JP4102441B2 - 単離された線維芽細胞活性化タンパク質アルファ二量体、およびその使用 - Google Patents
単離された線維芽細胞活性化タンパク質アルファ二量体、およびその使用 Download PDFInfo
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Description
本出願は、1994年4月20日に出願され現在係属中の出願番号08/230,491号の一部継続出願であり、該出願は本明細書中に含まれるものとする。
発明の分野
本発明は癌組織および反応性腫瘍間質細胞(reactive tumor stromal cell)に関連するある種の分子に関する。より詳細には、本発明は線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(以後「FAPα」)分子に関する。この分子の単量体型は以前に免疫化学的に同定されていたが、これをコードする核酸分子は単離またはクローニングされておらず、二量体も明らかにされていなかった。これらは、とりわけ本発明の特徴である。単量体タンパク質は、煮沸サンプルのSDS-PAGEによって測定すると約88から約95キロダルトンの分子量を有する。二量体は、未煮沸サンプルのSDS-PAGEによって測定すると約170キロダルトンの分子量を有する。FAPαは膜結合酵素に共通で特徴的な多くの特徴を有し、これもまた膜結合酵素であることを強く示唆する。核酸分子は本発明の重要部分であり、FAPαを発現している細胞のプローブとしてもこのタンパク質の組換え生産の出発物質としても有用である。FAPαタンパク質はこのタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するために用いることができ、従ってそれ自体が有用な診断薬となる。それらには本明細書中に記載されているように酵素機能に関連した使用を含めて更なる使用法がある。
背景および従来技術
上皮癌の浸潤性増殖は支持間質における特徴的な細胞及び分子的変化と関連している。例えば、上皮癌は、腫瘍組織血管形成、反応性腫瘍間質線維芽細胞の増加、リンパ系および食細胞の浸潤、ペプチドメディエーター及びプロテアーゼの放出、および改変された細胞外マトリックス(EMC)の産生を誘導する。例えば、Folkman, Adv. Cancer Res. 43: 175-203(1985); Bassetら、Nature 348: 669-704(1990); Denekampら、Cancer Metastasis Rev. 9: 267-282(1990); Cullenら、Cancer Res. 51: 4978-4985(1991); Dvorakら、Cancer Cells 3: 77-85(1991); Liottaら、Cancer Res. 51: 5054s-5059s(1991); Garin-Chesaら、J. Histochem. Cytochem. 37: 1767-1776(1989)を参照せよ。上皮癌の一般的ないくつかの組織学的タイプにおいて、非常によく一致する間質の分子的特色は線維芽細胞活性化タンパク質(FAPα)の誘導であり、これは増殖している培養線維芽細胞に対して作られたモノクローナル抗体mAb F19によって最初に発見された、95,000の分子量が観察される細胞表面の糖タンパク質である。Rettigら、Cancer Res. 46: 6406-6412(1986); Rettigら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3110-3114(1988); Garrin-Chesaら、Proc. Natl. Acad. USA 87: 7235-7239(1990); Rettigら、Cancer Res. 53: 3327-3335(1993)を参照せよ。これらの4つの論文のそれぞれは、そっくり本明細書中に含まれるものとする。
上に引用したような免疫組織化学的研究は、FAPαはある種の正常胎児間葉組織において一過性に発現するが、成人の正常組織は通常FAPα-であることを明らかにした。同様に、悪性の上皮細胞、神経および造血細胞は通常FAPα-である。しかしながら、上皮癌の普通に見られるタイプの大部分、乳癌、肺癌、皮膚癌、膵臓癌および結腸直腸癌の90%以上を含むものが多数のFAPα+反応性間質線維芽細胞を含んでいる。Garin-Chesaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7235-7239(1990)。FAPα+腫瘍間質線維芽細胞はほとんど不変的に腫瘍血管を伴っており、腫瘍血管内皮と悪性上皮細胞クラスターの基底側の間ではっきりした細胞区画を形成している。FAPα-間質線維芽細胞は原発のおよび転移癌腫の双方にみられるが、乳腺線維腺腫(fibroadenomas of the breast)および結腸直腸腺腫などのような良性および前悪性の上皮病変はFAPα+間質細胞をごく稀にしか含まない。上皮性腫瘍中の間質−特異的なFAPαの局在と対照的に、FAPαは骨および軟組織の肉腫の大部分の悪性細胞中で発現している(Rettigら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3110-3114(1988)。最後に、FAPα+線維芽細胞は治癒しつつある傷の肉芽組織中に検出されている(Garin-Chesaら、上記文献)。正常組織におけるFAPαの限定された分布パターンおよび多くの上皮癌の支持間質における一様な発現に基づいて、131I−ラベルしたmAb F19を用いた臨床試験が転移性大腸癌の患者で始められており(Weltら、Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 33: 319(1992); Weltら、J. Clin. Oncol. 12: 1561-1571(1994))、上皮癌の免疫検出及び免疫療法のための「腫瘍間質ターゲッティング(tumor stromal targeting)」の概念を探りつつある。
RettigらInt. J. Cancer 58: 385-392(1994)は本明細書に含まれることとするが、この中でFAPα分子とその性質について論述している。RettigらはFAPαは400キロダルトンを越える高分子複合体として見られると仮定しているが、二量体分子の可能性について議論しておらず、この論文はまたこの分子の特異的な酵素的性質について詳述してもいない。
胎児の発育、組織修復および発癌の際の組織再構築の時及び部位におけるFAPα+の誘導は、正常な線維芽細胞の生理機能におけるこの分子の基本的な役割と一致している。従って、この分子をコードする核酸分子を単離してクローニングすることは興味深くかつ価値あることである。これは本発明の特徴の1つであり、本発明の他の特徴と共に、以下の開示において詳細に説明する。本発明の更なる特徴はFAPα分子の二量体および、この分子の性質の利用を含む。これらの特徴は以下に詳しく述べる。
【図面の簡単な説明】
図1は、FAPαの予測されるアミノ酸配列とCD26の既知配列との比較である。アラインメントは最適化した。
図2A〜2Hは、いずれも種々の組織中のFAPαおよびCD26の免疫組織化学的検出を示すものである。図2Aおよび2Bにおいては、FAPα(図2A)およびCD26(図2B)について乳癌を調べた。図2Cおよび2Dにおいては、FAPα(図2C)およびCD26(図2D)について悪性線維性組織球腫を調べた。図2E(FAPα)および2F(CD26)においては皮膚瘢痕組織を調べた。図2G(FAPα)および2H(CD26)においては腎細胞癌腫を調べた。
図3は、実験で得た、FAPαが細胞外マトリックス(ECM)タンパク質分解活性を有することを示すいくつかのデータを表すものである。酵素活性を保つため未煮沸のサンプルを用いて293-FAPのゼラチン分解性抽出物のザイモグラフ検出を行ったところ、活性物質はSDS-PAGEで約170kDの分子量を有することが分かった。
好ましい実施態様の詳細な説明
実施例 1
線維芽細胞株WI-38は、従来よりmAb F19と反応することが観察されていた(Rettigら、Can. Res. 46: 6406-6412(1986); Rettigら、Proc. Natl. Acad. USA 85: 3110-3114(1988); Garin-Chesa.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7235-7239(1990); Rettigら、Canc. Res. 53: 3327-3335(1993))。以下の実験においてこれを用いた。
よく知られた技法および商業的に入手可能な材料を用いて、WI-38からcDNAライブラリーを調製した。具体的には、Fast Track mRNA単離キットおよびLibrarian cDNAファジミドシステムを用いて発現ベクターpCDNAI中にライブラリーを構築した。ライブラリーが調製されたら、このベクターを大腸菌(E. coli)細胞株MC 1061/P3中にエレクトロポレーションした。pCDNAI発現ベクターは抗生物質耐性遺伝子を含むので、大腸菌は抗生物質耐性によって選択できた。次に耐性のコロニーを更に実験に用いた。、SambrookらのMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab, Cold Spring Harbor, N.Y.第2版1989)に従って、アルカリ溶菌及びCsCl2精製によってそのコロニーからプラスミドDNAを得た。この技法は技術的によく知られたものであるが、本明細書中に含まれるものとする。
プラスミドDNAを単離したら、それをCOS-1細胞をトランスフェクトするために用い、次にその細胞を48時間培養し、その後細胞を抗体をコートしたシャーレでテストした。Rettig(1986)らの上述の文献に記載されたように、用いたmAbにはF19が含まれる。また、前記文献全体は本明細書に含まれるものとする。COS-1細胞は通常FAPα-であるので、どんな陽性の結果もコーディング配列の存在を示すものである。免疫学的選択方法(immunoselection protocol)はAruffoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365-3369(1987)の方法であり、この文献は本明細書に含まれるものとする。
Hirt, J.mol. Biol. 26: 365-369(1967)に従って陽性のクローンからプラスミドを回収し、大腸菌MC 1061/P3に再導入し、COS-1細胞で再選択した。
ここに示した手順をあと4回行った。その後、50の単離したバクテリアのコロニーのプラスミドDNAをQiagenプラスミドキットを用いて精製した。このコロニーのうち27クローンはEcoRI制限酵素マッピングによって決定したところ同一の2.8kbのインサートを含んでいることが分かった。COS-1細胞中での一過性発現およびmAb F19による直接免疫蛍光染色で決定したところそれらのいくつかはFAPα-特異的cDNAを含むことが分かった。それらのクローンのひとつ、すなわち、「pFAP.38」を以下に詳述するようにさらなる研究のために選んだ。
実施例 2
pFAP.38が同定されると、既知の細胞表面マーカーCD26をコードするベクター(「pCD26」)と共に、および対照ベクターpCDNA Iと一緒にテストした。これらの実験においては、COS-1細胞をpFAP.38、pCD26、またはpCDNAIの1つでトランスフェクションした。48時間後、細胞表面の抗原発現に対するよく知られたMHAロセットアッセイを用いて、トランスフェクタントをテストした。これらの実験では、FAPα特異的なmAb F19を用い、それと共にCD26特異的なmAb EF-1を用いた。他の4つのFAPα特異的mAb、すなわち、FB23、FB52、FB58およびC48も用いた。mAb F19と反応する(SW872脂肪肉腫)あるいはEF-1と反応する(SK-OV6卵巣癌)として知られる、2つの癌細胞株もテストした。その結果を以下の表1に示した。
実施例 3
次に抗体の標的となっている抗原を明らかにするために免疫沈降実験をおこなった。
細胞をTrans 35S−ラベル(ICN)で代謝的にラベルし、溶解バッファー(0.01MTris-HCl/0.15M NaCl/0.01M MgCl2/0.5%ノニデットP-40/アプロチニン(20μg/ml)/2mMフェニルメチル-スルホニルフルオリド)で抽出し、その後免疫沈降した。用いた手法はよく知られたもので、引用文献としてRettigら、Canc. Res. 53:3327-3335(1993);およびFellingerら、Canc. Res. 51: 336-340(1991)に見ることができ、これらの開示はすべて本明細書にそっくり含まれるものとする。沈降用mAbは、負の対照としてのマウスIg、mAb F19またはEF-1とした。対照テストは偽トランスフェクションした(mock transfected)COS-1細胞で行った。免疫沈降に続いて、この免疫沈降物を抽出バッファー中で煮沸し、還元条件下でNaDodSO4/PAGEによって分離した。いくつかの実験においては、免疫沈降した物質がグリコシル化されているかどうか調べるために、さらなるテストを行った。これらの実験においては細胞抽出物は免疫沈降する前にCon A-セファロースで分画した。免疫沈降後、但しNaDodSO4/PAGE分画前に、これらの免疫沈降物をN-グリカナーゼで消化した。
その結果、COS-1細胞では、(SDS-PAGEで定めたところ)pFAP.38は88kdタンパク質種を発現させていることが示され、これはSW872または培養線維芽細胞が産生する95kdのFAPα種よりも僅かに小さい。N-グリカナーゼ消化はほぼ同じ大きさのペプチド(75kdに対して74kd)を生じ、このことはCOS-1細胞中のFAPαタンパク質のグリコシル化はヒト細胞株におけるものと異なっていることを示す。
実施例 4
次に、FAPα+線維芽細胞株WI-38およびGM05389およびFAPα-卵巣癌細胞株SK-OV6のmRNAを用いて古典的なノーザンブロット解析を行った。Sambrookらの上述の文献の方法を用い、各細胞株からの5マイクログラムのmRNAをテストした。用いたプローブは32Pラベルしたもので、pFAP.38の2.3kb ECO RI断片、CD26の2.4kb Hind III断片、γ-アクチンcDNAの1.8kbBamHI断片から調製した。これらの断片は1%アガロースゲルから精製した。
FAPα+線維芽細胞株の抽出物は2.8kb FAP mRNA種を示したが、SK-OV6の抽出物は示さなかった。γ−アクチンmRNA種(1.8kb)は全ての種で観察された。
実施例 5
FAPαをコードするとして同定されたcDNAを更に詳細な解析にかけ、最初にシーケンシングを行った。Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467(1977)に記載された古典的なSanger方法論を用いてcDNAの両方の鎖をシーケンシングした。これが確定した後、これからアミノ酸配列を推測した。この情報は配列番号1に提示した。次に、この配列を既知のCD26のアミノ酸配列(Morimotoら、J. Immunol 143:3430-3437(1989))と比較した。図1は最適化配列アラインメントを用いてその比較を示したものである。比較の中でギャップはすべてアステリスクで、同一のアミノ酸はダッシュでCD26配列中に示した。推定される疎水性膜貫通配列は二重線を引き、考えられるN-グリコシル化部位は一重線を引いた。
配列解析により2812塩基対のインサートが示され、その中の2277塩基対がオープンリーディングフレームを構成する。このORFは塩基番号209のATG開始コドンから始まり、2486のTAA停止コドンまで及んでいる。
推定されるポリペプチドは760アミノ酸長であり、87,832の分子量がある。これに対して、N-グリカナーゼ消化して、免疫精製したFAPαは、NaDosSO4/PAGE上で見積もると75,000のMrを有することが報告されている(Rettigら、Canc. Res. 53:3327-3335(1993))。GenBankデータベース検索を行った。見つかった最も密接に関連する遺伝子はジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV;EC3.4.14.5)ホモローグであり、ヒトDPPIV(T-細胞活性化抗原CD26としても知られている)との間では、61%の核酸配列の同一性および48%のアミノ酸配列の同一性を示した。
関連する遺伝子の第2の組は、ヒト、ラットおよびウシのDPPXホモローグであり、これは脳および他の正常組織で広く発現している機能未知の遺伝子である。予測されるヒトDPPX遺伝子産物はFAPαおよびCD26と約30%のアミノ酸配列の同一性を示す。FAPα分子はII型膜内在性タンパク質に典型的な構造的特徴を示し、長いCOOH-末端細胞外領域と、疎水性膜貫通断片と、短い細胞質尾部を含んでいる。推定される細胞外領域は、可能性ある5つのN-グリコシル化部位と、11のシステイン残基(うち8つはFAPαとCD26の間で保存されている)およびDPPIVのようなセリンプロテアーゼに特徴的な高度に保存された触媒領域と一致する3つの断片を含んでいる。これらの保存された配列は、以下の表2に示す。DPPIVおよびDPPXとの比較はMorimotoらの上述の文献;Wadaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:197-201(1992);Yokotaniら、Human Mol. Genet. 2:1037-1039(1993)において行われている。
実施例 6
FAPα関連配列が非人類に存在するかどうかを決定するために一組の追加実験を行った。これを行うために、ヒト、マウス、およびチャイニーズハムスターのゲノムDNAを制限酵素で消化し、上述の32Pラベルした2.3kb断片を用いてサザンブロッティングによってテストした。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな洗浄条件(0.1 x SSC、0.1% NaDodSO4、68℃)で行った。マウス及びハムスターDNAの双方でクロスハイブリダイゼーションが容易に観察され、高度に保存されたFAPαホモローグの存在が示唆された。上述したCD26 cDNA断片を用いた対照実験においてはクロスハイブリダイゼーションの証拠は見られなかった。
実施例 7
CD26分子はFAPβと多くの生化学的および血清学的特徴を共通にし、FAPβは以前に記述されている、105kdの分子量を有するFAPαの関連分子であり、培養線維芽細胞およびメラニン細胞に見られる(Rettigら、Canc. Res. 53: 3327-3335(1993))。FAPβがCD26遺伝子産物であるか否かを決定するためにコトランスフェクション実験を行った。これをテストするために、上述したpFAP.38またはpCD26によるトランスフェクションに用いたのと同じ手順を用いたが、2つのベクターを用いて行った。上に示した結果はコトランスフェクションの効率は各ベクターに対して約40%であることを示し、従って約10〜20%の細胞がコトランスフェクションされるであろう。
コトランスフェクションに続いて、COS-1細胞を上述のようにTrans 35S-ラベルし、その後上述のように溶解した。
生じた細胞抽出物をCon Aセファロースで分離し、抗原(FAPαおよび/またはCD26)をCon A−結合分画中に回収した。結合分画は0.25M α-D-マンノピラノシドで溶離した。次に上述したように免疫沈降を行い、沈降物をこれもまた上述したようにNaDodSO4/PAGE上で分離した。
pFAP.38のみでトランスフェクションされた細胞はFAPαを産生したがFAPβは産生しなかった(mAb F19免疫沈降から決定した)。これらはCD26抗原も産生しない(EF-1でテストした)。pCD26単独でトランスフェクションされた細胞はCD26を産生したがFAPαは産生しなかった。コトランスフェクタントはmAb F19沈降物で調べたところ、CD26及びFAPα/FAPβヘテロマーを産生した。この結果は、FAPβがCD26遺伝子産物であることの直接的証拠を提供するものである。
実施例 8
従来からある種のヒト培養細胞がFAPαおよびCD26を同時発現し、FAPα/CD26ヘテロマー形成を示すことが観察されている。しかしながら、従来の免疫組織化学的研究によって決定されたところによるとFAPαおよびCD26のin vivoの分布パターンは重ならないように見える(Rettigら、Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85:3110-3114(1988); Garin-Chesaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7235-7329(1990); Rettigら、Canc. Res. 53: 3327-3335(1993); Steinら、Knapら編集のLeukocyte typing IV-white cell differentiation antigens, pp412-415(Oxford University Press, N.Y. 1989), pp412-415;
ら、J. Exp. Immunol. 74: 431-437(1988)を参照せよ)。FAPα/CD26相互結合の潜在的重要性を考慮して、正常組織およびFAPα+線維芽細胞を含むことが知られている損傷組織およびFAPα+悪性細胞を平行免疫組織化学的染色(side by side immunohistochemical staining)することにより組織分布を再検査した。
サンプルをテストするため、液体窒素で予め冷却したイソペンタン中で凍結して、OCTコンパウンド中に埋め込み、使用するまで-70℃に保存した。5マイクロメーター厚の切片を切り、ポリ-L-リジンコートしたスライド上にマウントし、空気乾燥し、冷却アセトン中で固定した(4℃、10分間)。次にこの切片を、よく知られたアビジン−ビオチン免疫−ペルオキシダーゼ法を用いて、mAb(10〜20μg/ml)でテストした。この方法は例えば、Garin-Chesaら、J. Histochem. Cytochem. 37: 1767-1776(1989); Garin-Chesaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7235-7239(1990); Rettigら、Canc. Res. 53: 3327-3335(1993); Garin-Chesaら、Am. J. Pathol. 142: 557-567に記載されている。
結果を図2に示してある。乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌および肺癌はFAPαの強い発現を示しCD26は見られなかった(図2Aおよび2Bを見よ)。悪性線維芽組織球腫を含む5種のFAPα+肉腫(図2Cおよび2D)をテストしたが、CD26の発現は無かった。治癒しつつある皮膚損傷の反応性線維芽細胞を調べたところ(図2E、2F)、FAPαおよびCD26の両方を多量に発現していることが示された。テストした3つの腎癌は(図2G、2H)は悪性の悪性上皮細胞中でCD26が発現していることを示した。FAPαは悪性上皮細胞中には存在せず、それらの癌腫の間質中で低く発現していることが示された。
実施例 9
FAPαをコードしたcDNAでトランスフェクションした哺乳動物細胞株を調製した。
ヒト胎児腎細胞株293はよく知られており、広く、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)から入手可能である。
293のサンプルを、インキュベーター内で37℃、95%空気5%CO2の大気中で維持した。細胞をダルベッコ改変最少基本培地(Dulbecco’s modified minimal essential medium)およびハムF12培地(Ham’s F12 medium)の50:50の混合、10%ウシ胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した培地中で培養した。Ustarら、Eur. Mol. Biol. J. 1991および/またはParkら、J. Biol. Chem. 169: 25646-25654(1994)、これらは両方とも本明細書に含まれるものとするが、これらに記載された方法に従って、FAPαのcDNA(すなわち配列番号1)を293細胞にトランスフェクションした。cDNAベクターの詳細は上に記載した(pFAP.38)。トランスフェクタントは抗生物質の耐性で選択し(200μg/mlジェネティシン)、ジェネティシンを含む選択培地中で維持した。
耐性細胞の個々のコロニーを拾い、6穴組織培養プレート中でコンフルエントになるまで増殖させ、上述したようにFAPα特異的モノクローナル抗体F19を用いて免疫蛍光アッセイ(IFA)でFAPα発現についてテストした。
FAPαを発現しているコロニーを広げ、これも上述したように間接IFAおよび細胞蛍光解析によって観察した。
IFAはトランスフェクタントについては陽性であり、それらのトランスフェクタントは以後細胞株293-FAPと称することとするが、親株の293では陰性であった。
実施例 10
実際に組換えFAPαが産生されているかどうかを確かめるため、一連の免疫沈降実験を行った。それらは、Parkらの上述の文献、およびRettigら、Canc. Res. 53:3327-3335(1993)の方法に従った。また、これらの文献は本明細書中に含まれるものとする。本質的には、35[S]メチオニンラベルした細胞抽出物をモノクローナル抗体F19と上述のやり方で一緒にした。次に沈降物を抽出バッファー中で煮沸し、SDS-PAGEゲル上で泳動し、マウスIgG1を負の対照とした。細胞株293-FAPおよびトランスフェクションされていない株293の両方をテストした。その結果、トランスフェクションされた細胞株293-FAPによって組換えFAPαが産生されていることが明確に示された。このことは、FAPα特異的なモノクローナル抗体F19を用いた免疫沈降解析によって決定された。
実施例 11
組換えFAPαを産生できるようになったことはこの分子の特性についてのさらなる研究を可能にした。具体的には、前の実施例において概説した構造的特徴が与えられているので、FAPαが酵素活性を有するかどうかを決定する実験を計画した。FAPαが細胞外マトリックス(ECM)タンパク質分解活性を有するか否かをテストするために実験を計画した。
抽出バッファー(0.15M NaCl、0.05M Tris-HCl、pH7.4、10mM MgCl2、1パーセントTriton X-114)を用いて293-FAP細胞の抽出物を調製し、遠心(4,000xg、10分間、4℃)できれいにし、37℃、10〜20分間、相分離させた。これをさらに続いて遠心(4,000xg、20〜25℃で20分間)した。界面活性剤相をバッファー(0.15M NaCl、0.05M Tris-HCl、pH7.4、5mM CaCl2、5mM MgCl2、0.75% Empigen BB)で希釈し、Rettigらの上述の文献に従ってコンカナバリンA-セファロースで分離した。コンカナバリンA結合分画をすべて0.25Mメチル-α-D-マンノピラノシド入りの溶離バッファー(0.15M NaCl、0.05M Tris-HCl、pH7.4、5mM CaCl2、5mM MgCl2、0.1%Triton X-100)で溶離し、ザイモグラフィーサンプルバッファー(0.25M Tris-HCl、pH6.8、8% SDS、40%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー)と3:1の割合で混合し、さらに解析に用いた。
サンプルの一定量を0.1%のゼラチンまたはカゼインのいずれかを含むポリアクリルアミドゲル上に載せた。Biorad Mini-ProteinIIシステムで、20mA定電流で1.5〜2時間、サンプルのブロモフェノールブルー色素の先端がゲルの底部に達するまで電気泳動を行った。ゲルを外しTriton X-100の2.5%水溶液中、20〜25℃で1時間、ロータリーシェーカー上でインキュベートした。Triton X-100溶液をデカンテーションし酵素バッファー(0.05M Tris-HCl、pH7.5、0.2M NaCl、5mM CaCl2、5mM MgCl2、0.02% Brij 35)に置き換えた。そのゲルを次に37℃または41℃でインキュベーションし、その後室温で染色または脱染色した。ゲルを0.5%クマシーブリリアントブルーG-250(Coomassie Brilliant Blue G-250)30%メタノール、10%酢酸の水溶液でそれぞれ15分、30分、60分間染色した。続いてゲルを30%CH3OH、5%グリセロールの水溶液中でインキュベーションし、次にセロファンシートの間で乾燥させた。
ゼラチナーゼ活性はKleinerら、Anal. Biochem. 218: 325-329(1994)に従って評価した。この文献はそっくり含まれるものとする。これはゼラチンを消化できるプロテアーゼが存在するか否かを決定するために用いられる慣用的アッセイである。分子量を決定するために、同じゲルにラベルした分子量スタンダードを還元条件下で泳動した。
同定されたアミノ酸配列モチーフに対するタンパク質分解性活性は、よく知られた膜オーバーレイアッセイ(membrane overlay assay)を用いてテストした。Smithら、Histochem. J. 24(9):637-647(1992)を参照せよ。またこれは本明細書に含まれるものとする。Ala-Pro-7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン、Gly-Pro-7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン、およびLys-Pro-7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンを基質とした。
これらの実験の結果の一部を図3に記述した。この図は、細胞抽出物中にゼラチン分解活性がザイモグラフ検出されたことを示す。Kleinerらの上述の文献を参照せよ。SDS-PAGEによる決定ではおよそ170キロダルトンのタンパク質種がゼラチン分解活性を有することが観察された。このタンパク質種は、293-FAP細胞株には見られたがトランスフェクションしていない293細胞では見られず、従ってFAPαとして同定される。分子量は二量体、すなわち二量体FAPα分子に一致する。
ゼラチンが基質であるときにここで観察されたタンパク分解活性は、カゼインが基質の場合は観察されなかった。
実施例 12
さらに170kd FAPα二量体を特徴づけるためこの後さらに研究を行った。具体的には実施例11に記載した実験を繰り返したが、但し、5%の2-メルカプトエタノールまたは5umヨードアセトアミドをSDS-PAGEの前に抽出物に加え、または、エチレンジアミンN,N,N’,N’-テトラ酢酸(10mM)をゼラチンザイモグラフィーに用いるインキュベーションバッファー中に加えた。これらの処理のどれも酵素活性を失わせなかった。対照的に、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動のまえに100℃で5分間加熱するとゼラチン−分解活性は失われた。
Smithら、Histochem J. 24(9): 643-647(1992)、この文献は本明細書中に含まれるものとするが、これに記載された膜オーバーレイアッセイを用いて更に調べると、テストしたAla-Pro、Gly-ProおよびLys-Proのジペプチドを全て切断することが明らかになった。
さらなる実験において、FAPαとマウスのCD8タンパク質の双方の細胞外領域を含む融合タンパク質を作り出した。このキメラタンパク質は昆虫細胞中でバキュロウイルスシステムで作った。このキメラタンパク質は、上記で論じたモデルを使うと、FAPαと同じ酵素活性を示した。
実施例 13
FAPα酵素活性の2つの定量的アッセイ法が、Ala-Pro-7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン(Ala-Pro-AFC)を基質として開発された。第1のアッセイ形では、FAPα-発現細胞の膜抽出物を5〜10倍体積の反応バッファー(100mM NaCl、100mM Tris pH7.8)と混合し、反応バッファーに溶かした0.5mM Ala-Pro-AFCの同体積に加え、その後37℃で1時間インキュベーションした。次に、遊離のAFCの放出を395nm励起/530nm放射フィルターセットを用いた蛍光測定器で測定した。このアッセイ形で解析した膜抽出物は、293-FAPα細胞(上述のFAP.38ベクターで安定にトランスフェクションされた293細胞)またはHT1080-FAPα細胞(FAP.38ベクターで安定にトランスフェクションされたHT1080細胞)のいずれかに由来する。FAPα-特異的活性を評価する負の対照実験はそれぞれの親である293またはHT1080細胞株から調製した膜抽出物で行った。第2のアッセイ法では、FAPαに特異的な抗体によって293-FAPαまたはHT1080-FAPα膜抽出物からFAPαを単離した。96ウェルELISAプレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶かした1μg/ml F19モノクローナル抗体により4℃で一晩コーティングした。以下で議論するCD8-FAPαの場合には、プレートは上記のようにF19抗体で、または1μg/mlラット抗-マウスCD8により、4℃で一晩コーティングした。次にウェルを洗浄バッファー(PBS、0.1% Tween 20)で洗浄した。過剰な結合部位をブロッキングバッファー(PBSに溶かした5%ウシ血清アルブミン)で室温、1時間ブロックした。ブロッキングバッファーを除き;293-FAPα発現細胞または対照細胞の膜抽出物を加え室温で1時間インキュベーションした。未結合の物質を除去し、ウェルを洗浄バッファーで洗い、FAPα活性を100μlのAla-Pro-AFC(反応バッファーに溶かした0.5mM Ala-Pro-AFC)を用いて37℃、1時間でアッセイした。遊離AFCの放出を上記のように測定した。mAb F19の結合は、測定できるほどに酵素活性に影響を与えなかった。
実施例 14
上述のFAPα酵素活性のアッセイ法を用いて、FAPα酵素活性のインヒビターが同定されている。このインヒビターは(S)-バリルピロリジン-2(R)-ボロン酸(Snowら、J. Am. Chem Soc.(1994)116:10860-10869)であり、以後ValboroProと表す。ValboroProはFAPαによるAla-Pro-AFCの切断を阻害し、IC50は0.11μMである。ValboroProはまた、FAPαのゼラチン分解活性を100μMの濃度で阻害する。ValboroProのFAPαに対する特異性は、無関係のセリンプロテアーゼ、トリプシンによるテストで示された。カルボベンゾキシ-L-バリニル-グリシニル-L-アルギニル-4-ニトラニリドアセテート(carbobenzoxy-L-valinyl-glycinyl-L-arginyl-4-nitranilide acetate)を基質に用いてアッセイした場合に、ValboroProによるウシ・トリプシンの阻害は全く見られなかった。
実施例 15
FAPαの酵素活性のために特異的、構造的に要求されることを明らかにすると、FAPαに結合し及び/又は阻害する分子の開発が容易になる。FAPαポリペプチドの予測されるアミノ酸配列の位置624のセリン残基がその酵素機能に重要であるか否かを調べるために、Zollerら、DNA 3:479-488(1984)に従い、標準的なポリメラーゼ連鎖反応法を用いて部位特異的突然変異誘発を行った。FAPα cDNA中のセリン624をコードするTCCコドンをGCGコドンに置き換え、これによりこの位置がアラニンとなる。改変したDNAをFAP.38に再導入し上述したように293細胞にトランスフェクションした。ジェネティシン耐性コロニーを選択し、上述したように、mAb F19およびRettigら、J. Cancer 58:385-392(1994)に記載された他のFAPα特異的抗体を用いてFAPα発現について間接IFAによって調べた。抗FAPα抗体の変異FAPα発現細胞への結合について、野生型FAPαをトランスフェクションした細胞に比較して相違が全く見られなかった。変異が存在することは、トランスフェクションした細胞のいくつかのクローンについてゲノムDNAを増幅して制限酵素消化することによって確かめた。変異FAPαの酵素活性を評価するために、以下のテストを行った。3つの独立した陽性クローンから膜抽出物を調製し、等量のFAPタンパク質(FAPαの別々のエピトープを認識する2つの抗体を用いて二重測定(double-determinate)ELISAアッセイによって決定)をゼラチン分解アッセイおよびAla-Pro-AFCキャプチャーアッセイ(capture assay)で調べた。単離した変異FAPαの、ゼラチン分解活性およびキャプチャーアッセイにおける活性は野生型FAPαに比較して検出できない程度まで減少し、双方で観察された酵素活性に関して触媒三つ組残基(catalytic triad)における正統的(canonical)セリンの役割が確認された。
実施例 16
分泌される水溶性FAPα酵素を得るために融合タンパク質を作り出した。この融合タンパクにおいては、Laneら、J. Exp. Med. 177:1209(1993)に記載されたように標準的なポリメラーゼ連鎖反応を用い、マウスCD8の最初の189アミノ酸からなるCD8の細胞外領域をFAPαの細胞外領域(アミノ酸27から760)に結合して、商業的に入手可能なpVL1393ベクターに挿入した。このベクターによるSf9細胞のトランスフェクションおよび生じた組換えバキュロウイルスの増幅は記載されているように(Baculovirus Expression Vectors, O’Reilly, MillerおよびLuckow, Oxford University Press, 1994)行った。CD8-FAP融合タンパク質は、CD8-FAPαバキュロウイルス感染4日後のHigh FiveTM細胞の使用後の培地から2段階精製で単離した。細胞およびウイルスを超遠心によって除き、上清をヘパリン−セファロース(ファルマシア(Pharmacia))の入ったカラムに通し、0.6、1.0および2.0M NaCl 10mMリン酸、pH7で段階的に溶離した。1.0および2.0M溶離液からの活性分画を集めYM-10フィルターと26/60Superdex-200ゲル濾過カラムを用いて濃縮した。活性は高分子量ピークに観察され、これをN-末端気相シーケンシング(N-terminal gas phase assya)にかけるとCD8-FAPαであることが確かめられた。ゼラチン分解性アッセイにおいて、精製CD8-FAPαをテストするとゼラチン分解性アッセイで200kDより大きいところに活性が検出され、これは融合タンパク質の予測される高い分子量と一致する。
実施例 17
構造的および機能的ホモログが非人類に存在するかどうかが確かめられてきた。例えば、マウスFAPαのcDNAがクローニングされ特徴が明らかにされている。相同なマウスFAPα cDNA配列(EMBLアクセション番号Y10007)の予測されるアミノ酸配列を調べると、種間にわたるFAPαの高度な保存性が明らかになる。2つのタンパク質は89%同一で触媒三つ組残基はヒトFAPαとマウスFAPαとの間で保存されている。高度に保存されていることと同様な組織で発現されていることは、非ヒト供与源からのFAPαがヒトFAPαと機能的に等価であるかもしれないことを示唆する。この結論は、CD8-ヒトFAPαと同様な設計のCD8-マウスFAPα融合タンパク質も、Ala-Pro-AFCを基質として用いて期待したジペプチジルペプチダーゼ酵素活性を示すことが見つかったことにより確かめられた。
前述の実施例は、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(「FAPα」)をコードする単離した核酸分子および、そのタンパク質分子の二量体、およびそれらの使用を記述する。COS-1細胞におけるこの配列の発現産物は、煮沸サンプルのSDS-PAGEによれば約88kdの分子量を示すタンパク質である。推測されるアミノ酸配列は、配列番号2に示したように、この分子の1形態として、約88kdの分子量を与える。
注意すべきは、COS-1単離物はグリコシル化されているのに対して、推測されるアミノ酸配列の分子量はグリコシル化を考慮していないため、分子量に明らかな不一致があることである。しかしながら、膜タンパク質はゲルシステムで異常な移動度を示すことが知られており、ここで観察された違いを説明できるかもしれない。
キメラおよび融合タンパク質も本発明の一部であり、これらはFAPα分子の触媒領域を含むFAPαの一部およびそれに加えて非FAPα構成要素を含む。FAPα触媒領域自体も本発明の一部である。
述べたようにFAPαはグリコシル化されることがあり、グリコシル化の型と量はこの分子を発現している細胞のタイプに依存して変化することは勿論である。本明細書に記載した実験はそのことを示している。この分子の二量体型についてもこれは事実であり、二量体型は本明細書ではじめて記載され、未煮沸サンプルのSDS-PAGEによって決定した約170キロダルトンの分子量を有する。
本発明はまた、FAPα分子を産生するのに有用な発現ベクターを作ることを含む。もっとも広い特徴においては、これらのベクターは機能するようにプロモーターに結合された、FAPαコーディング配列全体またはその一部を含んでいる。FAPαタンパク質またはタンパク質部分に融合したタンパク質領域(「融合タンパク質」)、抗生物質耐性を与える遺伝子、増幅可能遺伝子などのような付加的要素が発現ベクターの一部であってもよい。
コーディング配列およびベクターは細胞株を調製するために用いてもよく、コーディング配列または発現ベクターは受容宿主をトランスフェクションまたはトランスフォーメーションするために用いられる。用いられる細胞のタイプは大腸菌のような原核細胞または酵母、CHO、COSまたは他のタイプの細胞のような真核細胞であってもよい。
配列番号1に記載したように核酸分子が同定されると、当業者はストリンジェントな条件下でこれにハイブリダイズする核酸分子を同定し単離することが出来るようになる。本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」とは、上述したパラメーターをいい、その条件でマウス及びハムスターの配列も同定された。これらの条件はストリンジェンシーの程度を与えるものであって、列挙した条件から変えたパラメーターを用いて達成できることが当業者に分かるであろう。そのような変動は「ストリンジェントな条件」という表現に含まれる。
核酸分子が相補的な分子にハイブリダイズできることにより当業者は核酸ハイブリダイゼーションアッセイを用いることによりFAPαを発現している細胞を同定することができるようになる。本発明に記載された配列を用いて、相補的な配列にハイブリダイズさせ、かつ、それらを同定してもよい。このように、例えばFAPα分子を発現しているどの細胞中に存在するmRNAをも標的とすることができる。
本発明の核酸分子はまた、組換えFAPαを単量体および二量体のどちらの型でも産生するのに有用である。実施例は、宿主細胞が二量体型をアッセンブルすることができることを明確に示している。組換えタンパク質は、例えば既知のmAb F19に類似で同じ使用法の抗体を作り出すための免疫原として用いてもよい。同様に、組換えタンパク質および/または表面にその分子を発現している細胞はアンタゴニスト、アゴニスト、またはFAPα活性を有する分子と相互作用する他の分子を決定するためのアッセイに用いてもよい。そのような物質は、基質、阻害分子、抗体その他であるが、必ずしもこれらに限定するものではない。FAPα活性を有する分子は、例えばFAPαの単量体型または二量体型、触媒領域を含む誘導体その他であってもよい。FAPα活性を有する分子は純粋なものでも、FAPα活性遺伝子を受け取ったトランスフォーメーションまたはトランスフェクションされた細胞のような細胞抽出物の形であってもよい。原核生物および真核生物のどちらも用いることができる。本発明のこの最後の特徴は、膜結合酵素に対する観察された構造的類似に照らして考慮されるべきである。このタイプの分子はある種の特性と関連しているがここでは詳しく述べる必要はない。FAPαとの関連においてこれらの性質の阻害または増強は本発明の特徴であることを述べれば十分である。たとえば、組換え細胞または組換えFAPα自体を用いることによってFAPαの基質を同定してもよい。基質は修飾してその効果を増大させ、その効果を減少させ、又は単にそれらを検出可能なシグナルでラベルして、例えばFAPαを発現している細胞を明らかにするために用いることもできる。基質とFAPαとの相互作用、およびFAPαと何らかの分子との相互作用の研究は、FAPα分子のアゴニストおよびアンタゴニストを開発および/または同定するために利用することができる。
また、本発明の特徴は、SDS-PAGEで測定された約170キロダルトンの分子量を有する単離された二量体FAPα分子、酵素的切断剤としての使用、および本明細書で述べたような他の使用である。FAPαの酵素的に活性な形態は組換え融合タンパク質としても産生することができ、その組換えタンパク質は、FAPαの触媒領域および、分泌シグナル、プロテアーゼ切断部位、精製用タグ、および当業者に公知の他の断片を含む、適切な生化学的特性を持った他のタンパク質領域を備えた可溶性融合タンパク質のようなものである。上述したようなCD8ペプチド配列はその例である。FAPαが本明細書に記載したように特定の性質を持つという事実により、それらを発現している細胞上のその分子を同定することができる。次に、FAPα分子は腫瘍または腫瘍間質細胞と関連しているため、治療薬でFAPαを標的にすることは、十分な治療薬剤を投与して癌の苦痛を軽減することによって癌性または前癌状態を治療する方法として役立つ。
FAPαのタンパク質分解特性を示す実験により本発明の更なる特徴が導かれる。細胞外マトリックス、すなわち「EMC」タンパク質を分解するプロテアーゼは腫瘍増殖のある特徴において重要な役割を有することがよく知られており、その役割には、腫瘍細胞の浸潤、腫瘍血管形成(すなわち新血管形成(neoangiogenesis))、および腫瘍転移に与えるそれらの影響が含まれる。コラーゲンはECMの重要な部分であるため、プロテアーゼの基質としてはコラーゲンが特に注目される。FAPαがECMを消化するという事実はこの分子のインヒビターの治療における役割を示唆する。本明細書で用いる「インヒビター」はFAPα酵素機能と干渉する分子をいう。特に、そのようなインヒビターからモノクローナル抗体F19は除かれる。このmAbは結合はするがFAPαの酵素機能を阻害しないことが知られており、従ってインヒビターではない。結合し、かつ酵素を阻害するモノクロナル抗体に関して技術は十分に精通している。そうしたインヒビターの更なる例には、例えばFAPαの活性部位と干渉する、変性コラーゲン分子のような基質誘導体が含まれるであろう。他の適切なインヒビターは当業者には明らかであろうから、ここに掲げる必要はないであろう。これに加えて、組換えFAPαタンパク質および上述したFAPαでトランスフェクションされた細胞株は、上述の基質又は他の適切な基質を用いて酵素スクリーニングアッセイに利用することができ、どの化合物ライブラリーからもインヒビターを同定することができる。FAPα活性分子と相互作用する物質を明らかにすることは、それにより異常なFAPα活性を示す患者の状態を治療処置することへつながる。具体的には、阻害剤(たとえば、コラーゲン誘導体、S-バリル-ピロリジン-2(R)-ボロン酸)であれ、アゴニストまたはアンタゴニストであれ、適切な物質の一定量を、FAPα活性を正常にするのに十分な量で患者に投与する。
本発明の他の特徴は当業者に明らかであろうから、ここで述べる必要はないであろう。
使用してきた用語及び表現は説明のための用語として用いたもので、限定するものではなく、そのような用語及び表現を用いたことには、示した特徴及び説明した特徴のいかなる等価物またはその部分を除外する意図はなく、本発明の範囲内において種々の変更が可能であることはいうまでもない。
(2)配列番号1の情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:2815塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:2本鎖
(D)トポロジー:直線状
(ix)配列の記載:配列番号1:
(2)配列番号2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:760アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)トポロジー:直線状
(xi)配列の記載:配列番号:2
Claims (13)
- 単離された二量体線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAPα)分子であって、SDS-PAGEによる測定で170キロダルトンの分子量を有し、前記二量体FAPα分子の各モノマーが配列番号2記載のアミノ酸配列からなる、前記単離された二量体FAPα分子。
- 組換えで産生される請求項1記載の二量体FAPα分子。
- 真核細胞によって産生される請求項2記載の二量体FAPα分子。
- 式Xaa-Proの末端ジペプチドを分子から切断する方法であって、前記分子を第2の分子と接触させることを含み、前記の第2の分子が請求項1記載の二量体FAPα分子である、前記方法。
- FAPα活性を有する請求項1記載の二量体FAPα分子と相互作用する物質を同定する方法であって、前記分子をテストすべきサンプルと一緒にし、FAPα活性を有する分子と相互作用する分子の指標として、前記分子との相互作用を測定することを含む前記方法。
- 物質がFAPα活性のアンタゴニストである、請求項5記載の方法。
- 物質がFAPα活性のアゴニストである請求項5記載の方法。
- 物質がFAPα活性のインヒビターである請求項5記載の方法。
- 物質とFAPα活性を有する細胞抽出物とを一緒にすることを含む、請求項5記載の方法。
- 前記細胞抽出物がFAPα活性を有する分子をコードする核酸分子でトランスフォーメーションまたはトランスフェクションされた細胞の抽出物である、請求項9記載の方法。
- 細胞が原核細胞である、請求項10記載の方法。
- 細胞が真核細胞である、請求項10記載の方法。
- 物質がFAPα活性を有する請求項1記載の二量体FAPα分子と相互作用するかどうかを測定する方法であって、前記物質と前記分子を基質Ala-Pro-7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン(Ala-Pro-AFC)と一緒にすること、前記分子と基質Ala-Pro-AFCとの相互作用を決定すること、および、前記相互作用を前記物質の非存在下における前記分子と基質Ala-Pro-AFCとの相互作用と比較すること、を含み、前記相互作用間の相違があれば前記物質が前記分子と相互作用することを意味する、前記方法。
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