SK126798A3 - Isolated dimeric fibroblast activation protein alpha, and uses thereof - Google Patents

Isolated dimeric fibroblast activation protein alpha, and uses thereof Download PDF

Info

Publication number
SK126798A3
SK126798A3 SK1267-98A SK126798A SK126798A3 SK 126798 A3 SK126798 A3 SK 126798A3 SK 126798 A SK126798 A SK 126798A SK 126798 A3 SK126798 A3 SK 126798A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
fapα
molecule
activity
protein
dimeric
Prior art date
Application number
SK1267-98A
Other languages
English (en)
Inventor
Rainer Zimmerman
John E Park
Wolfgang Rettig
Lloyd J Old
Original Assignee
Ludwig Inst Cancer Res
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ludwig Inst Cancer Res, Boehringer Ingelheim Int filed Critical Ludwig Inst Cancer Res
Publication of SK126798A3 publication Critical patent/SK126798A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka Izolovanej dimérnej molekuly FABa, izolovaného a fúzovaného proteínu s jej obsahom a jej použitia. Predložená prihláška tohto vynálezu je čiastkovým pokračovaním spisu s poradovým číslom 08/230 491, podaného 20. apríla 1994, ako závislá.
Doterajší stav techniky
Invazný rast rakovín epitelu je spojený s charakteristickými zmenami buniek a molekúl podpornej stromy. Rakoviny epitelu napríklad indukujú vznik cievnych nádorov, šírenie reaktívnych nádorových stromálnych fibroblastov, lymfoidných a fagocytových infiltrátov, uvoľnenie peptidových mediátorov a proteolytických enzýmov, a produkciu zmeneného extracelulárneho matrixu (ECM). Pozri napríklad: Folkman, Adv. Cancer Res., 43, 175 až 203 (1985); Basset et al., Náture, 348, 699 až 704 (1990); Denekamp et al., Cancer Metastasis Rev., 9, 267 až 282 (1990); Cullen et al., Cancer Res., 51, 4978 až 4985 (1991); Dvoŕák et al., Cancer Celíš, 3, 77 až 85 (1991); Liotta et al., Cancer Res., 51, 5054 až 5059 (1991); Garin-Chesa et al., J. Histochem. Cytochem., 37, 1767 až 1776 (1989). Významným konzistentným molekulovým znakom stromy vo viacerých bežných histologických typoch rakoviny epitelu je indukcia fibroblastového aktivačného proteínu (FAPa), glykoproteínu povrchu bunky s určenou Mr 95 000, pôvodne odhaleného monoklonovou protilátkou mAb F19, pôsobiacou proti proliferácii kultivovaných fibroblastov. Pozri Rettig et al., Cancer Res., 46, 6406 až 6412 (1986); Rettig et al., Prac. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3110 až 3114 (1988); Garin-Chesa etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 7235 až 7239 (1990); Rettig et al., Cancer Res., 53, 3327 až
-23335 (1993); každá z uvedených štyroch publikovaných prác sa tu ako celok zahŕňa týmto odkazom.
Imunohistochemické štúdie, ako sú hore citované práce, ukázali, že FAPa je prechodne exprimovaný v určitých bežných fetálnych mesenchymálnych tkanivách, ale že normálne dospelé tkanivá sú vo všeobecnosti FAPa. Podobne, malignantné epitelové, nervové a hematopoietické bunky sú všeobecne tiež FAPa. Väčšina bežných typov epitelových rakovín, vrátane >90 % prsných karcinómov, pľúcnych a kožných karcinómov, karcinómov pankreasu a hrubého čreva však obsahuje značné množstvo FAPa+ reaktívnych stromálnych fibroblastov. GarinChesa et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 7235 až 7239 (1990). Uvedené FAPa+ nádorové stromálne fibroblasty takmer invariantne sprevádzajú cievne nádory, vytvárajúce osobitný bunkový útvar, vložený medzi nádorovým kapilárnym endotelom a bazálnym aspektom malignantných epitelových bunkových klastrov. Zatiaľ čo sa FAPa+ stromálne fibroblasty nachádzajú aj v primárnych aj v metastázovaných karcinómoch, benigné a premalignantné epitelové lézie, ako sú napríklad prsné fibroadenómy a adenómy hrubého čreva iba zriedka obsahujú FAPa+ stromálne bunky. Na rozdiel od stromálne-špecifickej lokalizácie FAPa v epitelových neoplazmách, FAPa je exprimovaný v malignantných bunkách v značnom počte kostných sarkómov a sarkómov mäkkého tkaniva. (Rettig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3110 až 3114 (1988)). Nakoniec, FAPa+ fibroblasty sú zisťované v granulačnom tkanive hojacich sa rán (Garin-Chesa et al., ibiď). Na základe obmedzenej distribúcie FAPa v normálnych tkanivách a jeho rovnomernej expresie v podpornej strome mnohých epitelovýh rakovín, klinické štúdie s použitím 1311 značenej mAb F19 iniciovali u pacientov s metastázovanou črevnou rakovinou (Welt ert al., Proc. Am. Assoc. Cancer. Res., 33, 319 (1992); Welt et al., J. Clin. Oncol., 12, 1561 až 1571 (1994)) skúmať koncept “nádorového stromálneho cieľovania” na imunodetekciu a imunoterapiu epitelových rakovín.
Publikovaná práca Rettiga et al., Int. J. Cancer, 58, 385 až 392 (1994), zahrnutá tu týmto odkazom, pojednáva o molekule FAPa, jej znakoch a vlastnostiach. Rettig et al. predpokladajú, že FAPa sa nachádza v komplexoch s
-3vysokou molekulovou hmotnosťou, vyše 400 kilodaltonov, ale nediskutujú ani možnosť dimérnych molekúl a článok ani neuvádza špecifické enzymatické vlastnosti molekuly.
Indukcia FAPa+ fibroblastov v časoch a v miestach meniaceho sa tkaniva v priebehu fetálneho vývoja, náhrady tkaniva a karcinogenézy je konzistentná so základnou úlohou tejto molekuly v normálnej fibroblastovej fyziológii. Potom bude záujem a významné izolovať a klonovať molekuly nukleových kyselín, ktoré kódujú pre uvedenú molekulu. Toto je jeden aspekt tohto vynálezu, ktorý sa podrobne opisuje spolu s ďalšími znakmi vynálezu v ďalšom texte. Ďalšie aspekty tohto vynálezu zahŕňajú dimérne molekuly FAPa a využívanie vlastností týchto molekúl a sú opisované v ďalšom texte.
Podstata vvnálezu
Vynález sa týka určitých molekúl, ktoré sú v spojitosti s rakovinovými tkanivami a s reaktívnymi nádorovými stromálnymi bunkami. Bližšie sa týka molekúl fibroblastového aktivačného proteinu alfa (v ďalšom texte označovaný “FAPa“). Monomérna forma uvedenej molekuly sa už identifikovala imunochemicky, ale kódujúce molekuly nukleových kyselín tejto formy neboli doteraz izolované alebo klonované, a neboli identifikované ani jej diméry. Tieto sú, inter alia, podstatou tohto vynálezu. Monomérny proteín má molekulovú hmotnosť od približne 88 do približne 95 kilodaltonov, stanovenú spôsobom SDS-PAGE varených vzoriek. Dimér má molekulovú hmotnosť okolo 170 kilodaltonov, ktorá bola stanovená spôsobom SDS-PAGE nevarených vzoriek. FAPa je charakterizovaný viacerými znakmi a vlastnosťami, ktoré sú spoločné a charakteristické pre membránovo viazané enzýmy, čo veľmi podporuje názor, že sám je tiež membránovo viazaným enzýmom. Molekuly nukleových kyselín, ktoré sú podstatnou časťou tohto vynálezu, sú užitočné aj ako sondy buniek, exprimujúcich FAPa, aj ako východiskový materiál na rekombinantnú prípravu uvedeného proteinu. Uvedený FAPa sa potom môže využiť na prípravu monoklonových protilátok, špecifických na uvedený proteín, ktoré
-4sú použiteľné ako diagnostické činidlá. Majú tiež ďalšie použitia, vrátane použití, týkajúcich sa enzymatických funkcií, ako sa opisujú v ďalšom texte.
Súčasťou vynálezu sú tiež chimérové a fúzované proteíný, ktoré obsahujú časť časť FAPa, obsahujúcu katalytickú doménu molekuly a naviac zoskupenia, ktoré nie sú súčasťou FAPa. Uvedená katalytická doména per se je tiež súčasťou vynálezu.
Podľa tohto opisu je zrejmé, že FAPa môže byť glykozylovaný rôznym druhom a množstvom glykozylačného činidla v závislosti od druhu bunky, exprimujúcej uvedenú molekulu. Vyplýva to z uvedených pokusov. Platí to tiež pre dimérnu formu molekuly, ktorá je tu opísaná prvýkrát a má molekulovú hmotnosť približne 170 kilodaltonov, ak sa molekulová hmotnosť stanovuje spôsobom SDSPAGE nevarených vzoriek.
Vynález zahŕňa tiež produkciu expresných vektorov, užitočných na prípravu molekuly FAPa. Z najširšieho hľadiska tieto vektory obsahujú úplnú kódujúcu sekvenciu FAPa alebo jej časť, vhodne viazanú s promótorom. Ďalšími zoskupeniami môžu byť časť expresného vektora, ako sú proteínové domény fúzované s FAPa proteínom, alebo proteínové čiastkové (“fúzový proteín”) gény, ktoré udeľujú odolnosť voči antibiotikám, amplifikovateľné gény a podobné.
Uvedené kódujúce sekvencie a vektory sa môžu tiež použiť na prípravu bunkovej línie, v ktorej sa kódujúce sekvencie alebo expresné vektory použijú na transfekciu alebo transformáciu prijímacieho hostiteľa. Použitý typ buniek môže byť prokaryotický, ako je E. coli, alebo eukaryotický, ako sú kvasinky, CHO, COS alebo iné typy buniek.
Identifikácia molekúl nukleových kyselín, ako je napríklad molekula uvedenená v SEQ ID No: 1 umožňuje odborníkovi tiež identifikovať a izolovať také molekuly nukleových kyselín, ktoré ich za stringentných podmienok hybridizujú. Výraz “stringentné podmienky” sa v tomto texte vzťahuje na také parametre, uvádzané hore, pri ktorých sa tiež identifikujú sekvencie myši aj škrečka. Odborníkovi, skúsenému v danej oblasti bude zrejmé, že tieto podmienky umožňujú určitú voľnosť v prísnosti, ktorú možno dosiahnuť použitím parametrov, odlišných od
-5parametrov, citovaných hore. Takéto odchýlenie sa je stále chápané v rámci výrazu “stringentné podmienky”.
Schopnosť molekúl nukleových kyselín hybridizovať na komplementárne molekuly umožňuje odborníkovi identifikovať tiež bunky, ktoré exprimujú FAPa; pritom možno použiť hybridizačné spôsoby analýzy nukleových kyselín. Na hybridizáciu na komplementárne sekvencie možno použiť sekvencie, opísané v tomto vynáleze, a tým ich identifikovať. Týmto spôsobom možno cieľovať mRNA, napríklad takú, ktorá je prítomná v každej bunke, exprimujúcej molekulu FAPa.
Je celkom pochopiteľné, že molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú užitočné tiež v produkcii rekombinantného FAPa, ako v monomérnej, tak aj v dimérnej forme. Príklady jasne ukazujú, že hostiteľské bunky sú schopné zostavovať dimérne formy. Rekombinantný proteín sa môže použiť, napríklad, ako zdroj imunogénu na vytvorenie protilátky, podobnej známej mAb F19, ktorá má rovnaké použitie. Podobne sa rekombinantný proteín a/alebo bunky, ktoré exprimujú uvedenú molekulu na svojich povrchoch, môžu použiť pri analýze na určenie antagonistov, agonistov, alebo ďalších molekúl, ktoré vstupujú do interakcie s molekulami, ktoré vykazujú účinnosť FAPa. Takými látkami môžu byť, bez toho že by boli na uvedené obmedzené, substráty, inhibičné molekuly, protilátky a ďalšie. Molekuly, vykazujúce účinnosť FAPa môžu byť napríklad monomérne alebo dimérne formy FAPa, deriváty obsahujúce katalytickú doménu a ďalšie. Molekuly s FAPa účinnosťou môžu byť čisté, alebo vo forme bunkového extraktu, ako sú extrakty transformovaných alebo transfektovaných buniek, ktoré získali FAPa aktívny gén. Môžu sa použiť aj prokaryoty aj eukaryoty. Tento posledný znak vynálezu treba uvažovať v súvislosti pozorovaných štruktúrnych podobností k membránovo viazaným enzýmom. Tento typ molekuly je v spojení s určitými vlastnosťami, ktoré tu nie je potrebné podrobne opisovať. Postačuje uviesť, že ak je inhibícia alebo potenciácia týchto vlastností v spojení s FAPa, potom sa uvedený typ zahŕňa do tohto vynálezu. Použitím rekombinantných buniek alebo rekombinantného FAPa per se možno napríklad identifikovať substráty, alebo substrát pre molekuly FAPa. Uvedené substráty môžu byť modifikované na
-6zlepšenie ich účinku, na potlačenie ich účinku, alebo jednoducho značené zistiteľnými signálmi tak, že ich možno použiť napríklad na identifikáciu buniek, exprimujúcich FAPa. Štúdie interakcie substrátu a FAPa, ako aj interakcie medzi FAPa a ktoroukoľvek inou molekulou môžu byť použité na vývoj a/alebo identifikáciu agonistov a antagonistov molekuly FAPa.
Vynález zahŕňa izolované dimérne molekuly FAPa, ktoré majú molekulovú hmotnosť okolo 170 kilodaltonov, stanovovanú spôsobom SDS-PAGE, ich použitie ako enzymatické štiepne činidlo a ďalšie opísané použitia. Enzymatický aktívne formy FAPa môžu byť tiež produkované ako rekombinantné fúzované proteíny, ako sú rozpustné fúzované proteíny, obsahujúce katalytickú doménu FAPa a ďalšie proteínové domény s vhodnými biochemickými vlastnosťami, vrátane sekrečných signálov, proteázových štiepnych miest, zakončení vhodných na čistenie a ďalších zoskupení, známych odborníkovi v danej oblasti. Príkladom sú peptidové sekvencie CD8, ako sa opisujú hore. Skutočnosť, že FAPa má osobitné vlastnosti, opísané už hore, umožňuje identifikáciu uvedenej molekuly na bunke, ktorá ho exprimuje. Pretože molekula FAPa je v spojení s nádormi a nádorovými bunkami, môže na druhej strane slúžiť na cieľovanie FAPa s terapeutickým činidlom ako spôsobu liečby rakovinových alebo predrakovinových stavov, podávaním dostatočného množstva terapeutického činidla na zmiernenie prejavov rakoviny.
Pokusy, ktoré preukazujú proteolytické vlastnosti FAPa vedú ešte k ďalšiemu hľadisku, ktoré vynález tiež zahŕňa. Je známe, že proteázy, ktoré odbúravajú extracelulárne matrixové (ECM) proteíny sú dôležité z určitých hľadísk pri raste nádorov, vrátane ich vplyvu na inváziu nádorových buniek, na vznik cievnych nádorov (to znamená na neoangiogenézu) a na nádorové metastázy. Osobitne zaujímavé sú kolagény vis-a-vis ako substráty proteáz, pretože kolagény sú dôležitou časťou ECM. Skutočnosť, že FAPa digeruje SCM dovoľuje uvažovať terapeutickú úlohu inhibítorov uvedenej molekuly. Výraz “inhibítory” sa v tomto texte používa vo význame molekúl, ktoré interferujú s enzýmovou funkciou FAPa. Z inhibítorov sa špecificky vylučuje monoklonová protilátka F19. O tejto protilátke je známe, že sa viaže ale neinhibuje enzýmovú funkciu FAPa a preto nie je inhibítor.
-7V odbore je veľa skúseností, týkajúcich sa monoklonových protilátok, ktoré sa aj viažu aj inhibujú enzýmy. Ďalšie príklady takých inhibítorov môžu zahŕňať napríklad deriváty substrátu, ako sú modifikované kolagénové molekuly, ktoré interferujú s aktívnymi miestami, alebo s inými miestami FAPa molekuly. Ďalšie vhodné inhibítory sú zrejmé odborníkom v danej oblasti a na tomto mieste ich netreba uvádzať. Rekombinantné FAPa proteíny a FAPa-transfektované bunkové línie, opísané hore, možno naviac využiť pri enzymatických skúškach vyhľadávania a výberu (enzymatický screening) s použitím substrátu, opísaného hore, alebo iných vhodných substrátov, na identifikáciu inhibítorov z akejkoľvek zloženej knižnice. Uvedená identifikácia látok, ktoré vstupujú do interakcie s aktívnymi molekulami FAPa preto vedie k terapeutickému vplyvu na stavy, pri ktorých subjekt vykazuje abnormálnu aktivitu FAPa. Bližšie, príslušná látka, ktorá pôsobí inhibičné (napríklad kolagénový derivát, S-valyl-pyrolidín-2(R)-borónová kyselina), agonista alebo antagonista sa podáva v množstve, ktoré je postačujúce na normalizáciu FAPa aktivity.
Ďalšie hľadiska tohto vynálezu budú zrejmé odborníkovi v danej oblasti a nie je treba ich tu uvádzať.
Pomenovania a výrazy, ktoré sa používajú v tomto texte sú použité na opis a nie na obmedzenie. Pri použití uvedených pomenovaní a výrazov sa v žiadnom prípade nevylučujú ekvivalenty uvedených znakov a javov, alebo ich častí a je zrejmé, že v rámci rozsahu tohto vynálezu sú možné aj rôzne úpravy.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 porovnáva odvodenú aminokyselinovú sekvenciu FAPa a známu sekvenciu CD26. Usporiadanie bolo optimalizované.
Obr. 2A až 2H, vrátane, zobrazujú imunohistochemickú detekciu FAPa a CD26 v rôznych tkanivách. Na obr. 2A a 2B sa jedná o štúdiu prsnej rakoviny pre FAPa (Obr. 2A) a CD26 (Obr. 2B). Na obr. 2C a 2D sa jedná o štúdiu malignantného vláknitého histiocytómu (MFH) pre FAPa (Obr. 2C) a CD26 (Obr.
I
1.
-82D). Tkanivo kožnej jazvy sa posudzuje na obr. 2E ( FAPa) a 2F (CD26). Štúdium bunkového karcinómu obličiek je ilustrované na Obr. 2G ( FAPa) a 2H (CD26).
Obr. 3 znázorňuje niektoré z výsledkov experimentov, ktoré ukázali, že FAPa mal extracelulárnu matrixovú (EMC) proteínovú degradačnú účinnosť. Keď sa vykonala zymografická detekcia želatínových degradačných extraktov 293FAPa, zistilo sa, že aktívna látka má molekulovú hmotnosť okolo 170 kD, stanovenú spôsobom SDS-PAGE s použitím nevarených vzoriek, aby sa zachovala enzýmová aktivita.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Pozorovala sa bunková línia fibroblastov WI-38, pred tým zreagovaná s mAb F19 (Rettig et al., Canc. Res., 46, 6406 až 6412 (1986); Garin-Chesa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 7235 až 7239 (1990); Rettig et al., Cancer Res., 53, 3327 až 3335 (1993)); použila sa v nasledujúcich experimentoch.
Dobre známymi technikami a z komerčne dostupných materiálov sa z WI-38 pripravila cDNA knižnica. Bližšie, uvedená knižnica sa konštruovala v expresnom vektore pCDNAl s použitím súpravy na izoláciu “Fast Track mRNA kit” a knižničného cDNA fagemidového systému. Po príprave knižnice sa vektory pomocou elektroporácie vniesli do buniek línie E. coli MC 1061/P3. Expresný vektor pCDNAl obsahuje gén rezistencie voči antibiotikám a tak sa E. coli selektovali s využitím tejto rezistencie voči antibiotikám. Rezistentné kolónie sa potom použili v ďalších experimetoch. Plazmidová DNA sa z kolónií získala spôsobom alkalickej lýzy a čistením na CsCI2 podľa Sambrooka et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y., USA, 2. vydanie, 1989). Uvedená technika je v odbore dobre známa a zahŕňa sa tu týmto odkazom.
Po izolácii sa plazmidová DNA použila na transfekciu buniek COS-1, ktoré sa potom kultivovali po dobu 48 hodín; potom sa skúšali v miskách s povlakom, ktorý
-9obsahoval protilátku. Použité protilátky zahŕňali F19, ako to opísal Rettig et al. (1986), ibid; táto publikácia sa tu v celosti zahŕňa týmto odkazom. Bunky COS-1 sú normálne FAPa'; pozitívne výsledky poukázali na prítomnosť kódujúcej sekvencie. Zvolil sa imunoselekčný protokol podľa publikácie Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3365 až 3369 (1987), ktorá sa tu zahŕňa týmto odkazom.
Podľa Hirta, J. Mol. Biol., 26, 365 až 369 (1967) sa z pozitívnych klonov získala plazmidová DNA a zaviedla sa znova do E. coli MC 1061/P3 a znova sa selektovala v bunkách COS-1.
Uvedený protokol sa opakoval štyri razy. Potom sa plazmidová DNA z 50 izolovaných kolónií baktérií čistila, pričom sa použila plazmidová súprava Qiagen kit. Zistilo sa, že z uvedených kolónií 27 klonov obsahovalo identické 2,8 kb inzerty, čo sa určilo mapovaním pomocou reštrikčného enzýmu EcoRi. Niekoľko z nich obsahovalo FAPa-špecifickú cDNA, čo sa stanovilo krátkodobou expresiou v bunkách COS-1 a priamym imunofluorescenčným farbením s mAb F19. Jeden z uvedených klonov, označený ako “pFAP.38” sa vyselektoval pre ďalšie štúdie, uvedené ďalej.
Príklad 2
Po identifikácii sa pFAP.38 skúšal spolu s vektorom, kódujúcim pre známy marker CD26 povrchu bunky (“pCD26”) ako aj s porovnávacím vektorom pCDNA I.
Bunky COS-1 sa pri týchto pokusoch transfektovali jedným z pFAP.38, pCD26 alebo pCDNAI. Po 48 hodinách sa transfektanty skúšali, pričom sa použil dobre známy spôsob MHA analýzy expresie antigénu na povrchu bunky. V týchto prácach sa použila mAb F19, ktorá je špecifická voči FAPa, spolu s mAb EF-1, ktorá je zasa špecifická voči CD26. Ďalej sa použili ešte 4 iné FAPa špecifické protilátky, FB23, FB52, FB58 a C48. Skúšali sa tiež dve rakovinové bunkové línie, ktoré sú známe tým, že reagujú s mAb F19 (SW872 liposarkóm) a EF-1 (SK-OV6 rakoviny vaječníkov). Výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej Tabuľke 1.
-10Tabuľka 1
Povrchová bunková expresia viacerých FAPa epitopov a CD26 v ľudských bunkách a transfektantoch buniek COS-1
Expresia antigénu na povrchu bunky
Terčová bunka F19 FB23 FB52 FB58 C48 EF-1
Ľudské bunky: SW872 liposarkóm >95 % >95 % >95 % >95 % >95 %
SK-OV6 rakoviny vaječníkov — >95 %
transfektanty COS-1: COS.pCDNAl, kontrola
COS.pFA P 238 40 % 30 % 40 % 20 % 20 % -
COS.pCD26 - - - - - 40 %
Príklad 3
Na identifikáciu uvedenými protilátkami cieľovaného antigénu sa vykonali imunoprecipitačné štúdie.
Bunky sa metabolický označili s trans 35S-značkou, (ICN), extrahovali tlmivým a štiepnym roztokom (0,01 M roztok Tris-HCI, 0,15 M roztok NaCl, 0,01 M roztok MgCI2i 0,5%-ný roztok nonidetu Ρ-40/aprotínu (20 pg.mľ1), 2 mM roztok fenylmetylsulfonylfluoridu), a potom sa podrobili imunoprecipitácii. Použité protokoly sú všeobecne dobre známe, čo je zrejmé z odkazov na práce Rettiga et al., Canc. Res., 53, 3327 až 3335 (1993); a Fellingera et al., Canc. Res.,51, 336 až 340 (1991), ktorých zverejnenia sa tu v ich úplnosti zahŕňajú týmto odkazom. Precipitačné protilátky boli negatívny kontrolný Ig myši, mAb F19, alebo EF-1. Porovnávacie (kontrolné) skúšky sa vykonali so simulovane transfektovanými bunkami COS-1. Po vykonaní imunoprecipitácie sa imunoprecipitáty varili v
-11 extrakčnom tlmivom roztoku a separovali pomocou NaDodSO4-PAGE v redukčných podmienkach. V niektorých pokusoch sa vykonala aj ďalšia skúška na určenie, či bol imunoprecipitovaný materiál glykozylovaný alebo nebol. Pri týchto pokusoch sa bunkové extrakty pred imunoprecipitáciou frakcionovali s Con A-sepharózou. Po imunoprecipitácii, ale pred frakcionáciou na NaDodSO4-PAGE sa tieto precipitáty digerovali s N-glykanázou.
Výsledky ukázali, že v COS-1 bunkách usmerňuje pFAP.38 expresiu 88 kD druhu proteínu (podľa stanovenia spôsobom SDS-PAGE), čo je o niečo menej ako 95 kD druhy FAPa, produkované SW872 alebo kultivovanými fibroblastmi. Peptidy porovnateľnej veľkosti (napríklad 74 kD v porovnaní s 75 kD), produkované pri digescii s N-glykanázou ukazujú, že glykozylácia FAPa proteínu v COS-1 bunkách je od ľudských bunkových línií rozdielna.
Príklad 4
Potom sa vykonala klasická analýza spôsobom Northern blot (imunopijakovaním) s použitím mRNA z FAPot+ fibroblastovej bunkovej línie WI-38 a GM 05389 a bunkovej línie SK-OV6 FAPa ' rakoviny vaječníkov.Skúšalo sa 5 pg RNA z každej bunkovej línie spôsobom podľa Sambrooka et al., ibid. Použité sondy boli značené 32P a pripravili sa z 2,3 kb fragmentu ECO I z pFAP.38, z 2,4 kb fragmentu Hind III z CD26 a z 1,8 kb fragmentu BamH I γ-aktínovej cDNA. Uvedené fragmenty sa čistili z prostredia 1%-ných agarových gélov.
V extraktoch FAPa+ fibroblastových kmeňov sa preukázali 2,8 kb druhy FAP mRNA, ale v extraktoch z SK-OV6 neboli prítomné. Prítomnosť γ-aktínového druhu mRNA (1,8 kb) sa pozorovala u všetkých druhov.
Príklad 5 cDNA, identifikované ako kódujúce pre FAPa sa podrobili podrobnej analýze, počínajúc sekvenovaním. Použila sa klasická Sangerova metodológia, ako
- 12je predložená v práci, zverejnenej v Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 74, 5463 až 5467 (1997) a to na sekvenovanie obidvoch vláken uvedenej cDNA. Keď bolo zabezpečené, že vlákna sú sekvenované, potom sa z nich dedukovala aminokyselinová sekvencia. Táto informácia je uvedená ďalej vo forme sekvencie označenej SEQ ID NO: 1. Uvedená sekvencia sa potom porovnávala so známou aminokyselinovou sekvenciou CD26 (Morimoto et al., J. Immunol., 143, 3430 až 3437 (1989)). Obr. 1 zobrazuje uvedené porovnanie za použitia optimalizovaného zarovnania. Všetky nezhody v uvedenom porovnaní sú označené hviezdičkami, pričom rovnaké aminokyseliny v sekvencií CD26 sú vyznačené čiarkované. Hydrofóbna predpokladaná transmembránová sekvencia je podčiarknutá dvojitou čiarou a potenciálne N-glykozylačné miesta sú podčiarknuté raz.
Sekvenčná analýza poukázala na inzert s 2 812 pármi báz, v ktorom 2 277 párov báz vytvára otvorený čítací rámec (open reading frame, ORF). Uvedený ORF je rozložený od počiatočného kodónu ATG v nukleotide 209 po konečný kodón TAA pri 2 486.
Odvodený polypeptid má dĺžku 760 aminokyselín a má moleklulovú hmotnosť 87 832. Pre digerovaný s glykanázou a ďalej imunočistený FAPa sa na rodiel od uvedeného uvádza, že bola stanovená Mr 75 000 na NaDodSO4-PAGE (Rettig eŕ al., Canc. Res., 53 3327 až 3335 (1993)). Vykonal sa prieskum v banke údajov GenBank. Zistilo sa, že najviac príbuznými génmi boli také gény, ktoré kódujú homológy dipeptidylpeptidázy IV (DPPIV; EC 3.4.14.5) s ľudskou DPPIV (známou tiež ako T-bunkový aktivačný antigén CD26), vykazujúce 61%-nú zhodu sekvencie nukleotidov a 48%-nú zhodnosť aminokyselinovej sekvencie.
Druhý súbor príbuzných génov sú ľudské, potkanie a bovinné homológy DPPX, génov neznámej funkcie, exprimovaných v mozgových a ďalších normálnych tkanivách. Predpokladaný ľudský DPPX génový produkt vykazuje okolo 30%-nú zhodu aminokyselinovej sekvencie s FAPa a CD26. FAPa molekula má štruktúrne znaky, typické pre II. typ integrálnych membránových proteínov, vrátane veľkej COOH-terminálnej extracelulárnej domény, hydrofóbneho transmembránového segmentu a krátkeho cytoplazmového konca. Predpokladaná
P
- 13extracelulárna doména obsahuje päť potenciálnych N-glykozylačných miest, jedenásť cysteínových zvyškov (osem z nich je konzervovaných medzi FAPa a CD26) a tri segmenty, zodpovedajúce vysoko konzervovaným katalytickým doménam, charakteristickým pre sérinové proteázy, ako je DPPIV. Uvedené konzervované sekvencie sa uvádzajú v Tabuľke 2, korá je uvedená v ďalšom texte. Porovnania k DPPIV a DPPX boli vykonané podľa prác Morimoto et ak, ibiď, Wada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89. 197 až 201 (1992); Yokotani et al., Human Mol. Genet., 2, 1037 až 1039 (1993).
Príklad 6
Ďalší súbor pokusov sa vykonal s cieľom určiť, či sekvencie príbuzné k FAPa sú prítomné u iných ako ľudských druhov. Za týmto cieľom sa digerovala genómová DNA človeka, myši a čínskeho škrečka pomocou reštrikčných enzýmov a produkty sa skúšali spôsobom Southern blotting za použitia 2,3 kb fragmentu, značeného s 32P, ktorý už bol opísaný hore. Hybridizácia sa vykonala s použitím stringentného premývania (0,1 x SSC, 0,1%-ný NaDodSO4, 68 °C). Ihneď sa pozorovala krížová hybridizácia u DNA myši a škrečka, čo umožňuje predpokladať vysoko konzervované homológy FAPa. V porovnávacích (kontrolných) skúškach s použitím hore opísaného cDNA fragmentu CD26 sa nepozoroval nijaký dôkaz krížovej hybridizácie.
Príklad 7
Molekula CD26 má viac biochemických a sérologických vlastností spoločných s FABp, ktorý už bol opísaný, s FAPa-asociovanou molekulou, ktorá má molekulovú hmotnosť 105 kD a bola nájdená pri kultivácii! fibroblastov a melanocytov (Rettig et al., Canc. Res., 53, 3327 až 3335 (1993)). Aby sa zistilo, či FABp je CD26 génový produkt, vykonali sa kotransfekčné pokusy. Pri pokusoch sa použili rovnaké protokoly ako boli použité pre transfekciu s pFAP.38 alebo CD26,
-14ktoré už boli opísané v predchádzujúcom texte. Rozdiel bol v tom, že sa použili dva vektory. Uvádzané výsledky ukázali, že účinnosť kotransfekcii bola okolo 40 % pre každý vektor a tak mohlo byť kotransfektovaných okolo 10 až 20 % buniek.
Po kotransfekcii boli COS-1 bunky označené Trans 35S a potom sa podrobili lýze rovnako, ako už bolo uvedené hore.
Výsledné bunkové extrakty sa separovali na Con A Sepharose a antigén (FAPa a/alebo CD26) sa získal z frakcie viazanej na Con A eluáciou 0,25 M roztokom α-D-manopyranozidu. Potom sa už opísaným postupom vykonala imunoprecipitácia a precipitáty sa separovali na NaDodSO4-PAGE .
Bunky transfektované iba s pFAP.38 produkovali FAPa ale nie FAPp (určené z imunoprecipitátov mAb F19). Neprodukujú tiež CD26 antigén (skúšané s EF-1). Bunky transfektované so samotným pCD26 produkujú CD26, ale nie FAPa. Kotransfektanty produkujú CD26 a FAPa/FABp heteroméry, ako boli určené v mAb F19 precipitátoch. Tento výsledok podáva priamy dôkaz, že FABp je génový produkt CD26.
Príklad 8
V minulosti sa už pozorovalo, že niektoré typy kultivovaných ľudských buniek koexprimujú FAPa a CD26 a vytvárajú FAPa/CD26 heteromér. Podľa doteraz vykonaných imunohistologických štúdií sa však rozdelenie in vivo FAPa a CD26 považovalo za také, ktoré sa vzájomne neprekrýva (pozri Rettig et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85, 3110 až 3114 (1988); Garin-Chesa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 7235 až 7329 (1990); Rettig et al., Canc. Res., 53, 3327 až 3335 (1993); Stein et al., in: Knapp et al., editori, Leukocyte typing IV - white celí differenciation antigens, strany 412 až 415 (Oxford University Press, N.Y. 1989); Môbious et al., J. Exp. Immunol., 74, 431 až 437 (1988)). Z pohľadu potenciálnej významnosti koasociácie FAPa/CD26 sa distribúcia tkaniva prehodnotila znova spolu s imunohistologickým farbením normálneho tkaniva a tkaniva chorého, o ktorom bolo známe, že obsahuje FAPa+ fibroblasty alebo FAPa+ malignantné bunky.
- 15Vzorky sa na skúšky zabudovali do OCT, zmrazili v izopentáne vopred vychladenom v tekutom dusíku a uložili pri -70 °C až do vykonania skúšky. Pripravili sa 5 mikrometrov hrubé rezy, preniesli sa na fólie s povlakom poly-L-lyzínu, sušili na vzduchu a fixovali sa v studenom acetóne (4 °C po dobu 10 minút). Rezy sa potom skúšali s mAb (10 až 20 pg.mľ1) spôsobom s avidín-biotínovou imunoperoxidázou, ktorý je dobre známy a je opísaný napríklad v prácach: Garin-Chesa et al., J. Histochem. Cytochem.,37, 1767 až 1776 (1989); Garin-Chesa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 7235 až 7239 (1990); Rettig et al., Canc. Res., 53, 3327 až 3335 (1993); Garin-Chesa et al., Am. J. Pathol., 142, 557 až 567.
Výsledky skúšok sa uvádzajú na Obr. 2. Karcinómy pŕs, hrubého čreva, pankreasu a pľúc vykázali silnú expresiu FAPa a nezistila sa žiadna expresia CD26 (pozri Obr. 2A a 2B). Skúšalo sa 5 FAPa+ sarkómov; vrátane malignantného fibrilárneho histiocytómu (Obr. 2C a 2D) a v žiadnom prípade sa nezaznamenala expresia CD26. Hodnotenia reaktívnych fibroblastov hojacich sa kožných poškodení (Obr. 2E, 2F) poukázali na výdatnú expresiu obidvoch FAPa a CD26. Vykonali sa skúšky troch obličkových karcinómov (Obr. 2G a 2H) a vo všetkých prípadoch sa v malignantnom epiteli pozorovala expresia CD26. V malignantných epitelových bunkách FAPa nebol zistený a jeho expresia v strome týchto karcinómov bola nízka.
Príklad 9
Pripravila sa bunková línia z cicavcov, ktorá sa transfektovala kódujúcou cDNA FAPa.
Ľudská zárodočná obličková bunková línia 293 je dobre známa a dostupná napríklad zo zbierky American Type Culture Collection.
V inkubátori sa pri 37 °C udržiavali vzorky uvedených buniek 293 pod atmosférou 95 % vzduchu a 5 % oxidu uhličitého. Bunky sa kultivovali v zmesi 50:50 Dulbeccovho upraveného minimálneho média a Hamsovho média 12, doplnenej s 10 % fetálneho bovinného séra, penicilínom a streptomycínom. S
- 16využitím spôsobov, ktoré opísali Ustar et al., Eur. Mol. Biol. J. (1991) a/alebo Park et al., J. Biol. Chem., 169, 25646 až 25654 (1994) a ktoré sa tu zahhŕňajú týmto odkazom, sa cDNA pre FAPa (to znamená SEQ ID No: 1) transfektovala do buniek 293. Podrobnosti o cDNA vektore poskytuje posledne uvedená literatúra (pFAP.38). Transfektanty sa selektovali pomocou rezistencie k antibiotikám (200 Hg.mľ1 geneticínu) a udržiavali sa v prostredí selekčného média, obsahujúceho geneticín.
Jednotlivé kolónie rezistentných buniek sa preniesli na 6 jamkové kultivačné platničky a nechali rást do splynutia a potom sa skúšali na expresiu FAPa imunofluorescenčnou analýzou (IFA) za použitia monoklonovej protilátky F19, špecifickej na FAPa, ako už bolo opísané hore.
Kolónie, ktoré exprimovali FAPa sa rozmnožili a monitorovali nepriamou IFA a cytofluorometrickou analýzou, ako sa tiež uvádza v hore citovanej literatúre.
Imunofluorescenčné analýzy boli pozitívne u transfektantov, ktoré sú v ďalšom texte označované ako bunková línia 293-FAP, ale boli negatívne u parentálnej línie 293.
Príklad 10
Na potvrdenie, že sa skutočne vytvoril rekombinantný FAPa, vykonal sa celý rad imunoprecipitačných pokusov. Tieto pokusy sa vykonali spôsobmi, ktoré opísal Park et al., ibid, a Rettig et al., Canc. Res., 53, 3327 až 3335 (1993). Uvedené práce sa tu zahŕňajú týmto odkazom. Bunkové extrakty so značkovaným metionínom pomocou 35S sa už uvedeným spôsobom viazali s monoklonovou protilátkou F19. Precipitáty sa potom varili v extrakčnom tlmivom roztoku a podrobili sa deleniu na SDS-PAGE géloch s použitím negatívnej kontroly, lgG1 myši. Skúšali sa obidve bunkové línie, 293-FAP a netransfektovaná línia 293. Výsledky jasne preukazujú, že u transfektovanej bunkovej línie 293-FAPa nastala produkcia rekombinantného FAP. Stanovenie sa vykonalo imunoprecipitačnými analýzami s použitím monoklonovej protilátky F19, špecifickej k FAPa.
.1
- 17Príklad 11
Ďalšie štúdium vlastností uvedenej molekuly umožnilo produkovať rekombinatný FAPa. Bližšie, na základe štruktúrnych údajov, uvedených v predchádzajúcich príkladoch sa navrhli experimentálne práce na určenie, či FAPa vykazuje enzymatickú aktivitu. Experimenty sa navrhli tak, že sa skúšalo, či FAPa má alebo nemá degradačnú účinnosť voči extracelulárnemu proteínovému matrixu (ECM).
S použitím tlmivého roztoku (0,15 M roztok NaCI, 0,05 M roztok Tris-HCI, pH
7.4, 10 mM roztok MgCI2, 1 % Tritónu X-114) sa pripravili extrakty buniek 293FAP. Extrakty sa odstredili (4 000 x g, 10 minút pri 4 °C), a fázovo delili pri 37 °C po dobu 10-20 minút. Nasledovalo ďalšie odstreďovanie (4 000 x g, 20 minút pri 20 až 25 °C). Tenzidová fáza sa zriedila tlmivým roztokom (0,15 M roztok NaCI, 0,05 M roztok Tris-HCI, pH 7,4, 5 mM roztok CaCI2, 5 mM roztok MgCI2, 0,75 % Empigénu BB) a delila na konkanavalínovej A-Sepharose postupom podľa Rettiga et al., uvedeným už hore. Všetky konkavalínom A viazané frakcie sa eluovali 0,25 M roztokom metyl-a-D-manopyranozidom v elučnom tlmivom roztoku 0,15 M NaCI, 0,05 Tris-HCI, pH 7,4, 5 mM CaCI2, 5 mM MgCI2, 0,1 % Triton X-100), v zmesi s tlmivým roztom na zymografiu vzoriek (0,25 M roztok Tris-HCI, pH 6,8, 8 % SDS, 40 % glycerolu, 0,01 % brómfenolovej modrej) v pomere 3:1. Eluáty sa použili na ďalšiu analýzu.
Alikvotné objemy vzorky sa naniesli na polyakrylamidové gély, obsahujúce buď 0,1 % želatíny alebo kazeínu. Potom sa pomocou zariadenia Biorad-MiniProtein II System vykonala elektroforéza pri stálom prúde 20 mA po dobu 1,5 až 2 hodiny až brómfenolová modrá zo štartovacej čiary dosiahla spodný koniec gélu. Gél sa vybral a inkuboval 1 hodinu pri 20 až 25 °C v prostredí 2,5%-ného vodného roztoku Tritonu X-100 na rotačnej trepačke. Roztok Triton X-100 sa potom dekantoval a nahradil enzýmovým tlmivým roztokom (0,05 M roztok Tris-HCI, pH
7.5, 0,2 M roztok NaCI, 5 mM roztok CaCI2, 5 mM roztok MgCI2, 0,02 % Brij 35). Gél sa potom inkuboval pri 37 °C alebo 41 °C, nasledovalo farbenie alebo
- 18odfarbenie pri teplote miestnosti. Gély sa vyfarbovali s 0,5%-ným roztokom Coomassiho brilantnej modrej G-250 vo vodnom roztoku 30%-ného metanolu a 10%-nej kyseliny octovej po dobu 15, 30 a 60 minút. Následne sa gély 15 minút inkubovali vo vodnom roztoku 30%-ného metanolu a 5%-ného glycerolu. Nasledovalo sušenie medzi listami celofánu.
Želatinázová aktivita sa vyhodnocovala spôsobom, ktorý v svojej práci uvádza Kleiner et al., Anál. Biochem., 218 325 až 329 (1994), ktorá sa tu v úplnosti zahŕňa týmto odkazom. Je to rutinná analýza, používaná na stanovenie, či je prítomná alebo neprítomná proteáza, schopná digerovať želatínu. Na rovnakom géli sa v redukčných podmienkach vykonali skúšky so značkovaným štandardom molekulovej hmotnosti na určenie molekulových hmotností.
Skúšala sa proteolytická aktivita určitých motívov aminokyselinových sekvencií za použitia dobre známeho analytického spôsobu membránového povlaku; pozri Smith et al., Histochem. J., 24(9), 637 až 647 (1992), zahŕňa sa týmto odkazom. Substrátmi boli Ala-Pro-7-amino-4-trifluórmetylkumarín, Gly-Pro-7amino-4-trifluórmetylkumarín a Lys-Pro-7-amino-4-trifluórmetylkumarín.
Výsledky týchto pokusov sú sčasti uvedené na Obr. 3. Tento obrázok znázorňuje zymografickú detekciu želatínovej degradačnej účinnosti bunkových extraktov. Pozri prácu Kleiner et al., uvedenú už skôr. Zistilo sa, že proteíny s hmotnosťami približne 170 kilodaltonov, ako boli stanovené pomocou SDS-PAGE, majú degradačnú účinnosť voči želatíne. Tieto druhy proteínov, ktoré boli zistené v bunkovej línii 293-FAP, ale nie u netransfektovaných buniek 293, sú tak identifikované ako FAPa. Molekulová hmotnosť je v súlade s dimérom, to znamená molekulou diméru FAPa.
Opísaná proteolytická účinnosť, pozorovaná na želatínovom substráte sa nepozorovala, ak substrátom bol kazeín.
Príklad 12
- 19Ďalšie štúdie mali za cieľ charakterizovať uvedený 170 kD FAPa dimér. Bližšie, zopakovali sa pokusy z príkladu 11 s tým rozdielom, že sa do extraktov pred SDS-PAGE pridalo 5 % 2-merkaptoetanolu alebo 5 μΜ jódacetamidu, alebo sa do inkubučného tlmivého roztoku na želatínovú zymografiu pridala kyselina etyléndiamín-N,N,N',N'-tetraoctová (10 mM). Prídavky uvedených látok nespôsosobili stratu enzymatickej aktivity. Na rozdiel od posledne uvedeného, 5 minútové zahrievanie pri 100 °C pred SDS polyakrylamidovou elektroforézou degradačnú enzymatickú aktivitu voči želatíne zničilo.
Ďalšie práce s použitím analytického spôsobu prekrytím membrány, opísaného napr. v práci Smith et al., Histochem J., 24(9), 643 až 647 (1992), zahŕňa sa týmto odkazom, ukázali, že FAPa diméry boli schopné štiepiť všetky zo skúšaných dipeptidov Ala-Pro, Gly-Pro a Lys-Pro.
V ďalších experimentoch sa produkoval fúzovaný proteín, obsahujúci extracelulárne domény dvoch proteínov FAPa a CD8 myši. Tento chimérový proteín má pri použití v modeli, aký bol diskutovaný hore, rovnakú enzymatickú účinnosť ako FAPa.
Príklad 13
Vyvinuli sa dva kvantitatívne postupy stanovenia FAPa enzýmovej aktivity s popužitím Ala-Pro-7-amino-4-trifluórmetylkumarínu (Ala-Pro-AFC) ako substrátu. V prvom postupe sa membránové extrakty FAPa-exprimujúcich buniek zmiešali s 5 až 10 násobným objemom reakčného tlmivého roztoku (100 mM roztok NaCl, 10 mM Tris, pH 7,8) a zmes sa pridalo do rovnakého objemu 0,5 mM roztoku Ala-ProAFC v reakčnom tlmivom roztoku. Nasledovala jednohodinová inkubácia pri 37 °C. Potom sa pomocou fluorimetra (395 nm excitácia / 530 nm emisia, filtrová zostava) meralo uvoľňovanie AFC. Týmto postupom analyzované membránové extrakty boli odvodené buď z 293-FAPa buniek (bunky 293 stabilne transfektované vektorom FAP.38, opísané už hore), alebo z buniek HT1080-FAPa (bunky HT1080 stabilne transfektované vektorom FAP.38). Porovnávacie skúšky (negatívna kontrola) na
-20FAPa-špecifické aktivity sa vykonali s membránovými extraktmi, pripravenými z príslušných parentálnych bunkových línií 293 alebo HT1080. V druhom postupe sa z 293- FAPa alebo HT1080- FAPa membránových extraktov pomocou protilátky špecifickej voči FAPa izoloval FAPa. 96-jamkové platne ELISA sa cez noc pokryli pri 4 °C s 1 pg.mľ1 monoklonovej protilátky F19 v fosfátom tlmenom roztoku soli (PBS). V prípade CD8- FAPa, diskutovanom hore, sa platne pri 4 °C cez noc pokryli protilátkou F19 ako predošlé, alebo s 1 pg.mľ1 protimyšacím CD8 potkana. Jamky sa potom premyli s premývacím tlmivým roztokom (PBS, 0,1 %-ný Tween 20). Nadbytočné väzbové miesta sa blokovali blokovacím tlmivým roztokom (5 %-né bovinné sérum albumínu v PBS) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Potom sa blokovací tlmivý roztok odstránil; pridali sa membránové extrakty 293-FAPaexprimujúcich buniek alebo kontrolných buniek a inkubovali sa jednu hodinu pri teplote miestnosti. Nenaviazaný materiál sa odstránil, jamky sa premyli premývacím tlmivým roztokom a stanovila sa aktivita FAPa za použitia 100 μΙ Ala-Pro-AFC (0,5 mM roztok Ala-Pro-AFC v reakčnom tlmivom roztoku) po dobu 1 hodiny pri 37 °C. Uvoľnený AFC sa stanovoval rovnako ako hore. Väzba protilátky mAb F19 s FAPa nemala merateľný vplyv na jeho enzymatickú aktivitu.
Príklad 14
S použitím hore opísaných postupov stanovenia FAPa enzýmových aktivít sa identifikoval inhibítor FAPa-enzýmatickej aktivity. Týmto inhibítorom je (S)valylpyrolidín-2(R)-borónová kyselina (Snow et al., J. Am. Chem. Soc., 116, 10860 až 10869 (1994), v tejto prácie označovaná ako ValboroPro. ValBoroPro inhibuje štiepenie Ala-Pro-AFC účinkom FAPa s IC50 = 0,11 μΜ. ValBoroPro tiež inibuje želatínolytickú účinnosť FAPa pri koncentrácii 100 μΜ. Špecifickosť ValBoroPro voči FAPa bola dokázaná skúškami s cudzou (nie príbuznou) sérinovou proteázou, trypsínom. Nezistila sa žiadna inhibícia bovinného trypsínu inhibítorom ValBoroPro (až do 100 μΜ), ak sa ako skúšobný substrát použil karboxybenzoxy-Lvalinyl-glycinyl-L-arginyl-4-nitroanilidacetát.
-21 Príklad 15
Identifikácia špecifických štruktúrnych predpokladov enzymatickej aktivity FAPa umožnila vývoj molekúl, ktoré môžu viazať a/alebo inhibovať FAPa. Aby sa zistilo, či je sérinový zvyšok v polohe 624 predpokladanej aminokyselinovej sekvencie FAPa peptidu kritický pre jeho enzymatickú funkciu, vykonala sa polohovo usmernená mutagenéza podľa Zollera et al., DNA, 3, 479 až 488 (1984) s použitím štandardného polymerázového reťazového reakčného (PCR) spôsobu. TCC kodón, kódujúci pre serín 624 v FAPa cDNA sa nahradil GCG, čoho výsledkom v tejto polohe bol alanín. Zmenená DNA sa znova vložila do vektora FAP.38 a transfektovala do buniek 293 rovnako, ako už bolo opísané. Vyselektovali sa kolónie odolné geneticínu a hodnotili sa nepriamou IFA na FAPa expresiu s použitím mAb F19 ako aj ďalších špecifických protilátok, opísaných Rettigom et al., J. Cancer, 58, 385 až 392 (1994), už uvedených hore. Pri porovnávaní s divokým typom FAPa transfektovaných buniek sa nezistili nijaké rozdiely vo väzbe antiFAPa protilátok na mutantné bunky, experimujúce FAPa. Prítomnosť mutácie sa potvrdila amplifikáciou genómovej DNA a digesciou s reštrikčným enzýmom, ktoré sa vykonali s viacerými klonmi transfektovaných buniek. Na hodnotenie enzymatickej aktivity mutantného FAPa sa vykonali ďalej uvedené skúšky. Pripravili sa membránové extrakty z troch nezávislých pozitívnych klonov a hodnotili sa rovnaké množstvá FAPa proteínu (množstvo sa stanovovalo dvojnásobnou analýzou ELISA s použitím dvoch anti- FAPa protilátok, ktoré rozoznávajú jednotlivé epitopy FAPa) pomocou želatínolytickej a Ala-Pro-AFC väzbovej analýzy. Obidve, želatínolytická účinnosť a aktivita vo väzbovej skúške izolovaného mutantu FAPa boli znížené až na úrovne, ktoré neboli stanoviteľné a boli porovnateľné s divokým typom FAPa; uvedené potvrdzuje úlohu kanonického serínu v katalytickej triáde pre obidve sledované enzymatické aktivity.
Príklad 16
-22Na získanie sekretovaného, vo vode rozpustného FAPa enzýmu sa vytvoril fúzovaný proteín. V tomto fúzovanom proteíne bola viazaná extracelulárna doména CD8, obsahujúca prvých 189 aminokyselín CD8 myši, na extracelulárnu doménu FAPa (aminokyseliny 27 až 760), ako to opisuje Lane et al., J. Exp. Med., 177, 1209 (1993), s použitím protokolov polymerázovej reťazovej reakcie a s vložením do komerčne dostupného vektora pVL1393. Transfekcia Sf9 buniek s týmto vektorom a amplifikácia výsledného bacilovírusu sa vykonali podľa opisu (Bacilovirus Expression Vectors, O'Reilly, Miller a Luckov, Oxford University Press, 1994). Uvedený fúzovaný CD8-FAP proteín sa izoloval dvojstupňovým čistením z vyčerpaného prostredia High Five™ buniek, infektovaných s CD8- FAPabacilovírusom po dobu štyroch dní. Bunky a vírus sa oddelili ultraodstreďovaním, supernatant sa nechal prejsť kolónou obsahujúcou Heparin-Sepharosu (Pharmacia) a stĺpec sa postupne eluoval s 0,6, 1,0 a 2,0 M roztokom NaCI v 10 mM fosfátovom tlmivom roztoku s pH 7.> Aktívne frakcie z 1,0 a 2,0 M eluátov sa spojili a skoncentrovali za použitia filtra YM-10 a gélovej filtračnej kolóny 26/60 Superdex200. Aktivita sa prejavila pri maximálnej molekulovej hmotnosti a vystavením Nterminálnemu sekvenovaniu v plynnej fáze sa potvrdilo, že sa jedná o CD8- FAPa. Pri želatínolytickej analýze sa zistila aktivita vyššia ako 200 kD, ak sa skúšal čistený CD8- FAPa, čo je v súlade s predpopkladanou vyššou molekulovou hmotnosťou fúzovaného proteínu.
Príklad 17
Zisťovala sa prítomnosť štruktúrnych a funkčných homológov u nie humánnych druhov. Klonovala sa a charakterizovala napr. cDNA pre FAPa myši. Hodnotenie predpokladanej aminokyselinovej sekvencie homológnej myšacej FAPa cDNA sekvencie (EMBL, prístupové čiíslo Y10007) preukázalo vysoký stupeň konzervácie humánneho aj myšacieho FAPa . Uvedené dva proteíny sú na 89 % identické a katalytická triáda je u obidvoch konzervovaná. Vysoký stupeň konzervácie a podobná tkanivová expresia naznačujú, že FAPa z nie humánnych
-23zdrojov môže byť funkčne rovnocenný ľudskému FAPa. Tento záver je potvrdený zistením, že pri použití Ala-Pro-AFC ako substrátu CD8-myšací FAPa fúzovaný proteín podobnej stavby ako CD8-ľudský FAPa preukazuje tiež očakávanú dipeptidylpeptidázovú enzymatickú aktivitu.
Predchádzajúce príklady opisujú izolovanú molekulu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje pre fibroblastový aktivačný proteín alfa (“ FAPa“) ako aj dimérne formy uvedenej molekuly a ich použitie. Produkt expresie uvedenej sekvencie z COS-1 je proteín, ktorý na SDS-PAGE varených vzoriek vykazuje molekulovú hmotnosť okolo 88 kD. Odvodená aminokyselinová sekvencia, ako sa pre jednu formu molekuly uvádza v SEQ ID No: 1 dáva molekulovú hmotnosť približne 88 kD.
Treba poznamenať, že jestvuje zdanlivý rozpor v molekulovej hmotnosti v tom, že izolovaná látka z COS-1 je glykozylovaná, zatiaľ čo molekulová hmotnosť z odvodenej aminokyselinovej sekvencie glykozyláciu neberie v úvahu. Je známe, že membránové proteíny vykazujú v gélových systémoch odchýľky v migrácii, ktoré by mohli vysvetliť pozorovaný rozdiel.
- 24Zoznam sekvencií (1) Všeobecná informácia:
(i) Prihlasovatelia: Zimmermann, Rajner; Park, John, E.; Rettig, Wolfgang;
Old, Lloyd J.
(ii) Názov vynálezu: Izolovaný dimérny fibroblastový aktivačný proteín alfa a jeho použitie (iii) Počet sekvencií: 2 (iv) Adresa pre korešpondenciu:
(A) Adresát: Felfe & Lynch (B) Ulica: 805 Third Avenue (C) Mesto: New York City (D) Štát: New York (E) Krajina: USA (F) ZIP: 10022 (v) Počítačom čitateľná forma:
(A) Druh média: Disketa 3,5, 2,0 MB pamäť (B) Počítač: IBM PS/2 (C) Operačný systém: PC - DOS (D) Softvér: WordPerfect (vi) Údaje súčasnej prihlášky (A) Číslo prihlášky:
(B) Dátum podania:
(C) Zatriedenie:
(vii) Údaje predchádzajúcej prihlášky:
(A) Číslo prihlášky: 08/619 280 (B) Dátum podania: 18. marec 1996 (C) Zatriedenie: 435 (vii) Údaje predchádzajúcej prihlášky:
(A) Číslo prihlášky: 08/230 491
-25(B) Dátum podania: 20. apríl 1994 (viii) Informácia o právnom zástupcovi (A) Meno: Hanson, Norman D.
(B) Registračné číslo: 30 946 (C) Odkazové číslo/číslo spisu: LUD 5330.1-PCT (ix) Telekomunikačná informácia:
(A) Telefón: (212) 688 9200 (B) Fax: (212) 838 3884 (2) Informácia o SEQ ID No: 1:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 2 815 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 1:
AAGAACGCCC CCAAAATCTG TTTCTAATTT TACAGAAATC TTTTGAAACT TGGCACGGTA 60
TTCAAAAGTC CGTGGAAAGA AAAAAACCTT GTCCTGGCTT CAGCTTCCAA CTACAAAGAC 120
AGACTTGGTC CTTTTCAACG GTTTTCACAG ATCCAGTGAC CCACGCTCTG AAGACAGAAT 180
TAGCTAACTT TCAAAAACAT CTGGAAAAAT GAAGACTTGG GTAAAAATCG TATTTGGAGT 240
TGCCACCTCT GCTGTGCTTG CCTTATTGGT GATGTGCATT GTCTTACGCC CTTCAAGAGT 300
TCATAACTCT GAAGAAAATA CAATGAGAGC ACTCACACTG AAGGATATTT TAAATGGAAC 360
ATTTTCTTAT AAAACATTTT TTCCAAACTG GATTTCAGGA CAAGAATATC TTCATCAATC 420
TGCAGATAAC AATATAGTAC TTTATAATAT TGAAACAGGA CAATCATATA CCATTTTGAG 480
TAATAGAACC ATGAAAAGTG TGAATGCTTC AAATTACGGC TTATCACCTG ATCGGCAATT 540
TGTATATCTA GAAAGTGATT ATTCAAAGCT TTGGAGATAC TCTTACACAG ČAACATATTA 600
CATCTATGAC CTTAGCAATG GAGAATTTGT AAGAGGAAAT GAGCTTCCTC GTCCAATTCA 660
GTATTTATGC TGGTCGCCTG TTGGGAGTAA ATTAGCATAT GTCTATCAAA ACAATATCTA 720
TTTGAAACAA AGACCAGGAG ATCCACCTTT TCAAATAACA TTTAATGGAA GAGAAAATAA 780
AATATTTAAT GGAATCCCAG ACTGGGTTTA TGAAGAGGAA ATGCTTCCTA CAAAATATGC 840
TCTCTGGTGG TCTCCTAATG GAAAATTTTT GGCATATGCG GAATTTAATG ATAAGGATAT 900
-26ACCAGTTATT GCCTATTCCT ATTATGGCGA ATACCCAAAG GCTGGAGCTA AGAATCCCGT CCCTGCGTAT GTAGGTCCCC AGGAAGTGCC TTATTTCAGT TGGCTCACGT GGGTIACTGA AGTCCAGAAT GTTTCGGTCC TGTCTATATG TTGTCCAAAG ACCCAGGAGC ATATAGAAGA TGTTTCAAGA CCAGTTTTCA GCTATGATGC GGATGGCTAC AAACATATTC ACTATATCAA AAGTGGCAAG TGGGAGGCCA TAAATATATT TAGCAATGAA TTTGAAGAAT ACCCTGGAAG CTATCCTCCA AGCAAGAAGT GTGTTACTTG CACAGCAAGT TTCAGCGACT ACGCCAAGTA CCCCATTTCC ACCCTTCATG ATGGACGCAC CAAGGAATTG GAAAATGCTT TGAAAAATAT TGAAGTAGAT GAAATTACTT TATGGTACAA AAAGAAGTAT CCCTTGCTAA TTCAAGTGTA TGTATTTGCT GTTAATTGGA TATCTTATCT GGTGGATGGT CGAGGAACAG CTTTCCAAGG GCTGGGTGTT TATGAAGTTG AAGACCAGAT TTTCATTGAT GAAAAAAGAA TAGCCATATG ACTGGCCCTT GCATCTGGAA CTGGTCTTTT CAGCTGGGAA TATTACGCGT CTGTCTACAC TGATAATCTT GAGCACTATA AGAATTCAAC TGTAGACTAT CTTCTCATCC ACGGAACAGC ACAGATTGCT AAAGCTCTGG TTAATGCACA CCAGAACCAC GGCTTATCCG GCCTGTCCAC CCTAAAGCAG TGTTTCTCTT TGTCAGACTA ATCTGAAAAC CTTATATAAA CCCCTCAGAC AATGCTAGTA TAAACAAACA AATTAATGTT ACTCAGAAGT TCAAGCTAAA TATTGTTTAC AGGGAGTCAT GCATTTTGCT TTGGACACAG TAATAAAGTC AGAAGTTCAA AAAAAAAAAA
TGAACAATAT CCTAGAACAA TAAATATTCC 960 TGTTCGGATA TTTATTATCG ATACCACTTA 1020 TGTTCCAGCA ATGATAGCCT CAAGTGATTA 1080 TGAACGAGTA TGTTTGCAGT GGCTAAAAAG 1140 TGACTTCAGG GAAGACTGGC AGACATGGGA 1200 AAGCAGAACT GGATGGGCTG GTGGATTCTI 1260 CATTTCGTAC TACAAAATAT TTAGTGACAA 1320 AGACACTGTG GAAAATGCTA TTCAAATTAC 1380 CAGAGTAACA CAGGATTCAC TGTTTTATTC 1440 AAGAAACATC TACAGAATTA GCATTGGAAG 1500 CCATCTAAGG AAAGAAAGGT GCCAATATTA 1560 CTATGCACTT GTCTGCTACG GCCCAGGCAT 1620 TGATCAAGAA ATTAAAATCC TGGAAGAAAA 1680 CCAGCTGCCT AAAGAGGAAA TTAAGAAACT 1740 GATGATTCTT CCTCCTCAAT TTGACAGATC 1800 TGGTGGTCCC TGCAGTCAGA GTGTAAGGTC 1860 TGCAAGTAAG GAAGGGATGG TCATTGCCTT 1920 TGACAAACTC CTCTATGCAG TGTATCGAAA 1980 TACAGCTGTC AGAAAATTCA TAGAAATGGG 2040 GGGCTGGTCC TATGGAGGAT ACGTTTCATC 2100 CAAATGTGGI ATAGCAGTGG CTCCAGTCTC 2160 AGAGAGATTC ATGGGTCTCC CAACAAAGGA 2220 TGTGATGGCA AGAGCAGAAT ATTTCAGAAA 2280 AGATGATAAT GTGCACTTTC AAAACTCAGC 2340 AGTGGATTTC CAGGCAATGT GGTACTCTGA 2400 GAACCACTTA TACACCCACA TGACCCACTT 2460 AAAACGATGC AGATGCAAGC CTGTATCAGA 2520 AGTTTGCTTA TTTTATTTTT TATGTTGTAA 2580 GTTCTAAAGG CTGTTAAAAA AAAGATGAGG 2640 ATTTTCTGGT ACTCTGTGAA AGAAGAGAAA 2700 TGTTTTATCA CCTGTTCATT TGAAGAAAAA 2760 AAAAAAAAAA AAAGCGGCCG CTCGA 2815
-27(2) Informácia o SEQ ID No: 2:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 760 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 2:
Met Lys Thr Trp Val Lys íle Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val
5 10 15
Leu Ala Leu Leu Val Met Cys íle Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His
20 25 30
Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp íle Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp íle Ser Gly
50 55 60
Gin Glu Tyr Leu His Gin Ser Ala Asp Asn Asn íle Val Leu Tyr Asn
65 70 75 80
íle Glu Thr Gly Gin Ser Tyr Thr íle Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gin Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr íle Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro íle Gin Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gin Asn Asn íle Tyr Leu Lys Gin Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gin íle Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys íle
180 185 190
Phe Asn Gly íle Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Pro Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala 210 Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala
215 220
Glu Phe Asn Asp Lys Asp íle Pro Val íle Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Glu Gin Tyr Pro Arg Thr íle Asn íle Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg íle Phe íle íle Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
Ala Tyr Val Gly Pro Gin Glu Val Pro Val Pro Ala Met íle Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gin Trp Leu Lys Arg Val Gin Asn Val Ser Val Leu Ser íle
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gin Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gin
325 330 335
Glu His íle Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Arg Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala íle Ser Tyr Tyr Lys íle Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His íle His Tyr íle Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala íle Gin íle Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala íle Asn íle
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gin Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn íle Tyr Arg íle Ser íle Gly Ser Tyr
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gin Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly íle Pro íle Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gin Glu íle Lys íle Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
Z 485 490 495
Ala Leu Lys Asn íle Gin Leu Pro Lys Glu Glu íle Lys Lys Leu Glu
500 505 510
Val Asp Glu íle Thr Leu Trp Tyr Lys Met íle Leu Pro Pro Gin Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu íle Gin Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gin Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp íle Ser Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val íle Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gin Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gin íle Thr Ala Val Arg Lys Phe íle
595 600 605
Glu Met Gly Phe íle Asp Glu Lys Arg íle Ala íle Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly íle Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu íle His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gin Asn Ser Ala Gin íle Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gin Val Asp Phe Gin Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gin Asn His Gly Leu
725 730 735
Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu
740 745 750
Lys Gin Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
r ť

Claims (27)

1. Izolovaná dimérna molekula FAPa, ktorá má molekulovú hmotnosť okolo 170 kilodaltonov, ktorá je stanovená spôsobom SDS-PAGE; pričom dimérna molekula FAPa je schopná degradovať extracelulárne matrixové proteíny.
2. Izolovaná dimérna molekula FAPa podľa nároku 1, v ktorej každý monomér dimérnej molekuly FAPa obsahuje aminosekvenciu SEQ ID No: 2.
3. Izolovaná dimérna molekula FAPa podľa nároku 1, ktorá je produkovaná rekombinantne.
4. Izolovaná dimérna molekula FAPa podľa nároku 3, ktorá je produkovaná eukaryotickými bunkami.
5. Izolovaný proteín, obsahujúci: (a) katalytickú doménu FAPa a (b) najmenej jednu časť ne-FAPa proteínu.
6. Spôsob odštiepenia terminálneho dipeptidu so vzorcom Xaa-Pro od molekuly, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje privedenie molekuly do styku s druhou molekulou pričom druhá molekula má FAPa enzymatickú aktivitu.
7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že druhá molekula je izolovaný dimér FAPa.
8. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že druhá molekula obsahuje FAPa-katalytickú doménu.
9. Spôsob identifikácie látky, ktorá vstupuje do interakcie s molekulou, ktorá má FAPa aktivitu; vyznačujúci sa tým, že zahrnuje spájanie molekuly so
-31 skúšanou vzorkou a stanovenie akejkoľvek interakcie s uvedenou molekulou ako indikácie molekuly, ktorá vstupuje do interakcie s molekulou, ktorá má FAPa aktivitu.
10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že molekula FAPa je dimérna.
11. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že molekula obsahuje FAPa-katalytickú doménu.
12. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že látka je antagonistom FAPa aktivity.
13. Spôsob podľa nároku 9, vyznačuj úci sa tým, že látka je agonistom FAPa aktivity.
14. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že látka je inhibítor FAPa aktivity.
15. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje spájanie látky s bunkovým extraktom, ktorý má FAPa aktivitu.
16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že bunkový extrakt je extrakt bunky, ktorá bola transformovaná alebo transfektovaná molekulou nukleovej kyseliny, ktorá kóduje molekulu s FAPa aktivitou.
17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že bunka je prokaryot.
-3218. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že bunka je eukaryot.
19. Použitie látky, ktorá vstupuje do interakcie s FAPa molekulami alebo s molekulami, ktoré majú aktivitu na degradáciu extracelulárneho matrixového proteínu, ktoré je dostatočné na zníženie úrovne FAPa aktivity na výrobu liečiva na liečbu subjektu v patologickom stave, charakterizovaným zvýšenou úrovňou FAPa aktivity vzhľadom na normálnu úroveň, pričom uvedené zvýšenie FAPa aktivity je charakterizované ako zvýšenie aktivity degradácie extracelulárneho matrixového proteínu
20. Použitie podľa nároku 19, kde látka je inhibítorom aktivity FAPa.
21. Použitie podľa nároku 20, kde inhibítorom je kolagénový derivát.
22. Použitie podľa nároku 20, kde inhibítorom je (Sý-valyl-pyrolidín-2(/?)borónová kyselina.
23. Použitie podľa nároku 19, kde látka je antagonistom aktivity FAPa.
24. Spôsob stanovenia schopnosti látky znižovať aktivitu FAPa, vyznačujúci sa t ý m, že zahrnuje:
- viazanie FAPa aktívnej molekuly; uvedená molekula s FAPa aktivitou je charakterizovaná tak, že má extracelulárnu matrixovú degradačnú aktivitu; uvedená FAPa aktívna molekula sa viaže s Ala-Pro-AFC za prítomnosti, alebo bez prítomnosti uvedenej látky, a
- stanovenie úrovne FAPa aktivity, pričom zníženie FAPa aktivity uvedenej molekuly za prítomnosti uvedenej látky poukazuje na to, že uvedená látka znižuje FAPa aktivitu uvedenej molekuly.
-3325. Fúzovaný proteín, obsahujúci časť FAPa molekuly, ktorá postačuje na zachovanie FAPa aktivity, a ne-FAPa aminokyselinovú sekvenciu, pričom fúzovaný proteín je rozpustný vo vode.
26. Fúzovaný proteín podľa nároku 25, pričom ne-FAPa aminokyselinová sekvencia je aminokyselinová sekvencia, nachádzajúca sa v CD8 proteíne.
27. Fúzovaný proteín podľa nároku 26, pričom CD8 proteín je proteín myši.
28. Fúzovaný proteín podľa nároku 26, pričom proteín CD8 je ľudský proteín.
29. Fúzovaný proteín podľa nároku 26, obsahujúci aminokyseliny 1 až 189 proteínu CD8 myši, viazané na aminokyseliny 27 až 760 FAPa.
SK1267-98A 1996-03-18 1997-03-12 Isolated dimeric fibroblast activation protein alpha, and uses thereof SK126798A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/619,280 US5767242A (en) 1994-04-20 1996-03-18 Isolated dimeric fibroblast activation protein alpha, and uses thereof
PCT/US1997/004215 WO1997034927A1 (en) 1996-03-18 1997-03-12 Isolated dimeric fibroblast activation protein alpha, and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK126798A3 true SK126798A3 (en) 1999-05-07

Family

ID=24481231

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1267-98A SK126798A3 (en) 1996-03-18 1997-03-12 Isolated dimeric fibroblast activation protein alpha, and uses thereof

Country Status (23)

Country Link
US (2) US5767242A (sk)
EP (1) EP0960127B1 (sk)
JP (1) JP4102441B2 (sk)
KR (1) KR20000064655A (sk)
CN (1) CN1214052A (sk)
AT (1) ATE449106T1 (sk)
AU (1) AU729369B2 (sk)
BG (1) BG102781A (sk)
BR (1) BR9708100A (sk)
CA (1) CA2242342C (sk)
CZ (1) CZ299698A3 (sk)
DE (1) DE69739665D1 (sk)
DK (1) DK0960127T3 (sk)
EE (1) EE03693B1 (sk)
ES (1) ES2334183T3 (sk)
HU (1) HUP0104468A3 (sk)
IL (1) IL125124A0 (sk)
NO (1) NO984298D0 (sk)
NZ (2) NZ331758A (sk)
PL (1) PL328947A1 (sk)
SK (1) SK126798A3 (sk)
TR (1) TR199801845T2 (sk)
WO (1) WO1997034927A1 (sk)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6455677B1 (en) 1998-04-30 2002-09-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh FAPα-specific antibody with improved producibility
US6979697B1 (en) * 1998-08-21 2005-12-27 Point Therapeutics, Inc. Regulation of substrate activity
EP1806138A1 (en) * 1999-05-25 2007-07-11 Point Therapeutics, Inc. Anti-tumor agents comprising boroproline compounds
US6890904B1 (en) 1999-05-25 2005-05-10 Point Therapeutics, Inc. Anti-tumor agents
JP2003500360A (ja) * 1999-05-25 2003-01-07 ポイント セラピューティクス， インコーポレイテッド ボロプロリン化合物類を含む抗癌剤
US20030092890A1 (en) * 1999-07-28 2003-05-15 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030091574A1 (en) * 2001-03-23 2003-05-15 Gevas Philip C. Combination treatment of pancreatic cancer
US20090191232A1 (en) * 2001-05-04 2009-07-30 Gevas Philip C Combination therapy for the treatment of tumors
AU2002326356A1 (en) * 2001-07-09 2003-01-29 Aphton Corporation Treatment and prevention of cancerous and pre-cancerous conditions of the liver, lung and esophagus
US7691967B2 (en) 2002-04-30 2010-04-06 Trustees Of Tufts College Smart pro-drugs of serine protease inhibitors
IL166157A0 (en) * 2002-07-09 2006-01-15 Point Therapeutics Inc Methods and compositions relating to isoleucine boroproline compounds
US7309774B2 (en) 2003-02-07 2007-12-18 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Antiplasmin cleaving enzyme
US20080057491A1 (en) * 2003-02-07 2008-03-06 Mckee Patrick A Substrates and inhibitors of antiplasmin cleaving enzyme and methods of use
EP1608984A2 (en) * 2003-03-28 2005-12-28 Aphton Corporation Gastrin hormone immunoassays
WO2005071073A1 (en) * 2004-01-09 2005-08-04 Point Therapeutics, Inc. Fap compositions and the use thereof for immunomodulation
EP1730193A2 (en) * 2004-03-29 2006-12-13 Receptor Biologix, Inc. Monoclonal antibodies to gastrin hormone
WO2006010517A2 (en) * 2004-07-29 2006-02-02 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with fibroblast activation protein (fap)
ES2400058T3 (es) * 2004-09-22 2013-04-05 Cancer Advances, Inc. Anticuerpos monoclonales para progastrina
US20090238862A1 (en) * 2004-10-27 2009-09-24 Wen-Tien Chen Methods and Compositions for Seprase Inactivation
JP5308029B2 (ja) 2004-11-24 2013-10-09 テクラブ インコーポレイテッド 分析物を検出するための装置および方法
US8067248B2 (en) 2005-12-14 2011-11-29 Luwig Institute for Cancer Research Method for diagnosing rheumatoid arthritis via assaying myofibroblast-like synoviocytes for fibroblast activation protein
US8933201B2 (en) 2006-06-07 2015-01-13 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Substrates and inhibitors of antiplasmin cleaving enzyme and fibroblast activation protein and methods of use
CA2657217A1 (en) * 2006-06-21 2007-12-27 The Scripps Research Institute Dna composition against tumor stromal antigen fap and methods of use thereof
CA2753884A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Trustees Of Tufts College Soft protease inhibitors, and pro-soft forms thereof
AU2013369261B2 (en) * 2012-12-28 2018-08-09 Cobiores Nv Minimally toxic prodrugs
CN103267852B (zh) * 2013-05-15 2015-03-25 中国医学科学院北京协和医院 成纤维激活蛋白α在制备胰腺癌预后试剂盒中的用途
JP6744826B2 (ja) 2014-06-13 2020-08-19 バック バイオサイエンシーズ, エルエルシーBach BioSciences, LLC Ｆａｐ活性化治療剤及びそれに関連する使用
CN105859866B (zh) * 2016-05-27 2019-08-13 郑州大学 Fap来源的抗肿瘤ctl表位肽p265及其应用
EP3555627B1 (en) 2016-12-14 2023-11-22 Purdue Research Foundation Fibroblast activation protein (fap)-targeted imaging and therapy
EP3624841A4 (en) 2017-06-15 2021-01-27 Cancer Advances, Inc., COMPOSITIONS AND METHODS OF INDUCING HUMORAL AND CELLULAR IMMUNITIES AGAINST TUMORS AND CANCER
JP2023554520A (ja) 2020-12-22 2023-12-27 コビオレス エヌヴイ テトラペプチド部分を含む化合物
WO2022167664A1 (en) 2021-02-07 2022-08-11 Cobiores Nv Compounds comprising a tetrapeptidic moiety

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1320734C (en) * 1986-02-04 1993-07-27 Suntory Limited Pyrrolidineamide derivative of acylamino acid and pharmaceutical composition containing the same
US5587299A (en) * 1994-04-20 1996-12-24 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Isolated nucleic acid molecule coding for fibroblast activation protein alpha and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU729369B2 (en) 2001-02-01
CA2242342A1 (en) 1997-09-25
JP4102441B2 (ja) 2008-06-18
EP0960127B1 (en) 2009-11-18
BR9708100A (pt) 2000-01-04
CN1214052A (zh) 1999-04-14
BG102781A (en) 1999-09-30
DE69739665D1 (de) 2009-12-31
US5965373A (en) 1999-10-12
ATE449106T1 (de) 2009-12-15
US5767242A (en) 1998-06-16
CZ299698A3 (cs) 1999-01-13
DK0960127T3 (da) 2010-03-29
AU2330297A (en) 1997-10-10
TR199801845T2 (xx) 1998-12-21
IL125124A0 (en) 1999-01-26
HUP0104468A3 (en) 2004-10-28
NO984298L (no) 1998-09-17
NO984298D0 (no) 1998-09-17
EE9800306A (et) 1999-02-15
NZ331758A (en) 2000-01-28
EE03693B1 (et) 2002-04-15
CA2242342C (en) 2013-05-14
PL328947A1 (en) 1999-03-01
EP0960127A1 (en) 1999-12-01
WO1997034927A1 (en) 1997-09-25
EP0960127A4 (en) 2004-09-08
ES2334183T3 (es) 2010-03-05
JP2000507100A (ja) 2000-06-13
NZ335543A (en) 2001-03-30
KR20000064655A (ko) 2000-11-06
HUP0104468A2 (hu) 2002-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK126798A3 (en) Isolated dimeric fibroblast activation protein alpha, and uses thereof
US7169566B2 (en) Metalloproteinases
CA2170509C (en) Dna encoding prostaglandin receptor ep2
AU685273B2 (en) Isolated nucleic acid molecule coding for fibroblast activation protein alpha and uses thereof
CA2296766C (en) Aggrecan degrading metallo proteases
EP0699763B1 (en) Nucleic acid sequence encoding trypsin-like enzyme and process for producing the enzyme
WO1995029233A9 (en) ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE CODING FOR FIBROBLAST ACTIVATION PROTEIN α AND USES THEREOF
Paul et al. Baculovirus-directed expression of the human insulin receptor and an insulin-binding ectodomain.
JP2002515020A (ja) ＴＮＦ−α転換酵素
US20020034789A1 (en) Isolated proteins containing portions of fapalpha and other proteins
EP0759079B1 (en) DNA ENCODING PRECURSOR OF INTERLEUKIN-1-BETA CONVERTING ENZYME-RELATED CYSTEINE PROTEINASE III (ICE rel-III)
JP2003532375A (ja) ヒトセリンプロテアーゼｔをコードするｄｎａ
Servos et al. Catalytically active soluble ecto‐5′‐nucleotidase purified after heterologous expression as a tool for drug screening
EP0754234B1 (en) DNA ENCODING PRECURSOR OF INTERLEUKIN-1 BETA CONVERTING ENZYME-RELATED CYSTEINE PROTEINASE II (ICE rel-II)
JP2003502006A (ja) Ｉｌ−１７ｒｈｄｎａ及びポリペプチド
MXPA98007556A (en) Fibroblastos activation protein alpha, dimerica and isolated, and uses of the
US6670135B1 (en) Semaphorin polypeptides
US6548284B1 (en) Membrane-bound metalloprotease and soluble secreted form thereof
WO1989005353A1 (en) Common acute lymphoblastic leukemia antigen
WO2000065025A2 (en) Dna molecules encoding human endothelin converting enzyme 3