PT96625B - Processo para a preparacao de bancos de genes de anticorpos humanos ("bibliotecas de anticorpos humanos") - Google Patents

Processo para a preparacao de bancos de genes de anticorpos humanos ("bibliotecas de anticorpos humanos") Download PDF

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Description

Descrição referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial com sede em D-3550 Marburg, Republica Federal Alemã, (inventores: Dr. Melvyn Little, Frank Berthold Breitling, Dr. Thomas Seehaus, Stefan Dubel e íris Klewinghaus, residentes na Republica Federal Alemã), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE BANCOS DE GENES DE ANTICORPOS HUMANOS (BIBLIOTECAS DE ANTICORPOS HUMANOS).
DESCRIÇÃO
A invenção refere-se à preparação e utilização de bancos de genes de anticorpos (AC) humanos. Partindo de uma mistura de linfõcitos B humanos, traduz-se o respectivo mRNA em cDNA, utilizando iniciadores (Primers) de oligo-dT. Em seguida ocorre uma amplificação do cDNA específico do AC por meio de uma reacção em cadeia de polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaetion) utilizando sequências de Primer de oligonucleôtidos adequados. Pela expressão deste cDNA específico do AC amplificado, num vector de expressão bacteriano, por exemplo o vector pFMT a seguir descrita, em E. coli, obtêm-se uma biblioteca de anticorpos humanos com um largo repertõrio de seleeção (Screening) in vitro com antihenes apropriados.
Calcula-se que o sistema imunolõgico do ser hu mano ou de um mamífero possui entre 106 e 10θ anticorpos diferen
tes. Este número de anticorpos ê suficiente para provocar uma reacção imunológica do corpo contra antigenes tanto de origem natural oomo artificiais. Atendendo ao facto de muitas vezes vários anticorpos reagirem com o mesmo antigene, a gama de anticor
7 pos verdadeiramente diferentes situa-se entre 10 e 10'.
Atê agora preparavam-se os anticorpos a partir de uma imunização com o antigene em causa, por exemplo por injec ção do antigene no organismo ou por incubação de células de baço in vitro com esse antigene. No caso de anticorpos policlonais podem isolar-se em seguida as imunoglobulinas a partir do soro e a partir delas obter os anticorpos específicos, por exemplo atra vês de processos de absorção. Os anticorpos monoclonais isolam-se por exemplo a partir dos sobrenadantes de culturas celulares ou do lisado celular de células de tumor de baço elonadas fundidas com linfôcitos B individuais (células de hibridoma). Os processos acima mencionados são particularmente adequados para a preparação de anticorpos humanos específicos ou de anticorpos monoclonais humanos.
O objectivo da presente invenção foi assim o de desenvolver um método geral acessível para a preparação de an ticorpos monoclonais humanos específicos (huMAC's) ou de partes de anticorpos, que contenham a posição de ligação ao antigene.
Descobriu-se que os huMAC’s desejados ou as suas partes, que contêm a região variável de ligação ao antigene se podem isolar a partir de bancos de genes de imunoglobulina humana. Em primeiro lugar isolou-se o mRNA a partir de uma mistura de linfôcitos B humanos não activados e traduziu-se em cDNA por meio de Primers de oligo-dT. Obteve-se uma amplificação específica da população de anticorpos, no interior da massa de cDNA obtida, utilizando a PCR. Para tal, utilizaram-se determina dos Primers de oligonucleótidos, homólogos âs sequências conservadas em ambos os extremos do cDNA do anticorpo (vide abaixo e exemplos). A estrutura do Primer para a reacção inversa de sín tese da cadeia nao codificante do DNA da cadeia pesada baseia-se em sequências IgM (subclasse III, uma vez que ê a que abrange a maioria das sequências IgM). As moléculas IgM em linfôcitos B
não activados encontram-se mais frequentemente representadas do que todas as outras classes de imunoglobulinas. Em contrapartida, as sequências IgG predominam em linfõcitos B activados, sendo a respectiva variedade em anticorpos diferentes muito menor. Numa biblioteca IgG existe ainda o perigo de um ou alguns IgG’s particularmente fortemente expressos dominaram a biblioteca.
Com este objectivo efectuaram-se até 30 ciclos de amplificações. Os Primers de oligonucleõtido contêm posições de restrição adequadas para inserir o DNA amplificado, por exemplo no plasmídeo de expressão do anticorpo bFMT (vide abaixo) . Este plasmídeo de expressão permite a expressão do cDNA de anticorpos e em seguida a secreção dos produtos de expressão em bactérias (E.coli). O operão do anticorpo do plasmídeo contêm as sequências das regiões variáveis tanto da cadeia pesada como da cadeia leva de um anticorpo. Sequências leader apropriadas da região aminoterminal de uma proteína bacteriana possibilitam a secreção das partes do anticorpo. As sequências Leader são cindidas, durante a secreção, por um enzima bacteriano. Durante a secreção dos produtos do cDNA do anticorpo as cadeias leve e pesada do anticorpo associam-se (com ou sem regiões constantes limítrofes). Forma-se deste modo um anticorpo ou fragmento de anticorpo que contêm uma ou mais posições de ligações funcionais do antigene. Foram também descritas por outros autores construçõessemelhantes para anticorpos individuais (Better et al. (1988 ), Science 240, 1041 e Skerras e Pluckthun (1988), Science 240, 1038).
A amplificação do DNA, que codifica para a região variável dos anticorpos, foi descrita por outros autores (orlandi et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sei. 86, 3833; Sastry et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sei. 86, 5728; Nard et al.(1989 ), Nature 341, 544); Huse et al. (1989), Science 246, 275). Nestes casos, isolou-se também, entre outros, o mRNA codificante para o anticorpo, a partir de células de hibridoma ou de linfõcitos de baço, após tratamento com um determinado antigene. Por isso, utilizaram-se também sequências de Primer, que se baseiam apenas em sequências IgG. Isto é naturalmente uma vantagem quando se pesquisam muitos clonos de DNA de anticorpos, originários de linfõcitos activados. Com Primers de sequências IgG são muito
maiores as possibilidades de encontrar clonos que contêm DNA codificante para anticorpos contra o antigene injectado. É ainda de acrescentar que nos trabalhos acima mencionados se sintetizou DNA de anticorpos murino, e como tal não humano, e se amplificou ainda, com exclusão das regiões da cadeia lambda.
Na presente invenção utilizam-se pelo contrario sequências Primer que são homólogas a sequências nas regiões constantes do cDNA de IgM. Deste modo pode concretizar-se da melhor forma a invenção, isto ê conseguir-se um elevado número de anticorpos, nomeadamente o repertório de anticorpos completo, na forma de uma biblioteca. A expressão, de preferência em E.coli, dã origem então â biblioteca de anticorpos humana desejada, na qual se podem encontrar os anticorpos humanos pretendidos ou as partes de anticorpos, por selecção (screening) de clonos bacterianos com o antigene escolhido.
Na Tab. 1 apresentam-se Primers de oligonucleptido adequados para a amplificação. As posições dos Primers acima referidos nas cadeias μ, lc e >representam-se esquematicamente na Tab. 2. As construções detalhadas de biologia molecular incluindo o vector de expressão, isto ê, o plasmideo de expressão do anticorpo pFMT, encontram-se descritas nos exemplos seguintes .
A invenção refere-se sequencialmente a bibliotecas de anticorpos humanos, preparadas por transcrição do mRNA de linfócitos B humanos não activados (periféricos) por meio de Primer oligo-dT, à amplificação subsequente por PCR utilizando sequências contendo Primers homólogas âs regiões conservadas do cDNA de IgM e â posterior introdução em plasmídeos de expressão adequados para a expressão em microorganismos, de preferência no vector de expressão pFMT para a expressão em E.coli. Numa forma de concretização preferencial introduz-se ainda uma sequência que codifica para um péptido marcador, por exemplo uma sequência TAG, de modo a que os produtos de expressão se possam identificar facilmente com anticorpos monoclonais estabelecidos contra o péptido marcador (Wehland et al., (1984), EMBO J. 3,1295).
A invenção abrange ainda a utilização das bibliotecas de anti corpos humanos acima mencionadas para o isola mento de anti corpos humanos pretendidos ou partes de anti corpos com posição de ligação de antigenes funcional, por meio de screening com antigenes escolhidos, bem como processos para o isolamento dos anticorpos humanos referidos ou das suas partes de ligação ao antigene, e ainda processos para a preparação das referidas bibliotecas de anticorpos humanos.
A invenção refere-se também a vectores de expressão com as propriedades do plasmídeo de expressão de antieor pos pFMT.
Os exemplos seguintes destinam-se a melhor ilustrar a invenção sem a limitarem. Finalmente, a invenção estã contida nas reivindicações da patente.
Exemplos:
Exemplo 1: Preparação de um vector de expressão de anticorpos
Escolheu-se o plasmídeo pKK233-2(Amann e Brosins, (1985) Gene 40, 183 e Straus e Gilbert, (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82, 2014) como vector base para a construção do vector de expressão de anticorpos (Fig. 1).
Antes da introdução do operão do anticorpo cortou-se o plasmídeo com Sal I e Bam Hl, preencheram-se os extremos com polimerase de Klenow e ligou-se. Removeram-se deste modo as duas posições de restrição e o DNA situado entre elas. Alêm disso, cindiu-se o plasmídeo com Hind III, preencheram-se os extremos com polimerase de Klenow e ligou-se com Bam Hl. Por meio desta operação removeu-se a posição de restrição Hind III e inseriu-se uma posição Bam Hl. Neste plasmídeo modificado inseriu-se õ DNA do anticorpo. Na Tab. 3 apresenta-se um modo de construção esquemático do operão do anticorpo, qúe codifica para um mRNA bicistrónico do anticorpo. Para possibilitar a secrej ção do anticorpo utilizou-se a sequência Leader do enzima bacteriano Pectatliase. A sequência Leader deste enzima tem sido • já utilizada para a expressão e secreção de um anticorpo quimê• rico rato-homem (fragmento Fab, Better et al., vide acima) bem
como da região variável de um anticorpo humanizado (Ward et al., vide acima; Huse et al., vide acima). 0 DNA para a primeira sequência Leader (P^ antes da cadeia pesada) e a sequência para uma segunda posição de ligação de ribosomas (RBS) e uma segunda sequência Leader (P^ antes da cadeia leva) sintetizaram -se a partir de vários oligonucleõtidos (Tab. 4).
Os cDNA's do anticorpo, que 'Codificam para as regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo humano (HuV-hlys ou Huvllys; Riechmann et al., (1988) J. Mol.Biol. 203, 825), foram fornecidos pelo Dr. G. Winter (Cambridge, RU). Introduziram-se as posições de restrição Hind III (Huvhlys) e EcoRv (Huvllys), para possibilitar a inserção do cDNA de anticor po no vector de expressão. Introduziram-se também outras posições de restrição para Ban II (Huvhlys) e BstEII ou Kpnl (HuVll ys), para trocar regiões hipervariãveis en bloc. No fim da se quência HuVhlys-cDNA introduziu-se.um sinal de stop. Removeu-se uma posição Ban II na cadeia leve. Estas alterações efectuaram-se por meio de site directed mutagenesis no bacteriofago M13 pl8(Zoller e Smith. Meth. Enzymol. 100, 468-500). Na Tab. 5 mos tra-se a sequência do DNA de anticorpo pronto.
Para a inserção da sequência Leader PI (Tab. 4) digeriu-se o plasmídeo modificado pKK 233-2 com os enzimas de restrição Ncol e PstI e inseriu-se a P^ entre estas posições (pKK 233-2-pp. Efectuaram-se mais passos de clonagem, atê ao último passo, c om o plasmídeo pUCl8. A razão ê que a ausência de partes individuais do operão do anticorpo no vector de expre ssão prejudica o crescimento do hospedeiro bacteriano..
Antes da clonagem em pUC18 teve de remover-se a respectiva posição de restrição BamHI. Após uma digestão com BamHI preencheram-se os ectremos de cadeia simples com o fragmento de Klenow e religou-se. Este plasmídeo modificado digeriu -se então com PstI e HindIII e ligaram-se P£ mais RBS entre estas posições de restrição (PUCI8-P2)· Nesta operação desaparece a posição de restrição HindIII original do plasmídeo z constroi -se uma nova posição de restrição HindIII. Digeriu-se então o . PUCI8-P2 com PstI e HindIII e ligou-se o DNA da cadeia pesada * (inserção Pst Ι-Hind III de M13) nestas duas posições (pUC!86
-·ΗΡ2). Digeriu-se depois este plasmideo com EcoRV e BamHI e ligou-se aí o DNA da cadeia leve (inserção EcoRV-BamHI de M13) (pUcl8-HP2L).
Numa forma de concretização preferencial ligou-se na nova posição de corte HindIII uma sequência TAG (Ta b. 4). A sequência TAG codifica para o péptido Glu-Glu-Gly-Glu-Glu-Phe e ê reconhecida pelo anticorpo monoclonal YL 1/2 (Wehland et al. (1984) EMBO J. 3, 1295). 0 plasmideo resultante é o pUC-HTP2L.
Para inserção do HP2L ou HTP2L no vector de expressão cortou-se pUcl8-HP2L ou pUC-HTP2L com PstI e BamHI, e ligou-se o fragmento de restrição obtido no plasmideo modíficadc pKK233-2-P^ nestas duas posições de restrição. Na Tab.6 apresen ta-se uma representação esquemática do vector de expressão pFMT pronto.
Exemplo 2: Obtenção de RNA a partir de linfõcitos B humanos
Para o enriquecimento em células B periféricas a partir de sangue humano, diluiu-se este com PBs(phosphate buffered saline) a 1:1 e centrifugou-se através de uma camada de Ficoll (Pharmacia) (1,077 kg/1). Lavaram-se as células da interface duas vezes com PBs e incubaram-se em meio RPMI, contendo 10% de soro de vaca fetal, sobre um substrato de plástico (frasco de cultura) , durante 1 hora a 37°C. As células aderentes (monõcitos e macrofogos) agarraram-se ao recipiente de cultura e puderam assim separar-se e remover-se da preparação. As células não aderentes recolheram-se por centrifugação e homogeneizaram-se em isotiocianato de guanidinio 4,4M, 5% de mercaptoetanol e 2% de lauroilsarcosina. O homogeneizado centrifugou-se então através de um leito de CsCl 5,7M, durante 18 horas a 125000g. O RNA sedimentado dissolveu-se em ãgua bidestilada e precipitou-se com 70% de etanol e 1/20 volumes de LICE 8 M a -20°C durante a noite .
Para se obter uma ainda maior diversidade de anticorpos de especificidades diferentes, misturaram-se prepara ções de RNA obtidas a partir de 500 ml de sangue de 20 pessoas diferentes.
Exemplo 3: Amplificação do DNA de anticorpos mRNA purificou-se em oligo-dt-Sepharose (kit de Pharmacia) e traduziu-se para cDNA com transcriptase reversa (kit de Amersham) e Primer oligo-dT. Utilizaram-se os produtos directamente na po lymerase chain reaction (PCR). G PCR-Primer e as posições de hi bridação estão apresentadas nas Tab. 1 e 2. Por meio de uma combinação do A-DNA obtido com DNA K ou Xno vector pFMT, prepararam-se dois bancos de expressão diferentes. A utilização de Primers diferentes para a síntese das cadeias não codificantes na polymerase chain reaction permite a preparação de dois tipos diferentes de anticorpos que, num caso, apenas contêm as regiões variáveis e, no outro caso, contêm ainda uma região constante (semelhante ao fragmento Fab de um anticorpo). Para a PcR fizeram-se reagir 4 yil de uma síntese de cDNA com 0,2 mmol de cada um dos dois.Primers num volume de 50 /xl. A mistura reaccional continha 100 m M Kcl, 0,1% de gelatina e 2,5 U de Tag-polimerase. Apõs 30 ciclos de polimerização, de 1 min. a 95°C, 2 min. a 55°C e 2 min. a 72°C, precipitou-se o DNA com etanol.
Exemplo 4: Inserção do DNA de anticorpo no plasmídeo de expressão
DNA precipitado tomou-se em tampão de carga para gel de agaroR se (0,1% de azul de bromofenol, 7% de Ficoll (Pharmacia)) e separou-se em 2% de agarose a lOV/cm em tampão TBE(45 m M Tris-borato, pM8.0,10 m M EDTA). Identificou-se o DNA de anticorpo sintetizado com base no seu peso molecular e eluiu-se a partir do gel. Apõs precipitação com etanol tomou-se em tampão adequado pa ra cada um dos enzimas de restrição e cortou-se com os enzimas de restrição correspondentes (Boehringer Mannheim) (Vide Tab. 1 <= 2). Apõs uma precipitação em etanol ligou-se no vector pFMT cortado do mesmo modo, como se mostra esquematicamente na Tab. 7.
Exemplo 5: Expressão e Screening de anticorpos em E. coli
Transfeccionam-se células de E. coli adequadas com plasmídeos pFMT, que contêm a biblioteca de DNA de anticorpos inseridas, colocam-se em placas de agarose e incubam-se em seguida com filtros de nitrocelulose, recobertos com o antigene pretendido. Após a remoção de anticorpos ligados não específicos, identificam-se os clonos activos com um anticorpo marcado contra a imunoglobulina segregada pela E. coli. Na forma de execução preferencial utiliza-se para a identificação dos clonos pretendidos o anticorpo mo noclonal YL 1/2, dirigido contra a sequência TAG.
Legenda da Fig. 1:
Carta de restrição do vector de expressão pKK233-2 (Amann e Brosins, vide acima).
Ptrc significa Promotor Triptofano-lac híbrido
RBS significa posição de ligação a ribosomas rrnB significa RNA B ribosomal (5S RNA)
5S significa gene para 5S RNA (contém rrnB)
Antes da clonagem de DNA de anticorpos no vector de expressão efectuaram-se as seguintes alterações:
1) As posições de restrição Sall e EeoRI removeram-se juntamente com o DNA entre elas situado.
2) A posição de restrição HindIII transformou-se numa posição de restrição BamHI.
Primer de oligonucleõtido para a amplificação de cDNA pela Polymerase chain reaction (PCR)
1. Primers de oligonucleõtido para a PCR directa
D. cadeia yi
Pst I
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCT
E. cadeia K ·
Bst Ε II
TGTCTGCATCTGT(A/G)GGAGACAGGGTCACCATCA(A/C)TTG
F. cadeia %
Bst Ε II
CCTCAG(C/T)GTCTGGG(A/T)CCCCAGGACAGAGGGTGACCATCTCCTGC
2. Primers de oligonucleotido para a PCR inversa (região variã vel mais regiões constantes limítrofes)
Al. Cadeia ju (sem sequências TAG)
Hind III
GGGTGGGACGAAGAAGCTTACTTAGGGAGGCAGCTCAGCAATCAC
A2. Cadeia /1 (sem sequências TAG)
Hind III
GGGTGGGACGAAGAAGCTAAGCTTGGGAGGCAGCTCAGCAATCAC
B. cadeia k
Bam Η I
GGCACTTCGGATÇÇTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGA
GCTCAGGCC
C. Cadeia Jb
Bam Η I
GTGAGGG(A/T)TGGGATCCTATGAACATTCTGTAGGGGCCACTGT
3. Primers de oligonucleõtido para a PCR inversa (regiões variáveis
Gl. Cadeia /1 (sem sequências TAG
Hind III
CACAGGAGACGAGGGGGAAAAGCTTTGGGGCTTATGCACTCCC
G2. Cadeia μ (sem sequências TAG
Hind III
CACAGGAGACGAGGGGGAAAAGCTTTGGGGCGGATGCACTCCC
ÍH. cadeia k
Bam Η I • AACAGAGGCGGATCCTCATTTCAACTGCTCATCAGATGGCGGGAAGATGAA * GAC
CM ffl ><
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Posições dos Primers para a reacção em cadeia de polimerase (PCR) de DNA de anticorpos.
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CONSTRUÇÃO DO VECTOR pFMT PARA A EXPRESSÃO E SECREÇÃO DE ANTICORPOS EM BACTÉRIAS w
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Tab. 4
Sequências das sequências Leader PI e P2 no operão do anticorpos bem como das Sequências TAG
PI
Sequência Leader da Pectatliase (Pl)
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVQLQ CATGAAATACCTCTTGCCTACGGCAGCCGCTGGCTTGCTGCTGCTGGCAGCTCAGCCGGC GATGGCGCAAGTTCAGCTGCA(G)
PstI
P2
Sequência Leader:I da Pectatliase (P2) Μ K Y L L PP <CJ,Tg T A
ACCGCTGCGGCG
ÇAGCCAAGCTTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTCCATGAAGTACTTACTGCCG Hind III
GLLLLAAQPAMAD I GGTCTCCTGCTGTTGGCGGCTCAGCCGGCTATGGCTGATATCGGATCCAGCT
EcoRV BamHI
Os nucleõtidos entre parêntesis são os nucleõtidos limítrofes do plasmídeo
As sequências Leader sintetizaram-se pela hibridação dos seguintes oligonucleõtidos:
Pl
a. 5'CATGAAATACCTCTTGCCTACGGCAGCCGCTGGCTTG3'
b. 3'TTTATGGAGAACGGATGCCGTCGGCGACCGAACGACGCAGACCGTCGAGTCGGCCGCTAC
CGCGTTCAAAGTCG5'
c. 5'CTGCTGCTGGCAGCTCAGCCGGCGATGGCGCAAGTTCAGCTGCA3'
P2
a. 5'GCCAAGCTTGAATTCATTAAAGAGGAGAAA3'
b. 5'TTAACTCCATGAAGTACTTACTGCCGACCGCTGCG3'
C.3'ACGCGGTTCCAACTTAAGTAATTTCTCCTCTTTAATTGAGGTACTTCATGAATGACGGCT
GGCGACGCCGCCCAGAGGACGACAACCGCCGAGTCGGCCGATACCGACTATAGCCTAGGT CGA5'
d. 5'GCTCAGCCGGCTATGGCTGATATCGGATCC3'
e. 5'GCGGGTCTCCTGCTGTTGGCG3'
As sequências TAG sintetizaram-se pela hibridação das seguintes sequências:
ΤΑΒ. 5 Sequências de nucleõtidos do DNA de anticorpos
a) Cadeia pesada (região variável), HuVhlys
HindIII...........
10
.........G VHSQVQLQESGPGLVR.
CTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGGAGAGCGGTCCAGGTCTTGTGAGA
PstI
30 CDR1 • P SQTL SLTCTVSGFTF S /G//Y//G/ CCTAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGTCTGGCTTCACCTTCAGCGGCTATGGT
BspMI
50 /V/ N/WVRQPPGRGLEWIG /M/ 1/ W/ G/ GTAAACTGGGTGAGACAGCGAGCTGGACGAGGTCTTGAGTGGATTGGAATGATTTGGGGT
CDR2 '60 70 /D/ G/ N /T /D /Y /N /S /A /L /K /S RVTMLVDT GATGGAAACACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGAGTGACAATGCTGGTAGACACC
90
SKNQFSLR.LSSVTAADTAVY
AGCAAGAACCAGTTCAGGGTGAGACTCAGCAGCGTGACAGCCGCCGACACCGCGGTCTAT . , SacII _100 CDR3 110
Y C A R E /R /D /Y /R /L /D /Y W GQGSLVT
TATTGTGCAAGAGAGAGAGATTATAGGCTTGACTACTGGGGTCAGGGCTCCCTCGTCACA
BanII
V S S Stop
GTCTCCTCATAAGCTTCCTTACAACCTCTCTCTTCTATTCAGCTTAA........BamHI
HindIII
b)Cadeia leve (região variável),HuVIIys HindIII........
10 GVESDIQNTQSPSSLSA
CTCTCCACAGGTGTCCACTCCGATATCGAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCC
EcoRV _CDR1 30_
SVGDRVTITC R/ A/ S/ G/ N/ 1/ Η/ N/ Y/ L
AGCGTGGGTGACAGGGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCGGTAACATCCACAACTACCTG
BstEII _ 40 50 CDR2 /A/ WYQQKPGKAPKLLIY /Y /T /T /T GCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACTACACCACCACC
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PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DE ANTICORPOS pFMT
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TABELA 7 INSERÇÃO DAS BIBLIOTECAS DE ANTICORPOS NO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO pFMT

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    Processo para a preparação de bibliotecas de anticorpos humanos, caracterizado por se isolar mRNA a partir de linfõcitos B humanos periféricos e se transformar em cDNA, se am plificar em seguida o cDNA que codifica os anticorpos através de iniciadores (Primer) apropriados utilizando a técnica PCR, se efectuar em seguida a introdução em plasmídeos de expressão apro priados e se efectuar finalmente a expressão do cDNA dos anticor pos em clonos isolados.
    - 2a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a expressão se efectuar no plasmídeo pFMT.
    - 3a Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se amplificar apenas a região variável ou um domínio constante mais a região variável, através da escolha de iniciadores (Primer) apropriados.
    - 4a Processo para o isolamento de anticorpos humanos específicos, caracterizado por se pesquisarem bibliotecas de anticorpos humanos preparados de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3 con antigenes específicos.
    A requerente reivindica as prioridades dos pedidos de patente alemães apresentados em 1 e 9 de Fevereiro de 1990, sob os N9s. P40 02 898.4 e P 40 03 881.5.
    Lisboa, 31 de Janeiro de 1991
    RESUMO
    PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE BANCOS DE GENES DE ANTICORPOS HUMANOS (BIBLIOTECAS DE ANTICORPOS HUMANOS)
    A invenção refere-se a um processo para a preparação de bibliotecas de anticorpos humanos, que compreende iso lar-se mRNA a partir de linfôcitos B humanos periféricos e se transformar em cDNA, se amplificar em seguida o cDNA que codifica os anticorpos através de iniciadores (Primer) apropriados utilizando a técnica PCR, se efectuar em seguida a introdução em plasmídeos de expressão apropriados e se efectuar finalmente a expressão do cDNA dos anticorpos em clonos isolados.
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