ES2335756T3 - Vector para silenciacion genica y metodo de silenciacion genica que lo utiliza. - Google Patents
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Abstract
Uso de un vector de silenciamiento génico para silenciar un gen diana en una planta hospedadora, donde dicho vector de silenciamiento génico comprende: un vector recombinante que incluye un promotor, una secuencia líder de ARN4 del virus del mosaico del pepino curso abajo del promotor, un gen que codifica una proteína de cubierta de una cepa del virus Y de la necrosis de patata (PVY-N) que está curso abajo de la secuencia líder, y un terminador que está curso abajo del gen, donde, con el fin de causar silenciamiento génico del gen diana específico en una planta hospedadora, una construcción génica que comprende un promotor, una secuencia del gen diana y un terminador es insertada curso abajo del terminador del vector.
Description
Vector para silenciación génica y método de
silenciación génica que lo utiliza.
\global\parskip0.930000\baselineskip
La presente invención se refiere al uso de un
vector viral para causar el silenciamiento génico (llamado vector
de silenciamiento génico aquí en lo sucesivo) y a un método de
silenciamiento génico usando el vector. Más particularmente, la
presente invención se refiere a un método de silenciamiento génico
del tipo inducido por virus, que exhibe una alta probabilidad de
incidencia de silenciamiento génico y que es hereditario según las
leyes de Mendel.
La supresión de la expresión de un gen diana
específico es una técnica prometedora no sólo en el aspecto de
investigación con el propósito del análisis de las funciones génicas
sino también para el cultivo de plantas. Como medio para ese
propósito, se conoce un método antisentido, que introduce un ADN
antisentido que tiene una secuencia de bases cuya dirección es
opuesta a la dirección del gen diana dentro de una célula para
inhibir la traducción del gen diana. Sin embargo, el método
antisentido tiene el problema de que es difícil la inhibición
completa de la producción de la proteína.
Para resolver el problema arriba mencionado
implicado en el método antisentido, recientemente se han aumentado
los estudios de silenciamiento génico. Los silenciamientos génicos
se clasifican en, uno que actúa a nivel de la transcripción de un
gen (Silenciamiento Génico Transcripcional; TGS por sus siglas en
inglés) y uno que actúa tras la transcripción (Silenciamiento
Génico Postranscripcional; PTGS). Ambos difieren del método
antisentido en que, en muchos casos, se da frecuentemente la
supresión de la expresión de genes endógenos cercana a un intervalo
del 100%. Recientemente, ha habido muchos trabajos de investigación
en PTGS; el fenómeno de la rápida descomposición de ARNm transcrito
se describe en los mamíferos, plantas y microorganismos (SCIENCE
vol. 288, 1370-1372; NATURE vol. 404,
804-808; etc.). Aunque el mecanismo de PTGS
actualmente es desconocido, el fenómeno se conoce como
Co-supresión en el campo de la biotecnología
vegetal.
Sin embargo, el problema ha sido indicado en que
la co-supresión exhibe una baja probabilidad de
incidencia de PTGS, y que se observa frecuentemente para la
inducción de PTGS que ocurre sólo en una porción del tejido.
Además, se conoce el silenciamiento génico
inducido por virus (VIGS) que usa un vector viral con el fin de
inducir eficazmente PTGS. Sin embargo, VIGS tiene los problemas que
implican el uso de virus per se como un vector y que el
silenciamiento génico no se hereda.
Los inventores de la presente invención
previamente han descrito en el documento JP
6-133783, un vector para impartir a las células de
patata resistencia a la cepa de necrosis del virus Y de la patata
(PVY-N). Los estudios posteriores se han dirigido
al descubrimiento de que el vector puede ser usado para
silenciamiento génico y completar la presente invención. Esto es,
la presente invención consiste en proporcionar el uso de un vector
de silenciamiento génico que suprime la expresión de un gen diana
específico en un hospedador.
Un vector de silenciamiento génico usado según
la presente invención es un vector recombinante que comprende una
secuencia potenciadora curso abajo del promotor y un gen que
codifica una proteína de cubierta de origen potyvirus (en adelante,
denominada ocasionalmente como "gen codificante de CP") curso
abajo del gen que codifica CP, donde es usada una construcción
génica diana específica que comprende un promotor, una secuencia del
gen diana y un terminador insertado curso abajo del terminador del
vector.
Además, el método de silenciamiento génico según
la presente invención comprende transformar una planta hospedadora
con una construcción génica obtenida insertando el gen diana dentro
del vector, suprimiendo así la expresión del gen diana en la planta
hospedadora.
El vector de silenciamiento génico según la
presente invención o el método de silenciamiento génico según la
presente invención da aproximadamente efectos inesperados tales
que:
(1) la alta probabilidad de incidencia del
silenciamiento génico puede proporcionarse incluso cuando sólo hay
una copia del gen diana;
(2) se pueden proporcionar individuos en los que
la expresión del gen diana está controlada a varios niveles
(suprimida en un intervalo de varios % a 100%) en la presente
generación;
(3) el silenciamiento génico puede ser heredado
en la progenie; y
(4) se pueden proporcionar variedades en las que
la expresión del gen diana es suprimida en un intervalo de varios %
a 100% cruzando con una variedad fija, debido a que el
silenciamiento génico se hereda conforme a las leyes de Mendel.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 es un diagrama que ilustra la
construcción del vector PVY-T/CPW.
La Fig. 2 es un diagrama que ilustra la
construcción del vector pYS415.
La Fig. 3 es un diagrama que ilustra la
construcción del vector pYS412.
La Fig. 4 es un diagrama que ilustra la
construcción del vector pYS436.
Las Figs. 5A y 5B son diagramas que ilustra la
construcción del vector pYS465.
La Fig. 6 es un diagrama que ilustra la
construcción del vector pYS466.
En aquellos diagramas, los símbolos de los
mismos son como sigue:
NPT = neomicina fosfotransferasa, BR = borde
derecho, BL = borde izquierdo, 35s-pro = promotor
35s del virus del mosaico de la coliflor, NOS-ter =
terminador de la nopalina sintetasa, Amp = gen de resistencia a
ampicilina, PVY-CP = gen de la proteína de cubierta
de PVY-T, GFP = gen GFP, GUS = gen de la
\beta-glucuronidasa, y PsDof1 = factores de
transcripción del deflector de zinc de guisante.
Más adelante, la invención se describirá en
detalle.
Los inventores de la presente invención
observaron que, en un vector GS-PVY (JP
6-133783 A) desarrollado con el fin de hacer la
patata resistente a una línea de necrosis del virus Y de la patata,
un gen incorporado alrededor de una proteína de cubierta
PVY-T en una dirección sentido es inducido para
causar silenciamiento génico en un hospedador, y encontraron que
existe un gen que codifica un potenciador y un gen que codifica una
proteína de cubierta de origen viral curso abajo de un promotor
profundamente relacionado con PTGS.
El vector GS-PVY es un vector
recombinante que tiene una secuencia líder del ARN4 del virus del
mosaico del pepino (CMV) curso abajo de un promotor y un gen que
codifica una proteína de cubierta de la cepa de necrosis del virus
Y de la patata (PVY-N) curso abajo de la secuencia
líder.
El promotor usado en el vector de silenciamiento
génico no está particularmente limitado, sino que puede ser uno
cualquiera, con tal de que pueda iniciar la transcripción de la
proteína de cubierta de origen viral. Por ejemplo, se pueden
utilizar el promotor 35S, el promotor PAL, el promotor PAL BOX.
La secuencia líder del ARN 4 en CMV se muestra
en Nitta et al., Japanese Journal of Phytopathology 54:
516-522 (1988). Además, se conoce bien que la
secuencia líder de una proteína estructural de un virus vegetal
generalmente tiene un efecto de potenciación de la expresión de
proteínas (D.E. Sleat y T.M.A Wilson, 1992, Plant Virus Genomes as
Source of Novel functions for Genetic Engineering, en Genetic
Engineering with Plant Viruses, T.M.A. Wilson y J.W. Davies ed.,
CRC Press, págs. 55-113).
Por ello, en el vector de silenciamiento génico,
no está limitada la secuencia líder del ARN 4 de CMV localizada
curso abajo del promotor del vector GS-PVY, sino que
puede ser cualquier secuencia potenciadora con tal de que pueda
activar la transcripción de la expresión de la proteína; por
ejemplo, un potenciador en el promotor 35S (una región de -90 a
-440) o se puede usar una secuencia potenciadora tal como la
secuencia TMV-\Omega.
Se conoce que la proteína de cubierta viral
tiene una composición aminoacídica específica de grupo y es el
único producto viral que tiene baja homología con otros grupos de
virus. PVY-T es un virus vegetal que pertenece a
Potyvirus. El silenciamiento génico de la presente invención se
considera como atribuible a la reacción de protección de la planta
contra la proteína de cubierta en el vector de silenciamiento génico
de la presente invención y el potenciador del mismo. Por ello,
también se pueden usar otras secuencias génicas si estas codifican
proteínas de cubierta derivadas de potyvirus que pertenecen al mismo
grupo que PVY-T y tienen altas homologías. Los
ejemplos de estos incluyen proteínas de cubierta derivadas de PVA,
PVV, PrLV, PrMoV, TEV, TVBMV, TVMV, y TWV.
Además, con el fin de aumentar la eficacia del
silenciamiento génico, la secuencia génica que codifica la proteína
de cubierta no se emplea sola, sino que se pueden organizar en
tándem una pluralidad de las mismas o diferentes secuencias.
El vector de silenciamiento génico según la
presente invención puede ser construido en base a vectores básicos
adecuados disponibles. Es preferible que el vector básico tenga un
origen de replicación que funcione en la célula hospedadora además
del promotor arriba mencionado. Además, es preferible que el vector
básico tenga un terminador y un marcador de selección apropiado tal
como resistencia a fármacos. Por ejemplo, el vector básico puede
ser fácilmente preparado insertando la secuencia líder arriba
mencionada de ARN4 de CMV y la secuencia que codifica CP de
PVY-T dentro de un vector disponible apropiado,
usando enzimas de restricción según el método convencional.
El método de silenciamiento génico se
caracteriza porque la planta hospedadora es transformada con dicho
vector de silenciamiento génico, donde el vector tiene un gen
adicional que es una diana de silenciamiento génico (en adelante,
denominado "gen diana") o un gen homólogo a un gen diana en una
dirección sentido aguas arriba o curso abajo del gen de la proteína
de cubierta arriba mencionada de origen Potyvirus.
La planta hospedadora en la que se va a causar
el silenciamiento génico por la aplicación de la presente invención
no está particularmente limitada. Hospedadores apropiados incluyen,
por ejemplo, patata y tabaco.
En la presente invención, la construcción del
gen diana que comprende un promotor, una secuencia del gen diana y
un terminador está insertada curso abajo del terminador del vector.
El gen diana no está particularmente limitado y puede ser cualquier
gen que exista en el hospedador (gen endógeno) o gen exógeno o uno
fijado. Aunque se desean los genes que codifican los mismos de
longitud total, también se pueden usar genes homólogos (por
ejemplo, aquellos que codifican una parte de la longitud total).
Cuando se usa un gen que tiene una homología, el gen más deseable
es el gen que tiene una homología superior; preferiblemente la
homología es 70% o más, más preferiblemente 80% o más. Además, con
respecto a un número de genes diana, una copia del gen puede
proporcionar suficientemente el efecto de la presente invención.
Sin embargo, para obtener un efecto más fiable, se puede usar una
pluralidad de genes, por ejemplo, en tándem. De esta manera, la
incorporación del gen diana dentro del vector de silenciamiento
génico y la transformación de la planta hospedadora con él pueden
inducir la supresión del gen diana en el hospedador.
El método de transformar una planta hospedadora
no está particularmente limitado y se puede seleccionar un método
apropiado dependiendo del tipo de planta hospedadora. Cuando el
hospedador es una célula de un planta, es preferible que
Agrobacterium tumefaciens, que tiene alta infectividad en
plantas, sea primero transformado con la construcción génica
obtenida por incorporación de un gen diana dentro del vector de
silenciamiento génico arriba mencionado, y luego, el transformante
sea inoculado en la planta hospedadora para efectuar la
infección.
Se conoce el método para transformar
Agrobacterium tumefaciens per se y se puede llevar a cabo
por, por ejemplo, un método de
congelación-descongelación (Documento Citado: G. An
et al., (1988) Binary Vectors, en Plant Molecular Biology
Manual A3, Kluwer Academic, Dordrecht págs.
1-19).
Por consiguiente, el silenciamiento génico de un
gen diana se induce en una alta probabilidad.
Además, se pueden obtener individuos en los que
la expresión de un gen diana está controlada a varios niveles
(suprimida en un intervalo de varios % a 100%).
Más aún, se confirma que el silenciamiento
génico de un gen diana inducido por el vector de silenciamiento
génico no sólo es eficaz en la presente generación en la que se
lleva a cabo la transformación, sin también se hereda en la
progenie auto fertilizada, ya que la expresión del gen diana puede
ser suprimida de forma estable y consecutivamente.
Aún más, desde que el silenciamiento inducido
del gen diana se hereda según las leyes de Mendel, la expresión del
gen diana puede ser suprimida a varios niveles, no sólo en la
progenie auto fertilizada, sino también en la progenie cruzada con
otras cepas y puede ser suprimida completamente (100%). Por ejemplo,
tal como se describe en los ejemplos de más abajo, aproximadamente
30 individuos (aproximadamente 59%) de 60 individuos de F1
suprimieron completamente la expresión de GFP usado como gen
marcador, y los 30 individuos restantes (aproximadamente 50%)
mostraron nivel de supresión de la expresión de GFP de bajo a medio,
mostrando así el efecto del silenciamiento génico.
Más adelante, la presente invención será
descrita en más detalle en forma de ejemplos. Sin embargo, los
ejemplos se proporcionan con el propósito de ilustrar la presente
invención y no se deben considerar como limitantes del alcance de
la presente invención descrita en las Reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Un vector pBI121PVY-T/CP (JP
6-133783) obtenido incorporando
PVY-T/CP dentro de un vector de expresión de
plantas p\betaI121 (fabricado por Clontech Corporation, EE.UU.) se
escindió con las enzimas de restricción HindIII y EcoRI para
proporcionar un fragmento de ADN que contiene un promotor 35S,
PVY-T/CP y el terminador Nos. Luego, el fragmento
se introdujo dentro de los sitios de restricción enzimática HindIII
y EcoRI de pUC19 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) para dar
pUC19-PVY-T/CP. El vector se
escindió con las enzimas de restricción HindIII y EcoRI para
recuperar el fragmento de ADN que contiene un promotor 35S,
PVY-T/CP y el terminador Nos. Luego, el fragmento
se hizo romo con la ADN polimerasa T4 para proporcionar un primer
fragmento romo de ADN.
Por otro lado, se escindió otro p\betaI121
PVY-T/CP con la enzima de restricción HindIII y
luego se hizo romo con la ADN polimerasa T4. El fragmento de ADN
ahora romo se ligó a pBI121 PVY-T/CP linealizado
usando ligasa T4 para proporcionar PVY-CPW en el
que el promotor 35S, PVY-T/CP, y el terminador Nos
están conectados en tándem doble.
Se construyó como sigue el vector pYS415 que
correspondía al vector p\betaI121 PVY-T/CP del
documento JP 6-133783 A con un gen GFP incorporado
en el mismo.
Primero, pYS409 que se obtuvo clonando dentro de
pUC19 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd) un promotor 35S, el gen
GFP y el terminador Nos se escindió con las enzimas de restricción
HindIII y EcoRI. Los fragmentos de ADN que contienen el promotor
35S, el gen GFP, y el terminador Nos se recuperaron y se hicieron
romos con ADN polimerasa T4 para dar fragmentos de ADN romos.
Luego, se escindió pBI121 PVY-T/CP con la enzima de
restricción EcoRI para hacerlos lineales y luego se hicieron romos
con ADN polimerasa T4. El fragmento de ADN romo anteriormente
obtenido se ligó a pBI121 PVY-T/CP romo linealizado
usando ligasa T4 para dar como resultado un vector pYS415 en el que
el promotor 35S, el gen GFP y el terminador Nos se insertaron curso
abajo del terminador Nos en pBI121 PVY-T/CP.
Se construyó como sigue un vector pYS412 que
corresponde al vector PVY-T/CPW construido en (1) de
más arriba dentro del cual se incorporó un gen GFP.
Primero, en el mismo método que en el caso de
pYS415 descrito en (2) de más arriba, se escindió con las enzimas
de restricción HindIII y EcoRI pY409 que corresponde a pUC19
(fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) que tiene un promotor 35S,
el gen GFP, y el terminador Nos clonados en el mismo. Los fragmentos
de ADN que contienen el promotor 35S, el gen GFP, y el terminador
Nos se recuperaron y se hicieron romos con la ADN polimerasa T4
para proporcionar fragmentos de ADN romos. Luego, el
PVY-T/CPW obtenido en (1) de más arriba se escindió
con la enzima de restricción EcoRI para hacerlos lineales y luego
romos con la ADN polimerasa T4. El fragmento de ADN romo
anteriormente obtenido se ligó al PVY-T/CPW romo
linealizado usando ligasa T4 para dar como resultado el vector
pYS412 en el que el promotor 35S, el gen GFP y el terminador Nos se
insertaron curso abajo de 3' del terminador Nos en
PVY-T/CPW.
Los vectores transformantes vegetales arriba
construidos pYS415 y pYS412 se introdujeron de forma separada
dentro de la cepa LBA4404 (Hoekema et al., Natura 303:
179-180, 1983) de Agrobacterium tumefaciens
por un método de congelación-descongelación para
llevar a cabo la transformación. Posteriormente, la selección por
resistencia a kanamicina dio colonias diana en las que pYS415 o
pYS412 se introdujo dentro de la cepa LBA4404 de Agrobacterium
tumefaciens.
Los niveles de tabaco recogidos a partir de
hojas de la planta del tabaco (Petit Havana SR1) cultivada durante
1,5 meses en un invernadero se esterilizaron superficialmente con
alcohol etílico al 70% e hipoclorito sódico al 1%, y se lavaron con
agua esterilizada, seguido de la preparación de discos de hoja que
tienen un diámetro de aproximadamente 6 mm. Los discos de hoja
junto con aproximadamente 108 células de Agrobacterium
tumefaciens transformado con el vector de la presente invención
tal como se describe más arriba se co-cultivaron
durante 48 horas en un medio líquido de Linsmaier y Skoog que
consiste en sales inorgánicas y 30 g/l de sacarosa.
A partir de entonces, los discos de hoja se
lavaron con agua esterilizada que contiene 250 mg/l de cefotaxima
para lavar las bacterias, y luego se colocaron en un medio de
Linsmaier y Skoog inducido que contiene sales inorgánicas, 0,3 mg/l
de ácido indolacético, 10 mg/l de 2ip (6-r,
r-dimetilallil-amino) Purina, 100
mg/l de kanamicina, 250 mg/l de cefotaxima, y agar al 0,9%. Después
de aproximadamente 1 mes, los tallos y las hojas que mostraban
resistencia a kanamicina se pusieron en un medio inducido por raíces
de Linsmaier y Skoog que contenía sales inorgánicas, 30 g/L de
sacarosa, 100 mg/L de kanamicina, 250 mg/L de cefotaxima y 0,9% de
agar. Después de cultivar durante aproximadamente 1 mes, los
transformantes que desarrollaron raíces se cultivaron en un
invernadero de sistema cerrado. La técnica arriba mencionada se
llevó a cabo según el método de Komari et al. (Ther. Appl.
Genet. 77, 547-552, 1999).
La expresión del gen GFP se analizó por
detección de la fluorescencia emitida por el transformante. Para
medir la fluorescencia, se usó un Molecular Imager FX fabricado por
BIO-RAD Laboratories, Inc. y el análisis se llevó a
cabo usando un sistema de análisis de imágenes AQUACOSMOS fabricado
por Hamamatsu Photonics Co., Ltd.
La fluorescencia de GFP a partir del tabaco
transformado transfectado con la construcción del vector arriba
mencionada pYS415 se midió por el método arriba mencionado. Como
resultado, se seleccionó una variedad de tabacos transformados,
dondelos tabacos varían de individuos que no emiten fluorescencia
verde hasta todos los individuos que emiten fluorescencia verde de
forma intensa. Además, la inoculación del virus
PVY-T permitió la selección de individuos que no
mostraron síntomas de enfermedad de PVY-T, es decir,
individuos inmunizados a partir de sólo aquellos individuos que no
emitían fluorescencia verde. La relación entre la expresión de GFP
y la resistencia a PVY-T se muestra en la Tabla 1
más abajo. Los resultados indican que en el tabaco transformado que
exhibe resistencia a PVY-T, la expresión de GFP está
suprimida por silenciamiento génico. Esto indica que el vector de
la presente invención suprime la expresión del gen GFP introducido
en incidencias altas.
Véase que la resistencia a PVY-T
del tabaco transformado se examinó según el ensayo descrito en el
párrafo de JP- 6-133783 A. Esto es, se inocularon
partículas de virus purificadas de PVY-T al tabaco
Bright Yellow No. 4 o Burley 21. Tras confirmar el síntoma de
necrosis tras 2 semanas, las hojas infectadas se ensayaron,
diluyeron con tampón PBS-T (tampón fosfato 0,02 M) 2
a 10 veces el peso de las hojas en fresco, y luego se
homogeneizaron. El homogenizado se inoculó a cada transformante. El
transformante sometido al ensayo se aclimató con uña de 12 cm y se
cultivó en un invernadero de sistema cerrado a aproximadamente 21ºC.
Tras 2 o 3 semanas de aclimatación, se realizó la inoculación
artificial. La inoculación artificial se llevó a cabo cubriendo 5
hojas de las hojas superiores a medias de la planta de ensayo con
una mezcla de malla de carborundo 600 y una concentración
predeterminada de homogenizado de virus. Tras la inoculación, se
examinó la presencia o ausencia de síntomas de necrosis con un
tiempo de 1 semana a 2 meses. Además, se examinó la presencia o
ausencia de partículas virales usando ELISA para ensayar el grado de
la resistencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Entre los tabacos transformados del Ejemplo 1,
se seleccionaron los individuos (GBS18, GBS19) que mostraron
resistencia a PVY-T y suprimieron completamente la
expresión de GFP debido a silenciamiento génico. Tras
auto-fertilizar los tabacos transformados, los
individuos (GBS18-13, BGS19-7,
GBS20-9) que muestran resistencia a
PVY-T y exhiben expresión suprimida de GFP se
seleccionaron a partir de la progenie
auto-fertilizante resultante (R1). Nótese que el
silenciamiento génico se indujo en un estado temprano para la línea
GBS19 mientras que las líneas GBS18 y GBS20 son líneas para las que
el silenciamiento génico fue inducido por la edad.
Lo siguiente, GBS18-13 y
GBS19-7 seleccionados como se describe más arriba se
cruzaron con tabaco transformado
(GBP-7-11) obtenido introduciendo y
fijando el gen GFP dentro del tabaco (Petit Habana SR1) de forma que
GFP puede expresarse en un índice alto. Las semillas F1
seleccionadas se esterilizaron superficialmente con alcohol etílico
al 70% (durante varios segundos) e hipoclorito sódico al 1% (5
minutos), se lavaron con agua esterilizada por un método
convencional, y se diseminaron en un medio de Linsmaier y Skoog,
seguido de medida de la fluorescencia verde de GFP con el tiempo
usando un Molecular Imager FX fabricado por BIO-RAD
Laboratories, Inc. Las condiciones de cultivo fueron las
siguientes.
Condiciones de luz: Irradiado bajo una lámpara
fluorescente blanca de 3.000 a 5.000 Lux durante 24 horas.
Temperatura de cultivo: 23ºC a 25ºC.
Nótese que la semilla
auto-fertilizante y la semilla híbrida F1 del tabaco
se recolectaron como sigue. Las semillas
auto-fertilizantes se pueden obtener fácilmente
cubriendo la inflorescencia del tabaco con una bolsa de papel con
el fin de evitar la mezcla de pólenes. Además, las semillas híbridas
F1 se pueden obtener castrando individuos a hibridar con individuos
objeto antes del cruce mientras se tiene cuidado de forma que los
pólenes de otros individuos no se mezclen, atacando los pólenes de
otros individuos que se hayan escindido de los estigmas de un
pistilo y luego cubriendo la inflorescencia con otra bolsa.
Normalmente, tras 4 o 5 semanas de floración, las cápsulas se
vuelven marrones y las semillas maduran. Los tabacos recombinantes
se cultivan en un sistema invernadero totalmente cerrado controlado
de 20ºC a 25ºC, y luego, se recolectan las semillas
auto-fertilizantes y las semillas híbridas F1 del
tabaco.
Como resultado, en todos los híbridos F1 fijados
(GFP7-11 x SR1cont.) entre el tabaco transformado
(amarillo) del cual se expresa GFP en un alto índice y el tabaco no
transformado (rojo), se observó expresión de GFP (naranja). Por el
contrario, al cruzar con GBS18-13,
GBS19-7 y GBS20-9, respectivamente,
aproximadamente 30 individuos de 60 individuos de F1
(aproximadamente el 50%) mostraron expresión de GFP completamente
suprimida (rojo), y los 30 individuos restantes (50%) mostraron
resultados en los que la expresión de GFP se suprimió a niveles de
medio a bajo (naranja a rojo). Además, el examen de la resistencia a
PVY-T indicó que todos los individuos en los que la
expresión de GFP estaba completamente suprimida (individuos rojos)
mostraron resistencia a PVY-T. En el día 8 a partir
de la siembra aséptica, aproximadamente la mitad de
GBS19-7xGFP7-11 (F1) estaba
completamente suprimida para la expresión de GFP (enrojecimiento),
lo que muestra un resultado tal que el silenciamiento génico se
indujo como procedimiento de la edad tal como las progenies
auto-fertilizantes de GBS18-13 y
GBS20-9.
Los resultados de más arriba indican que el
efecto de silenciamiento génico inducido en el tabaco por el vector
GS-PVY también está mantenido en la progenie
auto-fertilizante (R1) y además es exitoso en la
generación F1 obtenida por cruzamiento de la misma con otras
variedades de tabaco.
\vskip1.000000\baselineskip
Un vector pYS436, que corresponde al vector
PVY-T/CPW construido en (1) más arriba del Ejemplo 1
y tiene un gen de \beta-glucuronidasa (GUS)
incorporado al mismo se construyó como sigue.
Primero, pBI221 que corresponde a pUC19
(fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) que tiene el promotor 35S,
el gen GUS, y el terminador Nos clonado en el mismo se escindió con
enzimas de restricción HindIII y EcoRI. Los fragmentos de ADN que
contienen el promotor 25S, el gen GUS, y el terminador Nos se
recuperaron y se hicieron romos con la ADN polimerasa T4 para
obtener fragmentos de ADN romos. Luego, PVY-T/CPW se
escindió con la enzima de restricción EcoRI para hacerlo lineal y
luego se hizo romo con la ADN polimerasa T4. La ligación del
fragmento de ADN romo previamente obtenido al
PVY-T/CPW romo linealizado con ligasa T4 dio como
resultado un vector pYS436 en el que el promotor 35S, el gen GUS y
el terminador Nos se insertaron curso abajo del extremo 3' del
terminador Nos en PVY-T/CPW (véase Fig. 4).
El vector de transformación vegetal arriba
construido pYS436 se introdujo dentro de la cepa LBA4404 (Hoekema
el al., Nature 303; 179-180, 1983) de
Agrobacterium tumefaciens para llevar a cabo la
transformación en el mismo método que el Ejemplo 1. Posteriormente,
la selección por resistencia a kanamicina dio colonias objeto en
las que pYS436 se introdujo dentro de la cepa LBA4404 de
Agrobacterium tumefaciens.
El vector pYS436 obtenido se transformó dentro
de discos de hojas de la planta del tabaco (Petit Habana SR1)
cultivada en un invernadero durante 1,5 meses, en el mismo método
que en el Ejemplo 1.
Primero, se examinó la expresión del gen GUS en
Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) en los que el gen GUS se
introdujo por el vector pYS436. Como control, se usó
Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) transformado con el
vector pBI121 (Clontech Corporation, U.S.A.) que tiene un gen GUS
incorporado en el mismo. Como resultado, ambos Agrobacterium
tumefaciens en el que se introdujo pYS436 y Agrobacterium
tumefaciens en el que se introdujo pBI121 mostraron color azul,
que indica que en Agrabacterium, ambos pYS436 y pBI121
expresan el gen GUS.
Luego, se examinaron las expresiones de un gen
GUS, para tabacos transformados dentro de los cuales se introdujeron
pYS436 y pBI121 usando el Agrobacterium arriba mencionado.
Como resultado, los discos de hoja del tabaco transformado en los
que se introdujo pBI121, como control, mostraron color azul,
mientras que los discos de hoja del tabaco transformado dentro de
los cuales se introdujo pYS436 no mostraron color azul. Los
resultados se enumeran en la Tabla 2.
Los resultados de más arriba indican que en el
tabaco transformado dentro del cual se introduce pYS436, la
expresión del gen GUS está suprimida por silenciamiento génico.
\vskip1.000000\baselineskip
Primero, un vector pYS465, que corresponde al
vector PVY-T/CPW construido en (1) más arriba del
Ejemplo 1 y tiene un promotor 35S, un factor de transcripción en
dedo de guisante de zinc PsDof1, y el terminador Nos incorporado en
el mismo, se construyó como sigue.
PGEX-5X-1 que
tiene PsDof1 incorporado en el mismo (Documento Citado: Plant
Biotechnology, 19(4), 251-260 (2002)) se
escindió con enzimas de restricción SalI y Xho1, y se recuperó un
fragmento que contiene el gen PsDof1. Este se hizo romo con ADN
polimerasa T4 para obtener el fragmento de ADN romo.
Luego, se escindió pCaMCN (fabricado por
Pharmacia AB) con SalI para separar el gen CAT, y se hizo romo con
ADN polimerasa T4. El fragmento de ADN romo resultante se conectó al
fragmento del gen PsDof1 previamente obtenido usando ligasa T4 para
obtener un vector pCaMCN-PsDof1 en el que el
promotor 35S se conectó aguas arriba del fragmento del gen PsDof1 y
el terminador Nos se conectó curso abajo del mismo.
Luego, se escindió pCaMCN-PsDof1
con XbaI y EcoRI, y luego, se recuperó un fragmento génico en el que
el promotor 35S estaba conectado aguas arriba del fragmento génico
PsDof1 y el terminador Nos estaba conectado curso abajo del mismo.
Esto se hizo romo con ADN polimerasa T4 para obtener un fragmento de
ADN romo.
Luego, el pBI101.2 (Toyobo) al que se ha
conectado el gen GUS se escindió con XbaI y EcoRI para separar el
gen GUS y se hizo romo con ADN polimerasa T4. El fragmento de ADN
romo resultante se conectó al fragmento génico previamente obtenido
en el que el promotor 35S estaba conectado aguas arriba del
fragmento del gen PsDof1 y el terminador Nos estaba conectado curso
abajo del mismo usando ligasa T4, obteniendo de este modo un vector
pBI101.2-PsDof1.
Luego, pBI101.2-PsDof1 se
escinde con HindIII y EcoRI para recuperar el fragmento génico en el
que el promotor 35S estaba conectado aguas arriba del fragmento
génico PsDof1 y el terminador Nos estaba conectado curso abajo del
mismo, y este fragmento se hizo romo con ADN polimerasa T4 para
obtener un fragmento de ADN romo.
Luego, el PVY-T/CPW obtenido en
(1) del ejemplo 1 se escindió con la enzima de restricción EcoRI y
se hizo romo con ADN polimerasa T4. El fragmento de ADN romo
previamente obtenido se conectó al PVY-T/CPW romo
linealizado con ligasa T4, dando como resultado por ello un vector
pYS465 en el que el promotor 35S, el gen PsDof1 y el terminador Nos
fueron insertados curso abajo del extremo 3' del terminador Nos en
PVY-T/CPW.
Además, se construyó un vector pYS466 en el que
el promotor PAL, el factor de transcripción en dedo de guisante de
zinc PsDof1, y el terminador Nos fueron incorporados dentro del
vector PVY-T/CPW.
pUC18 que tiene el promotor repetidor de BOX 5 y
el gen CAT incorporados en el mismo (JP 2000-245463
A) se escindió con enzimas de restricción HindIII y BamH1 para
recuperar el fragmento de ADN del promotor PAL.
Luego, pBI101.2-PsDof1 se
escindió con HindIII y BamH1 para separar el promotor 35S, y el
fragmento resultante se conectó al promotor PAL previamente
obtenido con ligasa T4, obteniendo así un vector
pBI101.2-PAL-PsDof1. Además, el
pBI101.2-PAL-PsDof1 se escindió con
HindIII y EcoRI para recuperar un fragmento que contenía el
promotor PAL, el gen PsDof1, y el terminador Nos, y el fragmento
resultante se hizo romo con ADN polimerasa T4.
Luego, PVY-T/CPW se escindió con
enzima de restricción EcoRI y se hizo romo con ADN polimerasa T4. El
PVY-T/CPW romo linealizado se conectó al fragmento
de ADN romo previamente obtenido con ligasa T4, dando por ello un
vector pYS466 en el que el promotor PAL, el gen PsDof1, y el
terminador Nos fueron insertados curso abajo del extremo 3' del
terminador Nos en PVY-Y/CPW. (véase Fig. 6).
Los vectores transformantes vegetales arriba
construidos pYS465 y pYS466 se introdujeron dentro de la cepa
LBA4404 (Hoekema et al., Natura 303; 179-180,
1983) de Agrobacterium tumefaciens para llevar a cabo la
transformación en el mismo método que en el Ejemplo 1.
Posteriormente, se llevó a cabo la selección por kanamicina,
obteniendo con ello colonias diana que los que o pYS465 o pYS466
fueron introducidos dentro de la cepa LBA4404 de Agrobacterium
tumefaciens.
Los vectores obtenidos pYS465 y pYS466 se
transformaron dentro de discos de hoja de la planta del tabaco
(Petit Habana SR1) cultivadas en un invernadero durante 1,5 meses,
en el mismo método que en el Ejemplo 1.
La observación de los cambios morfológicos del
tabaco transformado con el vector pYS 465 p pYS466 indicaron que
los transformantes pYS465 mostraron una tendencia a crecimiento
inicial retardado. Por otro lado, algunos de los transformantes
pYS466 mostraron anormalidad morfológica tal como formación de
arrugas sobre la superficie de las hojas y encogimiento de toda la
hoja. Esto se considera atribuible a la incidencia del
silenciamiento génico de un factor de transcripción que tiene una
homología con el factor de transcripción PsDof1.
Tal como se describe más arriba en detalle,
según la presente invención, se pueden proporcionar efector
remarcables tales como conseguir silenciamiento génico de un gen
diana específico en un hospedador.
Claims (6)
1. Uso de un vector de silenciamiento génico
para silenciar un gen diana en una planta hospedadora, donde dicho
vector de silenciamiento génico comprende:
un vector recombinante que incluye
un promotor,
una secuencia líder de ARN4 del virus del
mosaico del pepino curso abajo del promotor,
un gen que codifica una proteína de cubierta de
una cepa del virus Y de la necrosis de patata
(PVY-N) que está curso abajo de la secuencia líder,
y
un terminador que está curso abajo del gen,
donde, con el fin de causar silenciamiento
génico del gen diana específico en una planta hospedadora, una
construcción génica que comprende un promotor, una secuencia del gen
diana y un terminador es insertada curso abajo del terminador del
vector.
2. El uso según la reivindicación 1, donde dicho
promotor es seleccionado del grupo que consiste en promotor 35S,
promotor PAL y promotor PAL BOX.
3. El uso según la reivindicación 1, donde una
pluralidad de las proteínas de cubierta es incorporada para
suprimir la expresión del gen diana más fuertemente.
4. El uso según la reivindicación 1, donde la
expresión del gen diana es suprimida, y la supresión es mantenida
de forma estable no sólo en la presente generación de transformantes
sino también en la progenie auto-fertilizante.
5. El uso según la reivindicación 4, donde dicho
transformante además es cruzado con otra planta para alcanzar una
generación híbrida, y el silenciamiento génico del gen diana es
mantenido en la generación híbrida.
6. El uso según la reivindicación 1, donde la
planta hospedadora es tabaco.
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