WO2003097841A1

WO2003097841A1 - Vecteur de silençage genique et procede de silençage genique utilisant ce vecteur

Info

Publication number: WO2003097841A1
Application number: PCT/JP2003/006328
Authority: WO
Inventors: Keisuke Kasaoka; Yasuhito Saito; Shigeru Kuwata
Original assignee: Japan Tobacco Inc.
Priority date: 2002-05-22
Filing date: 2003-05-21
Publication date: 2003-11-27
Also published as: PT1507009E; ES2335756T3; JPWO2003097841A1; DK1507009T3; EP1507009B1; JP4361858B2; DE60330140D1; EP1507009A1; ATE449182T1; AU2003235377A1; EP1507009A4

Description

明細書

ジーンサイレンシング用べクターおよびこれを用いたジーンサイレンシング方法

技術分野

本発明はジーンサイレンシングを生じさせるために使用できるウイノレスベタターおよび該ベクターを用いたジーンサイレンシング方法に関する。より詳細に言えば、ジーンサイレンシングの発生確率が高く、かつメンデルの法則に従った遺伝をするウィルス誘導型ジーンサイレンス方法に関するものである。

背景技術

特定の標的遺伝子の発現を抑制することは、遺伝子機能の解析を目的とした研究的側面のみならず、植物の品種改良のための手段としても有望な手法である。そのための手段として、標的遺伝子とは逆向きの塩基配列を有するアンチセンス

D N Aを細胞に導入して、標的遺伝子の翻訳を阻害するアンチセンス法が知られている。し力、し、アンチセンス法では、タンパク質の産生を完全に抑制することが困難であるという問題があった。

上記アンチセンス法の問題を解決するために、近年、ジーンサイレンシングの研究が活発になっている。ジーンサイレンシングは、遺伝子の転写レベルで作用するもの（ T r a n s c r i p t i o n a l e n e S i l e n c i n g ; T G S ) と、転写後に作用するもの（ P o s t T r a n s c r i p t i o n a l ¾J e n e S i l e n c i n g ; P T G S ) とに分類されるが、その何れにおいても、殆どの場合に 1 0 0 %の範囲に近い内在性遺伝子発現の抑制がしばしば起きる点でアンチセンス法とは異なっている。最近は P T G S に関する研究報告が多く、転写された m R N Aが急速に分解される現象が哺乳動物、植物および微生物で報告されている（ S C I E N C E v o l . 2 8 8， 1 3 7 0 - 1 3 7 2， N A T U R E v o l . 4 0 4 , 8 0 4 - 8 0 8 等）。 P T G S のメカニズムは現在も不明であるが、この事象は植物バイオの分野においてコ ' サブレッシヨン（ C o — S u p p r e s s i o n ) として知られている。

し力、し、コ · サブレッシヨンでは P T G S が起こる確率が低く、あるいは組織の一部のみでしか誘導されないということがたびたび起きるという問題が指摘されている。

また、 P T G S を効率的に誘導するためにウィルスベクタ一を用いるウィルス誘導型ジーンサイレンシング ( V i r u s — i n d u c e d g e n e s ι 1 e n c i n g ; V I G S ) が知られている。し力、し、 V I G S は、ウィルスそのものをベクターとしていることとジーンサイレンスが遺伝しないという問題が指摘されている。

本願発明の発明者等は、先に特開平 6 — 1 3 3 7 8 3 号において、ジャガイモ Y ゥイノレスえそ系統 ( PVY-T) に対する耐性を付与するためのベクターを開示した。その後の研究により、このべクターをジーンサイレンシングに使用できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、宿主における特定の標的遺伝子の発現を抑制するジーンサイレンシング用ベタターおよびジーンサイレンシング方法を提供するものである。

発明の開示

本発明によるジーンサイレンシング用ベクターは、プロモ一ターの下流にェンハンサー配列と、その下流にポティウイルス（ P o t y v i r u s ) 由来のコートタンパク質（以下「 C P」ということもある）をコードする遺伝子とを有する組換えべクターであって、 C P をコードする遺伝子の上流あるいは下流に、宿主植物においてジーンサイレンシングを生じさせるべき特定の標的遺伝子あるいは該標的遺伝子と相同な遺伝子配列をセンス方向に揷入したことを特徴とするものである。

また本発明によるジーンサイレンシング方法は、前記べクターに前記標的遺伝子を揷入して得られた遺伝子構築物により宿主植物を形質転換することで、前記宿主植物における前記標的遺伝子の発現を抑制することからなる。

本発明のジーンサイレンシング用べクターあるいは本発明のジーンサイレンシング方法は、

( 1 ) 標的遺伝子数が 1 コピーであっても、ジーンサイレンシングの発生確率が高い。

( 2 ) 当代で標的遺伝子の発現が多様なレベルで調整 (数％〜 1 0 0 %の範囲で抑制）された個体を得ることがで含る。

( 3 ) ジーンサイレンシングが後代にも遺伝する。

( 4 ) メンデルの法則に基づいて遺伝するため、固定品種との交配により数。/。〜 1 0 0 %の範囲で標的遺伝子の発現が抑制される品種を容易に得ることができる。

という予期しない効果をもたらした。

図面の簡単な説明

図 1 は、 P V Y— T ■ C P Wベクターの構築を示す図である。

図 2 は、 p Y S 4 1 5ベクターの構築を示す図である。図 3 は、 p Y S 4 1 2ベクターの構築を示す図である。図 4 は、 p Y S 4 3 6ベクターの構築を示す図である。図 5 Aおよぴ図 5 B は、 p Y S 4 6 5ベクターの構築を示す図である。

図 6 は、 p Y S 4 6 6ベクターの構築を示す図である。これらの図において、図中の略号は次の通りである： N P T =ネィマイシンホスホトランスフエレース、 B R =右ボーダ一、 B L =左ボーダー、 3 5 s — ； r o =カリフラワーモザイクウイノレス 3 5 s プロモーター、 N O S — t e r = パリン合成酵素のターミネータ一、 A m p =アンピシリン耐性遺伝子、 P V Y— C P = P V Y— Tのコートタンパク質遺伝子 G F P = G F P遺伝子、 G U S = j3 ダルクロニダーゼ遺伝子 P s D o f 1 =エンドゥ Z i n c f i n g e r 転写因子。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明者らは、ジャガイモを、ジャガイモ Y ウィルスえそ系統に対して抵抗性にするために開発された G S — P V Yベクタ一（特開平 6 — 1 3 3 7 8 3 号）の P V Y— T コートタンパク質の周辺にセンス方向に組み込まれた遺伝子のジーンサイレンスが誘導されることに注目し、プロモーターの下流に存在するェンハンサーをコードする遺伝子とウィルス由来のコートタンパク質をコードする遺伝子が P T G S に強く関与していることを見出した。

G S — P V Yベクターは、プロモーターの下流にキユウリモザイクウィルス（ C MV ) の R N A 4 におけるリーダー配列と、その下流にジャガイモ Yウィルスえそ系統（ P V Y—

T ) のコートタンパク質をコードする遺伝子とを有する組換えベクターである。本発明のジーンサイレンシング用べクターで用いられるプ口モーターは、特に限定されるものではなく、ウィルス由来のコートタンパク質の転写を開始できるものであればよい。たとえば、 3 5 Sプロモーター、 P A Lプロモーター、 P A L B O Xプロモーター等が利用できる。

C M Vにおける R N A 4 のリーダー配列は、新田ら（ 1 9 8 8 ) 日本植物病理学会報 5 4 : 5 1 6 — 5 2 2 に示されている。また、一般的に、植物ウィルスの構造タンパク質のリーダー配列が、タンパク質の発現を増強する作用をもっていることは良く知られている（ D . E . S l e a t a n d T . M . A . W i l s o n , 1 9 9 2 , P l a n t V i r u s G e n o m e s a s S o u r c e o f N o v e l f u n c t i o n s f o r G e n e t i c E n g i n e e r i n g , I n G e n e t i c E n g i n e e r i n g w i t h P l a V i r u s e s , T . M . A . W i l s o n a n d J . W . D a v i e s e d . ， C R C P r e s s , p p 5 5 — 1 1 3 ) 。

したがって、 G S — P V Yベクターのプロモーターの下流に配置された C M Vの R N A 4 におけるリーダー配列は、本発明のジーンサイレンスベクターにおいては、これに限定されるものではなく、タンパク質発現の転写を活性化させるェンハンサー配列であればよく、たとえば、 3 5 S プロモータ一中のェンハンサー（一 9 0 〜一 4 4 0 の領域）や T M V— オメガ配列のようなェンハンサー配列が使用できる。

ウィルスのコートタンパク質は、グループ特異的なアミノ酸組成を持っており、他のウィルスグループとは配列の相同性が低い唯一のウィルス産物であることが知られている。 P V Y— Tは、ポティウィルス（ P o t y v i r u s ) に属する植物ウィルスである。本発明のジーンサイレンスは、植物が本発明のジーンサイレンスべクター中のコートタンパク質とそのェンハンサーに対する防御に起因していると考えら得る。したがって、 P V Y— T と同一のグループに属し、相同性の高いポティウィルス由来のコートタンノ、。ク質、たとえば、 P V A , P V V , P r L V , P r M o V、 T E V , Τ V Β Μ V， Τ V Μ V , T W V由来のコートタンパク質をコードする遺伝子配列を使用することも可能である。

また、ジーンサイレンスの効率を高めるため、コートタンパク質をコードする遺伝子配列はシングルではなく、複数の同種あるいは異種配列をタンデムに配置してもよい。本発明のジーンサイレンス用ベクターは、入手可能な適切なベクターを基礎にして構築することができる。この基礎になるべクターは、上記プロモーターの他に宿主細胞内で機能する複製開始点を有し、また、ターミネータおよび薬剤耐性のような適当な選択マーカーを有することが好ましい。たとえば、入手可能な適切なベクターに、上記 C M Vの R N A 4 におけるリーダー配列おょぴ P V Y— Tの C P をコードする配列を、常法により制限酵素を駆使して揷入することで容易に調製することができる。

本発明のジーンサイレンス方法は、前述のジーンサイレンス用ベクターのポティウイノレス（ P o t y v i r u s ) 由来のコートタンパク質をコードする遺伝子の上流あるいは下流にジーンサイレンシングの標的とする遺伝子（以下「標的遺伝子」という）あるいは該標的遺伝子と相同性のある遺伝子をセンス方向で組込んだベクターを用いて宿主植物を形質転換することを特徴とするものである。

本発明を適用してジーンサイレンシングを生じさせるべき宿主植物は、特に限定されない。適切な宿主には、例えばジャガイモ、タノコ等が含まれる。

本発明においては、ジーンサイレンシングの標的遺伝子、即ち、宿主において遺伝子発現を抑制すべき遺伝子を、ジーンサイレンシング用ベクターのポティウイノレス由来 C P の上流あるいは下流に連結する。この標的遺伝子は特に限定されず、宿主の中に存在する如何なる遺伝子（内在性遺伝子）や外来性遺伝子であっても固定化しているものであってもよい。これらの遺伝子は全長をコードするものが望ましいが相同性を有するもの（たとえば、全長の一部分をコードするもの）を用いてもよい。相同性を有する遺伝子を用いる場合、相同性は高いものが望ましく、好ましくは 7割以上、より好ましくは 8割以上の相同性である。また、標的遺伝子数は 1 コピ一でも十分発明の効果を得られるが、より確実にするため複数個、たとえばタンデム、としてもよい。このように、標的遺伝子を本発明のジーンサイレンシング用べクターに組み込み、宿主植物を形質転換することにより、宿主における標的遺伝子の抑制を誘導することができる。

本発明において、宿主植物を形質転換する方法は特に限定されず、宿主植物の種類に応じて適切な方法を選択すればよい。宿主細胞が植物であるときには、まず、植物に対して強力な感染力を有するァグロバクテリゥム · ッメファシエンス

( A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c ι e n s ; を、上記ジーンサイレンシング用ベクターに標的遺伝子を導入した遺伝子構築物で形質転換し、これを宿主植物に接種して感染させる方法が好ましいが、これに限定されるものではない。ァグロパクテリゥム ■ ッメファシエンスの形質転換方法自体は公知であり、例えば凍結融解法（文献： G . A n e t a 1 . , ( 1 9 8 8 ) B i n a r y V e c t o r s ， I n P l a n t M o l e c u l a r B i o l o g y M a n u a l A 3 , K 1 u w e r A c a d e m i c， D o r d r e c h t . 1 - 1 9 ) により行うことができる。本発明によれば、標的遺伝子のジーンサイレンシングが高い確率で誘導される。

また、本発明によれば、標的遺伝子の発現が多様なレベルで調整（数％〜 1 0 0 °/₀の範囲で抑制）された個体を得ることができる。

さらにまた、本発明によるジーンサイレンシング用べクタ一を用いて誘導された標的遺伝子のジーンサイレンシングは、形質転換された当代だけでなく自殖後代でも遺伝することが認められ、標的遺伝子の発現を安定的且つ永続的に抑制することが可能である。

更にまた、誘導された標的遺伝子のジーンサイレンシングは、メンデルの法則に合致して遺伝するため自殖後代だけでなく、他の系統との交配によっても、標的遺伝子の発現を種々のレベルで抑制することができ、完全に（ 1 0 0 。/₀ ) 抑制することも可能である。その一例として、後述の実施例で示すように、 F 1 の 6 0個体中の約 3 0個体（約 5 0 % ) カマーカー遺伝子として用いた G F P発現を完全に抑制し、残りの 3 0個体（約 5 0 % ) は G F P発現が低程度から中程度に発現を抑制される結果となり、ジーンサイレンシングの効果が示された。

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を例示する目的で提供するものであり、特許請求の範囲に記載された発明を限定するものではなレヽ。

実施例 1 ： G F P遺伝子をマーカーとした実験 (当代における外来性遺伝子の抑制）く材料および方法 >

I . ベクターの作製

( 1 ) P V Y - T · C P Wベクターの構築：図 1 参照植物発現ベクター p B I 1 2 1 (米国クローンテック社製）に P V Y — T · C P を組込んだベクター p B I 1 2 1 P V Y - T - C P (特開平 6 — 1 3 3 7 8 3 号）を、制限酵素 H i n d I I I および E c o R I で切断して、 3 5 S プロモーター、 P V Y— Τ · C Pおよび N o s ターミネータを含む D N A断片を得た。この断片を p U C 1 9 (宝酒造株式会社製）の制限酵素部位 H i n d I I I および E c o R I 部位に導入して、 p U C 1 9 - P V Y— T ' C P を得た。このべクタ一を制限酵素 H i n d I I I および E c o R I で切断し、 3 5 Sプロモーター、 P V Y— T · C Pおよび N o s ターミネータを含む D N A断片を回収し、 T 4 D N Aポリメラーゼにより平滑末端として、第一の平滑末端 D N A断片を得た。

一方、もう一つの p B I 1 2 1 P V Y— T · C Pを制限酵素 H i n d i I I で切断した後、 T 4 D N Aポリメラーゼにより平滑末端とした。この線形化された p B I 1 2 1 P V

Y— T ■ C P に先に得られた平滑末端 DNA断片を T 4 リガ一ゼにより連結して、 3 5 S プロモーター、 P V Y— T ' C P および N o s ターミネータが二重タンデムで連結された P V

Y— C P Wを得た。

( 2 ) p Y S 4 1 5ベクターの構築：図 2参照

次のようにして、特開平 6 — 1 3 3 7 8 3 号の ρ Β Ι 1 2 1 P V Y - T ■ C Pベクターに G F P遺伝子が組込まれている p Y S 4 1 5ベクターを構築した。

先ず、 p U C 1 9 (宝酒造株式会社製）に 3 5 S プロモーター、 G F P遺伝子および N o s ターミネータがクローェングされている： Y S 4 0 9 を、制限酵素 H i n d I I I および E c o R I で切断した。 3 5 S プロモーター、 G F P遺伝子および N o s ターミネータを含む D N A断片を回収し、これを T 4 D N Aポリメラーゼにより平滑末端とすることにより、平滑末端 D N A断片を得た。次に、 p B I 1 2 1 P V Y 一 T · C P を制限酵素 E c o R I で切断して線形にした後、 T 4 D N Aポリメラーゼで平滑末端とした。この線形化された平滑末端の！） B I 1 2 1 P V Y - T · C P に、先に得られた平滑末端 D N A断片を T 4 リガーゼで連結することにより、 p B I 1 2 1 P V Y— T ' C P における N o s ターミネータの下流に、 3 5 Sプロモーター、 G F P遺伝子および N o s ターミネータが挿入されたベクター p Y S 4 1 5 を得た。

( 3 ) p Y S 4 1 2ベクターの構築：図 3 参照

次のようにして、（ 1 ) で構築した P V Y— T . C P Wベクタ一に G F P遺伝子が組込まれている p Y S 4 1 2ベクタ一を構築した。

まず、（ 2 ) で述べた p Y S 4 1 5 の場合と同様に、 p U C 1 9 (宝酒造株式会社製）に 3 5 S プロモーター、 G F P 遺伝子および N o s ターミネータがクローニングされている P Y S 4 0 9 を、制限酵素 H i n d i I I および E c o R I で切断した。 3 5 Sプロモーター、 G F P遺伝子おょぴ N o s ターミネータを含む D N A断片を回収し、これを T 4 D N Aポリメラーゼにより平滑末端とすることにより、平滑末端 D N A断片を得た。次に、（ 1 ) で得た P V Y— T . C P W を制限酵素 E c o R I で切断し、 T 4 D N Aポリメラーゼで平滑末端とした。この線形化された平滑末端の P V Y— T ■ C P Wに、先に得られた平滑末端 D N A断片を T 4 リガーゼで連結することにより、 P V Y— T ' C P Wにおける 3 ' N o s ターミネータの下流に、 3 5 S プロモーター、 G F P遺伝子おょぴ N o s ターミネータが挿入されたベクター p Y S 4 1 2 を得た。

I I . ァグロノクテリウム ■ ッメファシエンスへの形質転換

上記で構築された植物形質転換用ベクター； p Y S 4 1 5および p Y S 4 1 2 を、それぞれ別々に、凍結融解法によりァグロノクテリゥム · ッメファシエンスの菌種 L B A 4 4 0 4 (ホックマン等、 N a t u r e 3 0 3 ； 1 7 9 — 1 8 0 ， 1 9 8 3 ) に導入して形質転換を行った。続いて、カナマイシン耐性で選抜することにより、 p Y S 4 1 5 または p Y S 4 1 2 の何れかがァグロパクテリゥム · ッメファシエンスの菌種 L B A 4 4 0 4 に導入された目的のコロニーを得た。

I I I . タバコへの形質転換

温室内で 1 . 5 ヶ月栽培したタバコ品種（尸 e ί Η a v a n a S R I ) の上位葉から採取したタバコの葉を、 7 0 %エチルアルコールおよび 1 %次亜塩素酸ナトリゥムで表面殺菌し、滅菌水で洗浄した後、直径約 6 m mの葉片ディスクを調製した。この葉片と、上記のようにして本発明のベクタ一で形質転換したァグロバタテリゥム · ッメファシェンス約 1 0 ⁸ 細胞とを、 L i n s m a i e r および S k o o g の無機塩類および 3 0 g Z L のスクロースからなる液体培地中において 4 8 時間共存培養を行った。

その後、葉片をセフオタキシム 2 5 O m g / L を含む滅菌水で洗浄し、細菌を洗い落とした後、 L i n s m a i e r おょぴ S k o o g の無機塩類、インドール酢酸 0 . 3 m g / L 2 i p 1 0 m g / L _s カナマイシン l O O m g / L セフオタキシム 2 5 O m g Z Lおよび寒天 0 . 9 %を含む茎葉分化培地に置床した。約 1 ヶ月の後、カナマイシン耐性を示す茎葉を L i n s m a i e r および S k o o g の無機塩類、 3 0 g , L のスクロース、カナマイシン 1 0 0 m g Z L、セフオタキシム 2 5 O m g Z Lおよび寒天 0 . 9 %を含む発根培地に置床した。培養約 1 ヶ月後、発根した形質転換体を閉鎖系温室内で栽培した。上記の手法は、小鞠等（ T h e r . A p 1 . G e n e t . 7 7， 5 4 7 — 5 5 2、 1 9 8 9 ) の方法に従って行った。

I V . 形質転換体の分析

( 1 ) G F P遺伝子の発現

G F P遺伝子の発現は、形質転換体が発する蛍光を検出することにより分析した。蛍光測定には B I O — R A D社製の M o l e c u l a r I m a g e r F Xを用い、浜松ホト二タス社製の画像解析システム（ A Q U A C O S M O S ) を用いて解析した。

ぐ結果 >

( 1 ) G F P遺伝子のジーンサシレンシング

上記方法により、上記のベクター構築物 p Y S 4 1 5 で形質転換された形質転換タバコについて G F P の蛍光を測定したところ、 G F P の緑色蛍光を強く発現する個体から全く緑色蛍光が認められない形質転換タバコが選られた。更に、 P V Y - T ウィルスを接種したところ、緑色蛍光が認められない形質転換タバコのみから、 P V Y — T の病徴を示さない個体（免疫個体）が選られた。 G F P発現と P V Y — T抵抗性との関係を下記の表 1 に示す。この結果から明らかなように P V Y — Tに抵抗性を示す形質転換タバコは G F Pの発現がジーンサイレンシングにより抑制されている。これにより、本発明のベクターは、導入された G F P遺伝子の発現を高頻度で抑制することが示された。

表 1 GS-PVYベクター + GFP遺伝子を導入した形質転換タバコの

GFP発現と P VY-T抵抗性の関係

供試タノくコ品種： Petit Havana SRI

供試コンストラクト： pYS415 なお、形質転換タバコの P V Y— T抵抗性については、特開平 6 — 1 3 3 7 8 3 号の段落番号〔 0 0 2 7〕に記載の検定法に準じて調査した。即ち、タノコ B r i g h t Y e 1 l o w 4号または B u r l e y 2 1 に P V Y— Tの精製ウィルス粒子を接種し、 2週間後、壊疽症状を確認した後に感染葉をサンプリングし、生重に対して 2 〜 1 0倍の P B S 一 Tノッファー（リン酸バッファー 0 . 0 2 M) で希釈後、ホモジナイズし、その磨砕液を各々の形質転換体に接種した。供試する形質転換体は 4寸釘で鉢上げ後、 2 1 °C前後に調整された閉鎖系温室で栽培し、鉢上げ 2 〜 3 週間後に人工接種を行った。人工接種は、供試植物の上位葉から中位葉の 5枚の葉に対して、 6 0 0 メッシュのカーポランダムと所定濃度のウィルス磨砕液を混合したものを塗布することによって行つた。接種後、経時的（ 1 週間〜 2 力月）に壌疽病徴の有無を調査し、更に E L I S Aでウィルス粒子の有無を調べることにより、抵抗性の程度を検定した。

実施例 2 ： G F P遺伝子をマーカーとした実験

(他種との交雑による内在性遺伝子の抑制）実施例 1 において、ジーンサイレンシングにより P V Y— Tに対して抵抗性を示し、且つ G F P の発現が完全に抑制されている形質転換タバコ（ G B S 1 8 、 G B S 1 9 ) を選抜した。これらの形質転換タバコを自殖させた後、自殖後代 ( R 1 ) 力ら、 P V Y— Tに抵抗性で且つ G F Pの発現が抑制されたもの（ G B S 1 8 — 1 3 、 G B S 1 9 — 7 、 G B S 2 0 - 9 ) を選抜した。伹し、 G B S 1 9 系統は初期にジーンサイレンシングが誘導されるのに対して、 G B S 1 8 および G B S 2 0 系統はェイジが進むに伴ってジーンサイレンシングが誘導される系統である。

次に、上記で選抜された G B S 1 8 - 1 3 および G B S 1 9 一 7 と、タバコ P e t i t H a v a n a S R I ) に G F P遺伝子を導入して G F Pが高発現するように固定化した形質転換タバコ（ G F P — 7 — 1 1 ) とを交雑させた。選られた F 1 種子を、定法により 7 0 %エタノール（数秒）および 1 %次亜塩素酸ナトリウム（ 5分）で表面殺菌し、滅菌水で洗浄した後、 L i m s m a i e r および S k o o g培地上に播種し、 B I O— R A D社製の M o 1 e c u 1 a r I m a g e r F x を用いて G F P の緑色蛍光を経時的に測定した。栽培条件は下記の通りである。

光条件： 3 0 0 0 〜 5 0 0 0 L u x の白色蛍光灯下で 24時間照明

培養温度： 2 3 °C〜 2 5 °C

なお、タバコの自殖種子と F 1雑種種子の採種方法は次の通りである。タバコの自殖種子は、花粉の混入を防ぐために紙袋で花序部を覆うことにより容易に得られる。また、 F 1 雑種種子を得るためには、目的の個体と交雑する前に他からの花粉が混入しないように注意しながら除雄し、開裂したばかりの葯の花粉を雌しベの柱頭に付着させた後、上袋で花序部を覆うことにより得られる。通常、開花後 4 〜 5週間でサクが褐変し、種子が登熟する。遺伝子組換えタバコについては、 2 0 °C〜 2 5 °Cで制御された完全閉鎖系温室で栽培し、タバコの自殖種子と F 1雑種種子を採種した。

その結果、 G F Pが高発現する固定化した形質転換タバコ (黄色）と非形質転換タバコ（赤色）との F 1雑種（ G F P 7 — l l X S R l c o n t . ) では、全て G F P の発現（ォレンジ色）が認められた。これに対して、 G B S 1 8 — 1 3 、 G B S 1 9 — 7及び G B S 2 0 — 9 との交雑では、 F 1 の 6 0個体のうち約 3 0個体（約 5 0 % ) において G F Pの発現が完全に抑制され（赤色）、残りの 3 0個体（ 5 0 % ) では、 G F Pの発現が低程度から中程度に抑制される結果が（ォレンジ色〜赤色）得られた。更に、 P V Y— Tの抵抗性を調べた結果、 G F P発現が完全に抑制された個体（赤色個体）は全て、 P V Y— Tに対する抵抗性を示した。無菌播種 8 日目で、 G B S 1 9 — 7 X G F P 7— 1 1 ( F 1 ) の約半数は G F P の発現が完全に抑制され（赤色化）、 G B S 1 8 — 1 3 および G B S 2 0 — 9 の自殖後代と同様に、ェイジが進むに連れてジーンサイレンシングが誘導される結果となった。

以上の結果から、 G S — P V Yベクターによってタバコに誘導されたジーンサイレンシング効果は、自殖後代（ R 1 ) でも維持され、またこれを他のタバコ種と交雑して得られた F 1 世代にも受継がれることが明らかになった。

実施例 3 ： G U S遺伝子をマーカーとした実験

<材料および方法〉

I . ベクターの作製：

次のようにして、（ 1 ) で構築した P V Y— T ■ C P Wベクタ一に /3 —グルクロエダーゼ（ G U S ) 遺伝子が組込まれている p Y S 4 3 6ベクターを構築した。

先ず、 p U C 1 9 (宝酒造株式会社製）に 3 5 S プロモーター、 G U S遺伝子おょぴ N o s ターミネータがクローニングされている p B I 2 2 1 を、制限酵素 H i n d I I I およぴ E c o R I で切断した。 3 5 S プロモーター、 G U S遺伝子および N o s ターミネータを含む D N A断片を回収し、 T 4 D N Aポリメラーゼで平滑末端とすることにより、平滑末端 D N A断片を得た。次に、 P V Y— T · C P Wを制限酵素 E c o R I で切断して線形化した後、 T 4 D N Aポリメラーゼで平滑末端とした。この線形化された P V Y— T · C P W に、上記で得た平滑末端 D N A断片を T 4 リガーゼで連結することにより、 P V Y— T ' C P Wにおける 3 ' N o s ターミネータの下流に 3 5 Sプロモーター、 G U S遺伝子および N o s ターミネータが揷入されたベクター p Y S 4 3 6 を得た（図 4参照）。

I I . ァグロノクテリゥム . ッメファシエンスへの形質転換

上記で構築された植物形質転換用ベクター _P Y S 4 3 6 を、実施例 1 の場合と同様にして、ァグロバタテリゥム · ッメファシエンスの菌種 L B A 4 4 0 4 (ホックマン等、 N a t u r e 3 0 3 ; 1 7 9 — 1 8 0 、 1 9 8 3 ) に導入して形質転換を行った。続いて、カナマイシン耐性で選抜することにより、 Y S 4 3 6 がァグロバタテリゥム · ッメファシエンスの菌種 L B A 4 4 0 4 に導入された目的のコロニーを得た。 I I I . タバコへの形質転換

上記で得たベクター p Y S 4 3 6 を、実施例 1 の場合と同様にして、温室内で 1 . 5 ヶ月栽培したタバコ品種 P e t i t H a v a n a の葉片に形質転換した。

I V . 形質転換体の分析

( 1 ) G U S遺伝子の発現

先ず、ベクター p Y S 4 3 6 により G U S遺伝子を導入されたァグロパクテリゥム · ッメファシエンス（ L B A 4 4 0 4 ) における G U S遺伝子の発現を調べた。対照として、 G U S遺伝子を有するベクター p B I 1 2 1 (米国クローンテック社製）を導入されたァグロバタテリゥム · ッメファシェンス（ L B A 4 4 0 4 ) を用いた。その結果、 p Y S 4 3 6 を導入したァグロバタテリゥムおよび p B I 1 2 1 を導入したァグロパクテリゥムは何れも青色を呈し、ァグロバタテリゥムにおいては p Y S 4 3 6 および p B I 1 2 1 の両者共 G U S遺伝子を発現していることが明らかになった。

次に、上記ァグロバタテリゥムを用いて p Y S 4 3 6 およぴ p B I 1 2 1 を導入した形質転換タバコについて、 G U S 遺伝子の発現を調べた。その結果、対照である p B I 1 2 1 を導入した形質転換タバコの葉片は青色を呈するのに対して、 p Y S 4 3 6 を導入した形質転換タバコは青色を呈さなかつた。これらの結果を下記の表 2 に纏めた。表 2 pBI121 および pYS436 を導入した形質転換体の GUS発現

以上の結果から、 p Y S 4 3 6 を導入した形質転換タバコでは、 G U S遺伝子の発現がジーンサイレンシングにより抑制されていることが明らかになった。

実施例 4 : エンドゥ Z i n c f i n g e r 転写因子 P s D o f 1 をマーカーとした実験（内在性転写因子の抑制）

<材料および方法 >

I . ベクターの作製：

まず、実施例 1 の（ 1 ) で構築した P V Y— T ' C P Wベクタ一に 3 5 S プロモーター、エンドゥ Z i n c f i n g e r 転写因子 P s D o f 1 および N o s ターミネータが組込まれている p Y S 4 6 5ベクターを構築した。

P s D o f l の組み込まれた p G E X— 5 X— 1 (文献名 P l a n t B i o t e c h n o l o g y , 1 9 ( 4 ) , 2 5 1 - 2 6 0 ( 2 0 0 2 ) を制限酵素 S a l I および X h o I で切断し、 P s D o f 1 遺伝子を含む断片を回収し、これを T 4 D N Aポリメラーゼにより平滑末端とすることにより平滑末端 D N A断片を得た。

次に p C a M C N ( P h a r m a c i a 製）を S a 1 I で切断し C A T遺伝子を取り除き、 T 4 D N Aポリメラーゼにより平滑末端とし、これに先に得られた P s D o f 1遺伝子断片を T 4 リガーゼで連結して P s D o f 1 遺伝子断片の上流に 3 5 S プロモーター、下流に N o s ターミネータの連結したベクター p C a M C N— P s D o f 1 を得た。

ついで、 p C a M C N— P s D o f 1 を X b a I と E c o R I で切断し、 P s D o f l遺伝子断片の上流に 3 5 Sプロモーター、下流に N o s ターミネータが連結された遺伝子断片を回収し、これを T 4 D N Aポリメラーゼにより平滑末端とすることにより、平滑末端 D N A断片を得た。

次に G U S遺伝子の連結された； ρ Β Ι Ι Ο Ι . 2 (東洋紡）を X b a l と E c o R I で切断し、 G U S遺伝子を除去し、これを T 4 D N Aポリメラーゼにより平滑末端したものに先に得た P s D o f 1遺伝子断片の上流に 3 5 Sプロモーター、下流に N o s ターミネータが連結された遺伝子断片を T 4 リガーゼで連結したベクター p B I 1 0 1 . 2 - P s D o f 1 を得た。

ついで、： ρ Β Ι Ι Ο Ι . 2 — P s D o f l を H i n d i I I と E c o R I で切断し、 P s D o f l遺伝子断片の上流に 3 5 S プロモーター、下流に N o s ターミネータが連結された遺伝子断片を回収し、これを T 4 D N Aポリメラーゼにより平滑末端とすることにより、平滑末端 D N A断片を得た。次に、実施例 1 の（ 1 ) で得た P V Y— T · C P Wを制限酵素 E c o R I で切断し、 T 4 D N Aポリメラーゼで平滑末端とした。この線形化された平滑末端の P V Y— T ■ C P W に、先に得られた平滑末端 D N A断片を T 4 リガーゼで連結することにより、 P V Y— T ' C P Wにおける 3 ' N o s タ一ミネータの下流に、 3 5 Sプロモーター、 P s D o f l遺伝子および N o s ターミネータが揷入されたベクター p Y S 4 6 5 を得た。

さらに、 P V Y— T · C P Wベクターに P A Lプロモータ一、エンドゥ Z i n c ： f i n g e r 転写因子 P s D o f l および N o s ターミネータが組込まれている p Y S 4 6 6ベクタ一を構築した（図 5 Aおよび図 5 B参照）。

B O X 5 リピータ一プロモーターと C A T遺伝子が組み込まれた P U C 1 8 (特開 2 0 0 0 — 2 4 5 4 6 3 号）を制限酵素 H i n d I I I および B a m H l で切断し、 P A Lプ口モーター D N A断片を回収した。

次に； Β Ι Ι Ο Ι . 2 — P s D o f l を H i n d i I I と B a m H l で切断して 3 5 Sプロモーターを削除し、これに先に得た P A Lプロモーターを T 4 リガーゼで連結し、 ρ Β 1 1 0 1 . 2 — P A L — P s D o f l ベクターを得た。さらに： B I l O l . 2 — P A L — P s D o f l を H i n d i I I 及ぴ E c o R I で切断し、 P A Lプロモーター、 P s D o f 1 遺伝子および N o s ターミネータを含む断片を回収し、 T 4 D N Aポリメラーゼで平滑末端とした。

次に、 P V Y— T ■ C P Wを制限酵素 E c o R I で切断し、 T 4 D N Aポリメラーゼで平滑末端とした。この線形化された平滑末端の P V Y _ T · C P Wに、先に得られた平滑末端 D N A断片を T 4 リガーゼで連結することにより、 P V Y— T ' C P Wにおける 3 ' N o s ターミネータの下流に、 P A Lプロモーター、 P s D o f l 遺伝子おょぴ N o s ターミネ一タが揷入されたベクター ] p Y S 4 6 6 を得た（図 6 参照）。 I I . ァグロバタテリゥム ' ッメファシエンスへの形質転換

上記で構築された植物形質転換用ベクター _P Y S 4 6 5 および P Y S 4 6 6 を、実施例 1 の場合と同様にして、ァグロバタテリゥム ' ッメファシエンスの菌種 L B A 4 4 0 4 (ホックマン等、 N a t u r e 3 0 3 ; 1 7 9 — 1 8 0、 1 9 8 3 ) に導入して形質転換を行った。続いて、カナマイシン耐性で選抜することにより、 p Y S 4 6 5、 p Y S 4 6 6 がァグロノクテリゥム · ッメファシエンスの菌種 L B A 4

4 0 4 に導入された目的のコロニーを得た。

I I I . タバコへの形質転換

上記で得たベクター P Y S 4 6 5、 p Y S 4 6 6 を実施例 1 の場合と同様にして、温室内で 1 . 5 ヶ月栽培したタバコ品種 P e t i t H a v a n a S R I ) の葉片に形質転換した。

I V . 形質転換体の分析

( 1 ) 転写因子遺伝子のジーンサイレンス

ベクター： Y S 4 6 5 あるいは p Y S 4 6 6 で形質転換されたタバコの形態上変化を観察したところ、 P Y S 4 6 5形質転換体は、初期成育が遅れる傾向が見られた。一方、 p Y

5 4 6 6形質転換体は、葉の表面にしわが形成されたものや葉全体が縮む等の葉の形態異常が起きていた。このことは転写因子 P s D o f 1 と相同性のある転写因子のジーンサイレンスがおきた結果によるものと考察される。以上詳述したように、本発明によれば、宿主において特定の標的遺伝子のジーンサイレンシングを実現できる等、顕著な効果を得ることができる。

Claims

請求の範囲

1 . プロモーターの下流にェンハンサー配列と、その下流にポティウィルス由来のコートタンノク質をコードする遺伝子とを有する組換えべクターを含んでなり、宿主植物において特定の標的遺伝子のジーンサイレンシングを生じさせるために、該標的遺伝子あるいは該標的遺伝子と相同性のある遺伝子をコートタンパク質の上流あるいは下流に揷入して使用されるジーンサイレンシング用べクター。

2 . プロモーターの下流にキユウリモザイクゥイノレスの R N A 4 におけるリーダー配列と、その下流にジャガイモ Y ウィルスえそ系統（ P V Y— T ) のコートタンパク質 ( P V Y - T ■ C P ) をコードする遺伝子とを有する組換えべクタ一を含んでなり、宿主植物において特定の標的遺伝子のジーンサイレンシングを生じさせるために、該標的遺伝子あるいは該標的遺伝子と相同性のある遺伝子をジャガイモ Yウィルスえそ系統（ P V Y— T ) のコートタンパク質の上流あるいは下流に揷入して使用されるジーンサイレンシング用ベクタ

3 . 前記標的遺伝子の発現をより強く抑制するために、請求項 1 に記載のコートタンパク質を複数連結してなるジーンサイレンシング用べクター。

4 . 請求項 1 に記載のジーンサイレンシング用ベクターを宿主植物に形質転換することにより、前記宿主植物における前記標的遺伝子の発現を抑制することを含むジーンサイレンシング方法。

5 . 請求項 4 に記載の方法であって、前記標的遺伝子の発現を数％〜 1 0 0 %の範囲で抑制する方法。

6 . 請求項 4 または 5 に記載の方法であって、前記遺伝子の発現抑制が、前記形質転換された宿主の当代だけでなく、その自殖後代においても安定に維持される方法。

7 . 請求項 4 または 5 に記載の方法であって、更に、前記形質転換された宿主を他の宿主と交雑することを含み、この交雑で得られた雑種世代においても前記標的遺伝子の発現抑制が安定に維持される方法。

8 . 請求項 4 〜 7 の何れか 1 項に記載の方法であって、前記宿主細胞が P V Y罹病性植物であるときには、前記形質転換された宿主は P V Yに対して免疫性および抵抗性となり、同時にその抵抗性の程度に応じて前記標的遺伝子の発現が抑制される方法。