ES2336444T3 - Obtencion y empleo de ginotecas de anticuerpos humanos ("bancos de anticuerpos humanos"). - Google Patents

Obtencion y empleo de ginotecas de anticuerpos humanos ("bancos de anticuerpos humanos"). Download PDF

Info

Publication number
ES2336444T3
ES2336444T3 ES04008412T ES04008412T ES2336444T3 ES 2336444 T3 ES2336444 T3 ES 2336444T3 ES 04008412 T ES04008412 T ES 04008412T ES 04008412 T ES04008412 T ES 04008412T ES 2336444 T3 ES2336444 T3 ES 2336444T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
antibody
dna
cdna
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES04008412T
Other languages
English (en)
Inventor
Melvyn Prof. Dr. Little
Frank Dr. Breitling
Thomas Dr. Seehaus
Stefan Prof. Dr. Dubel
Iris Klewinghaus
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Original Assignee
Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25889602&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2336444(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DE4002898A external-priority patent/DE4002898A1/de
Priority claimed from DE4003881A external-priority patent/DE4003881A1/de
Application filed by Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Siemens Healthcare Diagnostics Inc filed Critical Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2336444T3 publication Critical patent/ES2336444T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Procedimiento para la obtención de bibliotecas de anticuerpos humanos; caracterizado porque se aísla el ARNm a partir de linfocitos B humanos periféricos, no activados y se transcribe en el ADNc, a continuación se amplifica el ADNc, que codifica anticuerpos, por medio de una reacción en cadena de polimerasa RCP con ayuda de cebadores adecuados, llevándose a cabo a continuación una incorporación en plásmidos de expresión adecuados y a continuación se lleva a cabo la expresión del anticuerpo-ADNc en clones individuales, caracterizado porque la maqueta de los cebadores para la reacción inversa para la síntesis de la hebra, no codificante, del ADN de la cadena pesada está basada en secuencias de IgM y porque se posibilita, por medio del empleo de diversos cebadores para la síntesis de la hebra, no codificante, la obtención de un tipo de anticuerpo, que está constituido por los dominios variables y por los primeros dominios constantes.

Description

Obtención y empleo de genotecas de anticuerpos humanos ("bancos de anticuerpos humanos").
La invención se refiere a la obtención y al empleo de genotecas de anticuerpos humanos (AK). A partir de una mezcla de linfocitos B humanos se traduce su ARNm en ADNc mediante el empleo de oligo-dT-cebadores. A continuación tiene lugar una amplificación de los ADNc específicos de los AK mediante una reacción en cadena de polimerasa (RCP, Polymerase Chain Reaction) con utilización de secuencias cebadoras de oligonucleótidos adecuadas. Por medio de la expresión de estos ADNc amplificados, específicos de los AK, en un vector de expresión bacteriano, por ejemplo en un vector pFMT, que se describe a continuación, en E. coli, está disponible, por lo tanto, una biblioteca de anticuerpos humanos con un amplio repertorio para llevar a cabo la exploración ("screenen") con antígenos seleccionados
in vitro.
Se estima que el sistema inmune de los seres humanos, o bien de los mamíferos, tiene entre 10^{6} y 10^{8} anticuerpos diferentes. Este número de anticuerpos es suficiente para generar una reacción inmune del cuerpo tanto contra todos los antígenos que existen en la naturaleza así como, también, contra los antígenos sintéticos. Si se tiene en consideración así mismo que con frecuencia varios anticuerpos reaccionan con el mismo antígeno, se establece el repertorio de los anticuerpos realmente diferentes más bien en el intervalo comprendido entre 10^{6} y 10^{7}.
Hasta el presente han sido obtenidos los anticuerpos específicos siempre a partir de una inmunización con el antígeno correspondiente, por ejemplo por medio de una inyección del antígeno en el organismo o por medio de una incubación de células del bazo in vitro con estos antígenos. En el caso de los anticuerpos policlonales pueden aislarse a continuación las inmunoglobulinas a partir del suero y a partir de las mismas pueden obtenerse los anticuerpos específicos por ejemplo por medio de procedimientos de absorción. Los anticuerpos monoclonales son aislados a partir de los sobrenadantes celulares o bien a partir del lisado celular de las células tumorales del bazo (células de hibridoma) clonadas, fusionadas con linfocitos B individuales. Los procedimientos que han sido citados precedentemente no son adecuados, de manera especial, para la obtención de anticuerpos humanos específicos o bien de anticuerpos monoclonales humanos.
La presente invención se plantea por consiguiente la tarea de desarrollar un método accesible en general para la generación de anticuerpos monoclonales humanos específicos (huMAK's) o de fragmentos de anticuerpos, que contengan los puntos de enlace con el antígeno.
Se ha encontrado que los huMAK's buscados o sus fragmentos, que contienen los dominios variables, que se enlazan con los antígenos, pueden ser aislados a partir de genotecas de inmunoglobulina humana. En primer lugar se partió de una mezcla de linfocitos B humanos no activados cuyo ARNm es aislado y es traducido en ADNc con ayuda de oligo-dT-cebadores. Una amplificación específica de la población de anticuerpos ADNc dentro del conjunto de ADNc obtenido se consiguió por medio de la utilización de la RCP. Con esta finalidad se emplearon determinados oligonucleótido-"cebadores", que son homólogos con respecto a las secuencias conservadas sobre ambos extremos del anticuerpo-ADNc (véase más adelante y los ejemplos). La maqueta del cebador para la reacción inversa para la síntesis de la hebra no codificante del ADN de la cadena pesada está basada en secuencias IgM (subclase III, puesto que ésta abarca la mayoría de las secuencias IgM). Las moléculas IgM están presentes en los linfocitos B no activados con mayor frecuencia que todas las otras clases de inmunoglobulinas. Las secuencias de IgG son preponderantes, por el contrario, en los linfocitos B activados, cuyo repertorio de anticuerpos diferentes es mucho menor. En el caso de una biblioteca IgG existiría por otra parte el peligro de que dominase en la biblioteca un IgG expresado de forma especialmente intensa o un número reducido de los mismos.
Se llevaron a cabo, de manera conveniente, hasta 30 episodios de amplificación. Los oligonucleótidos-"cebadores" contienen puntos de restricción adecuados con objeto de insertar el ADN amplificado por ejemplo en el plásmido de expresión del anticuerpo pFMT (véase más adelante). Este plásmido de expresión posibilita la expresión de anticuerpos-ADNc y a continuación la secreción de los productos de expresión en bacterias (E. coli). El anticuerpo-operón del plásmido contiene las secuencias de los fragmentos variables tanto de las cadenas pesadas así como, también, de las cadenas ligeras de un anticuerpo. Las secuencias "conductoras" adecuadas procedentes del fragmento aminoterminal de una proteína bacteriana posibilitan la secreción de los fragmentos de anticuerpo. Las secuencias "conductoras" son escindidas durante la secreción por un enzima bacteriano. Durante la secreción de los productos anticuerpos-ADNc se asocian las cadenas ligeras y las cadenas pesadas del anticuerpo (con o sin dominios constantes limítrofes). De este modo, se forma un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que contiene un punto funcional de enlace con el antígeno. De la misma manera, han sido descritos por otros autores constructos similares para anticuerpos individuales (Better et al. (1988), Science 240, 1041, y Skerras & Plückthun (1988), Science 240,1038).
La amplificación del ADN, que codifica fragmentos variables de anticuerpos, ha sido descrita ciertamente por otros autores (Orlandi et al. (1989), Proc. Nati. Acad. Sci. 86, 3833; Sastry et al., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. 86, 5728; Ward et al. (1989), Nature 341, 544); Huse et al. (1989), Science 246, 275). Sin embargo se aisló en este caso el ARNm, que codifica entre otras cosas también anticuerpos, a partir de células de hibridoma o de linfocitos del bazo después del tratamiento con un antígeno determinado. Por consiguiente se emplearán en aquél caso también secuencias cebadoras que únicamente están basadas en secuencias IgG. Naturalmente en aquél caso es ventajoso para buscar el mayor número posible de clones de anticuerpo-ADN, que procedan de linfocitos activados. Con cebadores procedentes de secuencias IgG son mucho mayores las probabilidades de encontrar clones, que contengan ADN codificadores de anticuerpos contra el antígeno inyectado. Así mismo debe añadirse que en los trabajos existentes han sido sintetizados anticuerpos-ADN murinos y, por consiguiente no humanos y que han sido amplificados además con exclusión de las regiones de la cadena lambda.
En la presente invención son utilizadas, por el contrario, secuencias cebadoras que son homologas con respecto a las secuencias de los dominios constantes del IgM-ADNc. De este modo la invención puede ser realizada del mejor modo posible, es decir que puede ponerse a disposición una gran variedad de anticuerpos, concretamente todo el repertorio de anticuerpos, en forma de una biblioteca. La expresión preferentemente en E. coli proporciona entonces la biblioteca de anticuerpos humanos buscada, en la que se encuentran los anticuerpos humanos buscados o bien los fragmentos de los anticuerpos mediante exploración de los clones bacterianos con el antígeno elegido.
En la tabla 1 se han reunido oligonucleótidos cebadores adecuados para llevar a cabo la amplificación. Las posiciones de los cebadores, precedentemente citados, sobre las cadenas \mu, kappa y lambda se han representado esquemáticamente en la tabla 2. En los ejemplos siguientes se han descrito las construcciones biológicas moleculares en detalle, entre las cuales también se encuentra el vector de expresión, es decir el plásmido de expresión del anticuerpo pFMT. La invención se refiere, por consiguiente, a bibliotecas de anticuerpos humanos preparadas mediante transcripción del ARNm a partir de linfáticos B humanos no activados (periféricos) por medio de oligo-dT-ceb adores, seguido de una amplificación por medio de una RCP con utilización de secuencias, que contienen cebadores, homologas con respecto a las regiones conservadas de IgM-ADNc y a continuación incorporación en un plásmido de expresión adecuado para llevar a cabo la expresión en microorganismos, preferentemente en el vector de expresión pFMT para llevar a cabo la expresión en E. coli. En una forma preferente de realización se incorpora, además, una secuencia, que codifica un péptido marcador, por ejemplo una secuencia "TAG" de tal manera que los productos de la expresión pueden ser detectados de manera sencilla con anticuerpos monoclonales establecidos frente al péptido marcador (Wehland et al., (1984), EMBO J. 3,1295).
De igual modo, la invención abarca el empleo de las bibliotecas de anticuerpos humanos precedentes para llevar a cabo el aislamiento de los anticuerpos humanos buscados o bien de fragmentos de anticuerpos con puntos funcionales para el enlace de antígenos mediante exploración "screenen" con antígenos seleccionados y así mismo abarca procedimientos para llevar a cabo el aislamiento de los anticuerpos humanos citados o sus fragmentos que se enlazan con los antígenos así como también abarca procedimientos para la obtención de las citadas bibliotecas de anticuerpos humanos.
La invención abarca, así mismo, vectores de expresión con las propiedades del plásmido de expresión del anticuerpo pFMT.
Los ejemplos siguientes desarrollan adicionalmente la invención sin limitarla. Por último la invención está contenida en las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos Ejemplo 1 Obtención de un vector de expresión de anticuerpos
Se eligió el plásmido pKK233-2 (Amann und Brosius, (1985) Gene 40, 183 y Straus und Gilbert, (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. 82, 2014) como vector básico para la formación del vector de expresión de anticuerpos (figura 1).
Como paso previo a la incorporación del anticuerpo-operón se cortó el plásmido con SalI y BamHI, se rellenaron los extremos con polimerasa Klenow y se ligaron. De este modo se eliminaron estos dos puntos de restricción y el ADN situado entremedias. Por otra parte se segmentó el plásmido con HindIII, se rellenaron los extremos con la polimerasa Klenow y se ligó con enlazadores BamHI. Por medio de esta operación se eliminó el punto de restricción HindIII y se insertó un punto BamHI. En este plásmido modificado se insertó el anticuerpo ADN. En la figura 3 se muestra una vía de construcción esquemática del anticuerpo-operón que codifica un anticuerpo ARNm bicistrónico. Con objeto de posibilitar la secreción del anticuerpo se utilizó la secuencia "conductora" del enzima bacteriano pectatliasa. La secuencia "conductora" de este enzima ha sido ya empleada para la expresión y para la secreción de un anticuerpo ratón-humano quimérico (Fab-Fragment, Better et al., en el lugar indicado) así como el fragmento variable de un anticuerpo "humanizado" (Ward et al., en el lugar indicado; Huse et al., en el lugar indicado). Se sintetizaron a partir de varios oligonucleótidos (tabla 4) el ADN para la primera secuencia "conductora" (P_{1} por delante de la cadena pesada) y la secuencia para un segundo punto de enlace de ribosomas (RBS) y una segunda secuencia "conductora" (P_{2} por delante de la cadena ligera).
Han sido obtenidos por Dr. G. Winter (Cambridge, UK) anticuerpos ADNc, que codifican las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo humano (HuVhlys o bien HuVllys; Riechmann et al., (1988) J. Mol. Biol. 203, 825). Se insertaron los puntos de restricción HindIII (HuVhlys) y EcoRV (HuVllys) con objeto de posibilitar la inserción del anticuerpo ADNc en el vector de expresión. Se introdujeron otros puntos de restricción para Bañil (HuVhlys) y BstEII y respectivamente KpnI (HuVllys), con objeto de intercambiar "en bloque" regiones hipervariables. En el extremo de la secuencia HuVhlys-ADNc se incorporó una señal de detención. Se eliminó en la cadena ligera un punto BanII. Estas modificaciones se llevaron a cabo por medio de una mutagénesis dirigida al punto "site directed mutagenesis" en el bacteriófago M13mpl8 (Zoller y Smith, Meth. Enzymol. 100, 468-500). En la tabla 5 se ha mostrado la secuencia del anticuerpo ADN confeccionado.
Para la inserción de la secuencia "conductora" P_{1} (tabla 4) se sometió a digestión al plásmido modificado pKK233-2 con los enzimas de restricción NcoI y PstI y se insertó P_{1} entre estos puntos (pKK233-2-P_{1}). Se llevaron a cabo otras etapas de clonación hasta la última etapa con el plásmido pUC18. El motivo se debe a que la presencia de fragmentos individuales del anticuerpo-operón en el vector de expresión influye negativamente sobre el crecimiento del anfitrión bacteriano.
Como paso previo a la clonación en pUC18 tuvo que ser eliminado su punto de restricción BamHI. Tras una digestión con BamHI se rellenaron los extremos de las cadenas individuales con el fragmento de Klenow y se volvieron a unir. Este plásmido modificado se sometió a digestión a continuación con PstI y HindIII y se ligó con P_{2} más RBS entre estos puntos de restricción (pUC18-P_{2}). Por medio de esta operación desaparece el punto de restricción original HindIII del plásmido y se incorpora un nuevo punto de restricción HindIII. A continuación se sometió a digestión al pUC18-p_{2} con PstI y con HindIII y se ligó el ADN de la cadena pesada (inserto de PstI-HindIII procedente de M13) en estos dos puntos (pUC18-HP_{2}). Este plásmido se sometió a digestión a continuación con EcoRV y con BamHI y se aportó por ligadura el ADN de la cadena ligera (inserto de EcoRV-BamHI procedente de M13) (pUC18-HP_{2}L).
En una forma preferente de realización se aportó por ligadura (tabla 4) una secuencia "TAG" en el nuevo punto de corte HindIII. La secuencia "TAG" codifica el péptido Glu-Glu-Gly-Glu-Glu-Phe y es reconocido por el anticuerpo monoclonal YL 1/2 (Wehland et al. (1984) EMBO J. 3, 1295). El plásmido resultante es pUC-HTP_{2}L.
Para la inserción de HP_{2}L o bien de HTP_{2}L en el vector de expresión se cortaron pUC18-HP_{2}L o bien PUC-HTP_{2}L con PstI y BamHI y el correspondiente fragmento de restricción se ligó respectivamente en el plásmido modificado pKK233-2-P_{1} en estos dos puntos de restricción. En la tabla 6 se muestra una representación esquemática del vector de expresión pFMT confeccionado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Obtención de ARN a partir de linfocitos B humanos
Con objeto de enriquecer las células B periféricas a partir de sangre humana, ésta se diluyó con fosfato tamponado salino PBS ("phosphate buffered saline") 1:1 y se centrifugó sobre una almohadilla de Ficoll^{R}(Pharmacia) (1,077 kg/l). Las células de la interfase se lavaron dos veces con PBS y se incubaron en medio RPMI, que contenía un 10% de suero de ternera fetal, con un fondo de plástico (botella de cultivo) durante una hora a 37ºC. Las células adherentes (monocitos y macrófagos) se adhirieron sobre el recipiente de cultivo y de este modo pudieron ser separadas de la preparación. Las células no adherentes se reunieron por medio de una centrifugación y se homogeneizaron con isotiocianato de guanidinio 4,4 M, mercaptoetanol al 5% y lauroilsarcosina al 2%. El homogenato se centrifugó a continuación sobre una almohadilla de CsCl 5,7 M durante 18 horas a 125.000 g. El ARN sedimentado se disolvió en H_{2}O bidestilada y se precipitó durante la noche con etanol al 70% y con 1/20 en volumen de LiCl 8 M a -20ºC.
Con objeto de obtener una pluralidad todavía mayor de anticuerpos de diversa especificidad se mezclaron preparaciones de ARN de respectivamente 500 ml de sangre de 20 personas diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Amplificación del anticuerpo ADN
Se purificó el ARNm a través de oligo-dT-sefarosa (estuche de la firma Phärmacia) y se tradujo en ADNc con transcriptasa inversa (estuche de la firma Amersham) y con oligo-dT-cebador. Los productos se emplearon directamente en la reacción en cadena de polimerasa "polymerase chain reaction" (RCP). En las tablas 1 y respectivamente 2 se han mostrado el cebador para la RCP y los puntos de hibridación. Por medio de una combinación de los \mu-ADN obtenidos bien con ADN kappa o con ADN lambda en el vector pFMT se prepararon dos bancos diferentes de expresión. El empleo de diversos cebadores para la síntesis de las hebras no codificantes en la reacción en cadena de polimerasa "polymerase chain reaction" posibilita la obtención de dos tipos diversos de anticuerpos, que en uno de los casos únicamente contienen los dominios variables, conteniendo en el otro caso adicionalmente además un dominio constante (similar al fragmento Fab de un anticuerpo). Para la RCP se hicieron reaccionar 4 \mul de un ADNc de síntesis respectivamente con 0,2 nmol de los dos cebadores en un volumen de 50 \mul. La carga de la reacción contenía 100 mM de KC1, un 0,1% de gelatina y 2,5 U de polimerasa Taq. Al cabo de 30 ciclos de polimerización, constituidos por 1 minuto a 95ºC, 2 minutos a 55ºC y 2 minutos a 72ºC, se precipitó con etanol el ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Inserción del anticuerpo ADN en el plásmido de expresión
El ADN precipitado se recogió en el tampón de carga para geles de agarosa (0,1% de azul de bromofenol, 7% de Ficoll^{R} [Pharmacia]) y se separó sobre un 2% de agarosa a 10 V/cm en tampón TBE (45 mM de tris-borato, pH 8,0, 10 mM de EDTA). El anticuerpo ADN sintetizado se identificó por medio de su peso molecular y se eluyó a partir del gel. Después de la precipitación con etanol se recogió dicho anticuerpo ADN en tampón para el correspondiente enzima de restricción y se cortó con el correspondiente enzima de restricción (Boehringer Mannheim) (véanse las tablas 1 y 2). Después de una precipitación en etanol se ligó en el vector pFMT cortado de la misma manera, como se ha mostrado esquemáticamente en la tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Expresión y exploración "screenen" de anticuerpos en E. coli
Se transfirieron E. coli competentes con plásmidos pFMT, que contienen la biblioteca de anticuerpo-ADN insertada, se extendieron sobre placas de agarosa y a continuación se incubaron con filtros de nitrocelulosa, que estaban recubiertos con el antígeno buscado. Después de la eliminación de los anticuerpos enlazados de manera inespecífica, se identifican los clones activos con un anticuerpo marcado contra la inmunoglobulina humana secretada por E. coli. En la forma preferente de realización se utiliza para la identificación de los clones buscados el anticuerpo monoclonal YL 1/2, que está dirigido contra la secuencia "TAG".
\vskip1.000000\baselineskip
Leyendas relativas a la figura 1
Mapa de restricción del vector de expresión pKK233-2 (Amann und Brosius, en el lugar indicado)
Ptrc significa promotor triptofano-lac híbrido
RBS significa puntos de enlace de los ribosomas
rrnB significa ARN B ribosómico (5S ARN)
5S significa gen para 5S ARN (que contiene rrnB)
\vskip1.000000\baselineskip
Como paso previo a la clonación del anticuerpo ADN en el vector de expresión se llevan a cabo las siguientes modificaciones:
1). Los puntos de restricción SalI y EcoRI se separaron junto con el ADN situado entremedias.
2). El punto de restricción HindIII se transformó en un punto de restricción BamHI.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Oligonucleótidos "cebadores" para la amplificación de ADNc con la "reacción en cadena de polimerasa -Polymerase Chain Reaction-"
1
2 
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
3 
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
4
5
6
TABLA 5 Secuencias de nucleótidos de anticuerpo ADN
7 
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
8 
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
9
<110> Dade Behring Marburg GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Preparación y empleo de genotecas de anticuerpos humanos ("bancos de anticuerpos humanos -Human-Antibody-Libraries")
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1990/B005 - Ma 833
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 04008412.1
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 1991-01-28
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP91101095.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1991-01-28
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tt 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtctgcatc tgtrggagac agggtcacca tcamttg 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctcagygtc tgggwcccca ggacagaggg tgaccatctc ctgc 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtgggacg aagaagctta cttagggagg cagctcagca atcac 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtgggacg aagaagctaa gcttgggagg cagctcagca atcac 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgagggwtg ggatcctatg aacattctgt aggggccact gt 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacaggagac gagggggaaa agctttgggg cttatgcact ccc 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacaggagac gagggggaaa agctttgggg cggatgcact ccc 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacagaggcg gatcctcatt tcaactgctc atcagatggc gggaagatga agac 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agctcctcag aggasggcgg gatccgagtg acctagggg 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgaaatac ctcttgccta cggcagccgc tggcttg 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
15 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgctgctgg cagctcagcc ggcgatggcg caagttcagc tgca 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccaagcttg aattcattaa agaggagaaa 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211>
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaactccat gaagtactta ctgccgaccg ctgcg 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
16 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctcagccgg ctatggctga tatcggatcc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgggtctcc tgctgttggc g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcttgaaga aggtgaagaa ttctaatg 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agctcattag aattcttcac cttcttca 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 407
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
20
21

Claims (3)

1. Procedimiento para la obtención de bibliotecas de anticuerpos humanos; caracterizado porque se aísla el ARNm a partir de linfocitos B humanos periféricos, no activados y se transcribe en el ADNc, a continuación se amplifica el ADNc, que codifica anticuerpos, por medio de una reacción en cadena de polimerasa RCP con ayuda de cebadores adecuados, llevándose a cabo a continuación una incorporación en plásmidos de expresión adecuados y a continuación se lleva a cabo la expresión del anticuerpo-ADNc en clones individuales, caracterizado porque la maqueta de los cebadores para la reacción inversa para la síntesis de la hebra, no codificante, del ADN de la cadena pesada está basada en secuencias de IgM y porque se posibilita, por medio del empleo de diversos cebadores para la síntesis de la hebra, no codificante, la obtención de un tipo de anticuerpo, que está constituido por los dominios variables y por los primeros dominios constantes.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión se lleva a cabo en el plásmido pFMT de conformidad con la tabla 6.
3. Procedimiento para el aislamiento de fragmentos de anticuerpos humanos específicos, caracterizado porque se exploran bibliotecas de anticuerpos humanos, preparados según la reivindicación 1 o 2, con antígenos específicos.
ES04008412T 1990-02-01 1991-01-28 Obtencion y empleo de ginotecas de anticuerpos humanos ("bancos de anticuerpos humanos"). Expired - Lifetime ES2336444T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4002898A DE4002898A1 (de) 1990-02-01 1990-02-01 Herstellung und verwendung von genbanken menschlicher antikoerper ("human-antikoerper-bibliotheken")
DE4002898 1990-02-01
DE4003881A DE4003881A1 (de) 1990-02-09 1990-02-09 Herstellung und verwendung von genbanken menschlicher antikoerper ("human-antikoerper-bibliotheken")
DE4003881 1990-02-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2336444T3 true ES2336444T3 (es) 2010-04-13

Family

ID=25889602

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES91101095.7T Expired - Lifetime ES2225816T5 (es) 1990-02-01 1991-01-28 Producción y utilización de bancos de genes de anticuerpos humanos ("bibliotecas de anticuerpos humanos")
ES04008412T Expired - Lifetime ES2336444T3 (es) 1990-02-01 1991-01-28 Obtencion y empleo de ginotecas de anticuerpos humanos ("bancos de anticuerpos humanos").

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES91101095.7T Expired - Lifetime ES2225816T5 (es) 1990-02-01 1991-01-28 Producción y utilización de bancos de genes de anticuerpos humanos ("bibliotecas de anticuerpos humanos")

Country Status (12)

Country Link
US (1) US6319690B1 (es)
EP (2) EP0440147B2 (es)
JP (1) JP3514778B2 (es)
KR (1) KR100186823B1 (es)
AT (2) ATE449853T1 (es)
AU (1) AU633682B2 (es)
CA (1) CA2035381C (es)
DE (2) DE59109273D1 (es)
DK (1) DK0440147T3 (es)
ES (2) ES2225816T5 (es)
IE (1) IE910335A1 (es)
PT (1) PT96625B (es)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0440147T3 (da) † 1990-02-01 2005-01-17 Dade Behring Marburg Gmbh Fremstilling og anvendelse af genbanker af humant antistof ("humant-antistof-biblioteker")
IL102490A0 (en) * 1991-07-15 1993-01-14 Wellcome Found Production of antibodies
DE4142077A1 (de) * 1991-12-19 1993-06-24 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur expression rekombinanter antikoerper
DE69531148T2 (de) * 1994-01-31 2004-04-29 Trustees Of Boston University, Boston Bibliotheken aus polyklonalen antikörpern
DE19728697C1 (de) * 1997-07-04 1999-03-25 Deutsches Krebsforsch Humaner Antikörper gegen ein Fusions(poly)peptid bzw. -protein, das einen Anteil von mindestens sechs Histidinen aufweist
EP1015633A1 (en) * 1997-09-19 2000-07-05 Laboratories Inc. Medelys Method and kit for early diagnosis of autoimmunity and lymphoma in central nervous system
US7803765B2 (en) * 1999-05-05 2010-09-28 Phylogica Limited Methods of constructing biodiverse gene fragment libraries and biological modulators isolated therefrom
CA2721199A1 (en) 1999-05-05 2000-11-16 Phylogica Limited Isolating biological modulators from biodiverse gene fragment libraries
US7270969B2 (en) * 1999-05-05 2007-09-18 Phylogica Limited Methods of constructing and screening diverse expression libraries
DK1276855T3 (da) * 2000-04-17 2012-11-26 Dyax Corp Fremgangsmåde til konstruktion af visningsbiblioteker over genetiske pakker for medlemmer af en diversificeret peptidfamilie
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
ATE498718T1 (de) 2000-12-18 2011-03-15 Dyax Corp Gerichtete bibliotheken die genetisch verpackt sind
WO2003035842A2 (en) * 2001-10-24 2003-05-01 Dyax Corporation Hybridization control of sequence variation
US20040067532A1 (en) 2002-08-12 2004-04-08 Genetastix Corporation High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody
US7981843B2 (en) 2004-01-20 2011-07-19 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
WO2005087812A1 (en) * 2004-03-05 2005-09-22 Ludwig Institute For Cancer Research Multivalent antibody materials and methods for vegf/pdgf family of growth factors
DK1754052T3 (en) * 2004-06-03 2015-09-28 Phylogica Ltd Modulators with biochemical properties
JP5431730B2 (ja) * 2005-12-16 2014-03-05 リボバックス バイオテクノロジーズ ソシエテ アノニム 不死化された抗体分泌細胞を得る方法
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
DK1973946T3 (da) 2006-01-20 2015-06-22 Cell Signaling Technology Inc Translokation og mutant ros kinase i human ikke-småcellet lungekarcinom
DK1987178T3 (en) * 2006-02-20 2015-04-20 Phylogica Ltd Process for the construction and screening of peptide structure libraries
US7700339B2 (en) 2006-04-14 2010-04-20 Cell Signaling Technology, Inc. Gene defects and mutant ALK kinase in human solid tumors
US8063012B2 (en) * 2006-09-19 2011-11-22 Phylogica Limited Neuroprotective peptide inhibitors of AP-1 signaling and uses therefor
US8822409B2 (en) * 2007-06-20 2014-09-02 Phylogica Limited Compositions and uses thereof for the treatment of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and clinical disorders associated with therewith
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
CA3187687A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US12529164B2 (en) 2007-09-14 2026-01-20 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
DK2203558T3 (en) 2007-10-18 2016-06-27 Cell Signaling Technology Inc TRANSLOCATION AND mutant ROS kinase IN HUMAN NON-small cell lung carcinoma
WO2009114815A1 (en) 2008-03-13 2009-09-17 Dyax Corp Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr3 designs
CA2968164C (en) * 2008-04-24 2019-08-20 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr1, cdr2, and cdr3 and novel lc cdr1, cdr2, and cdr3 designs
PT2881402T (pt) 2009-02-12 2017-08-23 Cell Signaling Technology Inc Expressão de ros mutante em cancro de fígado humano
CA2773564A1 (en) * 2009-09-14 2011-03-17 Dyax Corp. Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr3 designs
US20130052194A1 (en) * 2009-12-16 2013-02-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Anti-prostate cancer antibodies and methods of detection and treatment of prostate cancer using the same
KR102318383B1 (ko) * 2010-07-16 2021-10-27 아디맵 엘엘씨 항체 라이브러리
WO2012019132A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic lymphoma kinase in kidney cancer
WO2012142662A1 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Garvan Institute Of Medical Research Modified variable domain molecules and methods for producing and using them b
ES2655842T3 (es) 2012-04-18 2018-02-21 Cell Signaling Technology, Inc. EGFR y ROS1 en el cáncer
US10809264B2 (en) * 2014-05-29 2020-10-20 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Rare molecule detection
BR112020000719A2 (pt) 2017-07-11 2020-07-14 Compass Therapeutics Llc anticorpos agonistas que ligam o cd137 humano e seus usos
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
EP3713961A2 (en) 2017-11-20 2020-09-30 Compass Therapeutics LLC Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
WO2020102387A1 (en) 2018-11-13 2020-05-22 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2052027T5 (es) * 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
CA2016842A1 (en) † 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
CA2016841C (en) † 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
AU7247191A (en) * 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
DK0440147T3 (da) † 1990-02-01 2005-01-17 Dade Behring Marburg Gmbh Fremstilling og anvendelse af genbanker af humant antistof ("humant-antistof-biblioteker")

Also Published As

Publication number Publication date
EP0440147B2 (de) 2014-05-14
DE59109264D1 (de) 2004-10-28
CA2035381C (en) 2004-11-09
IE910335A1 (en) 1991-08-14
CA2035381A1 (en) 1991-08-02
PT96625A (pt) 1991-11-29
DE59109273D1 (de) 2010-01-07
KR910021475A (ko) 1991-12-20
EP1566442A3 (de) 2006-06-07
JP3514778B2 (ja) 2004-03-31
ATE277179T1 (de) 2004-10-15
DK0440147T3 (da) 2005-01-17
AU633682B2 (en) 1993-02-04
EP0440147B1 (de) 2004-09-22
ES2225816T5 (es) 2014-08-21
PT96625B (pt) 1998-07-31
ATE449853T1 (de) 2009-12-15
JPH04211394A (ja) 1992-08-03
ES2225816T3 (es) 2005-03-16
EP1566442A2 (de) 2005-08-24
EP0440147A2 (de) 1991-08-07
KR100186823B1 (ko) 1999-04-01
EP0440147A3 (en) 1992-07-08
US6319690B1 (en) 2001-11-20
EP1566442B1 (de) 2009-11-25
AU7011391A (en) 1991-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2336444T3 (es) Obtencion y empleo de ginotecas de anticuerpos humanos (&#34;bancos de anticuerpos humanos&#34;).
IE84034B1 (en) Preparation and use of a human antibody gene bank (human antibody libraries)
McCafferty et al. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains
KR100663319B1 (ko) 인간 17-1에이항원에 대해 특이성을 갖는 인간항체 및 그용도
ES2309999T3 (es) Metodo para la oligomerizacion de peptidos.
JP3490437B2 (ja) 単量体および二量体抗体フラグメント融合タンパク質
EP0894135B1 (en) Multivalent and multispecific antigen-binding protein
Kummer et al. Production and characterization of monoclonal antibodies raised against recombinant human granzymes A and B and showing cross reactions with the natural proteins
Palmer et al. Selection of antibodies to cell surface determinants on mouse thymic epithelial cells using a phage display library
RU94045919A (ru) Антитела, клетки, полипептид, днк векторы, способ получения полипептида, способ получения антитела, фармацевтическая композиция
Scarselli et al. Receptor phage: display of functional domains of the human high affinity IgE receptor on the M13 phage surface
EP0393045B1 (en) Fv antibody fragment production
KR101241667B1 (ko) 신규한 펩타이드 태그 및 그의 용도
Schneiderman et al. Expression of 12 rabbit IgA C alpha genes as chimeric rabbit-mouse IgA antibodies.
Hirabayashi et al. Kinetic analysis of the interactions of recombinant human VpreB and Ig V domains
Schlebusch et al. Production of a single-chain fragment of the murine anti-idiotypic antibody ACA125 as phage-displayed and soluble antibody by recombinant phage antibody technique
Lake et al. Construction and Serological Characterization of a Recombinant Human Single Chain T-Cell Receptor
HRP20010149A2 (en) High-affinity antibodies
Schilling et al. Analysis of the diversity of murine antibodies to dextran B1355: N-terminal amino acid sequences of heavy chains from serum antibody
PALMER et al. Intrathymic function of the human cortical epithelial cell surface antigen gp200‐MR6: single‐chain antibodies to evolutionarily conserved determinants disrupt mouse thymus development
Spooner et al. Genetically engineered antibodies for diagnostic pathology
RU2285043C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pСL1, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ЛЕГКОЙ ЦЕПИ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ВИРУСА ЭБОЛА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рСН1, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ УКАЗАННОГО АНТИТЕЛА, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
JPH1066582A (ja) Ｉｌ−６のヘリックスｄ領域を認識する抗体の遺伝子断片等
Davis et al. Determination of primary amino acid sequence and unique three-dimensional structure of WGH1, a monoclonal human IgM antibody with anti-PR3 specificity
Jahn et al. Expression of monovalent fragments derived from a human IgM autoantibody in E. coli. The input of the somatically mutated CDR1/CDR2 and of the CDR3 into antigen binding specificity