MXPA98007556A - Proteina de activacion de fibroblastos alfa, dimerica y aislada, y usos de la misma - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a formas diméricas de la proteína conocida como proteína de activación de fibroblastos alfa, o"FAPalfa"y sus usos.

Description

PROTEÍNA DE ACTIVACIÓN DE FIBROBLASTOS ALFA, DIMBRICA Y AISLADA, Y USOS DE LA MISMA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con ciertas moléculas asociadas con tejidos cancerosos y células de estroma tumoral activas. Más particularmente, se relaciona con las moléculas de proteína de activación de fibroblastos alfa (a continuación "FAPa") . Previamente se ha identificado inmunoquímicamenté una forma monomérica de la molécula, pero no se han aislado o clonado las moléculas de ácido nucleico que codifican para la misma, y se han identificado sus dímeros . Estas son, inter alia, características de la invención. La proteína monomérica tiene un peso molecular desde aproximadamente 88 hasta aproximadamente 95 unidades ilodalton determinado por SDS-PAGE de muestras sometidas a ebullición. El dímero tiene un peso molecular de aproximadamente 170 unidades kilodalton, determinado por SDS-PAGE de muestras sin someterlas a ebullición. La FAPQ; está caracterizada por numerosas características y propiedades las cuales son compartidas y por características de enzimas unidas a membrana, lo que sugiere muy fuertemente que la misma, también, es una enzima unida a membrana. Las moléculas de ácido nucleico REF. 27848 las cuales son una parte clave de la invención, son útiles tanto como sondas para células que expresen FAPa, como material inicial para producción recombinante de la proteína. Así, la proteína FAPa puede ser utilizada para producir anticuerpos monoclonales específicos para la proteína y por lo tanto son útiles como agentes diagnósticos en si mismos. También tiene usos adicionales, que incluyen usos relacionados con funciones enzimáticas, como se describe en la presente.

ANTECEDENTES Y TÉCNICA ANTERIOR El crecimiento invasivo de cánceres epiteliales se asocia con cambios celulares y moleculares característicos en el estroma de soporte. Por ejemplo, los cánceres epiteliales incluyen formación de vasos sanguíneos tumorales, el reclutamiento de fibroblastos estomales de tumor reactivo, infiltrados linfoides y fagocíticos, la liberación de mediadores peptídicos y enzimas proteolíticas, y la producción de una matriz extracelular (ECM) alterada. Véase, por ejemplo, Folkman, Adv. Cáncer Res. 43: 175-203 (1985); Basset et al., Nature 348: 699-704 (1990); Denekamp et al., Cáncer Metástasis Rev. 9: 267-282 (1990); Cullen et al., Cáncer Res. 51: 4978-4985 (1991); Dvorak et al., Cáncer Cells 3: 77-85 (1991); Liotta et al., # C ncer Res. 51: 5054s-5059s (1991); Garin-Chesa et al., J. Histochem. Cytochem. 37: 1767-1776 (1989). Un rasgo molecular altamente consiste del estroma en varios tipos histológicos comunes de cánceres epiteliales es la 5 inducción de la proteína de activación de fibroblastos (FAPGÍ) , una glicoproteína de superficie celular con un Mr observado de 95,000 descubierto originalmente con un anticuerpo monoclonal, mAb F19, producido contra fibroblastos cultivados proliferantes. Véanse Rettig et al., Cáncer Res. 46: 6406-6412 (1986); Rettig et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 3110-3114 (1988); Garin-Chesa et al., Proc. Nati. Acad. USA 87: 7235-7239 (1990); Rettig et al., Cáncer Res. 53: 3327-3335 (1993). Cada uno de estos cuatro documentos se incorpora como referencia en su totalidad. Los estudios inmunohistoquímicos tales como los citados antes han demostrado que FAPa se expresa transitoriamente en ciertos tejidos de mesenquimal fetal normal pero que los tej idos normales de ducto generalmente son FAPaf. Similarmente, las células epiteliales, neurales y hematopoyéticas malignas generalmente son FAPo . Sin embargo, la mayor parte de los tipos comunes de cánceres epiteliales, incluyendo >90% de carcinomas de mama, pulmón, piel, páncreas y colorrectal, contienen fibroblastos estomales reactivos FAPa+. Garin-Chesa et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 87: 7235-7239 (1990). Los fibroblastos estromales de tumor FAPa;+ casi invariablemente acompañan a los vasos sanguíneos tumorales, formando un compartimiento celular distinto interpuesto entre el endotelio capilar tumoral y el aspecto basal de los grupos celulares epiteliales malignos. Aunque los fibroblastos estomales FAPa+ se encuentran en carcinomas primario y metastásico, las lesiones epiteliales benignas y premalignas, tales como fibroadenomas de mama y adenomas colorrectales solo raramente contienen células estromales FAPa+. En contraste con la localización específica de estroma de FAPa en neoplasmas epiteliales, FAPa se expresa en células malignas de una gran proporción de sarcomas óseos y de tej ido suave . (Rettig et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 3110-3114 (1988) ) . Finalmente, se han detectado fibroblastos FAPo;+ en el tejido de granulación de sanado de heridas (Garin-Chesa et al., supra) . Basados en el patrón de distribución de tejido de FAPa; en tejidos normales y su expresión uniforme en el estroma de soporte de muchos cánceres epiteliales, se han iniciado ensayos clínicos con mAb F19 marcado con 131I en pacientes con cáncer metastásico de colon ( elt et al . , Proc. Am. Assoc. Cáncer Res. 33: 319 (1992); Welt et al. J. Clin. Oncol. 12: 1561-1571 (1994)) para explorar el concepto de "objetivo estromal tumoral" para inmunodetección e inmunoterapia de cánceres epiteliales.

"# Rettig et al., Int. J. Cáncer 58: 385-392 (1994), incorporado como referencia, discute la molécula de FAPa y sus características. Rettig et al postulan que FAPa se encuentra en complejos de peso molecular elevado que 5 exceden a 400 unidades kilodalton, pero no discute la posibilidad de moléculas diméricas, ni el documento elabora propiedades enzimáticas específicas de la molécula. La inducción de fibroblastos FAPGÍ+ en los momentos y sitios de remodelación de tejido durante el desarrollo fetal, preparación de tejido y carcinogénesis es consiste con un papel fundamental para esta molécula en la fisiología normal de fibroblastos. Por lo tanto, es de interés y valor aislar y clonar moléculas de ácido nucleico las cuales codifican para esta molécula. Este es un aspecto de la invención, el cual se describe con detalle junto con otras características de la invención, en la descripción que sigue. Los aspectos adicionales de la invención incluyen moléculas diméricas de FAPCÜ y el aprovechamiento de las propiedades de estas moléculas . Estas características también se elaboran en lo siguiente.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS -# La figura 1 compara la secuencia deducida de aminoácidos para FAPa y la secuencia conocida de CD26. Se ha optimizado la alineación. Las figuras 2A-2H, inclusive, muestran detección 5 inmunohistoquímica de FAPo; y CD26 en diversos tejidos. En las figuras 2A y 2B, se estudia el cáncer de mama, para FAPa (figura 2A) y CD26 (figura 2B) . En las figuras 2C y 2D, se estudia un histiocitoma fibroso maligno, para FAPa (figura 2C) , y CD26 (figura 2D) . Se examina tejido de 10 cicatrización dérmica en las figuras 2E (FAPQÍ) y 2F (CD26) . Se estudia un carcinoma en células renales en la figura 2G (FAPO!) y 2H (CD26) . La figura 3 representa alguno de los datos generados en experimentos los cuales muestran que FAPa 15 tiene una actividad degradante de proteína de matriz extracelular (ECM) . Cuando se lleva a cabo la detección zimográfica de extractos degradantes de gelatina de 293- FAP, se encuentra que la sustancia activa tiene un peso molecular de aproximadamente 170 kD, vía SDS-PAGE, 20 utilizando muestras que no han sido sometidas a ebullición, para reservar la actividad enzimática.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Ejemplo 1 * Previamente se ha observado que la línea de células de fibroblastos WI-38 reacciona con mAb F19 (Rettig et al., Canc. Res. 46: 6406-6412 (1986); Rettig et al., Proc. Nati. Acad. USA 85: 3110-3114 (1988); Garin-Chesa et 5 al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 7235-7239 (1990); Rettig et al., Canc. Res. 53: 3327-3335 (1993)). Se utilizan los experimentos que siguen. Se prepara una biblioteca de ADNc a partir de # WI-38, utilizando técnicas bien conocidas y materiales disponibles comercialmente. Específicamente, se construye la biblioteca en el vector de expresión pCDNAI, utilizando el equipo de aislamiento de ARNm Fast Track, y el sistema de fagémido ADNc Librarían. Una vez que se prepara la biblioteca, se someten a electroporación los vectores en la línea de células E. coli MC 1061/P3. El vector de expresión pCDNAI contiene un gen para resistencia antibióticos, de manera que se selecciona a E. coli vía resistencia a antibióticos. Las colonias las cuales son resistentes después se utilizan en experimentos posteriores. El ADN plásmido de las colonias se obtiene vía lisis alcalina y purificación en CsCl2, de acuerdo con Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab, Cold Spring Harbor, N.Y. 2d Ed. 1989) . La técnica es bien conocida en el arte, pero se incorporan como referencia en la presente.

Una vez que se ha aislado el ADN plásmido, se utiliza para transfectar células COS-1, las cuales después se cultivan durante 48 horas, después de lo cual se prueban con recipientes revestidos con anticuerpo. Los mAb 5 utilizados incluyen F19, como se describe por Rettig et al., (1986), supra, la cual se incorpora como referencia en su totalidad. Puesto que las células COS-1 normalmente son FAPaT, cualquier resultado positivo indica la presencia de * la secuencia codificante. El protocolo de inmunoselección fue el de Aruffo et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 84: 3365-3369 (1987) , incorporado en la presente como referencia. El ADN plásmido de clonas positivas se recupera, de acuerdo con Hirt, J. Mol. Biol. 26: 365-369 (1967), y se reintroduce en E. coli MC 1061/P3, y se vuelve a seleccionar en células COS-1. El protocolo presentado en la presente se sigue cuatro veces. Después de esto, el ADN plásmido de 50 colonias bacterianas aisladas se purifica, utilizando el equipo de plásmido Qiagen. De las colonias, se encuentra que 27 clonas contienen insertos idénticos de 2.8 kb, determinados por un mapeo de enzimas de restricción EcoRI . Se encuentra que varios de estos, contienen ADNc específico para FAPa determinado por expresión transitoria en células COS-1 y tinción de inmunofluorescencia directa con mAb F19.

Una de estas clonas, es decir, "pFAP.38" se selecciona para estudio posterior, y elaborado como se indica antes. Ejemplo 2 Una vez que se ha identificado el plásmido pFAP.38, se prueba junto con un vector codificante para un marcador de superficie bien conocido CD26 ("pCD26"), así como con un vector de control pCDNA I . En estos experimentos, se transfectan células COS-1 con uno de pFAP.38, pCD26 o pCDNAI de los plásmidos. Después de 48 horas, los transceptantes se prueban utilizando el ensayo de roseta MHA bien conocido para expresión de antígeno y superficie celular. En estos experimentos, se utiliza mAb F19, el cual es específico para FAPo;, junto con mAb EF-1, el cual es específico para CD26. También se utilizan otros cuatro mAb, específicos para FAPa, específicamente, FB23, FB52, FB58 y C48. También se prueban dos líneas de células cancerígenas las cuales se sabe reaccionan con mAb F19 (liposarcoma SW872) , o EF-1 (cáncer de ovario SK-0V6) . Los resultados se establecen en la Tabla 1, que sigue.

Tabla 1. Expresión en superficie celular de epitopos FAPa múltiples y CD26 en células humanas y transfectantes de células COS-1.

Expresión de antígeno en superficie celular Célula objetivo F19 F23 FB52 FB58 C48 EF-1 Células humanas 5 liposarcoma SW872 >95% >95% >95% >95% >95% - cáncer de ovario SK-OV6 _ _ _ _ _ -gg. Transfectantes COS-1 »j¿a control COS»pCDNAI _ _ _ _ _ _ COS«pFA P 38 40% 30% 40% 20% 20% - 10 C0S «pCD26 - - - - - 40% Ej emplo 3 Después se llevaron a cabo estudios de 15 inmunoprecipitación para identificar el antígeno al cual se dirigen los anticuerpos . Se marcaron metabólicamente células con una marca Trans35S (ICN) , extraído con amortiguador de lisis (Tris-HCl 0.01 M/NaCl 0.15 M/MgCl2 0.01 M/Nonidet P-40 al 20 0.5%/aprotinina (20 µg/ml) /fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM) , y después se inmunoprecipitan. Los protocolos utilizados son bien conocidos, como se observará con la referencia a Rettig et al., Canc. Res. 53: 3327-3335 (1993); y Fellinger et al., Canc. Res. 51: 336-340 (1991), 25 las descripciones de las cuales se incorporan en su - X1 -totalidad como referencia. Los mAb precipitantes fueron Ig de ratón como control negativo, mAb F19 o EF-1. Se llevaron a cabo pruebas control con células COS-1 transfectadas en falso. Después de la inmunoprecipitación, los inmunoprecipitados se someten a ebullición en amortiguador de extracción y se separan por NaD0dS04/PAGE, bajo condiciones reductoras . En algunos experimentos, se llevó a cabo una prueba adicional para determinar si el material inmunoprecipitado estaba glicosilado o no. En estos experimentos, se fraccionaron extractos celulares con A-SEPHAROSE antes de la inmunoprecipitación. Después de la inmunoprecipitación, pero antes del fraccionamiento en NaDodS04/PAGE, estos precipitados se digirieron con N-Glicanasa. Los resultados muestran que en células COS-1, pFAP.38 dirige la expresión de una especie de proteína 88 kd (determinada vía SDS-PAGE) , la cual es ligeramente más pequeña que la especie FAPa de 95 kd producida por SW872, o fibroblastos cultivados. La digestión con N-Glicanasa produce péptidos de tamaño comparable (es decir, 74 kd versus 75 kd) , que muestran que la glicosilación de la proteína FAPa en células COS-1 es diferente que en las líneas de células humanas.

E emplo 4 Posteriormente se llevó a cabo el análisis de transferencia Northern clásico. Utilizando el ARNm de líneas de células de fibroblastos FAPa+ WI-38 y GM 05389, y una línea de células de cáncer de ovario FAPaf, SK-0V6. Utilizando los procedimientos de Sambrook, et al., supra , se probaron cinco microgramos de ARNm de cada línea celular. Las sondas utilizadas se marcaron con 3P y se prepararon a partir de un fragmento ECO I de 2.3 kb del plásmido pFAP.38, un fragmento Hind III de 2.4 kb de CD26, y un fragmento BamHI de 1.8 kb de ADNc para ?-actina. Estos fragmentos se han purificado a partir de geles de agarosa al 1%. Los extractos de cepas de fibroblastos FAPOÍ+ muestran especies de ARNm par FAP de 2.8 kb, pero los extractos de SK-OV6 no. Una especie de ARNm para ?-actina (1.8 kb) se observa en todas las especies.

Ejemplo 5 El ADNc identificado como codificante para FAPo; se somete a un análisis más detallado, comenzando con el secuenciado. Se utiliza la metodología de Sanger, como se establece en Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977) "* f para determinar la secuencia de ambas cadenas del ADNc. Una vez que esto se asegura, se deduce de la misma una secuencia de aminoácidos . Esta información se presenta en la SEC. DE IDENT. NO: 1. Posteriormente la secuencia se 5 compara con la secuencia conocida de aminoácidos de CD26 (Morimoto et al., J. Immunol . 143: 3430-3437 (1989)). La figura 1 presenta la comparación, utilizando la alineación de secuencia utilizada. Cualquier espacio en la comparación se indica por asteriscos, mientras que los aminoácidos idénticos se muestran por iones en la secuencia CD26. Una secuencia transmembranal putativa hidrofóbica se subraya doble, mientras que los sitios de N-glicosilación potenciales se subrayan una vez . El análisis de secuencia muestra un inserto de 2812 pares de bases, en donde 2277 pares de bases constituyen el marco de lectura abierta. Este ORF se extiende desde el codón de inicio ATG en el nucleótido 209, hasta el codón de detención TAA en 2486. El polipéptido deducido es de 760 aminoácidos de largo, y tiene un peso molecular de 87,832. En contraste, se ha reportado que FAP-o; inmunopurificada, digerida con N-Glicanasa tiene un Mr estimado de 75,000 en NaDodS04/PAGE (Rettig et al., Canc. Res. 53: 3327-3335 (1993)). Se llevó a cabo una investigación en la base de datos GenBank. Los géneros relacionados más cercanamente fueron los que codifican para los homólogos IV de dipeptidilpeptidasa (DPPIV; EC 3.4.14.5), con DPPIV humano (también conocido como antígeno de activación de células T CD26) , que muestra 61% de identidad en la secuencia de nucleótidos, y 48% de 5 identidad en la secuencia de aminoácidos. El segundo conjunto de genes relacionados son homólogos de humano, rata y bovino de DPPX, un gen de función desconocida expresado ampliamente en el cerebro y otros tej idos normales . El producto del gen para DPPX humano predicho muestra aproximadamente 30% de identidad en la secuencia de aminoácidos con FAPa y CD26. La molécula de FAPo; muestra características estructurales típicas de las proteínas de membrana integrales tipo II, que incluyen un dominio extracelular COOH terminal grande, un segmento transmembranal hidrofóbico y una cola citoplasmática corta. El dominio extracelular putativo contiene cinco sitios potenciales de N-glicosilación, once residuos cisteína (ocho de los cuales se conservan entre FAPa y CD26) , y tres segmentos que corresponden a dominios catalíticos altamente conservados, característicos de las serina proteasas, tales como DPPIV. Estas secuencias conservadas se presentan en la Tabla 2, que sigue. Se realizan comparaciones de DPPIV y DPPX vía Morimoto et al., supra ; Wada et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 197-201 (1992); Yokotani et al., Human Mol. Genet. 2: 1037-1039 (1993).

Ejemplo 6 Se llevó a cabo un compuesto adicional de experimentos para determinar si están presentes secuencias relacionadas con FAPa; en especies no humanas . Para hacer esto, se digirió ADN genómico de humano, ratón y de hámster chino utilizando enzimas de restricción, y se probó mediante transferencia Southern, utilizando el fragmento de 2.3 kb, marcado con 32P, descrito antes. Se llevó a cabo la hibridización utilizando condiciones de lavado estrictas (0.1 x SSC, 0.1% NaDodS04, 68°C). Se observó fácilmente la hibridización cruzada con ADN de ratón, de hámster, lo que sugiere la existencia de homólogos de FAPa altamente conservados. En experimentos control utilizando un fragmento de ADNc para CD26 descrito antes, no se observó evidencia de hibridización cruzada.

E emplo 7 La molécula de CD26 comparte numerosas propiedades bioquímicas y serológicas con FAP/3, la cual ha sido previamente descrito, una molécula asociada con FAPo; que tiene un peso molecular de 105 kd, y que se encuentra en fibroblastos cultivados y en melanocitos (Rettig et al . Canc. Res. 53: 3327-3335 (1993)). Se llevaron a cabo experimentos de cotransfección, para determinar si FAP/3 es un producto del gen para CD26. Para probar esto, se utilizaron los mismos protocolos, los cuales fueron utilizados para transfección con pFAP.38 o pCD26, como se 5 describe antes, pero utilizando dos vectores. Los resultados presentados antes muestran que la eficiencia de cotransfección es de aproximadamente 40% para cada vector, j k de manera que aproximadamente 10-20% de la célula sería cotransfectada . 10 Después de la cotransfección, las células COS-1 se marcan con 3SS Trans, como se describe antes y después se lisan, como también se describe en lo anterior. Los extractos celulares resultantes se separan en Con A SEPHAROSE y se recupera el antígeno (FAPa; y/o CD26) en la fracción unida a Con-A. La fracción unida se eluye con a-D-manopiranósido 0.25 M. Posteriormente se lleva a cabo la inmunoprecipitación, como se describe antes, y los precipitados se separan en NaDoS04/PAGE, también como se describe en lo anterior. 20 Las células transfectadas únicamente con pFAP.38 producen FAPo;, pero no FAP3 (determinado a partir de inmunoprecipitados con mAb F19) . Tampoco producen antígeno CD26 (probado con EF-1) . Aquéllas células transfectadas con pCD26 solo, producen CD26 pero no FAPa;. Los cotransfectantes producen CD26 y_ heterómeros de FAPa/FAP3, determinado en los precipitados de mAb F19. Este resultado proporciona evidencia directa de que FAP/3 es un producto del CD26.

Ejemplo 8 Se ha observado previamente que algunos tipos de células humanas cultivadas coexpresan FAPa; y CD26, y muestran la formación del heterómero FAPa;/CD26. Sin embargo, los patrones de distribución in vivo de FAPa; y CD26, determinados en estudios inmunohistoquímicos previos, parecen no superponerse. (Véase Rettig et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 3110-3114 (1988); Garin-Chesa et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 7235-7329 (1990); Rettig et al., Canc. RES. 53: 3327-3335 (1993); Stein et al., en Knapp et al., eds . Leukocyte typing IV-white cell differentiation antigens, pp 412-415 (Oxford University Press, N.Y. 1989), pp . 412-415; Móbious et al., J. Exp. Immunol. 74: 431-437 (1988)). En vista de la importancia potencial de la coasociación de FAPCÜ/CD26, se reexaminó la distribución de tejido vía tinción inmunohistoquímica lado a lado de tejido normal y tejido de lesiones que se sabe contiene fibroblastos FAPaf o células malignas FAPa;+. Para probar las muestras, se incrustaron en compuesto OCT, se congelaron en isopentano preenfriado en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -70 °C hasta su uso. Se cortaron secciones de cinco micrómetros de espesor, se montaron en placas revestidas con poli-L-lisina, se secaron al aire y se fijaron en acetona fría (4°C durante 5 10 minutos) . Posteriormente las secciones se probaron con mAb (10-20 µg/ml) , utilizando el método bien conocido de inmunoperoxidasa avidina-biotina, como se describe por, por É ejemplo, Garin-Chesa et al., J. Histochem. Cytochem. 37: 1767-1776 (1989); Garin-Chesa et al., Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 87: 7235-7329 (1990); Rettig et al., Canc. Res. 53: 3327-3335 (1993); Garin-Chesa et al., Am. J. Pathol . 142: 557-567. Los resultados se muestran en la figura 2. Los carcinomas de mama, colorrectal, páncreas y pulmón muestran una fuerte expresión de FAPa; y no se encontró CD26 (véanse las figuras 2A y 2B) . Se probaron cinco sarcomas FAPa;+, incluyendo histocitoma fibroso maligno (figuras 2C y 2D) , y no hubo expresión de CD26. El examen de fibroblastos reactivos de medidas térmicas que sanan (figuras 2E, 2F) , muestra expresión abundante tanto como de FAPa! como de CD26. Los tres carcinomas renales probados (figuras 2G, 2H) , muestran la expresión de CD26 en epitelio maligno. FAPa! está ausente de células epiteliales malignas, y muestra una baja expresión en el estroma de estos carcinomas.

* Ejemplo 9 Se preparó una línea celular de mamífero, transfectada con ADNc que codifica para FAPa!. 5 La línea de células de riñon embriónico humano 293 es bien conocida y está altamente disponible de, por ejemplo, la American Type Culture Collection. Se mantuvieron muestras de 293 en un incubador a * 37 °C en una atmósfera de 95% de aire y 5% de C02. Las células se cultivaron en una mezcla 50:50 de medio esencial mínimo modificado de Dulbecco y medio F12 de Ham aumentado o mejorado son suero bovino fetal al 10%, penicilina y estreptomicina. Siguiendo los procedimientos descritos por Ustar et al., Eur. Mol. Biol. J. 1991, y/o Park et al., J.

Biol. Chem. 169: 25646-25654 (1994), las cuales se incorporan como referencia, se transfectó ADNc para FAPa! (es decir, la SEC. DE IDENT. NO:l), en las células 293. Los detalles del vector ADNc se proporcionan supra (pFAP.38) . Se seleccionan transfectantes por resistencia a antibióticos (200 µg/ml de geneticina) y después se mantuvieron en medio de selección, que contiene geneticina. Se tomaron colonias individuales de células resistentes, se hicieron crecer hasta confluencia en placas de cultivo de 6 pozos y se probaron para expresión FAPa! en un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) , utilizando anticuerpo monoclonal específico para FAPa!, F19, como se describe antes. Aquéllas colonias las cuales expresaron FAPa! fueron expandidas y monitoreadas por IFA indirecta y análisis citofluorométrico, también como se establece antes . Los IFA fueron positivos para los transfectantes, denominados a continuación como la línea celular 293 -FAP, pero fueron negativos par ala línea original 293.

Ejemplo 10 Con el fin de confirmar que FAPa; recombinante de hecho, estaba produciéndose, se llevaron a cabo una serie de experimentos de inmunoprecipitación. Estos siguieron los métodos de Park et al., supra y Rettig et al., Canc. Res. 53-: 3327-3335 (1993) , ambos los cuales se incorporan como referencia. Esencialmente, se combinaron extractos celulares marcados con 3S [S] metionina, con anticuerpo monoclonal F19, de la manera descrita antes. Posteriormente se sometieron a ebullición precipitados en amortiguador de extracción y se corrieron en geles SDS-PAGE, utilizando como un control negativo IgGl de ratón. Se probaron tanto la línea celular 293 -FAP como la línea 293 no transfectada. Los resultados indican claramente que se produce FAPa! recombinante por la línea celular transfectada 293 -FAP. Esto se determinó mediante análisis de inmunoprecipitación utilizando anticuerpo monoclonal específico para FAPa; F19.

Ejemplo 11 La capacidad de producir FAPa! recombinante permitió un estudio adicional de las propiedades de la molécula. Específicamente, dadas las características estructurales indicadas en los ejemplos previos, se diseñaron experimentos para determinar si FAPa! posee actividad enzimática. Se diseñaron experimentos para probar si FAPa! tiene o no actividad degradante de proteína de matriz extracelular (ECM) . Se prepararon extractos de células 293 -FAP utilizando un amortiguador de extracción (NaCl 0.15M, Tris-HCl 0.05M, pH 7.4, MgCl2 10 mM, Tritón X-114 1 por ciento), fueron separados por centrifugación (4,000 xg, 10 minutos a 4°C) , y se sometieron a división de fases a 37°C durante 10-20 minutos. Esto fue seguido por centrifugación adicional (4,000 x g, 20 minutos a 20-25°C). Las fases de detergente se diluyeron con amortiguador (NaCl 0.15 M, Tris-HCl 0.05 M, pH 7.4, CaCl2 5 mM, MgCl2 5 mM, Empigen BB 0.75%), y se separaron en concanavalina A-Sepharose siguiendo el procedimiento de Rettig et al., supra . Todas las fracciones unidas a concanavalina A se eluyeron con metil-a;-D-manopiranósido 0.25 M en amortiguador de elusión 0.15 M, Tris-HCl 0.05, pH 7.4, CaCl2 5 mM, MgCl2 5 mM, Tritón X-100 0.1%), se mezclaron con amortiguador de 5 muestra de zimografía (Tris-HCl 0.25 M, pH 6.8, SDS al 8%, glicerol al 40%, azul de bromofenol al 0.01%) en una proporción 3:1 y se utilizaron para análisis posterior. Se cargaron alícuotas de la muestra en geles de poliacrilamida que contienen 0.1% de gelatina o caseína.

Posteriormente se llevó a cabo la electroforesis en un sistema Biorad Mini-Protein II, a una corriente constante de 20 mA durante 1.5 - 2 horas, hasta que el azul de bromofenol debido a los frentes de las muestras ha alcanzado el extremo inferior del gel . El gel se remueve y se incuba durante una hora a 20-25°C en una solución acuosa a 2.5% de Tritón X-100 en un agitador giratorio. La solución de Tritón X-100 se decanta y se sustituye con amortiguador de enzima (Tris-HCl 0.05 M, pH 7.5, NaCl 0.2 M, CaCl2 5 mM, MgCl2 5 mM, Brij 35 al 0.02%).

Posteriormente el gel se incuba a 37°C o 41 °C, seguido por tinción o desteñido a temperatura ambiente. Los geles se tiñen con 0.5% de azul brillante de Coomassie G-250 en una solución acuosa de metanol al 30% y ácido acético al 10% durante 15, 30 y 60 minutos, respectivamente.

Posteriormente, los geles se incuban durante 15 minutos en una solución acuosa de CH3OH al 30% y glicerol al 5%, seguido por secado entre hojas de celofán. Se evaluó la actividad de gelatinasa de acuerdo con Kleiner et al., Anal. Biochem. 218: 325-329 (1994), 5 incorporado como referencia en su totalidad. Este es un ensayo habitual utilizado para determinar si está presente o no una proteasa capaz de digerir gelatina. Un estándar en peso molecular marcado se corrió en los mismos geles, bajo condiciones reductoras, para determinaciones de peso molecular. Se probó la actividad proteolítica para secuencias repetidas o motivos de secuencias de aminoácidos definidos, utilizando ensayo de superposición de membrana bien conocidos. Véase Smith et al., Histochem. J. 24(9): 637-647 (1992) , incorporado en la presente como referencia. Los sustratos fueron Al a - Pro - 7 - amino - 4 - trifluorometilcumarina, Gly-Pro-7-amino-4-trifluorometil- coumarina y Lys-Pro-7-amino-4-trifluorometilcoumarina. Los resultados de estos experimentos se muestran, en parte, en la figura 3. Esta figura muestra la detección zimográfica de actividad degradante de gelatina en los extractos celulares. Véase Kleiner et al., supra. Una especie de proteína de aproximadamente 170 unidades kilodaltons, determinada por SDS-PAGE, se observa que tiene actividad degradante de gelatina. Esta especie, la cual se encuentra en la l nea celular 293 FAP, pero no en células 293 no transfectadas, se identifica de esta manera como FAPa;. El peso molecular es consistente con un dímero, es decir, una molécula FAPa; dimérica. 5 La actividad proteolítica descrita en la presente en donde la gelatina es en sustrato, no se observa cuando la caseína es el sustrato.

* Ejemplo 12 10 Se llevaron a cabo estudios adicionales con el fin de caracterizar adicionalmente al ^ dímero FAPa; de 170 kD. Específicamente, se repitieron los ejemplos descritos en el Ejemplo 11, excepto que se agregaron 5% de 2-mercaptoetanol o yodoacetamidas 5 µm a los extractos antes de SDS-PAGE, o se agregó ácido etilendiamina N,N,N' ,N' -tetraacético (10 mM) al amortiguador de incubación utilizado para zimografía de gelatina. Ninguno de estos tratamientos suprime la actividad enzimática. En contraste, el calentamiento a 100 °C durante 5 minutos antes de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida suprime la actividad degradante de gelatina. Trabajo adicional, utilizando un ensayo de superposición de membrana, descrito por, por ejemplo, Smith et al., Histochem J. 24(9): 643-647 (1992), incorporado como referencia, muestra que los dímeros de FAPa; también son capaces de disociar la totalidad de los dipéptidos Ala- Pro, Gly-Pro y Lys-Pro probados. En experimentos adicionales, se produjo una 5 proteína de fusión la cual estaba constituida de dominios extracelulares tanto de FAPa! como de proteínas CD8 de ratón. Esta proteína quimérica se produjo en un sistema de baculovirus en células de insecto. La proteína quimérica muestra la misma actividad enzimática que FAPa! utilizando 10 el modelo descrito supra .

Ejemplo 13 Se desarrollaron dos ensayos cuantitativos para 15 determinar actividad de la enzima FAPa; utilizando como sustrato Ala-Pro-7-amino-4-trifluorometilcoumarina (Ala- Pro-AFC) . En el formato del primer ensayo, se mezclaron extractos de membrana de células que expresan FAPa! con 5-10 veces el volumen de amortiguador de reacción (NaCl 100 mM, 20 Tris 100 mM, pH 7.8), y se agregó a un volumen igual de Ala-Pro-AFC 0.5 mM en amortiguador de reacción seguido por una incubación durante 1 hora a 37 °C. Posteriormente se midió la liberación de AFC libre en un fluorímetro utilizando un conjunto de filtro de excitación de 25 395 nm/emisión de 530 nm. Los extractos de membrana ensayo se derivaron de células 293 -FAPa; (células 293 transfectadas establemente con vector FAP.38 descrito supra) o células HT1080-FAPa; (células HT1080 transfectadas establemente con vector 5 FAP.38) . Se llevaron a cabo experimentos de control negativos determinando actividades específicas para FAPa; con extractos de membrana preparados a partir de las líneas celulares 293 o HT1080 originales respectivas. En el segundo ensayo, se aisló FAPa; de extractos de membrana 293- 10 FAPa! o HT1080-FAPO! vía un anticuerpo específico para FAPa!. Se revistieron durante la noche 96 pozos para ELISA a 4°C con 1 µg/ml de anticuerpo monoclonal F19 en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . En el caso de CD8-FAPa; discutido infra, las placas se recubrieron con anticuerpo F19 como en lo anterior o con 1 µg/ml de CD18 de rata, contra ratón, durante la noche a 4°C. Posteriormente los pozos se elevaron con amortiguador de lavado (PBS, Tween 20 al 0.1%) . El exceso de sitios de unión se bloqueó con amortiguador de bloqueo (albúmina sérica bovina al 5% en PBS) durante una hora a temperatura ambiente. Se removió el amortiguador bloqueador; se agregaron extractos de membrana de células que expresan 293 -FAPa! o células control y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El material no unido se removió, los pozos se lavaron con amortiguador de lavado y se ensayó la actividad FAPa! utilizando 100 µl de Ala-Pro-AFC (Ala-Pro-AFC 0.5 mM en amortiguador de reacción) durante 1 hora a 37 °C. Se midió la liberación de AFC libre como en lo anterior. La unión de mab F19 a FAPa; no afecta de manera mensurable su actividad 5 enzimática.

Ejemplo 14 Utilizando ensayos para actividad enzimática de FAPa;, descrito supra, se identificó un inhibidor de actividad enzimática de FAPa!. Este inhibidor es el ácido (S) -valilpirrolidin-2 (R) -borónico (Snow et al., J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:10860-10869), denominado aquí como ValboroPro. ValboroPro inhibe la disociación de Ala-Pro-AFC por FAPa! con una CIS0 de 0.11 µM. ValboroPro también inhibe la actividad gelatinolítica de FAPa; a una concentración de 100 µM. Se demostró la especificidad de ValboroPro para FAPa; en pruebas con una serina proteasa no relacionada, tripsina. No se observó inhibición de la tripsina bovina por ValboroPro (hasta 100 µM) cuando se ensaya con acetato de carbobenzoxi-L-valinil-glicinil-L-arginil-4-nitranilida como sustrato.

Ejemplo 15 La identificación de requerimientos estructurales y específicos para las actividades enzimáticas de FAPa! facilita el desarrollo de moléculas las cuales se pueden unir y/o inhibir a FAPa!. Para examinar si el residuo de serina en la posición 624 de la secuencia predicha de aminoácidos del polipéptido FAPa! es crítico para su función enzimáticá, se realizó mutagénesis dirigida al sitio, de cuerdo con Zoller, et al. DNA 3:479-488 (1984) utilizando métodos de reacción de cadena de polimerasa, estándar. El codón TCC que codifica para serina 624 en el ADNc FAPa! fue sustituido con GCG, lo que resulta en una alanina en esta posición. El ADN alterado se reintrodujo en el vector FAP.38 y se transfectó en células 293 como se describe supra. Se seleccionaron las colonias resistentes a geneticina y se examinaron mediante IFA indirecta para determinar expresión de FAPa; utilizando mAb F19 así como otros anticuerpos específicos para FAPa; descritos por Rettig, et al., J. Cáncer 58:385-392 (1994) como se establece, supra. No se observaron diferencias en la unión de los anticuerpos contra FAPa; para las células que expresan FAPa; mutante, en comparación con células transfectadas con FAPa! tipo silvestre. Se confirmó la presencia de la mutación a través de amplificación del ADN de restricción realizado con varias clonas de células transfectadas . Para determinar la actividad enzimática de FAPa; mutante, se llevaron a cabo las siguientes pruebas . Se prepararon extractos de membrana 5 de tres clonas positivas independientes y se examinaron cantidades iguales de proteína FAPa; (determinado mediante un ensayo ELISA de doble determinado utilizando dos anticuerpos contra FAPa! que reconocen epitopos distintos de * FAPa;) en los ensayos de captura gelatinolítica y de Ala- 10 Pro-AFC. Tanto la actividad gelatinolítica como la actividad en el ensayo de captura de FAPa; mutante aislado se redujeron a niveles indetectables en comparación con FAPa! de tipo silvestre, confirmando el papel de la serina canónica en la triada catalítica para ambas actividades enzimáticas observadas.

Ejemplo 16 Se generó una proteína de fusión para obtener 20 enzima FAPa; soluble en agua, secretada. En esta proteína de fusión, el dominio extracelular de CD8, que consiste de los primeros 189 aminoácidos de CD8 de ratón, se unión al dominio extracelular de FAP (aminoácidos 27 a 760) , como se describe por Lañe et al., J. Exp. Med. 177:1209 (1983) 25 utilizando los protocolos de reacción en cadena de polimerasa estándar e insertado en el vector pVL1393 disponible comercialmente. La transfección de células Sf9 con este vector y la amplificación del baculovirus recombinante resultante se llevó a cabo como se describe 5 (Baculovirus Expresión Vectors, O'Reilly, Miller, y Luckow, Oxford University Press, 1994) . La proteína de fusión CD8- FAP se aisló en una purificación de dos etapas a partir del á ? medio desperdiciado de células High FiveMR infectadas con baculovirus CD8-AFPO!, durante cuatro días. Las células y el virus fueron removidos por ultracentrifugación, el sobrenadante se hizo pasar a través de una columna que contiene heparina-Sepharose (Pharmacia) y se eluyó paulatinamente con NaCl 0.6, 1.0 y 2.0 M en fosfato 10 mM, pH 7. Se acumularon las fracciones activas de los eluatos 1.0 y 2.0 M y se concentraron utilizando un filtro YM-10 y una columna de filtración en gel 26/60 Superdex-200. Se observó actividad en un pico de peso molecular alto el cual, cuando se somete a secuenciado de fase de gases N terminal, se confirmó que es CD8-FAPa;. En ensayos gelatinolíticos, se detectó actividad mayor de 200 kD en el ensayo gelatinolítico cuando se probó CD8-FAPa; purificado, consistente con el peso molecular predicho superior de la proteína de fusión.

Ejemplo 17 Se ha determinado la presencia de homólogos estructurales funcionales en especies no humanas . Por 5 ejemplo, el ADNc para FAPa; de ratón ha sido clonado y caracterizado . El examen de la secuencia predicha de aminoácidos de la secuencia de ADN para FAPa! homólogo de í- ratón (EMBL, número de acceso Y10007) revela un alto grado de conservación de FAPa! a través de las especies . Las dos proteínas son 89% idénticas y la triada catalítica se conserva entre FAPa! humano y FAPa; de ratón. Este grado de conservación y de expresión similar de tejido sugiere que FAPa! de fuentes no humanas puede ser funcionalmente equivalente a FAPa! humano. Esta conclusión se confirma por el hallazgo de que una proteína de fusión FAPa; de ratón CD8 de diseño similar a FAPa; humano CD8 también demuestra la actividad enzimática esperada de dipeptidilpeptidasa utilizando Ala-Pro-AFC como sustrato. Los ejemplos precedentes describen una molécula de ácido nucleico aislada la cual codifica para la proteína activante de fibroblastos alfa ("FAPa!"), así como formas diméricas de la molécula, y usos de la misma. El producto de expresión de la secuencia en COS-1 es una proteína la cual, en SDS-PAGE de muestras sometidas a ebullición, muestra un peso molecular de aproximadamente 88 kd. La secuencia de aminoácidos deducida, como se proporciona en la SEC. DE IDENT. N0.-1, para una forma de la molécula, proporciona un peso molecular de aproximadamente 88 kd. Debe hacerse notar que existe una discrepancia 5 aparente en el peso molecular en que el aislado de COS-1 está glicosilado, mientras que el peso molecular de las secuencias deducidas de aminoácidos no toma en consideración la glicosilación. Se sabe que las proteínas de membrana muestran migración aberrante en sistemas de gel, sin embargo, lo cual puede explicar la diferencia observada aquí . Además, una parte de la invención son proteínas quiméricas y de fusión, las cuales comprenden una porción de FAPa! la cual contiene el dominio catalítico de la molécula y componentes adicionales que no son FAPa!. El dominio catalítico FAPa; per se también es parte de la invención. Debe entenderse que, como se describe FAPa! puede estar glicosilada, variando el tipo y cantidad de glicosilación, en base al tipo de célula que exprese la molécula. Los experimentos descritos en la presente muestran esto. Esto también es válido para la fórmula dimérica de la molécula, descrito por primera vez en la presente, que tiene un peso molecular de aproximadamente * 170 unidades kilodalton, determinado por SDS-PAGE de muestras que no se han sometido a ebullición. La invención también abarca la producción de vectores de expresión útiles para producir la molécula 5 FAPa!. En su aspecto más amplio, estos vectores comprenden la totalidad de la secuencia codificante para FAPa! o porciones de la misma, unidas operablemente a un promotor. Los elementos adicionales pueden ser una parte del vector # de expresión, tales como dominios de proteína fusionados a la proteína FAPa! o genes para las porciones de proteínas ("proteína de fusión") , los cuales confieren resistencia a antibióticos, genes amplificables y así sucesivamente. Las secuencias codificantes y los vectores también se pueden utilizar para preparar líneas celulares, en donde la secuencia codificante o el vector de expresión se utiliza para transfectar o para transformar un huésped receptor. El tipo de célula utilizado puede ser procariótico, tal como E. coli o eucariótico, tales como levaduras, CHO, COS, u otros tipos de células. 20 La identificación de las moléculas de ácido nucleico tal como se establece en la SEC. DE IDENT. NO : 1 también permite que una persona familiarizada con la técnica identifique y aisle a aquéllas moléculas de ácido nucleico las cuales hibridizan con la misma bajo condiciones de restricción. Como se utiliza en la presente, el término "condición de restricción" se refiere a aquéllos parámetros establecidos supra, por los cuales también se identificó a las secuencias de ratón y de hámster. Se reconocerá por aquéllos familiarizados en la técnica que estas condiciones proporcionan un grado de restricción el cual puede obtenerse utilizando parámetros los cuales varían de los indicadores . Tal variación está comprendida por la expresión "condiciones de recepción". La capacidad de las moléculas de ácido nucleico para hibridizar a moléculas complementarias también permite que una persona familiarizada con la técnica identifique células las cuales expresan FAPa!, vía el uso de un ensayo de hibridización de ácido nucleico. Se pueden utilizar las secuencias descritas en la invención para hibridizar en secuencias complementarias y de esta manera identificarlas . De este modo, se puede tener como objetivo ARNm, por ejemplo, el cual está presente en cualquier célula que exprese la molécula FAPa;. Por supuesto, debe entenderse que las moléculas de ácido nucleico de la invención también son útiles en la producción de FAPa! recombinante, en forma tanto monomérica como dimérica. Los ejemplos muestran claramente que las células huésped son capaces de ensamblar las formas diméricas. La proteína recombinante puede ser utilizada, por ejemplo, como una fuente de un inmunógeno para * generación de anticuerpos dirigidos a mAb F19 conocido, y con los mismos usos. Similarmente, la proteína recombinante y/o células las cuales expresen a la molécula en su superficie, pueden ser utilizados en ensayos para 5 determinar antagonistas, agonistas u otras moléculas las cuales interactúan con moléculas que tienen actividad FAPa;. Tales sustancias pueden ser, pero no se limitan necesariamente a sustratos, moléculas inhibidoras, « anticuerpos y así sucesivamente. Las moléculas que tienen actividades FAPa;, pueden ser, por ejemplo, las formas monomérica o dimérica de FAPa;, derivados que contienen el dominio catalítico y así sucesivamente. La molécula que tiene actividad FAPa; puede estar pura o en forma de un extracto celular, tal como célula transformada o transfectada, la cual ha recibido un gen activo para FAPa;. Se pueden utilizar tanto procariotes como eucariotes . Esta última característica de la invención debe considerarse a la luz de las similitudes estructurales observadas a enzimas unidas a membrana. Este tipo de molécula se asocia con ciertas propiedades las cuales no necesitan ser descritas con detalle aquí. Será suficiente decir que la inhibición o potenciación de estas propiedades según se asocia con FAPa; es una característica de esta invención. Por ejemplo, uno puede identificar sustratos o el sustrato para molécula de FAPa!, por medio del uso de células ecombinante per se. Los sustratos se pueden modificar para mejorar su efecto, para disminuir su efecto o simplemente para marcarlos con señales detectables de manera que puedan ser utilizados, 5 por ejemplo, para identificar células las cuales expresan FAPa;. Se puede utilizar el estudio de la interacción del sustrato y FAPa! así como entre FAPa! y cualquier molécula cualquiera que sea, para desarrollar y/o para identificar # agonistas y antagonistas de la molécula FAPa!. 10 Otra característica adicional de la invención son moléculas de FAPa! diméricas y aisladas las cuales tienen un peso molecular de aproximadamente 170 unidades kilodalton, determinado por SDS-PAGE, su uso como un agente de disociación enzimática y otros usos como se describen en la presente. También se pueden producir formas enzimáticamente activas de FAPa! como proteínas de fusión recombinantes, tales como proteínas de fusión solubles que comprenden el dominio catalítico de FAPa! y otros dominios de proteína con propiedades bioquímicas adecuadas que incluyen señales secretoras, sitios de disociación de proteasa, etiquetas o marcas para purificación y otros elementos conocidos por aquéllos familiarizados con la técnica. Son ejemplares las secuencias de péptidos CD8, tales como las descritas supra . El hecho de que FAPa! tenga propiedades particulares, como se describe en la presente, permite la identificación de la molécula en células que las expresan. A su vez, debido a que la molécula de FAPa! está asociada con tumores y células estromales tumorales, el objetivo de FAPa! con agentes terapéuticos sirve como una manera de tratar condiciones cancerosas o precancerosas, al administrar un agente terapéutico suficiente para aliviar la carga de cáncer. Los experimentos muestran las propiedades proteolíticas de FAPa! lo que lleva a un aspecto adicional de la invención. Es bien sabido que las proteasas las cuales degradan la matriz extracelular o proteínas "ECM" tienen un papel importante en ciertos aspectos del crecimiento de tumores, que incluyen su efecto sobre la invasión de células tumorales, la invasión de vasos sanguíneos tumorales (es decir, neoangiogénesis) , y metástasis tumoral . Los colágenos son de especial interés frente a los sustratos de proteasas, pues los colágenos son una parte importante de la ECM. El hecho de que FAPa! digiera a ECM sugiere un papel terapéutico para los inhibidores de la molécula. Como se utiliza en la presente, el término "inhibidores" se refiere a moléculas las cuales interfieren con la función enzimática de FAPa!. Se excluyen específicamente de tales inhibidores al anticuerpo monoclonal F19. Se sabe que este mAb se une, pero no inhibe la función enzimática de FAPa!, y por lo tanto no es un inhibidor. La técnica conoce bien respecto a los anticuerpos monoclonales los cuales unen e inhiben enzimas. Ejemplos adicionales de tales inhibidores pueden incluir, por ejemplo, derivados de sustrato, tales como moléculas modificadas de colágeno, las cuales interfieren con el 5 sitio o sitios activos de la molécula de FAPa;. Otros inhibidores adecuados serán evidentes para aquéllos familiarizados con la técnica, y no necesitan ser incluidos en la presente. Además, las proteínas FAPa; recombinantes y las líneas de células transfectadas con FAPa! descritas supra pueden ser utilizadas en un ensayo de análisis enzimático, utilizando el sustrato descrito supra y otros sustratos adecuados para identificar inhibidores de cualquier biblioteca de compuestos. La identificación de sustancias las cuales interactúen con moléculas activas FAPa! por lo tanto lleva al tratamiento terapéutico de condiciones en donde un sujeto muestra actividad anormal de FAPa!. Específicamente, una cantidad de una sustancia apropiada, sea esta un inhibidor (por ejemplo un derivado de colágeno, ácido S-valil-pirrolidin-2 (R) -borónico) , un agonista o un antagonista se administra a un sujeto en una cantidad suficiente para normalizar la actividad de FAPa!. Otros aspectos de la invención serán evidentes para una persona familiarizada con la técnica y no necesitan establecerse aquí.

* Los términos y expresiones los cuales han sido utilizados se usan como términos de la descripción y no para limitación, y no hay intención en el uso de tales términos y expresiones para excluir algún equivalente de las características mostradas y descritas, o porciones de las mismas, reconociéndose que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención. • (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTES: Zimmermann, Rainer; Park, John E.; Rettig, Wolfgang; Oíd, Lloyd J. (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNA DE ACTIVACIÓN DE FIBROBLASTOS ALFA, DIMÉRICA Y AISLADA, Y USOS DE LA MISMA (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Felfe & Lynch (B) CALLE: 805 Third Avenue (C) CIUDAD: Ciudad de New York (D) ESTADO: New York (E) PAÍS: EUA (F) ZONA POSTAL: 10022 (v) FORMA LEÍBLE DE LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Diskette, 3.5 pulgadas, 2.0 MB de almacenamiento (B) COMPUTADORA: IBM PS/2 (C) SISTEMA OPERANTE PC-DOS (D) SOFTWARE O PROGRAMA: Wordperfect (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUALES: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES: (A) NUMERO DE SOLICITUD: 08/619,280 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 18 DE MARZO DE 1996 (C) CLASIFICACIÓN: 435 5 (vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: 08/230,491 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 DE ABRIL DE 1994 (viii) ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN: (A) NOMBRE: Hanson, Norman D. 10 (B) NÚMERO DE REGISTRO: 30,946 (C) REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: LUD 5330.1-PCT (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELÉFONO: (212) 688-9200 15 (B) TELEFAX: (212) 838-3884 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2815 pares de bases 20 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : 1 : AAGAACGCCC CCAAAATCTG TTTCTAATTT TACAGAAATC TTTTGAAACT TGGCACGGTA 60 TTCAAAAGTC CGTGGAAAGA AAAAAACCTT GTCCTGGCTT CAGCTTCCAA CTACAAAGAC 120 AGACTTGGTC CTTTTCAACG GTTTTCACAG ATCCAGTGAC CCACGCTCTG AAGACAGAAT 180 TAGCTAACTT TCAAAAACAT CTGGAAAAAT GAAGACTTGG GTAAAAATCG TATTTGGAGT 240 TGCCACCTCT GCTGTGCTTG CCTTATTGGT GATGTGCATT GTCTTACGCC CTTCAAGAGT 300 TCATAACTCT GAAGAAAATA CAATGAGAGC ACTCACACTG AAGGATATTT TAAATGGAAC 360 ATTTTCTTAT AAAACATTTT TTCCAAACTG GATTTCAGGA CAAGAATATC TTCATCAATC 420 TGCAGATAAC AATATAGTAC TTTATAATAT TGAAACAGGA CAATCATATA CCATTTTGAG 480 TAATAGAACC ATGAAAAGTG TGAATGCTTC AAATTACGGC TTATCACCTG ATCGGCAATT 540 TGTATATCTA GAAAGTGATT ATTCAAAGCT TTGGAGATAC TCTTACACAG CAACATATTA 600 CATCTATGAC CTTAGCAATG GAGAATTTGT AAGAGGAAAT GAGCTTCCTC GTCCAATTCA 660 GTATTTATGC TGGTCGCCTG TTGGGAGTAA ATTAGCATAT GTCTATCAAA ACAATATCTA 720 TTTGAAACAA AGACCAGGAG ATCCACCTTT TCAAATAACA TTTAATGGAA GAGAAAATAA 780 AATATTTAAT GGAATCCCAG ACTGGGTTTA TGAAGAGGAA ATGCTTCCTA CAAAATATGC 840 TCTCTGGTGG TCTCCTAATG GAAAATTTTT GGCATATGCG GAATTTAATG ATAAGGATAT 900 ACCAGTTATT GCCTATTCCT ATTATGGCGA TGAACAATAT CCTAGAACAA TAAATATTCC 960 ATACCCAAAG GCTGGAGCTA AGAATCCCGT TGTTCGGATA TTTATTATCG ATACCACTTA 1020 CCCTGCGTAT GTAGGTCCCC AGGAAGTGCC TGTTCCAGCA ATGATAGCCT CAAGTGATTA 1080 TTATTTCAGT TGGCTCACGT GGGTTACTGA TGAACGAGTA TGTTTGCAGT GGCTAAAAAG 1140 AGTCCAGAAT GTTTCGGTCC TGTCTATATG TGACTTCAGG GAAGACTGGC AGACATGGGA 1200 TTGTCCAAAG ACCCAGGAGC ATATAGAAGA AAGCAGAACT GGATGGGCTG GTGGATTCTT 1260 TGTTTCAAGA CCAGTTTTCA GCTATGATGC CATTTCGTAC TACAAAATAT TTAGTGACAA 1320 GGATGGCTAC AAACATATTC ACTATATCAA AGACACTGTG GAAAATGCTA TTCAAATTAC 1380 AAGTGGCAAG TGGGAGGCCA TAAATATATT CAGAGTAACA CAGGATTCAC TGTTTTATTC 1440 TAGCAATGAA TTTGAAGAAT ACCCTGGAAG AAGAAACATC TACAGAATTA GCATTGGAAG 1500 CTATCCTCCA AGCAAGAAGT GTGTTACTTG CCATCTAAGG AAAGAAAGGT GCCAATATTA 1560 CACAGCAAGT TTCAGCGACT ACGCCAAGTA CTATGCACTT GTCTGCTACG GCCCAGGCAT 1620 CCCCATTTCC ACCCTTCATG ATGGACGCAC TGATCAAGAA ATTAAAATCC TGGAAGAAAA 1680 CAAGGAATTG GAAAATGCTT TGAAAAATAT CCAGCTGCCT AAAGAGGAAA TTAAGAAACT 1740 TGAAGTAGAT GAAATTACTT TATGGTACAA GATGATTCTT CCTCCTCAAT TTGACAGATC 1800 AAAGAAGTAT CCCTTGCTAA TTCAAGTGTA TGGTGGTCCC TGCAGTCAGA GTGTAAGGTC 1860 5 TGTATTTGCT GTTAATTGGA TATCTTATCT TGCAAGTAAG GAAGGGATGG TCATTGCCTT 1920 GGTGGATGGT CGAGGAACAG CTTTCCAAGG TGACAAACTC CTCTATGCAG TGTATCGAAA 1980 GCTGGGTGTT TATGAAGTTG AAGACCAGAT TACAGCTGTC AGAAAATTCA TA6AAATGGG 2040 TTTCATTGAT GAAAAAAGAA TAGCCATATG GGGCTGGTCC TATGGAGGAT ACGTTTCATC 2100 ACTGGCCCTT GCATCTGGAA CTGGTCTTTT CAAATGTGGT ATAGCAGTGG CTCCAGTCTC 2160 CAGCTGGGAA TATTACGCGT CTGTCTACAC AGAGAGATTC ATGGGTCTCC CAACAAAGGA 2220 TGATAATCTT GAGCACTATA AGAATTCAAC TGTGATGGCA AGAGCAGAAT ATTTCAGAAA 2280 TGTAGACTAT CTTCTCATCC ACGGAACAGC AGATGATAAT GTGCACTTTC AAAACTCAGC 2340 ACAGATTGCT AAAGCTCTGG TTAATGCACA AGTGGATTTC CAGGCAATGT GGTACTCTGA 2400 CCAGAACCAC GGCTTATCCG GCCTGTCCAC GAACCACTTA TACACCCACA TGACCCACTT 2460 CCTAAAGCAG TGTTTCTCTT TGTCAGACTA AAAACGATGC AGATGCAAGC CTGTATCAGA 2520 ATCTGAAAAC CTTATATAAA CCCCTCAGAC AGTTTGCTTA TTTTATTTTT TATGTTGTAA 2580 AATGCTAGTA TAAACAAACA AATTAATGTT GTTCTAAAGG CTGTTAAAAA AAAGATGAGG 2640 ACTCAGAAGT TCAAGCTAAA TATTGTTTAC ATTTTCTGGT ACTCTGTGAA AGAAGAGAAA 2700 AGGGAGTCAT GCATTTTGCT TTGGACACAG TGTTTTATCA CCTGTTCATT TGAAGAAAAA 2760 TAATAAAGTC AGAAGTTCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGCGGCCG CTCGA 2815 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 760 aminoácidos 25 (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGÍA: lineal % (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 2: Met Lys Thr Trp Val Lys lie Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val 5 10 15 5 Leu Ala Leu Leu Val Met Cys lie Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His 20 25 30 Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp lie Leu 35 40 45 10 Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp lie Ser Gly 50 55 60 Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn lie Val Leu Tyr Asn 15 65 70 75 80 lie Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr lie Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys 85 90 95 Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val 100 105 110 Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala 115 120 125 25 Thr Tyr Tyr lie Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn 130 135 140 Glu Leu Pro Arg Pro lie Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser 5 145 150 155 160 tfk Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn lie Tyr Leu Lys Gln Arg Pro 165 170 175 10 Gly Asp Pro Pro Phe Gln lie Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys lie 180 185 190 Phe Asn Gly lie Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Pro Thr 15 195 200 205 Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala 210 215 220 Glu Phe Asn Asp Lys Asp lie Pro Val lie Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly 225 230 235 240 Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr lie Asn lie Pro Tyr Pro Lys Ala Gly 245 250 255 25 Ala Lys Asn Pro Val Val Arg He Phe He He Asp Thr Thr Tyr Pro 260 265 270 Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met He Ala Ser 275 280 285 Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val 290 295 300 Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser He 305 310 315 320 Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln 325 330 335 Glu His He Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val 340 345 350 Ser Arg Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala He Ser Tyr Tyr Lys He Phe 355 360 365 Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His He His Tyr He Lys Asp Thr Val 370 375 380 Glu Asn Ala He Gln He Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala He Asn He 385 390 395 400 Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu 405 410 415 Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn He Tyr Arg He Ser He Gly Ser Tyr 420 425 430 Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys 435 440 445 Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu 450 455 460 Val Cys Tyr Gly Pro Gly He Pro He Ser Thr Leu His Asp Gly Arg 465 470 475 480 Thr Asp Gln Glu He Lys He Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn 485 490 495 Ala Leu Lys Asn He Gln Leu Pro Lys Glu Glu He Lys Lys Leu Glu 500 505 510 Val Asp Glu He Thr Leu Trp Tyr Lys Met He Leu Pro Pro Gln Phe 515 520 525 Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu He Gln Val Tyr Gly Gly Pro 530 535 540 Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp He Ser Tyr 545 550 555 560 Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val He Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly 565 570 575 Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu 580 585 590 Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln He Thr Ala Val Arg Lys Phe He 595 600 605 Glu Met Gly Phe He Asp Glu Lys Arg He Ala He Trp Gly Trp Ser 610 615 620 Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu 625 630 635 640 Phe Lys Cys Gly He Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr 645 650 655 Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp -35--L 660 665 670 Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr ' 675 680 685 5 Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu He His Gly Thr Ala Asp Asp Asn 690 695 700 Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln He Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala 10 705 710 715 720 Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu 725 730 735 Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu 740 745 750 Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (29)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de FAPa! dimérica y aislada, caracterizada porque tiene un peso molecular de aproximadamente 170 unidades kilodalton, determinado por SDS-PAGE, en donde la molécula dimérica de FAPa! es capaz de degradar proteínas de la matriz extracelular. 2. La molécula dimérica de FAPa!, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque cada monómero de la molécula dimérica de FAPa! consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO:

2.

3. La molécula dimérica de FAPa!, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se produce de manera recombinante.

4. La molécula dimérica de FAPa!, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque se produce por una célula eucariótica.

5. Una proteína aislada, caracterizada porque consiste de: (i) el dominio catalítico de FAPa!, y (ii) por lo menos una porción de la proteína diferente a FAPa!.

6. Un método para disociar un dipéptido terminal de fórmula Xaa-Pro de una molécula, caracterizado porque comprende poner en contacto la molécula con una segunda molécula, la segunda molécula tiene actividad enzimática de FAPa!.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la segunda molécula es FAPa! dimérica y aislada.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la segunda molécula comprende un dominio catalítico de FAPa!.

9. Un método para identificar una sustancia la cual interactúa con una molécula que tiene actividad de FAPa!, caracterizado porque comprende combinar la molécula con una muestra que va a ser probada, y determinar cualquier interacción con la molécula como una indicación de una molécula la cual interactúa con una molécula que tiene actividad de FAPa!.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la molécula de FAPa! es dimérica.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la molécula comprende un dominio catalítico de FAPa!.

12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la sustancia es un antagonista de actividad de FAPa!.

13. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la sustancia es un agonista de la actividad de FAPa!.

14. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la sustancia es un inhibidor de la actividad de FAPo;.

15. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende combinar la sustancia con un extracto celular el cual tiene actividad de FAPa!.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el extracto celular es un extracto de una célula la cual ha sido transformada o transfectada con una molécula de ácido nucleico la cual codifica para una molécula con actividad de FAPa;.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la célula es un procariote .

18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la célula es un eucariote.

19. Un método para tratar a un sujeto con una condición patológica definida por un nivel aumentado de actividad de FAPa! en relación a un nivel normal, el incremento de actividad de FAPo! está definido por un incremento en la actividad degradante de la proteína de matriz extracelular, el método está caracterizado porque comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad de una sustancia la cual interactúa con moléculas de FAPa! o moléculas que tienen actividad degradante de proteína de matriz extracelular, suficiente para reducir el nivel de actividad de FAPa! en el sujeto.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19 , caracterizado porque comprende administrar un inhibidor de actividad de FAPa;.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el inhibidor es un derivado de colágeno .

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el inhibidor es ácido (S) -valil-pirrolidin-2 (R) -borónico.

23. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la sustancia es un antagonista de la actividad de FAPa!.

24. Un método para determinar la capacidad de una sustancia para disminuir la actividad de FAPa!, caracterizado porque comprende combinar una molécula que tiene actividad de FAPa!, la molécula tiene actividad de FAPa; y está definida porque tiene actividad degradante de proteína de matriz extracelular, con Ala-Pro-AFC en presencia y ausencia de la sustancia y determinar un nivel de actividad de FAPa;, en donde una disminución en la actividad de FAPa; de la molécula en presencia del sustrato indica que la sustancia disminuye la actividad de FAPa! de la molécula.

25. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende una porción de una molécula de FAPa! suficiente para retener la actividad de FAPa! y una secuencia de aminoácidos diferente a FAPa!, en donde la proteína de fusión es soluble en agua.

26. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos diferente de FAPa! es una secuencia de aminoácidos que se encuentra en una proteína CD8.

27. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la proteína CD8 es una proteína de ratón.

28. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la proteína. CD8 es una proteína humana.

29. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque comprende los aminoácidos 1 a 189 de CD8 de ratón unidos a los aminoácidos 27 a 760 de FAPa!.