CN112521469A - 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsD15及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsD15及其编码基因与应用。本发明通过水稻谷蛋白分选突变体D15的表型分析和目标基因的初步定位，最终克隆得到谷蛋白分选相关蛋白OsD15，该相关蛋白由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成，或将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有谷蛋白分选相关的由序列SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。本发明的谷蛋白分选相关蛋白影响水稻胚乳中谷蛋白的分选过程，将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物，因此，本发明所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsD15及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsD15及其编码基因与应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，养活了世界上超过一半以上的人口。虽然我国稻谷总产量已经能够基本满足国内稻米的总量需求，但其进口量也屡创新高。特别是随着人民生活水平的不断提高，对于稻米的食味营养品质的要求也越来越高。然而我国水稻的遗传改良育种在很长一段时间内只重视产量，造成中国稻米品质遗传育种研究相对滞后。因此除了追求高产，还应不断改善稻米品质。为促进稻米产业的结构性调整，增强我国稻米的国际竞争力，保证我国粮食安全，急需加强稻米品质形成的分子基础研究和优质水稻新品种的选育。淀粉作为稻米中第一大营养物质，对稻米的品质具有重要的影响，因此目前对稻米的品质改良也主要集中于淀粉改良。贮藏蛋白作为稻米中仅次于淀粉的第二大类营养物质，其含量和组成直接影响着稻米的各项品质指标和营养价值，但其受重视程度不够。因此，解析水稻各储藏蛋白合成、转运、加工和积累的分子机制对稻米的品质改良至关重要。

谷蛋白前体积累（57H）突变体是稻米蛋白品质改良研究的良好遗传材料。通过克隆谷蛋白合成、转运、加工和积累过程关键基因，构建谷蛋白分选网络，能为稻米蛋白品质改良奠定理论基础。目前已经克隆了几个调控谷蛋白转运的关键基因，但谷蛋白分选的确切机理仍知之甚少。本发明人从粳稻品种Kittake的化学诱变突变体库中筛选获得了一个新的57H突变体D15，目前尚无报道关于OsD15蛋白参与水稻储藏蛋白合成相关的研究。

发明内容

本发明通过水稻谷蛋白分选突变体D15克隆得到谷蛋白分选相关蛋白OsD15，提供一种谷蛋白分选相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的谷蛋白分选相关蛋白（OsD15），来源于稻属水稻（Oryza sativavar.Kitaaake），是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有所述功能的衍生蛋白质。

SEQ ID NO.1由947个氨基酸残基组成。

为了使（a）中的OsD15便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的OsD15可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的OsD15的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5´端和/或3´端连上表1所示的标签的编码序列得到。

同时，本发明还提供编码上述贮藏蛋白分选相关蛋白的基因（OsD15）。

所述基因OsD15可为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：

1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2）SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码谷蛋白分选相关蛋白的DNA分子。

SEQ ID NO.2由2841个核苷酸组成。

所述严格条件可为在0.1×SSPE (或 0.1×SSC)，0.1% SDS的溶液中，在65^oC下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为在pCAMBIA1305.1载体(http://www.cambia.org/daisy/cambia/585) 的多克隆位点EcoRI和NcoI之间重组插入所述基因（OsD15）得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCAMBIA1305.1-OsD15；所述pCAMBIA1305.1-OsD15是将由OsD15基因组编码序列连同上游2829 bp的启动子区和下游1023 bp的片段通过重组技术插入到pCAMBIA1305.1多克隆位点EcoRI和NcoI之间得到的(Clontech公司，Infusion重组试剂盒)。

将含有OsD15的pCAMBIA1305.1命名为pCAMBIA1305.1-OsD15。

含有以上任一所述基因（OsD15）的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法。

本发明提供的培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入谷蛋白分选异常的植物中，得到谷蛋白分选正常的转基因植物；所述谷蛋白分选异常植物为胚乳中谷蛋白前体剧增并伴随成熟谷蛋白含量降低的植物；所述谷蛋白分选正常的转基因植物为谷蛋白前体能被正常加工成为成熟谷蛋白的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入谷蛋白分选异常植物中；所述谷蛋白分选异常植物可为D15蛋白功能缺陷突变体。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明的谷蛋白分选相关蛋白影响水稻胚乳中谷蛋白的分选过程。将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1 野生型Kitaake和突变体D15的外观表型，其中，A为Kitaake和D15干种子以及胚乳横切表型，B为Kitaake和D15胚乳横切扫描电镜图片；

图2 野生型Kitaake和突变体D15 SDS-PAGE和Western blot分析，其中，A为Kitaake和D15胚乳储藏蛋白组分SDS-PAGE图，B为Kitaake和D15谷蛋白和球蛋白Western-Blot分析图；

图3 野生型Kitaake和突变体D15发育胚乳的半薄切片观察，其中，A-D为Kitaake和D15发育中期胚乳半薄切片考马斯亮蓝染色结果，E和F为Kitaake和D15发育中期胚乳半薄切片免疫荧光分析；

图4 野生型Kitaake和突变体D15发育胚乳的免疫胶体金观察，其中，A-B为Kitaake和D15发育中期胚乳中致密囊泡与高尔基体的形态结构，C-I为Kitaake和D15发育中期胚乳中胞外空间结构差异以及壁旁体形成过程；

图5 突变基因的图位克隆，其中，A为D15的精细定位图，B为D15的突变位点；

图6 转基因互补株系的表型分析，其中，A为Kitaake和D15以及转基因互补家系胚乳横切，B为Kitaake和D15以及互补家系储藏蛋白组分图，C为Kitaake和D15以及互补家系发育中期胚乳厚切片细胞壁染料染色观察结果；

图7 pCAMBIA1305.1载体图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：水稻中谷蛋白分选相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻谷蛋白分选突变体D15的表型分析

在粳稻品种kitaake的化学诱变突变体库中筛选出籽粒粉质的突变株系D15。与野生型相比，D15的主要特征是籽粒粉质，不透明（见图1A）。扫描电镜分析证实D15中淀粉颗粒松散，可能是导致胚乳粉质不透明的主要原因（见图1B）。D15种子蛋白的SDS-PAGE图谱显示谷蛋白57 kDa前体增加，相应成熟的谷蛋白酸性亚基和碱性亚基含量降低，同时球蛋白含量也有所降低（见图2A）。Western blot分析进一步验证了上述变化（见图2B）。

发育中期胚乳半薄切片经过考马斯亮蓝染色后观察发现，野生型存在两类蛋白体，球形的蛋白体I和不规则形状的蛋白体II，蛋白体II略大于蛋白体 I（见图3A和3C，白色三角标示蛋白体I，黑色三角标示蛋白体II）。而在D15中蛋白体II相比野生型明显变小（见图3D，黑色三角标示）。有趣的是，在D15中除上述两种蛋白体外，在细胞壁附近还发现一类填充有大量蛋白质的壁旁体类结构（见图3B和3D，白色星号标示）以及一些空泡状结构（黑色星号标示）。进一步的发育中期胚乳半薄切片免疫荧光实验也验证了上述结果（见图3E和3F）。以上结果表明D15突变体中的蛋白体II发育异常，大量蛋白质填充在细胞壁附近形成的壁旁体类结构中。

为了解析壁旁体类结构的形成过程，利用透射电镜结合免疫胶体金技术观察了发育中期的胚乳（见图4）。研究表明谷蛋白的后高尔基体运输由致密囊泡介导。突变体D15中致密囊泡可以从高尔基体正常出芽，与野生型一致（图4A和4B）。然而，有趣的是，D15中大量致密囊泡错误分选到胞外体空间（图4C和4D），逐渐积累并形成大的壁旁体类结构（图4E-4I）。

综上所述，上述结果证实D15中负责运输谷蛋白的致密囊泡发生错误分选，进而导致大量谷蛋白前体进入胞外体空间而不能被切割为成熟的酸性亚基和碱性亚基。

二、目标基因定位

1、目标基因的初步定位

利用突变体D15与广亲和品种Dular（购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库）杂交，在D15/Dular的F2分离群体中选取10粒D15表型（籽粒粉质不透明且谷蛋白前体增加）的隐性极端个体，抽提种子DNA，构建DNA混池。利用覆盖水稻全基因组的175对InDel标记进行连锁分析，将负责D15突变体表型的突变基因定位在第4号染色体连锁标记R4-8附近。

2、目标基因的精细定位

依据初定位结果，在连锁标记R4-8附近寻找公共图谱上的分子标记，并依据NCBI公布的水稻基因组序列信息在此区间自行开发连锁标记。利用154个隐性极端个体对目标基因进行了精细定位（分子标记见表2）。

表2 用于精细定位的分子标记

最终将目标基因OsD15精细定位在连锁标记31-20和31-29之间，物理距离为935kb（图5A）。经过对该区间内基因进行测序，发现基因OsD15的第5个外显子上存在一个单碱基的替换，使得目标蛋白错误翻译（图5B）。

三、目标基因OsD15的获得

提取粳稻品种kitaake叶片cDNA，以cDNA为模板，采用引物primer1和引物primer2进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白质如SEQID NO.1所示。

primer1：5'-ATGTACCAGTGGCGCAAGTTCGA-3'；

primer2：5'-TTATCGGCCATTTTCAGGAGGAA-3'。

将SEQ ID NO.1所示的蛋白质命名为OsD15蛋白，由947个氨基酸残基组成。将编码OsD15蛋白的基因命名为OsD15基因，其开放阅读框如SEQ ID NO.2所示。

在国家水稻数据库输入基因accession numbers，无相关文献报道，具体链接如下：

。

实施例2：OsD15蛋白及其编码基因的应用

一、基因组互补载体的构建

将pCAMBIA1305.1载体（参考文献：He Gao, Mingna Jin, et al., Days to heading 7, a major quantitative locus determining photoperiod sensitivity andregional adaptation in rice. Proc Natl Acad Sci USA,2014, 111(46): 16337-16342）的EcoRI和NcoI酶切位点之间的小片段替换为序列表中SEQ ID NO.3所示的双链DNA分子（包括OsD15基因上游2829 bp的启动子序列和下游1023 bp的终止子序列），得到pCAMBIA1305.1-OsD15基因组互补载体（已测序验证），pCAMBIA1305.1载体图谱见图7。

二、互补转基因植物的获得

1、将步骤一得到的pCAMBIA1305.1-OsD15互补载体导入农杆菌EHA105菌株（美国英俊公司），得到重组农杆菌。

2、采用步骤1得到的重组农杆菌转化粳稻品种kitaake（野生型），具体步骤如下：

（1）取步骤1得到的重组农杆菌菌体，采用N6液体培养基（Sigma公司，C1416）重悬并调整菌液OD_600nm为0.5。

（2）将培养至一个月的粳稻品种kitaake（野生型）成熟胚胚性愈伤组织在步骤（1）得到的菌液中侵染30 min，滤纸吸干菌液后转入含有10 g/L 琼脂的固体N6培养基（Sigma公司，C1416）中，24℃共培养3天；

（3）将步骤（2）培养的愈伤组织接种在含有10 g/L 琼脂，100 mg/L潮霉素的固体筛选N6固体培养基（Sigma公司，C1416）上培养16天（第一次筛选）；

（4）将步骤（3）培养后的健康愈伤组织接种在含有10 g/L 琼脂，100 mg/L潮霉素的固体筛选N6培养基（Sigma公司，C1416）上培养15天（第二次筛选）；

（5）将步骤（4）培养后的健康愈伤组织接种在含有10 g/L 琼脂，100 mg/L潮霉素的固体筛选N6培养基（Sigma公司，C1416）上培养15天（第三次筛选）；

（6）将步骤（4）培养后的健康愈伤组织接种在分化培养基（PhytoTechnologyLaboratories 公司，M524）上分化，得到T₀代植株。

3、对步骤2得到的T₀代植株进行鉴定，提取待测植株叶片的总DNA，采用引物primer3和引物primer4进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，缺失位点为双峰的为转基因阳性植株。

primer3：5'-TACTAAATCCCAGCAACAACCT -3'；

primer4：5'- ACTCACAATGCCCTT-3'。

三、表型鉴定

分别将T0代转pCAMBIA1305.1-OsD15植株，D15和野生型Kitaake种植在中国农业科学院转基因试验田内。结果显示转基因株系T2种子中出现了透明的籽粒（图6A），SDS-PAGE检测透明种子（L1，L2和L3）与野生型表现一样（图6B），发育中期胚乳半薄切片考马斯亮蓝染色结果也与野生型一致（图6C）。由此验证了转基因前的不透明粉质和谷蛋白前体增加性状是由OsD15基因控制的，即该OsD15基因为谷蛋白分选相关基因。将pCAMBIA1305.1-OsD15转化水稻D15突变体，可以使其成熟谷蛋白含量上升至正常水平。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsD15及其编码基因与应用

<160> 3

<210> 1

<211> 947

<212> 氨基酸

<400> 1

MYQWRKFEFF EEKAAGRGVP GEIASRVSCC SGGRGRVAVG CDDGTVGLLD RGFRLSYGFQAYASSVLFLQ QLKQRNVLIT VGDDDQPSSL SSAICLKVFD LDKVQEEGSS TTSPFCVQIL RIFTKQFPQAKITSFVVLEE APPILLIAIG LDNGSIYCIK GDIARERITR FMLQVEDGTS LPITGLGFRV EGQAHQLFAVTPSSITLFSL HDHPPRRQTL DQIGCETNAV AMSDRMDLII GRPEAVYFYE IDGRGPCWAF DGEKKFVGWFRGYLLCIIED QRSRKNTLNV YDLKNRLIAH SMPVGDVSHL VSEWGYIILI MSDKKILCIG EKDMESKLDMLFKKNLYTVA INLVQSQQAD PASTAEVLRK YGDHLYGKQE YDEAMSQYIH TIGHLEPSYV IQKFLDAKRIYNLTNYLEKL HDRGLASKDH TTLLLNCYTK LKDVEKLNHF IKDEDGVGEI KFDVETAIRV CRAAGYHEHAMFVAKKAGRH ELYLKILLED LGRYDEALQY ISSLEANQAG LTVKEYGKIL VEHRPAETVE ILLRLCTDGGDPMTRRGSNS MHLLMIPSPM DFVNIFVHSP KHLMEFLENY TKAVKDSPAQ TEIHNTLLEL YISKDLSFPSMSQENGFEEQ NSKERKGKEV ANGYKSGPRE KGNLGKEDMN VAKDIVDRQR KGLALLKSAW TSEMDDPLYDVDLALIICNA NAFKDGLLFL YEKLKLFKEV ISCYKQAHDH EGLIACCKKL GDSSQGGDPS LWGDLLKYFSELGEDCSKEV KEVLTYIEKE DVLPPIVVLE TLSKNPCLTL SVVKDYIARK LEQESKLIEE DRKSIDKYQDETELMKREIE DLKTNAKVFQ LSKCTTCTFT LDLPAVHFMC MHSFHLRCLG DNEKECPECA PEYRSVMEAKQKLEHNARDH DLFFRQLRGS KDGFSVVADY FSKGIVSKTA IPPENGR

<210> 2

<211> 2841

<212> DNA

<400> 2

1 atgtaccagt ggcgcaagtt cgagttcttc gaggagaagg cggccgggcg gggcgtgccc

61 ggcgagatcg cctcccgcgt cagctgctgc tccggcggcc gcggccgcgt cgccgtcggc

121 tgcgacgacg gcacggtggg gctccttgac cgcgggttcc gcctctccta cggcttccag

181 gcctacgcct cctccgtcct cttcctccag cagctcaagc aaaggaatgt tcttatcacg

241 gttggcgatg atgatcagcc atcttcacta tcgtcagcaa tctgtctaaa agttttcgat

301 cttgataaag tacaagaaga aggttcaagt acaacaagtc ctttctgtgt tcaaattttg

361 cgcatcttca ctaagcaatt tcctcaggca aagattacat cttttgtggt tctagaagaa

421 gcacctccta tactgctaat tgcgattgga ctggacaatg gttccattta ttgcatcaaa

481 ggtgacatcg cacgtgagcg tatcacgcga ttcatgttgc aagtcgagga tggcaccagt

541 ttacctatta ctggtcttgg tttccgagtt gaggggcaag cacaccagtt atttgctgta

601 actcctagtt caataacctt gtttagcttg catgatcatc caccgaggag gcaaacgctt

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781 gatggtgaga aaaagtttgt tggatggttt cggggctatt tactatgcat tattgaagat

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1201 gttaaaaacg attatgaaac aggtaagaaa agataaatgt atggctccaa aaatcaaaat

1261 ctttacctgg agactgctga tgggagcctt gcctactgca accaggctaa atttcagggt

1321 tagtgaaatc tctccgaatt gcttccgttg tggtatgcct gaaaatgatt ttcatctttt

1381 cttcggctgc ccttttagca agatcacttg gatgatttct gacattaatc tccgcactga

1441 tattttctct gataatgttt ctatggctca cataattgct tacatttcca ataactgttc

1501 taacaaagcc actttaaata gaatcttcac aatcatgtgg cagatttgga aggctagaaa

1561 tgatctcaag ttttagggta aaattcagga gccatctcaa gtttgttttg cagcagaggc

1621 aatgatcagc ttcctacatt gagcaacctc atttgcagga tgatgatatg gagcaatctt

1681 catcggagag aggaatggaa aagttgctgg aaggaaatag atgttatata gatgcttctt

1741 gggatgataa caaaataggc attggaatct tcttccattt gcctaacact cacaatgctc

1801 tttttatcaa agcttatagt catttggcag aatccccttt gcaatctgaa ctgctagcct

1861 tgcagctagc catggaaatt gccttgattc tgaactttgc agatacagtc ttccttacta

1921 attgctcaac tcttgcggac acggctagga aaaagaactt tcaagaggat ccaggacatt

1981 ggattctact gcccatttgg agtcaaatcc aagctttctt gccggatcat taagagtcca

2041 ttggattcca agacaactta ataagctagc tgataaactt gctaaagatg ctaggggatg

2101 ttcttcctcc tctcctgctt ttaattgtca aaatatttcc cacatcgctt agagcaagtt

2161 taatagtacc gcccactact agctccaatt gatctatagc caatctaata gccaattcat

2221 acaatagttg cttactatac tattaatata tggtcccacc tgtcatacac acagtgtgta

2281 ttggagtccg tgctgcagct ggctatagat ttgtagcctg ctgctcttct ctcttatcgt

2341 ttatctcatt aaaatatatt tatacctggc taatagccta ctattgtacc tgctcttatc

2401 cttcgcatca atgttttgct tctatgctgc gatccagcct aagggaaaga aattgtacaa

2461 tcaaccatgc actctgcttt tgctgccatt catcgctgag aatggcctaa cattttttct

2521 tactaggccc atccatccat ataccacgcc cggatagaca taatttttag cccacccaac

2581 taggcccaac tatatggacc atatatttgg gccggtttgg gcccagtctg cgaacaggtg

2641 gagttcactt cgaggatttc gcgtccgatc cgaatccagt ccgatccaat ccaatccgac

2701 ccagcgatcg agccgcacgc ccctcctccg ccggtcgccg ccgccgccgc agcgatccct

2761 cgccggagaa aggccttccg ccctccctcc ggcgggctcc ccctctctct ctctgctcgg

2821 gcagcgggga tgtaccagtg gcgcaagttc gagttcttcg aggagaaggc ggccgggcgg

2881 ggcgtgcccg gcgagatcgc ctcccgcgtc agctgctgct ccggcggccg cggccgcgtc

2941 gccgtcggct gcgacgacgg cacggtgggg ctccttgacc gcgggttccg cctctcctac

3001 ggcttccagg cctacgcctc ctccgtcctc ttcctccagc agctcaaggt actgggatag

3061 tgggatccct ttcaggattc aattctccgg tagatttgct tccggtgttg tctatcgtgc

3121 tggatcctgt atagttaggg ggtaaaagaa gccattgata tgtaatcgat cactaatttt

3181 gacttgtgag tagcgggcgc actctcctac gaccctgaac aatgcgagac atttttgtat

3241 acaatttgca agtaacttgt tgaatcattt ggttctctga ggcttagggt cagggtttga

3301 agaataaaat ttcggttgct gatagttttg caagtaccat tagttgtttc ttttagtctt

3361 aatgtcttat agacaaaatg gctttctttt cttttctcac taatatgcct gctaaatatg

3421 tactggttgt tagtattatt tttaatgcct tcttgtgtat tgcatttact aattgcattg

3481 ttttatcatg ataatagaag ctaactgtgg tatttaacaa ctgagcagca aaggaatgtt

3541 cttatcacgg ttggcgatga tgatcagcca tcttcactat cgtcagcaat ctgtctaaaa

3601 gttttcgatc ttgataaagt acaagaagaa ggttcaagta caacaagtcc tttctgtgtt

3661 caaattttgc gcatcttcac taagcaattt cctcaggcaa aggtaaattc tcctgcgaaa

3721 ttttgtgtct atgttatgta cttaacatcc tttttctagc tctaatctaa ttatcatgta

3781 ttgcggacca tttcagatta catcttttgt ggttctagaa gaagcacctc ctatactgct

3841 aattgcgatt ggactggaca atggttccat ttattgcatc aaaggtgaca tcgcacgtga

3901 gcgtatcacg cgattcatgt tgcaagtcga ggatggcacc agtttaccta ttactggtct

3961 tggtttccga gttgaggggc aagcacacca gttatttgct gtaactccta gttcaataac

4021 cttgtttagc ttgcatgatc atccaccgag gaggcaaacg cttgatcaga ttggttgtga

4081 gaccaatgct gtggcgatga gtgaccgcat ggtaaggatg tcatcttctg tttttgttca

4141 tgtttgtctg tcgttcccct ctaatcatat agttatacac atgttgttca aaatctgctt

4201 gcaactctct ctgatttagg gcttgtttgg taatctgacc caacttaccc atgatatttg

4261 tgtagttttc tgataagcta atgtgttcct ggaaaaatat gggatcctca gcctcacatt

4321 tgctgcaaaa aattgcatgc gaattgtggt gactgactaa ccatacactt gccaccatcc

4381 cctatgttat atggaagtta tgtatgtatc tcttctcatc acagactgac agccttaagt

4441 aaagtcaagg caaaggcaca tacactaatc atactaaagt aaaattagtc tgaccaagtt

4501 taactaaggg atagatgcag ctaacttagc tctgcggcta accaaaatca atatgtagct

4561 tgactcttgt gacgcaaagt ctagatccct ttgtgactgc ctgttttccc tgccttgtgg

4621 ctgctcgaaa ccacctcagt gtacaattgt gaaataatgc ataggaaaat tggcactaac

4681 catgtaaacc cataatagat tatagtttat tgcaagctag ctacaagaca tgggtctctc

4741 cacatgcatt tgattattgc attcatgcct gtgctgttcc cagtacattt ttcactagga

4801 tcttggtgaa atgcaatcct tatgtccatc tatcgtctat acaggatctg attattggta

4861 gacctgaagc tgtgtatttc tatgaaattg atggtagagg tccttgctgg gcctttgatg

4921 gtgagaaaaa gtttgttgga tggtttcggg gctatttact atgcattatt gaagatcaga

4981 ggagccggaa gaatactctt aatgtatatg atcttaagaa tcggttgatt gcacatagca

5041 tgccagtggg ggatgtttca cacttggtct ctgagtgggg atatattatt ctgataatga

5101 gcgataaaaa gattctttgc attggagaga aagatatgga gagtaagctt gatatgttgt

5161 ttaagaaaaa tctgtataca gtcgcaatca atcttgtaca aagtcaacag gccgatcctg

5221 cttcaactgc tgaggttcta aggaagtatg gtgaccatct ctatggaaaa caggaatatg

5281 atgaggccat gtcccaatat atccacacca ttggccatct tgaaccatca tatgttatac

5341 agaagttcct tgatgcaaaa cgcatctaca atctcacaaa ctatttagag aagttacatg

5401 atcgagggtt agcatccaaa gaccacacca cccttctgtt gaattgctat actaaactga

5461 aagatgtgga gaagcttaac catttcatca aagatgaaga tggggtaggt gaaatcaagt

5521 ttgatgtgga aactgccata agagtatgtc gtgcagctgg atatcatgag catgctatgt

5581 ttgttgccaa aaaggctggg aggcatgagt tgtatttgaa aattttactg gaggatcttg

5641 gtagatatga tgaggcactg cagtatatat ctagccttga ggcgaatcaa gcaggtctta

5701 ctgtaaaaga gtatgggaaa attcttgtgg agcatagacc tgctgaaaca gttgaaatac

5761 tgttgagact ctgtacagat ggtggagatc ctatgacaag aagaggttca aatagcatgc

5821 atttgcttat gataccttct ccaatggact ttgtaaacat atttgtacac agcccgaaac

5881 atctcatgga atttctagag aattatacca aagcagtaaa ggactcacct gctcaaacag

5941 aaattcataa cacccttctg gagttatata tatcaaaaga tttaagtttc ccttctatgt

6001 cacaagaaaa tggctttgag gagcagaata gtaaggaaag aaaaggtaaa gaagttgcaa

6061 atggctataa atctggccca agggagaaag gaaatctggg aaaggaagat atgaatgtcg

6121 caaaggatat tgttgatagg caaaggaaag ggcttgcatt gctcaagtct gcatggacat

6181 ctgagatgga tgatcctctg tatgatgttg atcttgctct tatcatctgt aatgcaaatg

6241 cattcaaaga tgggctattg tttctgtatg agaaactaaa actattcaaa gaagttatta

6301 gttgctacaa gcaagctcat gatcacgagg gtctaattgc ctgctgtaag aagctaggag

6361 attcatctca aggtggggat ccatctcttt ggggtgatct gttgaaatat tttagtgagc

6421 ttggggaaga ttgctctaaa gaggtcaagg aggtattgac ctatattgaa aaggaggatg

6481 ttttgcctcc tattgttgtg ctagagacat tgtcgaaaaa cccatgcttg acactgtcag

6541 ttgtcaagga ttacattgcc cgcaaacttg agcaagaatc aaagctaatc gaagaagata

6601 ggaaatctat tgacaagtac caggttggca atttaactgt gctacctttt tccttgcagc

6661 ttttacaata gttgggagaa ggaattggta tccattaata gtttagtttg ctgcaacata

6721 agattgaaaa gccttcctct attggtgcta gatacaatac aaaacatgtt caagccaaaa

6781 atacaaatat tagaggattt tttgttcata tatttcacta aaatatgttt gagctgtcat

6841 acttgatata gtcattaaat tattttcata cagttttgta ctctgtatag tcaatgtcct

6901 aaactttgta gttagatgtg gctgttgcac agctattggc atgtggtctc acaaggtgcc

6961 tttccatgtg atgaaccttt gtatggatat acttaaacac tagatttcag ttgaaatgtg

7021 tttcaggaca aatttgtttt aatttactga gttcagcaat ttgttttgca tcacacattc

7081 catgtgtatg ttgtctctca gttagtcagt ttgatgacct tagaatttat ttaatcatgc

7141 agtgtagcat gattaaccag ctgtttgagt gttgatacac actttgcacc acgggttact

7201 ttttgtgtgt aatatatatt tgagttgaca taattaccat gataaataat ttgttagcgc

7261 ttaacaatga tgagtgccat cctttatttg gaaagatgac agaaaacgtt actaaatccc

7321 agcaacaacc tacatagaaa cgataacaaa tagataacga ttgataacat cttttttgtt

7381 tatacaggat gagacagaac tgatgaaaag ggagatagaa gacctcaaga caaacgcaaa

7441 ggtctttcag cttagcaagt gtacgacgtg cacctttacg cttgaccttc ctgcggtcca

7501 cttcatgtgc atgcactcct tccaccttcg ctgccttggg gacaatgaga aagaatgccc

7561 agaatgtgct cccgaatata gatctgtcat ggaggcaaag cagaagctag aacataacgc

7621 tagagaccat gatctcttct tcaggcagct gaggggttca aaggatggct tctctgtcgt

7681 cgcagactat tttagcaagg gcattgtgag taaaacagcc attcctcctg aaaatggccg

7741 ataaggagtg gaagaaaacc agctctatta ctccccatgt acaggatttg acgatgtttt

7801 atctcctttc ccatggtgtt ttgtcatcat gtgagtttca gggtccatca cacagcatgt

7861 gcaggccttt aatagcgagt tcctctagtg taccaactta tgtatgcttt ctggcctatt

7921 ttttgtggcc gtgctatgga gttctgttgt gcttgacatt gtaaatcctt ctgttggcaa

7981 acgctgccta gtttttggca tttagttttg atggaagaag attcacggcc atcatgtttg

8041 agttcgacac tttgattact ctcgacacag taatttcttt ttcctgtaat tgttttcatt

8101 gtcaggttac catggtaatg gtatttctcc ttgctgttct tgcaataata cgcaattgag

8161 agtacttatc ttgtagaagt acgtactatc tcatatcatt gtctttttga aaccgttggt

8221 gttgtccact agcaaaactg atgtagaata cggcatgaaa gtatagtatg tatgattgga

8281 agtacgcctg tcgaagagtc ttgtctgtgg gcgttatttg tccaaaccag caacagggga

8341 attcgttgtt tttcttgcgt gcatgattca tctgaacctc cagcaaaaaa agaaggcctc

8401 aactactgct ggtcccatag aacatggaga tgtccccgtt ggaatgaatg agaaatagag

8461 gcatattata taaaatagtt cgaagaacct gacagagaag aacggtacat atagtgtaga

8521 atagtggcac attctgacat attgtaactg aaccccaaaa aggaaaaaaa aaagtgacat

8581 tatcatacgt gcaacgcatg cgatcaccat tcgtcgcgtc gtgggcacat gaggttcaca

8641 attatcaatc ttcccaatta agtagagcat gagagaaaga cggcaagatg cggccaaaga

8701 gtgtaggatt caagctaaac tatacgttat tcacgtatac accggaaatg gatggttaag

8761 ggtctgt

Claims (10)

1.一种谷蛋白分选相关蛋白，其特征在于选自如（a）或（b）所示的任一种：

（a）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有谷蛋白分选相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.如权利要求1所述的谷蛋白分选相关蛋白，其特征在于其末端增加有标签序列，优选为Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II、或c-myc。

3.编码权利要求1或2所述谷蛋白分选相关蛋白的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1）至4）任一所示的DNA分子：

1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2）SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码SEQ ID NO.1所述蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码谷蛋白分选相关蛋白的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCAMBIA1305.1载体的多克隆位点EcoR I和Nco I之间插入权利要求3或4所述基因得到的重组质粒。

7.权利要求1或2所述蛋白，权利要求3或4所述基因，权利要求5所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于其在培育谷蛋白分选正常的转基因植物中的应用，优选的所述植物是水稻。

9.一种培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法，是将权利要求3或4所述基因导入谷蛋白分选异常植物中，得到谷蛋白分选正常的转基因植物；其中所述谷蛋白分选异常为谷蛋白前体异常积累。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述基因通过重组表达载体导入谷蛋白分选异常的植物中，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，优选为烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、或苜宿。

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