ES2334183T3

ES2334183T3 - Proteina alfa de activacion de fibroblastos dimerica aislada, y usos de la misma.

Info

Publication number: ES2334183T3
Application number: ES97916024T
Authority: ES
Inventors: Rainer Zimmerman; John E. Park; Wolfgang Rettig; Lloyd J. Old
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Boehringer Ingelheim International GmbH; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Boehringer Ingelheim International GmbH; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1996-03-18
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 2010-03-05
Anticipated expiration: 2017-03-12
Also published as: AU729369B2; CA2242342A1; JP4102441B2; EP0960127B1; BR9708100A; CN1214052A; BG102781A; DE69739665D1; US5965373A; ATE449106T1; US5767242A; CZ299698A3; SK126798A3; DK0960127T3; AU2330297A; TR199801845T2; IL125124A0; HUP0104468A3; NO984298L; NO984298D0

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A FORMAS DIMERAS DE LA PROTEINA CONOCIDA COMO PROTEINA ALFA ACTIVADORA DE FIBROBLASTOS, O FAP AL , Y UTILIZACIONES DE LA MISMA

Description

Proteína \alpha de activación de fibroblastos dimérica aislada, y usos de la misma.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a determinadas moléculas asociadas a tejidos cancerosos y células estromales tumorales reactivas. Más particularmente, se refiere a moléculas de proteína alfa de activación de los fibroblastos (en lo sucesivo "FAP\alpha") . Con anterioridad ha sido identificada inmunoquímicamente una forma monomérica de la molécula, aunque no han sido aisladas ni clonadas moléculas de ácido nucleico codificantes de la misma ni han sido identificados los dímeros. Éstas son, inter alia, características de la invención. La proteína monomérica presenta un peso molecular comprendido entre aproximadamente 88 y aproximadamente 95 kilodaltons según se determinó mediante SDS-PAGE de muestras sometidas a ebullición. El dímero presentaba un peso molecular de aproximadamente 170 kilodaltons según se determinó mediante SDS-PAGE de muestras no sometidas a ebullición. FAP\alpha se caracteriza por varias características y propiedades que son compartidas y que son características de los enzimas unidos a membrana, sugiriendo muy fuertemente que también es un enzima unido a membrana. Las moléculas de ácido nucleico, que son una parte crucial de la invención, resultan útiles como sondas para células que expresan FAP\alpha y como materiales de partida para la producción recombinante de la proteína. Seguidamente la proteína FAP\alpha puede utilizarse para producir anticuerpos monoclonales específicos de la proteína y de esta manera ellos mismos resultan agentes diagnósticos útiles. También presentan usos adicionales, incluyendo usos relacionados con funciones enzimáticas, tal como se describe en la presente invención.

Antecedentes y antecedentes de la técnica

El crecimiento invasivo de cánceres epiteliales se asocia a cambios celulares y moleculares característicos en el estroma de soporte. Por ejemplo, los cánceres epiteliales inducen la formación de vasos sanguíneos tumorales, el reclutamiento de fibroblastos estromales tumorales reactivos, infiltrados linfoides y fagocíticos, la liberación de péptidos mediadores y enzimas proteolíticos, y la producción de una matriz extracelular alterada (ECM) (ver, por ejemplo, Folkman, Adv. Cancer Res. 43:175-203, 1985; Basset et al., Nature 348:699-704, 1990; Denekamp et al. , Cancer Metastasis Rev. 9:267-282, 1990; Cullen et al., Cancer Res. 51:4978-4985, 1991; Dvorak et al., Cancer Cells 3:77-85, 1991; Liotta et al., Cancer Res. 51:5054s-5059s, 1991; Garin-Chesa et al., J. Histochem. Cytochem. 37:1767-1776, 1989). Una característica molecular altamente consistente del estroma en varios tipos histológicos comunes de los cánceres epiteliales es la inducción de la proteína de activación fibroblástica (FAP\alpha), una glucoproteína de superficie celular con un M_{r} observado de 95.000 descubierta originalmente con un anticuerpo monoclonal, mAb F19, cultivado contra fibroblastos en proliferación en cultivo (ver Rettig et al., Cancer Res. 46:6046-6412, 1986; Rettig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3110-3114, 1988; Garin-Chesa et al., Proc. Natl. Acad. USA 87:7235-7239, 1990; Rettig et al., Cancer Res. 53:3327-3335, 1993).

Algunos estudios inmunohistoquímicos, tales como aquellos citados supra, han demostrado que FAP\alpha se expresa transitoriamente en determinados tejidos mesenquimales fetales normales pero que los tejidos adultos normales son generalmente FAP\alpha^{-}. De manera similar, las células epiteliales, neurales y hematopoyéticas malignas son generalmente FAP\alpha^{-}. Sin embargo, la mayoría de los tipos comunes de cáncer epitelial, incluyendo >90% de los carcinomas de mama, pulmón, piel, páncreas y colorrectal, contienen abundantes fibroblastos estromales reactivos FAP\alpha^{+} (Garin-Chesa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7235-7239, 1990). Los fibroblastos estromales tumorales FAP\alpha^{+} prácticamente invariablemente acompañan a los vasos sanguíneos tumorales, formando un compartimiento celular diferenciado interpuesto entre el endotelio capilar tumoral y el aspecto basal de los grupos de células epiteliales malignas. Aunque los fibroblastos estromales FAP\alpha^{+} se encuentran en carcinomas tanto primarios como colorrectales, sólo raramente contienen células estromales FAP\alpha^{+}. En contraste con la localización específica del estroma de FAP\alpha en los neoplasmas epiteliales, FAP\alpha se expresa en las células malignas de una gran proporción de sarcomas óseos y del tejido blando (Rettig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3110-3114, 1988). Finalmente, se han detectado fibroblastos FAP\alpha^{-} en el tejido granulado de heridas en cicatrización (Garin-Chesa et al., supra). Basándose en el restringido patrón de distribución de FAP\alpha en los tejidos normales y su expresión uniforme en el estroma de soporte de muchos cánceres epiteliales, se han iniciado ensayos clínicos con mAb F19 marcado con ^{131}I en pacientes con cáncer de colon metastásico (Welt et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 33:319, 1992; Welt et al., J. Clin. Oncol. 12:1561-1571, 1994) con el fin de explorar el concepto de "dianización estromal tumoral" para la inmunodetección e inmunoterapia de los cánceres epiteliales.

Rettig et al., Int. J. Cancer 58:385-392, 1994, comentan la molécula FAP\alpha y sus características. Rettig et al. postulan que FAP\alpha se encuentra en complejos de elevado peso molecular, superior a 400 kilodaltons, pero no comentan la posibilidad de moléculas diméricas, ni dicho artículo detalla las propiedades enzimáticas específicas de la molécula.

La inducción de los fibroblastos FAP\alpha^{+} en tiempos y sitios de remodelado de tejidos durante el desarrollo fetal, la reparación de tejidos y la carcinogénesis, es consistente con que esta molécula presente un papel fundamental en la fisiología del fibroblasto normal. Por lo tanto, resulta interesante y valioso aislar y clonar moléculas de ácido nucleico que codifiquen dicha molécula. Lo anterior constituye un aspecto de la invención, que se describe en detalle, conjuntamente con otras características de la invención, en la exposición siguiente. Entre los aspectos adicionales de la invención se incluyen las moléculas diméricas de FAP\alpha y la explotación de las propiedades de estas moléculas. Estas características también se describen detalladamente a continuación.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 compara la secuencia de aminoácidos deducida de FAP\alpha y la secuencia conocida de CD26. La alineación ha sido optimizada.

Las figuras 2A-2H, ambas inclusive, muestran la detección inmunohistoquímica de FAP\alpha y de CD26 en diversos tejidos. En las figuras 2A y 2B, se estudia el cáncer de mama para FAP\alpha (figura 2A) y para CD26 (figura 2B). En las figuras 2C y 2D, se estudia el histiocitoma fibroso maligno para FAP\alpha (figura 2C) y para CD26 (figura 2D) . El tejido cicatrizal dérmico se examina en las figuras 2E (FAP\alpha) y 2F (CD26) . El carcinoma de células renales se estudia en las figuras 2G (FAP\alpha) y 2H (CD26).

La figura 3 presenta algunos datos generados en experimentos que demostraron que FAP\alpha presentaba actividad degradadora de las proteínas de la matriz extracelular (ECM). Al llevar a cabo la detección zimográfica de extractos en degradación de gelatina de 293-FAB, se encontró que la sustancia activa presentaba un peso molecular de aproximadamente 170 kD mediante SDS-PAGE, utilizando muestras no sometidas a ebullición para conservar la actividad enzimática.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes Ejemplo 1

Previamente se había observado que la línea de células fibroblásticas WI-38 reaccionaba con mAb F19 (Rettig et al., Canc. Res. 46:6406-6412, 1986; Rettig et al., Proc. Natl. Acad. USA 85:3110-3114, 1988; Garin-Chesa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UA 87:7235-7239, 1990; Rettig et al., Canc. Res. 53:3327-3335, 1993). Se utilizó en los experimentos siguientes.

Se preparó una biblioteca de ADNc a partir de WI-38 utilizando técnicas bien conocidas y materiales disponibles comercialmente. Específicamente, la biblioteca se construyó en el vector de expresión pCDNAI utilizando el kit de aislamiento de ARNm Fast Track y un sistema fagémido de biblioteca de ADNc. Tras preparar la biblioteca, los vectores se introdujeron mediante electroporación en la línea celular E. coli MC 1061/P3. El vector de expresión pCDNAI contiene un gen de resistencia a antibiótico, de manera que se seleccionaron los E. coli a partir de la resistencia al antibiótico. Las colonias que eran resistentes seguidamente se utilizaron en los experimentos posteriores. El plásmido de ADN procedente de las colonias se obtuvo mediante lisis alcalina y purificación en CsCl_{2}, según Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y., 2a edición, 1989). El procedimiento es bien conocido de la técnica.

Tras aislar el plásmido de ADN, se utilizó para transfectar células COS-1, que seguidamente se cultivaron durante cuarenta y ocho horas, sometiéndolas seguidamente a ensayo en placas recubiertas de anticuerpo. Entre los mAbs utilizados se incluían F19, tal como describen Rettig et al., supra, 1986.

Debido a que las células COS-1 normalmente son FAP\alpha^{-}, cualquier resultado positivo indica la presencia de la secuencia codificante. Se utilizó el protocolo de inmunoselección de Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365-3369, 1987.

El plásmido de ADN procedente de los clones positivos se recuperó según el método de Hirt, J. Mol. Biol. 26:365-369, 1967, se reintrodujo en E. coli MC 1061/P3 y se reseleccionó en células COS-1.

Se siguió el protocolo proporcionado en la presente invención, durante cuatro rondas. A continuación, se purificó el plásmido de ADN a partir de 50 colonias bacterianas aisladas utilizando el kit de plásmido Qiagen. De entre dichas colonias, se encontraron 27 clones que contenían inserciones idénticas de 2,8 kb, según determinación mediante mapeado con el enzima de restricción EcoRI. Se encontró que algunos de ellos contenían ADNc específico de FAP\alpha según se determinó mediante expresión transitoria en células COS-1 y tinción inmunofluorescente directa con mAb F19. Uno de estos clones, "pFA.38", se seleccionó para estudios posteriores, tal como se describe en detalle posteriormente.

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Ejemplo 2

Tras identificar pFAB.38, éste se sometió a ensayo conjuntamente con un vector codificante del marcador de superficie celular conocido CD26 ("pCD26"), así como con el vector de control pCDNA I.

En estos experimentos, se transfectaron células COS-1 con uno de entre pFA.38, pCD26 o pCDNAI. Tras cuarenta y ocho horas, se sometieron a ensayo los transfectantes utilizando el ensayo bien conocido de rosetas MHA para la expresión de antígenos de superficie. En estos experimentos, mAb F19, que es específico de FAP\alpha, se utilizó conjuntamente con mAb EF-1, que es específico de CD26. También se utilizaron otros cuatro mAbs específicos de FAP\alpha: FB23, FB52, FB58 y CD48. También se sometieron a ensayo dos líneas de células cancerosas que es conocido que reaccionan con mAb F19 (liposarcoma SW872) o con EF-1 (cáncer ovárico SK-OV6). Se proporcionan los resultados en la Tabla 1, a continuación.

TABLA 1 Expresión en la superficie celular de múltiples epítopos de FAP\alpha y de CD26 en células humanas y en células COS-1 transfectantes

1

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Ejemplo 3

A continuación, se llevaron a cabo estudios de inmunoprecipitación para identificar el antígeno que era la diana de los anticuerpos.

Las células se marcaron metabólicamente con marcaje trans ^{35}S (ICN), se extrajeron con tampón de lisis (Tris-HCl 0,01 M/NaCl 0,15 M, MgCl_{2} 0,01 M/Nonidet P-40 al 0,5%/aprotinina (20 \mug/ml)/fenilmetilo 2 mM + fluoruro de sulfonilo) y después se inmunoprecipitaron. Todos los protocolos utilizados eran bien conocidos, tal como se apreciará a partir de Rettig et al., Cancer Res. 53:3327-3335, 1993, y de Fellinger et al., Canc. Res. 51:336-340, 1991.

Los mAbs que precipitaron fueron: Ig de ratón de control negativo, mAb F19 o EF-1. Se llevaron a cabo ensayos de control con células COS-1 falsamente transfectadas. Tras la inmunoprecipitación, los inmunoprecipitados se sometieron a ebullición en tampón de extracción y se separaron mediante NaDOdSO_{4}/PAGE bajo condiciones reductores. En algunos experimentos se llevó a cabo un ensayo adicional para determinar si el material inmunoprecipitado se encontraba glucosilado. En estos experimentos, los extractos celulares se fraccionaron con Con-A SEFAROSA antes de la inmunoprecipitación. Tras la inmunoprecipitación, aunque antes del fraccionamiento en NaDodSO_{4}/PAGE, dichos precipitados se digirieron con N-glucanasa.

Los resultados demostraron que, en células COS-1, pFA.38 dirige la expresión de una especie proteína de 88 kD (según se determinó mediante SDS-PAGE) que es ligeramente más pequeña que la especie de FAP\alpha de 95 kD producida por SW872 o por fibroblastos en cultivo. La digestión con N-glucanasa produjo péptidos de tamaño comparable (es decir, 74 kD frente a 75 kD), demostrando que la glucosilación de la proteína FAP\alpha en células COS-1 es diferente que en líneas celulares humanas.

Ejemplo 4

A continuación, se llevó a cabo un análisis clásico de transferencia northern utilizando el ARNm de líneas celulares de fibroblastos FAP\alpha^{+} WI-38 y GM 05389, y la línea celular de cáncer ovárico-FAP\alpha SK-OV6. Mediante la utilización de los procedimientos de Sambrook et al., supra, se sometieron a ensayo cinco microgramos de ARNm de cada línea celular. Las sondas utilizadas se marcaron con ^{32}P y se prepararon a partir de un fragmento ECORI de 2,3 kb de pFAP.38, un fragmento HindIII de 2,4 kb de CD26 y un fragmento BamHI de 1,8 kb del ADNc de la \gamma-actina. Estos fragmentos habían sido purificados a partir de geles de agarosa al 1%.

Los extractos de cepas de fibroblastos FAP\alpha^{+} mostraron una especie de ARNm de FAP de 2,8 kb, mientras que los extractos de SK-OV6 no lo hicieron. Se observó una especie de ARNm de la \gamma-actina (1,8 kb) en todas las especies.

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Ejemplo 5

El ADNc identificado como codificante de FAP\alpha se sometió a un análisis más detallado partiendo de una secuenciación. Se utilizó la metodología clásica de Sanger, tal como se proporciona en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977, para secuenciar ambas cadenas del ADNc. Tras realizar lo anterior, se dedujo una secuencia de aminoácidos de dicho ADNc. Esta información se presenta en la secuencia SEC ID nº 1. A continuación, la secuencia se comparó con la secuencia de aminoácidos conocida de CD26 (Morimoto et al., J. Immunol. 143:3430-3437, 1989). La figura 1 presenta la comparación utilizando una alineación optimizada de secuencias. Cualquier hueco en la comparación se indica mediante asteriscos, mientras que los aminoácidos idénticos se muestran mediante barras en la secuencia de CD26. Una secuencia transmembrana putativa hidrofóbica se señala con doble subrayado, mientras que los sitios potenciales de N-glucosilación se señalan con subrayado simple.

El análisis de secuencias muestra una inserción de 2.812 pares de bases, en la que 2.277 pares de bases constituyen el marco de lectura abierto. Este ORF se extiende desde el codón de inicio (ATG) en el nucleótido 209, hasta el codón de parada TAA en 2.486.

El polipéptido deducido presenta una longitud de 760 aminoácidos y un peso molecular de 87.832. En contraste, se informó que la FAP\alpha digerida con N-glucanasa e inmunopurificada presentaba un M_{r} estimado de 75.000 en NaDodSO_{4}/PAGE (Rettig et al., Canc. Res. 53:3327-3335, 1993). Se llevó a cabo una búsqueda en la base de datos GenBank. Los genes más estrechamente relacionados que se encontraron fueron aquellos codificantes de homólogos de dipeptidil-peptidasa IV (DPPIV; EC 3.4.14.5) respecto a DPPIV humana (también conocida como antígeno CD26 de activación de las células T), que mostraba una identidad de secuencia de nucleótidos de 61% y una identidad de secuencia de aminoácidos de 48%.

El segundo grupo de genes relacionados eran homólogos humanos, de rata y bovinos de DPPX, un gen de función desconocida expresado ampliamente en tejido cerebral y en otros tejidos normales. El producto génico DPPX humano predicho muestra una identidad de secuencia de aminoácidos aproximada de 30% respecto a FAP\alpha y a CD26. La molécula FAP\alpha muestra características estructurales típicas de las proteínas membranales integrales de tipo II, entre ellas un dominio extracelular COOH-terminal grande, un segmento transmembranal hidrofóbico y una cola citoplasmática corta. El dominio extracelular putativo contiene cinco sitios de N-glucosilación potenciales, once residuos cisteína (ocho de los cuales se encuentran conservados en FAP\alpha y CD26) y tres segmentos correspondientes a dominios catalíticos altamente conservados característicos de las serina proteasas, tales como DPPIV.

Las comparaciones entre DPPIV y DPPX se realizaron según Morimoto et al., supra; Wada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:197-201, 1992; Yokotani et al., Human Mol. Genet. 2:1037-1039, 1993.

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Ejemplo 6

Se llevó a cabo un conjunto adicional de experimentos para determinar si las secuencias relacionadas con FAP\alpha se encontraban presentes en especies no humanas. Para ello, se digirió ADN genómico humano, de ratón y de hámster chino utilizando enzimas de restricción, y se sometieron a ensayo, mediante transferencia southern, utilizando el fragmento de 2,3 kb marcado con ^{32}P, tal como se ha indicado anteriormente. La hibridación se llevó a cabo utilizando condiciones de lavado restrictivas (0,1XSSC, NaDodSO_{4} al 0,1%, 68ºC). La hibridación cruzada se observó fácilmente en ADN tanto de ratón como de hámster, sugiriendo la existencia de homólogos altamente conservados de FAP\alpha. En experimentos de control con el fragmento de ADNc de CD26 indicado anteriormente, no se observó evidencia de hibridación cruzada.

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Ejemplo 7

La molécula CD26 comparte varias propiedades bioquímicas y serológicas con FAP\beta, que es una molécula asociada a FAP\alpha descrita anteriormente que presenta un peso molecular de 105 kD, y se encuentra sobre fibroblastos y melanocitos en cultivo (Rettig et al., Cancer Res. 53:3327-3335, 1993). Se llevaron a cabo experimentos de cotransfección para determinar si FAP\beta era un producto génico CD26. Para este ensayo se utilizaron los mismos protocolos que los utilizados para la transfección con pFAP.38 o pCD26, tal como se ha descrito anteriormente, aunque utilizando los dos vectores. Los resultados presentados anteriormente demostraron que la eficiencia de cotransfección era de aproximadamente 40% para cada vector, de manera que aproximadamente 10% a 20% de las células deberían cotransfectarse.

Tras la cotransfección, las células COS-1 se marcaron con trans ^{35}S, tal como se ha indicado anteriormente, y después se lisaron, también tal como se ha indicado anteriormente.

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Los extractos celulares resultantes se separaron en Con-A sefarosa y se recuperó el antígeno (FAP\alpha y/o CD26) en la fracción ligada a Con-A. La fracción ligada se eluyó con \alpha-D-manopiranósido 0,25 M. Seguidamente se llevó a cabo la inmunoprecipitación, tal como se ha descrito anteriormente, y los precipitados se separaron en NaDodSO_{4}/PAGE, también tal como se ha comentado anteriormente.

Aquellas células transfectadas únicamente con pFA.38 produjeron FAP\alpha, pero no FAP\beta (determinado a partir de inmunoprecipitados de mAb F19). Tampoco produjeron antígeno CD26 (sometido a ensayo con EF-1). Aquellas células que habían sido transfectadas solo con pCD26 produjeron CD26 pero no FAP\alpha. Los cotransfectantes produjeron CD26 y heterómeros FAP\alpha/FAP \beta, según se determinó en los precipitados de mAb F19. Este resultado proporciona evidencia directa de que FAP\beta es un producto génico CD26.

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Ejemplo 8

Anteriormente se ha observado que algunos tipos celulares humanos en cultivo coexpresan FAP\alpha y CD26 y muestran la formación de heterómero FAP\alpha/CD2. Sin embargo, los patrones de distribución in vivo de FAP\alpha y CD26, según los estudios inmunohistoquímicos anteriores, aparentemente eran no solapantes (ver Rettig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3110-3114, 1988; Garin-Chesa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7235-7329, 1990; Rettig et al., Canc. Res. 53:3327-3335, 1993; Stein et al., en: Knapp et al., editores, Leukocyte typing IV-white cell differentiation antigens, páginas 412 a 415 (Oxford University Press, N.Y., 1989, páginas 412 a 415; Mobious et al., J. Exp. Immunol. 74:431-437, 1988) . En vista de la significación potencial de la coasociación FAP\alpha/CD26, se examinó nuevamente la distribución en tejidos, mediante tinción inmunohistoquímica en paralelo de tejidos normales y tejidos lesionados que era conocido que contenían fibroblastos FAP\alpha^{+} o células malignas FAP\alpha^{+}.

Para someter a ensayo las muestras, se incluyeron en compuesto OCT, se congelaron en isopentano preenfriado en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70ºC hasta que se utilizaron. Se cortaron secciones de cinco micrómetros de grosor, se montaron en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina, se secaron al aire y se fijaron en acetona fría (4ºC, durante 10 minutos). A continuación, las secciones se sometieron a ensayo con mAbs (10 a 20 \mug/ml) utilizando el método bien conocido de inmunoperoxidasa avidina-biotina, tal como se describe en, por ejemplo, Garin-Chesa et al., J. Histochem. Cytochem. 37:1767-1776, 1989; Garin-Chesa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7235-7239, 1990; Rettig et al., Cancer Res. 53:3327-3335, 1993; Garin-Chesa et al., Am. J. Pathol. 142:557-567.

Se muestran los resultados en la figura 2. Los carcinomas de mama, colorrectal, páncreas y pulmón mostraron una fuerte expresión de FAP\alpha pero no se encontró CD26 (ver las figuras 2A y 2B) . Se sometieron a ensayo cinco sarcomas FAP\alpha^{+}, incluyendo histiocitoma fibroso maligno (figuras 2C y 2D) y se encontró que no se producía expresión de CD26. El examen de fibroblastos reactivos de lesiones dérmicas en cicatrización (figuras 2E y 2F) mostró una expresión abundante tanto de FAP\alpha como de CD26. Los tres carcinomas renales sometidos a ensayo (figuras 2G y 2H) mostraron expresión de CD26 en epitelio maligno. FAP\alpha se encontraba ausente de las células epiteliales malignas y mostraba una expresión reducida en el estroma de dichos carcinomas.

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Ejemplo 9

Se preparó una línea celular de mamífero, transfectada con un ADNc codificante de FAP\alpha.

La línea de células renales embrionarias humanas 293 es bien conocida y se encuentra ampliamente disponible de, por ejemplo, la American Type Culture Collection.

Se mantuvieron muestras de células 293 en un incubador a 37ºC en una atmósfera de 95% aire y 5% CO_{2}. Las células se cultivaron en una mezcla 50:50 de medio esencial mínimo modificado por Dulbecco y medio Ham F12, enriquecido con suero fetal bovino al 10%, penicilina y estreptomicina. Siguiendo los procedimientos descritos por Ustar et al., Eur. Mol. Biol. J., 1991 y/o Park et al., J. Biol. Chem. 169:25646-25654, 1994, se transfectó ADNc de FAP\alpha (es decir, la secuencia SEC ID nº 1) en células 293. Se han proporcionado anteriormente los detalles del vector de ADNc (pFA.38). Se seleccionaron transfectantes para resistencia a antibióticos (200 \mug/ml de geneticina) y seguidamente se mantuvieron en medio de selección que contenía geneticina.

Se recolectaron colonias individuales de células resistentes, se cultivaron hasta la confluencia en 6 placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos y se sometieron a ensayo para la expresión de FAP\alpha en un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) utilizando anticuerpo monoclonal F19 específico para FAP\alpha, tal como se ha descrito anteriormente.

Aquellas colonias que expresaban FAP\alpha se expandieron y se realizó un seguimiento mediante análisis IFA y citofluorométrico, también como se ha indicado anteriormente.

Las IFAs eran positivas para los transfectantes, denominadas en lo sucesivo línea celular 293-FAP, pero eran negativas para la línea parental 293.

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Ejemplo 10

Con el fin de confirmar que la FAP\alpha recombinante de hecho se estaba produciendo, se llevó a cabo una serie de experimentos de inmunoprecipitación. Estos experimentos siguiendo los métodos de Park et al., supra, y de Rettig et al., Canc. Res. 53:3327-3335, 1993. Esencialmente se combinaron extractos celulares marcados con ^{35}[S]-metionina con anticuerpo monoclonal F19 de la manera descrita anteriormente. A continuación, los precipitados se sometieron a ebullición en tampón de extracción y se corrieron en geles SDS-PAGE utilizando, como control negativo, IgG1 de ratón. Se sometieron a ensayo tanto la línea celular 293-FAP como la línea 293 no transfectada. Los resultados indicaron claramente que la FAP\alpha recombinante era producida por la línea celular transfectada 293-FAP. Esto se determinó mediante análisis de inmunoprecipitación utilizando anticuerpo monoclonal F19 específico de FAP\alpha.

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Ejemplo 11

La capacidad de producir FAP\alpha recombinante permitió el estudio adicional de las propiedades de las moléculas. Específicamente, dadas las características estructurales descritas de manera general en los ejemplos anteriores, se diseñaron experimentos para determinar si FAP\alpha presentaba actividades enzimáticas. Los experimentos se diseñaron para someter a ensayo la posibilidad de FAP\alpha presentase una actividad degradadora de proteína de matriz extracelular (ECM).

Se prepararon extractos de células 293-FAP utilizando un tampón de extracción (NaCl 0,15 M, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM, Triton X-114 al 1 por ciento) y se clarificaron mediante centrifugación (4.000xg, 20 minutos a una temperatura de entre 20ºC y 25ºC). Las fases de detergente se diluyeron con tampón (NaCl 0,15 M, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, CaCl_{2} 5 mM, MgCl_{2} 5 mM, Empigen BB al 0,75%) y se separaron en concavalina A-sefarosa según Rettig et al., supra. Cualquier fracción ligada a concavalina-A se eluyó con metil-\alpha-D-manopiranósido 0,25 M en tampón de elución (NaCl 0,15 M, Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, CaCl_{2} 5 mM, MgCl_{2} 5 mM, Triton X-100 al 0,1%), se mezcló con tampón de zimografía (Tris-HCl 0,25 M, pH 6,8, SDS al 8%, glicerol al 40%, azul bromofenol al 0,01%) a una proporción de 3:1 y se utilizó para análisis adicionales.

Se cargaron alícuotas de las muestras en geles de poliacrilamida que contenían 0,1% de gelatina o de caseína. A continuación, se llevó a cabo electroforesis en un sistema Biorad Min-Protein II a una corriente constante de 20 mM durante 1,5 a 2 horas hasta que los frente de pigmento azul bromofenol de las muestras habían alcanzado el extremo inferior del gel. Se extrajo el gel y se incubó durante una hora a una temperatura de entre 20ºC y 25ºC en una solución acuosa al 2,5% de Triton X-100 en un agitador rotatorio. La solución de Triton X-100 se decantó y se sustituyó por tampón enzimático (Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, NaCl 0,2 M, CaCl_{2} 5 mM, MgCl_{2} 5 mM, Brij 35 al 0,02%). A continuación, el gel se incubó a 37ºC o a 41ºC, seguido de tinción o destinción a temperatura ambiente. Los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie G-250 al 0,5% en una solución acuosa de metanol al 30% y ácido acético al 10% durante 10, 30 y 60 minutos, respectivamente. Posteriormente, los geles se incubaron durante 15 minutos en una solución acuosa de CH_{4}OH al 30% y glicerol al 5%, seguido del secado entre láminas de celofán.

Se evaluó la actividad de gelatinasa según Kleiner et al., Anal. Biochem. 218:325-329, 1994.

Éste es un ensayo rutinario utilizado para determinar si se encuentra presente o no una proteasa capaz de digerir gelatina. Se corrió un estándar marcador de peso molecular en los mismos geles, bajo condiciones reductoras, para las determinaciones de peso molecular.

Se sometió a ensayo la actividad proteolítica para motivos de secuencia definida de aminoácidos, utilizando un ensayo conocido de superposición de membranas (ver Smith et al., Histochem. J. 2 4(9):637-647, 1992). Los sustratos eran Ala-Pro-7-amino-4-trifluorometil-coumarina, Gly-Pro-7-amino-4-trifluorometil-coumarina y Lys-Pro-7-amino-4-trifluorometil-coumarina.

Los resultados de dichos experimentos se ilustran, en parte, en la figura 3. Esta figura muestra la detección zimográfica de la actividad degradadora de gelatina, en los extractos celulares (ver Kleiner et al., supra). Se observó que una especie de proteína de aproximadamente 170 kilodaltons según se determinó mediante SDS-PAGE, presentaba actividad degradadora de gelatina. Esta especie, que se encontró en la línea celular 293-FAP pero no en células 293 no transfectadas, se identificó de esta manera como FAP\alpha. El peso molecular era consistente con un dímero, es decir, con una molécula FAP\alpha dimérica.

La actividad proteolítica indicada en la presente invención, en la que el sustrato es gelatina, no se observó en el caso de que el sustrato fuese caseína.

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Ejemplo 12

A continuación, se llevaron a cabo estudios adicionales para caracterizar el dímero FAP\alpha de 170 kD adicionalmente. Específicamente, se repitieron los experimentos descritos en el Ejemplo 11, excepto en que se añadió 5% de 2-mercaptoetanol o 5 \mul de yodoacetamida a los extractos antes del SDS-PAGE, o ácido etilendiamín-N,N,N',N'-tetraacético (10 mM) al tampón de incubación utilizado para la zimografía de gelatina. Ninguno de dichos tratamientos eliminó la actividad enzimática. En contraste, el calentamiento a 100ºC durante cinco minutos antes de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida eliminó la actividad degradadora de gelatina.

En experimentos adicionales se produjo una proteína de fusión que comprendía los dominios extracelulares de tanto la proteína FAP\alpha como la proteína CD8 murina. Esta proteína quimérica se produjo en un sistema baculovírico en células de insecto. La proteína quimérica mostraba la misma actividad enzimática que FAP\alpha, utilizando el modelo comentado anteriormente.

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Ejemplo 13

Se desarrollaron dos ensayos cuantitativos para la actividad del enzima FAP\alpha utilizando Ala-Pro-7-amino-4-trifluorometil-coumarina (Ala-Pro-AFC) como el sustrato. En el primer formato de ensayo, se mezclaron los extractos de membranas de células que expresan FAP\alpha con un volumen 5 a 10 veces mayor de tampón de reacción (NaCl 100 mM, Tris 100 mM, pH 7,8) y se añadieron a un volumen igual de Ala-Pro-AFC 0,5 mM en tampón de reacción, seguido de una incubación durante una hora a 37ºC. A continuación, se midió la liberación de AFC libre en un fluorímetro utilizando un conjunto de filtros de excitación a 395 nm/emisión a 530 nm. Los extractos de membranas analizados en este formato de ensayo se derivaron da células 293-FAP\alpha (células 293 transfectadas establemente con vector FAP.38, indicado anteriormente) o células HT1080-FAP\alpha (células HT1080 establemente transfectadas con vector FAP.38). Se llevaron a cabo experimentos de control negativo que evaluaban actividades específicas de FAP\alpha con extractos de membranas preparados a partir de las líneas celulares respectivas parental 293 o HT1080. En el segundo ensayo, se aisló FAP\alpha a partir de extractos de membranas de 293-FAP\alpha o HT1080-FAP\alpha mediante un anticuerpo específico para FAP\alpha. Se recubrieron placas ELISA de noventa y seis pocillos durante la noche a 4ºC con 1 \mug/ml de anticuerpo monoclonal F19 en solución salina tamponada con fosfato (PBS). En el caso de CD8-FAP\alpha comentado posteriormente, las placas se recubrieron con anticuerpo F19 tal como anteriormente o con 1 \mug/ml de CD8 de rata antiratón durante la noche a 4ºC. A continuación, los pocillos se lavaron con tampón de lavado (PBS, Tween 20 al 0,1%). El exceso de sitios de unión se bloqueó con tampón de bloqueo (albúmina de suero bovino al 5% en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se separó el tampón de bloqueo; se añadieron extractos de membranas procedentes de células que expresaban 293-FAP\alpha o de células de control y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El material no unido se eliminó, los pocillos se lavaron con tampón de lavado y la actividad de FAP\alpha se sometió a ensayo utilizando 100 \mul de Ala-Pro-AFC (Ala-Pro-AFC 0,5 mM en tampón de reacción) durante una hora a 37ºC. Se midió la liberación de AFC libre tal como anteriormente. La unión de mAb F19 a FAP\alpha no afectó mediblemente su actividad enzimática.

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Ejemplo 14

Utilizando ensayos para la actividad enzimática de FAP\alpha, descritos anteriormente, se identificó un inhibidor de la actividad enzimática de FAP\alpha. Este inhibidor era ácido (S)-valilpirrolidín-2(R)-borónico (Snow et al., J. Am. Chem. Soc. 116:10860-10869, 1994), denominado en la presente invención ValboroPro. ValboroPro inhibe el corte de Ala-Pro-AFC por parte de FAP\alpha con una IC_{50} de 0,11 \muM. ValboroPro también inhibe la actividad gelatinolítica de FAP\alpha a una concentración de 100 \muM. La especificidad de ValboroPro para FAP\alpha se demostró en ensayos con una serina proteasa no relacionada, la tripsina. No se observó inhibición de la tripsina bovina por parte de ValboroPro (hasta 100 \muM) al realizar un ensayo con acetato de carbobenzoxi-L-valinil-glicinil-L-arginil-4-nitranilido como sustrato.

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Ejemplo 15

La identificación de requisitos estructurales específicos para las actividades enzimáticas de FAP\alpha facilita el desarrollo de moléculas que pueden unirse y/o inhibir FAP\alpha. Para examinar si el residuo serina en la posición 624 de la secuencia de aminoácidos predicha del polipéptido FAP\alpha resulta crítica para su función enzimática, se llevó a cabo mutagénesis sitio-dirigida según Zoller et al., DNA 3:479-488, 1984, utilizando métodos estándares de reacción en cadena de la polimerasa. El codón TCC para la serina 624 en el ADNc de FAP\alpha se sustituyó por GCG, resultando en alanina en esta posición. Se reintrodujo el ADN alterado en el vector FAP.38 y se transfectó en células 293 tal como se ha descrito supra. Se seleccionaron las colonias resistentes a geneticina y se examinaron mediante IFA indirecta para la expresión de FAP\alpha utilizando mAb F19, así como otros anticuerpos específicos para FAP\alpha descritos por Rettig et al., J. Cancer 58:385-392, 1995, tal como se ha indicado supra. No se observaron diferencias entre la unión de los anticuerpos anti-FAP\alpha a las células que expresaban FAP\alpha mutante y a las células transfectadas por FAP\alpha de tipo salvaje. La presencia de la mutación se confirmó mediante amplificación del ADN genómico y se llevó a cabo la digestión con enzimas de restricción de varios clones de células transfectadas. Para evaluar la actividad enzimática de la FAP\alpha mutante, se llevaron a cabo los ensayos siguientes. Se prepararon extractos de membranas a partir de tres clones positivos independientes y se examinaron cantidades iguales de proteína FAP\alpha (según se determinó en un ensayo ELISA de doble determinante utilizando dos anticuerpos anti-FAP\alpha que reconocen epítopos diferentes de FAP\alpha) en los ensayos gelatinolítico y de captura de Ala-Pro-AFC. Tanto la actividad gelatinolítica como la actividad observada en el ensayo de captura de FAP\alpha mutante aislado se redujeron hasta niveles indetectables en comparación con la FAP\alpha de tipo salvaje, confirmando el papel de la serina canónica en la tríada catalítica para ambas actividades enzimáticas observadas.

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Ejemplo 16

Se generó una proteína de fusión para obtener enzima FAP\alpha soluble en agua secretado. En esta proteína de fusión, se unión el dominio extracelular de CD8, consisten de los primeros 189 aminoácidos del CD8 murino, al dominio extracelular de FAP\alpha (aminoácidos 27 a 760) tal como describen Lane et al. , J. Exp. Med. 177:1209, 1993, utilizando protocolos estándares de reacción en cadena de la polimerasa y se insertaron en vector pVL39 disponible comercialmente. La transfección de células Sf9 con este vector y la amplificación del baculovirus recombinante resultante se llevaron a cabo tal como se ha descrito con anterioridad (Baculovirus Expression Vectors, O'Reilly, Miller y Luckow, Oxford University Press, 1994). Se aisló la proteína de fusión CD8-FAP en una purificación en dos etapas a partir del medio agotado de células High Five^{TM} infectadas por baculovirus CD8-FAP\alpha durante cuatro días. Las células y los virus se eliminaron mediante ultracentrifugación, el sobrenadante se pasó a través de una columna que contenía heparina-sefarosa (Pharmacia) y se eluyó en etapas con NaCl 0,6, 1,0 y 2,0 M en fosfato 10 mM, pH 7. Las fracciones activas de los eluidos de 1,0 M y 2,0 M se agruparon y se concentraron utilizando un filtro YM-10 y una columna de filtración en gel 26/60 Superdex-200. Se observó actividad en un pico de alto peso molecular que, al someterlo a secuenciación N-terminal en fase gaseosa, se confirmó que era CD8-FAP\alpha. En los ensayos gelatinolíticos, se detectó una actividad superior a 200 kD en el ensayo gelatinolítico al someter a ensayo CD8-FAP\alpha purificado, lo que es consistente con el peso molecular predicho más alto de la proteína de fusión.

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Ejemplo 17

Se ha determinado la presencia de homólogos estructurales y funcionales en especies no humanas. Por ejemplo, el ADNc de la FAP\alpha de ratón ha sido clonado y caracterizado. El examen de la secuencia de aminoácidos predicha de la secuencia de ADNc de la FAP\alpha homóloga de ratón (número de acceso EMBL Y10007) revela un alto grado de conservación de la FAP\alpha en diferentes especies. Las dos proteínas son idénticas al 89% y la tríada catalítica se encuentra conservada en las FAP\alpha humana y del ratón. El alto grado de conservación y la expresión similar en los tejidos sugiere que la FAP\alpha procedente de fuentes no humanas podría ser funcionalmente equivalente a la FAP\alpha humana. Esta conclusión queda confirmada por el resultado de que una proteína de fusión CD8-FAP\alpha murina de diseño similar a la CD8-FAP\alpha humana también demuestra la actividad enzimática dipeptidilpeptidasa esperada utilizando Ala-Pro-AFC como sustrato.

Los ejemplos anteriores describen una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína alfa activadora de fibroblastos ("FAP\alpha"), así como formas diméricas de la molécula, y usos de las mismas. El producto de expresión de la secuencia en COS-1 es una proteína que, en SDS-PAGE de muestras sometidas a ensayo, muestra un peso molecular de aproximadamente 88 kD. La secuencia de aminoácidos deducida, tal como se proporciona en la secuencia SEC ID nº 1, para una forma de la molécula, proporciona un peso molecular de aproximadamente 8 8 kD.

Debe indicarse que existe una aparente discrepancia de peso molecular, al encontrarse glucosilado el aislado COS-1, mientras que el peso molecular de las secuencias de aminoácidos deducidas no incluye la glucosilación. Sin embargo, es conocido que las proteínas membranales muestran una migración aberrante en los sistemas de gel que puede explicar la diferencia observada en la presente invención.

Debe entenderse que, tal como se ha descrito, FAP\alpha puede encontrarse glucosilado, dependiendo el tipo y la cantidad de glucosilación del tipo de célula que expresa la molécula. El experimento descrito en la presente invención demuestra lo anterior. También resulta aplicable a la forma dimérica de la molécula, descrita por primera vez en la presente invención, que presenta un peso molecular de aproximadamente 170 kilodaltons según determinación mediante SDS-PAGE de muestras no sometidas a ebullición.

La invención también comprende la producción de vectores de expresión útiles para producir la molécula FAP\alpha. En su sentido más amplio, dichos vectores comprenden la secuencia codificante completa de FAP\alpha o partes de la misma, operablemente ligada a un promotor. Algunos elementos adicionales pueden formar una parte del vector de expresión, tales como dominios de proteína fusionados con la proteína FAP\alpha o genes de partes de proteína ("proteína de fusión") que proporcionan resistencia a un antibiótico, genes amplificables, y similares.

Las secuencias codificantes y vectores también pueden utilizarse para preparar líneas celulares, en las que la secuencia codificante o el vector de expresión se utiliza para transfectar o para transformar un huésped receptor. El tipo de célula utilizado puede ser procariótico, tal como E. coli, o eucariótico, tal como levaduras, CHO, COS u otros tipos celulares.

La identificación de moléculas de ácido nucleico tales como las proporcionadas en la secuencia SEC ID nº 1 también permite que el experto identifique y aísle aquellas moléculas de ácido nucleico que se hibridan a la misma bajo condiciones restrictivas. La expresión "condición restrictiva" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a aquellos parámetros proporcionados supra, en donde también se identifican las secuencias tanto murinas como de hámster. El experto en la materia reconocerá que dichas condiciones proporcionan un grado de astringencia que puede alcanzarse utilizando parámetros que difieren de aquellos indicados. Dicha discrepancia queda comprendida dentro de la expresión "condiciones restrictivas".

\newpage

La capacidad de las moléculas de ácido nucleico de hibridarse a moléculas complementarias también permite que el experto en la materia identifique las células que expresan FAP\alpha, mediante la utilización de un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos. Pueden utilizarse las secuencias descritas en la invención para la hibridación con secuencias complementarias, identificándolas de esta manera. De este modo puede reconocerse el ARNm, por ejemplo, que se encuentra presente en cualquier célula que exprese la molécula FAP\alpha.

Evidentemente se entiende que las moléculas de ácido nucleico de la invención también resultan útiles para producir FAP\alpha recombinante, tanto en forma monomérica como dimérica. Los ejemplos demuestran claramente que las células huésped son capaces de ensamblar las formas diméricas. La proteína recombinante puede utilizarse, por ejemplo, como una fuente de inmunógeno para la generación de anticuerpos afines a mAb F19, que es conocido, y con los mismos usos. De manera similar, la proteína recombinante, y/o las células que expresan la molécula sobre su superficie, pueden utilizarse en ensayos para determinar los antagonistas, agonistas u otras moléculas que interaccionan con moléculas que presentan actividad de FAP\alpha. Estas sustancias pueden ser, aunque sin limitarse a ellas, substratos, moléculas inhibidoras, anticuerpos, etc. Las moléculas que presentan actividad de FAP\alpha pueden ser, por ejemplo, las formas monoméricas o diméricas de FAP\alpha, derivados que contienen el dominio catalítico y similares. La molécula que presenta actividad de FAP\alpha puede ser pura o encontrarse en forma de un extracto celular, tal como una célula transformada o transfectada, que ha recibido un gen activo de FAP\alpha. Pueden utilizarse tanto procariotas como eucariotas. Esta última característica de la invención debe considerarse a la luz de las similitudes estructurales observadas con los enzimas unidos a membrana. Este tipo de molécula se asocia a determinadas propiedades que no resulta necesario describir en detalle en la presente invención. Resulta suficiente afirmar que la inhibición o la potenciación de estas propiedades asociadas a FAP\alpha es una característica de la presente invención. Por ejemplo, puede identificarse uno o más sustratos para las moléculas de FAP\alpha mediante la utilización de células recombinantes o FAP\alpha recombinante per se. Los sustratos pueden modificarse para mejorar su efecto, para reducir su efecto o simplemente para marcarlos con señales detectables de manera que puedan utilizarse, por ejemplo, para identificar células que expresan FAP\alpha. El estudio de la interacción de sustrato y FAP\alpha, así como la de FAP\alpha y cualquier otra molécula, puede utilizarse para desarrollar y/o para identificar agonistas y antagonistas de la molécula FAP\alpha.

También constituyen una característica de la invención las moléculas de FAP\alpha diméricas aisladas que presentan un peso molecular de aproximadamente 170 kilodaltons según se determina mediante SDS-PAGE, la utilización de las mismas como agente enzimático de corte, y otros usos tales como los descritos en la presente invención. También pueden producirse formas enzimáticamente activas de FAP\alpha en forma de proteínas de fusión recombinantes, tales como proteínas de fusión solubles que comprenden el dominio catalítico de FAP\alpha y otros dominios de proteína con propiedades bioquímicas adecuadas, incluyendo señales secretorias, sitios de corte de proteasa, etiquetas para la purificación y otros elementos conocidos para el experto en la materia. Son ejemplares las secuencias de péptido CD8, tales como las indicadas supra. El hecho de que FAP\alpha presente propiedades particulares, tal como se describe en la presente invención, permite la identificación de la molécula sobre células que la expresan. A su vez, debido a que la molécula de FAP\alpha se asocia a tumores y a células estromales tumorales, el reconocimiento de FAP\alpha por parte de agentes terapéuticos sirve para tratar una condición cancerosa o precancerosa mediante la administración de suficiente agente terapéutico para aliviar la carga de cáncer.

Los experimentos que demuestran las propiedades proteolíticas de FAP\alpha conducen a todavía un aspecto adicional de la invención. Es bien conocido que las proteasas que degradan la matriz extracelular, o proteínas "ECM", presentan un papel importante en determinados aspectos del crecimiento tumoral, incluyendo su efecto sobre la invasión de células tumorales, la formación de vasos sanguíneos en tumores (es decir, la neoangiogénesis) y la metástasis tumoral. Los colágenos resultan de especial interés frente a los sustratos de proteasas, debido a que los colágenos son una parte importante de la ECM. El hecho de que FAP\alpha digiere la ECM sugiere un papel terapéutico para los inhibidores de la molécula. El término "inhibidores", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a moléculas que interfieren con la función enzimática de FAP\alpha. Se encuentra específicamente excluido de dichos inhibidores el anticuerpo monoclonal F19. Este MAb es conocido que se une, aunque no inhibe, la función enzimática de FAP\alpha y por lo tanto no es un inhibidor. Se conoce mucho con respecto a los anticuerpos monoclonales que se unen e inhiben enzimas. Entre los ejemplos adicionales de dichos inhibidores se incluirían, por ejemplo, derivados de sustratos, tales como moléculas de colágeno modificadas, que interfieren con el sitio o sitios activos de la molécula de FAP\alpha. Otros inhibidores adecuados resultarán evidentes para el experto en la materia y no resulta necesario listarlos en la presente memoria. Además, las proteínas FAP\alpha recombinantes y las líneas celulares transfectadas por FAP\alpha descritas supra pueden utilizarse en un ensayo de cribado enzimático utilizando el sustrato indicado supra u otros sustratos adecuados, para identificar inhibidores de entre cualquier biblioteca de compuestos. La identificación de sustancias que interaccionan con moléculas activas de FAP\alpha permite, de esta manera, el tratamiento terapéutico de condiciones en las que un sujeto muestra una actividad de FAP\alpha anormal. Específicamente, se administra una cantidad de una sustancia apropiada, sea un inhibidor (por ejemplo un derivado del colágeno, ácido S-valil-pirrolidín-2(R)-borónico), un agonista o un antagonista, en un sujeto en una cantidad suficiente para normalizar la actividad de FAP\alpha.

Otros aspectos de la invención resultarán evidentes para el experto en la materia y no resulta necesario indicarlos en la presente memoria.

Los términos y expresiones que han sido utilizados se utilizan como términos descriptivos y no limitativos, y al utilizar dichos témrinos y expresiones no existe intención de excluir ningún equivalente de las características mostradas y descritas o de partes de las mismas, reconociéndose que resultan posibles diversas modificaciones que se encuentran comprendidas dentro del alcance de la invención.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTES: Zimmermann, Rainer; Park, John E.; Rettig, Wolfgang; Old, Lloyd J.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNA ALFA DE ACTIVACIÓN DE FIBROBLASTOS DIMÉRICA AISLADA, Y USOS DE LA MISMA

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Felfe & Lynch

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(B): CALLE: 805 Third Avenue

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(C): CIUDAD: New York City

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(D): ESTADO: New York

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(E): PAÍS: E.E.U.U.

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(F): ZIP: 10022

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: disquete, 3,5 pulgadas, almacenamiento de 2,0 MB

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(B): ORDENADOR: IBM PS/2

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS

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(D): PROGRAMA INFORMÁTICO: Wordperfect

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(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/619.280

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-MARZO-19 9 6

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(C): CLASIFICACIÓN: 435

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(vii): DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/230.491

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 2 0-ABRIL-19 94

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(viii): INFORMACIÓN DEL CESIONARIO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Hanson, Norman D.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 30.946

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: LUD 5330.1-PCT

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A): TELÉFONO: (212)688-9200

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(B): TELEFAX: (212)838-3884

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 2.815 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:

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2

3

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A): LONGITUD: 760 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:

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4

5

6

7

Claims

1. Molécula de FAP\alpha dimérica aislada, que presenta un peso molecular de 170 kilodaltons, determinado mediante SDS PAGE, en la que dicha molécula FAP\alpha dimérica es capaz de degradar las proteínas de la matriz extracelular.

2. Molécula FAP\alpha dimérica según la reivindicación 1, en la que cada monómero de dicha molécula FAP\alpha dimérica consiste de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2.

3. Molécula FAP\alpha dimérica según la reivindicación 1, producida recombinantemente.

4. Molécula FAP\alpha dimérica según la reivindicación 3, producida por una célula eucariótica.

5. Método para cortar un dipéptido terminal de fórmula Xaa Pro separándolo de una molécula, que comprende poner en contacto dicha molécula con una segunda molécula, siendo dicha segunda molécula la molécula PAP\alpha dimérica según la reivindicación 1 y presentando FAP\alpha actividad enzimática.

6. Método para identificar una sustancia que interacciona con la molécula FAP\alpha dimérica según la reivindicación 1 que presenta actividad de FAP\alpha, que comprende combinar dicha molécula con una muestra que debe someterse a ensayo, y determinar cualquier interacción con dicha molécula a modo de indicación de la presencia de una molécula que interacciona con una molécula que presenta actividad de FAP\alpha.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha sustancia es un antagonista de la actividad de FAP\alpha.

8. Método según la reivindicación 6, en el que dicha sustancia es un agonista de la actividad de FAP\alpha.

9. Método según la reivindicación 6, en el que dicha sustancia es un inhibidor de la actividad de FAP\alpha.

10. Método según la reivindicación 6, que comprende combinar dicha sustancia con un extracto celular que presenta actividad de FAP\alpha.

11. Método según la reivindicación 10, en el que dicho extracto celular es un extracto de una célula que ha sido transformado o transfectado con una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula con actividad de FAP\alpha.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha célula es un procariota.

13. Método según la reivindicación 11, en el que dicha célula es un eucariota.

14. Método para determinar si una sustancia interacciona con la molécula FAP\alpha dimérica según la reivindicación 1 que presenta actividad de FAP\alpha, que comprende combinar dicha sustancia y dicha molécula con Ala-Pro-AFC, determinar la interacción de dicha molécula con Ala-Pro-AFG y comparar dicha interacción con la interacción de dicha molécula con Ala-Pro-AFC en ausencia de dicha sustancia, en el que una diferencia entre los mismos indica que dicha sustancia interacciona con dicha molécula.