promyla vodou. Produkt se vysušil v exsikátoru nad P2O5 při teplotě místnosti za sníženého tlaku. Produkt se použil v další reakci bez jakéhokoliv dalšího čištění.
Směs chlorchinolonu 1N00(CI) (2,9 g, 13,0 mmol), trifluoracetát acylpiperazlnu AV-0020 (4,0 g, 13,0 mmol a DABCO (2,91 g, 26,0 mmol) v 25 ml NMP se míchala při 100 °C přes noc. Směs se nalila do 50 ml solanky, získaná sraženina se odfiltrovala, promyla vodou a vysušila v exsikátoru nad P2O5 při teplotě místnosti za sníženého tlaku. Produkt se použil v další reakci bez jakéhokoliv dalšího čištěni.
Výtěžky a další informace pro získané sloučeniny jsou ukázány v tabulce 7. Pro sloučeniny označené 1M1, X je O a R2 je COOEt. Pro sloučeniny označené 1M2, X je S a R2 je COOEt. Pro sloučeniny označené 1N1, X je O a R2 je NO2. Pro sloučeniny označené 1N2, X je S a R2 je NO2.
Tabulka 7
Výtěžek, g Výtěžek, % B.t., °C M/Z t, min Čistota, % (LCMS)
1M1 4,7 92 223-226 rozkl. 396,2; 350,2 2,67 >94
1M2 4,9 92 220 - 222 366,2,412,3 2,84 >94
1N1 4,5 95 266-267 rozkl. 369 2,73 >92
1N2 4,7 95 265 rozkl. 385,2 2,89 >92
·· ···· » · · » · · 9 ·
158 ·· · • · · • · ·
9999 ·
···· · • 9 ·
9999
Reakční schéma 13
R2 = COOEt (1M1, 1M2), N02(1N1, 1N2) + Br —R4 (06 - 20)
X=O,S
1M106-1N222
K suspenzi NaH (0,04 g, 1,0 mmol) v suchém NMP (3 ml) se přidala sloučenina 1M1 (nebo 1M2) nebo 1N1 (nebo 1N2) (0,8 mmol). Po ukončení vývoje plynu se přidal bromid (06-20) (1,0 mmol). Reakčni směs se míchala, až nebylo možno detekovat stopy výchozího materiálu (kontrola LCMS). K reakci se přidal 10% roztok NH4CI (20 ml) a výsledná směs se extrahovala DCM. Sloučeniny 1M1 a 1M2 se izolovaly a čistily preparativnl HPLC (C-18 silikagelová kolona, 150 mm x 41 mm, 40 ml/min, gradient vodaacetonitril od 60:40 do 5: 95,20 min.). Sloučeniny připravené touto cestou jsou označeny indexem „A“ za označením sloučeniny v tabulce 5.
K roztoku sloučeniny 1M1 (nebo 1M2) nebo 1N1 (nebo 1N2) (1,0 mmol) v suchém DMF (5 ml) se přidal bromid (06 - 20) (2,0 mmol) a K2CO3 (200 mg). Sloučeniny 1M122,1M222,1N122,1N222 se získaly v 1,4-dioxanu pomoci 4,0 mmol cyklopentylbromidu. Reakčni směs se míchala při 80 až 100 °C po 20 až 40 hodin (kontrola LCMS). 10% roztok NH4CI (20 ml) se přidal do reakční směsi a výsledná směs se extrahovala DCM. Sloučeniny 1M106 - 1N220 se izolovaly a čistily preparativnf HPLC (C18 silikagelová kolona, 150 mm x 41 mm, 40 ml/min, gradient voda-acetonitril od 60 : 40 do 5:95,40 min.). Tabulka 8 poskytuje údaje o čistotě ostatní pro výsledné sloučeniny. Sloučenina 1N119.HCI se čistila preparativnl HPLC (C18 silikagelová kolona, 150 mm x 41 mm, 40 ml/min, gradient voda-acetonitril-HCI (0,001%) od 80 : 40 do 5 : 95, 40 min.). Sloučeniny připravené touto cestou jsou označeny indexem „B“ za označením sloučeniny v tabulce 8. Fyzikální vlastnosti sloučenin jsou obsaženy v tabulce 8.Označení včetně „(1)“ indikuje, že sloučenina je regioizomer.
φφ · • φ · • φ φ • φφφφ • · φφφφ φ « φ φφφ • φφφ ·
159 ♦ · φφφφ φ φ • φφφ • φ φ φ φ φφ φφφ φφ
Tabulka 8
Compounds Yield, mg Yield, % m.p. °C M/Z τ, min UV (Wave 254 nm, run 10 min.) Purity, % (LCMS)
1Μ112Α 78 19 151-152.5 506.2; 460.4 6.46 >97
1Μ115Α 96 23 177.5-179 516.4; 470.5 5.09 >97
1Ν110Α 99 29 163-166 423.2 4.96 >99
1Μ214Α 116 29 180.5-182.5 508.3; 462.1 5.26 >99
1Μ106Α 98 27 141-143 452.3; 406.3 5.13 >97
1Ν106Α 152 45 | 114-116 425.1 5.13 >99
1Ν114Α 97 26 216-217 465.4 5.08 >96
1Ν206Α 148 42 72-74 441.6 5.41 >97
1Ν111(1)Β 137 29 99-100 465.4; 447.4 5.91 >99
1Ν1158 157 32 105-110 489.4 5.14 >921
1Ν116Α 143 34 205-208 527.3 5.69 >99
1Ν211(1)Α 107 22 83-85 481.3 6.21 >98
1Ν212Α 96 24 73-75 495.5 6.78 >97
1Ν215Α 87 22 220-221 505.3 5.38 >932
1Ν2168 207 38 228-230 543.2 5.90 >943
1Ν2178 107 21 251-252 503.3 5.23 >94'*
1Ν2188 207 39 95-97 525.5 5.92 >96
1Μ1188 104 19 159-161 536.4,490.3 5.64 >97
1Μ2158 107 20 87-88 532.3; 486.3 5.34 >99
1Μ2188 147 27 110-112 552.4; 506.3 5.89 >99
1Ν120® 92 19 179-181 473.4; 455.3 5.49 >98
1Ν2108 99 23 187-190 439.4 5.22 >96
1Μ1078 138 30 70-72 465.5; 420.3 5.31 >95
1Μ1088 213 45 71-73 478.3; 432.2 4.79 >96
1Μ1108 142 32 161-162 450.3; 404.3; 350.1 4.84 >97
1Μ111(1)8 185 38 174-175 492.4; 446.2 5.84 >93
1Μ2078 131 27 65-67 482.4; 436.4 3.88 >99
1Μ2088 189 38 71-72 494.5; 448.2 5.05 >97
1Μ211(1)β 148 29 161-163 462.3; 508.5 6.19 >99
1Μ2128 105 20 163-165 522.7; 476.3 6.74 >98
1Ν1078 114 35 103-107 439.5 5.40 >99
1Ν1088 301 59 200-203 451.2 4.83 >97
1Ν2078 187 27 70-72 455.2 5.69 >98
1Ν2148 146 38 172-175 481.1 5.31 >97
1Μ1138 152 32 147-150 476.3; 430.2 4.71 >99
1Μ1148 202 41 170-172 492.4; 446.2 4.97 >99
1Μ1168 227 41 185-187 554.4; 508.4 5.67 >98
1Μ1178 147 29 96-98 514.5; 468.6 4.92 >98
1Μ119* 107 27 65-67 487.4; 441.6; 413.3 2.95 >96
• ···· * > · »·· ·
160
Compounds Yield, mg Yield, % m.p. °C M/Z · τ, min UV (Wave 254 nm, run 10 min.) Purity, % (LCMS)
1M1208 137 27 165.5-167 500.5;454.2 5.46 >99
1M206® 167 36 157-158 468.6;422.3 5.31 >98
1M2108 107 23 157-158 466.3; 420(2 5.13 >99
1M213B 107 42 60-63 492.4; 446.3 5.01 >98
1M2168 157 28 177-179 570.3; 524.5 5.87 >96
1M2178 102 19 134-135 530.4; 484.3 5.18 >97
1M219A 192 48 74-76 503.4; 457.3 3.14 >97
1M2208 92 18 143-145 516.4; 470.5 5.69 >98
1N112A 182 48 65-68 479.2 6.52 >945
1N113 82 18 95-97 449.1 4.83 >97
1N1178 124 25 233.5-235 487.2 4.99 >98
1N1188 107 21 163-163.5 509.5 5.73 >99
1N119‘HCIA 27 5 251-252 460.3 3.10 >98
1N2088 179 38 204-205 467.5 5.11 >96
1N219A 107 28 258.5-260.5 476.3 3.14 >94
1N2208 202 41 231.5-232.5 489.3; 471.5 5.75 >98
1M122 107 23 157-158 464.4; 418.4; 350.2 5.28 >986
1N122 207 47 210-211 437.4; 5.38 >987
1M222 129 27 166-167 480,3; 434.4; 366.2 5.56 >99«
1N222 103 23 110-112 453.2 5.67 >969
'HPLC >96%
HPLC UV-254 >94%
HPLC >97% 4 HPLC >96% 5HPLC(UV254) pure>95%. β HPLC =100% 7 HPLC >94% 8 HPLC = 100% 8 HPLC >96 • · • · • · · • · · · ·
161
Reakční schéma 14
R2 = COOEt (série M), NO2 (série N)
K roztoku chinolonu 1N01 (nebo 1M01) (14,8 g, 63,94 mmol) a triethylbenzylamoniumchloridu (58,4 g, 265,5 mmol) v MeCN (235 ml) se přidalo 26 mi POCI3 (282,4 mmol). Směs se míchala přes noc při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku a zbytek se míchal ve vodě (335 ml) po 2 hodiny. Sraženina se odfiltrovala, promyla vodou, vysušila, promyla horkým cyklohexanem a opět vysušila. Fyzikální vlastnosti připravených sloučenin jsou ukázány v tabulce 9.
Tabulka 9
Výtěžek, g Výtěžek, % B. t., °C M/Z t, min Čistota, % (LCMS)
1NO1(CI) 5,59 89 258 - 259 239; 193 3,34 >95
1M01(CI) 8,63 51 95,5 - 98 266,1; 220,1 3,34 >95
Reakčni schéma 15
~ 1 ,R2 r ΟγΟ NMP / DABCO
ΐΓ^ΙΙ^ 1 0 H 100 °C
R2 = COOEt <1M00<CI)). NO2(1N00(CI)
O • CFjCOOH
j 1MP1TFA
IMBocPI 1NPITFA
INBocPl
K roztoku 1 NO(CI) (640 mg, 2,68 mmol) v 3 ml DMF se přidal postupně t-butoxykarbonylpiperazin (500 mg, 2,68 mmol) a DABCO (300 mg, 2,68 mmol). Reakční • · · 0
000· · 0 • •00 • 00
162 směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. (Pro 1M01(CI) se míchala reakční směs při 60 °C přes noc). Reakce se ukončila přidáním vody (15 ml) a vzniklá sraženina se odfiltrovala a promyla vodou. (Pro 1M01(CI) se reakce ukončila přidáním 20 % roztoku NH4CI (15 ml), extrahovala se DCM (3x3 ml), vysušila přes Na2SO4, rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku, a zbytek se rozetřel v hexanu. Získaná sraženina se odfiltrovala a promyla hexanem). Produkt se vysušil v exsikátoru nad P2O5 při teplotě místnosti za sníženého tlaku. Rozpustil se v 1 ml TFA a ponechal 1 hod.. Roztok se rozmíchal s 20 ml éteru, sraženina se odfiltrovala, promyla éterem a vysušila na vzduchu. Fyzikální vlastnosti připravených sloučenin jsou ukázány v tabulce 10.
Tabulka 10
Výtěžek, 9 Výtěžek, % B. t., °C M/Z t, min Čistota, % (LCMS)
1MP1TFA 0,84 59 214-215 rozkl. 316,1;270,1 1,98 >97
1NP1TFA 1,01 75 234 - 234 rozkl. 598,2; 241,2 1,98 >98
Reakční schéma 16
R2 = COOEt (1M00(CI)), NO2 (1N00(CI)
R3 i
DMF/DABCO ........
TFA
K roztoku 1N01 (Cl) (50 mg, 0,419 mmol) v 3 ml DMF se postupně přidal trifluoracetát 3-thienoypiperazinu (69 mg, 0,440 mmol) a DABCO (47 mg, 0,419 mmol). Reakční směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Reakce se ukončila vodou (15 ml) a vzniklá sraženina se odfiltrovala a promyla vodou. Produkt se vysušil v exsikátoru na P2O5 při teplotě místnosti za sníženého tlaku. Produkty připravené podle tohoto schématu jsou popsány v tabulce 11 indexem ,A za označením sloučeniny.
• ·
9 9
9 9 9
163
Reakční schéma 17
Směs pyrol-2-karboxylové kyseliny (91 mg, 0,82 mmol) a CDI (133 mg, 0,82 mmol) ve 2 ml DMF se míchala přes noc při teplotě místnosti. (V případě 1MO81, 1M091, 1M221, 1M271,1N081,1N211 -vNMP (1 ml), 1M071,1M151,1M181, 1M191,1M211, 1N071,1N151,1N181,1N271 - v DMSO (1 ml)). Pak se přidal 1NP1TFA a směs se míchala při 60 °C po 6 hodin. (V případě 1M181, 1N181 - při teplotě místnosti). Směs se zředila 5 ml solanky a extrahovala CH2CI2 (3x2 ml). Spojené extrakty se promyly vodou (1 ml), vysušily Na2SO4 a odpařily za sníženého tlaku. (V případě 1M071,1M151, 1M191, 1M211,1N071,1N151,1N191,1N211 se směs zředila vodou, práškovitá sraženina se odfiltrovala, promyla vodou, vysušila na vzduchu a rozpustila v 5 až 6N roztoku HCI v isopropanolu. Roztok se zahříval pod refluxem 10 min. Rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku, zbytek se rozmělnil v éteru nebo acetonu. Získaná sraženina se odfiltrovala k získání hydrochloridu požadované sloučeniny). Získané zbytky byly požadované produkty. Produkty připravené podle tohoto schématu jsou v tabulce 11 označeny indexem „B“ za označením sloučeniny. Údaje o výtěžku sloučenin připravených podle schémat 16 a 17 jsou ukázány v tabulce 11.. Označeni zahrnující „(2)“ indikují, že sloučenina je regioizomer.
• · • · · ·
164
Tabulka 11
Compound Yield, 9 Yieíd, % m.p. °C M/Z τ, min (run 10 min.) Purity, % (LCMS)
1M311A 82 53 113-115 406.3; 361.4 2.38’ >97
ÍN111A 62 77 182 383.1 3.01’ > 99
1N131* 68 81 252-254 399.0 3.01’ 100
1N311a 138 87 212-214 379.1 2.38’ > 97
1M1018 146 77 225.5-227 409.2; 270.3 4.11 >97
1N121A 87 82 227-230 428.2 4.57 >94
1N1618 88 93 157.5-160 383.2 3.46 >99
1N2018 162 84 215-217 461.2 4.81 >97
1N3018 121 100 227-230 430.3 5.08 >97
1N3418 87 85 225-227 413.0 4.56 >932
1N1718 122 41 175-177 398.0 4.36 >95
1N2218 238 81 187-188 394.1; 348.2 3.69 >98
1N2418 175 60 258-260 394.1 2.89 >96
1N3518 210 74 229-231 383.0; 337.3 2.72 >97
1M111(2)8 174 91 155.5-158 410.2; 364.2 4.01 >97
1M1318 186 94 137.5-140 426.1; 380.1 4.22 >97
1M1618 170 89 189-190 410.1; 364.2; 346.1 3.43 >96
1M2018 221 97 176-178 490.1; 442.4; 416.0 4.67 >95
1M2918 212 97 210-211 471.3; 425.2 4.22 >98
1N0918 227 79 84-87 387.3;369.2 3.70 >98
1N1418 124 36 223-224.5 467.3 5.41 >98
1M1218 146 69 52-54 455.3; 409.1; 381.2 4.45 >943
1M2418 116 59 209-210 421.3; 375.1 3.01 >95
1M281 x 1.5 H2O8 222 98 164-166 459.4; 413.1 4.86 >97
1M3018 168 79 67-70 457.3; 411.0; 383.1 4.94 >944
1M351® 119 62 206-208 409.9; 364.3; 336.4 2.76 >98
1N1018 228 80 218-221 382.2; 289.2 4.19 >98
1N191*HCI8 250 77 270-273 400.1 2.74 >96
1N2318 256 87 217-219 394.1 2.99 >95
1N2818 249 77 283-285 432.2 4.99 >99
1N2918 254 77 293.5-294 444.4 4.30 >97
1N321A 392 84 146.5-149 369.0 2.85 >99
1N331A 455 94 189-190 385.1 2.99 >99
• · · · ·
• · * * · · ····<· ·· ·
165
Compound Yield, 9 Yield, % m.p. °C M/Z τ, min (run 10 min.) Purity, %(LCMS)
1M1418 103 45 130-131 494.5; 448.2 5.31 >97
1M1718 129 65 125-127 425.0; 379.2; 351.4 4.22 >96
1M2318 149 76 49-52 375.1;421.1 3.01 >96
1M321* 247 55 130.5-131.5 396.3; 350.2; 269.3 3.04 >98
1M331A 276 59 113-114.5 412.3; 366.2 2.91 >99
1M3418 114 56 225-227 440.5; 394.1; 270.3 4.39 >99
1M071*HCI 233 56 43-45 413.4; 367.1; 270.1 2.76 >97
1M081 65 15 143-145 427.2; 270.2 3.09 >99
1M091 171 39 60-62 414.4; 270.0 3.59 >99
1M151*HCI 147 27 108-111 431.3; 385.1; 270.3 2.18 >99
1M181 124 43 67-69 411.5; 365.3; 337.4 3.97 .99
1M191W 327 76 105-107 427.3; 270.3 2.13 >98
1M211(2) 70 14 427.3; 381.4; 270.0 2.79 >96
1M221 247 56 160-160.5 421.4; 375.1; 357.1; 347.3 3.60 >93
1M271 135 31 65-67 422.3; 376.2; 348.0 3.56 >94
1Ν07ΓΗΟ 141 34 83-86 386.2 3.14 >96
1N081 85 14 263-265 400.2 3.12 >97
1N15THCI 227 69 198-200 404.2 2.82 >95
1N181 246 86 200-201 384.1 4.00 >97
1N211(2)*HCI 71 11 78-80 400.2 2.36 >95
1N271 247 84 214-215 395.1; 349.2; 242.3 3.65 >99
1 Run 8 min.
2 HPLC >98% 3 HPLC >96% 4 HPLC >97%
Výtěžek inhibitorů MIF připravených tak, jak se popisuje ve vybraných schématechvýše, je ukázán v tabulce 12. Označení zahrnující „(1)“ a „(2)“ indikují, že sloučenina je regioizomer.
Tabulka 12
No. Compound Weight, mg m.p., (°C)
1 1Μ07ΓΗΟ 226 43-45
2 1M081 58 143-145
3 1M091 164 60-62
4 1M101 139 225.5-227
•· · ······ ··· • · · ··· · · · • · · · ···· · ··« • ···· 9 9 · · · · 9 ··· • · 9 9 9 9 9 9
9999 9 99 999 99 ·
166
5 1M106 84 141-143
6 1M107 131 70-72
7 1M108 196 71-73
8 1M110 135 161-162
9 1M111(1) 178 174-175
10 1M111(2) 167 155.5-158
11 1M112 72 151-152.5
12 1M113 145 147-150
13 1M114 195 170-172
14 1M115 91 177.5-179
15 1M116 220 185-187
16 1M117 140 96-98
17 1M118 97 159-161
18 1M119 100 65-67
19 1M120 130 165.5-167
20 1M121 139 52-54
21 1M122 100 157-158
22 1M131 179 137.5-140
23 1M141 96 130-131
24 1M151*HCI 140 108-111
25 1M161 163 189-190
26 1M171 122 125-127
27 1M181 117 67-69
28 1M191*HCI 320 105-107
29 1M201 214 176-178
30 1M206 160 157-158
31 1M207 124 65-67
32 1M208 182 71-72
33 1M210 100 157-158
34 1M211(1) 141 161-163
35 1M211(2)*HCI 112 80-81
36 1M212 98 163-165
37 1M213 200 60-63
38 1M214 109 180.5-182.5
39 1M215 100 87-88
40 1M216 150 177-179
41 1M217 95 134-135
42 1M218 140 110-112
43 1M219 185 258.5-260.5
44 1M220 85 143-145
45 1M221 240 160-160.5
46 1M222 122 166-167
47 1M231 142 49-52
48 1M241 109 209-210
49 1M271 128 65-67
50 1M281 215 164-166
51 1M291 205 210-211
52 1M301 161 67-70
53 1M311 75 113-115
• · · • · · · · · • · ·
167
54 1M321 230 130.5-131.5
55 1M331 258 113-114.5
56 1M341 107 225-227
57 1M351 112 206-208
58 1N071*HCI 134 83-86
59 1N081 78 263-265
60 1N091 220 84-87
61 1N101 221 218-221
62 - 1N106 145 114-116
63 1N107 107 103-107
64 1N108 294 200-203
65 1N110 90 163-166
66 1N111(1) 130 99-100
67 1N111(2) 56 182
68 1N112 175 65-68
69 1N113 75 95-97
70 1N114 90 216-217
71 1N115 150 105-110
72 1N116 133 205-208
73 1N117 117 233.5-235
74 1N118 100 163-163.5
75 1N119*HCI 42 251-252
76 1N120 85 179-181
77 1N121 80 227-230
78 1N122 200 210-211
79 1N131 60 252-254
80 1N141 117 223-224.5
81 1N151*HCI 220 198-200
82 1N161 81 157.5-160
83 1N171 115 175-177
84 1N181 239 200-201
85 1N191*HCI 243 270-273
86 1N201 155 215-217
87 1N206 141 72-74
88 1N207 180 70-72
89 1N208 172 204-205
90 1N210 92 187-190
91 1N211(1) 100 83-85
92 1N211(2)*HCI 64 78-80
93 1N212 89 73-75
94 - - -
95 1N214 139 172-175
96 1N215 80 220-221
97 1N216 200 228-230
98 1N217 100 251-252
99 1N218 200 95-97
100 1N219 100 258.5-260.5
101 1N220 195 231.5-232.5
102 1N221 231 187-188
• · · · · · • φ ·
• Φ ·
168
103 1N222 96 110-112
104 1N231 246 217-219
105 1N241 168 258-260
106 1N271 240 214-215
107 1N281 242 283-285
108 1N291 247 293.5-294
109 1N301 114 227-230
110 1N311 131 212-214
111 1N321 385 146.5-149
112 1N331 448 189-190
113 1N341 80 225-227
114 1N351 202 229-231
Přiklad 15
Následující schémata ukazují obecnou proceduru pro syntézu Boc-derivátů kyselin.
Směs L-thiazolidin-4-karboxylové kyseliny (1 g, 7,51 mmol, 98 % čistota, AVOCADO, #15033), Na2CO3 (1,75 g, 16,5 mmol) ve vodě (9 ml) a isopropanolu (1 ml) se míchalo do rozpuštění. Pak se přidal Boc20 (1,967 g, 9,01 mmol) a směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Získaná suspenze se zředila vodou (10 ml) a extrahovala hexanem (5 ml). Spodní fáze se oddělila, přidal se EtOAc (20 ml) a míchaná směs se okyselila na pH 2 - 3. EtOAc fáze se oddělila, vodná fáze se extrahovala EtOAc (3x 1é ml). Spojené extrakty se promyly vodou (10 ml), vysušily přes Na2SO4 a odpařily za sníženého tlaku. Zbytek se krystalizoval z éteru a získaná sraženina se odfiltrovala, aby po vakuovém sušení poskytla N-Boc-thiazolidin-4-karboxylovou kyselinu (1,03 g, 59 %).
Přiklad 16
Alkylpiperaziny se mohou synteizovat podle následujících schémat.
169
Reakční schéma 21
s
N(Et)3> CH2CL2
N(Et)3, CH2CL2
O
TFA
Roztok čerstvě destilovaného thionylchloridu (3,9 ml, 0,053 mmol) v dichlormethanu (5 ml) se po kapkách přidal do míchaného roztoku 2-thiofenmethanolu (4,2 ml, 0,44 mmol) a triethylaminu (7,4 ml, 0,05 mmol) v dichlormethanu (25 ml), teplota se udržovala pod 20 °C. Poté se zvýšila na 40 °C po 1 hod., roztok se nalil na drcený led, dichlormethanová fáze se oddělila a vysušila přes MgSO4. Poté se po kapkách přidala do míchaného roztoku N-Boc-piperazinu (2g, 0,011 mmol) a triethylaminu (1,5 ml, 0,011 mmol) v dichlormethanu (45 ml). Viz Nicholas A. Meanwell, Piyasena Hewawasam, Jeanina A. Thomas, J. J. Kim Wright, John W. Russel, Marianne Gamberdella, Harold J. Goldenberg, Steven M. Seiler, a George B. Zavoico, Inhibitors od Blood Platelet cAMP Phosphodiesterase. 4. Structural Variation of the Side-Chain Terminus of water-Soluble
1,3-Dihydro-2H-imdazo[4,5-b]quinolin-2-one Derivatives, J. Med. Chem. (1993) Vol. 36, pp.3251-3264; Elena Carceller, Manuel Merlos, Marta Giral, Carmen Almansa, Javier Bartroli, Julian Garcia-Rafanell, a Javier Forn, Synthesis and Structure-Activity Relationships of 1-Acyl-4-methyl-((2-methyl-3-pyridyl)cyanomethyl)piperazines as PAF antagonists, J. Med. Chem. (1993) No. 36, pp. 2984-2997. Směs se míchala přes noc při teplotě místnosti, rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku a zbytek se extrahoval éterem. Éterový roztok se odpařil za sníženého tlaku, zbytek se rozpustil v TFA (3,3 ml, 0,043 mmol) a ponechal po 30 min.. TFA se odstranila za sníženého tlaku, zbytek se rozetřel s éterem, sraženina se odfiltrovala a vysušila na vzduchu, čímž poskytla ditrifluoracetát 1-(2-thienylmethyl)piperazinu (3,16 g, 72 %). Viz William J. Archer, Robert Cook, a Roger Taylor, Electrophillic Aromatic Substitution. Part 34. Partial Rate Factors for Detritiation of Dithieno[1,2-b:4,3-b']benzene, and Dithieno[2,1-b:4,3-b']benzene, J. Chem Soc. Perkin Trans.ll. (1983) pp. 813-819.
9 ·♦·
170
Reakční schéma 22 // \\ ουυυ '/ \\ Ό -2-->-
SOCI.
N(Et)3, CH2CL2
Cl
O
N(Et)3, CH2CL2
O
TFA
Roztok čerstvě destilovaného thionylchloridu (3,9 ml, 0,053 mmol) v dichlormethanu (5 ml) se přidal po kapkách do míchaného roztoku furfurylalkoholu (3,8 ml, 0,044 mmol) a triethylaminu (7,4 ml, 0,05 mmol) v dichlormethanu (25 ml), teplota se udržovala pod 20 °C. Směs se míchala po 1 hod.. Poté se rozpouštědlo odpařilo, zbytek se rozpustil v dichlormethanu (150 ml). Získaný roztok se přidal po kapkách do míchaného roztoku N-Boc-piperazinu (2g, 0,011 mmol) a triethylaminu (4 ml, 0,029 mmol) v dichlormethanu (45 ml). Směs se míchala přes noc při teplotě místnosti, rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku a zbytek se extrahoval éterem. Éterový roztok se odpařil za sníženého tlaku, zbytek se rozpustil v TFA (3,3 ml, 0,043 mmol) a ponechal po 30 min.. TFA se odstranila za sníženého tlaku, zbytek se rozetřel s éterem, a získaná černá sraženina se odfiltrovala. Poté se sraženina rozpustila v 200 ml MeOH, přidalo se aktivní uhlí, a sraženina se zahřívala pod refluxem 30 min.. Aktivní uhlí se odfiltrovalo, rozpouštědlo se odpařilo, zbytek se rozetřel s éterem. Získaná bílá sraženina se odfiltrovala a vysušila na vzduchu za vzniku ditrifluoracetátu 1-(2-furylmethy)piperazinu (1,64 g, 40 %). Viz. R. Lukeš a V. Dienstbierova, Collection Czechoslov. Chem. Commun. (1954) Vol. 19, pp. 609-610.
Přiklad 17
Sulfonamidy se mohou syntetizovat podle následujících schémat.
4-hvdroxy-1-methyl-3-nitro-1H-chinolin-2-on (označovaný jako 595-01)
Roztok ethylnitroacetátu (15,96 g, 120 mmol) se pomalu přidal do suspenze hydridu sodného (60% v minerálním oleji, 5,28 g, 132 mmol) v dimethylacetamidu pod atmosférou N2. Směs se nechala míchat při teplotě místnosti, dokud neskončil vývoj vodíku, poté se zahřála na 90 °C na 30 min. a ochladila na teplotu místnosti. Pomalu se přidal roztok N-methylisatového anhydridu (23,38 g, 132 mmol v dimethylacetamidu a roztok se zahříval na 120 °C přes noc. Směs se ochladila na teplotu místnosti, nalila do ledové vody a okyselila 10% HCI. Vzniklá pevná látka se zfiltrovala a několikrát promyla ·· · • * • · · > · · · · » · · « · • 9 9 9 99
171 vodou za vzniku 7,1 g (27 %) žluté pevné látky. B.t. 193 °C. 1H NMR (DMSO-D6): δ 3,60 (s, 3H), 7,37 (t, J=7,6 Hz, 1H), 7,77 (t, J=7,5 Hz, 1H), 8,12 (d, J=7,9 Hz, 1H). EIMS m/z 221 (M+1), 243 (M+23). Anal. (C10H8N2O4) C,H,N.
NaH, DMA 90°C. 15 h
4-chlor-1-methvl-3-nitro-1H-chinolin-2-on (označený jako 595-02)
Suspenze 595-01 (6,2 g, 28,18 mmol) v 70 ml oxychloridu fosforečného se zahřívala na 90 °C po 3 hod.. Rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. Zbytek se suspendoval v ledové vodě a neutralizoval hydrogenuhličitanem sodným. Vzniklá pevná látka se zfiltrovala a vysušila za vzniku 4,91 g (73 %) hnědé pevné látky. B.t. 235 °C.
Ή NMR (DMSO-De): δ 3,72 (s, 3H), 7,556 (t, J=7,5 Hz, 1H), 7,78 (d, J=8,6 Hz, 1H), 7,92 (t, J=8,6 Hz, 1H), 8,+ě (d, J=7,9 Hz, 1H). EIMS m/z 239 (M+1), 261 (M+23). Anal. (C10H7N2O3CI) C,H,N.
4-(thiofen-2-karbonyl)piperazin-1-karboxylová kyselina, terč, butylester (595-03)
2-thiofenkarbonylchlorid (2,04 g, 1,49 ml) se přidal k roztoku terč. butyl-1 piperazinkarboxylátu (2,5 g, 13,4 mmol) a DMAP (20 mg) v pyridinu (15 ml) při 0 ’C pod N atmosférou a míchal se při teplotě místnosti přes noc. Směs se nalila do ledové vody, sraženina se odfiltrovala a vysušila za vzniku bíié pevné látky (3,5 g, 8 %). B.t. 86 °C.
Ή NMR (DMSO-De): δ 1,42 (s, 12H), 3,40 (m, 4H), 3,61 (m, 4H), 7,12 (m, 1H), 7,43 (d, J=4,1 Hz, 1H), 7,77 (d, J=4,8 Hz, 1H). EIMS m/z 297 (M+1), 319 (M+23). Anal. (C14H20N2O3S) C,H,N.
595-03 595-04
Piperazin-1-ylthiofen2-ylmethanon (označeny jako 595-04)
K roztoku 595-03 (3,5 g, 11,8 mmol) v dichlormethanu (50 ml) se přidala kyselina trifluoroctová (10 ml). Roztok se míchal při teplotě místnosti po 3 hod. Rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku a zbytek se rozpustil v chloroformu.
• » 9 99 9
999 9
172
Organická fáze se promyla nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysušila pfes Na2SO4 a odpařila za vzniku 2,2 g (94 %) hnědého viskózniho oleje. 1H NMR (DMSO-De): δ 2,78 (m, 4H), 3,59 (m, 4H), 7,12 (t, J=4,1 Hz, 1H), 7,38 (d, J=4,1 Hz, 1H),
7,74 (d, J=4,8 Hz, 1H). EIMS m/z 197 (M+1).
-methyl-3-nitro-444-(thiofen-2-karbonyl)piperazin-1 -yll-1 H-chinolin-2-on (označený jako 595-06)
595-04 (1g, 5,5 mmol) a diizopropylethylamin (1,74 ml, 10 mmol) se přidal k roztoku 595-02 (1,2 g, 5 mmol) v toluenu (100 ml) a zahříval se při 100 °C po 15 hod. Rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku. Čištění zbytku flash chromatografií (CH2CI2/MeOH, 49:1) poskytlo 1,05 g )53 %) žluté pevné látky. B.t. 105 °C. Ή NMR (DMSO-D6): δ 3,19 (m, 4H), 3,65 (s, 3H), 3,90 (m, 4H), 7,14 (t, J=4,5 Hz, 1H), 7,43 (t, J=7,5 Hz, 1H), 7,48 (d, J=4,1 Hz, 1H), 7,67 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,80 (m, 2H). EIMS m/z 399 (M+1), 421 (M+23). Anal. (C19H18N4O4S) C,H,N.
3-amino-1 -methyl-4-f4-(thiofen-2-karbonyl)piperazin-1 -yll-1 H-chinolon-2-on (označený jako 595-09)
K suspenzi 595-06 (600 mg, 1,5 mmol) v etanolu se přidalo Pd/C (10 %, 75 mg). Suspenze se míchala pod H2 atmosférou při 60 °C po 4 hod.. Horká směs se zfiltrovala přes Celit a filtrát se odpařil dosucha. Zbytek se rekrystalizoval v ethanolu za vzniku 490 mg (88 %) bílé pevné látky. B.t. 202 eC. Ή NMR (DMSO-D8): δ 3,60 (s, 3H), 7,37 (t, J=7,6 Hz, 1H), 7,77 (t, J=7,5 Hz, 1H, 8,12 (d, J=7,9 Hz, 1H). EIMS m/z 221 (M+1), 243 (M+23). Anal. (C10H8N2O4) C,H,N.
N-{1 -methvl-2-oxo-4-f4-(thiofen-2-karbonyl)piperazin-1 -yll-1.2-dihvdrochinolin-3-vl)-methansulfonamid (označený jako 595-15)
Methansulfonylchlorid (0,1 ml, 1,5 mmol) se přidával po kapkách k roztoku 59509 (20 mg, 0,32 mmol) v pyridinu (2 ml) pod N2 atmosférou a dále se míchal při teplotě místnosti přes noc. Rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku a zbytek se rozpustil v • Φ φ φ φ » · · · · φ φ • ··· φ φ
ΦΦΦ· · φ* φ I · Φ ► · ·
173 ethylacetátu. Organická fáze se sušila přes Na2SO4 a odpařila se na zbytek, který se extrahoval éterem za vzniku 103 mg (73 %) bílé pevné látky. B.t. 223 C. 1H NMR (DMSOD6): δ 3,08 (s, 3H), 3,31 (m, 4H), 3,64 (s, 3H), 3,95 (m, 4H), 7,15 (t, J=4,0 Hz, 1H), 7,33 (t, J=7,6 Hz, 1H), 7,44 d, J=4,0 Hz, 1H), 7,56 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,66 (t, J=7,4 Hz, 1H), 7,79 (d, J=4,9 Hz, 1H), 7,98 (d, J=8,2 Hz, 1H), 8,84 (s, 1H). EIMS m/z 447 (M+1), 469 (M+23). Anal. (C2qH22N4O4S2) C,H,N.
Pyr.. RT, Overnight
595-15
Jiné sulfonamidy se mohou připravit podobnými cestami syntézy.
Přiklad 18
Suifonyiy se mohou syntetizovat podle následujfcích schémat.
Ethylester kyseliny p-tolvlsulfanyloctové (označeno jako 595-35)
Roztok 4-methylbenzenthiolu (5g, 40,25 mmol) se přidával po kapkách k suspenzi NaH (60 % v minerálním oleji, 1,98 g, 48,30 mmol) v THF při teplotě místnosti a míchal se po 30 min. pod N2 atmosférou. Ethylbromacetát (4,9 ml, 44,27 mmol) se přidával pomalu k tomuto roztoku a dále se míchal při teplotě místnosti po 3 hod.. Rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustil ve ve zředěné HCI a extrahoval ethylacetátem. Spojené organické fáze se dostatečně promyly nasyceným roztokem NaHCO3, vodou a solankou a vysušily přes Na2SO4. Odpaření organické fáze poskytlo 8,46 g (99 %) bezbarvého oleje. Ή NMR (CDCI3): δ 1,22 (t, J=7,2 Hz, 3H), 2,32 (s, 3H), 3,57 (s, 2H), 4,14 (q, J=7,2 Hz, 2H), 7,11 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,33 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,33 (d, J=8,0 Hz, 2H). EIMS m/z 210 (M+1), 233 (M+23).
Ethylester kysetiny (toluen-4-sulfonyl)octové (označený jako 595-35)
K roztoku 595-29 (10 g, 47,55 mmol) v dichlormethanu se přidala kyselina m-chlorperoxybenzoová (21,31 g, 95,1 mmol) po částech při 0 °C. Směs se zahřála na teplotu místnosti a míchala se přes noc. Vzniklá pevná látka se odfiltrovala a filtrát se dostatečně promyl 1N NaOH, vodou a solankou. Organická fáze se vysušila přes Na2SO4
174 ·· · • 9 · • · 9
9999
9 a odpařila za vzniku 9,8 g (85 %) bezbarvého oleje. 1H NMR (CDCI3): δ 1,22 (t, J=7,2 Hz, 3H), 2,45 (s, 3H), 4,08 (s, 2H), 4,17 (q, J=7,2 Hz, 2H), 7,37 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,83 (d, J=8,0 Hz, 2H). EIMS m/z 243 (M+1), 265 (M+23).
NaH. THF s Br^COOEt -I
RT. 3h k
S. .COOEt m-CPBA, CH2CI2
595-29
RT, Plfe> W
595-35
4-hvdroxy-1 -methyl-3-(toluen-4-sulfonyl)-1 H-chinolin-2-on (označený 595-36)
Roztok 595-35 (9,8 g, 4,049 mmol) se pomalu přidal do suspenze hydridu sodného (60 % v minerálním oleji, 1,78 g, 44,52 mmol) v dimethylacetamidu pod atmosférou N2. Směs se míchala při teplotě místnosti, dokud neustal vývoj vodíku, poté se zahřála na 90 °C na 30 min. a ochladila na teplotu místnosti. Pomalu se přidal roztok N-methylisatového anhydridu (7,88 g, 44,52 mmol) v dimethylacetamidu a zahříval se přes noc na 120 °C. Směs se ochladila na na teplotu místnosti, nalila do ledové vody a okyselila studenou 10 % HCI. Vzniklá tuhá látka se odfiltrovala a několikrát promyla vodou za vzniku 5,7 g (43%) bílé pevné látky. B.t. 191 °C. Ή NMR (DMSO-D6): δ 2,39 (s, 3H), 3,44 (s, 3H), 7,36 (t, J=7,5 Hz, 1H), 7,42 (d, J=8,2 Hz, 2H), 7,55 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,81 (t, J=7,1 Hz, 1H), 7,95 (d, J=8,2 Hz, 2H), 8,11 (d, J=8,0 Hz, 1H). EIMS m/z 330 (M+1), 352 (M+23). Anal (Ci7H15NO4S) C, Η, N.
4-chlor-1-methvl6-(toluen-4-sulfonvl)-1H-chinolin-2-on (označený jako 595-46)
Suspenze 595-36 (5,2 g, 5,9 mmol) v 30 ml oxychloridu fosforečného se zahřívala na 130 eC po 30 hod. Rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. Zbytek se suspendoval v ledové vodě a neutralizoval hydrogenuhličitanem sodným. Vzniklá pevná látka se odfiltrovala a vysušila za vzniku 2,3 g (43 %) bílé pevné látky. B.t. 193 °C. 1H NMR (DMSO-De): δ 2,38 (s, 3H), 3,52 (s, 3H), 7,39 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,48 (t, J=7,5 Hz, 1H), 7,64 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,84 (t, J=7,1 Hz, 1H), 7,94 (d, J=8,2 Hz, 2H), 8,32 (d, J=8,0 Hz, 1H). EIMS m/z 348 (M+1), 370 (M+23). Anal. (C17H14NO3SCI) C, Η, N.
· 00 0000 0· 0 ·0· 000 0·· ··· 0 0000 · « 0 · * 0000 0 0 0 0 0 · 9 0000 • · 00 0000 • •00 0 00 000 0« ·
175
-methyl-4-[4-(thiofen2-karbonyl)piperazin-1 -vl1-3-toluen-4-sutfonyQ-1 H-chinolžn-2-on (označený jako 595-48)
K roztoku 595-46 (289 mg, 0,83 mmol) a 595-04 (195 mg, 0,99 mmol) v toluenu se přidal díizopropylethylamin (0,38 ml, 2,22 mmol) a zahříval se přes noc na 105 °C. Roztok se ochladil a rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. K olejovitému zbytku se přidala voda a vše se ošetřilo ultrazvukem. Vzniklá pevná látka se odfiltrovala a promyla vodou a éterem za vzniku žluté pevné látky, 360 mg (86 %), b.t.213 °C. 1H NMR (DMSOD6): δ 2,37 (s, 3H), 3,37 (s, 3H),3,65 (m, 4H), 3,94 (m, 4H), 7,16 (t, J=4,3 Hz, 1H), 7,32 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,39 (t, J=7,6 Hz, 1H), 7,54 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,74 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,80 (d, J=4,5 Hz, 1H), 8,15 (d, J=8,2 Hz, 1H). EIMS m/z 508 (M+1), 530 (M+23). Anal.
(C26H25N3O4S2) C, H, N.
595-48
595-46 595-04
4-hvdroxv-3-methansulfonvl-1-methyl-1H-chinolin-2-on (označený jako 595-05)
Roztok ethylmethansulfonylacetátu (3,78 g, 22,74 mmol) se pomalu přidal do suspenze hydridu sodného (60 % v minerálním oleji, 1,07 g, 25 mmol) v dimethylacetamidu pod atmosférou N2. Směs se nechala míchat při teplotě místnosti, dokud neustal vývoj vodíku, a poté se zahřívala na 90 °C a ochladila na teplotu místnosti. Pomalu se přidal roztok N-methylisatového anhydridu (4,43 g, 25 mmol) v dimethylacetamidu a zahříval se na 120 °C přes noc. Směs se ochladila na teplotu místnosti, nalila do ledové vody a okyselila ledovou 10 % HCI. Vzniklá pevná látka se odfiltrovala a promyla několikrát vodou za vzniku 2,76 g (48 %) bílé pevné látky. B.t. 170 °C. Ή NMR (DMSOD6): δ 3,51 (s, 3H), 3,59 (s, 3H), 7,39 (t, J=7,4 Hz, 1H), 7,62 (d, J=8,2 Hz, 1H), 7,84 (t, J=7,0 Hz, 1H), 8,09 (t, J=8,0 Hz, 1H). EIMS m/z 254 (M+1), 294 (M+23). Anal (CuHnNO.SJC, Η, N.
4-chlor-3-methansulfonvl-1-methyl-1H-chinolin-2-on (označený jako 595-14)
Suspenze 595-05 (1,5 g, 5,9 mmol) v 30 ml oxychloridu fosforečného se zahřívala na 130 °C po 30 hod. Rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. Zbytek se ·· ·
Β · · • · · * ···· ·· ···· • · · • · ··· • · · · • · · ·· ··· ·· 0 • · 9 • · · · • · 9 9999
9 9
9 C
176 suspendoval v ledové vodě a neutralizoval hydrogenuhličitanem sodným. Vzniklá pevná látka se odfiltrovala a vysušila za vzniku 773 mg (48 %) bílé pevné látky. B.t. 221 °C.
Ή NMR (DMSO-De): δ 3,48 (s, 3H), 3,68 (s, 3H), 7,49 (t, J=7,8 Hz, 1H), 7,72 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,89 (t, J=8,6 Hz, 1H), 8,29 (d, J=8,5 Hz, 1h). EIMS m/z 272 (M+1), 294 (M+23). Anal (CnHwCINOsS) C, Η, N.
„COOE1
NaH, ®C. 15
3-methansulfonvl-1 -methvl-4-f4-(thiofen-2-karbonvl)piperazin-1 -yll-1 H-chinolin-2-on (označený jako 595-16)
Diizopropylethylamin (0,38 ml, 2,22 mmol) se přidal k roztoku 595-14 (300 mg,
1,11 mmol) a 595-04 (239 mg, 1,12 mmol) v toluenu a zahříval se přes noc na 105 °C. Roztok se ochladil rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. K olejovitému zbytku se přidala voda a ošetřil se ultrazvukem. Vzniklá pevná látka se zfiltrovala a promyla vodou a éterem za vzniku žluté pevné látky, 384 mg (81 %), b.t 224 °C. Ή NMR (DMSO-D6): δ 3,36 (s, 3H), 3,52 (m, 4H), 3,60 (s, 3H), 3,91 (m, 4H), 7,16 (t, J=3,5 Hz, 1H), 7,37 (t, J=7,5 Hz, 1H), 7,47 (d, J=3,5 Hz, 1H), 7,61 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,57 (t, J=8,1 Hz, 2H), 7,79 (d, J=4,8 Hz, 1H), 8,10 (d, J=8,5 Hz, 1H). EIMS m/z 432(M+1), 454 (M+23). Anal.
(C20H21N3O4S2) C, Η, N.
Přiklad 19
595-16
Ethylester kyseliny 4-hvdroxv-2-oxo-1.2-dihydrochinolin-3-karboxylové (označený jako 595-68)
Roztok diethylmalonátu (80 g, 050 mol) se pomalu přidal do suspenze hydridu sodného (60 % v minerálním oleji, 22g, 0,55 mol) v dimethylacetamidu pod atmosférou N2. Směs se nechala míchat při teplotě místnosti, dokud se vyvíjel vodík, poté se zahřála na • · • · · · • · · · · · · · · • · · · · · · · · ··· • ···· · · · 9 9 9 9 9999 • 9 9 9 9 9 9 9
9 9 · ····· ·· ·
177 °C po 30 min. a ochladila na teplotu místnosti. Pomalu se přidal roztok anhydridu kyseliny ísatoové (89,72 g, 0,55 mol) v dimethylacetamidu a zahřál se na na 120 °C po 15 hod. Směs se ochladila na teplotu místnosti, nalila do ledové vody a a okyselila 10 % studenou HCI. Vzniklá tuhá látka se zfiltrovala a několikrát promyla vodou za vzniku 55 g (47 %) bílé tuhé látky. B.t. 173 °C. Ή NMR (DMSO-D6): δ 1,30 (t, J=6,9 Hz, 3H), 4,33 (q, J=6,9 Hz, 2H), 7,18 (t, J=7,5 Hz, 1H), 7,26 (d, J=8,2 Hz, 1H), 7,62 (t, J=7,2 Hz, 1H), 7,93 (d, J=8,0 Hz, 1H), 11,05 (s, 1H), 13,5 (s, 1H). EIMS m/z 234 (M+1), 256 (M+23). Anal. (CuHnNOJC, H,N.
Ethylester kyseliny 2.4 dichlorchinolin-3-karboxylové (označený jako 595-72)
Suspenze 595-68 (35 g, 150 mmol) v 200 ml oxychloridu fosforečného se zahřívala pod refluxem po 30 min.. Rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. Zbytek se suspendoval v ledové vodě a neutralizoval hydrogenuhličitanem sodným. Vzniklá tuhá látka se odfiltrovala a vysušila za vzniku 39 g (97 %) bílé pevné látky. B.t. 93 °C. 1H NMR (DMSO-De): δ 1,37 (t, J=6,9 Hz, 3H), 4,49 (q, J=6,9 Hz, 2H), 7,89 (t, J=8,5 Hz, 1H), 8,02 (t, J=7,2 Hz, 1H), 8,10 (d, J=8,3 Hz, 1H), 8,28 (d, J=8,0 Hz, 1H). EIMS m/z 270 (M+1), 292 (M+23). Anal. (C12H9CI2NO2) C, Η, N.
Ethylester kyseliny 4-chlor-2-oxo-1.2-dihvdrochinolin-3-karboxvlové (označený jako 595-76)
Octan amonný (12,6 g, 164 mmol) se přidal k roztoku 595-72 (40,17 g, 149 mmol) v kyselině octové (150 ml). Směs se zahřívala na 140 ’C po 4 hod.. Roztok se ochladil a vlil do ledové vody. Vzniklá pevná látka se odfiltrovala, promyla vodou a vysušila za vzniku bílé pevné látky (34 g, 91 %). B.t. 186 °C. Ή NMR (DMSO-D6): δ 1,37 (t, J=6,9 Hz, 3H), 4,50 (q, J=6,9 Hz, 2H), 7,87 (t, J=7,5 Hz, 1H), 8,01 (t, J=7,0 Hz, 1H), 8,08 (d,
J=8,4 Hz, 1H), 8,26 (d, J=8,2 Hz, 1H). EIMS m/z 252 (M+1). Anal. (C12HwCINO3) C, Η, N.
ct cooa poc,
-li JL JL
O 140 °C, 0.5 h
595-72
595-76 • ······
178
Ethylester kyseliny 2-oxo-4-f4-(thiofen-2-karbonyl)piperazin-1-yl1-1.2-dihvdrochinolin-3-karboxylové (označený jako 595-77)
K roztoku 595-76 (7g, 27,8 mmol) v dimethylacetamidu se přidal 1,4diazabicyklo[2.2.2]oktan (6,23 g, 55,6 mmol) a 595-04 (6g, 30,6 mmol). Roztok se zahříval na 115 °C po 15 hodin. Reakční směs se ochladila a nalila do ledové vody. Vzniklá tuhá látka se zfiltrovala, promyla vodou a vysušila za vzniku bílé pevné látky (7g, 62 %), b.t.
198 °C. Ή NMR (DMSO-D6): δ 1,28 (t, J=6,9 Hz, 3H), 3,12 (m, 4H), 3,87 (m, 4H), 4,28 (q, J=6,9 Hz, 2H), 7,15 (t, J=4,3 Hz, 1H), 7,23 (t, J=7,5 Hz, 1H), 7,31 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,45 (d, J=3,1 Hz, 1H), 7,54 (t, J=7,4 Hz, 1H), 7,79 (d, J=4,9 Hz, 1H), 7,87 (d, J=8,0 Hz, 1H). EIMS m/z 412(M+1), 434 (M+23). Anal. (C21H21N3O4S 0,5 H2O) C, Η, N.
Ethylester kyseliny 1 -(4-fluorbenzvl)-2-oxo-4-f-4-(thíofen-2-karbonvl)pžperazin-1 vll-1.2-dihvdrochinolin-3.karboxylová kyselina (označený jako 595-78)
K suspenzi hydridu sodného (60 % v minerálním oleji, 0,78 g, 19,46 mmol) v DMF se pomalu přidal roztok 595-77 (7g, 17,03 mmol) v DMF. Suspenze se míchala při teplotě místnosti 30 min.. K tomuto roztoku se pomalu přidal 4-fluorbenzylbromid a dále se míchal 2 hod.. Směs se nalila do studené vody a okyselila chladnou 10 % HCI. Vzniklá pevná látka se oddělila, promyla vodou a přečistila bleskovou chromatografii (CH2CI2/MeOH, 49 :1) za vzniku 5,9 g (67 %) bílé pevné látky. B.t. 52 °C. Ή NMR (DMSO-De): δ 1,30 (t, J=6,9 Hz, 3H), 3,16 (m, 4H), 3,89 (m, 4H), 4,32 (q, J=6,9 Hz, 2H), 7,14 - 7,17 (m, 2H), 7,24 - 7,27 (m, 2H), 7,31 (t, J=7,6 Hz, 1H), 7,44 - 7,47 (m, 2H), 7,58 (t, J=8,5 Hz, 1H), 7,79 (d, J=4,9 Hz, 1H), 8,02 (d, J=8,5 Hz, 1H). EIMS m/z 520(M+1), 542 (M+23). Anal. (C28H26FN3O4S 0,5 H2O) C, Η, N.
Přiklad 20
Následuje popis syntézy knihovny sloučenin obecného vzorce 1a a 1b . jak jsou popsány výše. Sloučeniny zahrnující „M“ v označení obsahují skupinu -COOEt.
··· ······ «·· ··· · · · · · · ··· · · · · · · · · · • ···· · « · · · · · ···· • · ·· · · · · • · · · · ····· ·· ·
179
Sloučeniny zahrnující v označení „N obsahují skupinu NO2. Dvě cifry za za „M“ nebo „N“ odpovídají numerickému označení pro funkční skupinu R1. Sloučeniny mají následující struktury, s výjimkou těch, jejichž označení obsahuje „+i“.
Ve sloučeninách, které mají označení „+i“, R3 je substituent na kyslíkovém atomu chinolonové skupiny spíše než na dusíkovém atomu, tj. sloučenina struktury 1b_, jak je popsána níže. Označení „i“ se objevuje kdekoliv ve výhodných provedeních, a odkazuje na substituent na kyslíkovém atomu chinolonové skupiny a ne na dusíkovém atomu.
Numerické označeni funkčních skupin R1
Vodík Methyl Chlor
1 2 3
Numerické označení funkčních skupin R2
2 3 4 5 θ • · • · · ·
4» ·
180
Numerické označení funkčních skupin R3
• »· • · 9 9 9 · • · · 9 9 9 99 9 9 9 9 • ···· 99 9 999 9 9999 • · · · · · · · ···· 9 99 99 9 9 9 9
3 4
Numerická označení připravených inhibitorů MIF je ukázáno v tabulce 13. Tabulka 13
R3 = 1 Methyl R3 = R3 = 4 R3 = Á 5 ’ R3 = 6
1N11 1N12 1N13 1N14 1N15
1N21 1N22 1N23 1N24 1N25
1N31 1N32 1N33 1N34 1N35
1N41 1N42 1N43 1N44 1N45
1N51 1N52 1N53 1N54 1N55+Í
1N61 1N62 1N63 1N64 1N65
2N11 2N12+Í 2N13 2N14 2N15
2N21 2N22 2N23 2N24 2N25
2N31 2N32 2N33 2N34 2N35
2N41 2N42 2N43 2N44 2N45
2N51 2N52 2N53 2N54 2N55+Í
2N61 2N62 2N63 2N64 2N65
1M11 1M12 1M13 1M14 1M15+Í
1M21 1M22 1M23 1M24 1Μ25+Ϊ
1M31 1M32 1M33 1M34 1M35+Í
1M41 1M42 1M43 1M44 1M45+Í
1M51 1M52 1M53 1M54 1M55
1M61 1M62 1M63 1M64 1M65
2M11 2M12 2M13 2M14 2M15
2M21 2M22 2M23 2M24 2Μ25+Ϊ
2M31 2M32 2M33 2M34 2M35+Í
2M41 2M42 2M43 2M44 2M45+Í
2M51 2M52 2M53 2M54 2M55
2M61 2M62 2M63 2M64 2M65+Í
3M11 3M12 3M13 3M14 3Μ15+Ϊ
3M21 3M22 3M23 3M24 3M25
3M31 3M32 3M33 3M34 3M35+Í
3M41 3M42 3M43 3M44 3M45+Í
3M51 3M52 3M53 3M54 3M55+Í
3M61 3M62 3M63 3M64 3M65+Í
• · • · • ······ • · · · · · · · ··· · ···· · · · · • ···· · « · · · · · ···· • · · · ··· • · · · ·«··· ·· «
181
Detaily reakčnfch schémat pro přípravu meziproduktů inhibitorů MIF jsou ukázány níže.
Všechny následující sloučeniny se získaly použitím podobné nebo stejné procedury: Sloučenina 1M21: výtěžek 176 mg, 56,56 %; sloučenina 1M31: výtěžek 64 mg, 20,60 %; sloučenina 1M41: výtěžek 110 mg, 35,48 %; sloučenina 1M51: výtěžek 139 mg,
44,18 %; sloučenina 1M61: výtěžek 88 mg, 28,37 %; sloučenina 2M13: výtěžek 144 mg, 38,09 %; sloučenina 2M21: výtěžek 113 mg, 36,73 %; sloučenina 2M23: výtěžek 137 mg, 36,16 %; sloučenina 2M31: výtěžek 27 mg, 8,67 %; sloučenina 2M33: výtěžek 141 mg, 37,45 %; sloučenina 2M41: výtěžek 72 mg, 23,30 %; sloučenina 2M43: výtěžek 117 mg,
31,54 %; sloučenina 2M51: výtěžek 65 mg, 21,20 %; sloučenina 2M53: výtěžek 91 mg,
24,87 %; sloučenina 2M61: výtěžek 113 mg, 36,94 %; sloučenina 2M63: výtěžek 127 mg, 33,99 %; sloučenina 3M11: výtěžek 58 mg, 19009 %; sloučenina 3M21: výtěžek 134 mg, 43,32 %; sloučenina 3M41: výtěžek 141 mg, 45,83 %; sloučenina 3M51: výtěžek 119 mg, 38,42 %; sloučenina 3M61: výtěžek 162 mg, 45,85 %;a sloučenina 3M63: výtěžek 40 mg, 11,00%.
·· · • · • · · · · · · · · • · « · · · · · · · · · • ···· · « · · · · · ···· • · · · ···· ···· · ·· ··· ·· ·
182
Reakční schéma 22
poct,
•WÍ.CUF
° W-Μ». *O-*nac
Přiklad 21
Deriváty Boc kyselin se připravily podle následujícího reakčního schématu
Reakční schéma 23
V06
Q
Aklrtoh
* ^oc ftCOCLE^N rA
AV-QOd-jeXVBOQ'
► CFjCOOH
R
Av-oofi-ep
Qςκ
AV-0010
AV-0020
AV-0040
AV-OOSO
F
AV-0030
AV-OOSO • · · ► · · • · · • · · · · • ·
183
Výtěžek a čistota sloučenin připravených podle schématu 25 je ukázána v tabulce 13.
Tabulka 13
Vzorek Výtěžek, g Výtěžek, % Čistota, % CMS
AV-0010 25,0 55 >90
AV-0020 42,0 52 >90
AV-0030 39,0 79 >90
AV-0040 49,0 86 >90
AV-0050 36,0 82 >90
AV-0060 43,0 88 >90
Přiklad 22
Série inhibitorů MIF se připravila podle následujících reakčních schémat. Zkratky pro reaktanty jsou následující: DCM = dichlormethan; DMA = dimethylacetamid; DMF = N-dimethylformamid; HOAc = kyselina octová; MeCN = acetonitril; DABCO = triethylendiamin; TEBAC = benzyltriethylamoniumchlorid; NMP = 1-methyl-2-pyrolidon; BOC = terc.BuOCO; ppa = kyselina polyfosforečná; TFA = kyselina trifluoroctová.
V/“* <Eoxana i bwKwn»* 3 i 1
h. ΠAldrich
Lahcaster
2000
K intenzívně míchanému roztoku kyseliny 2-amino-5-methylbenzoové (67,7 g, 0,45 molu) ve směsi 250 ml dioxanu a 150 ml toluenu se po kapkách přidal roztok difosgenu (96,7 g, 0,49 molu) v 80 ml dioxanu. Reakční směs se míchala 12 hodin a poté se sraženina odfiltrovala a promyla éterem. Filtrát a éterové frakce se spojily a rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku. Zbytek se rozetřel s hexanem a zbylá sraženina se zfiltrovala, promyla hexanem a vysušila přes noc při teplotě místnosti. Sloučenina 2000: výtěžek 66,5 g, (84 %), čistota 93 % (LCMS).
9·· 9 9999 9 999
9999 999 9999 9999
9 99 9999
9999 9 99 999 99 9
184
K míchanému roztoku NaH (18,9 g, 0,47 molu) v suchém DMA se po kapkách přidal ester kyseliny malonové. K výslednému roztoku se po částech přidal anhydrid kyseliny isatoové. Reakční směs se zahřívala na 130 až 150 °C po 10 hodin a poté se oddestilovaí DMA. Zbytek se rozetřel s vodou a okyselil na pH 3 požitím 10% HCI. Výsledná sraženina se odfiltrovala a promyla vodou. Pevný materiál se dal do 2I Erlenmeyerovy baňky, přidal se 1 I vody a pH se upravilo na 12 až 13 použitím K2CO3. Výsledný roztok se odfiltroval a filtrát se okyselil 10% HCI na pH 2 až 3. Sraženina se odfiltrovala, promyla éterem a krystalizovala z dioxanu. Sloučenina 2M00: výtěžek 23,3 g, (24 %), čistota 90 % (LCMS).
ΜΗ,ΟΑο
21400
2MOO<CI)
K suspenzi 2M00 (23,0 g, 0,093 molu) v toluenu (40 ml) se přidalo 71,3 g POCI3 (43 ml, 0,465 molu). Vzniklý roztok se zahříval pod refluxem 1,5 hodiny. Rozpouštědlo se oddestilovalo za sníženého tlaku a výsledný olej se postupně extrahoval heptanem (kontrola pomocí TLC). Spojené heptanové frakce se odpařily a zbytek se zahříval s 200 ml vody a zfiltroval. Po sušení při teplotě místnosti po 18 hod. se získaná dichlorová sloučenina převedla do 250 ml baňky s kulatým dnem a přidalo se 90 ml kyseliny octové a 8,0 g octanu amonného. Reakční směs se zahřívala pod refluxem po 2 hod. (kontrola LCMS a TLC). Když se nedal v reakční směsi detekovat žádný výchozí materiál, horký roztok se nalil do vody a vzniklá sraženina se zfiltrovala. Výtěžek a čistota sloučenin připravených podle uvedeného schématu je uveden v tabulce 14.
Tabulka 14
Sloučenina Výtěžek, g Výtěžek, % Čistota, % CMS
AV-1M00(CI) 50,00 70 >90
AV-2M00(CI) 10,96 44 >90
AV-3M00(CI) 30,00 70 >90
3M1O « ······ · · · • · · · · · · • · · · · · · · ··· ···· · · · · · · · ····
185
Metoda A: K roztoku 2M00 (1,0g, 3,77 mmol) v DMA se postupně přidával acylpiperazin (0,75 g, 4,16 mmol) a DABCO (0,84 g, 7.5 mmol). Reakční směs se míchala při 100 až 120 °C po 15 hodin. Reakce se zastavila 20% roztokem NH4CI a výsledná sraženina se odfiltrovala a promyla vodou. Produkt se vysušil v exsikátoru nad P2O5 při teplotě místnosti za sníženého tlaku. Produkt se použil v následující reakci bez dalšího čištění.
Metoda B: Směs chlorchinolonu 2M00 (1,0 g, 3,77 mmol), trifluoracetátu acylpiperazinu AV 0500 (1,55 g, 4,14 mmol) a DABCO (0,84 g, 7,5 mmol) ve 3 ml DMF se míchal při 101 °C přes noc, směs se nalila do 50 ml solanky, získaná pevná látka se odfiltrovala, promyla vodou a vysušila v exsikátoru za sníženého tlaku. Produkt se použil v další reakci bez jakéhokoliv čištění.
Výtěžky získaných sloučenin jsou ukázány v tabulce 15.
Tabulka 15
Sloučenina Metoda Výtěžek, g Výtěžek, % Čistota, % CMS
1M10 A 1,38 88 >90
1M20 A 1,47 90 >90
1M30 A 1,49 89 >90
1M40 A 1,67 95 >90
1M50 A 1,78 94 >90
1M60 A 1,58 91 >90
2M10 A 1,16 75 >90
2M20 A 1,22 76 >90
2M30 A 1,24 76 >90
2M40 A 1,34 78 >90
2M50 B 1,83 99 >90
2M60 A 1,31 78 >90
3M10 A 1,05 70 >90
3M20 A 1,21 78 >90
3M30 A 1,26 79 >90
3M40 A 1,41 85 >90
3M50 A 1,64 92 >90
3M60 A 1,28 78 >90
186
4444 44 4
4 4 4 4 · • 4·4· 4 4 4 4
4 444 44444
4 4 4 4 *
444 44 4
K suspenzi NaH (0,03 g, 0,8 mmol) v suchém DMF (1 ml) se přidala sloučenina 2M10 (0,30 g, 0,7 mmol). Po ukončení vývoje plynu se přidal benzylbromid (0,19g, 1,1 mmol). Reakční směs se míchala, dokud se nedaly detekovat ani stopy výchozího materiálu (kontrola LCMS). K reakci se přidal 20% roztok NH4CI a výsledná směs se extrahovala DCM. Sloučenina 2M12 se izolovala a a čistila preparativní HPLC (C-18 siiikagelová kolona, 150 mm x 41 mm, 40 ml/min., gradient: voda - acetonitril od 60 :40 do 5 „ 95, 20 min.. Sloučenina 2M12: výtěžek 114 mg (31 %), čistota > 99 % (HPLC).
Metoda A: K suspenzi NaH 0,03 g (0,8 mmol) v suchém DMF (2 ml) se přidala sloučenina 1M60 (300 mg, 0,7 mmol). Po ukončení vývinu plynu (~ 30 min.) se přidal roztok dimethylaminoethylchloridu (2,1 mmol) v éteru. Reakční směs se zahřívala na 100 °C (éter se odstranil destilací) po 12 hod.. Roztok se ochladil na teplotu místnosti a pH směsi se upravilo na pH 9 1 % roztokem AcOH ve vodě. Směs se extrahovala DCM (3x3 ml) a spojené frakce DCM se promyly solankou a vysušily přes MgSO4. DCM se odstranil na rotační odparce a produkt se vyčistil preparativní TLC (silikagel AnalTech GF, 1000 g, eluent CHCL: EtOH 4:1). Sloučenina 1M64: Výtěžek 84 mg (24 %), čistota > 99 % (HPLC).
Metoda Β: K suspenzi NaH 0,114 g (2,84 mmol, 60% disperze v minerálním oleji) ve 3 ml DMP se po částech přidal chinolon 2M50 (0,33 g, 0,676 mmol). Po ukončení • ·« · ··· · · · · · · · · · • 9999 99 9 999 9 9999
9 9 9 9 9 9 9
9999 9 99 999 99 9
187 vývoje plynu (~30 min) se směs míchal 30 min. při teplotě místnosti a přidal se hydrochlorid dimethylaminoethylchloridu 0,195 g, (1,35 mmol). Výsledná směs se zahřívala na 100 °C přes noc. Reakční směs se ochladila a nalila do vody (25 ml)a získaná pevná látka se odfiltrovala, promyla vodou a vysušila při 85 °C přes noc. Cílový izomer se izoloval preparativní TLC (silikagel AnalTech GF, 1500 g, eluent 10% triethylaminu v EtOAC, spodní skvrna).Sloučenina M54: výtěžek 68 mg (18 %).
K suspenzi NaH (0,03 g 0,8 mmol) v suchém DMF (2 ml) se přidala sloučenina 1M60 (300 mg, 0,7 mmol). Po ukončení vývinu plynu (~ 30 min.) se přidal roztok dimethylaminoethylchloridu (2,1 mmol) v éteru. Reakční směs se zahřívala na 100 °C (éter se odstranil destilací) po 12 hod.. Roztok se ochladil na teplotu místnosti a pH směsi se upravilo na pH 9 1 % roztokem AcOH ve vodě. Směs se extrahovala DCM (3x3 ml) a spojené frakce DCM se promyly solankou a vysušily přes MgSO4. DCM se odstranil na rotační odparce a produkt se vyčistil preparativní TLC (silikagel AnalTech GF, 1000 g, eluent CHCI3: EtOH 4:1). Sloučenina 1M64: Výtěžek 84 mg (24 %), čistota > 99 % (HPLC). Všechny následující sloučeniny se získaly pomocí podobné nebo stejné procedury: Sloučenina 1M34: výtěžek 77 mg, 22,00 %; sloučenina 1M54:výtěžek 58 mg,
16,88 %; sloučenina 1M64: výtěžek 84 mg, 24,00 %; sloučenina 2 M14, výtěžek 57 mg, 16,25%; sloučenina 2M34, výtěžek 63 mg, 17,95 %; a sloučenina 2M64, výtěžek 42 mg, 12,00%.
Reakční schéma 24
Sloučeniny 1 M15...3M65: Všechny sloučeniny vypsané níže se získaly použitím procedury popsané výše pro sloučeninu 1M64: Sloučenina 3M15:36 mg, 13 %; sloučenina 3M65,5mg, 1%; sloučenina 1M65:31 mg, 9 %; sloučenina 1M45,34 mg, 10 %; sloučenina 1M55,51 mg, 15 %; sloučenina 1M35,51 mg, 14 %; sloučenina 3M45,52 mg, 15 %; sloučenina3M25, 24 mg, 12 %; sloučenina 3M35, 71 mg, 12 %; sloučenina 3M35i, 16 mg, 4 %; sloučenina3M5i, 22mg, 8 %; sloučeninal M65i, 20 mg, 6 %; sloučenina 1M45i, 27 mg, 8 %; sloučenina 1M35i, 28 mg, 8 %; sloučenina 3M65 i, 23 mg, 6 %.
·» · ······ ·· · • ♦ · ♦ · · · · · • · · · 9 99· 9 9 9 9
9999 9 · · · · · φ ····
1M10...3M60
188
1M15L.3M6S <1β cmpde)
Reakčni schéma 25:
OI(Aldfleb) K(AMrtdi)
NaOH.
PPA .es
HHO3 o —*
M
K roztoku p-toluidinu (10 g, 93,3 mmol) a Et3N (13,6 ml) v DCM (100 ml) se po kapkách přidal chlorid monoethylmalonátu (17,72 ml) při 0 až 5 °C (lázeň voda s ledem). Po ukončení reakce (kontrola TLC) se reakční směs nalila do vody 300 ml) a pH se upravilo na 2 HCI (konc.).Organická vrstva se oddělila a vodná fáze se extrahovala DCM (3 x 50 ml). Spojené extrakty DCM se promyly solankou (50 ml) a vysušily přes síran sodný. DCM se odstranil na rotační odparce a zbytek se rozpustil ve směsi 600 ml MeOH a 400 ml 1N NaOH. Reakční směs se zahřívala pod refluxem 3 hod., ochladila na teplotu místnosti a okyselila 2N HCI na pH 2. MeOH se odstranil za sníženého tlaku a voda se extrahovala EtOAC (3 x 100 ml). Organická vrstva se promyla solankou, vysušila přes siran sodný a rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku. Ke zbytku se přidalo 40 d PPA a směs se míchala na magnetickém míchadle a zahřívala na 170 °C po 3 hodiny. Reakční směs se ochladila na teplotu místnosti a pomalu se zředila 500 ml 1N HCI. pH výsledného roztoku se se upravilo roztokem 20% NaOH ve vodě na pH 4. Vzniklá sraženina se odfiltrovala, promyla vodou a vysušila v exsikátoru nad NaOH přes noc. Výtěžek 05 byl 13,2 g (81 %.)
K roztoku 5-methyl-2,4-dihydroxychinolinu (13,2 g) v ledové kyselině octové (200 ml) se pomalu přidalo 25 ml HNO3 (63%). reakční směs se zahřívala na 90 °C 30 min., ochladila na teplotu místnosti a nalila do vody (700 ml). Vzniklá sraženina se • Φ « φ φ φ • φ ·♦ φφφφ
• φ • ΦΦΦ
189 odfiltrovala a promyla vodou. Vzniklá sloučenina se vysušila nad NaOH v exsikátoru přes noc. Výtěžek 06 byl 7,68 g (44 %).
K míchané suspenzi dihydroxychinolinu 01 (50 g) v ledové kyselině octové (600 ml) se přidalo 98 ml HNO3 (63%). Reakční směs se zahřívala na 90 °C po 30 min. a ochladila na teplotu místnosti. Vzniklá sraženina se odfiltrovala a promyla vodou (5 x 100 ml). Získaná sloučenina se vysušila nad P2O5 v exsikátoru přes noc. Výtěžek 1N00 byl
52,7 g(%).
Reakční schéma 26
K roztoku 5-chlorisatového anhydridu 3000 )15 g, 75,91 mmol) v DMF (75 ml) se přidal bezvodý uhličitan draselný (8,85 g) a jodmethan 14,46 g (114 mmol). Reakční směs se míchala při teplotě místnosti 18 hodin a nalila se do ledové vody. Sraženina se odfiltrovala, promyla vodou a vysušila nad P2O5 v exsikátoru přes noc. Sloučenina 3001: výtěžek 15,3 g (95 %), čistota > 90 % (LCMS). Sloučenina 3003: výtěžek 18,2 g (79 %), ·· · ·· ···· • · · · · · ··· ··· · ···· · · · · • ···· · · · · · · · ···· • · · · · · · · ···· · ·· ··· ·· ·
190 čistota > 90 % (LCMS). Všechny následující sloučeniny se získaly za použití podobné nebo stejné procedury: Sloučenina 3002:16,1 g, 74 % výtěžek, čistota > 90 % (LCMS); sloučenina 3003: výtěžek 18,2 g (79 %), čistota > 90 % (LCMS).
K míchanému roztoku ethylnitroacetátu 7,5 ml, 68 mmol) v 50 ml DMF se po částech přidal 2,85 g NaH. Když ustal vývoj vodíku, směs se zahřívala na 80 °C 15 min.. Roztok N-methylisatoového anhydridu 3001 (15 g, 71 mmol) v 60 ml DMF se přidával po dobu 15 min., po které se reakce zahřívala na 120 °C 18 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo destilací, zbytek se rozpustil ve vodě a okyselil N HCI na pH = 4. Sraženina se zfiltrovala, promyla vodou a vysušila v exsikátoru nad NaOH přes noc. Sloučenina 3N01: výtěžek 16,6 g (92 %), čistota > 90 % (LCMS). Sloučenina 3N03: výtěžek 18,5 g (89 %), čistota > 90 % (LCMS).
K roztoku chinolonu N00 (18,8 g, 78,1 mmol) a triethylbenzylamoniumchloridu 71 g, 312 mmol) v MeOH (290 ml) se přidal POCI3 (32 ml, 344 mmol).Směs se míchala • · ♦ ··»
0 ····
0000
0000 ► · 1 > · 4
0··
191 přes noc. Rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku, a zbytek se míchal ve vodě (290 ml) 3 hodiny. Vysrážená pevná látka se odfiltrovala, promyla vodou, vysušila, promyla horkým cyklohexanem, vysušila a dvakrát překrystalovala z THF/hexanu. Sloučenina 3N00(CI): výtěžek 5,59 g (28 %), čistota > 95 % LCMS).
Směs chlorchinolonu 3N00(CI) (0,30 g, 1,16 mmol), trifluoracetátu acylpiperazinu AV-0500 (0,45 g, 0,22 mmol) a DABCO 0,26 g, 2,32 mmol) ve 2 ml DMF se míchala přes noc. Poté se směs nalila do vody (15 ml), promyla vodou a vysušila nad P2O5 v exsikátoru přes noc. Produkt se použil v následující reakci bez jakéhokoliv dalšího čištění. Sloučenina 3N50: Výtěžek 0,50 g (90 %), čistota > 95 % (LCMS).
Výhodná provedení byla popsána ve spojení s jejich specifickými provedeními. Rozumí se, že je možné provádět další modifikace, a tento popis vynálezu spolu s nároky je schopen pokrýt jakékoliv varianty, použití nebo adaptace vynálezu, řídícími se ve všeobecnosti principy tohoto vynálezu a zahrnující včetně takových odchylek od předmětných závěrů, které přicházejí se znalostí běžných praktik ve stavu techniky, ke kterým vynález náleží, a je možno je aplikovat na podstatné rysy zde vysvětlené, které spadají do rámce vynálezu a jeho ekvivalentů. Všechny reference zde citované, včetně, ale ne tím omezeny na reference z technické literatury, udělené patenty a patentové přihlášky jsou zde zahrnuté jako odkazy v jejich úplnosti.
Průmyslová využitelnost
Sloučeniny, jichž se tento vynález týká, je možno průmyslově využít k výrobě léčiv k potlačováni nemocí a úpravě stavů, souvisejících s aktivitou MIF.

Claims (184)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Chinolinový derivát obecného vzorce (I) nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde:
    X je kyslík nebo síra;
    Y je vybráno ze skupiny, skládající se z NO, -NO2; -C(=O)R5; -C(=O)OR5; -C(=O)NR5R6; -NR5C(=O)R5; -NR5SO2R5; a -S(O)mR5,·
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2;
    n je 0,1 nebo 2, za podmínky, že když n je 0, Z je -C(=O)-;
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R'R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5. -OR5, -SR5 a -NRsRei
    Rt je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a Rs; Rsa Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou pňpojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, • · · · · • · · · · • · · · · • ······ · • · · · • · · · · · ♦
    193 substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a R8 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínek, že:
    R4 není vodík nebo methyl, jestliže R1 je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Yje -C(=O)OCH2CH3;
    R4 není methyl, jestliže R1 je methyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Y je
    -NO2;
    R4 není -CH2CH2OH, jestliže R1 je vodík nebo methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, Rs je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a
    R4 není methyl, jestliže Ri je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Yje -C(=O)OCH2CH3
  2. 2. Chinolinový derivát obecného vzorce (I) nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde:
    X je kyslík nebo síra;
    Y je vybráno ze skupiny, skládající se z NO, -NO2; -C(=O)R5; -C(=O)OR5; -C(=O)NR,RS; -NR5C(=O)R5; -NR5SO2R5; a -S(O)mR5;
    Z je -CH2-; m je 0,1 nebo 2; nje 1;
    R1 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, • · • ······ · ··· ····· * · ·· · · · · ·» · · · ····· · · ·
    194 dialkylu a R'R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5. -OR5, -SR5 a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a Rs; R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    R8 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínek, že:
    R4 není vodík nebo methyl, jestliže R1 je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Yje -C(=O)OCH2CH3;
    R4 není methyl, jestliže R1 je methyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Y je
    -NO2;
    R4 není -CH2CH2OH, jestliže R1 je vodík nebo methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, Rs je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a
    R4 není methyl, jestliže R1 je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3.
  3. 3. Chinolinový derivát podle nároku 2, kde X je kyslík.
  4. 4. Chinolinový derivát podle nároku 2, kde Y je -C(=O)OCH2CH3.
  5. 5. Chinolinový derivát podle nároku 2, kde Y je -NO2. s
  6. 6. Chinolinový derivát podle nároku 2, kde R4 je nebo
    O;
    » · 999999 9 9 9 • · ··· · · · • · · 9 9 9 9* 9 9 9 9 » 99·· 9 · · 99» « 99··
    195
  7. 7. Chinolinový derivát podle nároku 2, kde R4 je nebo
  8. 8. Chinolinový derivát obecného vzorce (I) nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde:
    X je kyslík nebo síra;
    Y je -C(=O)OCH2CH3;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2;
    n je 0,1 nebo 2, za podmínky, že když n je 0, Z je -C(=O)~;
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R’R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5. -ORS,
    -SR5 a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a R^; R5a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, • · · · ·
    196 substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a Rg je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínky, že:
    R4 není methyl, jestliže R1 je methyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Y je -NO2
  9. 9. Chinolinový derivát podle nároku 8, kde X je kyslík.
    lO.Chinolinový derivát podle nároku 8, kde Z je -CH2- a n je 1.
  10. 11 .Chinolinový derivát podle nároku 8, kde R4 je
  11. 12. Chínolinový derivát podle nároku 8, kde R, je
  12. 13. Chinolinový derivát obecného vzorce (I) nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde:
    X je kyslík nebo síra;
    Yje -NO2;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2;
    n je 0,1 nebo 2, za podmínky, že když n je 0, Z je -C(=O)-;
    R1 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu,
    X is oxygen or sulfur;
    Y is -C(=O)OCH2CH3;
    Zís-CH2- or-C(O)-; m is 0, 1, or 2;
    n is 0, 1, or 2, with the proviso that when n is 0, Z is -C(=O)-;
    Ri is selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, substituted alkyl, aryl, substituted aryl, arylalkyl, substituted arylalkyl, heterocycle, substituted heterocycle, heterocyclealkyl or substituted heterocyclealkyl, dialkyl, and R’R”N(CH2)X-, wherein x is 2 to 4, and wherein R’ and R” are independently selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, substituted alkyl, aryl, arylalkyl, substituted arylalkyl, heterocycle, substituted heterocycle, heterocyclealkyl, substituted heterocyclealkyl, and dialkyl;
    R2 and R3 are independently selected from the group consisting of halogen, —Rs, — OR5, — SR5, and —NRsRg;
    R4 is selected from the group consisting of -CH2R7, -C(=O)NR5R6, C(=O)OR7, -C(=O)R7, and R8;
    Rs and Ró are independently selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, substituted alkyl, aryl, substituted aryl, arylalkyl, substituted arylalkyl, heterocycle, substituted heterocycle, heterocyclealkyl, and substituted heterocyclealkyl; or R5 and Re taken together with a nitrogen atom to which they are attached form a heterocycle or substituted heterocycle;
    R7 is selected from the group consisting of alkyl, substituted alkyl, aryl, substituted aryl, arylalkyl, substituted arylalkyl, heterocycle, substituted heterocycle, heterocyclealkyl, and substituted heterocyclealkyl; and
    Rg is selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, substituted alkyl, aryl, substituted aryl, arylalkyl, substituted arylalkyl, heterocycle,. substituted heterocycle, heterocyclealkyl, and substituted heterocyclealkyl;
    with the provisos that:
    R4 is not hydrogen or methyl when Ri is phenyl, R2 and R3 are both hydrogen, and X is oxygen;
    R4 is not -CH2CH2OH when R] is hydrogen or methyl, R2 is 7chloro, R3 is hydrogen, and X is oxygen; and
    -6• ο φ • · φφ φφφφ φφ φ φ φ φ φ φφφ φφ «
    197 dialkylu a R'R“N(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5. -OR5, -SRs a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a Rs!
    R5a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    Re je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínek, že:
    R4 není vodík nebo methyl, jestliže Ri je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík;
    R4 není -CH2CH2OH, jestliže Rt je vodík nebo methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, Rs je vodík, X je kyslík; a
    R4 není methyl, jestliže Rt je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3.
  13. 14.Chinolinový derivát podle nároku 13, kde X je kyslík.
  14. 15.Chinolinový derivát podle nároku 13, kde Z je -CH2- a n je 1.
  15. 16.Chinolinový derivát podle nároku 13, kde R» je
  16. 17.Chinolinový derivát podle nároku 13, kde R4 je 0; / nebo0
    4 · 4 4 4 4 4
    198
  17. 18.Chinolinový derivát obecného vzorce (I) nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde: X je kyslík nebo síra;
    Y je vybráno ze skupiny, skládající se z NO, -NO2; -C(=O)R5; -C(=O)OR6;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2;
    n je 0,1 nebo 2, za podmínky, že když n je 0, Z je -C(=O)-;
    Ri je vybrán ze skupiny, skládajíc! se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklů, substituovaného heterocyklů, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R'R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklů, substituovaného heterocyklů, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, ~R5. -OR5, -SR5 a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z nebo
    R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklů, substituovaného heterocyklů, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus.
  18. 19. Chinolinový derivát podle nároku 18, kde X je kyslík.
    • 9 9
    9 ·
    99 9 • 9 9 9 9 9 9 • 999 9 «9 ·«· ·«
    199
  19. 20 .Chinolinový derivát podle nároku 18, kde Z je -CH2- a n je 1.
  20. 21 .Chinolinový derivát podle nároku 18, kde Y je -C(=O)OCH2CH3.
  21. 22.Chinolinový derivát podle nároku 18, kde Y je -NO2.
  22. 23.Chinolinový derivát obecného vzorce (I) nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde:
    X je kyslík nebo síra;
    Y je vybráno ze skupiny, skládajíc! se z NO, -NO2; -C(=O)R5; -C(=O)OR5; -C(=O)NR5R6; -NR5C(=O)R5; -NR5SO2R5; a -S(O)mR5;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2;
    n je 0,1 nebo 2, za podmínky, že když n je 0, Z je -C(=O)-;
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R'R“N(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládajíc! se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládajíc! se z halogenu, -R;>. -OR5, -SR5 a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z ; a • 4 4 4 4 • · 4 ··«·♦· 4 4 • · 4 · 4 4 4
    444 4 4444 4
    4 444444 4 44» • 4 44 4444 • 444 4 44 444 44 4
    200
    R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného ary,alkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkyiu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoři heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus.
  23. 24. Chinolinový derivát podle nároku 23, kde X je kyslík.
  24. 25. Chínolinový derivát podle nároku 23, kde Z je -CH2- a n je 1.
  25. 26. Chinolinový derivát podle nároku 23, kde Y je -C(=O)OCH2CH3.
  26. 27. Chinolinový derivát podle nároku 23, kde Y je -NO2.
  27. 28. Chinolinový derivát obecného vzorce (I) nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde:
    X je kyslík;
    Y je vybráno ze skupiny, skládající se z NO, -NO2; -C(=O)R5; -C(=O)OR5; -C(=O)NR(JR6; -NR5C(=O)R5; -NR5SO2Rs; a -S(O)mR5;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2;
    n je 0,1 nebo 2, za podmínky, že když n je 0, Z je -C(=O)-;
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R'R“N(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, • · · ··· ··· · · · • · · · · · · · · · · · • ···· · · · 9 · 9 · ···· • · · · ···· ···· · ·· «·· ·· ·
    201 skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5. -OR5, -SR5 a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a Rs;
    R5 a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    Rs je vybrán ze skupiny, skládající se z vodiku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínek, že:
    R4 není vodík nebo methyl, jestliže R1 je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Yje -C(=O)OCH2CH3;
    R4 není methyl, jestliže R1 je methyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Y je
    -NO2;
    R, není -CH2CH2OH, jestliže R1 je vodík nebo methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a
    R4 není methyl, jestliže R1 je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3
  28. 29. Chinolinový derivát podle nároku 28, kde Z je -CH2- a n je 1.
  29. 30. Chinolinový derivát podle nároku 28, kde Y je -C(=O)OCH2CH3.
  30. 31 .Chinolinový derivát podle nároku 28, kde Y je -NO2.
    lebo
  31. 32.Chinolinový derivát podle nároku 28, kde R4 je o;
    O;
    ·« ··* · ·· · ···· · ·
    202
  32. 33.Chinolinový derivát podle nároku 28, kde R4 je nebo
  33. 34.Chinolinový derivát podle nároku 26, jehož struktura je:
  34. 35.Chinolinový derivát podle nároku 27, jehož struktura je:
    o
    99 · 99 9999 ··
    9 9 9 9 9 9 9
    999 9 9999 9
    9 9999 99 9 999 • 9 99 9999 • 9 99 9 99999 99 9
    203
  35. 36.Chinolinový derivát podle nároku 27, jehož struktura je:
    • 9 • 99 • 9999
  36. 37.Chinolinový derivát podle nároku 27, jehož struktura je:
  37. 38.Chinolinový derivát podle nároku 26, jehož struktura je:
    0« ·
    00 ··♦· ♦ *
    204
  38. 39.Chinolinový derivát podle nároku 26, jehož struktura je:
    • 0 · · 0 0 0 0 • 0000 0 0 0 • · · 0
    0000 0 00 000
  39. 40.Chinolinový derivát podle nároku 27, jehož struktura je:
  40. 41 .Chínolinový derivát podle nároku 26, jehož struktura je:
    //
    F' ·· · ·· ····
    205
  41. 42.Chinolinový derivát podle nároku 27, jehož struktura je:
  42. 43.Chinolinový derivát podle nároku 26, jehož struktura je:
  43. 44.Chinolinový derivát podle nároku 26, jehož struktura je:
    Cl
    O CH,
    O
    206
  44. 45,Chinolinový derivát podle nároku 21, jehož struktura je:
    ·· · ·· ···· ·· · ·«· ··· ··· ··· · · · · · · ··· * ···· · · · · · · · ··· • · ·· ···· ···· · ·· ··· ·· ·
  45. 46.Chinolinový derivát podle nároku 27, jehož struktura je:
  46. 47.Chinolinový derivát podle nároku 27, jehož struktura je:
    207
  47. 48.Chinolinový derivát podle nároku 27, jehož struktura je:
    ·* · ·· ···· 99 9
    9 9 9 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9 999 9 9 9 9
    9 9999 99 9 999 9 9999
    9 9 9 9 9 9 9 9
    9999 9 99 999 99 «
  48. 49.Chinolinový derivát podle nároku 26, jehož struktura je:
  49. 50.Chinolinový derivát podle nároku 27, jehož struktura je:
    Cl.
    ·· ·
    9 ·
    208
  50. 51 .Chinolinový derivát podle nároku 26, jehož struktura je:
    9 9 9
    9 9 9
    9 9999
    9 9
    9999 9 ·· ···· * 9 • 999 ·· * • 9 9 • 9 9 · • · · 9·99
    9 9 9
    99 9
  51. 52.Chinolinový derivát podle nároku 21, jehož struktura je:
  52. 53.Chinolinový derivát podle nároku 26, jehož struktura je:
    • 9 9
    9 9
    9 9 9 9
    209
  53. 54.Chinolinový derivát podle nároku 26, jehož struktura je:
    *9*9 · *
  54. 55.Chinolinový derivát podle nároku 26, jehož struktura je:
  55. 56.Chinolinový derivát podle nároku 21, jehož struktura je:
    • · • · • · · ·
    210
  56. 57.Chinolinový derivát podle nároku 26, jehož struktura je:
  57. 58. Farmaceutická kompozice obsahující chinolinový derivát podle nároku 1 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.
  58. 59. Způsob redukce aktivity MIF v pacientovi v případě potřeby, skládající se z podání pacientovi efektivního množství chinolinového derivátu majícího strukturu (I):
    nebo jeho stereoizomeru, prekurzoru, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelné soli, kde: X je kyslík nebo síra;
    Y je vybráno ze skupiny, skládající se z NO, -NO2; -C(=O)R5; -C(=O)OR5; -C^OJNRsRe; -NR5C(=O)R5; -NR5SO2R5; a -S(O)mR5;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2;
    n je 0,1 nebo 2, ža podmínky, že když n je 0, Z je -C(-O)-;
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, ·· · · · · · · · • · · · · · • · · · · · ··· • · · · · · · · · · • · · · · ♦ ····· · · ·
    211 dialkylu a R'R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkýlu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykioalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -Rs, -OR5, -SR5 a -NR5Re;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a R8; R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládajíc! se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    R8 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínek, že:
    R4 není vodík nebo methyl, jestliže Ri je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3;
    R4 není methyl, jestliže Ri je methyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Y je
    -NO2;
    Rt není -CH2CH2OH, jestliže Ri je vodík nebo methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, Rs je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a
    R4 není methyl, jestliže Ri je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3
  59. 60.Způsob léčení zánětu v teplokrevném zvířeti, obsahující podání efektivního množství chinolinového derivátu podle nároku 1 zvířeti.
  60. 61 .Způsob léčení septického šoku v teplokrevném zvířeti, obsahující podání efektivního množství chinolinového derivátu podle nároku 1 zvířeti.
  61. 62.Způsob léčení artritidy v teplokrevném zvířeti, obsahující podání efektivního množství • · • · · ·
    212 chinolinového derivátu podle nároku 1 zvířeti.
  62. 63. Způsob léčení rakoviny v teplokrevném zvířeti, obsahující podání efektivního množství chinolinového derivátu podle nároku 1 zvířeti.
  63. 64. Způsob léčení akutního respiračního syndromu v teplokrevném zvířeti, obsahující podání efektivního množství chinolinového derivátu podle nároku 1 zvířeti.
  64. 65. Způsob léčení zánětlivého onemocnění v teplokrevném zvířeti, obsahující podání efektivního množství chinolinového derivátu podle nároku 1 zvířeti.
  65. 66. Způsob léčení podle nároku 65, kde zánětlivé onemocnění je vybráno ze skupiny, skládající se z reumatické artritidy, osteoartritidy, zánětlivého onemocnění střev a astmatu.
  66. 67. Způsob léčení autoimunitního v teplokrevném zvířeti, obsahující podání efektivního množství chinolinového derivátu podle nároku 1 zvířeti.
  67. 68. Způsob léčení podle nároku 67, kde autoimunitní onemocnění je vybráno ze skupiny, skládající se z diabetů, astmatu a sklerózy multiplex.
  68. 69. Způsob potlačení imunitní odpovědi v teplokrevném zvířeti, obsahující podání efektivního množství chinolinového derivátu nároku 1 zvířeti.
  69. 70. Způsob snížení angiogeneze v teplokrevném zvířeti, obsahující podání efektivního množství chinolinového derivátu podle nároku 1 zvířeti.
  70. 71. Způsob léčení nemoci spojené s nadměrnou hladinou glukokortikoidů v teplokrevném zvířeti, obsahující podání efektivního množství chinolinového derivátu podle nároku 1 zvířeti.
  71. 72. Způsob léčení podle nároku 71, kde nemocí je Cushingova choroba.
  72. 73. Způsob detekce činidla, které moduluje aktivitu MIF, skládající se z kroků: - kontaktuje se vzorek obsahující MIF s činidlem; a
    213
    - detekuje se schopnost činidla modulovat MIF určením rozdílu schopnosti protilátky vázat MIF.
  73. 74. Způsob určení podle nároku 73, kde protilátka je monoklonální protilátka.
  74. 75. Způsob určení podle nároku 73, kde MIF zahrnuje fúzní proteiny, mutanty nebo jeho varianty.
  75. 76. Způsob použití navázáni protilátky jako zástupného značkovače pro určování činidla, které moduluje aktivitu polypeptidu, skládající se z kroků:
    - polypeptid se kontaktuje s domnělým modulačním činidlem;
    - polypeptid se kontaktuje s monoklonální protilátkou; a
    - detekuje se rozdílová aktivita polypeptidu ve vztahu ke kontrole.
  76. 77. Chinolinový derivát obecného vzorce (II) nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde:
    X je kyslík nebo síra;
    Y je vybráno ze skupiny, skládající se z NO, -NO2; -C(=O)R5; -C(=O)OR5; -C(=O)NR5RS; -NR5C(=O)R5; -NR5SO2R5; a -S(O)mR5;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2;
    n je 0,1 nebo 2, za podmínky, že když n je 0, Z je -C(=O)-;
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R'R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R’ a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, • · • ·
    214 skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -Rs. -OR5, -SR5 a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a Rg;
    R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a Rg brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    Rg je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínek, že:
    R4 není vodík nebo methyl, jestliže R1 je feny,, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Yje -C(=O)OCH2CH3;
    R4 není methyl, jestliže R1 je methyl, R2 a Rs jsou oba vodík, X je kyslík a Y je
    -NO2;
    R4 není -CH2CH2OH, jestliže R: je vodík nebo methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, Rs je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a
    R4 není methyl, jestliže R1 je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3
  77. 78.Chinolinový derivát obecného vzorce (II)
    215 nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde:
    X je kyslík nebo síra;
    Y je vybráno ze skupiny, skládající se z NO, -NO2; -C(=O)R5; -C(=O)ORS; -C(=O)NR5R6; -NR5C(=O)R5; -NR5SO2R5; a -S(O)mR5;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2; nje 1;
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R'R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5, -OR5, -SRs a -NRsRe;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a Rs;
    R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    Rs je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínek, že:
    R4 není vodík nebo methyl, jestliže R1 je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Yje -C(=O)OCH2CH3;
    R4 není methyl, jestliže Ri je methyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Y je
    -NO2;
    Ri není -CH2CH2OH, jestliže R1 je vodík nebo methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a • · ····
    216
    R4 není methyl, jestliže R: je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodik, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3
  78. 79. Chinolinový derivát podle nároku 78, kde Ri je -NCH2CH2CH2N(CH3)2.
  79. 80. Chinolinový derivát podle nároku 78, kde X je kyslík.
  80. 81 .Chinolinový derivát podle nároku 78, kde Y je -C(=O)OCH2CH3.
  81. 82.Chinolinový derivát podle nároku 78, kde Y je -NO2.
  82. 83.Chinolinový derivát podle nároku 78, kde R4 je
  83. 84.Chinolinový derivát podle nároku 78, kde R4 je
  84. 85.Chinolinový derivát obecného vzorce (II) nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde: X je kyslík nebo síra;
    Yje je -C(=O)OCH2CH3;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2; nje 1;
    Ri je vybrán ze skupiny, skládajíc! se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, • · · · · ·
    217 arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného aryialkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R'R“N(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5 -OR5, -SR5 a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7l -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a R8;
    R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a Rs brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    R8 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínek, že:
    R4 není vodík nebo methyl, jestliže Fó je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Yje -C(=O)OCH2CH3;
    R4 není -CH2CH2OH, jestliže Ri je vodík nebo methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík a X je kyslík; a
    R4 není methyl, jestliže Ri je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík a X je kyslík
  85. 86. Chinolinový derivát podle nároku 85, kde X je kyslík.
  86. 87. Chinolinový derivát podle nároku 85, kde Z je -CH2- a n je 1.
  87. 88.Chinolinový derivát podle nároku 85, kde R4 je o; « · • · • ·« • · · • · · • · · · · • · ···· ·
    218
  88. 89.Chinolinový derivát podle nároku 85, kde R4 jeo
  89. 90.Chinolinový derivát obecného vzorce (II) nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde:
    X je kyslík nebo síra;
    Y je vybráno ze skupiny, skládající se z NO, -NO2; ~C(=O)RS; -C(=O)OR5; -C(=O)NR5R6; -NR5C(=O)R5; -NR5SO2R5; a -S(O)mR5;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2;
    n je 0,1 nebo 2, za podmínky, že když n je O, Z je -C(=O)-;
    Ri je -NCH2CH2CH2N(CH3)2;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -Rs. -OR5, -SRg a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a Re;
    R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    R8 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu,
    219 substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu.
  90. 91 .Chinolinový derivát podle nároku 90, kde Z je -CH2- a n je 1.
  91. 92. Chinolinový derivát podle nároku 90, kde Y je -C(=O)OCH2CH3.
  92. 93. Chinolinový derivát podle nároku 90, kde Y je -NO2.
  93. 94.Chinolinový derivát podle nároku 90, kde R» je
  94. 95.Chinolinový derivát podle nároku 90, kde R4 je
  95. 96.Chinolinový derivát obecného vzorce (II) nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde:
    X je kyslík nebo síra;
    Yje -NO2;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2;
    n je 0,1 nebo 2, za podmínky, že když n je 0, Z je -C(=O)-;
    R, je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, ♦ ·
    4 4 4 4 4 • 4 ·
    4444
    220 dialkylu a R'R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklů, substituovaného heterocyklů, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5 -OR5, -SR5 a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5RS, -C(=O)OR7 a R8;
    R5a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklů, substituovaného heterocyklů, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklů, substituovaného heterocyklů, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    R8 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklů, substituovaného heterocyklů, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínky, že:
    R4 není methyl, jestliže R1 je methyl, R2 a R3 jsou oba vodík a X je kyslík.
  96. 97. Chinolinový derivát podle nároku 96, kde R1 je -NCH2CH2CH2N(CH3)2.
  97. 98. Chinolinový derivát podle nároku 96, kde X je kyslík.
  98. 99. Chinolinový derivát podle nároku 96, kde Z je -CH2~ a n je 1.
    lOO.Chinolinový derivát podle nároku 96, kde R4 je \/\/neb0
  99. 101 .Chinolinový derivát podle nároku 96, kde R4 je • · · · · · • · · • · ·♦· • · » ·· · • · · • · · • ···· · • · ···· · ·· ···
    221
  100. 102.Chinolinový derivát obecného vzorce (II) nebo jeho stereoizomer, prekurzor, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl, kde:
    X je kyslík nebo síra;
    Y je vybráno ze skupiny, skládající se z NO, -NO2; -C(=O)R5; -C(=O)OR5; -C(=O)NR5R6; -NR5C(=O)R5; -NR5SO2R5; a -S(O)mR5;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2;
    n je 0,1 nebo 2, za podmínky, že když n je 0, Z je -C(=O)-;
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R'R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R’ a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5. -OR5, -SR5 a -NR5R6;
    R.j je vybrán ze ski a °
    R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    • 4 4 · 4 4
    4 4 4 444
    44 · • ·
    4 4 4
    4 4···
    222
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkyiu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    R8 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu.
  101. 103. Chinolinový derivát podle nároku 67, kde Ri je -NCH2CH2CH2N(CH3)2.
  102. 104. Chinolinový derivát podle nároku 2, kde X je kyslík.
  103. 105. Chinolinový derivát podle nároku 8, kde Z je -CH2- a n je 1.
  104. 106. Chinolinový derivát podle nároku 67, kde Y je -C(=O)OCH2CH3.
  105. 107. Chinolinový derivát podle nároku 2, kde Y je -NO2.
  106. 108. Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
    • * · • · · • · · · • · ·»·
    9t ···· >··· · ·
    223
  107. 109.Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
    1 lO.Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
  108. 111 .Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
    φ φ
    Φ Φ I
    Φ ΦΦ«
  109. 112.Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
    φφ φ φ φ φφφ φ φφφφ φ · . Α * * φ ·· φφφφ • φ • φφφ φ φ φ φ » φφφ
    224
  110. 114.Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
    225
  111. 115.Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
  112. 116.Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
  113. 117.Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
    • · * · · · • · ·
    226
  114. 118.Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
  115. 119.Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
  116. 120.Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
    • ·
    227
  117. 121 .Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
  118. 122.Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
  119. 123.Chinolinový derivát podle nároku 92, jehož struktura je:
    228
  120. 124.Chinolinový derivát podle nároku 93, jehož struktura je:
    00 0 0
  121. 125.Chinolinový derivát podle nároku 107, jehož struktura je:
  122. 126.Způsob snížení aktivity MIF v pacientovi v případě potřeby, obsahující podání pacientovi efektivního množství chinolinového derivátu obecného vzorce (II):
    • · · · · ·
    229 nebo jeho stereoizomeru, prekurzoru, nebo jeho farmaceuticky akceptovatelné soli, kde:
    X je kyslík nebo síra;
    Y je vybráno ze skupiny, skládající se z NO, -NO2; -C(=O)R5; -C(=O)OR5; -C(=O)NR5R6; -NR5C(=O)R5; -NR5SO2R5; a -S(O)mR5;
    Z je -CH2- nebo -C(=O)-; m je 0,1 nebo 2;
    n je 0, 1 nebo 2, za podmínky, že když n je 0, Z je -C(=O)-;
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R'RN(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5, -OR5, -SRs a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O) NRsRe, -C(=O)OR7 a R8;
    R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    R8 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínek, že:
    R4 není vodík nebo methyl, jestliže R1 je fenyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3;
    R4 není methyl, jestliže Rt je methyl, R2 a R3 jsou oba vodík, X je kyslík a Y je
    -NO2;
    Rí není -CH2CH2OH, jestliže Rt je vodík nebo methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3; a
    230
    R4 není methyl, jestliže Ri je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor, R3 je vodík, X je kyslík a Y je -C(=O)OCH2CH3.
  123. 127. Způsob léčení zánětu v teplokrevném zvířeti, obsahující podání zvířeti efektivní množství sloučeniny podle nároku 77.
  124. 128. Způsob léčení septického šoku v teplokrevném zvířeti, obsahující podání zvířeti efektivní množství sloučeniny podle nároku 77.
  125. 129. Způsob léčení artritidy v teplokrevném zvířeti, obsahující podání zvířeti efektivní množství sloučeniny podle nároku 77.
  126. 130. Způsob léčení rakoviny v teplokrevném zvířeti, obsahující podání zvířeti efektivní množství sloučeniny podle nároku 77.
  127. 131 .Způsob léčeni akutního respiračního syndromu v teplokrevném zvířeti, obsahující podání zvířeti efektivní množství sloučeniny podle nároku 77.
  128. 132. Způsob léčení zánětlivého onemocnění v teplokrevném zvířeti, obsahující podání zvířeti efektivní množství sloučeniny podle nároku 77.
  129. 133. Způsob léčení podle nároku 132, kde zánětlivé onemocnění je vybráno ze skupiny, skládající se z reumatické artritidy, osteroartritidy, zánětlivého onemocnění střev a astmatu.
  130. 134. Způsob léčení autoimunitního onemocnění v teplokrevném zvířeti, obsahující podáni zvířeti efektivní množství sloučeniny podle nároku 77.
  131. 135. Způsob léčení podle nároku 134, kde autoimunitní onemocnění je vybráno ze skupiny, skládající se z diabetů, astmatu a sklerózy multiplex.
  132. 136. Způsob potlačení imunitní odpovědi v teplokrevném zvířeti, obsahující podání zvířeti efektivní množství sloučeniny podle nároku 77.
  133. 137.Způsob snížení angiogeneze v teplokrevném zvířeti, obsahující podání zvířeti efektivní ·· · ► · · • · · *····
    231 množství sloučeniny podle nároku 77.
  134. 138.Způsob léčení onemocnění, spojených s nadměrnou hladinou glukokortikoidů, v teplokrevném zvířeti, obsahujíc! podání zvířeti efektivní množství sloučeniny podle nároku 77.
  135. 139.Způsob léčení podle nároku 138, kde onemocnění je Cushingova choroba.
  136. 140.Způsob přípravy sloučeniny vzorce (IV), obsahující kroky, kdy: - se zreaguje sloučenina vzorce (III) (vzorec lil) se sloučeninou obecného vzorce (IV)
    S/7
    -N.
    (vzorec IV)
    N za vzniku sloučeniny obecného vzorce (V) (vzorec V) kde R? je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykioalkylu a substituovaného heterocykloaikylu; a ·· · • ·
    232 sloučenina obecného vzorce (V) se zreaguje se sloučeninou obsahující X-Rb kde X je vybrán ze skupiny, skládající se z Cl, Br a I, a kde R: je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a aminoalkylu R'R“N(CH2)x-, kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu, kde x je 2 až 4, čímž se získá sloučenina obecného vzorce (VI):
    ck r7
    Ví kde sloučenina obecného vzorce (VI) je vhodná pro použití jako inhibitor MIF.
  137. 141. Způsob přípravy podle nároku 140, kde sloučenina obecného vzorce (VI) je:
    ·♦ ···· ·· · • ·
    233
  138. 142. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce (AIV), obsahující kroky, kdy se zreaguje sloučenina vzorce (Al):
    se sloučeninou obecného vzorce (IV):
    (vzorec IV) za vzniku sloučeniny obecného vzorce Alll:
    kde R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a sloučenina obecného vzorce (Alll) se zreaguje se sloučeninou obsahující X-Rb kde X je vybrán ze skupiny, skládající se z Cl, Br a I, a kde Ri je vybrán ze skupiny, skládajíc! se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a aminoalkylu R'R“N (CH2)x-, kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu, kde x je 2 až 4, čímž se získá sloučenina obecného vzorce (AIV):
    99 9 • 9 9 • 9 9 • 9999 • 9
    9999 9
    9 9 9 999
    99 «
    9 9 9 • <99 • 9 9999 • 9 9
    99 ·
    234
    Ri
  139. 143. Způsob přípravy sloučeniny (IVa), obsahující kroky, kdy se zreaguje sloučenina obecného vzorce (la):
    (vzorec la) se sloučeninou obecného vzorce (Ha):
    R4 .N.
    (vzorec Ha) za vzniku sloučeniny obecného vzorce (lila):
    ·· ···· ·· .
    ’ · · · . .
    .· · · · ·...
    • ···· · · , * * · .
    ’··· · ·· ···' ·· · • . · • · ...
    • · · · ...· ··
    235 (vzorec lila) a zreagováním sloučeniny obecného vzorce (lila) se sloučeninou obsahující X-Ri, čímž vznikne sloučenina obecného vzorce (IVa):
    R4 přičemž sloučenina obecného vzorce (IVa) je vhodná pro použití jako inhibitor MIF, a kde:
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5. -OR5, -SR5 a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a Re;
    R5a Re jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    19 · • ·
    236
    R? je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    Rs je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    X je vybrán ze skupiny, skládající se z I, Br a I; a
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R'RN(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    za podmínek, že:
    R4 není vodík nebo methyl, jestliže Rt je fenyl a R2 a R3 jsou oba vodík;
    R4 není -CH2CH2OH, jestliže Rt je vodík nebo methyl, R2 je 7-chlor a R3 je vodík; a
    Rt není methyl, jestliže Rt je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor a R3 je vodík.
  140. 144.Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
    • ···
    237
  141. 145.Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
  142. 146.Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
  143. 147.Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
    F * · • · · • · « · • · · * • · · · · ·
    238
  144. 148.Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
  145. 149 .Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
  146. 150.Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
    F • · • · • · · • · · • · » · ·
    239
  147. 151 .Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
  148. 152.Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
  149. 153.Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
    o • · * • · · · ·
    240
  150. 154.Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
    • · · · · * • · · « · · ♦ ···· · ·· · • 4 ·»· · · · · · • · · · · * ····· ·· 4
  151. 155.Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
  152. 156.Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
    • · · ·
    241
  153. 157.Způsob přípravy podle nároku 143, kde sloučenina obecného vzorce (IVa) je:
  154. 158.Způsob přípravy sloučeniny vzorce (AVIa) obsahujíc! kroky, kdy se zreaguje sloučenina obecného vzorce (Ala):
    se sloučeninou obecného vzorce (Ha):
    R4 (vzorec Ha) • 9 • 9 9 ► ·9·Ι 9 • ·
    242 za vzniku sloučeniny obecného vzorce^Allla):
    R
    N
    O a sloučenina obecného Vzorce (Allla) se zreaguje se sloučeninou obsahující X-Rb čímž vznikne sloučenina vzorce (AlVa):
    Ri kde sloučenina vzorce (AlVa) je vhodné pro použití jako inhibitor MIF, a kde:
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R,RN(CH2)x-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5 -OR5, -SR5 a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládajíc! se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a Re!
    • · • · ·
    243
    R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládajíc! se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    R8 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínky, že R4 není methyl, jestliže Ri je methyl a R2 a R3 jsou oba vodík.
  155. 159.Způsob přípravy podle nároku 158, kde sloučenina obecného vzorce (AlVa) je:
    N
    I ch3 ·· 9
    244
  156. 160.Způsob přípravy podle nároku 158, kde sloučenina obecného vzorce (AlVa) je:
  157. 161 .Způsob přípravy podle nároku 158, kde sloučenina obecného vzorce (AlVa) je:
  158. 162.Způsob přípravy podle nároku 158, kde sloučenina obecného vzorce (AlVa) je:
    F ·· ·· ·
    245
  159. 163.Způsob přípravy podle nároku 158, kde sloučenina obecného vzorce (AlVa) je:
  160. 164.Způsob přípravy podle nároku 158, kde sloučenina obecného vzorce (AlVa) je:
  161. 165.Způsob přípravy podle nároku 158, kde sloučenina obecného vzorce (AlVa) je:
    I φφ * • φ φφφ φφφφφ φ φφφ φφφ φφ *
  162. 166.Způsob přípravy podle nároku 158, kde sloučenina obecného vzorce (AlVa) je:
    246 φφφφ φ «φφφ φφ φφφ · e φφφ φ Φ φφ· φφφφ φφ φ··
  163. 167.Způsob přípravy podle nároku 158, kde sloučenina obecného vzorce (AlVa) je:
  164. 168.Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce (IVb), obsahující kroky, kde se zreaguje sloučenina vzorce (III):
    (vzorec lil)
    4 · 4
    4 4
    4 4 4 » · 4 4 4
    44 4444
    4 « 4 4 · 4
    4 4444 4 444
    4 4 4»· 44444
    247 se sloučeninou obecného vzorce (IV):
    (vzorec IV) za vzniku sloučeniny obecného vzorce (V)
    CK .Ry kde R, je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a sloučenina obecného vzorce (V) se zreaguje se sloučeninou obsahující X-Ri, kde X je vybrán ze skupiny, skládající se z Cl, Br a I a kde Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a aminoalkylu R'R“N(CH2)x-, kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu, kde x je 2 až 4, čímž vznikne sloučenina obecného vzorce (IVb):
    «· «
    O.
    248 .N.
    Rv ·· ···« • · · · ♦ · ·>· · · · · · • ·«»·«· · 1
    9 · · · ·· · *> « · · ··» • · 9 • « · • · · · • · ·· · • · · ♦ » · (vzorec IVb) 'N' kde sloučenina obecného vzorce (IVb) je vhodná pro použití jako inhibitor MIF.
  165. 169.Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce (AlVb) obsahující kroky, kde se zreaguje sloučenina vzorce (Al):
    se sloučeninou obecného vzorce (IV):
    N (vzorec IV) za vzniku sloučeniny obecného vzorce (Alll):
    I · • ·
    9 9 9
    9 99 99 ·»··
    249 • · ··· 9 ♦ * • · · · kde R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a sloučenina obecného vzorce (Alll) se zreaguje se sloučeninou obsahující X-Ri, kde X je vybrán ze skupiny, skládající se z Cl, Br a I, a kde je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a aminoalkylu R'R“N(CH2)x-, kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu, kde x je 2 až 4, čímž vznikne sloučenina obecného vzorce (AlVb):
    O
    0· *
    0 0 ·
    0 0 0
    0 0 0 0 0
    0 0 0
    0 0000
    0 ·
    00 0000 0 0 0 0 « 0 0 0 0 0
    0 0 0 0 0
    0 0 0 ·
    0 0 0 0 0
    250 kde sloučenina obecného vzorce (AlVb) je vhodná pro použití jako inhibitor MIF.
  166. 170.Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce (IVab), obsahující kroky, kde se zreaguje sloučenina vzorce (Ia):
    se sloučeninou obecného vzorce (lla):
    n.
    ] (vzorec lla) za vzniku sloučeniny obecného vzorce (lila):
    R4 a sloučenina obecného vzorce (lila) se zreaguje se sloučeninou obsahující X-Ri, čímž vznikne sloučenina obecného vzorce (IVab):
    »· ♦ « · • · · ♦ · · • · · • ·<·♦ ♦ 1 ιι · · i ♦ ···
    251 kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je vhodná pro použití jako inhibitor MIF, a kde R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5. -OR5, -SR5 a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR? a R8;
    R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R, je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    R8 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    X je vybrán ze skupiny, skládající se z Cl, Br a I; a
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R'R“N(CH2)X~, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    za podmínek, že:
    44 4
    4 4 4
    4 4 4 « 4444 4
    4 ♦ • 4 4 4- · •4 4444
    4 ·4 • 4··· • 4 ·
    4 4 4 • 4 4 4 4 • 4 4
    4 4 4
    4 4 4 · • 4 4444
    4 4 4 ♦ 4 ·
    252
    R4 není vodík nebo methyl, jestliže Ri je fenyl a R2 a R3 jsou oba vodík;
    R4 není -CH2CH2OH, jestliže Ri je vodík nebo methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor a R3 je vodík; a
    R4 není methyl, jestliže Ri je methyl, R2 je vodík nebo 7-chlor a R3 je vodík.
  167. 171 .Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
  168. 172.Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
    44 4
    4 4 4
    4 4 4 4
    4 4 4444
    4 4 4 • 4 4
    4« · • · 4 • · 4
    4 4444
    4 4
    4444 4
    253
  169. 174.Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
  170. 175.Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
    -N-ch H.C ^3 φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφφ φ φ • Φ φφ φ • φ φ φ φ φ φ • φ φ φφφφ φ φ φ
    ΦΦ 9
    254
  171. 176.Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
    • Φ φφ*φ φ · φ φ φφφφ φ φ φ · φ φ φ φ* ·Φ·
  172. 177.Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
  173. 178.Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
    9 9 9
    9 9 9 9
    9 ·♦···
    9 9 ·
    99 9
    255
  174. 179.Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
    ·· ···* ·* · • 9 · · · · • · · · ···· • ···· * · · ♦ 9 · ·
    9999 9 99 999
  175. 180.Způsob přípravy podfe nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
  176. 181 .Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
    256
  177. 182.Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
    ·· · • · · • · · • ···· • · ·· · * * ► · · · « • · • ··· • · • · · • ···· • ·
  178. 183.Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
  179. 184.Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
  180. 185.Způsob přípravy podle nároku 170, kde sloučenina obecného vzorce (IVab) je:
    99 * «· 9999 ·· 9
    9 9 9 9 9 9 · 9 9
    9 9 9 9 9 99* 9 * 9 *
    9 9999 ♦ 9 9 999· ····
    9 * ·· 9999
    9*99 9 99 *99 99 9
    257
  181. 186.Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce (AlVab), obsahující kroky, kde se zreaguje sloučenina vzorce (Ala):
    (vzorec Ala) se sloučeninou obecného vzorce (Ha):
    R4 (vzorec Ha)
    99 9
    9 9 9
    9 * 9 9 * *··«·
    9 9 9
    99 9 t9 9
    99 9999
    9 9 9 9 9 9
    999 9 9999
    9 ···· 9 · ♦ · · • 9 · · · ···· 9 99 999
    258 za vzniku sloučeniny obecného vzorce (Allla):
    R4 sloučenina obecného vzorce (Allla) se zreaguje se sloučeninou obsahující X-Ri, čímž vznikne sloučenina obecného vzorce (AlVab):
    R4 kde sloučenina obecného vzorce (AlVab) je vhodná pro použití jako inhibitor MIF, a kde:
    Ri je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu nebo substituovaného heterocykloalkylu, dialkylu a R'R“N(CH2)X-, kde x je 2 až 4, a kde R' a R“ jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu, substituovaného heterocykloalkylu a dialkylu;
    R2 a R3 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z halogenu, -R5. -OR5, -SR5 a -NR5R6;
    R4 je vybrán ze skupiny, skládající se z -CH2R7, -C(=O)NR5R6, -C(=O)OR7 a R8;
    φφ φ
    I Φ Φ » φφφ » φ Φ·Φ« φφ · » φ φ φφφ φ φφφφ •Φ φφφφ • φ • φφφ
    259
    R5a R6 jsou nezávisle vybrány ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; nebo R5 a R8 brané společně s dusíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří heterocyklus nebo substituovaný heterocyklus;
    R7 je vybrán ze skupiny, skládající se z alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu; a
    R8 je vybrán ze skupiny, skládající se z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heterocyklu, substituovaného heterocyklu, heterocykloalkylu a substituovaného heterocykloalkylu;
    za podmínky, že R-. není methyl, jestliže Ri je methyl a R2 a R3 jsou oba vodík.
  182. 187.Způsob přípravy podle nároku 186, kde sloučenina obecného vzorce (AlVab) je:
  183. 188.Způsob přípravy podle nároku 186, kde sloučenina obecného vzorce (AlVab) je:
    • 9 ·
    9 9
    9 · ·
    9 999
    9 · • 9 9999 • · • ··· • 9 ·
    9 9 9
    9 9 9
    9 9999 9
    9 9
    9999 9
    260
  184. 189.Způsob přípravy podle nároku 186, kde sloučenina obecného vzorce (AlVab) je:
CZ20033503A 2001-05-24 2002-05-24 Inhibitory faktoru inhibice migrace makrofágů a metoda jejich identifikace CZ20033503A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29364201P 2001-05-24 2001-05-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20033503A3 true CZ20033503A3 (cs) 2004-08-18

Family

ID=23129922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20033503A CZ20033503A3 (cs) 2001-05-24 2002-05-24 Inhibitory faktoru inhibice migrace makrofágů a metoda jejich identifikace

Country Status (24)

Country Link
US (14) US7105519B2 (cs)
EP (1) EP1389110B1 (cs)
JP (1) JP4346312B2 (cs)
KR (1) KR100896973B1 (cs)
CN (1) CN1523989A (cs)
AR (1) AR036032A1 (cs)
AT (1) ATE461920T1 (cs)
AU (2) AU2002303906B2 (cs)
BR (1) BR0209948A (cs)
CA (1) CA2447103A1 (cs)
CZ (1) CZ20033503A3 (cs)
DE (1) DE60235750D1 (cs)
ES (1) ES2342877T3 (cs)
HU (1) HUP0500101A3 (cs)
IL (1) IL158550A0 (cs)
MX (1) MXJL03000038A (cs)
MY (1) MY140679A (cs)
NZ (1) NZ529244A (cs)
PL (1) PL367127A1 (cs)
PT (1) PT1389110E (cs)
RU (1) RU2327695C2 (cs)
UY (1) UY27304A1 (cs)
WO (1) WO2002094203A2 (cs)
ZA (1) ZA200309738B (cs)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2352228T3 (es) 2001-03-29 2011-02-16 Cytokine Pharmasciences, Inc. Procedimiento y composiciones para usar el polipéptido de cadena invariante de mhc de clase ii como receptor para el factor inhibidor de la migración de macrófagos.
UY27304A1 (es) * 2001-05-24 2002-12-31 Avanir Pharmaceuticals Inhibidores del factor inhibidor de la migración de los macrófagos y métodos para su identificación
US20030195192A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-16 Fortuna Haviv Nicotinamides having antiangiogenic activity
US20040014744A1 (en) * 2002-04-05 2004-01-22 Fortuna Haviv Substituted pyridines having antiangiogenic activity
AU2003235122A1 (en) 2002-04-26 2003-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Cell death inhibitor
AU2003247772A1 (en) * 2002-06-27 2004-01-19 Schering Aktiengesellschaft Substituted quinoline ccr5 receptor antagonists
TW200418829A (en) 2003-02-14 2004-10-01 Avanir Pharmaceutics Inhibitors of macrophage migration inhibitory factor and methods for identifying the same
TWI328009B (en) 2003-05-21 2010-08-01 Glaxo Group Ltd Quinoline derivatives as phosphodiesterase inhibitors
GB0316915D0 (en) 2003-07-18 2003-08-20 Glaxo Group Ltd Compounds
US7364869B2 (en) * 2003-07-29 2008-04-29 The J. David Gladstone Institutes Method of detecting antigen-specific T lymphocytes
CN1839133A (zh) * 2003-08-22 2006-09-27 阿文尼尔药品公司 作为巨噬细胞移动抑制因子的抑制剂的取代的二氮杂萘衍生物及其在治疗人类疾病中的应用
US7592466B2 (en) 2003-10-09 2009-09-22 Abbott Laboratories Ureas having antiangiogenic activity
AU2011265309B2 (en) * 2003-11-21 2014-06-05 Array Biopharma, Inc. AKT protein kinase inhibitors
CN1882347A (zh) 2003-11-21 2006-12-20 阿雷生物药品公司 Akt蛋白激酶抑制剂
AU2005228426B2 (en) * 2004-03-29 2010-07-15 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Treatment of type 1 diabetes with inhibitors of macrophage migration inhibitory factor
DE102004029573A1 (de) * 2004-06-18 2005-12-29 Gambro Lundia Ab MIF-Adsorbent
WO2006031199A1 (en) * 2004-09-17 2006-03-23 Alex Poh Teck Choong System and method for batch conversion of rfid tag to rfid label
WO2006102191A1 (en) * 2005-03-24 2006-09-28 Avanir Pharmaceuticals Thienopyridinone derivatives as macrophage migration inhibitory factor inhibitors
DK1928438T3 (da) * 2005-09-26 2013-04-22 Avigen Inc Anvendelse af ibudilast til behandling af stofafhængighed
GB0605689D0 (en) * 2006-03-21 2006-05-03 Novartis Ag Organic compounds
WO2007112036A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 The Feinstein Institute For Medical Research Modified macrophage migration inhibitory factor inhibitors
CN100457895C (zh) * 2006-05-24 2009-02-04 中国科学院生物物理研究所 鼠抗人巨噬细胞迁移抑制因子单克隆抗体及其应用
US7622256B2 (en) * 2006-05-31 2009-11-24 Avigen, Inc. Method for selecting compounds that modulate MIF-induced expression of ICAM-1 and/or VCAM-1
WO2007142923A1 (en) * 2006-05-31 2007-12-13 Avigen, Inc. Mif inhibitors for treating neuropathic pain and associated syndromes
US7845914B2 (en) * 2007-02-15 2010-12-07 Deere & Company Self-priming fast fill sprayer pump system
US9272034B2 (en) * 2007-10-04 2016-03-01 The Regents Of The University Of California Treatment of conditions related to shock
US9643922B2 (en) * 2008-08-18 2017-05-09 Yale University MIF modulators
US9540322B2 (en) 2008-08-18 2017-01-10 Yale University MIF modulators
EP2198879A1 (en) 2008-12-11 2010-06-23 Institut Curie CD74 modulator agent for regulating dendritic cell migration and device for studying the motility capacity of a cell
WO2012009649A1 (en) * 2010-07-16 2012-01-19 Anderson Gaweco Mif inhibitors and their uses
WO2012031383A1 (zh) 2010-09-06 2012-03-15 中国科学院广州生物医药与健康研究院 酰胺类化合物
EP2621521A4 (en) 2010-10-02 2014-04-23 Univ California MINIMAL REDUCTION OF INTESTINAL DYSFUNCTION
WO2013050453A1 (en) 2011-10-07 2013-04-11 Baxter Healthcare S.A. Oxmif as a diagnostic marker
KR20130118612A (ko) * 2012-04-20 2013-10-30 (주)네오믹스 신규한 아미노피리딘 유도체 및 이의 용도
CA3095012C (en) 2012-05-01 2023-02-07 Translatum Medicus Inc. Methods for treating and diagnosing blinding eye diseases
WO2014200872A1 (en) 2013-06-09 2014-12-18 Rjs Biologics Llc Pharmaceutical compounds targeted by mif affinity-tethered moieties
US11397182B2 (en) 2014-10-07 2022-07-26 Cornell University Methods for prognosing and preventing metastatic liver disease
EP3327004B1 (en) * 2015-07-17 2020-11-04 Fujifilm Corporation Nitrogen-containing heterocyclic compound
CN111518076B (zh) * 2018-01-17 2021-06-01 杭州阿诺生物医药科技有限公司 具有吲哚胺-2,3-双加氧酶(ido)抑制剂的制备方法
JP2021521173A (ja) 2018-04-11 2021-08-26 オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション 眼内薬物送達用の持続放出微粒子のための方法及び組成物
DK3774817T3 (da) 2018-04-13 2023-02-13 Cancer Research Tech Ltd Bcl6-hæmmere
DK3814348T3 (da) 2018-06-27 2023-10-30 Bristol Myers Squibb Co Substituerede naphthyridinonforbindelser, der er anvendelige som t-celleaktivatorer
EA202190137A1 (ru) 2018-06-27 2021-05-17 Бристол-Маерс Сквибб Компани Нафтиридиноновые соединения для применения в качестве активаторов t-клеток
AR119821A1 (es) 2019-08-28 2022-01-12 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de piridopirimidinonilo sustituidos útiles como activadores de células t
AR120823A1 (es) 2019-12-23 2022-03-23 Bristol Myers Squibb Co Compuestos bicíclicos sustituidos útiles como activadores de células t
CN113121435B (zh) * 2021-04-20 2022-08-30 辽宁大学 一种2,4-二氯喹啉类化合物的合成方法

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4324893A (en) 1979-04-18 1982-04-13 American Home Products Corporation 4-Amino-3-carboxy or cyano-1,2-dihydro-2-oxo-1,8-naphthyridine derivatives
US4299814A (en) 1979-05-25 1981-11-10 Monsanto Company Radioimmunoassay of MIF
US4284768A (en) * 1980-07-02 1981-08-18 American Home Products Corporation 1,2-Dihydro-4-amino-2-oxo-3-quinoline-carboxylic acid derivatives
NZ211191A (en) 1984-02-22 1988-01-08 Wellcome Found Cloning of dna for protozoal antigens
US5733524A (en) 1984-03-19 1998-03-31 The Picower Institute For Medical Research Methods and materials for the diagnosis and treatment of conditions such as stroke
US5869534A (en) 1992-05-21 1999-02-09 The Picower Institute For Medical Research Glycosylation of lipids and lipid-containing particles, and diagnostic and therapeutic methods and materials derived therefrom
US5733933A (en) 1984-03-19 1998-03-31 The Picower Institute For Medical Research Methods and materials for the diagnosis and treatment of conditions such as stroke
US5801200A (en) 1984-03-19 1998-09-01 The Picower Institute For Medical Research Methods and materials for the diagnosis and treatment of conditions such as stroke
US5700447A (en) 1992-05-21 1997-12-23 The Picowder Institute For Medical Research Methods and materials for the diagnosis and treatment of conditions such as stroke
AU592753B2 (en) 1984-05-24 1990-01-25 Ciba-Geigy Ag Lymphokine in pure foem, novel monoclonal antibodies hybridoma cell lines, processes and applications
JPH0672158B2 (ja) 1984-05-24 1994-09-14 チバ−ガイギ− アクチエンゲゼルシヤフト 精製されたヒトマクロファージ遊走阻止因子
US4708937A (en) 1984-10-15 1987-11-24 Brigham & Women's Hospital Purified migration inhibitory factor also having colony stimulating factor activity
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB8602626D0 (en) 1986-02-04 1986-03-12 Ciba Geigy Ag Neurite-promoting factor
ES2052602T3 (es) 1986-10-03 1994-07-16 Ciba Geigy Ag Nuevos peptidos afines a las linfocinas.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0463037A1 (en) 1989-03-17 1992-01-02 Genetics Institute, Inc. Human macrophage migration inhibitory factor
FI82144C (fi) 1989-03-22 1991-01-10 Wallac Oy Foerfarande foer samtidig bestaemning av flera ligander.
GB8915414D0 (en) 1989-07-05 1989-08-23 Ciba Geigy Novel cytokines
KR0166088B1 (ko) 1990-01-23 1999-01-15 . 수용해도가 증가된 시클로덱스트린 유도체 및 이의 용도
US5328990A (en) 1991-04-26 1994-07-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Isolation of macrophage migration inhibition factor from ocular lens
CA2054602C (en) 1991-10-31 2003-04-22 Anthony Pawson Method for assaying for a substance that affects an sh2-phosphorylated ligand regulatory system
US5624804A (en) 1991-12-20 1997-04-29 The Rockefeller University Immunochemical detection of In vivo advanced glycosylation end products
EP0702566B1 (en) 1993-05-17 2010-07-21 Cytokine Pharmasciences, Inc Inhibition of migration inhibitory factor in the treatment of diseases involving cytokine-mediated toxicity
US6030615A (en) 1993-05-17 2000-02-29 The Picower Institute For Medical Research Combination method for treating diseases caused by cytokine-mediated toxicity
US6774227B1 (en) 1993-05-17 2004-08-10 Cytokine Pharmasciences, Inc. Therapeutic uses of factors which inhibit or neutralize MIF activity
US5650295A (en) 1995-06-02 1997-07-22 Human Genone Sciences, Inc. Macrophage migration inhibitory factor-3
US6080408A (en) 1994-08-22 2000-06-27 Connaught Laboratories Limited Human immunodeficiency virus type 1 nucleic acids devoid of long terminal repeats capable of encoding for non-infectious, immunogenic, retrovirus-like particles
SI9400363A (en) 1994-09-19 1996-08-31 Mozetic Francky Bojana Human macrophage migration inhibitory factor of nonlymphoid origin, expression of mif in e. coli and purification of recombinant protein
US5955203A (en) 1994-10-05 1999-09-21 Simpson Timber Company Resin-coated overlays for solid substrates
AU4365796A (en) 1994-11-16 1996-06-06 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Methods for inhibiting cell proliferation by inhibiting the mitogenic activity of macrophage migration inhibitory factor
DE19601697A1 (de) 1996-01-18 1997-07-24 Wacker Chemie Gmbh Redispergierbare Tackifierpulver
US6492428B1 (en) 2000-07-26 2002-12-10 The Picower Institute For Medical Research Compounds having MIF antagonist activity
US6420188B1 (en) 1996-02-16 2002-07-16 The Picower Institute For Medical Research Screening assay for the identification of inhibitors for macrophage migration inhibitory factor
US6599938B1 (en) * 1999-10-29 2003-07-29 The Picower Institute Of Medical Research Compounds having MIF antagonist activity
AU727108B2 (en) 1996-04-18 2000-11-30 Ariad Pharmaceuticals, Inc. In vitro fluorescence polarization assay
US5883224A (en) 1996-04-19 1999-03-16 Cytokine Sciences, Inc. Characterization of transfer factors and methods of use
US5919815A (en) * 1996-05-22 1999-07-06 Neuromedica, Inc. Taxane compounds and compositions
JPH1171351A (ja) * 1997-08-29 1999-03-16 Ss Pharmaceut Co Ltd 置換キノロン誘導体及びこれを含有する医薬
US6413939B1 (en) 1997-10-31 2002-07-02 The Picower Institute For Medical Research Inducible phosphofructokinase and the Warburg effect
WO2000007007A1 (en) 1998-07-28 2000-02-10 Biometric Imaging, Inc. Device and method for cell motility assay
ES2353637T3 (es) * 1998-08-07 2011-03-03 Immunex Corporation Moléculas denominadas ldcam.
US6214343B1 (en) 1999-05-24 2001-04-10 Ophidian Pharmaceuticals, Inc. Prevention and treatment of necrotizing enterocolitis
CA2434671A1 (en) 2001-01-12 2002-09-06 The Picower Institute For Medical Research Methods and compositions for modulating regulation of the cytotoxic lymphocyte response by macrophage migration inhibitory factor
ES2352228T3 (es) 2001-03-29 2011-02-16 Cytokine Pharmasciences, Inc. Procedimiento y composiciones para usar el polipéptido de cadena invariante de mhc de clase ii como receptor para el factor inhibidor de la migración de macrófagos.
UY27304A1 (es) 2001-05-24 2002-12-31 Avanir Pharmaceuticals Inhibidores del factor inhibidor de la migración de los macrófagos y métodos para su identificación
CA2459224C (en) 2001-09-03 2012-05-08 Takeda Chemical Industries, Ltd. 1,3-benzothiazinone derivatives and the use thereof
FR2829491B1 (fr) 2001-09-12 2005-09-30 Diverchim Procede de preparation des hydroxy-acides gras insatures et de leurs esters, leur utilisation comme agent anti-collagenase
AU2002365941A1 (en) 2001-12-05 2003-09-02 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Methods of diagnosis, monitoring and treatment of fertility
US20040019921A1 (en) 2001-12-19 2004-01-29 Fingerle-Rowson Gunter R. Non-human mammal with disrupted or modified MIF gene, and uses thereof
AU2003235122A1 (en) 2002-04-26 2003-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Cell death inhibitor
NZ537301A (en) 2002-06-07 2006-06-30 Cortical Pty Ltd Therapeutic molecules and methods-1
US20060106102A1 (en) 2002-06-07 2006-05-18 Eric Morand Napththalene derivatives which inhibit the cytokine or biological activity of microphage migration inhibitory factor (mif)
CA2497971A1 (en) 2002-09-18 2004-04-01 Pfizer Products Inc. Triazole derivatives as transforming growth factor (tgf) inhibitors
WO2004060881A1 (ja) 2002-12-05 2004-07-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited １，３−ベンゾチアジノン誘導体、その製造法および用途
TW200418829A (en) 2003-02-14 2004-10-01 Avanir Pharmaceutics Inhibitors of macrophage migration inhibitory factor and methods for identifying the same
US7361474B2 (en) 2003-02-24 2008-04-22 United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Serum macrophage migration inhibitory factor (MIF) as marker for prostate cancer
CN1839133A (zh) 2003-08-22 2006-09-27 阿文尼尔药品公司 作为巨噬细胞移动抑制因子的抑制剂的取代的二氮杂萘衍生物及其在治疗人类疾病中的应用
WO2006102191A1 (en) 2005-03-24 2006-09-28 Avanir Pharmaceuticals Thienopyridinone derivatives as macrophage migration inhibitory factor inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
US7435737B2 (en) 2008-10-14
PT1389110E (pt) 2010-07-01
RU2327695C2 (ru) 2008-06-27
US20050282236A1 (en) 2005-12-22
ES2342877T3 (es) 2010-07-16
US7514225B2 (en) 2009-04-07
HUP0500101A2 (hu) 2005-05-30
US20060194792A1 (en) 2006-08-31
US20050287617A1 (en) 2005-12-29
CN1523989A (zh) 2004-08-25
JP4346312B2 (ja) 2009-10-21
MY140679A (en) 2010-01-15
ZA200309738B (en) 2004-10-04
ATE461920T1 (de) 2010-04-15
US7192955B2 (en) 2007-03-20
PL367127A1 (en) 2005-02-21
US7235565B2 (en) 2007-06-26
US20030195194A1 (en) 2003-10-16
AR036032A1 (es) 2004-08-04
EP1389110A4 (en) 2004-10-20
US7230106B2 (en) 2007-06-12
US20060194793A1 (en) 2006-08-31
BR0209948A (pt) 2004-12-21
US7084141B2 (en) 2006-08-01
US20070197547A1 (en) 2007-08-23
JP2005500266A (ja) 2005-01-06
US20060199827A1 (en) 2006-09-07
US7192961B2 (en) 2007-03-20
KR100896973B1 (ko) 2009-05-14
US20070232613A1 (en) 2007-10-04
US7238809B2 (en) 2007-07-03
US7129236B2 (en) 2006-10-31
WO2002094203A2 (en) 2002-11-28
KR20040041095A (ko) 2004-05-13
AU2007201493A1 (en) 2007-04-26
US20060199825A1 (en) 2006-09-07
US7202248B2 (en) 2007-04-10
US20070021440A1 (en) 2007-01-25
US20060205734A1 (en) 2006-09-14
US7105519B2 (en) 2006-09-12
RU2003132534A (ru) 2005-04-20
EP1389110A2 (en) 2004-02-18
US20060235023A1 (en) 2006-10-19
US7732146B2 (en) 2010-06-08
US7157469B2 (en) 2007-01-02
NZ529244A (en) 2006-04-28
HUP0500101A3 (en) 2009-09-28
DE60235750D1 (de) 2010-05-06
US7432374B2 (en) 2008-10-07
AU2002303906B2 (en) 2007-06-28
UY27304A1 (es) 2002-12-31
US20060194818A1 (en) 2006-08-31
WO2002094203A3 (en) 2003-04-10
IL158550A0 (en) 2004-05-12
CA2447103A1 (en) 2002-11-28
EP1389110B1 (en) 2010-03-24
MXJL03000038A (es) 2004-12-03
US20060094727A1 (en) 2006-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20033503A3 (cs) Inhibitory faktoru inhibice migrace makrofágů a metoda jejich identifikace
US7312220B2 (en) Inhibitors of macrophage migration inhibitory factor and methods for identifying the same
AU2002303906A1 (en) Inhibitors of macrophage migration inhibitory factor and methods for identifying the same
AU2007201494B2 (en) Inhibitors of macrophage migration inhibitory factor and methods for identifying the same