ES2332799T3 - Fragmentos de arnt sintetasa. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para purificar un fragmento de ARNt sintetasa, que comprende realizar una etapa de filtración para la reducción de endotoxinas después de realizar una etapa de aclarado y antes de realizar al menos una de las etapas seleccionadas entre: una etapa de intercambio de tampón; una etapa de concentración; y una etapa de cromatografía de intercambio catiónico, en el que dicha etapa de cromatografía de intercambio catiónico comprende el uso de una resina de intercambio catiónico, en el que dicha resina se selecciona entre: CM Sepharose, SP Sepharose y DEAE Sepharose.
Description
Fragmentos de ARNt sintetasa.
La presente solicitud es una continuación en
parte de la Solicitud de Estados Unidos Nº 11/019.969 presentada el
20 de diciembre de 2004, que es una continuación en parte de la
Solicitud de Estados Unidos Nº 10/962.218 presentada el 7 de
octubre de 2004; la presente solicitud también es una continuación
en parte de la Solicitud de Estados Unidos Nº 10/980.866 presentada
el 2 de noviembre de 2004, que es una continuación en parte de la
Solicitud de Estados Unidos Nº 10/961.529 presentada el 7 de octubre
de 2004; la presente solicitud también reivindica la prioridad de
la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/598.019 presentada
el 2 de agosto de 2004 y las Solicitudes de Estados Unidos Nº
10/962.171, 10/962.217, 10/962.058, 10/961.528, 10/962.375,
10/962.062, 10/962.218, 10/961.529, 10/961.526 y 10/961.486, todas
las cuales se presentaron el 7 de octubre de 2004.
El crecimiento tisular normal, que se produce
durante el desarrollo embrionario, la curación de las heridas y el
ciclo menstrual se caracteriza por la dependencia de la formación de
nuevos vasos sanguíneos para el suministro de oxígeno y nutrientes,
así como la eliminación de los productos de desecho. La angiogénesis
es el nombre que se da al desarrollo de nuevos capilares a partir
de vasos sanguíneos preexistentes. El alcance de la angiogénesis
está determinado por el equilibrio entre los factores
proangiogénicos y los factores anti-angiogénicos.
Los factores proangiogénicos incluyen, aunque sin limitación, el
factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), el factor de
crecimiento de fibroblastos (FGF), interleuquina-8
(IL-8), angiogenina, angiotropina, factor de
crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de células
endoteliales derivado de plaquetas, factor de crecimiento
transformante \alpha (TGF-\alpha), factor de
crecimiento transformante \beta (TGF-\beta) y
óxido nítrico. Los factores anti-angiogénicos
incluyen, aunque sin limitación, trombospondina, angiostatina y
endostatina.
Aunque en la mayoría de los tejidos normales el
equilibrio favorece a los factores anti-angiogénicos
y está inhibida la angiogénesis, muchas afecciones pueden
manifestarse después de un cambio a un fenotipo estimulante de
angiogénesis. Tales afecciones angiogénicas incluyen, aunque sin
limitación, degeneración macular relacionada con la edad (AMD),
cáncer (tanto sólido como hematológico), anormalidades del
desarrollo (organogénesis), ceguera diabética, endometriosis,
neovascularización ocular, psoriasis, artritis reumatoide (AR),
decoloraciones de la piel (por ejemplo, hemangioma, nevus flammeus
o nevus simplex) y curación de las heridas.
Es deseable identificar composiciones y
procedimientos que modulen o inhiban la angiogénesis.
La presente invención se refiere a
procedimientos para purificar agentes terapéuticos, es decir,
Fragmentos de ARNt Sintetasa de modo que estén sustancialmente
libres de endotoxinas. También se presentan en el presente
documento preparaciones adecuadas para administración terapéutica
que comprenden un agente farmacéutico, en las que las preparaciones
están sustancialmente libres de endotoxinas. Tales preparaciones se
pueden usar en una diversidad de aplicaciones terapéuticas,
incluyendo, aunque sin limitación, aplicaciones en la terapia de
cánceres, aplicaciones en la terapia de trastornos neovasculares,
aplicaciones en la inhibición de la angiogénesis y aplicaciones en
la terapia de afecciones oftálmicas.
En una realización, la presente invención se
refiere a preparaciones farmacéuticas adecuadas para la
administración a un ser humano que comprenden un agente
farmacéutico y un vehículo farmacéuticamente aceptable donde la
cantidad de endotoxinas en la preparación farmacéutica es menos de
aproximadamente 10 unidades de endotoxina por miligramo de agente
farmacéutico. En una realización, el agente farmacéutico es un
polipéptido.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a preparaciones farmacéuticas adecuadas para la
administración a un ser humano que comprenden un polipéptido y un
vehículo farmacéuticamente aceptable en las que la cantidad de
endotoxina en la preparación farmacéutica es menos de
aproximadamente 10 unidades de endotoxina por miligramo de
polipéptido.
En otro aspecto, la presente descripción se
refiere a preparaciones farmacéuticas adecuadas para uso en terapia
oncológica o administración oftálmica en un ser humano que
comprenden un polipéptido y un vehículo farmacéuticamente aceptable
donde la cantidad de endotoxinas en la preparación farmacéutica es
menos de aproximadamente 10 unidades de endotoxina por miligramo de
polipéptido.
En uno cualquiera de los aspectos mencionados
anteriormente, el polipéptido se sintetiza de forma recombinante.
En otro de estos aspectos el polipéptido se produce en y se recupera
de una célula procariota transformada o su progenie. En otro
aspecto, el polipéptido se produce en y se recupera de una célula
eucariota transformada o su progenie. En otro aspecto, el
polipéptido se produce en y se recupera del citoplasma de la célula
eucariota transformada o su progenie. En otro aspecto, el
polipéptido puede modular la angiogénesis. En otro aspecto, el
polipéptido se puede usar para tratar degeneración macular,
retinopatía diabética u otras enfermedades o afecciones asociadas
con neovascularización ocular no deseada. En otro aspecto, el
polipéptido tiene un punto isoeléctrico de menos de aproximadamente
8,0. En otro aspecto, el polipéptido tiene un punto isoeléctrico
entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 8,0. En otro aspecto, el
polipéptido tiene un punto isoeléctrico entre aproximadamente 6,0 y
aproximadamente 7,5. En otro aspecto, el polipéptido comprende una
hendidura hidrófoba y en un perfeccionamiento adicional de este
aspecto, el polipéptido tiene también un punto isoeléctrico de
menos de aproximadamente 8,0.
El polipéptido es preferiblemente parte de una
triptófano ARNt sintetasa. En uno cualquiera de los aspectos
mencionados anteriormente, la preparación comprende un
T2-TrpRS o un homólogo del mismo.
En una realización, la presente invención se
refiere a procedimientos para purificar cualquiera de los
polipéptidos o agentes farmacéuticos mencionados anteriormente, que
comprenden realizar una etapa de filtración para la reducción de
endotoxinas después de realizar una etapa de aclarado y antes de
realizar una etapa de intercambio de tampón. Además, la etapa de
filtración para la reducción de endotoxinas se puede realizar antes
de realizar una etapa de cromatografía de intercambio catiónico.
Como alternativa, la etapa de filtración para la reducción de
endotoxinas se puede realizar antes de realizar una etapa de
concentración.
En otra realización, la presente invención se
refiere a procedimientos para purificar cualquiera de los
polipéptidos o agentes farmacéuticos mencionados anteriormente, que
comprenden realizar una etapa de filtración para la reducción de
endotoxinas después de realizar una etapa de aclarado y antes de
realizar una etapa de concentración. Además, la etapa de filtración
para la reducción de endotoxinas se puede realizar antes de realizar
una etapa de cromatografía de intercambio catiónico. Como
alternativa, la etapa de filtración para la reducción de endotoxinas
se puede realizar antes de realizar una etapa de intercambio de
tampón.
En otra realización, la presente invención se
refiere a procedimientos para purificar cualquiera de los
polipéptidos o agentes farmacéuticos mencionados anteriormente, que
comprenden realizar una etapa de filtración para la reducción de
endotoxinas después de realizar una etapa de aclarado y antes de
realizar una etapa de cromatografía de intercambio catiónico. Como
alternativa, la etapa de filtración para la reducción de endotoxinas
se puede realizar antes de realizar una etapa de concentración.
Como alternativa, la etapa de filtración para la reducción de
endotoxinas se puede realizar antes de realizar una etapa de
intercambio de tampón.
En otra realización, la presente invención se
refiere a procedimientos para purificar cualquiera de los
polipéptidos o agentes farmacéuticos mencionados anteriormente en
los que se realiza una etapa de filtración para la reducción de
endotoxinas antes de realizar una etapa de concentración y antes de
realizar una etapa de cromatografía de intercambio catiónico y
antes de una etapa de intercambio de tampón.
El orden de las etapas de concentración,
intercambio de tampón y cromatografía de intercambio catiónico en
cualquiera de los procedimientos de purificación mencionados
anteriormente puede variar, pero en una realización, se realiza al
menos una etapa de concentración antes de la etapa de intercambio de
tampón. Como alternativa, se realiza una etapa de cromatografía de
intercambio catiónico después de la etapa de intercambio de tampón.
Como alternativa, se realiza al menos una etapa de concentración
antes de la etapa de cromatografía de intercambio catiónico. Como
alternativa, la etapa de cromatografía de intercambio catiónico se
realiza después de una etapa de intercambio de tampón y al menos
una etapa de concentración. Como alternativa, se realiza al menos
una etapa de concentración antes de la etapa de intercambio de
tampón y la etapa de cromatografía de intercambio catiónico. Y como
alternativa, se realiza una etapa de concentración adicional después
de cualquier etapa de intercambio de tampón.
En una realización adicional de cualquiera de
los procedimientos de purificación mencionados anteriormente, la
etapa de filtración para la reducción de endotoxinas se realiza
después de una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. La
etapa de cromatografía de intercambio aniónico comprende el uso de
una resina de intercambio aniónico. La resina de intercambio
aniónico se selecciona entre el grupo constituido por Q Sepharose,
DEAE Sepharose y ANX Sepharose. En otra realización más, la resina
de intercambio aniónico es Q Sepharose. En cualquiera de estos usos
de resinas de intercambio aniónico, se puede usar una diversidad de
calidades y tamaños, incluyendo, aunque sin limitación calidad
Source, calidad de flujo rápido y calidad de alto rendimiento.
En una realización de cualquiera de los
procedimientos de purificación mencionados anteriormente que
implican una etapa de cromatografía de intercambio catiónico, la
etapa de cromatografía de intercambio catiónico comprende el uso de
una resina de intercambio catiónico. La resina de intercambio
catiónico se selecciona entre el grupo constituido por CM
Sepharose, SP Sepharose, DEAE Sepharose. En otra realización más, la
resina de intercambio catiónico es CM Sepharose. En cualquiera de
estos usos de resinas de intercambio catiónico, se puede usar una
diversidad de calidades y tamaños, incluyendo, aunque sin limitación
calidad Source, calidad de flujo rápido y calidad de alto
rendimiento.
En otra realización, la presente invención se
refiere a procedimientos para purificar un polipéptido adecuado
para la administración a un paciente que comprenden una etapa de
cromatografía de intercambio aniónico, una etapa que comprende un
medio para reducir las endotoxinas y una etapa de intercambio de
tampón, en los que la etapa que comprende un medio para reducir las
endotoxinas se realiza antes de la etapa de intercambio de tampón.
En una realización adicional, el polipéptido adecuado para la
administración a un paciente es adecuado para administración
oftálmica. En otra realización adicional, el polipéptido adecuado
para administración oftálmica es un modulador de la angiogénesis.
En otra realización adicional más, el polipéptido adecuado para
administración oftálmica se puede usar para tratar la degeneración
macular, retinopatía diabética o enfermedades o afecciones
asociadas con neovascularización ocular no deseada. En un
perfeccionamiento adicional de cualquiera de las realizaciones
indicadas en este párrafo, el polipéptido está sustancialmente libre
de endotoxinas.
La presente invención proporciona preparaciones
de polipéptido para uso en administración oftálmica que comprenden
el polipéptido purificado preparado mediante un procedimiento que
comprende una etapa de cromatografía de intercambio aniónico, una
etapa que comprende un medio para reducir las endotoxinas y una
etapa de intercambio de tampón, en los que la etapa que comprende
un medio para reducir las endotoxinas se realiza antes de la etapa
de intercambio de tampón. La preparación del polipéptido puede
comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. El
polipéptido es parte de una ARNt sintetasa. El polipéptido puede ser
parte de una triptofanil-ARNt sintetasa. En otra
posibilidad adicional, el polipéptido es un T2-TrpRS
o un homólogo del mismo. En las preparaciones de polipéptido
mencionadas en este párrafo, la concentración de endotoxinas en la
preparación de polipéptido puede ser menos de aproximadamente 10
unidades de endotoxina por miligramo de polipéptido.
La presente invención proporciona composiciones
de polipéptido que comprenden un polipéptido, en las que el
polipéptido es parte de una ARNt sintetasa, donde la composición de
polipéptido está sustancialmente libre de endotoxinas. El
polipéptido puede ser parte de una triptofanil-ARNt
sintetasa. Un aspecto alternativo, son composiciones de polipéptido
que comprenden un polipéptido, donde el polipéptido es todo o parte
de un T2-TrpRS o un homólogo del mismo, donde la
composición de polipéptido está sustancialmente libre de
endotoxinas. En otro de los aspectos mencionados en este párrafo,
la composición de polipéptido comprende además un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
En otra realización, la presente invención se
refiere a procedimientos para preparar las composiciones de
polipéptido mencionadas en el párrafo anterior, que comprenden
realizar una etapa de concentración sobre fracciones de polipéptido
refinadas recogidas, donde las fracciones de polipéptido refinadas
recogidas están sustancialmente libres de endotoxinas. En una
realización adicional existen procedimientos para preparar las
fracciones de polipéptido refinadas recogidas de la realización
previa que comprenden realizar una etapa de cromatografía de
intercambio catiónico sobre una muestra de polipéptido sin refinar
produciendo de este modo las fracciones de polipéptido refinadas
recogidas de la realización previa, donde la muestra de polipéptido
sin refinar está sustancialmente libre de endotoxinas. En
realizaciones adicionales existen procedimientos para producir la
muestra de polipéptido sin refinar de la realización previa, que
comprenden realizar una etapa de intercambio de tampón, sobre una
muestra de polipéptido en un tampón de intercambio
post-aniónico produciendo de este modo la muestra
de polipéptido sin refinar de la realización previa, donde la
muestra de polipéptido en el tampón de intercambio
post-aniónico está sustancialmente libre de
endotoxinas. En realizaciones adicionales existen procedimientos
para producir la muestra de polipéptido en el tampón de intercambio
post-aniónico de la realización previa que
comprenden realizar una etapa de concentración sobre las fracciones
de polipéptido recogidas a partir de una columna de intercambio
aniónico antes de la etapa de intercambio de tampón, produciendo de
este modo la muestra de polipéptido en el tampón de intercambio
post-aniónico de la realización previa, en el que
las fracciones de polipéptido recogidas a partir de una columna de
intercambio aniónico están sustancialmente libres de endotoxinas.
En realizaciones adicionales existen procedimientos para producir
las fracciones de polipéptido recogidas a partir de una columna de
intercambio aniónico de la realización previa que comprenden
realizar una etapa de filtración para la reducción de endotoxinas
antes de la etapa de concentración de la realización previa. En una
realización adicional existen procedimientos que comprenden realizar
una etapa de cromatografía de intercambio aniónico antes de la
etapa de filtración para la reducción de endotoxinas.
En el presente documento se desvelan
procedimientos para tratar a un paciente que tiene una enfermedad o
afección oftálmica que comprenden administrar una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido, en la que el nivel de
endotoxinas en la cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido
es menos de aproximadamente 10 unidades de endotoxina por miligramo
de polipéptido. En un tratamiento, la enfermedad o afección
oftálmica está asociada con neovascularización ocular no deseada.
El polipéptido se puede aislar de una célula procariota
transformada o progenie de la misma. El aislamiento puede comprender
una etapa de filtración para la reducción de endotoxinas antes de
una etapa de refinado. En otra realización más, el aislamiento
comprende además una etapa de aclarado antes de la etapa de
filtración para la reducción de endotoxinas. En otra realización
adicional, el aislamiento comprende además una etapa de
concentración después de la etapa de refinado. En otra realización
más, el aislamiento comprende además una etapa de intercambio de
tampón, después de la etapa de filtración para la reducción de
endotoxinas.
La presente invención también proporciona una
composición que comprende un complejo multi-unidad
de un fragmento de ARNt sintetasa. Preferiblemente, el complejo
multi-unidad del fragmento de ARNt sintetasa está
aislado y/o es soluble. Los ejemplos de complejos
multi-unidad incluyen dímeros (incluyendo
homodímeros), trímeros, etc. Un complejo
multi-unidad de la presente invención puede incluir
un primer monómero y un segundo monómero, donde el primer y segundo
monómeros están unidos covalentemente o asociados de forma no
covalente.
Un fragmento de ARNt sintetasa de la presente
invención puede ser, por ejemplo, un fragmento de triptofanil ARNt
sintetasa, un fragmento de ARNt sintetasa humana o cualquier
fragmento angiostático de un fragmento de ARNt sintetasa. En
algunas realizaciones, el fragmento de ARNt sintetasa se selecciona
entre el grupo constituido por las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y cualquier homólogo y análogo de las
mismas.
La presente invención también proporciona una
composición que comprende un primer fragmento de ARNt sintetasa y
un segundo fragmento de ARNt sintetasa, en el que el primer
fragmento de triptofanil ARNt sintetasa tiene una metionina en su
extremo N y el segundo triptofanil ARNt sintetasa no tiene una
metionina en su extremo N.
Más del 50% de la composición puede comprender
el primer fragmento de ARNt sintetasa. Más del 50% de la composición
puede comprender el segundo fragmento de ARNt sintetasa.
El primer y/o segundo fragmentos de ARNt
sintetasa pueden ser fragmentos de triptofanil ARNt sintetasa,
fragmentos de triptofanil ARNt sintetasa humana o cualquier
fragmento angiostático de una ARNt sintetasa. Los ejemplos de
fragmentos angiostáticos de una ARNt sintetasa incluyen, aunque sin
limitación, el polipéptido de las SEC ID Nº: 15-17,
27-29, 39-41, 51-53
y cualquier homólogo o análogo de las mismas.
En algunas realizaciones, una composición de
este documento tiene un pI de aproximadamente
7,4-7,8. En realizaciones más preferidas, una
composición de este documento tiene un pI de aproximadamente
7,6.
Las composiciones de este documento pueden
incluir también un agente terapéutico. Un agente terapéutico de la
presente invención se puede seleccionar entre el grupo constituido
por un agente anti-neoplásico, un agente
anti-inflamatorio, un agente antibacteriano, un
agente antiviral y un agente anti-angiogénico.
Cualquiera de los complejos
multi-unidad de la presente invención se puede
formular en una formulación farmacéutica que comprende un complejo
multi-unidad y un excipiente farmacéuticamente
aceptable. La formulación también puede incluir un segundo agente
terapéutico seleccionado entre el grupo constituido por: un agente
anti-neoplásico, un agente
anti-inflamatorio, un agente antibacteriano, un
agente angiogénico, un agente antiviral y un agente
anti-angiogénico. Para administración ocular, una
formulación farmacéutica no incluye un conservante. En realizaciones
preferidas, una formulación farmacéutica es una solución.
Cualquiera de las composiciones (incluyendo
formulaciones farmacéuticas) de este documento puede liofilizarse.
Las composiciones (incluyendo formulaciones farmacéuticas) de este
documento se pueden usar para inhibir la angiogénesis en una célula
poniendo en contacto una célula con una composición de la presente
invención. Las composiciones de este documento se pueden usar
también para tratar a un individuo que padece una afección
angiogénica administrando al individuo una formulación farmacéutica
de la presente invención.
La presente invención también proporciona
formulaciones farmacéuticas que comprenden un primer fragmento de
ARNt sintetasa y un segundo fragmento de ARNt sintetasa, en las que
dicho primer y segundo fragmentos de ARNt sintetasa están
dimerizados de forma no covalente y no incluyen una secuencia
marcadora, tal como una marca hexa-histidina. Tales
formulaciones farmacéuticas pueden tener un primer fragmento de ARNt
sintetasa que tiene una metionina en su extremo N y una segunda
ARNt sintetasa que no incluye una metionina en su extremo N.
El primer y segundo fragmentos de ARNt sintetasa
de tales formulaciones farmacéuticas pueden ser fragmentos de
triptofanil ARNt sintetasa. Opcionalmente, el primer fragmento de
ARNt sintetasa se selecciona entre el grupo constituido por las SEC
ID Nº: 15-17, 27-29,
39-41, 51-53, homólogos y análogos
de las mismas. Opcionalmente, el segundo fragmento de ARNt
sintetasa se selecciona entre el grupo constituido por las SEC ID
Nº: 12-14, 24-26,
36-38, 48-50, homólogos y análogos
de las mismas. Opcionalmente, el primer fragmento de ARNt sintetasa
es SEC ID Nº: 15 o un homólogo o análogo de la misma y/o el segundo
fragmento de ARNt sintetasa es SEC ID Nº: 12 o un homólogo o
análogo de la misma. Opcionalmente, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es SEC ID Nº: 27 o un homólogo o análogo de la misma y/o
el segundo fragmento de ARNt sintetasa es SEC ID Nº: 24 o un
homólogo o análogo de la misma.
En cualquiera de las formulaciones farmacéuticas
de este documento, el primer fragmento de ARNt sintetasa puede ser
menos de aproximadamente el 5% en peso de la cantidad total del
primer y segundo fragmentos de ARNt sintetasa. En algunas de las
formulaciones farmacéuticas de este documento, el segundo fragmento
de ARNt sintetasa es al menos aproximadamente el 5% en peso de la
cantidad total del primer y segundo fragmentos de ARNt sintetasa.
En algunos casos, una formulación farmacéutica tiene un primer
fragmento de ARNt sintetasa que es aproximadamente el 50% en peso
de la cantidad total del primer y segundo fragmentos de ARNt
sintetasa y un segundo fragmento de ARNt sintetasa que es
aproximadamente el 50% en peso de la cantidad total del primer y
segundo fragmentos de ARNt sintetasa.
En cualquiera de las formulaciones farmacéuticas
de este documento la concentración de endotoxinas puede ser menos
de una unidad de endotoxina por miligramo de fragmentos de ARNt
sintetasa. Además, las formulaciones farmacéuticas de este
documento preferiblemente están sustancialmente libres o
completamente libres de detergentes y/o conservantes.
La presente invención también proporciona un kit
que incluye un recipiente que contiene cualquiera de las
formulaciones farmacéuticas de este documento y un conjunto de
instrucciones para modular la angiogénesis. Tales kits también
pueden incluir una o más jeringas precargadas en los que cada
jeringa incluye una dosis única de tal formulación
farmacéutica.
La invención también proporciona procedimientos
para modular la angiogénesis en una célula o un organismo. Tales
procedimientos incluyen poner en contacto una célula u organismo con
una formulación farmacéutica de la invención. Preferiblemente dicha
angiogénesis es angiogénesis ocular o neovascularización ocular.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para tratar a un paciente que padece una afección que
comprende administrar a dicho paciente una formulación farmacéutica
descrita en este documento. Preferiblemente tal afección implica
angiogénesis ocular o neovascularización ocular. El tratamiento o
prevención puede implicar administrar las formulaciones
farmacéuticas de este documento de forma local, (por ejemplo, al
ojo).
También se describe una secuencia
polinucleotídica que codifica un primer fragmento de ARNt sintetasa
y un segundo fragmento de ARNt sintetasa. Opcionalmente, al menos
uno de tales fragmentos de ARNt sintetasa es un fragmento de
triptofanil ARNt sintetasa. Opcionalmente, ambos de tales fragmentos
de ARNt sintetasa son fragmentos de triptofanil ARNt sintetasa. Los
fragmentos de triptofanil ARNt sintetasa pueden ser de mamífero o
de ser humano y pueden tener actividad angiostática. Opcionalmente,
un primer fragmento de ARNt sintetasa y/o un segundo fragmento de
ARNt sintetasa se seleccionan entre el grupo constituido por las SEC
ID Nº: 12-17, 24-29,
36-41, 48-53 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas. Una secuencia polinucleotídica puede
codificar un primer y segundo fragmentos de ARNt sintetasa en
tándem. Tales secuencias polinucleotídicas también codifican un
engarce. Una secuencia polinucleotídica que codifica un engarce
puede situarse entre las secuencias polinucleotídicas que codifican
el primer y segundo fragmentos de ARNt sintetasa. Un engarce es lo
suficientemente largo como para permitir que el primer y segundo
fragmentos de ARNt sintetasa expresados giren libremente y formen
dímeros entre sí. El engarce y el primer y segundo fragmentos de
ARNt sintetasa están preferiblemente en el mismo marco de lectura
abierta.
Opcionalmente, la secuencia polinucleotídica que
codifica al menos dos fragmentos de ARNt sintetasa también codifica
una secuencia líder. Un líder puede ser un anticuerpo o fragmento de
anticuerpo que localiza el polipéptido en una región particular. La
secuencia polinucleotídica también puede codificar una prosecuencia.
Una prosecuencia puede escindirse una vez que los polipéptidos de
ARNt sintetasa codificados alcanzan una posición deseada (por
ejemplo, el humor vítreo de un ojo).
Preferiblemente, el fragmento de ARNt sintetasa
se selecciona entre el grupo constituido por las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y cualquier homólogo o análogo de las mismas.
Tales polipéptidos pueden estar codificados, por ejemplo, por las
SEC ID Nº: 18-23, 30-35,
42-47, 54-59 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas.
También se describe un vector de expresión que
comprende una secuencia polinucleotídica descrita en este documento,
así como una célula huésped que comprende tal vector de
expresión.
La presente invención también proporciona un
liposoma dirigido que comprende un vector de expresión como se ha
descrito.
Los vectores de expresión de este documento
pueden ser útiles para preparar un complejo
multi-unidad. Por tanto, se describe un
procedimiento para crear un complejo multi-unidad,
en el que el procedimiento incluye las etapas de: proporcionar un
vector de expresión descrito en este documento; transfectar una
célula huésped con dicho vector de expresión; y mantener dicha
célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión.
También se describen anticuerpos que se unen de
forma específica a una ARNt sintetasa o a un fragmento, homólogo o
análogo de la misma. Por ejemplo, un anticuerpo se puede unir a un
epítope de una ARNt sintetasa o un fragmento, homólogo o análogo de
la misma. La ARNt sintetasa (o fragmento de la misma) puede ser una
triptofanil ARNt sintetasa, una ARNt sintetasa humana o cualquier
fragmento angiostático de una ARNt sintetasa. Preferiblemente, el
anticuerpo se une de forma específica a un polipéptido seleccionado
entre el grupo constituido por las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y cualquier homólogo y análogo de las mismas.
Un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo
monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo
anti-idiotípico o un fragmento de anticuerpo.
El anticuerpo se puede unir a un polipéptido que
lleve el epítope, en el que el polipéptido que lleva el epítope
comprende de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 aminoácidos de
una ARNt sintetasa (o un fragmento, homólogo o análogo de la
misma). Tales polipéptidos que llevan epítopes, o epítopes, son
preferiblemente epítopes de extremo N o incluyen el extremo N de la
ARNt sintetasa (o un fragmento, homólogo o análogo de la misma).
Un polipéptido que lleva un epítope puede
incluir al menos 5 secuencias de aminoácidos de un fragmento de una
ARNt sintetasa. El fragmento de la ARNt sintetasa puede ser un
fragmento de una triptofanil ARNt sintetasa, un fragmento humano de
triptofanil ARNt sintetasa, o cualquier fragmento angiogénico de
ARNt sinteasa.
Los ejemplos de polipéptidos que llevan un
epítope incluyen polipéptidos que comprenden o como alternativa
están constituidos por: restos de aminoácidos de aproximadamente 1 a
aproximadamente 5, aproximadamente 1 a aproximadamente 15 o
aproximadamente 1 a aproximadamente 25 de las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y cualquier homólogo y análogo de las mismas;
los restos de aminoácidos desde aproximadamente 10 a aproximadamente
15, aproximadamente 10 a aproximadamente 25 o aproximadamente 10 a
aproximadamente 35 de las SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41, 48-53
y cualquier homólogo y análogo de las mismas; restos de aminoácidos
desde aproximadamente 20 a aproximadamente 25, aproximadamente 20 a
aproximadamente 35 o aproximadamente 20 a aproximadamente 45 de las
SEC ID Nº: 12-17, 24-29,
36-41, 48-53 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas.
También se describe una secuencia
polinucleotídica que codifica uno o más de los polipéptidos que
llevan un epítope de este documento.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe una composición que
comprende un fragmento aislado de ARNt sintetasa, en que el
fragmento de ARNt sintetasa, comprende, está constituido
esencialmente por o está constituido por una secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 12, 15, 24, 27, 36, 39, 48 ó 51.
Preferiblemente, dicho fragmento de ARNt sintetasa es de menos de
45 kD, más preferiblemente menos de 44 kD, menos de 43,9 kD, 43,8
kD, 43,7 kD, 43,6 kD o más preferiblemente menos de 43,5 kD.
Preferiblemente tal fragmento de ARNt sintetasa es
anti-angiogénico.
Opcionalmente, una composición que comprende un
fragmento de ARNt sintetasa aislado, en la que el fragmento de ARNt
sintetasa comprende, está constituido esencialmente por o está
constituido por la SEC ID Nº: 13, 16, 25, 28, 37, 40, 49 ó 52.
Preferiblemente, tal fragmento de ARNt sintetasa es de menos de 48
kD, más preferiblemente menos de 47 kD o más preferiblemente menos
de 46 kD. Preferiblemente tal fragmento de ARNt sintetasa es
anti-angiogénico.
Opcionalmente, la presente invención proporciona
una composición que comprende un fragmento de ARNt sintetasa
aislado, en la que el fragmento de ARNt sintetasa comprende, está
constituido esencialmente por o está constituido por la SEC ID Nº:
14, 17, 26, 29, 38, 41, 50 ó 53. Preferiblemente, tal fragmento de
ARNt sintetasa es de menos de 53 kD, más preferiblemente menos de
52 kD, más preferiblemente menos de 51 kD, más preferiblemente
menos de 50 kD o más preferiblemente menos de 49 kD. Preferiblemente
tal fragmento de ARNt sintetasa es
anti-angiogénico.
Opcionalmente, un fragmento de ARNt sintetasa
está aislado. Opcionalmente, un fragmento de ARNt sintetasa está
purificado. Tal etapa de purificación puede reducir la cantidad de
una endotoxina en una composición farmacéutica. La cantidad de
endotoxina en una composición es preferiblemente de menos de 30, 20,
10 o más preferiblemente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1
endounidades.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona
procedimientos para tratar a un individuo que padece una afección
angiogénica. Los procedimientos incluyen la etapa de administrar a
un individuo de este tipo una formulación farmacéutica que
comprende un complejo multi-unidad de un fragmento
de ARNt sintetasa o un homólogo o análogo del mismo.
Los ejemplos de afecciones angiogénicas que
pueden tratarse mediante la presente invención incluyen, aunque sin
limitación, degeneración macular relacionada con la edad, cáncer,
anormalidades en el desarrollo, ceguera diabética, endometriosis,
neovascularización ocular, psoriasis, artritis reumatoide (AR),
decoloraciones de la piel, tales como himengioma y curación de las
heridas.
El fragmento de ARNt sintetasa usado en el
procedimiento puede ser un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa
o un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa humana o cualquier
fragmento angiostático de la misma. Los ejemplos de fragmentos
contemplados incluyen, aunque sin limitación, los de las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y cualquier homólogo y análogo de las
mismas.
Opcionalmente, el complejo
multi-unidad es un dímero o un homodímero. Cuando un
complejo multi-unidad es un dímero, el dímero puede
incluir un primer monómero y un segundo monómero, en el que el
primer monómero y el segundo monómero son diferentes, homólogos,
sustancialmente homólogos o idénticos. El primer y segundo monómeros
y el complejo multi-unidad contemplados en este
documento pueden estar unidos covalentemente o unidos de forma no
covalente.
Opcionalmente, a un individuo que padece y/o es
susceptible a angiogénesis se le puede administrar o
co-administrar adicionalmente un agente terapéutico
seleccionado entre el grupo constituido por: un agente
anti-neoplásico, un agente
anti-inflamatorio, un agente antibacteriano, un
agente antiviral y un agente anti-angiogénico.
Las formulaciones farmacéuticas usadas se pueden
administrar sistémica o localmente. Para administración sistémica,
las formulaciones farmacéuticas de este documento se pueden
administrar a una dosis de 0,1-100 mg/kg. Para
administración tópica, las formulaciones farmacéuticas de este
documento se pueden administrar a una dosis de
50-1000 \mug/cm^{2}. En particular, para
administración intraocular, las formulaciones farmacéuticas de este
documento se pueden administrar a una dosis de
50-1000 \mug/ojo. Cuando se administran al ojo,
las formulaciones farmacéuticas preferiblemente no incluyen un
conservante y se envasan en dosificaciones unitarias únicas.
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La presente invención también proporciona
procedimientos para seleccionar un agente angiostático donde los
procedimientos incluyen las etapas de poner en contacto un receptor
de un fragmento de ARNt sintetasa con un miembro de una biblioteca
de agentes candidatos y seleccionar un agente candidato de la
biblioteca que se una de forma selectiva al receptor. Los agentes
candidatos de una biblioteca (dos o más agentes) pueden ser, por
ejemplo, polipéptidos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos
peptídicos, ácidos nucleicos, carbohidratos y moléculas pequeñas o
grandes, orgánicas o inorgánicas.
Opcionalmente, los procedimientos anteriores
para seleccionar incluyen adicionalmente la etapa de evaluar la
capacidad de un agente candidato de inhibir la angiogénesis. La
evaluación puede incluir la etapa de administrar el agente
candidato a la retina de un mamífero y visualizar la
neovascularización de dicha retina.
Los ejemplos de fragmentos de ARNt sintetasa
usados en el procedimiento de selección incluyen fragmentos de
triptofanil ARNt sintetasa, fragmentos de triptofanil ARNt sintetasa
humana y otros fragmentos angiostáticos de una ARNt sintetasa.
La presente invención proporciona procedimientos
para obtener un ligando optimizado para un receptor de un fragmento
de ARNt sintetasa. Tales procedimientos incluyen las etapas de
obtener una estructura de rayos X de dicho receptor con dicho
fragmento; usar un programa informático para analizar el punto de
contacto entre el receptor y el fragmento de ARNt sintetasa; y
modificar el fragmento de ARNt sintetasa para aumentar su afinidad
por el receptor. Los ejemplos de programas informáticos que se
pueden usar en estas realizaciones incluyen, aunque sin limitación,
GRID, MCSS, AUTODOCK, DOCK, AMBER, QUANTA e INSIGHT II.
El fragmento de ARNt sintetasa usado en los
procedimientos para obtener un ligando optimizado puede ser un
fragmento de triptofanil ARNt sintetasa, un fragmento de triptofanil
ARNt sintetasa humana o cualquier fragmento angiostático de una
ARNt sintetasa. Tales fragmentos se pueden seleccionar entre el
grupo constituido por las SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41, 48-53
y cualquier homólogo o análogo de las mismas
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona
procedimientos para modular la angiogénesis. Tales procedimientos
comprenden la etapa de poner en contacto una célula o tejido
susceptible de experimentar angiogénesis con un complejo
multi-unidad que comprende un fragmento de ARNt
sintetasa o un homólogo o análogo del mismo.
Un fragmento de ARNt sintetasa puede ser, por
ejemplo, un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa, un fragmento
de ARNt sintetasa humana o cualquier fragmento angiostático de una
ARNt sintetasa. Los ejemplos de fragmentos de ARNt sintetasa
incluyen los seleccionados entre el grupo constituido por las SEC ID
Nº: 12-17, 24-29,
36-41, 48-53 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas.
Un complejo multi-unidad puede
ser soluble y/o estar aislado. Un complejo
multi-unidad puede incluir dos o más monómeros. En
algunos ejemplos, un complejo multi-unidad es un
dímero o un homodímero. Dos o más unidades de monómero de un
complejo multi-unidad pueden estar unidas de forma
covalente o asociadas de forma no cova-
lente.
lente.
Opcionalmente, un complejo
multi-unidad puede tener un primer monómero y un
segundo monómero, donde dicho primer monómero comprende un
fragmento de ARNt sintetasa que tiene una metionina en su extremo N
y donde dicho segundo monómero comprende un fragmento de ARNt
sintetasa que no tiene una metionina en su extremo N. Tales
composiciones pueden tener un valor de pI de aproximadamente
7,4-7,8.
Los ejemplos de un primer monómero incluyen los
seleccionados entre el grupo constituido por las SEC ID Nº:
15-17, 27-29, 39-41,
51-53 y cualquier homólogo o análogo de las
mismas.
Los ejemplos de un segundo monómero incluyen los
seleccionados entre el grupo constituido por las SEC ID Nº:
12-14, 24-26, 36-38,
48-50 y cualquier homólogo o análogo de las
mismas.
Opcionalmente, un complejo
multi-unidad comprende un primer monómero y un
segundo monómero, en el que dicho primer monómero comprende un
fragmento de ARNt sintetasa modificado para incluir al menos una
cisteína de origen no natural en su dominio de dimerización y dicho
segundo monómero comprende un fragmento de ARNt sintetasa
modificado para incluir al menos una cisteína de origen no natural
en su dominio de dimerización.
Tales fragmentos de ARNt sintetasa pueden ser,
por ejemplo, fragmentos de triptofanil ARNt sintetasa, fragmentos
de ARNt sintetasa humana o cualquier fragmento angiostático de una
ARNt sintetasa.
Adicionalmente, se puede poner en contacto una
célula o tejido con un segundo agente terapéutico seleccionado
entre el grupo constituido por: un agente
anti-neoplásico, un agente
anti-inflamatorio, un agente antibacteriano, un
agente antiviral y un agente anti-angiogénico.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona kits para
modular la angiogénesis. Opcionalmente, un kit comprende un
recipiente que comprende un complejo multi-unidad
en el que al menos una unidad de dicho complejo
multi-unidad comprende un fragmento de ARNt
sintetasa o un homólogo o análogo del mismo; e instrucciones
escritas para el uso del mismo para tratar a un individuo. Un
complejo multi-unidad puede ser, por ejemplo, un
dímero que tiene dos unidades. Los monómeros de un complejo
multi-unidad pueden ser diferentes entre sí u
homólogos, sustancialmente homólogos o idénticos. Opcionalmente, un
complejo multi-unidad es un dímero que tiene dos
monómeros
homólogos.
homólogos.
Opcionalmente, un fragmento de ARNt sintetasa
puede ser un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa, una
triptofanil ARNt sintetasa humana o cualquier fragmento
angiostático de un fragmento de ARNt sintetasa. Por ejemplo, un
fragmento de ARNt sintetasa se puede seleccionar entre el grupo
constituido por las SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41, 48-53
y cualquier homólogo o análogo de las mismas.
Dos monómeros cualesquiera dentro de un complejo
multi-unidad pueden estar unidos covalentemente o
unidos de forma no covalente. La composición en el primer
recipiente puede envasarse para administración sistémica en una
dosificación unitaria única. Cuando se envasa en dosificaciones
unitarias únicas, una dosis puede variar entre
50-1000 \mug/dosis. El kit de este documento
también puede incluir un segundo agente terapéutico. Tal segundo
agente terapéutico puede estar contenido en un segundo recipiente.
Los ejemplos de un segundo agente terapéutico incluyen, aunque sin
limitación, un agente anti-neoplásico, un agente
anti-inflamatorio, un agente antibacteriano, un
agente antiviral y un agente anti-angiogénico.
Un kit puede incluir un recipiente, que
comprende un anticuerpo que se une específicamente a un epítope de
un fragmento de ARNt sintetasa e instrucciones por escrito para el
uso del mismo. En tales ejemplos, el fragmento de ARNt sintetasa es
un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa o un fragmento de
triptofanil ARNt sintetasa humana o cualquier fragmento
angiostático de una ARNt sintetasa. Opcionalmente, un fragmento
angiostático de ARNt sintetasa es uno seleccionado entre el grupo
constituido por las SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41, 48-53
y cualquier homólogo y análogo de las mismas.
Opcionalmente, un kit comprende un recipiente
que comprende una composición de un primer fragmento de ARNt
sintetasa y un segundo fragmento de ARNt sintetasa, en el que el
primer fragmento de ARNt sintetasa tiene una metionina en su
extremo N y en el que el segundo fragmento de ARNt sintetasa no
tiene una metionina en su extremo N; e instrucciones por escrito
para el uso del mismo.
El primer fragmento de ARNt sintetasa puede ser,
por ejemplo, un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa, un
fragmento de ARNt sintetasa humana o un fragmento angiostático de
una ARNt sintetasa. El segundo fragmento de ARNt sintetasa puede
ser, por ejemplo, un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa, un
fragmento de ARNt sintetasa humana o un fragmento angiostático de
una ARNt sintetasa.
Los ejemplos de fragmentos angiostáticos de ARNt
sintetasa que tienen una metionina en su extremo N incluyen, aunque
sin limitación, los seleccionados entre grupo el constituido por las
SEC ID Nº: 15-17, 27-29,
36-38, 48-50 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas.
Los ejemplos de fragmentos angiostáticos de ARNt
sintetasa que no tienen una metionina en su extremo N incluyen,
aunque sin limitación los seleccionados entre el grupo constituido
por las SEC ID Nº: 12-14, 24-26,
36-38, 48-50 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas.
Una composición en el primer recipiente puede
tener un pI de aproximadamente 7,4-7,8.
Tales kits pueden incluir además un segundo
agente terapéutico, tal como un agente
anti-neoplásico, un agente
anti-inflamatorio, un agente antibacteriano, un
agente antiviral o un agente anti-angiogénico. El
segundo agente terapéutico puede estar contenido en un recipiente
diferente.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona
procedimientos comerciales para modular la angiogénesis. Los
procedimientos comerciales de este documento incluyen las etapas de
buscar a un agente que module o se una a un receptor de un
fragmento de ARNt sintetasa; y comercializar dicho agente.
Un fragmento de ARNt sintetasa de la presente
invención puede ser, por ejemplo, un fragmento de triptofanil ARNt
sintetasa o una tirosil ARNt sintetasa. Preferiblemente tal
fragmento es de mamífero o más preferiblemente de ser humano.
Opcionalmente, un fragmento de ARNt sintetasa tiene actividad
angiostática. Los ejemplos de tales fragmentos angiostáticos de
ARNt sintetasa incluyen, aunque sin limitación, un fragmento
seleccionado entre el grupo constituido por las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y cualquier homólogo y variante de las
mismas.
Una etapa de búsqueda puede incluir explorar una
biblioteca de agentes candidatos para identificar un agente que
module la angiogénesis. Tal agente puede ser, por ejemplo, una
molécula pequeña, un péptido o un peptidomimético. Una etapa de
búsqueda puede implicar el uso de un programa informático para
generar un peptidomimético de dicho fragmento de ARNt
sintetasa.
La presente invención también proporciona
procedimientos comerciales que comprenden las etapas de (i)
modificar un fragmento de ARNt sintetasa para potenciar su
capacidad de formación de dímeros; y (ii) comercializar el
fragmento de ARNt sintetasa potenciado o la forma dimerizada del
mismo.
Tales fragmentos de ARNt sintetasa son
preferiblemente fragmentos angiostáticos, fragmentos de triptofanil
ARNt sintetasa y/o fragmentos de ARNt sintetasa humana. Los ejemplos
de tales fragmentos incluyen un fragmento seleccionado entre el
grupo constituido por las SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41, 48-53
y cualquier homólogo y análogo de las mismas.
La etapa de modificación de este documento puede
implicar generar un vector de expresión que codifique un fragmento
de ARNt sintetasa modificado en su dominio de dimerización para
incluir una o más cisteínas de origen no natural.
Opcionalmente, la etapa de modificación implica
generar un vector de expresión que codifique dos fragmentos de ARNt
sintetasa. Un vector de expresión también puede codificar un
engarce. Tal engarce puede estar situado entre el primer y el
segundo fragmentos de ARNt sintetasa.
Opcionalmente, la etapa de modificación implica
el uso de un programa informático para optimizar el fragmento de
ARNt sintetasa. Los ejemplos de programas informáticos útiles
incluyen, aunque sin limitación, GRID, MCSS, AUTODOCK, DOCK, AMBER,
QUANTA, e INSIGHT II.
Opcionalmente, la presente invención proporciona
procedimientos comerciales que incluyen las etapas de (i) preparar
un fragmento de ARNt sintetasa recombinante; y (ii) comercializar
dicho fragmento para modular la angiogénesis. Los ejemplos de
fragmentos de ARNt sintetasa recombinantes que se pueden preparar
incluyen, aunque sin limitación, fragmentos de triptofanil ARNt
sintetasa y fragmentos de tirosil ARNt sintetasa. Preferiblemente
tales fragmentos son humanos. También, preferiblemente, tales
fragmentos pueden modular la angiogénesis.
Los ejemplos de fragmentos angiostáticos
incluyen, aunque sin limitación, SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41, 48-53
y cualquier homólogo y análogo de las mismas.
Cualquiera de los fragmentos de ARNt sintetasa
que module la angiogénesis de este documento, puede estar en
unidades monoméricas o parte de un complejo
multi-unidad.
Los procedimientos comerciales en este documento
preparan tales fragmentos de ARNt sintetasa que modulan la
angiogénesis preparando en primer lugar un vector de expresión que
codifica tales fragmentos, transfectando después una célula huésped
con dicho vector de expresión y finalmente manteniendo dicha célula
huésped en condiciones que permitan la expresión de dicho fragmento
de ARNt sintetasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las nuevas características de la invención se
exponen particularmente en las reivindicaciones adjuntas. Se
obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de
la presente invención con referencia a la siguiente descripción
detallada que expone las realizaciones ilustrativas, en las que se
utilizan los principios de la invención y los dibujos adjuntos de
los que:
La Figura 1 ilustra la secuencia de restos de
aminoácidos del polipéptido triptofanil ARNt sintetasa (SEC ID Nº:
63); mini-polipéptido de triptofanil ARNt sintetasa
(SEC ID Nº: 29), que corresponde a los restos de aminoácidos
48-471 de la SEC ID Nº: 63; polipéptido
T1-triptofanil ARNt sintetasa (SEC ID Nº: 25), que
corresponde a los restos de aminoácidos 71-471 de
la SEC ID Nº: 63; y polipéptido T2-triptofanil ARNt
sintetasa (SEC ID Nº: 24), que corresponde a los restos de
aminoácidos 94-471 de la SEC ID Nº: 63. Todas las
secuencias son construcciones recombinantes y tienen una metionina
N-terminal y un resto KLAAALEHHHHHH terminal (SEC
ID Nº, 76).
La Figura 2 es una fotomicrografía que ilustra
el desarrollo vascular retiniano en un modelo de ratón.
La Figura 3 es una representación gráfica de los
datos presentados en el Ejemplo 3, a continuación.
La Figura 4 es una representación gráfica de los
datos presentados en el Ejemplo 4, a continuación.
La Figura 5 es una fotomicrografía que ilustra
la localización de unión de T2 marcado con his (SEC ID Nº: 7) en la
retina en un modelo de ratón.
La Figura 6 ilustra el pI experimental de un
polipéptido producido de forma recombinante mediante un vector de
expresión que codifica la SEC ID Nº: 27.
La Figura 7 muestra una ilustración de un
diagrama de flujo de un procedimiento posible para purificar las
composiciones de este documento.
La Figura 8 ilustra otra realización de los
procedimientos de purificación de la invención.
La Figura 9 ilustra un análisis en
SDS-PAGE con Tris-glicina al
4-20% (condiciones reductoras) que demuestra la
pureza de un polipéptido producido por una célula huésped bacteriana
transfectada con un vector de la SEC ID Nº: 70, que codifica la SEC
ID Nº: 27 y purificado adicionalmente usando uno de los
procedimientos descritos en este documento.
La Figura 10 ilustra un gel de
SDS-PAGE de muestras producidas expresando de forma
recombinante en E. coli un vector de la SEC ID Nº: 70, que
codifica la SEC ID Nº: 27, en el que se calienta algún producto.
La Figura 11 ilustra un gel de PAGE nativo de un
producto producido expresando de forma recombinante en E.
coli un vector de la SEC ID Nº: 70, que codifica la SEC ID Nº:
27.
La Figura 12 ilustra una curva de calibrado en
la que el eje x es el tiempo de retención de los elementos de
calibrado por minuto y el eje y es el logaritmo del PM.
La Figura 13 ilustra un producto producido
expresando de forma recombinante en E. coli un vector
de la SEC ID Nº: 70, que codifica la SEC ID Nº: 27, detectado a una
absorbancia UV de 215 nm.
La Figura 14 ilustra un producto producido
expresando de forma recombinante en E. coli un vector de la
SEC ID Nº: 70, que codifica la SEC ID Nº: 27, detectado a una
absorbancia UV de 254 nm.
La Figura 15 ilustra un producto producido
expresando de forma recombinante en E. coli un vector
de la SEC ID Nº: 70, que codifica la SEC ID Nº: 27, detectado a una
absorbancia UV de 280 nm.
La Figura 16 ilustra los resultados de un ensayo
de intercambio de PPi.
La Figura 17 ilustra los resultados de recuentos
por minuto del ensayo de intercambio de PPi.
La Figura 18 ilustra diversos niveles de
inhibición en ratón después del nacimiento.
La Figura 19 ilustra una comparación del
porcentaje de inhibición de la angiogénesis mediante un producto
producido por la expresión en E. coli de la SEC ID Nº: 71,
SEC ID Nº: 70 purificado a aproximadamente el 95% de pureza y la
SEC ID Nº: 70 purificado a aproximadamente el 100% de pureza en
diversas dosificaciones.
La Figura 20 ilustra los resultados de una
columna de HPLC de fase inversa de un producto producido mediante
la expresión en E. coli de un polinucleótido que codifica la
SEC ID Nº: 27, purificado para reducir los niveles de
endotoxinas.
La Figura 21 ilustra el espectro de
MALDI-TOF de un producto producido mediante la
expresión recombinante en E. coli del vector SEC ID
Nº: 70, que se purifica después hasta aproximadamente el 95% \pm
4% de pureza.
La Figura 22 ilustra un espectro de
MALDI-TOF de un producto producido mediante la
expresión recombinante en E. coli del vector SEC ID
Nº: 70, que se purifica después hasta aproximadamente el 100% \pm
1% de pureza.
La Figura 23 ilustra el espectro de masas de un
producto producido mediante la expresión recombinante de la SEC ID
Nº: 70 en E. coli, seguido de la purificación hasta más del
99% de pureza y la retirada de sustancialmente todas las
endotoxinas, que se digiere después por GluC.
La Figura 24 ilustra el espectro de masas de un
producto producido mediante la expresión recombinante de la SEC ID
Nº: 70 en E. coli, seguido de la purificación hasta
más del 99% de pureza y la retirada de sustancialmente todas las
endotoxinas, que se digiere después con tripsina.
La Figura 25 ilustra el espectro de masas de un
producto producido mediante la expresión recombinante de la SEC ID
Nº: 70 en E. coli, seguido de la purificación hasta más del
99% de pureza y la retirada de sustancialmente todas las
endotoxinas, que se digiere después con GluC mostrando el péptido
N-terminal sin una metionina a 494 m/z
(Mr=2468).
La Figura 26 ilustra el espectro de masas de un
producto producido mediante la expresión recombinante de la SEC ID
Nº: 70 en E. coli, seguido de la purificación hasta más del
99% de pureza y la retirada de sustancialmente todas las
endotoxinas, que se digiere después con GluC mostrando el péptido
N-terminal sin una metionina a 618 m/z
(Mr=2468).
La Figura 27 ilustra el espectro de masas de un
producto producido mediante la expresión recombinante de la SEC ID
Nº: 70 en E. coli, seguido de purificación hasta más del 99%
de pureza y la retirada de sustancialmente todas las endotoxinas,
que se digiere después con GluC, mostrando el extremo
N-terminal sin una metionina.
La Figura 28 ilustra una fragmentación de la
masa cargada doblemente en m/z = 759 de un producto producido
mediante la expresión recombinante de la SEC ID Nº: 70 en E.
coli, seguido de la purificación hasta más del 99% de pureza y
la retirada de sustancialmente todas las endotoxinas.
La Figura 29 ilustra un espectro de masas de
MALDI-TOF de un producto producido mediante la
expresión recombinante de la SEC ID Nº: 70 en E. coli,
seguido de la purificación hasta más del 99% de pureza y la retirada
de sustancialmente todas las endotoxinas, que se digiere después
por GluC.
La Figura 30 ilustra un espectro de masas de
MALDI-TOF de un producto producido mediante la
expresión recombinante de la SEC ID Nº: 70 en E. coli,
seguido de la purificación hasta más del 99% de pureza y la retirada
de sustancialmente todas las endotoxinas, que se digiere después
por tripsina.
La Figura 31 ilustra un espectro de ionización
por electronebulización de un producto producido mediante la
expresión recombinante de la SEC ID Nº: 70 en E. coli,
seguido de purificación hasta más del 99% de pureza y la retirada
de sustancialmente todas las endotoxinas, que se desala después con
una ZipTip C_{4} (Millipore).
La Figura 32 ilustra el espectro de
electronebulización enrollado de la Figura 32.
La Figura 33 ilustra un espectro de masas de
MALDI-TOF de un producto producido mediante la
expresión recombinante de la SEC ID Nº: 70 en E. coli,
seguido de la purificación hasta más del 99% de pureza y la retirada
de sustancialmente todas las endotoxinas, que se desala después con
una columna preparatoria de C_{4} (ZipTip, Millipore).
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "aminoácido" o "resto de
aminoácido" se refiere a un aminoácido que está preferiblemente
en la forma isomérica L. Cuando un resto de aminoácido es parte de
una cadena polipeptídica, el resto de aminoácido L puede
sustituirse por la forma isomérica D, siempre que la propiedad
funcional deseada se mantenga. NH_{2} se refiere al grupo amino
libre presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH se
refiere al grupo carboxi libre presente en el extremo carboxilo de
un polipéptido.
Para mantener la nomenclatura convencional de
polipéptidos descrita en J. Biol. Chem., 243:
3552-59 (1969) y adoptada en 37 C.F.R. \NAK\NAK
1.821-1.822, todas las secuencias de restos de
aminoácidos representadas en este documento mediante fórmulas
tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección
convencional del extremo amino al extremo carboxilo. Además, la
frase "resto de aminoácido" se define ampliamente para que
incluya aminoácidos modificados e inusuales, tales como los
mencionados en 37 C.F.R. \NAK\NAK 1.821-1.822.
Una raya en el principio o final de la secuencia de restos de
aminoácidos indica un enlace peptídico a una secuencia adicional de
uno o más restos de aminoácidos o a un grupo
amino-terminal tal como NH_{2} o a un grupo
carboxilo-terminal tal como
COOH.
COOH.
En un péptido o proteína, los especialistas en
la técnica conocen sustituciones conservativas de aminoácidos
adecuadas y pueden hacerse de forma general sin alterar la actividad
biológica de la molécula resultante. Los especialistas en la
técnica saben que, en general, las sustituciones únicas de
aminoácidos en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran
de forma sustancial la actividad biológica (véase, por ejemplo,
Watson y col. Molecular Biology of the Gene, 4a Edición, 1987, The
Benjamin/Cummings Pub. Co. pág. 224).
\newpage
Tales sustituciones se hacen preferiblemente con
las expuestas a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
El término "análogo" o "análogos" como
se usa en este documento se refiere a una composición que conserva
la misma estructura o función (por ejemplo, unión a un receptor) que
un polipéptido o ácido nucleico de este documento. Los ejemplos de
análogos incluyen peptidomiméticos, ácidos nucleicos peptídicos,
compuestos orgánicos o inorgánicos pequeños y grandes, así como
derivados y variantes de un polipéptido o ácido nucleico de este
documento. El término "derivado" o "variante" como se usa
en este documento se refiere a un péptido o ácido nucleico que
difiere del polipéptido o ácido nucleico de origen natural en una o
más supresiones, adiciones, sustituciones o modificaciones de la
cadena lateral de aminoácidos o ácidos nucleicos. Las sustituciones
de aminoácidos incluyen alteraciones en las que un aminoácido se
sustituye por un resto de aminoácido de origen natural o no
convencional diferente. Tales sustituciones pueden clasificarse como
"conservativas", en cuyo caso un resto de aminoácido contenido
en un polipéptido se reemplaza por otro aminoácido de origen natural
de carácter similar en relación a la polaridad, funcionalidad de la
cadena lateral o tamaño.
La presente invención también abarca
sustituciones "no conservativas", en las que un resto de
aminoácido que está presente en un péptido se sustituye por un
aminoácido que tiene propiedades diferentes, tales como aminoácidos
de origen natural de un grupo diferente (por ejemplo, sustituyendo
un aminoácido cargado o hidrófobo con alanina) o como alternativa,
en las que un aminoácido de origen natural se sustituye por un
aminoácido no convencional. Preferiblemente, las sustituciones de
aminoácidos son conservativas.
Las sustituciones de aminoácidos son típicamente
de restos únicos, pero pueden ser de múltiples restos, agrupados o
dispersados. Las adiciones abarcan la adición de uno o más restos de
aminoácidos de origen natural o no convencionales. La supresión
abarca la supresión de uno o más restos de aminoácidos.
Como se ha indicado anteriormente, los derivados
peptídicos incluyen péptidos en los que uno o más de los
aminoácidos ha experimentado modificaciones de la cadena lateral.
Los ejemplos de modificaciones de la cadena lateral contemplados en
la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino tales
como alquilación reductora por reacción con un aldehído seguido de
reducción con NaBH_{4}; amidinación con metilacetimidato;
acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con
cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido
2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS); acilación de
grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico;
y piridoxilación de lisina con piridoxal-5 fosfato
seguido de reducción con NaBH_{4}.
El grupo guanidina de restos de arginina se
puede modificar por la formación de productos de condensación
heterocíclicos con reactivos tales como
2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal. El grupo
carboxilo se puede modificar por activación con carbodiimida
mediante la formación de O-acilisourea seguida de la
posterior derivatización, por ejemplo, hasta una amida
correspondiente. Los grupos sulfhidrilo se pueden modificar por
procedimientos tales como carboximetilación con ácido yodoacético o
yodoacetamida; oxidación del ácido perfórmico a ácido cisteico;
formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiol; reacción
con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida;
formación de derivados de mercurio usando
4-cloromercuribenzoato, ácido
4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de
fenilmercurio,
2-cloromercuri-4-nitrofenol
y otros derivados de mercurio; carbamoilación con cianato a pH
alcalino. Cualquier modificación de restos de cisteína no debe
afectar a la capacidad del péptido de formar los enlaces disulfuro
necesarios. También es posible sustituir los grupos sulfhidrilo de
cisteína por equivalentes de selenio de modo que el péptido forme
un enlace diselenio en lugar de uno o más de los enlaces
disulfuro.
disulfuro.
Los restos de triptófano se pueden modificar
mediante, por ejemplo, oxidación con
N-bromosuccinimida o alquilación del anillo de
indol con bromuro de
2-hidroxi-5-nitrobencilo
o haluros de sulfenilo. Los restos de tirosina, por otro lado, se
pueden alterar mediante nitración con tetranitrometano para formar
un derivado de 3-nitrotirosina. La modificación del
anillo de imidazol de un resto de histidina se puede conseguir
mediante alquilación con derivados del ácido yodoacético o
N-carbetoxilación con dietilpirocarbonato. El resto
de prolina se puede modificar mediante, por ejemplo, hidroxilación
en la posición 4. Otros derivados contemplados en la presente
invención incluyen un intervalo de variantes de glicosilación de una
molécula completamente no glicosilada hasta una molécula
glicosilada modificada. Los patrones de glicosilación alterados se
pueden producir como resultado de la expresión de moléculas
recombinantes en diferentes células huésped.
Los derivados adicionales incluyen alteraciones
que están causadas por la expresión del polipéptido en bacterias u
otros sistemas huésped así como a través de modificaciones químicas.
Preferiblemente, los derivados conservan la actividad deseada. Por
ejemplo, un derivado de T2 puede ser una versión truncada de T2 que
conserva la capacidad de T2 de unirse a uno de sus receptores de
origen natural o de inhibir la angiogénesis.
El término "antagonista" se usa en este
documento para referirse a una molécula que inhibe una actividad
biológica. Los ejemplos de moléculas antagonistas incluyen, aunque
sin limitación, anticuerpos, ácidos nucleicos antisentido, ácidos
nucleicos de ARNsi y otros agentes de unión.
El término "anticuerpo" o
"anticuerpos" como se usa en este documento incluye anticuerpos
policlonales, anticuerpos monoclonales (mAb), anticuerpos
quiméricos, anticuerpos anti-idiotípicos
(anti-Id) para anticuerpos que se pueden marcar en
forma soluble o unida, así como fragmentos, regiones o derivados de
los mismos (por ejemplo, cadenas pesadas, cadenas ligeras, Fab,
Fab', F(ab')2, Fabc y Fv por separado).
La expresión "cantidad eficaz" como se usa
en este documento se refiere a la cantidad de composición necesaria
para conseguir el efecto indicado.
Las expresiones "terapia génica" y
"terapia genética" se refieren a la transferencia de ácidos
nucleicos heterólogos a ciertas células, células diana, de un
mamífero, particularmente un ser humano, con un trastorno o afección
para la que se busca tal terapia. El ácido nucleico se introduce en
las células diana seleccionadas de manera que el ADN heterólogo se
exprese y se produzca un producto terapéutico codificado de este
modo. Como alternativa, los ácidos nucleicos heterólogos pueden de
alguna manera mediar la expresión de un ácido nucleico que codifique
el producto terapéutico; los mismos pueden codificar un producto,
tal como un péptido o ARN que de alguna manera media, directa o
indirectamente, la expresión de un producto terapéutico. La terapia
genética también se puede usar para que un ácido nucleico que
codifica un producto génico reemplace un gen defectuoso o
complemente un producto génico producido por el mamífero o la
célula en la que se introduce. El ácido nucleico introducido puede
codificar un compuesto terapéutico, tal como un inhibidor del factor
de crecimiento del mismo o un factor de necrosis tumoral o
inhibidor del mismo, tal como un receptor del mismo, que no se
produce normalmente en el huésped mamífero o que no se produce en
cantidades terapéuticamente eficaces o en un momento
terapéuticamente útil. El ADN heterólogo que codifica el producto
terapéutico se puede modificar antes de la introducción en las
células del huésped afectado para potenciar o de otra manera alterar
el producto o expresión del mismo.
El término "homodímero" como se usa en este
documento se refiere a dos monómeros que forman un complejo juntos
de forma covalente o no covalente en el que los dos compuestos son
idénticos.
El término "homólogo" u "homólogos"
como se usa en este documento se refiere a homología con respecto a
estructura y/o función. Con respecto a homología de secuencia, las
secuencias son homólogas si las mismas son al menos el 50%,
preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el
70%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al
menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% idénticas, más
preferiblemente al menos el 97% idénticas o más preferiblemente al
menos el 99% idénticas. La expresión "sustancialmente homólogo"
proporciona secuencias que son al menos el 90%, más preferiblemente
al menos el 95% idénticas, más preferiblemente al menos el 97%
idénticas o más preferiblemente al menos el 99% idénticas. Las
secuencias homólogas pueden ser el mismo gen funcional en
diferentes especies.
\newpage
El término "huésped" como se usa en este
documento se refiere a un organismo que expresa un ácido nucleico
de esta invención en al menos una de sus células. La expresión
"célula huésped" como se usa en este documento se refiere a
una célula que expresa las secuencias de nucleótidos de acuerdo con
esta invención.
El término "inhibir" como se usa en este
documento se refiere a prevención o cualquier reducción o
eliminación detectable de una afección.
El término "aislado" como se usa en este
documento se refiere a un compuesto o molécula (por ejemplo, un
polipéptido o ácido nucleico) que está relativamente libre de otros
compuestos o moléculas con los que normalmente se asocia in
vivo. En general, un polipéptido aislado constituye al menos
aproximadamente el 75%, más preferiblemente aproximadamente el 80%,
más preferiblemente aproximadamente el 85%, más preferiblemente
aproximadamente el 90%, más preferiblemente aproximadamente el 95%
o más preferiblemente aproximadamente el 99% en peso de una muestra
que lo contiene.
La expresión "mini-TrpRS"
como se usa en este documento se refiere a un polipéptido que tiene
una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo
constituido por las SEC ID Nº: 2, 3, 14, 17, 26, 29, 38, 41, 50, 53
y cualquier homólogo y análogo de las mismas.
La expresión "complejo
multi-unidad" como se usa en este documento se
refiere a un complejo de una o más unidades de monómero que forman
complejos entre sí de forma covalente o no covalente. Los ejemplos
de complejos de multi-unidad incluyen dímeros,
trímeros, etc.
La expresión "ácido nucleico" o "molécula
de ácido nucleico" como se usa en este documento se refiere a una
secuencia de oligonucleótidos, secuencia polinucleotídica,
incluyendo variantes, homólogos, fragmentos o análogos de las
mismas. Un ácido nucleico puede incluir ADN, ARN o una combinación
de los mismos. Un ácido nucleico puede ser una hebra de origen
natural o sintético, de doble hélice o hélice única, sentido o
antisentido.
Como se usa en este documento la expresión
"unido operativamente" cuando se refiere a una primera
secuencia de ácido nucleico que está unida operativamente con una
segunda secuencia de ácido nucleico se refiere a una situación en
la que la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en relación
funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo,
un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante
si el promotor realiza la transcripción o expresión de la secuencia
codificante. Generalmente, las secuencias de ácido nucleico unidas
operativamente son contiguas y, cuando sea necesario unir dos
regiones codificantes de proteína, los marcos de lectura abierta
están alineadas.
El término "peptidomimético" como se usa en
este documento se refiere a agentes tanto peptídicos como no
peptídicos que imitan aspectos de un polipéptido. Los análogos
peptídicos no hidrolizables de restos críticos se pueden generar
usando benzodiazepina (Véase Freidinger y col. en Peptides:
Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden,
Países Bajos, 1988), azepina (véase Huffman y col. en Peptides:
Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden,
Países Bajos, 1988), anillos de \gamma lactama sustituidos
(Garvey y col. en Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall
ed., ESCOM Publisher: Leiden, Países Bajos, 1988), pseudopéptidos
de ceto-metileno (Ewenson y col. (1986) J Med Chem
29: 295; y Ewenson y col. en Peptides: Structure and Function
(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical
Co. Rockland, III., 1985), núcleos dipeptídicos con giros \beta
(Nagai y col. (1985) Tetrahedron Lett 26: 647; y Sato y col. (1986)
J Chem Soc Perkin Trans 1:1231) y
\beta-aminoalcoholes (Gordon y col. (1985) Biochem
Biophys Res Commun 126: 419; y Dann y col. (1986) Biochem Biophys
Res Commun 134: 71).
El término "polipéptido", "péptido",
"oligopéptidos" o "proteína" se refiere a cualquier
composición que incluye dos o más aminoácidos unidos entre sí
mediante un enlace peptídico. Se apreciará que los polipéptidos
contienen a menudo aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos
denominados comúnmente como los 20 aminoácidos de origen natural y
que muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales se
pueden modificar en un polipéptido dado, mediante procedimientos
naturales tales como glicosilación y otras modificaciones
post-traduccionales o mediante técnicas de
modificación química que se conocen bien en la técnica.
Entre las modificaciones conocidas que pueden
estar presentes en polipéptidos se incluyen, aunque sin limitación,
acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación,
unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión
covalente de un polinucleótido o derivado de polinucleótido, unión
covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de
fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces
disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes,
formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación,
\gamma-carboxilación, glicación, glicosilación,
formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodación, metilación,
miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico,
fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación,
sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de
transferencia tal como arginilación y ubiquitinación.
El término "receptor" se refiere a una
molécula biológicamente activa que se une específicamente a (o con)
otras moléculas. La expresión "proteína receptora" se puede
usar para indicar de forma más específica la naturaleza proteica de
un receptor específico. Por ejemplo, la expresión "receptor T2"
se refiere a una molécula biológicamente activa que se une
específicamente a (o con) T2.
El término "T1" o
"T1-TrpRS" se refiere a un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID Nº: 13,
25, 37, 49, homólogos o análogos de las mismas y cualquier secuencia
polinucleotídica que codifique las mismas.
El término "T2" o
"T2-TrpRS" se refiere a un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende las SEC ID Nº: 12,
24, 36, 48, homólogos o análogos de las mismas y cualquier secuencia
polinucleotídica que codifique las mismas.
El término "tratar" como se usa en este
documento se refiere a eliminar, reducir o aliviar síntomas en un
sujeto o prevenir que se produzcan, empeoren o progresen tales
síntomas.
El término "TrpRS" o "triptofanil ARNt
sintetasa" como se usa en este documento se refiere a la
triptofanil ARNt sintetasa de longitud completa como se ilustra en
la Figura 1, en la que el resto de aminoácido 213 es Gly o Ser y el
resto de aminoácido 214 es Asp o Tyr (independientemente del otro).
Por tanto, las expresiones "variante GD", "variante SD",
"variante GY" y "variante SY" como se usan en este
documento se refieren a TrpRS o fragmentos del mismo con los restos
de aminoácidos correspondientes en la localización anterior dentro
del polipéptido.
El término "tRS" como se usa en este
documento significa un polipéptido de ARNt sintetasa y/o ácidos
nucleicos que codifican tal polipéptido, ya sea de origen natural o
de origen no natural.
La expresión "polipéptidos de ARNt sintetasa
truncados" significa polipéptidos que son más cortos que la ARNt
sintetasa de longitud completa correspondiente.
Las aminoacil-ARNt sintetasas
(tRS) son proteínas antiguas que son esenciales para descodificar la
información genética durante el proceso de traducción. Hay dos
clases de tRS. La primera clase, clase I, contiene un bucle común
con la secuencia de identificación KMSKS (y HIGH, como parte de un
pliegue de unión de dinucleótido de Rossman de láminas \beta
paralelas ("dominio de pliegue Rossman")). Sever y col.,
Biochem. 35, 32-40 (1996). La segunda clase,
Clase II, tiene una topología totalmente diferente de bases de unión
de dinucleótido en láminas \beta antiparalelas.
La triptofanil-ARNt sintetasa
(TrpRS) es una tRS de Clase I. Se cree que la expresión de TrpRS se
estimula por interferón ("IFN") (por ejemplo,
IFN-\gamma) y/o factor de necrosis tumoral
("TNF") (por ejemplo, TNF-\alpha). El
IFN-\gamma es responsable del estado antiviral y
antiproliferativo de las células animales. Véase Kisselev, L.,
Biochimie 75, 1027-1039 (1993). La
estimulación de TrpRS por IFN sucede en el nivel transcripcional
mediante una secuencia reguladora de consenso denominada elemento de
respuesta estimulado por IFN ("ISRE"). Un examen de secuencias
de ISRE de varios genes de respuesta a IFN indica un motivo común de
GGAAAN(N/-)GAAA. Por tanto, la presente invención
proporciona el uso de las composiciones de este documento para
tratar afecciones mediadas por IFN y/o TNF y en particular
afecciones mediadas por IFN-\gamma y/o
TNF-\alpha.
Las moléculas de TrpRS de mamífero tienen un
dominio amino-terminal unido. En las células humanas
normales, hay dos formas de TrpRS que pueden detectarse: una forma
principal constituida por la molécula de longitud completa (restos
de aminoácidos 1-471 de la SEC ID Nº: 1) y una forma
truncada secundaria ("mini-TrpRS"; un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 3,
14, 19 ó 20). En cualquiera de las realizaciones de
Trp-RS de este documento el aminoácido 213 puede ser
una Gly o Ser y el aminoácido 214 puede ser una Asp o Tyr. Tales
variantes pueden denominarse en este documento la variante GD,
variante GY, variante SD y variante SY.
La forma secundaria se genera por la supresión
del dominio amino-terminal a través de corte y
empalme alternativo del pre-ARNm (Tolstrup y col.,
J. Biol. Chem. 270: 397-403 (1995)). Se ha
determinado que el extremo amino de mini-TrpRS es
un resto de metionina en la posición 48 de la molécula de TrpRS de
longitud completa. Como alternativa, se puede generar TrpRS
truncado por proteolisis. Lemaire y col., Eur. J. Biochem.
51: 237-52 (1975). Por ejemplo, TrpRS bovina se
expresa altamente en el páncreas y se secreta en el jugo pancreático
(Kisselev, Biochimie 75: 1027-39 (1993)),
provocando de este modo la producción de una molécula de TrpRS
truncada. Estas observaciones sugieren que TrpRS truncada podría
tener una función diferente de la aminoacilación de ARNt.
Los estudios indican que la TrpRS de longitud
completa no inhibe la angiogénesis, mientras que
mini-TrpRS inhibe la proliferación y migración
celular inducida por VEGF (Wakasugi y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. 99: 173-177 (2002)). En particular, un
ensayo CAM en pollitos muestra que mini-TrpRS
bloquea la actividad angiogénica de VEGF. Por tanto, la retirada de
los primeros 47 restos de aminoácido deja al descubierto la
actividad anti-angiogénica de TrpRS. TrpRS y
mini-TrpRS se describen adicionalmente en las
Solicitudes Internacionales Nº PCT/US01/08966 y PCT/US01/8975,
presentadas las dos el 21 de marzo de 2001.
Los fragmentos adicionales de TrpRS que tienen
actividad angiostática se denominan en este documento T1 y T2. El
tratamiento de TrpRS con PMN elastasa da como resultado dos
productos adicionales: un fragmento de 47 kDa (super
mini-TrpRS o T1; por ejemplo, SEC ID Nº: 13, 16, 25,
28, 37, 40, 49 y 52) y un fragmento de aproximadamente 43 kDa
(T2-TrpRS o T2; por ejemplo, SEC ID Nº: 12, 15, 24,
27, 36, 39, 48 y 51). El análisis de los aminoácidos terminales ha
revelado a Ser-71 y Ser-94,
respectivamente, como los restos NH_{2}-terminales
para estos fragmentos. Tanto T1 como T2 han demostrado ser
antagonistas potentes de la angiogénesis in vivo como se
ilustra en los siguientes ejemplos. T1 y T2 se describen
adicionalmente en la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº
60/270.951, presentada el 23 de febrero de 2001, para
"Tryptophanyl-tRNA Synthetase Derived
Polypeptides Useful for the Regulation of Angiogenesis", así como
en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/080.839,
presentada el 22 de febrero de 2002 y la Solicitud Internacional Nº
PCT/US02/05185, presentada el 22 de febrero de 2002. Los
procedimientos para preparar T2 se describen adicionalmente en la
Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/598.019, presentada
el 8 de agosto de 2004, titulada "Composition of and Purification
Methods for Low-Endotoxin Therapeutic
Agents".
La presente invención proporciona composiciones
que comprenden un fragmento de ARNt sintetasa que tiene actividad
angiogénica o angiostática (anti-angiogénica).
Preferiblemente, tales composiciones y/o
fragmentos de ARNt sintetasa son sustancialmente puros. En otras
realizaciones, las composiciones y/o fragmentos de ARNt sintetasa de
este documento son al menos el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 55%,
el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el
92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99%, el
99,1%, el 99,2%, el 99,3%, el 99,4%, el 99,5%, el 99,6%, el 99,7%,
el 99,8%, el 99,9% o el 99,95% puras. El porcentaje de pureza se
refiere al peso de la composición y/o fragmento de ARNt sintetasa
por el peso total de la composición y/o fragmento de ARNt sintetasa
(p/p), respectivamente. Cuando se hace referencia a una composición
que comprende un fragmento de ARNt sintetasa, la composición se
considera que es, por ejemplo, el 80% pura, si se observa el 80% del
producto total en un único pico de cromatografía a una absorbancia
UV entre 180-220 nm. De forma similar, cuando se
hace referencia a un fragmento de ARNt sintetasa, el fragmento de
ARNt sintetasa se considera que es, por ejemplo el 90% puro, si se
observa el 90% del producto total bajo un único pico de
cromatografía a una absorbancia UV entre 180-220
nm.
En algunos casos, los fragmentos de ARNt
sintetasa (y composiciones que comprenden tales fragmentos) son
angiogénicos. Opcionalmente, los fragmentos de ARNt sintetasa (y
las composiciones que comprenden tales fragmentos) son
angiostáticos. Cuando se hace referencia a actividad angiostática,
se dice que un fragmento de ARNt sintetasa tiene actividad
angiostática cuando se mide por los procedimientos descritos en el
Ejemplo 18. Preferiblemente, un fragmento de ARNt sintetasa (o
composición que comprende el fragmento de ARNt sintetasa) tiene
actividad angiostática de más de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,
50, 55, 60, 65, 70 o 75 unidades de actividad angiostática.
Opcionalmente, un fragmento de ARNt sintetasa (y composiciones que
comprenden el mismo) tiene actividad angiostática de más de 50
unidades de actividad angiostática.
Los ejemplos de fragmentos de ARNt sintetasa
incluyen fragmentos de triptofanil ARNt sintetasa y fragmentos de
tirosil ARNt sintetasa. Tales fragmentos son preferiblemente de
mamífero o más preferiblemente humanos. Tales fragmentos
preferiblemente no incluyen una marca His (por ejemplo, una serie de
restos de aminoácidos histidina, añadidos comúnmente al extremo C).
Los ejemplos de fragmentos de ARNt sintetasa que no incluyen marcas
His incluyen las SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41, 48-53
y homólogos y variantes de las mismas. Se prefiere la retirada de
la marca His para formulaciones farmacéuticas administradas a un
organismo a causa de la afinidad de la marca His por ciertos
compuestos y su efecto sobre la solubilidad de un polipéptido y el
potencial de que la marca His sea antigénica y potencialmente
provoque un efecto inmunológico no deseado. Sin embargo, la
retirada de una marca His no es trivial y en algunos casos puede
afectar a otros aspectos de un polipéptido.
Los ejemplos de fragmentos de triptofanil ARNt
sintetasa que se describen en la presente invención incluyen
mini-TrpRS, T1, T2 y cualquier fragmento angiogénico
o angiostático de los mismos. Preferiblemente, tales polipéptidos
tienen una secuencia de aminoácidos que comprende, que está
constituida esencialmente por o que está constituida por las SEC ID
Nº: 12-17, 24-29,
36-41, 48-53 o cualquier homólogo,
análogo o fragmento de las mismas. Tales fragmentos pueden ser de
origen natural o no natural. Tales fragmentos están preferiblemente
aislados y/o purificados.
Opcionalmente, una composición comprende un
fragmento de ARNt sintetasa, donde el fragmento de ARNt sintetasa
comprende, está constituido esencialmente por o como alternativa
está constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada
entre el grupo de las SEC ID Nº: 12, 15, 24, 27, 36, 39, 48, 51 y
cualquier homólogo y análogo de las mismas. Preferiblemente, tal
fragmento de ARNt sintetasa no incluye una marca His.
Preferiblemente, tal fragmento de ARNt sintetasa es menor de 45 kD,
más preferiblemente menor de 44 kD, 43,9 kD, 43,8 kD, 43,7 kD, 43,6
kD o más preferiblemente menos de 43,5 kD. Preferiblemente tales
fragmentos son anti-angiogénicos. Tales fragmentos
de ARNt sintetasa pueden aislarse y/o purificarse mediante los
procedimientos de este documento u otros procedimientos conocidos
en la técnica.
En algunos casos una composición comprende un
fragmento de ARNt sintetasa, donde el fragmento de ARNt sintetasa
comprende, está constituido esencialmente por o como alternativa
está constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada
entre el grupo de las SEC ID Nº: 13, 16, 25, 28, 37, 40, 49, 52 y
cualquier homólogo y análogo de las mismas. Preferiblemente, tal
fragmento de ARNt sintetasa no incluye una marca His.
Preferiblemente, tal fragmento de ARNt sintetasa es menor de 48 kD,
más preferiblemente menor de 47 kD o más preferiblemente menor de
46 kD. Preferiblemente tal fragmento de ARNt sintetasa es
anti-angiogénico. Tal fragmento de ARNt sintetasa
se puede aislar y/o purificar mediante los procedimientos de este
documento u otros procedimientos conocidos en la técnica.
En algunos casos, una composición de la presente
invención comprende un fragmento de ARNt sintetasa, donde el
fragmento de ARNt sintetasa comprende, está constituido
esencialmente por o como alternativa está constituido por una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de las SEC ID
Nº: 14, 17, 26, 29, 38, 41, 50, 53 y cualquier homólogo y análogo
de las mismas. Preferiblemente, tal fragmento de ARNt sintetasa no
incluye una marca His. Preferiblemente, tal fragmento de ARNt
sintetasa es menor de 53 kD, más preferiblemente menor de 52 kD,
más preferiblemente menor de 51 kD, más preferiblemente menor de 50
kD o más preferiblemente menor de 49 kD. Preferiblemente, tales
fragmentos son mayores de 43 kD. Preferiblemente tal fragmento de
ARNt sintetasa es anti-angiogénico. Tal fragmento
de ARNt sintetasa se puede aislar y/o purificar mediante los
procedimientos de este documento u otros procedimientos conocidos
en la técnica.
Un fragmento de ARNt sintetasa está
preferiblemente aislado. Además, un fragmento de ARNt sintetasa está
preferiblemente purificado. Los procedimientos para purificar un
fragmento de ARNt sintetasa se describen en la Solicitud
Provisional de Estados Unidos Nº 60/598.019.
En algunos casos, una composición que comprende
un fragmento de ARNt sintetasa o un fragmento de ARNt sintetasa
tiene un punto isoeléctrico experimental (pI) de menos de 10,0, más
preferiblemente menos de 9,0 o más preferiblemente menos de 8,0. En
algunos casos, un fragmento de ARNt sintetasa tiene un punto
isoeléctrico de 5,0 a 9,0, más preferiblemente 6,0 a 8,0 o más
preferiblemente 7,4 a 7,8. En algunos casos, un fragmento de ARNt
sintetasa de la invención tiene un pI experimental mayor de 5,0,
5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3,
6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ó 7,5.
Preferiblemente, un fragmento de ARNt sintetasa de la invención
tiene un pI experimental de aproximadamente 7,6. En algunas
realizaciones, un fragmento de ARNt sintetasa de este documento
tiene una hendidura hidrófoba.
Los fragmentos de ARNt sintetasa de este
documento pueden ser monómero o monómeros en un complejo
multi-unidad. Un complejo
multi-unidad puede incluir, por ejemplo, al menos 2,
3, 4, 5 ó 6 monómeros. Tanto el monómero como los complejos
multi-unidad pueden ser solubles y se pueden aislar
o purificar hasta alcanzar la homogeneidad. Un complejo
multi-unidad de la invención comprende al menos dos
unidades de monómero que se asocian entre sí de forma covalente, no
covalente o tanto covalente como no covalentemente. Un complejo
multi-unidad, hecho de monómeros unidos de forma no
covalente, puede romperse en unidades monoméricas individuales en
ciertas condiciones tales como concentraciones de sal altas,
detergente y/o calor. Por lo tanto, para mantener las formaciones
de complejos multi-unidad debe evitarse aplicar
agentes desnaturalizantes al producto, tal como calor sustancial,
detergente y/o concentraciones de sal altas.
Las unidades monoméricas en un complejo
multi-unidad pueden ser diferentes, homólogas,
sustancialmente homólogas o idénticas entre sí. Un complejo
multi-unidad de la invención incluye al menos una,
dos, tres, cuatro, cinco o seis unidades monoméricas que
comprenden, están constituidas esencialmente por o están
constituidas por un fragmento de ARNt sintetasa de este
documento.
Por ejemplo, una composición puede comprender un
dímero, en el que cada unidad monomérica del dímero se selecciona
entre el grupo constituido por las SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41, 48-53
y homólogos y análogos de las mismas. Preferiblemente, una
composición comprende un dímero en el que al menos uno de los dos
monómeros comprende, está constituido esencialmente por o está
constituido por la SEC ID Nº: 24. En algunas realizaciones, las dos
unidades monoméricas de un dímero comprenden, están constituidas
esencialmente por o están constituidas por la SEC ID Nº: 24.
Por ejemplo, la presente invención contempla un
dímero que tiene dos monómeros que son fragmentos T2. La presente
invención describe un dímero que tiene dos monómeros que comprenden,
están constituidos esencialmente por o están constituidos por la
SEC ID Nº: 12, 15, 24, 27, 36, 39, 48, 51 o cualquier homólogo o
análogo de las mismas. La presente invención contempla un dímero
que tiene dos monómeros que comprenden, están constituidos
esencialmente por o están constituidos por la SEC ID Nº: 12, 24, 36,
48 u homólogos o análogos de las mismas. Más preferiblemente, un
dímero de la presente invención comprende, está constituido
esencialmente por o está constituido por la SEC ID Nº: 24 o
cualquier homólogo o análogo de la misma. Preferiblemente, cada
unidad monomérica no incluye una marca His. Opcionalmente, tales
composiciones de dímeros están aisladas y/o purificadas.
Opcionalmente tales composiciones de dímeros son solubles.
Opcionalmente, tales dímeros son homodímeros.
Dos o más monómeros en un complejo
multi-unidad se pueden unir de forma covalente. Los
monómeros unidos de forma covalente se pueden unir directamente
(mediante enlaces) o indirectamente (por ejemplo, mediante un
engarce). Para unir directamente los monómeros de este documento,
puede ser beneficioso modificar los polipéptidos de este documento
para potenciar la dimerización. Por ejemplo, se puede modificar uno
o más restos de aminoácidos de un fragmento de ARNt sintetasa
mediante la adición o sustitución por una o más cisteínas. Un
fragmento de ARNt sintetasa modificado es preferiblemente un
fragmento de triptofanil ARNt sintetasa. Tales fragmentos son
preferiblemente de mamífero o más preferiblemente humanos. Tales
fragmentos tienen actividad angiostática y preferiblemente
comprenden, están constituidos esencialmente por o están
constituidos por un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID
Nº: 12-17, 24-29,
36-41, 48-53 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas. Preferiblemente, tal secuencia de aminoácidos
no incluye una marca His. Los procedimientos para crear
sustituciones de cisteína, tales como mediante mutagénesis dirigida
al sitio, son conocidos para los especialistas en la técnica.
Preferiblemente, tal modificación sucede en el
dominio de dimerización del fragmento de ARNt sintetasa. Un dominio
de dimerización se refiere a ese dominio que forma enlaces
covalentes y/o no covalentes con un segundo monómero. Por ejemplo,
el dominio de dimerización de Trp-RS de longitud
completa (SEC ID Nº: 1) está entre los restos de aminoácido
aproximadamente 230 a aproximadamente 300 o más preferiblemente
entre los restos de aminoácido aproximadamente 237 a
aproximadamente 292. En otro ejemplo, el dominio de dimerización
para un polipéptido de la SEC ID Nº: 13, un T1, está entre los
restos de aminoácido aproximadamente 160 a aproximadamente 230 o
más preferiblemente entre los restos de aminoácido aproximadamente
167 a aproximadamente 222. En otro ejemplo, el dominio de
dimerización para un polipéptido de la SEC ID Nº: 12, 24, 36 ó 42,
un T2, está entre los restos de aminoácido aproximadamente 137 a
aproximadamente 157 o más preferiblemente entre los restos de
aminoácido aproximadamente 144 a aproximadamente 149. Para otros
fragmentos angiogénicos de una ARNt sintetasa, la región de
dimerización puede ser cualquier región que sea homóloga a las
regiones anteriores o la SEC ID Nº: 60.
La adición o sustitución de cisteínas puede
crear puentes disulfuro, que unen dos o más monómeros de forma
covalente. Preferiblemente, dos o más de los polipéptidos
modificados de este documento se unen covalentemente para formar un
complejo multi-unidad (monomérico). Un complejo
multi-unidad comprende al menos dos, tres, cuatro,
cinco o seis monómeros. Los diversos monómeros en un complejo
multi-unidad pueden ser diferentes, homólogos,
sustancialmente homólogos o idénticos entre sí. Opcionalmente, dos o
más de los diversos monómeros en un complejo
multi-unidad son sustancialmente homólogos entre sí
o idénticos entre sí.
Dos o más monómeros también pueden estar unidos
covalentemente mediante un engarce. Un engarce de la presente
invención es preferiblemente lo suficientemente largo como para
permitir que los dos o más monómeros se alineen en orientación
cabeza a cola (extremo N a extremo C). En algunos casos, un engarce
tiene al menos aproximadamente 3, más preferiblemente
aproximadamente 30, más preferiblemente aproximadamente 150, más
preferiblemente aproximadamente 300 o más preferiblemente
aproximadamente 450 átomos de longitud. Las secuencias engarce, que
generalmente están entre 2 y 25 aminoácidos de longitud, se conocen
bien en la técnica e incluyen, aunque sin limitación, la secuencia
espaciadora glicina(4)-serina (GGGGS x3)
descrita por Chaudhary y col. (1989). Estos y otros engarces se
pueden usar en la presente invención.
En algunos casos se puede usar un engarce para
localizar un complejo multi-unidad. Por ejemplo, un
engarce puede comprender, estar constituido esencialmente por o
estar constituido por un fragmento de anticuerpo o agente de unión.
En algunos casos un engarce comprende, está constituido
esencialmente por o está constituido por un anticuerpo o fragmento
de anticuerpo o un agente de unión que se une de forma específica a
un fotorreceptor o a otro receptor localizado en el ojo.
Los ejemplos de enlaces no covalentes
(asociaciones) incluyen enlaces electrostáticos, enlaces iónicos,
enlaces de hidrógeno, enlaces de Van der Waals y efecto
hidrófobo.
Un polipéptido puede ser cualquiera de los
anteriores donde (i) uno o más de los restos de aminoácido se
sustituyen por un resto aminoácido conservado o no conservado
(preferiblemente un resto de aminoácido conservado) y tal resto de
aminoácido sustituido está o no está codificado por el código
genético; (ii) uno o más de los restos de aminoácido incluye un
grupo sustituyente; (iii) el polipéptido está fusionado con otro
compuesto (por ejemplo, un compuesto para aumentar la semivida del
polipéptido o dirigirlo hacia un receptor, célula, tejido u organelo
específico), (iv) los aminoácidos adicionales están fusionados al
polipéptido, tales como una secuencia líder o secretora o una
secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido o una
secuencia pro-proteína; o (v) uno o más de los
restos de aminoácido está sustituido por un resto de aminoácido no
conservado (preferiblemente cisteína) y tal resto de aminoácido
sustituido forma un puente disulfuro con un segundo polipéptido (por
ejemplo, para formar un dímero u homodímero). Tales derivados se
considera que están dentro del alcance de los especialistas en la
técnica a partir de los contenidos de este documento.
Por ejemplo, cualquiera de los polipéptidos de
este documento se puede modificar para mejorar la estabilidad y
aumentar la potencia por medios conocidos en la técnica. Por
ejemplo, los L-aminoácidos pueden reemplazarse por
D-aminoácidos, el extremo amino puede acetilarse o
el extremo carboxilo se puede modificar, por ejemplo, proteger con
etilamina (Dawson, D. W. y col., Mol. Pharmacol., 55:
332-338 (1999)) o glicosilarse.
En otro ejemplo, los polipéptidos de este
documento se pueden fusionar a otra proteína o parte de la misma.
Por ejemplo, el polipéptido mini-TrpRS, T1 o T2 o
parte de los mismos, se pueden unir operativamente a otro resto
polipeptídico para potenciar la solubilidad. En algunos casos, un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende,
está constituida esencialmente por o está constituida por la SEC ID
Nº: 12-17, 24-29,
36-41, 48-53 y cualquier homólogo y
análogo de la misma se une de forma operativa a otro resto
polipeptídico para potenciar la solubilidad. Preferiblemente, tal
polipéptido no incluye una marca His. Los ejemplos de una proteína
que se puede fusionar con mini-TrpRS, T1 o T2 o
parte de los mismos para potenciar la solubilidad incluyen una
proteína plasmática o fragmento de la misma. En otros casos, el
polipéptido mini-TrpRS, T1 o T2 o parte de los
mismos, se pueden unir operativamente a otro resto polipeptídico
para dirigir la molécula a un tejido o tipo celular específico. Por
ejemplo, los polipéptidos mini-TrpRS, T1 o T2 o
parte de los mismos se pueden unir operativamente a un anticuerpo
que se une específicamente a las células fotorreceptoras en el ojo,
una célula tumoral particular o un organelo particular. En algunos
casos, los polipéptidos mini-TrpRS, T1 o T2 se
pueden unir operativamente a un resto polipeptídico que ayuda a
reducir la respuesta inmune, por ejemplo, una región F(c)
constante de una inmunoglobulina.
Opcionalmente, los polipéptidos de este
documento incluyen una secuencia líder. Una secuencia líder se puede
usar para permitir al polipéptido entrar en una célula o
compartimento celular específico. Por tanto, la presente invención
describe un polipéptido que comprende, está constituido
esencialmente por o está constituido por las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y cualquier análogo y homólogo de las mismas
que tienen una secuencia líder. En algunos casos tal polipéptido no
incluye una marca His.
En otro ejemplo, los polipéptidos de este
documento se pueden modificar para una dimerización potenciada. Las
modificaciones que potencian la dimerización de un polipéptido
incluyen alternancias (por ejemplo, sustituciones o adiciones) a la
secuencia de origen natural que potencia las interacciones
covalentes y/o no covalentes del polipéptido con otro monómero.
Preferiblemente las modificaciones se hacen dentro de un dominio de
dimeriza-
ción.
ción.
Para triptofanil-ARNt sintetasa
y fragmentos de la misma, el dominio de dimerización está
aproximadamente entre los restos de aminoácido 230 y 300 o más
preferiblemente aproximadamente entre los restos de aminoácido 237
y 292 de la Trp-tRS de longitud completa (SEC ID Nº:
1). Tales polipéptidos (preferiblemente mini-TrpRS,
T1 y T2) tienen capacidades de dimerización potenciadas. Por tanto,
la presente invención describe un monómero
mini-TrpRS con una adición o sustitución de cisteína
aproximadamente entre los restos de aminoácidos 183 y 253 o más
preferiblemente aproximadamente entre los restos de aminoácido 190 y
245. La presente invención describe un monómero T1 con una adición
o sustitución de cisteína aproximadamente entre los restos de
aminoácido 160 y 230 o más preferiblemente entre los restos de
aminoácido 167 y 222. La presente invención describe un monómero T2
con una adición o sustitución de cisteína aproximadamente entre los
restos de aminoácido 137 y 208 o más preferiblemente entre los
restos de aminoácido 144 y 200.
La presente invención adicionalmente describe
que cualquiera de los polipéptidos modificados con cisteína pueden
dimerizar para formar dímeros de ARNt sintetasa. Preferiblemente,
tal dimerización sucede de forma natural y/o espontáneamente como
resultado de expresar y/o purificar cualquiera del polipéptido o los
polipéptidos anteriores usando un vector que codifica un fragmento
único de ARNt sintetasa y permitiendo que tales fragmentos
expresados formen dímeros de forma natural.
Por tanto, una composición comprende homodímeros
de unidades monoméricas preferiblemente idénticas. Por ejemplo, una
composición comprende un dímero de dos monómeros que tiene la SEC ID
Nº: 12, un dímero de dos monómeros que tiene la SEC ID Nº: 13, un
dímero de dos monómeros que tiene la SEC ID Nº: 14, un dímero de dos
monómeros que tiene la SEC ID Nº: 15, un dímero de dos monómeros
que tiene la SEC ID Nº: 16, un dímero de dos monómeros que tiene la
SEC ID Nº: 17, un dímero de dos monómeros que tiene la SEC ID Nº:
24, un dímero de dos monómeros que tiene la SEC ID Nº: 25, un
dímero de dos monómeros que tiene la SEC ID Nº: 26, un dímero de dos
monómeros que tiene la SEC ID Nº: 27, un dímero de dos monómeros
que tiene la SEC ID Nº: 28, un dímero de dos monómeros que tiene la
SEC ID Nº: 29, un dímero de dos monómeros que tiene la SEC ID Nº:
36, un dímero de dos monómeros que tiene la SEC ID Nº: 37, un
dímero de dos monómeros que tiene la SEC ID Nº: 38, un dímero de dos
monómeros que tiene la SEC ID Nº: 39, un dímero de dos monómeros
que tiene la SEC ID Nº: 40, un dímero de dos monómeros que tiene la
SEC ID Nº: 41, un dímero de dos monómeros que tiene la SEC ID Nº:
48, un dímero de dos monómeros que tiene la SEC ID Nº: 49, un
dímero de dos monómeros que tiene la SEC ID Nº: 50, un dímero de dos
monómeros que tiene la SEC ID Nº: 51, un dímero de dos monómeros
que tiene la SEC ID Nº: 52 o un dímero de dos monómeros que tiene
la SEC ID Nº: 53.
Una composición de este documento comprende una
combinación de cualquiera de los homodímeros idénticos anteriores.
Por ejemplo, una composición puede comprender un dímero de dos
monómeros que tiene la SEC ID Nº: 12 y un dímero de dos monómeros
que tiene la SEC ID Nº: 24. También se contemplan todas las
combinaciones diferentes de los dímeros anteriores.
La presente invención proporciona una
composición que comprende un primer fragmento de ARNt sintetasa y un
segundo fragmento de ARNt sintetasa, en la que el primer fragmento
de ARNt sintetasa tiene una metionina en su extremo N ("fragmento
Met-tRS") y en la que la segunda ARNt sintetasa
no tiene una metionina en su extremo N ("fragmento
no-Met-tRS").
Preferiblemente, los fragmentos de ARNt
sintetasa de este documento son fragmentos de
triptofanil-ARNt sintetasa. En algunas de tales
realizaciones, un primer fragmento de ARNt sintetasa que tiene una
metionina en su extremo N es un "fragmento
Met-TrpRS" y el segundo fragmento de ARNt
sintetasa que no tiene una metionina en su extremo N es un
"fragmento no-Met-TrpRS".
Los ejemplos de fragmentos
Met-TrpRS o fragmentos de
triptofanil-ARNt sintetasa que tienen una metionina
en sus extremos N incluyen polipéptidos que comprenden, están
constituidos esencialmente por o están constituidos por una
secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº: 15-17,
27-29, 39-41, 51-53
o cualquier homólogo, análogo o fragmento de las mismas.
Preferiblemente, tales fragmentos no incluyen una marca His.
Los ejemplos de fragmentos de
Trp-RS o fragmentos de triptofanil ARNt sintetasa
que no tienen metionina en sus extremos N, incluyen polipéptidos
que comprenden, están constituidos esencialmente por o están
constituidos por las SEC ID Nº: 12-14,
24-26, 36-38, 48-50
o cualquier homólogo, análogo o fragmento de las mismas. También se
contemplan en este documento todos los otros fragmentos
angiostáticos de Trp-ARNt sintetasa.
Preferiblemente, tales fragmentos no incluyen una marca His.
En algunos casos, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 15 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
la misma. Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
El segundo fragmento de ARNt sintetasa puede ser un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está constituida
esencialmente por o está constituida por la SEC ID Nº: 12 o
cualquier homólogo, análogo o fragmento de la misma.
Preferiblemente tal fragmento no incluye una marca His.
En algunos casos, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 16 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
la misma. Preferiblemente tal fragmento no incluye una marca His. El
segundo fragmento de ARNt sintetasa puede ser un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está constituida
esencialmente por o está constituida por la SEC ID Nº: 13 o
cualquier homólogo, análogo o fragmento de la misma.
Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
En algunos casos, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 17 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
la misma. Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
El segundo fragmento de ARNt sintetasa puede ser un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está constituida
esencialmente por o está constituida por la SEC ID Nº: 14 o
cualquier homólogo, análogo o fragmento de la misma.
Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
En algunos casos, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 27 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
la misma. Preferiblemente tal fragmento no incluye una marca His. El
segundo fragmento de ARNt sintetasa puede ser un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está constituida
esencialmente por o está constituida por la SEC ID Nº: 24 o
cualquier homólogo, análogo o fragmento de la misma.
Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
En algunos casos, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 28 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
la misma. Preferiblemente tal fragmento no incluye una marca His. El
segundo fragmento de ARNt sintetasa puede ser un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está constituida
esencialmente por o está constituida por la SEC ID Nº: 25 o
cualquier homólogo, análogo o fragmento de la misma.
Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
En algunos casos, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 29 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
la misma. Preferiblemente tal fragmento no incluye una marca His. El
segundo fragmento de ARNt sintetasa puede ser un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está constituida
esencialmente por o está constituida por la SEC ID Nº: 26 o
cualquier homólogo, análogo o fragmento de la misma.
Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
En algunos casos, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 39 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
la misma. Preferiblemente tal fragmento no incluye una marca His. El
segundo fragmento de ARNt sintetasa puede ser un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está constituida
esencialmente por o está constituida por la SEC ID Nº: 36 o
cualquier homólogo, análogo o fragmento de la misma.
Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
En algunos casos, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 40 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
la misma. Preferiblemente tal fragmento no incluye una marca His. El
segundo fragmento de ARNt sintetasa puede ser un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está constituida
esencialmente por o está constituida por la SEC ID Nº: 37 o
cualquier homólogo, análogo o fragmento de la misma.
Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
En algunos casos, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 41 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
la misma. Preferiblemente tal fragmento no incluye una marca His. El
segundo fragmento de ARNt sintetasa puede ser un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está constituida
esencialmente por o está constituida por la SEC ID Nº: 38 o
cualquier homólogo, análogo o fragmento de la misma.
Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
En algunos casos, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 51 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
la misma. Preferiblemente tal fragmento no incluye una marca His. El
segundo fragmento de ARNt sintetasa puede ser un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está constituida
esencialmente por o está constituida por la SEC ID Nº: 48 o
cualquier homólogo, análogo o fragmento de la misma.
Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
En algunos casos, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 52 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
la misma. Preferiblemente tal fragmento no incluye una marca His. El
segundo fragmento de ARNt sintetasa puede ser un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está constituida
esencialmente por o está constituida por la SEC ID Nº: 49 o
cualquier homólogo, análogo o fragmento de la misma.
Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
En algunos casos, el primer fragmento de ARNt
sintetasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 53 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
la misma. Preferiblemente tal fragmento no incluye una marca His. El
segundo fragmento de ARNt sintetasa puede ser un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está constituida
esencialmente por o está constituida por la SEC ID Nº: 50 o
cualquier homólogo, análogo o fragmento de la misma.
Preferiblemente, tal fragmento no incluye una marca His.
En algunos casos de este documento que contienen
un primer fragmento de ARNt sintetasa que tiene una metionina en su
extremo N y un segundo fragmento de ARNt sintetasa que no tiene una
metionina en su extremo N, el primer fragmento de ARNt sintetasa
puede comprender aproximadamente el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el
25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el
65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% en peso de la
cantidad total de fragmentos de ARNt sintetasa. En otros casos, el
primer fragmento de ARNt sintetasa comprende menos de
aproximadamente el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el
35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el
75%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% en peso de la cantidad total
de fragmentos de ARNt sintetasa.
En algunos casos de este documento que contienen
un primer fragmento de ARNt sintetasa que tiene una metionina en su
extremo N y un segundo fragmento de ARNt sintetasa que no tiene una
metionina en su extremo N, el segundo fragmento de ARNt sintetasa
comprende aproximadamente el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el
30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el
70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de peso de la cantidad
total de fragmentos de ARNt sintetasa. En otros casos, el segundo
fragmento de ARNt sintetasa que no tiene una metionina en su
extremo N comprende al menos aproximadamente el 5%, el 10%, el 15%,
el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el
60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% en
peso de la cantidad total de fragmentos de ARNt sintetasa.
El término "aproximadamente" como se usa
para describir un porcentaje en peso de una composición se refiere
al porcentaje en peso +/- el 4, el 3, el 2 o el 1%.
Una composición puede comprender aproximadamente
el 50% en peso de un primer fragmento de ARNt sintetasa y
aproximadamente el 50% en peso de un segundo fragmento de ARNt
sintetasa. Por ejemplo, una composición comprende aproximadamente
el 50% en peso de un fragmento Met-tRS y
aproximadamente el 50% en peso de un fragmento
no-Met-tRS. En algunos casos, una
composición comprende aproximadamente el 50% en peso de un fragmento
Met-TrpRS y aproximadamente el 50% en peso de un
fragmento no-Met-TrpRS. En otros
casos, más del 50% de una composición comprende un fragmento
Met-Trp-RS o un fragmento
no-Met-Trp-RS.
Preferiblemente, los fragmentos anteriores no incluyen una marca
His.
Cualquiera de las composiciones anteriores puede
comprender adicionalmente un agente terapéutico, tal como un agente
anti-neoplásico, un agente
anti-inflamatorio, un agente
anti-bacteriano, un agente angiogénico, un agente
antiviral y un agente anti-angiogénico. Los ejemplos
de tales agentes se describen en este documento. Preferiblemente,
el agente terapéutico es un agente anti-angiogénico
y es un antagonista de VEGF o un antagonista de integrina.
En otro aspecto, la invención proporciona un
péptido que comprende, está constituido esencialmente por o está
constituido por una porción que lleva un epítope de los polipéptidos
descritos en este documento. El término "epítope" como se usa
en este documento, se refiere a una porción de un polipéptido que
tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal,
preferiblemente un mamífero y más preferiblemente en un ser humano.
Los péptidos que llevan epítopes antigénicos de los polipéptidos de
la invención son útiles para inducir anticuerpos, incluyendo
anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un
polipéptido de la invención. La expresión "epítope antigénico"
como se usa en este documento, se define como una porción de una
proteína a la que un anticuerpo puede unir de forma específica su
antígeno como se determina mediante cualquier procedimiento bien
conocido en la técnica, por ejemplo, mediante los
inmunoensayos.
Los polipéptidos que llevan epítopes antigénicos
de la invención contienen preferiblemente una secuencia de al menos
aproximadamente cinco o aproximadamente siete, más preferiblemente
al menos aproximadamente nueve o aproximadamente once aminoácidos y
más preferiblemente de al menos aproximadamente 5 a aproximadamente
30 o más preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente
20 aminoácidos contenidos dentro de un fragmento de ARNt sintetasa
o más preferiblemente un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa.
Tales fragmentos son preferiblemente de mamífero o más
preferiblemente humanos. Los fragmentos de ARNt de este documento
tienen actividad angiostática. Los ejemplos de fragmentos de
triptofanil ARNt sintetasa humana con actividad angiostática
incluyen, aunque sin limitación las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y homólogos y análogos de las mismas. En este
contexto "aproximadamente" incluye el valor particularmente
numerado y valores mayores o menores en varios aminoácidos (5, 4, 3,
2 ó 1).
En algunos casos, tales polipéptidos que llevan
epítopes son "epítopes de extremo N". La frase "epítope de
extremo N" como se usa en este documento se refiere a un péptido
que tiene una secuencia de aminoácidos que está más próxima al
extremo N que al extremo C de un polipéptido de la invención (por
ejemplo, SEC ID Nº: 12-17, 24-29,
36-41, 48-53 y homólogos y análogos
de las mismas). En algunos casos, tales polipéptidos que llevan
epítopes comprenden o están constituidos por el extremo N de un
polipéptido de la invención (por ejemplo, SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y homólogos y análogos de las mismas).
Los ejemplos de tales polipéptidos que llevan
epítopes incluyen polipéptidos que comprenden o como alternativa
están constituidos por: restos de aminoácido de aproximadamente 1 a
aproximadamente 5, aproximadamente 1 a aproximadamente 15 o
aproximadamente 1 a aproximadamente 25 de las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y cualquier homólogo o análogo de las mismas;
restos de aminoácido de aproximadamente 10 a aproximadamente 15,
aproximadamente 10 a aproximadamente 25 o aproximadamente 10 a
aproximadamente 35 de las SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41, 48-53
y homólogos o análogos de las mismas; restos de aminoácido de
aproximadamente 20 a aproximadamente 25, aproximadamente 20 a
aproximadamente 35 o aproximadamente 20 a aproximadamente 45 de las
SEC ID Nº: 12-17, 24-29,
36-41, 48-53 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas.
Los polipéptidos anteriores se pueden usar para
propósitos de investigación (por ejemplo, para distinguir entre un
fragmento y otro), para propósitos de diagnóstico (por ejemplo para
identificar y cuantificar fragmentos angiogénicos/angiostáticos);
y/o para propósitos terapéuticos (por ejemplo, para inhibir la
actividad angiostática de un fragmento angiostático de ARNt
sintetasa).
Por ejemplo, los anticuerpos de la presente
invención pueden distinguir entre dos cualquiera de los siguientes:
TrpRS, mini-TrpRS, T1 y T2. En algunos casos, los
anticuerpos de la presente invención pueden distinguir entre un
fragmento de ARNt sintetasa que tiene y que no tiene metionina en su
extremo N. (Por ejemplo, un anticuerpo puede distinguir entre las
SEC ID Nº: 12 y 15; o entre las SEC ID Nº: 13 y 16; o entre las SEC
ID Nº: 14 y 17; u homólogos o análogos de las mismas). En algunos
casos, los anticuerpos de la presente invención pueden distinguir
entre dos variantes de un fragmento de ARNt sintetasa. (Por ejemplo,
un anticuerpo de la presente invención puede distinguir entre dos
polipéptidos seleccionados entre el siguiente grupo: SEC ID Nº: 12,
24, 36 y 48).
Otros anticuerpos que se unen al dominio de
dimerización o al dominio de unión al receptor también pueden ser
útiles como agentes terapéuticos para tratar o prevenir una afección
asociada con el crecimiento vascular disminuido (una afección
anti-angiogénica).
Además, el calibrado de la cantidad de
fragmentos de ARNt que son angiogénicos y/o no angiogénicos puede
permitir el diagnóstico de una afección mediada por
angiogénesis.
La presente invención también describe
polinucleótidos que codifican estos péptidos que llevan epítopes
antigénicos.
Los polipéptidos que llevan epítopes se pueden
usar para inducir anticuerpos de acuerdo con procedimientos bien
conocidos en la técnica que incluyen, aunque sin limitación,
inmunización in vivo, inmunización in vitro y
procedimientos de presentación en fago.
Si se usa inmunización in vivo, los
animales pueden inmunizarse con péptido libre; sin embargo, puede
reforzarse el título de anticuerpos anti-péptido
acoplando el péptido a un vehículo macromolecular, tal como
hemocianina de lapa californiana (KLH) o toxoide tetánico. Por
ejemplo, los péptidos que contienen restos de cisteína se pueden
acoplar a un vehículo usando un engarce tal como éster de
maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), mientras que
otros péptidos se pueden acoplar a vehículos usando un agente de
unión más general tal como glutaraldehído.
Para preparar un anticuerpo policlonal, se
inmunizan animales tales como, por ejemplo, conejos, ratas y ratones
con péptidos libres o acoplados a vehículo, por ejemplo, por
inyección intraperitoneal y/o intradérmica de emulsiones que
contienen aproximadamente 100 microgramos de un péptido que lleva
epítopes y posiblemente un vehículo proteico y adyuvante de Freund
o cualquier otro adyuvante que se conoce que estimula una respuesta
inmune. Pueden ser necesarias varias inyecciones de refuerzo, por
ejemplo, a intervalos de aproximadamente dos semanas para
proporcionar un título útil de anticuerpo
anti-péptido que se pueda detectar, por ejemplo,
por ensayo ELISA usando péptido libre adsorbido a una superficie
sólida. El título de anticuerpos anti-péptido en el
suero de un animal inmunizado se puede aumentar por selección de
anticuerpos anti-péptido, por ejemplo, por
adsorción al péptido sobre un soporte sólido y elución de los
anticuerpos seleccionados de acuerdo con procedimientos bien
conocidos en la técnica.
Más preferiblemente, la presente invención
describe anticuerpos monoclonales que son capaces de unirse de
forma específica a uno o más de los polipéptidos de este documento.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar fácilmente a través
del uso de técnicas bien conocidas tales como las ilustradas en la
Patentes de Estados Unidos Nº 4.196.265. Típicamente, una técnica
implica inmunizar en primer lugar a un animal adecuado con un
antígeno seleccionado (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido
de la presente invención) de manera suficiente para proporcionar
una respuesta inmune. Los roedores tales como ratones y ratas son
animales preferidos. Las células del bazo de los animales
inmunizados se fusionan después con células de un mieloma celular
inmortal. Cuando el animal inmunizado es un ratón, una célula de
mieloma preferida es una célula de mieloma NS-1
murina.
Las células de bazo/mieloma fusionadas se
cultivan en un medio selectivo para seleccionar células de
bazo/mieloma fusionadas a partir de las células parentales. Las
células fusionadas se separan de la mezcla de células parentales no
fusionadas, por ejemplo, mediante la adición de agentes que bloquean
la síntesis de novo de nucleótidos en el medio de
cultivo tisular. Este cultivo proporciona una población de
hibridomas a partir de la cual se seleccionan los hibridomas
específicos. Típicamente, la selección de hibridomas se realiza
cultivando las células por dilución de clon único en placas de
microtitulación, seguido del ensayo de los sobrenadantes clonales
individuales para determinar la reactividad con
antígeno-polipéptido. Los clones seleccionados se
pueden propagar después de forma indefinida para proporcionar el
anticuerpo monoclonal. Preferiblemente, un anticuerpo monoclonal
también está humanizado.
Como apreciará un especialista en la técnica y
como se ha analizado anteriormente, los polipéptidos que comprenden
un epítope inmunogénico o antigénico se pueden fusionar con otras
secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden
fusionar con el dominio constante de inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgG
o IgM) o porciones del mismo (CH1, CH2, CH3 o cualquier combinación
de los mismos y porciones de los mismos) dando como resultado
polipéptidos quiméricos. Tales proteínas de fusión pueden facilitar
la purificación y pueden aumentar la semivida in vivo.
La presente invención también describe
fragmentos, regiones o derivados de los anticuerpos anteriores.
Tales fragmentos incluyen cadenas pesadas, cadenas ligeras, Fab,
Fab', F(ab')2, Fabc y Fv diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también proporciona
secuencias polinucleotídicas que codifican cualquiera de los
polipéptidos de este documento. En algunos casos, una secuencia
polinucleotídica codifica dos o más de los polipéptidos de este
documento. Preferiblemente, las secuencias polinucleotídicas están
aisladas.
Por ejemplo, la presente invención proporciona
secuencias polinucleotídicas que codifican uno o más, o dos o más
fragmentos de ARNt sintetasa. Los fragmentos de ARNt sintetasa
pueden ser fragmentos de una cualquiera o más de las ARNt
sintetasas conocidas en la técnica, pero más preferiblemente una
triptofanil ARNt sintetasa o una tirosil ARNt sintetasa. Una ARNt
sintetasa de la presente invención es preferiblemente de mamífero o
más preferiblemente humana. Además, los fragmentos de tales ARNt
sintetasa preferiblemente tienen actividad angiostática.
Por ejemplo, en algunos casos una secuencia
polinucleotídica codifica uno o más fragmentos angiostáticos de una
ARNt sintetasa. Los ejemplos de fragmentos angiostáticos de una
triptofanil ARNt sintetasa incluyen mini-TrpRS, T1
y T2 y cualquier fragmento angiostático, homólogo o análogo de los
mismos. Por tanto, en algunos casos un polinucleótido codifica un
fragmento de triptofanil ARNt sintetasa que comprende, está
constituido esencialmente por o está constituido por un polipéptido
seleccionado entre el grupo constituido por las SEC ID Nº:
12-17, 24-29,
36-41, 48-53 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas. Preferiblemente, un polinucleótido codifica
un fragmento de triptofanilo que comprende, que está constituido
esencialmente por o está constituido por la SEC ID Nº: 24 ó 27.
Los ejemplos de secuencias polinucleotídicas que
codifican tales fragmentos son la secuencia polinucleotídica de las
SEC ID Nº: 18-23, 30-35,
42-47, 54-59 y homólogos y análogos
de las mismas. Los ejemplos adicionales de polinucleótidos aislados
incluyen los polinucleótidos de las SEC ID Nº:
70-75.
Puesto que el código del ADN está degenerado, de
modo que más de un codón puede codificar un único resto de
aminoácido, las secuencias polinucleotídicas anteriores son
ilustrativas y no tienen por objeto ser limitantes de ningún modo.
Cualquiera de los polinucleótidos anteriores está preferiblemente
aislado.
En algunos casos, una secuencia polinucleotídica
de la presente invención codifica dos o más de los polipéptidos de
este documento. Por ejemplo, un polinucleótido de la presente
invención puede codificar un primer fragmento de ARNt sintetasa y
un segundo fragmento de ARNt sintetasa. El primer fragmento de ARNt
sintetasa puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos que comprende, está constituida esencialmente por o
está constituida por las SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41, 48-53
u homólogos o análogos de las mismas. El segundo fragmento de ARNt
sintetasa puede ser un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos que comprende, está constituida esencialmente por o
está constituida por las SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41, 48-53
u homólogos o análogos de las mismas. El primer y segundo
fragmentos de ARNt sintetasa pueden ser diferentes, homólogos,
sustancialmente homólogos o idénticos.
En algunos casos, las secuencias de nucleótidos
que codifican dos o más copias de una secuencia polipeptídica
pueden estar fusionadas en tándem. Cuando dos secuencias de
nucleótidos que codifican polipéptidos se fusionan en tándem, cada
polipéptido puede tener su propia orientación de modo que cuando las
dos secuencias de nucleótidos se expresan los polipéptidos
codificados pueden dar como resultado una conexión terminal
C-N, N-N, C-C o
C-N. En casos preferidos, la expresión de las
secuencias de nucleótidos de este documento da como resultado que
el extremo N del segundo polipéptido esté covalentemente unido al
extremo C del primer polipéptido.
En algunos casos, una secuencia polinucleotídica
que codifica dos o más fragmentos de ARNt sintetasa puede codificar
también un engarce. Una secuencia de nucleótidos que codifica un
engarce se puede insertar entre dos secuencias de nucleótidos de
fragmentos de ARNt sintetasa. Una secuencia de nucleótidos que
codifica un engarce puede ser lo suficientemente larga como para
permitir que un primer fragmento de ARNt sintetasa y un segundo
fragmento de ARNt sintetasa se dispongan de forma productiva y
dimericen entre sí. En algunos casos, una secuencia de nucleótidos
que codifica un engarce es de al menos 9, al menos 30, al menos
aproximadamente 60, al menos aproximadamente 90, al menos
aproximadamente 120, al menos aproximadamente 150, al menos
aproximadamente 180, al menos aproximadamente 210, al menos
aproximadamente 240, al menos aproximadamente 270 o al menos
aproximadamente 300 nucleótidos de longitud.
En algunos casos, una secuencia polinucleotídica
que codifica un primer fragmento de ARNt sintetasa se puede
insertar dentro de una secuencia polinucleotídica que codifica un
segundo fragmento de ARNt sintetasa. Esto dará como resultado la
traducción de un primer segmento del primer fragmento de ARNt
sintetasa, la traducción completa del segundo fragmento de ARNt
sintetasa y después la traducción del segmento restante del primer
fragmento de ARNt sintetasa.
En algunos casos, una secuencia polinucleotídica
de este documento codifica un fragmento de ARNt sintetasa
modificado. Un ejemplo de un fragmento de ARNt sintetasa modificado
es uno en el que el fragmento se ha modificado (por ejemplo, por
adición o sustitución de aminoácidos) para insertar una o más
cisteínas de origen no natural en el fragmento. Preferiblemente, el
fragmento de ARNt sintetasa es un fragmento de triptofanil ARNt
sintetasa o más preferiblemente un fragmento seleccionado entre el
grupo constituido por las SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41,48-53
y cualquier homólogo o análogo de las mismas.
Preferiblemente, se insertan una cisteína o
cisteínas de origen no natural (por ejemplo, por adición o
sustitución) en el dominio de dimerización del fragmento. La
inserción de una cisteína de este tipo se puede realizar en el
nivel de ácido nucleico usando tecnología recombinante. Las
secuencias de ácido nucleico que se pueden modificar mediante la
siguiente invención para incluir cisteínas incluyen, aunque sin
limitación, las SEC ID Nº: 18-23,
30-35, 42-47, 54-59
y cualquier homólogo y análogo de las mismas.
En algunos casos, un polinucleótido de la
invención codifica dos o más fragmentos de ARNt sintetasa
modificados. Por ejemplo, un polinucleótido puede codificar 2 o más
fragmentos de triptofanil ARNt sintetasa donde cada fragmento se
modifica para incluir al menos una cisteína de origen no natural en
su dominio de dimerización. Los ejemplos de fragmentos de
triptofanil ARNt sintetasa que se pueden modificar del siguiente
modo incluyen, aunque sin limitación, las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y cualquier homólogo o análogo de las
mismas.
Cualquiera de los polinucleótidos de este
documento está fusionado preferiblemente en la misma fase de lectura
a una secuencia polinucleotídica que ayuda a la expresión y
secreción de un polipéptido desde una célula huésped. Esto da como
resultado un vector de expresión. Se puede usar un vector de
expresión para expresar los polinucleótidos en una célula
huésped.
En algunos casos, se puede fusionar una
secuencia líder que funciona como una secuencia de secreción para
controlar el transporte de un polipéptido desde la célula después de
la secuencia de fase de lectura abierta. Un polipéptido que tiene
una secuencia líder es una pre-proteína y puede
haberse escindido la secuencia líder por medio de la célula huésped
para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos
también pueden codificar una pro-proteína que es la
proteína madura más restos de aminoácido 5' adicionales. Una
proteína madura que tiene una prosecuencia es una
pro-proteína y es una forma inactiva de la proteína.
Una vez que la prosecuencia se ha escindido, permanece una proteína
madura activa. Por tanto, por ejemplo, el polinucleótido de la
presente invención puede codificar una proteína madura o una
proteína que tiene una prosecuencia o una proteína que tiene tanto
una prosecuencia como una presecuencia (secuencia líder).
Preferiblemente, cuando una secuencia polinucleotídica de la
presente invención codifica una prosecuencia, tal prosecuencia se
escinde en el humor vítreo del ojo o en una célula cancerosa o
tumor diana.
En algunos casos, las pre o
pro-secuencias codifican anticuerpos o fragmentos de
anticuerpo que se unen a una célula diana (por ejemplo,
fotorreceptores). De nuevo, la pre o pro-secuencia
puede incluir un sitio de escisión por proteasas que permitirá que
la secuencia se escinda automáticamente después de alcanzar su sitio
deseado, activando de este modo las composiciones de este
documento.
Los polinucleótidos también pueden tener la
secuencia codificante fusionada en fase a una secuencia marcadora
que permite la purificación del polipéptido. La secuencia marcadora
puede ser una marca de hexa-histidina aportada por
un vector pQE-9 para proporcionar la purificación
del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un
huésped bacteriano o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser
una marca de hemaglutinina (HA) cuando se usa un huésped mamífero,
por ejemplo, células COS-7. La marca de HA
corresponde a un epítope obtenido de la proteína hemaglutinina de la
gripe. (Wilson, I y col., Cell, 37: 767 (1984)).
La presente invención describe adicionalmente
polinucleótidos que hibridan con cualquiera de las secuencias
descritas en este documento, preferiblemente en condiciones
rigurosas. Una condición rigurosa se refiere a una condición que
permite a los dúplex de ácido nucleico distinguirse en base a su
grado de desapareamiento. Tales polinucleótidos (por ejemplo,
antisentido y ARNi) se pueden usar para inhibir la expresión de un
fragmento de ARNt angiostático o fragmento de ARNt angiogénico
dependiendo del resultado deseado. Tales polinucleótidos también
pueden servir como sondas y cebadores para propósitos de
investigación y diagnóstico.
Los ácidos nucleicos antisentido son secuencias
de nucleótidos que son complementarias a la hebra codificante de
una molécula de ADNc bicatenaria o a una secuencia de ARNm de una
secuencia de nucleótidos diana, que codifican preferiblemente un
factor de angiogénesis positivo, por ejemplo, VEGF. Los ácidos
nucleicos antisentido se pueden usar como un agente para inhibir la
angiogénesis en los procedimientos descritos en este documento. Los
mismos inhiben la traducción formando enlaces de hidrógeno con un
ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser
complementario a una región codificante angiogénica completa (por
ejemplo, VEGF) o solamente a una porción de la misma.
Un oligonucleótido antisentido de este documento
puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30,
35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Un ácido nucleico
antisentido se puede construir usando reacciones de síntesis
química y de ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos
en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por
ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse
químicamente usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos
modificados de diversas maneras diseñados para aumentar la
estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la
estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos
antisentido y sentido, por ejemplo, se pueden usar derivados de
fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Los ejemplos
de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar el ácido
nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo,
5-bromouracilo, 5-clorouracilo,
5-yodouracilo, hipoxantina, xantina,
4-acetilcitosina,
5-(carboxihidroxilmetil)uracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tiouridina,
5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,
\beta-D-galactosilqueosina,
inosina, N6-isopenteniladenina,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina,
2-metilguanina, 3-metilcitosina,
5-metilcitosina, N6-adenina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metoxiaminometil-2-tiouracilo,
\beta-D-manosilqueosina,
5'-metoxicarboximetiluracilo,
5-metoxiuracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
ácido uracil-5-oxiacético (v),
wybutoxosina, pseudouracilo, queosina,
2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, metiléster del ácido
uracil-5-oxiacético, ácido
uracil-5-oxiacético (v),
5-metil-2-tiouracilo,
3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo,
(acp3)w y 2,6-diaminopurina. Como
alternativa, el ácido nucleico antisentido se puede producir de
forma biológica usando un vector de expresión en el que se ha
subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es
decir, el ARN trascrito a partir del ácido nucleico insertado será
de orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana
de interés).
En algunos casos se pueden usar ácidos nucleicos
bicatenarios para silenciar genes asociados con la angiogénesis
(por ejemplo, triptofanil ARNt sintetasa y/o tirosil ARNt sintetasa)
por ARN de interferencia. El ARN de interferencia ("ARNi") es
un mecanismo de silenciamiento de genes
post-transcripcional en el que se introduce un ARN
bicatenario (ARNds) correspondiente a un gen (o región codificante)
de interés en una célula u organismo dando como resultado la
degradación del ARNm correspondiente. El efecto del ARNi persiste
durante múltiples divisiones celulares antes de que se recupere la
expresión génica. El ARNi es, por lo tanto, un procedimiento
extremadamente poderoso para preparar knockouts dirigidos o
"knockdowns" en el nivel de ARN. El ARNi ha demostrado tener
éxito en células humanas, incluyendo células de riñón embrionario
humano y células HeLa (véase, por ejemplo, Elbashir y col. Nature
24 de mayo de 2001; 411(6836): 494-8).
En un caso, la transfección de pequeños ARNds
(menos de 50, más preferiblemente 40, más preferiblemente 30 o más
preferiblemente 20 nucleótidos (nt)) inhibe de forma específica la
expresión génica (revisado en Caplen (2002) Trends in Biotechnology
20: 49-51). En resumen, se piensa que ARNi funciona
de la siguiente manera. El ARNds correspondiente a una porción de
un gen a silenciar se introduce en una célula. El ARNds se digiere
en pequeños nucleótidos de ARNds, ARNsi o pequeños ARN de
interferencia. Los dúplex de ARNsi se unen a un complejo de
nucleasa para formar lo que se conoce como el complejo de
silenciamiento inducido por ARN o RISC. El RISC dirige al trascrito
homólogo mediante interacciones de apareamiento de bases entre una
de las hebras de ARNsi y el ARNm endógeno. Después escinde el ARNm
a aproximadamente 12 nucleótidos del extremo 3' del ARNsi (revisado
en Sharp y col. (2001) Genes Dev 15: 485-490; y
Hammond y col. (2001) Nature Rev Gen 2:
110-119).
La tecnología de ARNi en el silenciamiento de
genes utiliza procedimientos convencionales de biología molecular.
Se puede producir ARNds correspondiente a la secuencia a partir de
un gen diana que se tiene que inactivar mediante procedimientos
convencionales, por ejemplo, mediante trascripción simultánea de
ambas hebras de un ADN de molde (correspondiente a la secuencia
diana) con ARN polimerasa T7. Los kits para la producción de ARNds
para su uso en ARNi están disponibles en el mercado, por ejemplo, de
New England Biolabs, Inc. Los procedimientos de transfección de
ARNds o plásmidos modificados por ingeniería genética para fabricar
ARNds son rutinarios en la técnica.
Se han presentado efectos del silenciamiento de
genes similares a los de ARNi en células de mamífero con
transfección de una construcción híbrida de
ARNm-ADNc (Lin y col., Biochem Biophys Res Commun 2
de marzo de 2001; 281(3): 639-44),
proporcionando otra estrategia más para el silenciamiento de genes.
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a
procedimientos para modular la angiogénesis poniendo en contacto una
célula o tejido con un ARNi o antisentido complementario a una ARNt
sintetasa (por ejemplo, TyrRS o TrpRS) o un fragmento de la misma.
Por ejemplo, un antisentido o ARNi puede ser complementario a una
secuencia polinucleotídica seleccionada entre el grupo constituido
por las SEC ID Nº: 18-23, 30-35,
42-47, 54-60 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas.
Los polinucleótidos se proporcionan
preferiblemente en forma aislada y preferiblemente se purifican
hasta homogeneidad.
La presente invención también proporciona
vectores (preferiblemente vectores de expresión) que incluyen
polinucleótidos, células huésped que están modificadas
genéticamente con vectores y la producción de polipéptidos mediante
técnicas recombinantes.
Los vectores se pueden construir usando técnicas
recombinantes convencionales ampliamente disponibles para un
especialista en la técnica. Tales técnicas pueden encontrarse en
referencias de biología molecular comunes tales como Sambrook y
col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989), D. Goeddel, ed., Gene Expression
Technology, Methods in Enzymology series, Vol. 185, Academic Press,
San Diego, Calif. (1991), e Innis y col. PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications Academic Press, San Diego, Calif.
(1990).
La presente invención contempla la construcción
recombinante de un vector que comprende uno o más, o más
preferiblemente dos o más, de las secuencias polinucleotídicas
descritas anteriormente. Las construcciones comprenden un vector,
tal como un vector plasmídico o viral en el que se insertan una o
más, o más preferiblemente dos o más secuencias polinucleotídicas
de la invención, en orientación directa o inversa. Preferiblemente,
se insertan dos secuencias polinucleotídicas en un vector en
tándem. Las secuencias polinucleotídicas pueden ser adyacentes entre
sí o estar separadas por un engarce.
Las células huésped son células que expresan las
secuencias de nucleótidos descritas en este documento. Los ejemplos
representativos de huéspedes apropiados incluyen células
bacterianas, tales como E. coli, Salmonella typhimurium y
Streptomyces; células fúngicas, tales como levaduras; células
de insecto, tales como Drosophila y Sf9; células animales
tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; células vegetales, etc. La
selección de un huésped apropiado se considera que está dentro del
alcance de los especialistas en la técnica a partir de los
contenidos de este documento.
Hay disponibles para un especialista en la
técnica múltiples procedimientos virales y no virales adecuados
para introducir tales secuencias de nucleótidos en una célula
huésped diana.
Los procedimientos de transducción viral pueden
comprender el uso de un virus ADN o ARN recombinante que comprende
una secuencia de ácido nucleico que dirige o inhibe la expresión de
una proteína que tiene actividad sialiltransferasa para infectar
una célula diana. Un virus ADN adecuado para uso en la presente
invención incluye, aunque sin limitación, un adenovirus (Ad), virus
adenoasociado (AAV), herpes virus, virus vaccinia o un poliovirus.
Un virus ARN adecuado para su uso en la presente invención incluye,
aunque sin limitación, un retrovirus o virus Sindbis. Los
especialistas en la técnica apreciarán que existen varios de tales
virus ARN y ADN que pueden ser adecuados para su uso en la presente
invención.
Las técnicas de suministro "no viral" que
se han usado o propuesto para terapia génica incluyen complejos de
ADN-ligando, complejos
adenovirus-ligando-ADN, inyección
directa de ADN, precipitación con CaPO_{4}, técnicas con pistola
génica, electroporación, liposomas y lipofección. Cualquiera de
estos procedimientos está ampliamente disponible para un
especialista en la técnica y sería adecuado para su uso en la
presente invención. Están disponibles otros procedimientos
adecuados para un especialista en la técnica y se entenderá que la
presente invención se puede realizar usando cualquiera de los
procedimientos disponibles de transfección. Varias de tales
metodologías se han utilizado por especialistas en la técnica con
éxito variable. La lipofección se puede conseguir encapsulando una
molécula de ADN aislada dentro de una partícula liposomal y poniendo
en contacto la partícula liposomal con la membrana celular de la
célula diana. Los liposomas son partículas coloidales de
autoensamblaje en las que una bicapa lipídica, constituida por
moléculas anfífilas, tales como fosfatidil serina o fosfatidil
colina, encapsula una porción del medio que la rodea de modo que la
bicapa lipídica rodea un interior hidrófilo. Se pueden construir
liposomas unilamelares o multilamelares de modo que el interior
contenga un producto químico, fármaco o una molécula de ADN aislada
deseados.
Se pueden usar vectores de expresión para
expresar los polinucleótidos de este documento en células huésped.
Los vectores de expresión contienen las secuencias polinucleotídicas
apropiadas, tales como las descritas en este documento, así como
una secuencia promotora o de control apropiada, que se pueden
emplear para transformar un huésped apropiado para permitir que el
huésped exprese la proteína. Preferiblemente, un vector de expresión
expresa un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por
las SEC ID Nº: 12-17, 24-29,
36-41, 48-53 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas. Por lo tanto, una composición se puede
producir transfectando una célula huésped con un vector de
expresión o secuencia polinucleotídica que codifique un polipéptido
que comprenda, esté constituido esencialmente por o esté
constituido por una secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 o cualquier homólogo o análogo de las mismas.
La célula huésped después se mantiene en condiciones que permitan
que se produzca el polipéptido o composición.
Para obtener la transcripción de las secuencias
polinucleotídicas de este documento dentro de una célula huésped,
se utiliza una región reguladora de la transcripción capaz de
dirigir la expresión génica en la célula diana. La región
reguladora de la transcripción puede comprender un elemento
promotor, potenciador, silenciador o represor y se asocia de forma
funcional con un ácido nucleico. Preferiblemente, la región
reguladora de la transcripción dirige la expresión génica de alto
nivel en la célula diana. Las regiones reguladoras de la
transcripción adecuadas para su uso en la presente invención
incluyen, aunque sin limitación, el potenciador/promotor inmediato
temprano de citomegalovirus (CMV) humano, el potenciador/promotor
temprano de SV40, el promotor del poliomavirus JC, el promotor de
la albúmina, PGK y el promotor de \alpha-actina
acoplado con el potenciador de CMV, los promotores lac o
trp de E. coli, el promotor de fago lambda P_{L} y
otros promotores que se conoce que controlan la expresión de genes
en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de
expresión también puede contener un sitio de unión a ribosoma para
el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción.
Además, los vectores de expresión también pueden
contener un gen para proporcionar un rasgo fenotípico para la
selección de células huésped transformadas tal como resistencia a
dihidrofolato reductasa o neomicina para un cultivo de células
eucariotas o tal como resistencia a tetraciclina, kanamicina o
ampicilina en E. coli.
En un aspecto preferido, la construcción
comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo,
un promotor, unido operativamente a la secuencia. Los especialistas
en la técnica conocen grandes cantidades de vectores y promotores
adecuados y están disponibles en el mercado. Los siguientes vectores
se proporcionan a modo de ejemplo: (a) Bacterianos: pQE70,
pQE-9 (Qiagen), pBs, phagescript, PsiX174,
pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene),
pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540
y PRIT5 (Pharmacia); (b) Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1,
pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, PMSG, pSVL (Pharmacia) y pET20B.
Opcionalmente, el vector es pET24B que es un vector de selección de
kanamicina. Sin embargo, se puede usar cualquier otro plásmido o
vector siempre que sea replicable y viable en el huésped.
Las regiones promotoras se pueden seleccionar
entre cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol
transferasa) u otros vectores con marcadores de selección. Dos
vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los
promotores bacterianos particulares nombrados incluyen lacI, lacZ,
T3, T7, gpt, lambda P_{R}, PL y trp. Los promotores eucariotas
incluyen el temprano inmediato de CMV, timidina quinasa de HSV, SV40
temprano y tardío, LTR de retrovirus y
metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y
promotor apropiados está dentro del nivel de especialidad ordinaria
en la técnica.
En un caso adicional, la presente invención
proporciona células huésped que contienen la construcción descrita
anteriormente. La célula huésped puede ser una célula eucariota
superior, tal como una célula de mamífero o una célula eucariota
inferior, tal como una célula de levadura o la célula huésped puede
ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La
introducción de la construcción en la célula huésped puede
efectuarse por transfección con fosfato cálcico, transfección
mediada por DEAE-Dextrano, electroporación,
transfección viral (por ejemplo, usando adenovirus o un retrovirus),
así como otros medios conocidos en la técnica. Véase Davis, L y
col., Basic Methods in Molecular Biology, 1986; véase también
el documento WO 0/009813.
Las construcciones en células huésped se pueden
usar de manera convencional para producir los productos
polipeptídicos codificados por la secuencia recombinante. Por
ejemplo, la presente invención proporciona procedimientos para
preparar un complejo multi-unidad que tiene
actividad angiostática. Tal procedimiento incluye las etapas de
proporcionar un vector de expresión que codifica uno o más
fragmentos de ARNt sintetasa, transfectar una célula huésped con
tal vector de expresión y mantener la célula huésped en condiciones
adecuadas para la expresión. Opcionalmente, un vector de expresión
usado para transfectar una célula huésped codifica uno, dos o más
fragmentos de ARNt sintetasa. Más preferiblemente, tales fragmentos
de ARNt sintetasa son fragmentos de triptofanil ARNt sintetasa. En
algunos casos, tales fragmentos se obtienen de ARNt sintetasa de
mamífero o más preferiblemente de ARNt sintetasa humana. En algunos
casos, el vector de expresión codifica un fragmento de ARNt
sintetasa seleccionado entre el grupo constituido por las SEC ID
Nº: 12-17, 24-29,
36-41, 48-53 y cualquier fragmento,
homólogo y análogo de las mismas. En algunos casos, tal vector de
expresión codifica un segundo fragmento de ARNt sintetasa, en el
que el segundo fragmento de ARNt sintetasa también se selecciona
entre el grupo constituido por las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y cualquier fragmento, homólogo y análogo de
las mismas. Los dos fragmentos de ARNt sintetasa pueden ser
diferentes, homólogos, sustancialmente homólogos o idénticos.
La presente invención también contempla que una
célula huésped (por ejemplo, una bacteria) puede o no escindir la
metionina en el extremo N de cualquiera de los polipéptidos de este
documento, dependiendo de los procesos naturales dentro de la
célula huésped. Por tanto, la presente invención también contempla
que una composición puede comprender una combinación de fragmentos
de Met-ARNt sintetasa y
no-Met-ARNt sintetasa. Por ejemplo,
una bacteria transfectada con una secuencia polinucleotídica que
codifica las SEC ID Nº: 15-17,
27-29, 39-41,
51-53, puede dar como resultado una combinación de
tanto fragmentos de Met-ARNt sintetasa como
fragmentos de no-Met-ARNt
sintetasa, todo fragmentos de met-ARNt sintetasa o
todo fragmentos de no-Met-ARNt
sintetasa.
Como alternativa, los polipéptidos se pueden
producir de forma sintética mediante sintetizadores peptídicos
convencionales.
Las proteínas se pueden expresar en células de
mamífero, de levadura, bacterias u otras células bajo el control de
los promotores apropiados. También se pueden emplear sistemas de
traducción libres de células para producir tales proteínas usando
ARN obtenidos de las construcciones de ADN de la presente invención.
Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para su
uso con huéspedes procariotas y eucariotas por Sambrook y col,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring
Harbor, N.Y., (1989).
La trascripción de una secuencia
polinucleotídica que codifica los polipéptidos por eucariotas
superiores se aumenta insertando una secuencia potenciadora en el
vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en
cis, normalmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 300
pares de bases (pb), que actúan sobre un promotor para aumentar su
trascripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en la
parte tardía del origen de replicación (pb 100 a 270), un
potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, un potenciador
de polioma en la parte tardía del origen de replicación y
potenciadores de adenovirus.
Generalmente, los vectores de expresión
recombinante incluirán orígenes de replicación y marcadores
seleccionables que permitan la transformación de la célula huésped,
por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli,
kanamicina para pET24B y el gen TRP1 de S. cerevisiae y un
promotor obtenido de un gen altamente expresado para dirigir la
trascripción de una secuencia estructural cadena abajo. Tales
promotores pueden obtenerse de operones que codifican enzimas
glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa
(PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida o proteínas de choque
térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se
ensambla en la fase apropiada con las secuencias de inicio y
terminación de la traducción y preferiblemente, una secuencia líder
capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio
periplásmico o en medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia
heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un
péptido de identificación N-terminal que le imparte
características deseadas, por ejemplo, estabilización o
purificación simplificada del producto recombinante expresado.
Después de la transformación de una cepa huésped
adecuada y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad
celular apropiada, el promotor seleccionado se desreprime por el
medio apropiado (por ejemplo, un cambio de temperatura o inducción
química) y las células se cultivan durante un periodo adicional.
Las células se recogen típicamente por
centrifugación, se alteran por medios físicos o químicos y el
extracto en bruto resultante se conserva para una purificación
adicional.
Las células microbianas empleadas en la
expresión de proteínas se pueden alterar por cualquier procedimiento
conveniente, incluyendo ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, alteración
mecánica o el uso de agentes de lisado celular.
También se pueden emplear diversos sistemas de
cultivo de células de mamífero para expresar proteína recombinante.
Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las
líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono,
descritas por Gluzman, Cell, 23: 175 (1981) y otras líneas celulares
capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas
celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de
mamífero comprenderán un origen de replicación, un promotor y
potenciador adecuados y también todos los sitios de unión a ribosoma
necesarios, sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores
de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción y
secuencias no trascritas que flanquean el extremo 5'. Las secuencias
de ADN obtenidas del genoma viral SV40, por ejemplo, los sitios
origen de SV40, promotor temprano, potenciador, de corte y empalme
y poliadenilación, se pueden usar para proporcionar los elementos
genéticos no trascritos necesarios.
Por tanto, en su forma más básica, un
polipéptido se puede preparar proporcionando el vector de expresión
apropiado, transfectando una célula huésped con tal vector de
expresión y manteniendo la célula huésped en condiciones adecuadas
para la expresión. Preferiblemente, los vectores de expresión usados
en este documento incluyen al menos una secuencia de nucleótidos
que codifica un fragmento de ARNt sintetasa o más preferiblemente
un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa o cualquier homólogo o
análogo del mismo. El vector que codifica tales fragmentos de
triptofanil ARNt sintetasa se puede modificar para codificar una o
más cisteínas de origen no natural en el dominio de dimerización
del polipéptido. En algunas realizaciones, un vector de expresión
codifica dos o más fragmentos de ARNt sintetasa o más
preferiblemente, dos o más fragmentos de triptofanil ARNt
sintetasa. Tales vectores preferiblemente codifican un engarce
situado entre el primer y segundo fragmentos.
Los polipéptidos se recuperan y purifican a
partir de cultivos de células recombinantes por procedimientos
usados hasta ahora, incluyendo precipitación con sulfato amónico o
etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o
catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de
interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en
hidroxiapatita y cromatografía en lectina. Se prefiere tener
concentraciones bajas (aproximadamente 0,1-5 mM) de
ión calcio presente durante la purificación (Price y col., J. Biol.
Chem., 244: 917 (1969)). Se pueden usar etapas de replegamiento de
proteínas, si fuera necesario, para completar la configuración de
la proteína madura. Finalmente, se puede emplear cromatografía
líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas finales de
purificación. Se describen en este documento procedimientos de
purificación adicionales.
Los polinucleótidos también se pueden emplear
como terapia génica mediante la expresión de tal polipéptido in
vivo.
Diversos vectores virales que se pueden utilizar
para terapia génica como se muestra en este documento incluyen
adenovirus, herpes virus, vaccinia, virus adenoasociados (AAV) o
preferiblemente, un virus ARN tal como un retrovirus.
Preferiblemente, el vector retroviral es un derivado de un
retrovirus murino o aviar o es un vector lentiviral. El vector
retroviral preferido es un vector lentiviral. Los ejemplos de
vectores retrovirales en los que un único gen extraño se puede
insertar incluyen, aunque sin limitación: virus de la leucemia
murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey
(HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), SIV, BIV, VIH y
Virus del Sarcoma de Rous (RSV). Varios vectores retrovirales
adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores
pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable
de modo que las células transducidas puedan identificarse y
generarse. Insertando una secuencia polipeptídica de unión a ADN de
interés obtenida de dedos de cinc en el vector viral, junto con otro
gen que codifica el ligando de un receptor en una célula diana
específica, por ejemplo, se hace al vector específico de diana. Los
vectores retrovirales pueden hacerse específicos de diana
insertando, por ejemplo, un polinucleótido que codifica una
proteína (dímero). La fijación de dianas preferida se realiza usando
un anticuerpo para dirigir al vector retroviral. Los especialistas
en la técnica conocerán o pueden determinar fácilmente sin
experimentación excesiva, secuencias polinucleotídicas específicas
que se pueden insertar en el genoma retroviral para permitir el
suministro específico de diana del vector retroviral que contiene el
polinucleótido de proteína de unión a
nucleótido-dedo de cinc.
Puesto que los retrovirus recombinantes son
deficientes, requieren ayuda para producir las partículas de vector
infecciosas. Esta ayuda puede proporcionarse, por ejemplo, usando
líneas celulares auxiliares que contengan plásmidos que codifican
todos los genes estructurales del retrovirus bajo el control de
secuencias reguladoras dentro de la LTR. Estos plásmidos carecen de
una secuencia de nucleótidos que permita al mecanismo de empaquetado
reconocer un trascrito de ARN para la encapsidación. Las líneas
celulares auxiliares que tienen supresiones de la señal de
empaquetado incluyen, aunque sin limitación, PSI.2, PA317 y PA12,
por ejemplo. Estas líneas celulares producen viriones vacíos,
puesto que no se empaqueta el genoma. Si un vector retroviral se
introduce en tales células en las que la señal de empaquetado está
intacta, pero los genes estructurales se reemplazan por otros genes
de interés, el vector puede empaquetarse y se produce un virión
vector. Los viriones vector producidos por este procedimiento se
pueden usar después para infectar una línea celular tisular, tal
como células NIH 3T3, para producir grandes cantidades de viriones
retrovirales quiméricos.
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Otro sistema de suministro dirigido para
polinucleótidos que codifican polipéptidos de unión a ADN obtenidos
de dedos de cinc es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas
de dispersión coloidal incluyen complejos macromoleculares,
nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que
incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y
liposomas. El sistema coloidal preferido de esta invención es un
liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificial que son
útiles como vehículos de suministro in vitro e in
vivo. Se ha demostrado que vesículas unilamerales grandes (LUV),
que varían en tamaño de 0,2-4,0 \mum, pueden
encapsular un porcentaje sustancial de un tampón acuoso que contenga
macromoléculas grandes. Pueden encapsularse el ARN, el ADN y
viriones intactos en el interior acuoso y suministrarse a células
en forma biológicamente activa (Fraley y col., Trends
Biochem. Sci., 6: 77, (1981)).
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden usar liposomas dirigidos para
suministrar los polinucleótidos de este documento. En algunos casos
la secuencia polinucleotídica es un vector de expresión como se
describe en este documento. Para que un liposoma sea un vehículo de
transferencia génica eficaz, deben estar presentes las siguientes
características: (1) encapsulación de los genes de interés en alta
eficacia sin comprometer su actividad biológica; (2) unión
preferente y sustancial a una célula diana en comparación con
células no diana; (3) suministro de los contenidos acuosos de la
vesícula al citoplasma de la célula diana con alta eficacia; y (4)
expresión exacta y eficaz de la información genética (Mannino y
col., Biotechniques, 6: 682, (1988)).
La composición del liposoma es normalmente una
combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de alta
temperatura de transición de fase, normalmente en combinación con
esteroides, especialmente colesterol. También se pueden usar otros
fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los
liposomas dependen del pH, fuerza iónica y la presencia de cationes
divalentes.
Los ejemplos de lípidos útiles en la producción
de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como
fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina,
fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos.
Son particularmente útiles los diacilfosfatidilgliceroles, donde el
resto lipídico contiene de 14-18 átomos de carbono,
particularmente de 16-18 átomos de carbono y está
saturado. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina
del huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y
diestearoilfosfatidilcolina.
La fijación de dianas de los liposomas se ha
clasificado en base a factores anatómicos y mecánicos. La
clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por
ejemplo, específica de órgano, específica de célula y específica de
organelo. La fijación de dianas mecánica puede distinguirse en base
a si es pasiva o activa. La fijación de dianas pasiva utiliza la
tendencia natural de los liposomas a distribuirse a células del
sistema retículo-endotelial (RES) en órganos que
contienen capilares sinusoides. La fijación de dianas activa, por
otro lado, implica la alteración del liposoma acoplando el liposoma
a un ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar,
glicolípido o proteína o cambiando la composición o tamaño del
liposoma para conseguir la dirección a órganos y tipos celulares.
Por ejemplo, un sistema de suministro de liposoma dirigido puede
incluir anticuerpos que se unan de forma específica a células
cancerosas, células tumorales, células fotorreceptoras, tejido
miocárdico, etc.
La superficie del sistema de suministro dirigido
se puede modificar de diversas maneras. En el caso de un sistema de
suministro de liposomas dirigidos, pueden incorporarse grupos
lipídicos en la bicapa lipídica del liposoma para mantener el
ligando de dirección en asociación estable con la bicapa del
liposoma. Se pueden usar diversos grupos de unión para unir las
cadenas lipídicas al ligando de dirección.
En general, los compuestos unidos a la
superficie del sistema de suministro dirigido serán ligandos y
receptores que permitirán al sistema de suministro dirigido
encontrar y "alojarse" en las células deseadas. Un ligando
puede ser cualquier compuesto de interés que se unirá a otro
compuesto, tal como un receptor.
En general, las proteínas de la superficie de
membrana que se unen a moléculas efectoras específicas se denominan
receptores. En la presente invención, los anticuerpos son los
receptores preferidos. Se pueden usar anticuerpos para dirigir
liposomas a ligandos específicos de la superficie de la célula. Por
ejemplo, ciertos antígenos expresados de forma específica en
células tumorales, denominados antígenos asociados a tumor (TAA),
pueden explotarse para el propósito de dirigir liposomas que
contienen proteína de unión a nucleótidos-dedo de
cinc-anticuerpo directamente al tumor maligno.
Puesto que el producto génico de la proteína de unión a
nucleótidos-dedo de cinc puede ser indiscriminado
con respecto al tipo celular en su acción, un sistema de suministro
dirigido ofrece una mejora significativa sobre la inyección al azar
de liposomas inespecíficos. Se pueden usar varios procedimientos
para unir covalentemente anticuerpos policlonales o monoclonales a
una bicapa de liposoma. Los liposomas dirigidos a anticuerpo pueden
incluir anticuerpos monoclonales o policlonales o fragmentos de los
mismos tales como Fab o F(ab')_{2}, siempre que se unan de
forma eficaz al epítope antigénico de las células diana. Los
liposomas también pueden dirigirse a células que expresan receptores
para hormonas u otros factores del suero.
Se pueden administrar células transfectadas con
los polinucleótidos de este documento a un paciente. En algunos
casos, las células transfectadas se originan a partir del paciente.
En otros casos, las células transfectadas no se originan a partir
del paciente. En cualquier caso, las células pueden transfectarse
por las construcciones de este documento in vivo, ex vivo o
in vitro. Opcionalmente, las células transfectadas son
células madre. Los procedimientos para preparar células madre
hematopoyéticas se describen en el documento PCT/US2003/024839.
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La presente invención proporciona procedimientos
para seleccionar análogos para las composiciones de este documento
y, en particular, análogos para mini-TrpRS, T1 y T2.
El término "análogos" como se usa en este documento significa
compuestos que comparten estructura y/o función, tales como, por
ejemplo, peptidomiméticos y cualquier compuesto orgánico o
inorgánico pequeño o grande. En realizaciones preferidas, un análogo
es un compuesto pequeño orgánico o inorgánico que imita la función
y estructura de mini-TrpRS, T1 o T2, teniendo
interacciones similares con su receptor o receptores.
En cualquiera de las realizaciones de este
documento y especialmente para aplicaciones oftálmicas, las
composiciones (por ejemplo, formulaciones farmacéuticas y/o
polipéptidos) de este documento están preferiblemente
sustancialmente libres de endotoxinas.
Los niveles de endotoxinas en una preparación
farmacéutica o de polipéptidos se pueden determinar por cualquier
técnica conocida; tales técnicas están muy extendidas y son usadas
comúnmente por los especialistas en la técnica en los campos
farmacéutico y biotecnológico. Por ejemplo, la FDA publicó Good
Guidance Practices en febrero de 1997 que indicaba varios
procedimientos para cuantificar los niveles de endotoxinas en una
muestra, incluyendo ensayos del Lisado de Amebocitos de Limulus
usando técnicas cromagénicas, turbidimétricas-de
punto final y turbidimétricas-cinéticas. Todas
estas técnicas, así como otras técnicas (incluyendo, aunque sin
limitación, el uso de colonias de ensayo pirogénicas de conejo) se
pueden usar de forma apropiada para determinar los niveles de
endotoxinas de las muestras descritas en este documento.
Por tanto, por ejemplo, una formulación
farmacéutica para la administración sistémica o administración
tópica puede tener una concentración de endotoxinas que es
preferiblemente menor de aproximadamente 500, 400, 300, 200, 100,
90, 80, 70, 50, 40, 30, 25, 20 ó 15 o más preferiblemente menos de
aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 o más
preferiblemente menos de aproximadamente 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005
o 0,001 unidades de endotoxina por miligramo de producto (por
ejemplo, polipéptido).
Para otras formas de administración, por
ejemplo, intraocular, mediante inhalación, mediante gotas oculares,
vaginal, rectal, etc., una formulación farmacéutica de la presente
invención preferiblemente tiene una concentración de endotoxinas
que es menor de 50, 40, 30, 25, 20 ó 15 o más preferiblemente menor
de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 o más
preferiblemente menor de aproximadamente 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005
ó 0,001 unidades de endotoxinas por miligramo de un producto (por
ejemplo, polipéptido).
La cantidad de endotoxinas en una muestra se
refiere a la cantidad de endotoxinas (tal como medida en unidades
de endotoxina (o U.E.)) en una muestra en relación a la cantidad de
polipéptido o agente farmacéutico deseado en esa muestra
(generalmente proporcionado por mg de polipéptido o agente
farmacéutico). La cantidad de endotoxinas puede medirse por
cualquiera de diversas técnicas. Sin embargo, las unidades
particulares empleadas en este documento son solamente ilustrativas
y se usan en todo el documento por razones de coherencia y para
facilitar la lectura. Es decir, los procedimientos y materiales
presentados en este documento no están limitados por la
"unidades" particulares usadas para presentar la cantidad de
endotoxinas en una muestra. La conversión entre diversas unidades
(sólo a modo de ejemplo, U.E./mg de polipéptido a U.E./ml de
muestra) se considera dentro de las capacidades de un especialista
en la técnica.
En algunas realizaciones, la reducción de
endotoxina es la última o casi la última etapa en un procedimiento
de purificación. En otras realizaciones, la reducción de endotoxina
sucede en una etapa temprana del procedimiento de purificación (por
ejemplo, antes de las etapas que puedan conducir a unión fuerte y/o
irreversible de endotoxina al polipéptido).
La Figura 7 ilustra un diagrama de flujo que
ilustra una secuencia de etapas de purificación (sucediendo cada
una antes de la siguiente) para purificar un agentes farmacéutico
y/o polipéptido de la presente invención. Cuando una etapa sucede
"antes de" otra etapa, entonces la primera etapa se ha
completado al menos parcialmente en una muestra particular que
contiene un polipéptido antes de que se inicie la etapa
posterior.
En la etapa 100 se forma una pasta celular de
células cultivadas en un fermentador (la pasta celular se puede
almacenar apropiadamente hasta que sea necesaria). A continuación en
la etapa 120, la pasta celular se resuspende en un tampón. En la
etapa 130 las células se alteran.
En la etapa 140, el lisado celular se aclara. El
aclarado generalmente implica la retirada del material insoluble
(por ejemplo, desechos celulares, organelos y membranas) en toda o
en parte de una solución que contiene un polipéptido de interés
(por ejemplo, un lisado u homogeneizado celular). Los procedimientos
y composiciones descritos en este documento no están limitados por
la técnica usada para producir la pasta celular, el lisado o el
homogeneizado (o cualquier otro término análogo usado en la técnica
para el material). El aclarado se puede conseguir mediante
numerosos procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo
solamente a modo de ejemplo, filtración simple, centrifugación,
diálisis, filtración profunda, ultrafiltración usando membranas con
límites próximos a 100 K (en los que el producto deseado es el
filtrado y los productos retenidos se descartan), decantación u
otros medios apropiados conocidos por especialistas en la técnica de
tales separaciones. Es decir, en general, después del aclarado, una
fracción comprende en su mayor parte las porciones insolubles de
una célula, mientras que la otra fracción comprende en su mayor
parte las porciones solubles de una célula. En otro aspecto de una
etapa de aclarado, una suspensión se vuelve una solución aclarada.
Los especialistas en la técnica aprecian, por supuesto, que la
reducción de endotoxinas surge de forma inespecífica durante una
etapa de aclarado por medios de selección frente a la inclusión de
membranas celulares restantes (fragmentos grandes). Sin embargo, el
aclarado, en sí mismo, no está diseñado para proporcionar una
preparación de polipéptido que esté sustancialmente libre de
endotoxinas.
En la etapa 150, se realiza cromatografía
aniónica sobre el lisado celular aclarado. Esta etapa puede incluir
recoger las fracciones eluyentes deseadas. La cromatografía de
intercambio aniónico se refiere al uso de una superficie cargada
positivamente con la que una proteína cargada negativamente puede
formar una interacción iónica. La proteína puede eluirse después de
forma selectiva de la superficie cargada positivamente manipulando
la concentración de sal y/o el pH del disolvente de elución. Los
ejemplos de superficies cargadas positivamente incluyen resinas de
intercambio aniónico.
Los ejemplos de resinas de intercambio aniónico
incluyen, aunque sin limitación, las resinas basadas en
dietilaminoetilo (DEAE), basadas en amonio cuaternario (Q o QAE) y
las basadas en Amberlite. Están disponibles en el mercado
diferentes sustratos, tamaños (por ejemplo, flujo rápido o FF,
Source o de alto rendimiento o HP) y diámetros de poro de las
resinas para resinas de intercambio aniónico en proveedores químicos
convencionales y su uso se considera dentro del alcance de los
procedimientos descritos en este documento. Preferiblemente, una
resina de intercambio aniónico se selecciona entre el grupo
constituido por Q Sepharose, DEAE Sepharose y ANX Sepharose. En
otra realización más, la resina de intercambio aniónico es
Q-Sepharose. Como apreciarán los especialistas en
la técnica, las resinas de tamaño más pequeño pueden proporcionar
una separación de productos más limpia, pero con un coste
consecuente en la velocidad con la que tales productos se eluyen de
la columna de cromatografía. Analizar tales costes a la hora de
seleccionar una resina de intercambio aniónico se considera dentro
de la capacidad de un especialista en la técnica. La cromatografía
de intercambio aniónico se realiza preferiblemente antes de reducir
los niveles de endotoxinas del eluyente recogido.
La etapa 160 implica reducir los niveles de
endotoxinas de las fracciones eluidas recogidas. Tal etapa puede
retirar todas, sustancialmente todas o algunas endotoxinas de una
muestra. Esta etapa no necesita aumentar la pureza global de la
proteína (por ejemplo, T1, T2 o mini-trpRS). Las
técnicas para la reducción de endotoxinas incluyen, a modo de
ejemplo, ultrafiltración (por ejemplo, usando membranas con límites
próximos a 100 K en los que el producto polipeptídico deseado está
en los productos retenidos y el filtrado se descarta); cromatografía
de fase inversa, de afinidad, por exclusión de tamaño, de
interacción hidrófoba y/o de intercambio aniónico (por ejemplo,
incluyendo Q Sepharose); gradientes de centrifugación de sacarosa;
absorción de endotoxinas en carbón activado, sílice,
hidroxiapatita, vidrio y/o poliestireno; precipitación con
isopropanol, acetato de amonio o polietilenglicol; técnicas de
separación de fase usando tensioactivos, tales como detergentes;
uso de superficies de filtro cargadas y medios de destoxificación
patentados tales como Acticlean Etox^{TM},
Prosep-Remtox, Mustang E y CUNO Zeta Plus ZA. Estos
últimos se proporcionan típicamente en dispositivos a través de los
que fluye la muestra de polipéptido. En cualquiera de las
realizaciones de este documento, son preferibles técnicas basadas
en filtración sobre las técnicas basadas en columna en base a la
recuperación del producto en relación con la reducción en los
niveles de endotoxinas.
En algunas realizaciones, el nivel de
endotoxinas se reduce usando ultrafiltración. La ultrafiltración
implica separar todos o al menos alguno o al menos un polipéptido o
polipéptidos deseados de moléculas de diferente tamaño y/o
moléculas que tienen un peso molecular diferente del polipéptido o
polipéptidos deseados. La ultrafiltración puede implicar una
técnica conocida como filtración en flujo tangencial (a diferencia
de la filtración en flujo axial). Pasando la solución sobre la
membrana de forma tangencial y teniendo la capacidad de recircular
la solución (también llamado el producto retenido), los materiales
pueden pasar a través de la membrana de manera más fácil. La
capacidad de pasar a través de la membrana está determinada por dos
factores: el tamaño de poro de la membrana (también conocido como
el límite de peso molecular) y la presión transmembrana (ajustada
por el usuario por medio de las bombas y válvulas). Usando diversas
realizaciones de este ajuste, la proteína de interés puede pasar a
través de la membrana (en el filtrado, éste se usa en los sistemas
de aclarado) o no pasar a través de la membrana (permanece en el
producto retenido, que se usa en intercambios de tampón y sistemas
de concentración). En algunas realizaciones, se usa ultrafiltración
para filtrar un medio líquido y moléculas pequeñas de soluto a
través de una membrana semipermeable que tiene poros con un límite
medio de peso molecular que varía de 100 kDa a 1.000 kDa, 200 kDa a
900 kDa, 300 kDa a 800 kDa o 400 kDa a 500 kDa. En algunas
realizaciones, se usa ultrafiltración para filtrar un medio líquido
y moléculas pequeñas de soluto a través de un membrana
semipermeable que tiene poros con un límite medio de peso molecular
de al menos 90 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa,
600 kDa, 700 kDa, 800 kDa, 900 kDa o 1.000 kDa. Realizar una etapa
de ultrafiltración puede incluir un procedimiento de diálisis para
separar proteínas globulares en solución de solutos de bajo peso
molecular. Una etapa de este tipo puede utilizar una membrana
semipermeable para retener las moléculas proteicas y permitir a las
moléculas pequeñas de soluto y agua pasar a través de la misma.
Tales membranas pueden tener un límite de peso molecular que varía,
a modo de ejemplo solamente, de 1 kDa a 100 kDa, 2 kDa a 90 kDa, 3
kDa a 80 kDa, 4 kDa a 70 kDa, 5 kDa a 60 kDa o 6 kDa a 50 kDa, 7 kDa
a 40 kDa, 8 kDa a 30 kDa o 9 kDa a 20 kDa. En algunas
realizaciones, los límites de peso molecular pueden ser de menos de
90 kDa, 85 kDa, 80 kDa, 75 kDa, 70 kDa, 65 kDa, 60 kDa, 55 kDa, 50
kDa, 45 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa, 10
kDa, 5 kDa o 1 kDa. Preferiblemente, el límite de peso molecular
para retener moléculas de ARNt sintetasa y permitir a las moléculas
pequeñas de soluto y agua pasen a través es de menos de 50 kDa,
menos de 25 kDa o menos de 1 kDa.
En realizaciones preferidas, los polipéptidos
purificados por la presente invención no se modifican o
desnaturalizan durante el procedimiento de reducción de
endotoxinas. La etapa de reducción de endotoxinas se realiza
preferiblemente antes de la etapa de intercambio de tampón.
En la etapa 170, las fracciones de eluyente
filtradas se concentran. La realización de una etapa de
concentración puede dar como resultado un aumento de concentración
de un polipéptido deseado o un agente farmacéutico (por ejemplo,
cualquiera de los polipéptidos de este documento) en el disolvente
en al menos un factor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40,
50, 100, 200, 300, 400 ó 500. Preferiblemente, un procedimiento de
aumento de la concentración de este tipo se realiza después de una
primera etapa de cromatografía (por ejemplo, cromatografía de
intercambio aniónico y/o intercambio catiónico). Generalmente, una
etapa de concentración implica reducir la cantidad relativa de
disolvente de una muestra. Los procedimientos para realizar una
etapa de concentración de este tipo incluyen, aunque sin
limitación, ultrafiltración, evaporación, liofilización y
precipitación (seguida de resolubilización).
Una etapa de concentración se realizará
típicamente al menos una vez, 2, 3, 4, 5 ó 6 veces durante la
purificación de un polipéptido y/o agente farmacéutico. Por
ejemplo, si la primera etapa de cromatografía de intercambio iónico
es una etapa de cromatografía de intercambio aniónico, entonces una
etapa de concentración se puede realizar sobre la fusión de
fracciones eluidas que contienen el polipéptido y/o agente
farmacéutico deseado (en este caso, también conocidas como las
fracciones de polipéptido recogidas de la columna de intercambio
aniónico). De forma similar, si la segunda columna de cromatografía
de intercambio iónico es una etapa de cromatografía de intercambio
catiónico (también conocida como una etapa de refinado), entonces se
puede realizar una etapa de concentración sobre la fusión de
fracciones eluidas que contienen el polipéptido y/o agente
farmacéutico deseado (en este caso, las fracciones de polipéptido
refinadas recogidas o las fracciones de polipéptido recogidas de la
columna de intercambio catiónico).
La etapa o etapas de concentración pueden
suceder antes de una etapa de intercambio de tampón o
simultáneamente a una etapa de intercambio de tampón.
En la etapa 180, el tampón o los tampones se
intercambian para preparar una etapa de cromatografía de intercambio
catiónico. El intercambio de tampón implica el cambio de un
"disolvente", es decir, se cambia el entorno líquido de un
polipéptido, por completo o en parte. Los disolventes pueden incluir
solutos micromoleculares (por ejemplo, sales) del medio en el que
se encuentra un polipéptido deseado y/o solutos macromoleculares.
Una técnica adecuada para realizar un intercambio de tampón es
ultrafiltración. Otra técnica adecuada es diálisis de la solución
que contiene el polipéptido frente a cantidades sustancialmente más
grandes de un tampón diferente. Otras técnicas de intercambio de
tampón, incluyen por ejemplo, infiltración en gel y diafiltración.
La etapa de intercambio de tampón puede suceder antes de, después o
simultáneamente con una etapa de concentración. Un ejemplo del
último enfoque es mediante la técnica conocida como diafiltración a
volumen constante. Una etapa de intercambio de tampón podría usarse
una vez o múltiples veces para purificar un agente farmacéutico y/o
polipéptido. A modo de ejemplo solamente, si una muestra de
polipéptido particular (es decir, T2 producido por la expresión
recombinante del vector de la SEC ID Nº: 70) comprende una fusión de
muestras recogidas de una columna de intercambio aniónico (es
decir, una etapa de cromatografía de intercambio aniónico), entonces
esta muestra de polipéptido (conocida en este documento como una
muestra de polipéptido en un tampón de intercambio
post-aniónico) puede experimentar intercambio de
tampón antes de cargar la muestra de polipéptido en una columna de
intercambio catiónico (es decir, una etapa de cromatografía de
intercambio catiónico). Otro ejemplo en el que podría realizarse
provechosamente una etapa de intercambio de tampón sobre una muestra
de polipéptido es antes de almacenar la muestra de polipéptido
finalizada, pero después de la etapa de refinado (por ejemplo, la
última etapa de cromatografía de intercambio iónico).
En la etapa 190, se realiza una cromatografía de
intercambio catiónico. Esta etapa puede incluir la recogida de las
fracciones de eluyente deseadas. La cromatografía de intercambio
catiónico se refiere al uso de una superficie cargada negativamente
con la que la proteína cargada positivamente puede formar una
interacción iónica. Cuando se realiza una etapa de cromatografía de
intercambio catiónico sobre una muestra que ya ha experimentado una
etapa de cromatografía de intercambio aniónico, la etapa de
cromatografía de intercambio catiónico se denomina a veces "etapa
de refinado"; la muestra cargada en la columna de intercambio
catiónico es la muestra sin refinar y las fracciones eluidas que
contienen la muestra de polipéptido deseada se han refinado y
pueden denominarse una muestra de polipéptido refinada. La proteína
puede entonces eluirse de forma selectiva de la superficie cargada
negativamente manipulando la concentración de sal y/o el pH del
disolvente de elución. Los ejemplos de superficies cargadas
negativamente incluyen resinas de intercambio catiónico.
Los ejemplos de resinas de intercambio catiónico
incluyen, a modo de ejemplo solamente, resinas basadas en
carboximetilo (CM) y sulfopropilo (SP). Están disponibles diferentes
sustratos, tamaños (por ejemplo, flujo rápido o FF, Source o alto
rendimiento o HP) y diámetros de poro de resina para resinas de
intercambio catiónico de proveedores químicos convencionales y su
uso se considera dentro del alcance de los procedimientos descritos
en este documento. Como apreciarán los especialistas en la técnica,
las resinas de tamaño más pequeño pueden proporcionar una
separación de los productos más limpia, pero con un consecuente
coste en la velocidad con la que tales productos se eluyen de la
columna de cromatografía. El análisis de tal coste a la hora de
seleccionar una resina de intercambio catiónico se considera dentro
de la capacidad de un especialista en la técnica.
Finalmente, en la etapa 200, la muestra se
concentra de nuevo y, opcionalmente, se intercambian de nuevo los
tampones. Esto da como resultado una muestra de polipéptido que
tiene unos niveles de endotoxina reducidos. La preparación baja en
endotoxinas se puede formular además en la etapa 210 antes de la
administración a un organismo (por ejemplo, un ser humano) en la
etapa 220.
La Figura 8 es otra ilustración de los
procedimientos de purificación descritos en este documento.
En algunos aspectos de los procedimientos de
este documento, se realiza una etapa de filtración para la reducción
de endotoxinas después de realizar una etapa de aclarado y antes de
realizar una etapa de intercambio de tampón. Además, la etapa de
filtración para la reducción de endotoxinas se puede realizar antes
de realizar una etapa de cromatografía de intercambio catiónico.
Como alternativa, la etapa de filtración para la reducción de
endotoxinas se puede realizar antes de realizar una etapa de
concentración.
En algunos aspectos de los procedimientos de
este documento, se realiza una etapa de filtración para la reducción
de endotoxinas después de realizar una etapa de aclarado y antes de
realizar una etapa de concentración. Además, la etapa de filtración
para la reducción de endotoxinas se puede realizar antes de realizar
una etapa de cromatografía de intercambio catiónico. Como
alternativa, la etapa de filtración para la reducción de endotoxinas
se puede realizar antes de realizar una etapa de intercambio de
tampón.
En algunos aspectos de los procedimientos de
este documento, se realiza una etapa de filtración para la reducción
de endotoxinas después de realizar una etapa de aclarado y antes de
realizar una etapa de cromatografía de intercambio catiónico. Como
alternativa, la etapa de filtración para la reducción de endotoxinas
se puede realizar antes de realizar una etapa de concentración.
Como alternativa, la etapa de filtración para la reducción de
endotoxinas se puede realizar antes de realizar una etapa de
intercambio de tampón.
En algunos aspectos de los procedimientos de
este documento, se realiza una etapa de filtración para la reducción
de endotoxinas antes de realizar una etapa de concentración y antes
de realizar una etapa de cromatografía de intercambio catiónico y
antes de una etapa de intercambio de tampón.
El orden de las etapas de concentración,
intercambio de tampón y cromatografía de intercambio catiónico en
cualquiera de los procedimientos de purificación de este documento
puede variar, pero en una realización, se realiza al menos una
etapa de concentración antes de la etapa de intercambio de tampón.
Como alternativa, se realiza una etapa de cromatografía de
intercambio catiónico después de la etapa de intercambio de tampón.
Como alternativa, se realiza al menos una etapa de concentración
antes de la etapa de cromatografía de intercambio catiónico. Como
alternativa, la etapa de cromatografía de intercambio catiónico se
realiza después de una etapa de intercambio de tampón y al menos
una etapa de concentración. Como alternativa, se realiza al menos
una etapa de concentración antes de la etapa de intercambio de
tampón y la etapa de cromatografía de intercambio catiónico. Y como
alternativa, se realiza una etapa de concentración adicional después
de cualquier etapa de intercambio de tampón.
En una realización adicional de cualquiera de
los procedimientos de purificación de este documento, la etapa de
filtración para la reducción de endotoxinas se realiza después de
una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. En una
realización adicional, la etapa de cromatografía de intercambio
aniónico comprende el uso de una resina de intercambio aniónico. En
una realización adicional más, la resina de intercambio aniónico se
selecciona entre el grupo constituido por Q Sepharose, DEAE
Sepharose y ANX Sepharose. En otra realización más, la resina de
intercambio aniónico es Q Sepharose. En cualquiera de estos usos de
resina de intercambio aniónico, se puede usar una diversidad
calidades y tamaños, incluyendo, aunque sin limitación, calidad
Source, calidad de flujo rápido y calidad de alto rendimiento.
En cualquiera de los procedimientos de
purificación de este documento, la etapa de cromatografía de
intercambio catiónico puede comprender el uso de una resina de
intercambio catiónico. En una realización adicional, la resina de
intercambio catiónico se selecciona entre el grupo constituido por
CM Sepharose, SP Sepharose y DEAE Sepharose. En otra realización
más, la resina de intercambio catiónico es CM Sepharose. En
cualquiera de estos usos de resinas de intercambio catiónico se
puede usar una diversidad de calidades y tamaños, incluyendo,
aunque sin limitación, calidad Source, calidad de flujo rápido y
calidad de alto rendimiento.
En un aspecto alternativo, los procedimientos
para purificar un polipéptido pueden comprender una etapa de
cromatografía de intercambio aniónico, una etapa que comprende un
medio para reducir las endotoxinas y una etapa de intercambio de
tampón, donde la etapa que comprende un medio para reducir las
endotoxinas se realiza antes de la etapa de intercambio de tampón.
En una realización adicional, el polipéptido adecuado para la
administración a un paciente es adecuado para administración
oftálmica. En otra realización más, el polipéptido adecuado para
administración oftálmica es un modulador de la angiogénesis. En otra
realización más, el polipéptido adecuado para administración
oftálmica se puede usar para tratar degeneración macular,
retinopatía diabética o enfermedades o afecciones asociadas con la
neovascularización ocular no deseada. En un perfeccionamiento
adicional de cualquiera de las realizaciones indicadas en este
párrafo, el polipéptido está sustancialmente libre de
endotoxinas.
En algunas realizaciones, la purificación de un
polipéptido puede comprender una etapa de cromatografía de
intercambio aniónico, una etapa que comprende un medio para reducir
las endotoxinas y una etapa de intercambio de tampón, donde la
etapa que comprende un medio para reducir las endotoxinas se realiza
antes de la etapa de intercambio de tampón.
En cualquiera de las realizaciones de este
documento, una etapa de purificación puede comprender una etapa de
concentración de fracciones de polipéptido refinadas recogidas,
donde las fracciones de polipéptido refinadas recogidas están
sustancialmente libres de endotoxinas. Una realización adicional son
procedimientos para preparar las fracciones de polipéptido
refinadas recogidas de la realización anterior que comprenden
realizar una etapa de cromatografía de intercambio catiónico sobre
una muestra de polipéptido sin refinar produciendo de este modo las
fracciones de polipéptido refinadas recogidas de la realización
anterior, donde la muestra de polipéptido sin refinar está
sustancialmente libre de endotoxinas. Realizaciones adicionales son
procedimientos para producir la muestra de polipéptido sin refinar
de la realización previa que comprenden realizar una etapa de
intercambio de tampón sobre una muestra de polipéptido en un tampón
de intercambio post-aniónico produciendo de este
modo la muestra de polipéptido sin refinar de la realización
previa, donde la muestra de polipéptido en el tampón de intercambio
post-aniónico está sustancialmente libre de
endotoxinas. Realizaciones adicionales son procedimientos para
producir la muestra de polipéptido en el tampón de intercambio
post-aniónico de la realización previa que
comprenden realizar una etapa de concentración sobre fracciones de
polipéptido recogidas de una columna de intercambio aniónico antes
de la etapa de intercambio de tampón produciendo de este modo la
muestra de polipéptido en el tampón de intercambio
post-aniónico de la realización previa, donde las
fracciones de polipéptido recogidas de una columna de intercambio
aniónico están sustancialmente libres de endotoxinas. Realizaciones
adicionales son procedimientos para producir las fracciones de
polipéptido recogidas de una columna de intercambio aniónico de la
realización previa que comprenden realizar una etapa de filtración
para la reducción de endotoxinas antes de la etapa de concentración
de la realización previa. Una realización adicional son
procedimientos que comprenden realizar una etapa de cromatografía
de intercambio aniónico antes de la etapa de filtración para la
reducción de endotoxinas.
La pureza de la muestra de polipéptido se puede
determinar antes, durante y/o después de cualquiera de las etapas
mencionadas anteriormente.
Como se ha descrito anteriormente, se puede
utilizar una diversidad de sistemas vectores de expresión - huésped
para expresar cualquiera de los polipéptidos de este documento (por
ejemplo, un fragmento de ARNt sintetasa, tal como T1, T2 o
miniTrpRS, que comprende preferiblemente, está constituido
esencialmente por o está constituido por un polipéptido de la SEC
ID Nº: 12-17, 24-29,
36-41 ó 48-53). Los sistemas de
expresión que se pueden usar incluyen, aunque sin limitación,
microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E.
coli y B. subtilis) transformadas con vectores de
expresión de ADN de bacteriófagos, ADN de plásmidos o ADN de
cósmidos recombinantes que contienen una secuencia polinucleotídica
que codifica cualquiera de los polipéptidos de este documento al
menos en parte; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces y
Pichia) transfectadas con los vectores de expresión de
levadura recombinantes que contienen una secuencia polinucleotídica
que codifica cualquiera de los polipéptidos de este documento al
menos en parte; sistemas de células de insecto infectados con
vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo,
baculovirus) que contienen una secuencia polinucleotídica que
codifica cualquiera de los polipéptidos de este documento al menos
en parte; sistemas de células vegetales infectados con vectores de
expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de
la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o
transfectados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes
(por ejemplo, plásmido Ti) que contienen una secuencia de
nucleótidos que codifica cualquiera de los polipéptidos de este
documento al menos en parte; o sistemas de células de mamífero (por
ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3, U937) que alojan construcciones
de expresión recombinantes que contienen promotores obtenidos del
genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de
metalotioneína) o de virus de mamífero, (por ejemplo, el promotor
tardío de adenovirus; el promotor 7,5 K del virus vaccinia).
En sistemas eucariotas, se pueden usar varios
sistemas de selección, incluyendo aunque sin limitación genes tales
como el de timidina quinasa del virus de herpes simple (Wilkie y
col., 1979, Nucleic Acids Res., 7: 859-77),
hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa
(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 48:
2026) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., 1980,
Cell 22: 817) que se pueden emplear en células tk, hprt o aprt
respectivamente. También, se puede usar la resistencia a
antimetabolitos como base de selección. Los siguientes genes
ilustran este enfoque: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato
(Subramani S y col., Mol Cell Biol. 1:
854-64 (1981); Gasser y col., Proc Natl. Acad. Sci,
1982, 79(21): 6522-26 (1982); O'Hare y col.,
(1981), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 78: 1527), especialmente en
células de dhfr (Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci,
(1980), 77(7): 4216-4220); gpt, que confiere
resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, (1981),
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 78: 2072); neo, que confiere
resistencia al aminoglicósido G-418
(Colberre-Garapin y col., (1981), J. Mol. Biol. 150:
1); hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre y col.,
(1984), Gene 30: 147); el gen bar, que confiere resistencia a
bialafos; y D-aminoácido oxidasa, que confiere
resistencia a D-alanina o D-serina
(Erikson y col, Nat Biotechnol., (2004), 22(4):
455-58).
En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar
varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para
cualquiera de los polipéptidos de este documento u homólogos o
análogos de los mismos. Las bacterias adecuadas incluyen, a modo de
ejemplo solamente, bacterias gram positivas y gram negativas. En una
realización, el polipéptido se expresa en bacterias E. coli
y se aísla posteriormente de las células usando los procedimientos
de purificación descritos en este documento.
El polipéptido se puede expresar en una célula
procariota usando sistemas de expresión conocidos por los
especialistas en la técnica de la biotecnología. Los sistemas de
expresión útiles para la práctica de los procedimientos y
composiciones se describen en las Patentes de Estados Unidos Nº
5.795.745; 5.714.346; 5.637.495; 5.496.713; 5.334.531; 4.634.677;
4.604.359; 4.601.980.
Las células procariotas pueden cultivarse en una
diversidad de condiciones conocidas para los especialistas en la
técnica. En un aspecto, las células se cultivan en un medio adecuado
para el crecimiento de tales células, por ejemplo, medios mínimos o
medios completos (es decir, ricos). Generalmente, el medio usado
para cultivar las células no debe contener concentraciones de sales
u otros productos químicos, por ejemplo, urea, que sean tan altas
como para interferir con el reparto del polipéptido o con la
formación de fases durante los procedimientos de extracción.
Cualquiera de los polipéptidos de este documento
u homólogos o análogos de los mismos se puede expresar en animales
transgénicos. Las especies animales que incluyen, aunque sin
limitación, ratones, ratas, conejos, cobayas, cerdos, cerdos
vietnamitas, cabras y primates no humanos, por ejemplo, babuinos,
monos y chimpancés se pueden usar para generar animales
transgénicos que expresan un transgen que codifica cualquiera de los
polipéptidos de este documento o un homólogo o análogo de los
mismos. Adicionalmente, cualquiera de los polipéptidos de este
documento, incluyendo a modo de ejemplo solamente,
T1-TrpRS, T2-TrpRS y
mini-TrpRS que se puede usar en las composiciones y
procedimientos descritos en este documento, también se puede
expresar en plantas transgénicas.
Los procedimientos de purificación de este
documento son útiles para purificar cualquiera de los polipéptidos
de este documento a partir de una mezcla en bruto que puede ser rica
en contaminantes, tales como extractos celulares o desechos
celulares. Las células que expresan el polipéptido de este documento
se pueden preparar antes del procedimiento de purificación de una
diversidad de maneras. Por ejemplo, se puede preparar una pasta de
células muertas congeladas o se pueden usar células vivas que estén
congeladas o se pueden usar directamente células vivas en un
procedimiento de extracción.
Si el polipéptido de este documento se purifica
a partir de células, las células se alteran u homogeneizan antes de
la extracción del polipéptido. El propósito de alterar u
homogeneizar las células es liberar el polipéptido de este
documento de las células. Se conoce en la técnica una diversidad de
maneras para alterar u homogeneizar células de distintos orígenes,
por ejemplo, el uso de molinos de perlas, choque osmótico, prensas
francesas, procesado por homogeneizador Dounce, sonicación,
microfluidización, homogeneización a alta presión y fractura por
congelación. Si el polipéptido se secreta por las células en las que
se sintetiza, las células no tienen que lisarse sino que el
polipéptido se puede extraer del fluido extracelular o medio de
cultivo, por ejemplo, puede añadirse directamente al fermentador un
agente formador de fase.
Los procedimientos de purificación descritos en
este documento pueden incluir cualquier técnica para separar el
agente farmacéutico o polipéptido deseado a partir de otros
materiales no deseados. Estas técnicas incluyen, a modo de ejemplo
solamente, filtración en flujo tangencial (también conocido como
TFF), filtración profunda, ultrafiltración, diálisis, extracciones
de dos fases, decantación, técnicas de "desalado", un sistema
de adsorción en lecho expandido y centrifugación.
De acuerdo con las composiciones y
procedimientos de purificación descritos en este documento, el
polipéptido se puede purificar a partir de células, de un
homogeneizado celular, de células alteradas, de una mezcla en bruto
obtenida después de la síntesis química del polipéptido o cualquier
tipo de mezcla que contenga el polipéptido de interés y
contaminantes de modo que la purificación del polipéptido sea
deseable.
Después de cada etapa de purificación, el
polipéptido puede detectarse por una diversidad de procedimientos
incluyendo, aunque sin limitación, bioensayos, HPLC, determinación
de aminoácidos o ensayos inmunológicos, por ejemplo,
radioinmunoensayo, ELISA, transferencia de Western usando unión de
anticuerpos y SDS-PAGE. Tales anticuerpos incluyen,
aunque sin limitación, anticuerpos policlonales, anticuerpos
monoclonales (mAb), anticuerpos humanizados o quiméricos,
anticuerpos de cadena única, fragmentos Fab, fragmentos
F(ab')_{2}, fragmentos producidos por una biblioteca de
expresión de Fab y fragmentos de unión a epítopes o cualquiera de
los anteriores.
La cantidad de polipéptido purificado y su nivel
de pureza se pueden determinar por procedimientos bien conocidos en
la técnica. Por ejemplo, y no a modo de limitación, se puede
examinar una formulación de polipéptidos que se ha preparado usando
los procedimientos de purificación de este documento con
electroforesis en gel de poliacrilamida seguida de la tinción del
gel para visualizar el polipéptido total en el gel. En una
realización, el rendimiento y la pureza del polipéptido después de
una extracción de dos fases se determinan usando HPLC de fase
inversa.
La pureza de una formulación de un polipéptido
preparado usando los procedimientos de purificación de este
documento puede variar dependiendo del material de partida. A modo
de ejemplo solamente, cuando se purifica un polipéptido que se
expresa en E. coli, la preparación resultante contiene al
menos aproximadamente el 50% en peso del polipéptido de interés,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 85% y preferiblemente al
menos aproximadamente el 95%, preferiblemente al menos
aproximadamente el 96%, preferiblemente al menos aproximadamente el
97%, preferiblemente al menos aproximadamente el 98%,
preferiblemente al menos aproximadamente el 99% o más
preferiblemente al menos aproximadamente el 99,5%.
Todos los procedimientos de purificación de
polipéptidos conocidos por los especialistas en la técnica se
pueden usar para purificación adicional. Tales técnicas se han
descrito ampliamente en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning
Techniques, Methods in Enzymology, Volumen 152, Academic Press, San
Diego, Calif. (1987); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
edición., Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989);
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, all
Viols., (1989) y actualizaciones periódicas de los mismos); New
Polypeptide Techniques: Methods in Molecular Biology, Walker, J. M.,
ed., Humana Press, Clifton, N.J., (1988); y Polypeptide
Purification: Principles and Practice, 3ª edición, Scopes, R. K.,
Springer-Verlag, Nueva York, N.Y., (1987). Los
procedimientos adicionales para purificar adicionalmente el
polipéptido incluyen, aunque sin limitación precipitación con
sulfato de amonio, intercambio iónico, filtración en gel,
cromatografía en fase inversa (y las formas de HPLC o FPLC de los
mismos) y cromatografía de interacción hidrófoba.
\vskip1.000000\baselineskip
Un receptor de cualquiera de las composiciones
de este documento se puede usar para seleccionar agentes que puedan
modular el receptor. Preferiblemente, el agente se combina con una
biblioteca de dos o más agentes candidatos. Los agentes candidatos
que se unen o interaccionan con el receptor se pueden seleccionar
para evaluación adicional (por ejemplo, detectando la capacidad
para prevenir/tratar la neovascularización ocular en ratones u
otros mamíferos, véanse los Ejemplos 3 y 4). Los ejemplos de agentes
candidatos incluyen polipéptidos (por ejemplo, aminoácidos
lineales, cíclicos, naturales, aminoácidos no naturales, compuestos
peptidomiméticos y ácidos nucleicos peptídicos), ácidos nucleicos,
carbohidratos y moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas o
grandes. Tales bibliotecas las puede generar un especialista en la
técnica y pueden estar adaptadas para ensayos específicos.
Los agentes candidatos pueden obtenerse a partir
de una amplia diversidad de fuentes incluyendo bibliotecas de
compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles
numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una
amplia diversidad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo
expresión de oligonucleótidos aleatorizados. Como alternativa,
están disponibles o se pueden producir fácilmente bibliotecas de
compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos,
vegetales y animales. Adicionalmente, las bibliotecas y compuestos
producidos de forma natural o sintética se modifican fácilmente a
través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales.
Pueden someterse agentes farmacológicos conocidos a modificaciones
químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación,
esterificación o amidación, para producir análogos
estructurales.
Los agentes que se unen al receptor después
pueden evaluarse adicionalmente para determinar su actividad
angiostática usando cualquiera de los modelos de ensayo angiogénico
descritos en este documento o conocidos, de otra manera, en la
técnica. Los ejemplos de ensayos para determinar la angiogénesis
incluyen los descritos en el Ejemplo 3 y el ensayo de angiogénesis
de Matrigel descrito en el Ejemplo 4. Los agentes que tienen un
efecto significativo sobre la angiogénesis se consideran análogos
de las composiciones de este documento.
Las composiciones se pueden modificar o pueden
diseñarse nuevas composiciones usando herramientas de modelado por
ordenador. Una vez que existe confirmación de unión entre un ligando
(T2 o cualquiera de los otros homodímeros de este documento) y su
receptor o receptores, las modificaciones del ligando pueden
permitir capacidades de unión aumentadas o el diseño racional del
fármaco.
Esto implica típicamente resolver la estructura
cristalina del complejo ligando/receptor; analizar los contactos
realizados entre los componentes del ligando y receptor; comparar
cómo interaccionaría el ligando con el receptor usando simulación
por ordenador y el software apropiado; y alterar las partes del
ligando que están impedidas estéricamente o son incompatibles de
otra manera con la unión al ligando. El software utilizado
típicamente en el modelado molecular es capaz de conseguir cada una
de estas etapas, así como de sugerir reemplazos potenciales para
diversos restos del ligando que aumentarían la asociación con la
segunda quinasa nativa. Preferiblemente, el software también puede
sugerir pequeños compuestos orgánicos o inorgánicos que se pueden
usar en lugar del ligando (por ejemplo, T2) para conseguir los
mismos efectos.
Preferiblemente, se usa un sistema de modelado
molecular para analizar la interacción hecha entre un fragmento de
triptofanil ARNt sintetasa y su receptor. Posteriormente, el
fragmento de triptofanil ARNt sintetasa se puede modificar para
mejorar las afinidades de unión de estos dos compuestos.
Un especialista en la técnica puede usar uno de
varios procedimientos para seleccionar restos químicos para
remplazar partes del ligando de modo que se optimice la unión al
receptor nativo. Este procedimiento puede comenzar mediante
inspección visual lado a lado del ligado y el receptor en la
pantalla del ordenador basándose en la estructura de rayos X de los
dos compuestos. Después, los ligandos modificados pueden ensayarse
para determinar su capacidad de alojar el receptor nativo usando un
software tal como DOCK y AUTODOCK seguido de minimización de
energía y dinámica molecular con campos de fuerza mecánica
moleculares convencionales, tales como CHARMM y AMBER.
Otros programas informáticos especializados que
pueden ayudar también en el procedimiento de reemplazo de
fragmentos incluyen los siguientes:
1. GRID (P. J. Goodford, "A Computational
Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on
Biologically Important Macromolecules", J. Med. Chem., 28,
páginas 849-857 (1985)). GRID está disponible en
Oxford University, Oxford, RU.
2. MCSS (A. Miranker y col., "Functionality
Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search
Method." Proteins: Structure, Function and Genetics, 11, páginas
29-34 (1991)). MCSS está disponible en Molecular
Simulations, Burlington, Mass.
3. AUTODOCK (D. S. Goodsell y col., "Automated
Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing",
Proteins: Structure, Function, and Genetics, 8, páginas
195-202 (1990)). AUTODOCK está disponible en Scripps
Research Institute, La Jolla, Calif.
4. DOCK (I. D. Kuntz y col., "A Geometric
Approach to Macromolecule-Ligand Interactions",
J. Mol. Biol., 161, páginas 269-288 (1982)). DOCK
está disponible en Universidad de California, San Francisco,
Calif.
También se pueden emplear otras técnicas de
modelado molecular de acuerdo con esta invención. Véase, por
ejemplo, N. C. Cohen y col., "Molecular Modeling Software and
Methods for Medicinal Chemistry", J. Med. Chem., 33, páginas
883-894 (1990). Véase también, M. A. Navia y col.,
"The Use of Structural Information in Drug Design", Current
Opinions in Structural Biology, 2, páginas 202-210
(1992).
Una vez que se ha diseñado o seleccionado un
compuesto mediante los procedimientos anteriores, la eficacia con
la que esta entidad se puede unir al receptor se puede ensayar y
optimizar adicionalmente mediante evaluación computacional.
Una entidad diseñada o seleccionada para unirse
al receptor nativo se puede optimizar adicionalmente de forma
computacional de modo que en su estado de unión preferiblemente
carezca de interacción electrostática de repulsión con el receptor
diana. Tales interacciones no complementarias (por ejemplo,
electrostáticas) incluyen interacciones de repulsión
carga-carga, dipolo-dipolo y
carga-dipolo. Específicamente, la suma de todas las
interacciones electrostáticas entre el ligando y el receptor cuando
el ligando está unido al receptor hace preferiblemente una
contribución neutra o favorable a la entalpía de unión.
Está disponible en la técnica un software
informático específico para evaluar la energía de deformación del
compuesto y la interacción electrostática. Los ejemplos de programas
diseñados para tales usos incluyen: Gaussian 92, revisión C [M. J.
Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa. © 1992]; AMBER, versión 4.0
[P. A. Kollman, Universidad de California en San Francisco, ©
1994]; QUANTA/CHARMM [Molecular Simulations, Inc., Burlington,
Mass.© 1994]; e Insight ll/Discover (Biosysm Technologies Inc., San
Diego, Calif. © 1994). Estos programas pueden aplicarse, por
ejemplo, usando una estación de trabajo Silicon Graphics, una
estación de trabajo lndigo_{2} o IBM RISC/6000 modelo 550. Los
especialistas en la técnica conocerán otros sistemas de hardware y
paquetes de software.
Una vez que el ligando modificado se ha
seleccionado o diseñado óptimamente, como se ha descrito
anteriormente, pueden hacerse después sustituciones en algunos de
sus átomos o grupos laterales para mejorar o modificar sus
propiedades de unión. Generalmente, las sustituciones iniciales son
conservativas, es decir, el grupo de reemplazo tendrá
aproximadamente el mismo tamaño, forma, hidrofobicidad y carga que
el grupo original. Tales compuestos químicos sustituidos pueden
analizarse después para determinar la eficacia del ajuste al
receptor mediante los mismos procedimientos informáticos descritos
con detalle anteriormente.
Cualquiera de las composiciones y análogos y
cualquier sal, profármaco o metabolito de los mismos, se puede
formular para la administración a un individuo mediante la adición
de un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las sales farmacéuticamente aceptables son sales
no tóxicas a la concentración a la que se administran. La
preparación de tales sales puede facilitar el uso farmacológico
alterando las características físico-químicas de la
composición sin evitar que la composición ejerza su efecto
fisiológico. Los ejemplos de alteraciones útiles en las propiedades
físicas incluyen disminuir el punto de fusión para facilitar la
administración a través de la mucosa y aumentar la solubilidad para
facilitar la administración de concentraciones mayores del
fármaco.
Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen
sales de adición de ácido tales como aquellas que contienen
sulfato, clorhidrato, fosfato, sulfonato, sulfamato, sulfato,
acetato, citrato, lactato, tartrato, metanosulfonato,
etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato,
ciclohexilsulfonato, ciclohexilsulfamato y quinato. Las sales
farmacéuticamente aceptables pueden obtenerse de ácidos tales como
ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido
sulfónico, ácido sulfámico, ácido acético, ácido cítrico, ácido
láctico, ácido tartárico, ácido malónico, ácido metanosulfónico,
ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido
p-toluenosulfónico, ácido ciclohexilsulfónico, ácido
ciclohexilsulfámico y ácido quínico. Tales sales se pueden preparar,
por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de ácido o base libres
del producto con uno o más equivalentes de la base o ácido
apropiado en un disolvente o medio en el que la sal sea insoluble o
en un disolvente tal como agua que se retira después al vacío o por
secado por congelación o intercambiando los iones de una sal
existente por otro ión en una resina de intercambio iónico
adecuada.
Los vehículos oftálmicamente aceptables son
agentes que no tienen efecto perjudicial persistente en el ojo
tratado o en el funcionamiento del mismo o en la salud general del
sujeto tratado. Típicamente, las formulaciones farmacéuticas para
administraciones intraoculares estarán sustancialmente libres de
detergente y/o conservante o completamente libres de detergente y/o
conservante.
Las suspensiones acuosas útiles para
formulaciones oftálmicas pueden contener uno o más polímeros como
agentes de suspensión. Los polímeros útiles incluyen polímeros
solubles en agua tales como polímeros de celulosa, por ejemplo,
hidroxipropilmetilcelulosa y polímeros insolubles en agua tales como
polímeros reticulados que contienen carboxilo. Las formulaciones
oftálmicas útiles también pueden comprender un polímero mucoadhesivo
oftálmicamente aceptable, seleccionado por ejemplo entre
carboximetilcelulosa, carbómero (polímero de ácido acrílico),
poli(metilmetacrilato), poliacrilamida, policarbófilo,
copolímero de ácido acrílico/acrilato de butilo, alginato sódico y
dextrano.
Los agentes solubilizantes oftálmicamente
aceptables para ayudar en la solubilidad de cualquiera de las
composiciones de este documento incluyen agentes que dan como
resultado la formación de una solución micelar o una solución
auténtica del agente. Ciertos tensioactivos no iónicos, por ejemplo
polisorbato 80, pueden ser útiles como agentes solubilizantes, como
también pueden serlo glicoles, poliglicoles, por ejemplo,
polietilenglicol 400 y éteres de glicol. Sin embargo, en general,
tales tensioactivos y glicoles no se usan en composiciones para la
administración intraocular excepto en dosis muy bajas a causa de su
potencial para causar ciertos efectos secundarios dañinos, tales
como el desprendimiento de la retina. Por consiguiente, tales
tensioactivos y glicoles preferiblemente no se usan o, si se
requiere, se usan sólo en pequeñas cantidades.
Los agentes de ajuste de pH o agentes
tamponantes oftálmicamente aceptables útiles incluyen, por ejemplo,
ácidos tales como ácido acético, bórico, cítrico, láctico, fosfórico
y clorhídrico; bases tales como hidróxido sódico, fosfato sódico,
borato sódico, citrato sódico, acetato sódico, lactato sódico y
tris-hidroximetilaminometano; y tampones tales como
citrato/dextrosa, bicarbonato sódico y cloruro amónico. Tales
ácidos, bases y tampones se incluyen en una cantidad necesaria para
mantener el pH de la composición en un intervalo oftálmicamente
aceptable.
Las sales oftálmicamente aceptables útiles
incluyen aquellas que tienen cationes sodio, potasio o amonio y
aniones cloruro, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato,
sulfato, tiosulfato o bisulfito; las sales adecuadas incluyen
cloruro sódico, cloruro potásico, tiosulfato sódico, bisulfito
sódico y sulfato amónico.
Los tensioactivos oftálmicamente aceptables
útiles para potenciar la estabilidad física o para otros propósitos
incluyen glicéridos de ácidos grasos de polioxietileno y aceites
vegetales, por ejemplo, aceite de ricino hidrogenado con
polioxietileno (60); y alquiléteres y alquilfeniléteres de
polioxietileno; por ejemplo, octoxinol 10, octoxinol 40.
Las formulaciones farmacéuticas oftálmicas de
este documento también pueden tener la forma de un artículo sólido
que se puede insertar entre el ojo y el párpado o en el saco
conjuntival, donde libera el agente. La liberación es en el fluido
lagrimal que baña la superficie de la córnea o directamente a la
propia córnea, con la que el artículo sólido está generalmente en
contacto íntimo. Los artículos sólidos adecuados para el implante
en el ojo de esta manera están generalmente compuestos
principalmente de polímeros y pueden ser biodegradables o no
biodegradables.
El vehículo farmacéuticamente aceptable puede
ser uno que no destruya o afecte a un complejo
multi-unidad de un fragmento de ARNt sintetasa.
Las formulaciones farmacéuticas de este
documento pueden incluir además un agente terapéutico seleccionado
entre el grupo constituido por: un agente
anti-neoplásico, un agente
anti-inflamatorio, un agente antibacteriano, un
agente antiviral, un agente angiogénico y un agente
anti-angiogénico. Los ejemplos de tales agentes se
describen en este documento.
Por ejemplo, un agente
anti-neoplásico se puede seleccionar entre el grupo
constituido por Clorhidrato de Acodazol; Acronina; Adozelesina;
Aldesleuquina; Altretamina; Ambomicina; Acetato de Ametantrona;
Aminoglutetimida; Amsacrina; Anastrozol; Antramicina; Asparaginasa;
Asperlina; Azacitidina; Azetepa; Azotomicina; Batimastat;
Benzodepa; Bicalutamida; Clorhidrato de Bisantreno; Dimesilato de
Bisnafida; Bizelesina; Sulfato de Bleomicina; Brequinar Sódico;
Bropirimina; Busulfán; Cactinomicina; Calusterona; Caracemida;
Carbetimer; Carboplatino; Carmustina; Clorhidrato de Carrubicina;
Carzelesina; Cedefingol; Clorambucilo; Cirolemicina; Cisplatino;
Cladribina; Mesilato de Crisnatol; Ciclofosfamida; Citarabina;
Dacarbazina; Dactinomicina; Clorhidrato de Daunorrubicina;
Decitabina; Dexormaplatino; Dezaguanina; Mesilato de Dezaguanina;
Diazicuona; Docetaxel; Doxorrubicina; Clorhidrato de Doxorrubicina;
Droloxifeno; Citrato de Droloxifeno; Propionato de Dromostanolona;
Duazomicina; Edatrexato; Clorhidrato de Eflornitina; Elsamitrucina;
Enloplatino; Enpromato; Epipropidina; Clorhidrato de Epirrubicina;
Erbulozol; Clorhidrato de Esorrubicina; Estramustina; Fosfato de
Estramustina Sódica; Etanidazol; Aceite Etiodizado I 131;
Etopósido; Fosfato de Etopósido; Etoprina; Clorhidrato de Fadrozol;
Fazarabina; Fenretinida; Floxuridina; Fosfato de Fludarabina;
Fluorouracilo; Flurocitabina; Fosquidona; Fostriecina Sódica;
Gemcitabina; Clorhidrato de Gemcitabina; Oro Au 198; Hidroxiurea;
Clorhidrato de Idarrubicina; Ifosfamida; Imofosina; Interferón
Alfa-2a; Interferón Alfa-2b;
Interferón Alfa-n1; Interferón
Alfa-n3; Interferón \beta-1a;
Interferón \gamma-1b; Iproplatino, Clorhidrato de
Irinotecano; Acetato de Lanreotida; Letrozol; Acetato de Leuprolida;
Clorhidrato de Liarozol; Lometrexol Sódico; Lomustina; Clorhidrato
de Losoxantrona; Masoprocol; Maitansina; Clorhidrato de
Mecloretamina; Acetato de Megestrol; Acetato de Melengestrol;
Melfalán; Menogaril; Mercaptopurina; Metotrexato; Metotrexato
Sódico; Metoprina; Meturedepa; Mitindomida; Mitocarcina;
Mitocromina; Mitogilina, Mitomalcina; Mitomicina; Mitosper;
Mitotano; Clorhidrato de Mitoxantrona; Ácido Micofenólico;
Nocodazol; Nogalamicina; Ormaplatino; Oxisurano; Paclitaxel;
Pegaspargasa; Peliomicina; Pentamustina; Sulfato de Peplomicina;
Perfosfamida; Pipobromano; Piposulfano; Clorhidrato de
Piroxantrona; Plicamicina; Plomestano; Porfimer Sódico;
Porfiromicina; Prednimustina; Clorhidrato de Procarbacina;
Puromicina; Clorhidrato de Puromicina; Pirazofurina; Riboprina;
Rogletimida; Safingol; Clorhidrato de Safingol; Semustina;
Simtraceno; Esparfosato Sódico; Esparsomicina; Clorhidrato de
Espirogermanio; Espiromustina; Espiroplatino; Estreptonigrina;
Estreptozocina; Cloruro de Estroncio Sr 89; Sulofenur,
Talisomicina; Taxano; Taxoide; Tecogalan Sódico; Tegafur;
Clorhidrato de Teloxantrona; Temoporfina; Tenipósido; Teroxirona;
Testolactona; Tiamiprina; Tioguanina; Tiotepa; Tiazofurina;
Tirapazamina; Clorhidrato de Topotecano; Citrato de Toremifeno;
Acetato de Trestolona; Fosfato de Triciribina; Trimetrexato;
Glucuronato de Trimetrexato; Triptorelina; Clorhidrato de
Tubulozol; Mostaza de Uracilo; Uredepa; Vapreotida; Verteporfina;
Sulfato de Vinblastina; Sulfato de Viscristina; Vindesina; Sulfato
de Vindesina; Sulfato de Vinepidina; Sulfato de Vinglicinato;
Sulfato de Vinleurosina; Tartrato de Vinorelbina; Sulfato de
Vinrosidina; Sulfato de Vinzolidina; Vorozol; Zeniplatino;
Zinostatina; Clorhidrato de Zorrubicina.
Los agentes anti-angiogénicos
son cualquier agente que inhiba la angiogénesis, ya se hayan
descrito en este documento o sean conocidos en la técnica. En
realizaciones preferidas, un agente anti-angiogénico
es un agente anti-VEGF tal como Macugen^{TM}
(Eyetech, Nueva York, NY); o un anticuerpo
anti-VEGF.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
formular por técnicas convencionales usando uno o más vehículos,
excipientes y diluyentes adecuados. Véase, por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Sciences, (19ª edición. Williams & Wilkins,
1995).
Los ejemplos de vehículos, excipientes y
diluyentes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol,
manitol, almidones, goma arábiga, fosfato cálcico, alginatos,
silicato cálcico, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona,
celulosa, goma de tragacanto, jarabe de gelatina, metilcelulosa,
hidroxibenzoatos de metilo y propilo, talco, estearato de magnesio,
agua y aceite mineral. Otros aditivos incluyen opcionalmente
agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de
suspensión. Un vehículo oftálmico está preferiblemente en
soluciones acuosas estériles, sustancialmente isotónicas.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
formular para proporcionar liberación inmediata, sostenida o
retardada del compuesto. Para las aplicaciones que proporcionan
liberación lenta, pueden preferirse particularmente ciertos
vehículos. Los vehículos de liberación lenta adecuados se pueden
formular a partir de dextrosa, dextrano, ácido poliláctico y
diversos derivados de celulosa, por ejemplo etilhidroxicelulosa en
forma de microcápsulas.
Se pueden añadir diversos aditivos a las
formulaciones de este documento. Tales aditivos incluyen sustancias
que sirven para la emulsificación, conservación, humidificación,
mejora de la consistencia y demás y que se emplean
convencionalmente en las preparaciones farmacéuticas. Otros aditivos
incluyen compuestos que tienen propiedades tensioactivas, iónicas o
no iónicas tales como monolaurato de sorbitano, oleato de
trietanolamina, monopalmitato de polioxietilensorbitano,
sulfosuccinato de dioctil sodio, monotioglicerol, tiosorbitol, ácido
etilendiamina tetra-acético, etc.
Para indicaciones no oculares, un excipiente
puede incluir un conservante. Los conservantes adecuados para su
uso en preparaciones farmacéuticas no oculares incluyen cloruro de
benzalconio, bencetonio, alcohol feniletílico, clorobutanol,
timerosal y similares. Los tampones adecuados incluyen ácido bórico,
bicarbonato sódico y potásico, borato sódico y potásico, carbonato
sódico y potásico, acetato sódico, bifosfato sódico, Tris y
similares, en cantidades suficientes para mantener el pH entre
aproximadamente pH 3 y aproximadamente pH 9,5, más preferiblemente
entre aproximadamente pH 7 y pH 7,5. Los agentes de tonicidad
adecuados son dextrano 40, dextrano 70, dextrosa, glicerina,
cloruro potásico, propilenglicol, cloruro sódico y similares, de
modo que el equivalente de cloruro sódico en la solución oftálmica
está en el intervalo del 0,9 \pm0,2%.
Los antioxidantes y estabilizantes adecuados
incluyen bisulfito sódico y potásico, metabisulfito sódico y
potásico, tiosulfato sódico, tiourea y similares. Los agentes
humectantes y de aclarado adecuados incluyen polisorbato 80,
polisorbato 20, poloxámero 282 y tiloxapol. Los agentes de aumento
de la viscosidad adecuados incluyen dextrano 40, gelatina,
glicerina, hidroxietilcelulosa, hidroximetilpropilcelulosa,
lanolina, metilcelulosa, vaselina, polietilenglicol, alcohol
polivinílico, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa y
similares. Los estabilizantes tales como agentes quelantes que se
pueden usar incluyen, por ejemplo, EDTA, EGTA, DTPA, DOTA,
etilendiamina, bipiridina, 1,10-fenantroleno, éteres
corona, aza corona, catecoles, dimercaprol,
D-penicilamina y deferoxamina. Los antioxidantes
que pueden actuar también como estabilizantes incluyen compuestos
tales como ácido ascórbico, bisulfito sódico, palmitato de
ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado,
metabisulfito potásico y metabisulfito
sódico.
sódico.
Las formulaciones pueden incluir cápsulas,
geles, sobrecitos, comprimidos, polvos o comprimidos efervescentes
o no efervescentes, polvos o gránulos; en forma de una solución o
suspensión en líquido acuoso o no acuoso; o en forma de una
emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite.
Las cápsulas o comprimidos se pueden formular fácilmente y pueden
hacerse fáciles de tragar o masticar. Los comprimidos pueden
contener vehículos, aglutinantes, lubricantes, diluyentes, agentes
disgregantes, agentes colorantes, agentes saporíferos, agentes
inductores de flujo o agentes de fusión adecuados. Un comprimido se
puede elaborar por compresión o moldeado, opcionalmente con uno o
más ingredientes adicionales. Los comprimidos formados por
compresión se pueden preparar comprimiendo el ingrediente activo en
una forma de fluida (por ejemplo, polvos, gránulos) mezclado
opcionalmente con un aglutinante (por ejemplo, gelatina o
hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte,
conservante, disgregante (por ejemplo, almidón glicolato sódico o
carboximetilcelulosa reticulada), agente tensioactivo o
dispersante. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina,
azúcares naturales tales como glucosa o
\beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas
naturales y sintéticas tales como goma arábiga, goma de tragacanto
o alginato sódico, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, ceras o
similares. Los comprimidos se pueden revestir o ranurar
opcionalmente y se pueden formular de modo que proporcionen
liberación lenta o controlada del ingrediente activo. Los
comprimidos también pueden estar provistos opcionalmente de un
revestimiento entérico para proporcionar liberación en partes del
aparato digestivo diferentes del estómago.
Las formulaciones adecuadas para administración
tópica (por ejemplo, curación de heridas) en la boca donde el
ingrediente activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado
incluyen grageas que pueden comprender el ingrediente activo en un
vehículo aromatizado, normalmente sacarosa y goma arábiga o goma de
tragacanto; gelatina, glicerina o sacarosa y goma arábiga; y
elíxires bucales que comprenden el ingrediente activo en un
vehículo líquido adecuado. Las aplicaciones tópicas para
administración incluyen pomadas, cremas, suspensiones, lociones,
polvo, soluciones, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles o
aceites. Como alternativa, una formulación puede comprender un
parche o vendaje transdérmico tal como una venda impregnada con un
ingrediente activo y opcionalmente uno o más vehículos o
diluyentes.
Para administrarse en forma de un sistema de
suministro transdérmico, la administración de la dosificación será,
por supuesto, continua en lugar de intermitente durante todo el
régimen de dosificación. Las formulaciones tópicas pueden incluir
deseablemente un compuesto que potencie la absorción o penetración
del ingrediente activo a través de la piel u otras áreas afectadas.
Los ejemplos de tales potenciadores de la penetración dérmica
incluyen dimetilsulfóxido y análogos relacionados.
Las formulaciones adecuadas para la
administración parenteral incluyen formulaciones acuosas y no
acuosas isotónicas con la sangre del receptor pretendido; y
suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir
sistemas de suspensión diseñados para dirigir el compuesto a
componentes de la sangre o uno o más órganos. Las formulaciones se
pueden presentar en recipientes cerrados herméticamente de dosis
única o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales. Para
formulaciones intraoculares, se prefieren dosificaciones unitarias
porque no hay conservantes en la formulación. Para otras
formulaciones parenterales, se pueden usar conservantes, lo cual
permitirá recipientes multidosis.
Se pueden preparar soluciones y suspensiones
para inyección improvisada a partir de polvos estériles, gránulos y
comprimidos del tipo descrito previamente. Las formas parenteral e
intravenosa también pueden incluir minerales y otros materiales
para hacerlas compatibles con el tipo de inyección o sistema de
suministro elegido.
Las administraciones parenterales particulares
contempladas por la presente invención incluyen administraciones
intraoculares e intravítreas al ojo. Las formulaciones farmacéuticas
para administraciones intraoculares e intravítreas incluyen
solución salina taponada con fosfato (PBS) y solución salina
isotónica equilibrada (BSS) con o sin excipientes tales como
manitol o sorbitol como estabilizantes de proteínas.
En general, el agua, aceite adecuado, solución
salina, dextrosa acuosa (glucosa) o soluciones de azúcar
relacionadas y glicoles tales como propilenglicol o
polietilenglicoles son vehículos adecuados para soluciones
parenterales. Las soluciones para la administración parenteral
contienen preferiblemente el ingrediente activo, agentes
estabilizantes adecuados y, si es necesario, sustancias tamponantes.
Los agentes antioxidantes, tales como bisulfito sódico, sulfito
sódico o ácido ascórbico, solos o combinados, son agentes
estabilizantes adecuados. También se usan ácido cítrico, sales del
mismo o EDTA sódico. Además, las soluciones parenterales pueden
contener conservantes, tales como cloruro de benzalconio, metil o
propilparabeno o clorobutanol. Los vehículos farmacéuticos
adecuados se describen en Remington, citado anteriormente.
Una composición o formulación farmacéutica de
este documento puede estar liofilizada.
Las formulaciones farmacéuticas preferiblemente
tienen menos de aproximadamente 30, 20 ó 10, más preferiblemente
menos de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 o más preferiblemente menos de
0,1, 0,01 o 0,001 unidades de endotoxina por miligramo de agentes
terapéuticos.
La presente invención también contempla que
cualquiera de las composiciones (incluyendo formulaciones
farmacéuticas) de este documento se puede usar para modular la
angiogénesis en una célula o tejido. Tales procedimientos implican
poner en contacto la célula o tejido con un agente
anti-angiogénico (por ejemplo, angiostático) o
angiogénico adecuado. Por ejemplo, opcionalmente, una célula o
tejido que experimenta o es susceptible a angiogénesis (por
ejemplo, una afección angiogénica) se puede poner en contacto con un
complejo multi-unidad de un fragmento de ARNt
sintetasa o un homólogo o análogo del mismo para inhibir una
afección angiogénica. En otro casos, una célula o tejido que
experimenta o es susceptible a angiogénesis insuficiente (por
ejemplo, una afección angiostática) se puede poner en contacto con
un inhibidor de un fragmento de ARNt sintetasa, por ejemplo, un
ARNi, ácido nucleico antisentido, anticuerpo u otro agente de unión
o agente que interfiera con la actividad angiostática de un
fragmento de triptofanil ARNt sintetasa.
Las células/tejido que se pueden modular son
preferiblemente células de mamífero o más preferiblemente células
humanas. Tales células pueden estar en un estado de salud o en un
estado de enfermedad. En algunas realizaciones, una célula
cancerosa, célula tumoral o una célula que experimenta
neovascularización se pone en contacto con una composición de la
presente invención. En algunos casos, una célula que experimenta
angiogénesis debida a un aumento de VEGF, interferón \gamma y/o
TNF-\alpha se pone en contacto con una composición
de la presente invención. En un ejemplo, una célula fotorreceptora
se pone en contacto con un complejo multi-unidad de
la presente invención.
La angiogénesis se puede modular en una célula o
tejido poniendo en contacto la célula con un complejo
multi-unidad, tal como un dímero, trímero, etc. de
la presente invención. En casos preferidos, tal complejo
multi-unidad está aislado. Además, un complejo
multi-unidad puede ser soluble.
Cuando se modula la angiogénesis, la tasa de
angiogénesis puede inhibirse poniendo en contacto una célula o
tejido con una cantidad eficaz de un complejo
multi-unidad. Un ejemplo del complejo
multi-unidad incluye un primer monómero y un
segundo monómero. El primer y segundo monómeros pueden ser
diferentes, homólogos, sustancialmente homólogos o idénticos entre
sí. Cualquiera de los monómeros puede comprender un fragmento de
ARNt sintetasa. Un fragmento de ARNt sintetasa puede ser, por
ejemplo, un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa, un fragmento
de triptofanil ARNt sintetasa humana y/o cualquier fragmento
angiostático de una ARNt sintetasa. Los ejemplos de fragmentos
angiostáticos de triptofanil ARNt sintetasa incluyen los
seleccionados entre el grupo constituido por las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y cualquier homólogo y análogo de las
mismas.
Las unidades de un complejo
multi-unidad pueden estar unidas covalentemente o
unidas no covalentemente. Los monómeros unidos covalentemente se
pueden unir por cualquier procedimiento descrito en este documento,
por ejemplo, un engarce o un enlace de disulfuro. En algunos casos,
dos o más monómeros se unen mediante una o más cisteínas de origen
no natural. Tales cisteínas preferiblemente se localizan en un
dominio de dimerización de un monómero. En algunos casos, los
monómeros se unen mediante un engarce. Un engarce debe ser lo
suficientemente largo como para permitir a dos o más monómeros la
libertad de disponerse de forma productiva y dimerizar entre
sí.
Cuando se modula la angiogénesis, la tasa de
angiogénesis puede potenciarse poniendo en contacto una célula o
tejido con una cantidad eficaz de un inhibidor de un fragmento de
ARNt sintetasa que tiene actividad angiostática. Los ejemplos de
tales inhibidores incluyen, aunque sin limitación un anticuerpo, un
ácido nucleico antisentido, un ácido nucleico ARNi, un
peptidomimético, un ácido nucleico peptídico, un péptido y una
molécula orgánica o inorgánica pequeña o grande. Tales inhibidores
pueden funcionar, por ejemplo, uniéndose de forma competitiva a un
receptor de dicho fragmento de ARNt sintetasa; uniéndose al sitio de
unión de dicho fragmento de ARNt sintetasa; uniéndose a dicho
fragmento de ARNt sintetasa y cambiando su conformación; inhibiendo
la expresión de dicha ARNt sintetasa y/o inhibiendo la escisión de
una ARNt sintetasa de longitud completa que forma dicho fragmento
de ARNt sintetasa.
Las composiciones de este documento se pueden
usar para modular la estabilización y/o maduración neovascular. Por
tanto, las composiciones de este documento se pueden usar para
potenciar la curación de heridas y regular la función celular del
endotelio vascular.
Adicionalmente se contempla que cualquiera de
las composiciones de este documento se puede administrar a un
paciente susceptible a o que padece una afección asociada con la
angiogénesis aumentada (formación vascular) ("una afección
angiogénica") o una capacidad disminuida para la formación
vascular ("una afección anti-angiogénica")
(colectivamente, "afecciones mediadas por angiogénesis").
Los ejemplos de afecciones angiogénicas que
pueden tratarse/prevenirse mediante las
composiciones/procedimien-
tos incluyen, aunque sin limitación, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), afección neoplásica (tumor sólido y trastornos hematológicos), anormalidades del desarrollo (organogénesis), ceguera diabética, endometriosis, neovascularización ocular, psoriasis, artritis reumatoide (AR), tratar retinopatía del prematuro (ROP) y decoloraciones de la piel (por ejemplo, hemangioma, nevus flammeus o nevus simplex).
tos incluyen, aunque sin limitación, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), afección neoplásica (tumor sólido y trastornos hematológicos), anormalidades del desarrollo (organogénesis), ceguera diabética, endometriosis, neovascularización ocular, psoriasis, artritis reumatoide (AR), tratar retinopatía del prematuro (ROP) y decoloraciones de la piel (por ejemplo, hemangioma, nevus flammeus o nevus simplex).
Los ejemplos de afecciones
anti-angiogénicas que pueden tratarse/prevenirse
mediante las composiciones/procedi-
mientos incluyen, aunque sin limitación, enfermedad cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis (véase Moulton, K., PNAS, Vol. 100, Nº 8: 4736-4741 (2003)), restenosis (véase Brasen JH., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. Nov; 21(11): 1720-6 (2001)), enfermedad vascular periférica, enfermedad arterial periférica, daño tisular después de la reperfusión de tejido isquémico o fallo cardiaco (véase, The U. of Tenn., The Vessel, 4(1) (2003)), inflamación crónica y curación de heridas.
mientos incluyen, aunque sin limitación, enfermedad cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis (véase Moulton, K., PNAS, Vol. 100, Nº 8: 4736-4741 (2003)), restenosis (véase Brasen JH., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. Nov; 21(11): 1720-6 (2001)), enfermedad vascular periférica, enfermedad arterial periférica, daño tisular después de la reperfusión de tejido isquémico o fallo cardiaco (véase, The U. of Tenn., The Vessel, 4(1) (2003)), inflamación crónica y curación de heridas.
Por ejemplo, la presente invención describe
procedimientos para tratar o prevenir afecciones asociadas con
neovascularización ocular usando cualquiera de las
composiciones/procedimientos de este documento. Las afecciones
asociadas con la neovascularización ocular incluyen, auque sin
limitación, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada
con la edad ("ARMD"), glaucoma rubeótico, queratitis
intersticial, retinopatía del prematuro, retinopatía isquémica (por
ejemplo, células falciformes), miopía patológica, histoplasmosis
ocular, pterigia, coroidopatía punctata interna y similares.
Los ejemplos de afecciones neoplásicas que
pueden ser tratables o prevenibles mediante las
composiciones/proce-
dimientos de este documento incluyen, aunque sin limitación, cáncer mamario, cáncer de piel, cáncer de hueso; cáncer de próstata; cáncer de hígado; cáncer de pulmón; cáncer de cerebro; cáncer de la laringe; vesícula biliar; páncreas; recto; paratiroides; tiroides; glándula suprarrenal; tejido neural; cabeza y cuello; colon; estómago; bronquios; riñones; carcinoma de las células basales; carcinoma de las células escamosas de tipo tanto ulcerante como papilar; carcinoma cutáneo metastásico; osteosarcoma; sarcoma de Ewing; sarcoma de las células del retículo; mieloma; tumor de las células gigantes; tumor pulmonar microcítico; cálculos en la vesícula; tumor de las células de los islotes; tumor cerebral primario; tumores linfocítico y granulocítico agudo y crónico; leucemia de las células capilares; adenoma; hiperplasia; carcinoma medular; feocromocitoma; neuromas de la mucosa; ganglioneuromas intestinales; tumor hiperplásico del nervio de la córnea; tumor con hábito marfanoide; tumor de Wilm; seminoma; tumor de ovarios; tumor leiomiomata; displasia cervical; y carcinoma in situ; neuroblastoma; retinoblastoma; sarcoma del tejido blando; carcinoide maligno; lesión cutánea tópica; micosis fungoide; rabdomiosarcoma; sarcoma de Kaposi; sarcoma osteogénico y otros sarcomas; hipercalcemia maligna; tumor de las células renales; policitemia vera; adenocarcinoma; glioblastoma multiforme; leucemias (incluyendo leucemia mielogenosa aguda); linfomas; melanomas malignos; carcinomas epidermoides; linfoma mieloide crónico; tumores del estroma gastrointestinal y
melanoma.
dimientos de este documento incluyen, aunque sin limitación, cáncer mamario, cáncer de piel, cáncer de hueso; cáncer de próstata; cáncer de hígado; cáncer de pulmón; cáncer de cerebro; cáncer de la laringe; vesícula biliar; páncreas; recto; paratiroides; tiroides; glándula suprarrenal; tejido neural; cabeza y cuello; colon; estómago; bronquios; riñones; carcinoma de las células basales; carcinoma de las células escamosas de tipo tanto ulcerante como papilar; carcinoma cutáneo metastásico; osteosarcoma; sarcoma de Ewing; sarcoma de las células del retículo; mieloma; tumor de las células gigantes; tumor pulmonar microcítico; cálculos en la vesícula; tumor de las células de los islotes; tumor cerebral primario; tumores linfocítico y granulocítico agudo y crónico; leucemia de las células capilares; adenoma; hiperplasia; carcinoma medular; feocromocitoma; neuromas de la mucosa; ganglioneuromas intestinales; tumor hiperplásico del nervio de la córnea; tumor con hábito marfanoide; tumor de Wilm; seminoma; tumor de ovarios; tumor leiomiomata; displasia cervical; y carcinoma in situ; neuroblastoma; retinoblastoma; sarcoma del tejido blando; carcinoide maligno; lesión cutánea tópica; micosis fungoide; rabdomiosarcoma; sarcoma de Kaposi; sarcoma osteogénico y otros sarcomas; hipercalcemia maligna; tumor de las células renales; policitemia vera; adenocarcinoma; glioblastoma multiforme; leucemias (incluyendo leucemia mielogenosa aguda); linfomas; melanomas malignos; carcinomas epidermoides; linfoma mieloide crónico; tumores del estroma gastrointestinal y
melanoma.
Los procedimientos incluyen un procedimiento
para tratar a un individuo que padece una afección angiogénica
administrando al individuo una formulación farmacéutica que
comprende un complejo multi-unidad. Un complejo
multi-unidad de la presente invención es un complejo
de 2 o más monómeros, 3 o más monómeros, 4 o más monómeros, 5 o más
monómeros o 6 o más monómeros.
En algunos casos, un monómero de un complejo
multi-unidad es un fragmento de ARNt sintetasa o un
homólogo o un análogo del mismo. Preferiblemente, el fragmento de
ARNt sintetasa es un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa (SEC
ID Nº: 61-64) o cualquier homólogo o derivado del
mismo. El fragmento de ARNt sintetasa es preferiblemente un
fragmento de una ARNt sintetasa de mamífero o más preferiblemente
ARNt sintetasa humana. En algunos casos, se selecciona un monómero
del complejo multi-unidad entre el grupo constituido
por SEC ID Nº: 12-17, 24-29,
36-41 y 48-53. Un primer monómero y
un segundo monómero del complejo multi-unidad pueden
ser diferentes, homólogos, sustancialmente homólogos o idénticos.
En realizaciones preferidas, un complejo
multi-unidad es un dímero (con monómeros homólogos o
sustancialmente homólogos) o más preferiblemente un homodímero (con
monómeros idénticos).
Los dos o más monómeros en un complejo
multi-unidad pueden estar unidos covalentemente,
asociados no covalentemente o ambas cosas.
También se contempla en este documento que las
composiciones de este documento pueden interaccionar específicamente
con al menos un receptor angiogénico. Un receptor angiogénico es
cualquier receptor de superficie celular que puede mediar la
angiogénesis (incluyendo crecimiento de desarrollo anormal,
tumorigénesis, linfogénesis y vasculogénesis). Los receptores
angiogénicos se sitúan preferiblemente en una célula endotelial o
más preferiblemente una célula de endotelio vascular. En algunos
casos, las composiciones de este documento se usan para modular un
receptor angiogénico o para tratar una afección mediada por el
receptor angiogénico.
Los receptores angiogénicos conocidos incluyen,
aunque sin limitación, receptores del factor de crecimiento de
VEGF, IGF, EGF, PDGF y FGF. Otros receptores angiogénicos preferidos
incluyen moléculas de adhesión celular como se describe a
continuación. Los receptores angiogénicos también incluyen
receptores CXC o receptores de quimioquinas. Los ejemplos de
receptores CXC incluyen, aunque sin limitación, el grupo constituido
por IL8RA, IL8RB, IL8RBP, CXCR3, CXCR4, BLR1 y CXCR6. Los ejemplos
de receptores de quimioquinas incluyen, aunque sin limitación el
grupo constituido por CCR1-CCR9, GPR2,
CCRL1-CCRL2 y FPRL1.
Los procedimientos de tratamiento descritos en
este documento incluyen además administrar a un individuo que
padece una afección angiogénica, uno o más agentes terapéuticos
seleccionados entre el grupo constituido por agentes
anti-neoplásicos, agentes antivirales, agentes
anti-inflamatorios, agentes antibacterianos o
agentes anti-angiogénicos.
Tales tratamientos de combinación se pueden
conseguir administrando al individuo una
co-formulación de las composiciones de este
documento con el agente o agentes terapéuticos adicionales o
administrando las composiciones de este documento y el agente o
agentes terapéuticos como dos formulaciones farmacéuticas
diferentes. En realizaciones en las que se administra más de una
composición/agente terapéutico a un individuo, se pueden utilizar
dosificaciones más bajas de las composiciones y/o agente o agentes
terapéuticos como resultado del efecto sinérgico de los dos
ingredientes activos.
Los ejemplos de agentes
anti-neoplásicos se proporcionan en este documento y
se conocen en la técnica.
Los agentes antibacterianos que se pueden
administrar a un individuo incluyen, aunque sin limitación,
penicilinas, aminoglicósidos, macrólidos, monobactamas,
rifamicinas, tetraciclinas, cloranfenicol, clindamicina,
lincomicina, imipenem, ácido fusídico, novobiocina, fosfomicina,
fusidato sódico, neomicina, polimixina, capreomicina,
colistimetato, colistina, gramicidina, minociclina, doxiciclina,
vanomicina, bacitracina, kanamicina, gentamicina, eritromicina y
cefalosporinas.
Los agentes anti-inflamatorios
que se pueden administrar a un individuo incluyen, aunque sin
limitación, AINE (por ejemplo aspirina (salicilamida), salicilamida
sódica, indoprofeno, indometacina, trihidrato de indometacina
sódica, Bayer^{TM}, Buffering^{TM}, Celebrex^{TM},
diclofenaco, Ecotrin^{TM}, diflunisal, fenoprofeno, naproxeno,
sulindac, Vioxx^{TM}), corticosteroides o corticotropina (ACTH),
colchicina y acetato de anecortavo.
Los agentes antivirales que se pueden
administrar a un individuo incluyen, aunque sin limitación,
metilamina de
\alpha-metil-P-adamantano,
1,-D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-3-carboxamida,
9-[2-hidroxi-etoxi]metilguanina,
adamantanamina,
5-yodo-2'-desoxiuridina,
trifluorotimidina, interferón, arabinósido de adenina, CD4,
3'-azido-3'-desoxitimidina
(AZT),
9-(2-hidroxietoximetil)-guanina
(aciclovir), ácido fosfonofórmico,
1-adamantanamina, péptido T y
2',3'didesoxicitidina.
Los agentes angiogénicos que se pueden
administrar a un individuo incluyen, aunque sin limitación,
Angiogenina, Angiopoyetina-1,
Del-1, factores de crecimiento de Fibroblasto: ácido
(aFGF) y básico (bFGF), Folistatina, factor estimulante de colonias
de Granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento de
Hepatocitos (HGF)/factor de dispersión (SF),
lnterleuquina-8 (IL-8), Leptina,
Midquina, factor de crecimiento Placentario, factor de crecimiento
de las células endoteliales derivado de plaquetas
(PD-ECGF), factor de crecimiento de BB derivado de
plaquetas (PDGF-BB), Pleiotrofina (PTN),
Progranulina, Proliferina, factor de crecimiento
transformante-\alpha
(TGF-\alpha), factor de crecimiento
transformante-\beta (TGF-\beta),
factor de necrosis tumoral-\alpha
(TNF-\alpha) y factor de crecimiento del endotelio
vascular (VEGF)/factor de permeabilidad vascular (VPF).
Los agentes anti-angiogénicos
que se pueden administrar a un individuo incluyen antagonistas de
material angiogénico. La expresión "antagonistas de material
angiogénico" se usa en este documento para referirse a cualquier
molécula que inhiba la actividad biológica de un material
angiogénico. Los ejemplos de antagonistas de material angiogénico
incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos que se unen
específicamente al material angiogénico, ARNi que inhiben la
traducción del material angiogénico y otros agentes que se
unen/interfieren con la actividad biológica del material
angiogénico.
Los ejemplos de materiales angiogénicos
incluyen, aunque sin limitación: (1) factores de crecimiento y sus
receptores; (2) receptores de remodelado y morfogénicos y sus
ligandos; (3) receptores de adhesión y sus ligandos; (4) enzimas
degradantes de la matriz, tales como
Metalo-Proteinasas de la Matriz (MMP); (5) moléculas
de señalización, tales como Raf y MAPK, PKA, GTPasas de la familia
Rhos; PKB; y (6) factores de trascripción y reguladores (por
ejemplo, factor inducible por hipoxia (HIF)-1, Id
1/3 y Factor Nuclear-B) y productos génicos de
homobox (por ejemplo, HoxD3 y B3).
En algunos casos, el material angiogénico es un
factor de crecimiento y/o su receptor. Los ejemplos de receptores
de factores de crecimiento incluyen receptores de VEGF (por ejemplo,
VEGFR1 soluble, VEGFR1 (Flt-1), VEGFR2
(Flk-1) y VEGFR3 (Flt-4)) y sus
ligandos (por ejemplo, VEGF A, B, C y D). Por tanto, En algunas
realizaciones, un agente anti-angiogénico es un
antagonista de un receptor de VEGF, tal como VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3
o un antagonista de un ligando de VEGF, tal como VEGFA, VEGFB,
VEGFC o VEGFD. En algunas realizaciones, un agente
anti-angiogénico es un antagonista de un ligando de
VEGF (por ejemplo, VEGFA-VEGFD). Más
preferiblemente, un agente anti-angiogénico es un
antagonista de VEGFA. Los ejemplos de agentes
anti-VEGF, anti-angiogénicos
incluyen Avastina (Genentech, Inc.), Macugen (EyeTech
Pharmaceuticals, Inc.) o Visudyne (Novartis, Crop.) y el anticuerpo
monoclonal anti-VEGF M293. Se describen ejemplos
adicionales de agentes anti-angiogénicos
anti-VEGF en las patentes de Estados Unidos Nº
5.730.977, 6.383.484, 6.403.088, 6.479.654, 6.559.126 y
6.676.941.
Los ejemplos adicionales de factores de
crecimiento y sus receptores incluyen, aunque sin limitación,
angiogenina, angiopoyetina-1,
Del-1, factores de crecimiento de fibroblastos
("FGF") y FGFR (incluyendo aFGF ácido y bFGF básico),
folistatina, factor estimulante de colonias de granulocitos
(G-CSF), factor de crecimiento de hepatocitos
(HGF), lnterleuquina-8 (IL-8),
leptina, midquina, factor de crecimiento placentario, factor de
crecimiento endotelial derivado de plaquetas
(PD-ECGF), factor de crecimiento de BB derivado de
plaquetas (PDFG-BB), pleiotrofina (PTN),
progranulina, proliferina, factor de crecimiento transformante
(TGF)-\alpha, TGF-\beta y factor
de necrosis tumoral (TNF)-\alpha.
En algunos casos, un agente
anti-angiogénico es un antagonista de un receptor de
remodelado y morfogénico y/o ligando. Los ejemplos de receptores y
ligandos de remodelado y morfogénicos incluyen, aunque sin
limitación, los receptores de Tie (por ejemplo, Tie1 y Tie2) y sus
ligandos (por ejemplo, ANG-1, ANG-2
y ANG-3/4), así como los receptores de Efrina (por
ejemplo, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB6, EphA4) y sus ligandos
(por ejemplo, efrina B1, B2 y B3).
En algunos casos, un agente
anti-angiogénico es un antagonista de un receptor de
adhesión y/o su ligando. Los ejemplos de los receptores de adhesión
y sus ligandos incluyen, aunque sin limitación, las integrinas,
cadherinas, semoforinas y fibronectina. Existen dieciocho
subunidades \alpha y ocho \beta de mamífero que se ensamblan
para formar 24 heterodímeros diferentes de receptores de integrina.
En algunos casos, un antagonista de un receptor de adhesión es un
antagonista de un receptor de integrina vascular seleccionado entre
el grupo constituido por \alpha1\beta1, \alpha2\beta1,
\alpha3\beta1, \alpha4\beta1, \alpha5\beta1,
\alpha6\beta1, \alpha8\beta1, \alpha9\beta1,
\alphaV\beta1, \alphaV\beta3, \alphaV\beta5,
\alpha6\beta4 y \alphaV\beta8. En casos más preferidos, un
antagonista de un receptor de adhesión es un antagonista de un
receptor de integrina vascular seleccionado entre el grupo
constituido por \alpha1\beta1, \alpha2\beta1,
\alpha5\beta1 y \alphaV\beta3. En casos más preferidos, una
antagonista de un receptor de adhesión es un antagonista de
\alphaV\beta3.
\alphaV\beta3.
Los antagonistas peptídicos y de anticuerpo de
esta integrina inhiben la angiogénesis induciendo de forma
selectiva la apoptosis de las células del endotelio vascular en
proliferación. Los anticuerpos contra integrina están disponibles
en el mercado en, por ejemplo, Chemicon Internation, Biocompare,
Soretec, etc.
Existen dos rutas de angiogénesis dependientes
de citoquina y pueden definirse por su dependencia a distintas
integrinas de células vasculares, \alphaV\beta3 y
\alphaV\beta5. Específicamente, la angiogénesis inducida por
FGF básico y VEGF depende de la integrina \alphaV\beta3 y
\alphaV\beta5, respectivamente, puesto que los antagonistas de
anticuerpo de cada integrina bloquean de forma selectiva una de
estas rutas angiogénicas en modelos de córnea del conejo y membrana
corioalantoidea de pollos (CAM). Los antagonistas peptídicos que
bloquean todas las integrinas \alphaV inhiben la angiogénesis
estimulada por FGF y VEGF. Aunque los vasos sanguíneos oculares
humanos normales no presentan integrina, las integrinas
\alphaV\beta3 y \alphaV\beta5 se presentan de forma
selectiva en los vasos sanguíneos en tejidos de pacientes con
enfermedad ocular neovascular activa. Aunque solamente
\alphaV\beta3 se observó de forma uniforme en tejido de
pacientes con ARMD, \alphaV\beta3 y \alphaV\beta5 estaban
presentes ambas en tejidos de pacientes con PDR. Los antagonistas
peptídicos de integrinas administrados sistémicamente bloquearon la
formación de nuevos vasos sanguíneos en un modelo de ratón de
vasculogénesis de la retina.
Existen muchos tipos diferentes de cadherinas.
El grupo de cadherinas estudiado más ampliamente se conoce como
cadherinas clásicas o de tipo I. Las cadherinas que contienen
motivos de unión de calcio dentro de repeticiones de cadherina del
dominio extracelular, pero que no contienen una secuencia HAV CAR,
se consideran cadherinas no clásicas. Hasta la fecha, se han
identificado nueve grupos de cadherinas no clásicas (tipos
ll-X). Estas cadherinas son glicoproteínas de
membrana. Las cadherinas de tipo II o atípicas incluyen cadherina
OB, también conocida como cadherina-11 (Getsios y
col., Developmental Dynamics 211: 238-247,
(1998)); cadherina-5, también conocida como
cadherina VE (Navarro y col., J. Cell Biology 140:
1475-1484 (1998)); cadherina-6,
también conocida como cadherina K (Shimoyama y col., Cancer
Research 55: 2206-2211 (1995));
cadherina-7 (Nakagawa y col., Development
121: 1321-1332 (1995); cadherina-8
(Suzuki y col., Cell Regulation 2: 261-270
(1991)), cadherina-12, también conocida como
cadherina Br (Tanihara y col., Cell Adhesion and
Communication 2: 15-26, (1994));
cadherina-14 (Shibata y col., J. Biological
Chemistry 272: 5236-5240 (1997)),
cadherina-15, también conocida como cadherina M
(Shimoyama y col., J. Biological Chemistry 273:
10011-10018 (1998)) y cadherina PB (Sugimoto y
col., J. Biological Chemistry 271:
11548-11556 (1996)). Para una revisión general de
las cadherinas atípicas, véase Redies y Takeichi, Developmental
Biology 180: 413-423 (1996) y Suzuki y col.,
Cell Regulation 2: 261-270 (1991).
Los ejemplos adicionales de receptores
angiogénicos incluyen neuropilinas (por ejemplo
neuropilina-1 y neuropilina-2),
endoglina, PDFG\betaR, CXCR-4, Factor Tisular
("TF"), receptor de trombina, G\alpha_{13} y EP3. Se ha
sugerido que T-2 también se une a
neuropilina-1 y 2, véase, por ejemplo, Solicitud
Internacional Nº PCT/US02/23868, que tiene la publicación Nº WO
03/009813. Por tanto, la presente invención describe procedimientos
para identificar otros compañeros de unión que puedan interaccionar
específicamente con y/o unirse a tRS o más preferiblemente T2.
Tales procedimientos incluyen el uso de un sistema doble híbrido de
levadura, un sistema de biblioteca de presentación de fagos,
biblioteca de selección de péptidos, programas de formación de
imágenes por ordenador y similares.
Los agente anti-angiogénicos
pueden incluir ácidos nucleicos, polipéptidos, peptidomiméticos,
PNA, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos
orgánicos o inorgánicos pequeños o grandes que se unen a moléculas
asociadas a angiogénesis.
Otros agentes anti-angiogénicos
conocidos que se encuentran en el organismo incluyen, aunque sin
limitación, angioarrestina, angiostatina (fragmento plasminógeno),
antitrombina III anti-angiogénica, inhibidor
derivado de cartílago (CDI), fragmento CD59 del complemento,
endostatina (fragmento XVIII del colágeno), fragmento de
fibronectina, Gro-\beta, heparinasas, fragmento de
hexasacárido de heparina, gonadotropina coriónica humana (hCG),
interferón \alpha/\beta/\gamma, proteína inducible por
interferón (IP-10),
interleuquina-12, kringle 5 (fragmento
plasminógeno), inhibidores de metaloproteinasa (TIMP),
2-metoxiestradiol, inhibidor de la ribonucleasa
placentaria, inhibidor del activador de plasminógeno, factor 4 de
plaquetas (PF4), fragmento de prolactina de 16 kDa, proteína
relacionada con la proligerina (PRP), retinoides,
tetrahidrocortisol-S,
trombospondina-1 (TSP-1), factor de
crecimiento transformante-\beta, vasculostatina,
vasostatina (fragmento de calreticulina).
La administración de una composición a una
célula diana in vivo se puede conseguir usando cualquiera de
una diversidad de técnicas bien conocidas por los especialistas en
la técnica.
Por ejemplo, las composiciones se pueden
administrar sistémicamente o localmente por cualquier medio conocido
en la técnica (por ejemplo, por vía oral, por vía intraocular, por
vía intravascular (i.v.), por vía intradérmica, por vía
intramuscular, por vía transdérmica, por vía a través de la mucosa,
por vía entérica, por vía parenteral, por inhalación de
pulverización, por vía rectal o por vía tópica) en formulaciones
unitarias de dosificación y que contienen excipientes, adyuvantes y
vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales.
Para los propósitos de esta invención, la
expresión "administración oftálmica" abarca, aunque sin
limitación, inyección intraocular, inyección subretiniana,
inyección intravítrea, administración periocular, inyecciones
subconjuntivales, inyecciones retrobulbares, inyecciones
intracamerales (incluyendo en la cámara anterior o vítrea),
inyecciones o implantes subtenonianos, soluciones oftálmicas,
suspensiones oftálmicas, pomadas oftálmicas, implantes oculares e
insertos oculares, soluciones intraoculares, uso de iontoforesis,
incorporación en soluciones de irrigación quirúrgica y paquetes (a
modo de ejemplo solamente, un parche de algodón saturado insertado
en el fórnix).
Como se usa en este documento, el término
parenteral incluye por vía subcutánea, intravenosa, intramuscular,
intraesternal, técnicas de infusión o inyecciones
intra-peritoneales. Los supositorios para la
administración rectal del fármaco se pueden preparar mezclando el
fármaco con un excipiente adecuado no irritante tal como manteca de
cacao y polietilenglicoles que son sólidos a temperaturas ordinarias
pero líquidos a la temperatura rectal y, por lo tanto, se fundirán
en el recto y liberarán el fármaco.
El régimen de dosificación para tratar un
trastorno o una enfermedad con los vectores de esta invención y/o
composiciones de esta invención se basa en diversos factores,
incluyendo el tipo de enfermedad, la edad, peso, sexo, la afección
médica del paciente, la gravedad de la afección, la vía de
administración y el compuesto particular empleado. Por tanto, el
régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero se puede
determinar de forma rutinaria usando procedimientos
convencionales.
Para administración sistémica, los polipéptidos
(preferiblemente dímeros u homodímeros) y/o moléculas pequeñas se
administran preferiblemente a una dosis de al menos 0,05, 0,1, 0,2,
0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0,
7,0, 8,0, 9,0, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100 ó 150 mg/kg de peso
corporal. En otros casos, los polipéptidos (preferiblemente dímeros
u homodímeros) y/o moléculas pequeñas de este documento se
administran sistémicamente a una dosis de 0,1-100
mg/kg, más preferiblemente 0,5-50 mg/kg, más
preferiblemente 1-30 mg/kg de peso corporal o más
preferiblemente 5-20 mg/kg.
Para administración localizada, los polipéptidos
(preferiblemente dímeros u homodímeros) y/o moléculas pequeñas se
administran preferiblemente a una dosis de al menos 50 \mug, 100
\mug, 150 \mug, 200 \mug, 250 \mug, 300 \mug, 350 \mug,
400 \mug, 450 \mug, 500 \mug, 550 \mug, 600 \mug, 650
\mug o 700 \mug. En otras realizaciones, los polipéptidos
(preferiblemente dímeros u homodímeros) y/o moléculas pequeñas de
este documento se administran por vía local a una dosis de
50-1000 \mug, más preferiblemente
100-800 \mug, más preferiblemente
200-500 \mug o más preferiblemente
300-400 \mug por sitio. En otros casos los
polipéptidos (preferiblemente dímeros u homodímeros) y/o moléculas
pequeñas de este documento se administran por vía local a una dosis
de menos de 1000 \mug, 900 \mug, 800 \mug, 700 \mug, 600
\mug, 500 \mug, 400 \mug, 300 \mug, 200 \mug, 100 \mug,
50 \mug, 25 \mug, 10 \mug o 5 \mug por sitio.
Por ejemplo, para administración dérmica, los
polipéptidos (por ejemplo, dímeros) y/o peptidomiméticos y/o
moléculas pequeñas se administran a una dosis de
50-1000 \mug/cm^{2}, más preferiblemente
100-800 \mug/cm^{2} o más preferiblemente
200-500 \mug/cm^{2}. En otro ejemplo, para
administración ocular, los polipéptidos (por ejemplo, dímeros) y/o
peptidomiméticos y/o moléculas pequeñas de la presente invención se
administran en una dosis de 50-1000 \mug/ojo, más
preferiblemente 100-800 \mug/ojo o más
preferiblemente 200-500 \mug/ojo.
Las composiciones farmacéuticas preferiblemente
incluyen el ingrediente activo (por ejemplo, T2) en una cantidad
eficaz, es decir, en una cantidad eficaz para conseguir beneficio
terapéutico o profiláctico. La cantidad eficaz real para una
aplicación particular dependerá de la afección que se esté tratando
y de la vía de administración. La determinación de una cantidad
eficaz está dentro de las capacidades de los especialistas en la
técnica, especialmente a la luz de la descripción de este
documento.
Preferiblemente, la cantidad eficaz del
ingrediente activo, por ejemplo T2, es de aproximadamente 0,0001 mg
a aproximadamente 500 mg de agente activo por kilogramo de peso
corporal de un paciente, más preferiblemente de aproximadamente
0,001 a aproximadamente 250 mg de ingrediente activo por kilogramo
de peso corporal del paciente, aún más preferiblemente de
aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 100 mg de ingrediente
activo por kilogramo por peso corporal del paciente, todavía más
preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 50 mg
de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal del paciente y
lo más preferible es que sea de aproximadamente 1 mg a
aproximadamente 15 mg de ingrediente activo por kilogramo de peso
corporal del paciente.
En términos de porcentaje en peso, las
formulaciones comprenderán preferiblemente el ingrediente activo,
por ejemplo, T2-TrpRS, en una cantidad de
aproximadamente el 0,0001 a aproximadamente el 10% en peso, más
preferiblemente de aproximadamente el 0,001 a aproximadamente el 1%
en peso, más preferiblemente de aproximadamente el 0,05 a
aproximadamente 1% en peso o más preferiblemente de aproximadamente
el 0,1% en peso a aproximadamente el 0,5% en peso. En algunas
formaciones oftálmicas la composición en este documento se formula
entre 0,01-1000 mg/ml, 0,1-100
mg/ml, 1-10 mg/ml, 2-10 mg/ml,
2-9 mg/ml, 3-9 mg/ml,
4-8 mg/ml, 5-8 mg/ml,
5-7 mg/ml o 6-7 mg/ml. Para las
formulaciones sistémicas, las composiciones de este documento se
puede formular entre 0,001-100 mg/ml,
0,01-10 mg/ml, 0,1-10 mg/ml,
2-10 mg/ml, 2-9 mg/ml,
3-9 mg/ml, 4-8 mg/ml,
5-8 mg/ml, 5-7 mg/ml o
6-7 mg/ml.
Se puede seleccionar una célula o tejido para
una afección mediada por angiogénesis (por ejemplo, una afección
anti-angiogénica o una afección angiogénica). Esto
se puede conseguir mediante cualquier tecnología conocida en la
técnica. Por ejemplo, se pueden usar sondas marcadas, sondas
marcadas descritas en el documento WO 2004/011900 para identificar
y/o cuantificar fragmentos de ARNt sintetasa angiostáticos y/o
angiogénicos en una muestra. Generalmente, tales sondas marcadas
incluyen un resto de unión que es específico para un fragmento de
ARNt sintetasa (por ejemplo, miniTrp-RS, T1 o T2),
un informador detectable (tal como un grupo fluorescente) y
opcionalmente un modificador de la movilidad. El modificador de la
movilidad y el informador detectable están unidos al resto de unión
mediante un engarce escindible. El resto de unión puede ser, por
ejemplo, un anticuerpo específico para un fragmento de ARNt
sintetasa descrito en este documento (por ejemplo, un polipéptido
seleccionado entre las SEC ID Nº: 12-17,
24-29, 36-41, 48-53
y cualquier homólogo y análogo de las mismas.
Después de unir el agente diana, las marcas
escindibles pueden escindirse y separarse de acuerdo con su
movilidad. Se puede usar más de una sonda marcada de forma
simultánea para determinar el estado angiogénico de una
célula/tejido/organismo.
En algunos casos, se puede diagnosticar o
explorar un paciente para una o más afecciones asociadas con la
angiogénesis (una afección mediada por angiogénesis) antes de o
después del tratamiento. Por ejemplo, un individuo se puede
explorar para una afección seleccionada entre el grupo constituido
por adiposidad, enfermedades cardiovasculares, restenosis, cáncer,
inflamación crónica, daño tisular después de reperfusión,
neurodegeneración, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn,
enfermedad de Alzheimer, enfermad de Parkinson, diabetes,
endometriosis, psoriasis, fallo en la curación de heridas y
neovascularización ocular. Si a un paciente se le diagnostica que
tiene una afección de este tipo o es susceptible de una afección de
este tipo, se puede administrar al paciente una cantidad
terapéuticamente eficaz de las composiciones de este documento. De
forma similar, puede controlarse a un paciente después de que se
administre un tratamiento terapéutico para ver si se requieren
tratamientos adicionales.
Los procedimientos para diagnosticar o explorar
pacientes para afecciones se conocen en la técnica e incluyen la
detección de polimorfismos de un único nucleótido (SNP) o alelos que
están asociados con la resistencia o susceptibilidad a tales
afecciones. Preferiblemente, tal diagnóstico se hace usando un
dispositivo de microserie. Los ejemplos de SNP que se pueden usar
para detectar/diagnosticar a un individuo una afección neovascular
ocular (o susceptibilidad a la misma) se describen en la patente de
Estados Unidos Nº 6.713.300. Los SNP adicionales relacionados con
afecciones mediadas por angiogénesis pueden identificarse en la base
de datos dbSNP mantenida por NCBI en
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov>.
La invención de este documento también contempla
procedimientos comerciales para proporcionar productos terapéuticos
y/o de diagnóstico para tratar individuos que padecen o son
susceptibles a afecciones angiogénicas. En algunos casos, un
procedimiento comercial contempla la búsqueda de un agente que
module o se una a un receptor de fragmentos de ARNt sintetasa y la
comercialización de un agente de este tipo. Un fragmento de ARNt
sintetasa es preferiblemente un fragmento de triptofanil ARNt
sintetasa. Los fragmentos de triptofanil ARNt sintetasa de este
documento son preferiblemente de mamífero o más preferiblemente
humanos. Los ejemplos de fragmentos de triptofanil ARNt sintetasa
humanos incluyen polipéptidos que comprenden, están constituidos
esencialmente por o están construidos por las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53, homólogos y análogos de las mismas.
Preferiblemente, un fragmento de ARNt sintetasa de este documento es
angiostático. En algunos casos, la etapa de búsqueda de un agente
que module o se una a un receptor de un fragmento de ARNt sintetasa
implica usar un programa informático para generar peptidomiméticos
del fragmento de ARNt sintetasa. En algunos casos, la etapa de
búsqueda implica explorar una biblioteca de agentes candidatos para
identificar un agente que module o se una al receptor. Existen
diversas formas de bibliotecas disponibles para seleccionar agentes
candidatos. Tales bibliotecas incluyen bibliotecas peptídicas y
bibliotecas de moléculas pequeñas, así como otras descritas en este
documento o conocidas en la técnica.
La presente invención también proporciona un
procedimiento comercial que incluye las etapas de modificar un
fragmento de ARNt sintetasa para potenciar su capacidad de
dimerización y comercializar el fragmento potenciado o la forma de
dímero del mismo. De nuevo, el fragmento de ARNt sintetasa puede ser
un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa o más preferiblemente un
fragmento que son polipéptidos que comprenden, están constituidos
esencialmente por o están construidos por las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53, homólogos y análogos de las mismas. En
algunos casos, tales procedimientos comerciales contemplan el uso de
un programa informático para optimizar los fragmentos de ARNt
sintetasa de este documento. Los ejemplos de programas informáticos
que se pueden usar para optimizar un ligando incluyen, aunque sin
limitación, GRID, MCSS, AUTODOCK, DOCK, AMBER, QUANTA e INSIGHT II.
En otros casos los procedimientos comerciales de este documento
contemplan generar un vector de expresión que codifique un
fragmento de ARNt sintetasa modificado para incluir una o más
cisteínas de origen no natural. Preferiblemente, tales
modificaciones suceden en el dominio de dimerización del fragmento.
En otros casos, los procedimientos comerciales de este documento
contemplan generar un vector de expresión que codifique dos
fragmentos de ARNt sintetasa. Tales vectores pueden codificar
también un engarce que se sitúa preferiblemente entre los dos
fragmentos.
Los procedimientos comerciales de este documento
también contemplan comercializar fragmentos de una ARNt sintetasa
que modulen la angiogénesis. En algunos casos, tales fragmentos
pueden inhibir la angiogénesis (por ejemplo, fragmentos
angiostáticos de una ARNt sintetasa). En otras realizaciones, tales
fragmentos pueden potenciar la angiogénesis (por ejemplo,
inhibidores de fragmentos angiostáticos de una ARNt sintetasa).
Preferiblemente, un procedimiento comercial contempla comercializar
composiciones que se pueden usar para modular la angiogénesis.
Tales composiciones pueden ser cualquiera de las composiciones
descritas por la presente invención. Preferiblemente, tales
composiciones comprenden un primer fragmento de ARNt sintetasa que
tiene una metionina en su extremo N y un segundo fragmento de ARNt
sintetasa que no tiene una metionina en su extremo N. La metionina
puede ser de origen natural o de origen no natural. Los ejemplos de
un primer fragmento de ARNt sintetasa que tiene una metionina en su
extremo N incluyen, aunque sin limitación, las SEC ID Nº:
15-17, 27-29, 39-41,
51-53 y cualquier homólogo, análogo o fragmento de
las mismas. Los ejemplos de un segundo fragmento de ARNt sintetasa
que no tiene una metionina en su extremo N incluyen, aunque sin
limitación, las SEC ID Nº: 12-14,
24-26, 36-38, 48-50
y cualquier homólogo, análogo o fragmento de las mismas. En algunos
casos, las composiciones de este documento incluyen aproximadamente
el 50% en peso de un fragmento de ARNt sintetasa que tiene una
metionina en su extremo N y aproximadamente el 50% en peso de un
fragmento de ARNt sintetasa que no tiene metionina en su extremo N.
Preferiblemente, tales composiciones están aisladas y/o purificadas.
Tal ARNt sintetasa puede, en condiciones apropiadas, formar
dímeros.
dímeros.
Opcionalmente, la presente invención se refiere
a un procedimiento comercial que incluye las etapas de expresar un
vector de expresión que codifica un fragmento de ARNt sintetasa y
comercializar dicho fragmento para modular la angiogénesis. Un
fragmento de ARNt sintetasa puede ser, por ejemplo, un fragmento de
triptofanil ARNt sintetasa, un fragmento de ARNt sintetasa humana o
cualquier fragmento angiostático de una ARNt sintetasa. Los ejemplos
de tales fragmentos incluyen, aunque sin limitación, las SEC ID Nº:
12-17, 24-29, 36-41,
48-53 y cualquier homólogo y análogo de las
mismas.
En algunos casos, los fragmentos comercializados
son parte de un complejo multi-unidad. Un complejo
multi-unidad puede incluir dos o más unidades
monoméricas unidas covalentemente o asociadas no covalentemente.
En algunos casos, el vector de expresión también
codifica un segundo fragmento de ARNt sintetasa. El primer
fragmento de ARNt sintetasa y el segundo fragmento de ARNt sintetasa
pueden ser diferentes, homólogos, sustancialmente homólogos o
idénticos. Además, En algunas realizaciones, el primer fragmento de
ARNt sintetasa y el segundo fragmento de ARNt sintetasa se
modifican para incluir al menos una cisteína de origen no natural.
Tal cisteína de origen no natural se sitúa preferiblemente en el
dominio de dimerización de los fragmentos de ARNt sintetasa.
Un vector de expresión que codifica dos o más
fragmentos de ARNt sintetasa puede tener los dos o más fragmentos
alineados en tándem. En algunos casos, el vector de expresión
también puede codificar un engarce. La secuencia polinucleotídica
que codifica el engarce puede situarse entre la secuencia que
codifica el primero y la secuencia que codifica el segundo
fragmento de ARNt sintetasa. Un engarce es preferiblemente lo
suficientemente largo para permitir a dicho primero y dicho segundo
fragmentos de ARNt sintetasa rotar libremente y formar dímeros.
Los fragmentos y los complejos
multi-unidad de este documento se pueden preparar
transfectando una célula huésped con los vectores de expresión
descritos en este documento y manteniendo la célula huésped en
condiciones que permitan la expresión del uno o más fragmentos de
ARNt sintetasa.
Los procedimientos comerciales de este documento
también contemplan comercializar agentes de diagnóstico para la
detección de afecciones mediadas por angiogénesis (por ejemplo, una
afección angiostática o angiogénica).
Por ejemplo, un agente de diagnóstico se puede
comercializar para detectar una afección angiogénica, tal como una
afección de neovascularización ocular o AMD, de forma independiente
o en combinación con una composición angiostática descrita en este
documento (por ejemplo, un fragmento angiostático de una ARNt
sintetasa, más preferiblemente un fragmento angiostático de una
triptofanil ARNt sintetasa o más preferiblemente
mini-trpRS, T1 y/o T2). Los ejemplos de variaciones
génicas y agentes de diagnóstico que se pueden usar para detectar
afecciones de neovascularización ocular incluyen los descritos en la
Patente de Estados Unidos Nº 6.713.300.
En otro ejemplo, se puede comercializar un
agente de diagnóstico para detectar una afección
anti-angiogénica, tal como una enfermedad
cardiovascular, de forma independiente o en combinación con una
composición angiogénica descrita en este documento (por ejemplo, un
inhibidor de un fragmento angiostático de una ARNt sintetasa, tal
como una triptofanil ARNt sintetasa, por ejemplo,
mini-trpRS, T1 y/o T2).
En algunos casos, se usa un agente de
diagnóstico para medir la cantidad de una composición de la presente
invención (por ejemplo, mini-TrpRS, T1 o T2) en un
paciente o en un organismo. Tales datos se pueden usar para
estudios farmacocinéticos o farmacodinámicos. La detección de las
composiciones de este documento se puede realizar usando
procedimientos tales como ELISA, HPLC y/o cualquiera de los
anticuerpos de este documento. La cantidad o nivel de una
composición en un paciente u organismo se puede usar posteriormente
para determinar si debe administrase tratamiento adicional.
En este documento se contempla adicionalmente la
etapa de asociación con un tercero para comercializar las
composiciones y/o agentes de diagnóstico de este documento. Los
ejemplos de socios pueden incluir socios biotecnológicos, socios
farmacéuticos, socios de productos del consumidor, socios de
agricultura, socios científicos, socios gubernamentales, etc.
En algunos casos, los socios pueden proporcionar
capacidades de financiación o investigación para, por ejemplo,
descubrir análogos de las composiciones de este documento, descubrir
receptores para las composiciones de este documento, optimizar las
composiciones, realizar ensayos clínicos sobre las composiciones de
este documento, desarrollar inhibidores para las composiciones de
este documento, etc.
La invención también proporciona un kit que
comprende uno o más recipientes cargados con una o más de las
composiciones de este documento. Los kits pueden incluir
instrucciones por escrito sobre cómo usar tales composiciones (por
ejemplo, para modular la angiogénesis o tratar a un paciente que
padece una afección angiogénica).
En un caso, un kit comprende un recipiente donde
el recipiente comprende una o más de las composiciones de este
documento. Los ejemplos de composiciones que pueden estar en un
recipiente incluyen: una composición que comprende un fragmento
aislado de ARNt sintetasa que tiene una secuencia de aminoácidos que
comprende, está constituida esencialmente por o está constituida
por la SEC ID Nº: 12-17, 24-29,
36-41, 48-53 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas. Preferiblemente, tal fragmento de ARNt
sintetasa no incluye una marca His. Además, si un fragmento de ARNt
sintetasa comprende, está constituido esencialmente por o está
constituido por la SEC ID N: 12, 15, 24, 27, 36, 39, 48, 51 o
cualquier homólogo o análogo de las mismas, entonces tal fragmento
de ARNt sintetasa es preferiblemente de menos de 45 kD, más
preferiblemente menos de 44 kD, 43,9 kD, 43,8 kD, 43,7 kD, 43,6 kD
o más preferiblemente menos de 43,5 kD. Si un fragmento de ARNt
sintetasa comprende, está constituido esencialmente por o está
constituido por la SEC ID Nº: 13, 16, 25, 28, 37, 40, 49, 52 o
cualquier homólogo y análogo de las mismas, entonces tal fragmento
de ARNt sintetasa es preferiblemente de menos de 48 kD, más
preferiblemente de menos de 47 kD o más preferiblemente de menos de
46 kD. Si un fragmento de ARNt sintetasa comprende, está
constituido esencialmente por o está constituido por la SEC ID Nº:
14, 17, 26, 29, 38, 41, 50, 53 o cualquier homólogo o análogo de
las mismas, entonces tal fragmento de ARNt sintetasa es
preferiblemente de menos de 53 kD, más preferiblemente de menos de
52 kD, más preferiblemente de menos de 51 kD, más preferiblemente
de menos de 50 kD o más preferiblemente de menos de 49 kD.
Preferiblemente un fragmento de ARNt sintetasa en un recipiente
está purificado.
En algunos casos, un kit comprende un recipiente
que comprende un complejo multi-unidad, en el que al
menos una unidad del complejo multi-unidad
comprende un fragmento de ARNt sintetasa o un homólogo o análogo del
mismo. Un complejo multi-unidad puede ser, por
ejemplo, un dímero que tiene dos unidades. Los monómeros de un
complejo multi-unidad pueden ser diferentes entre
sí, homólogos, sustancialmente homólogos o idénticos. En algunos
casos, un complejo multi-unidad es un dímero que
tiene dos monómeros homólogos.
En algunos casos, un kit incluye un recipiente
que comprende un primer fragmento de ARNt sintetasa y un segundo
fragmento de ARNt sintetasa, en el que el primer fragmento de ARNt
sintetasa tiene una metionina en su extremo N. Preferiblemente,
tales fragmentos de ARNt sintetasa son fragmentos de triptofanil
ARNt sintetasa. Más preferiblemente, el primer fragmento de ARNt
sintetasa tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, está
constituida esencialmente por o está constituida por las SEC ID Nº:
15-17, 27-29, 39-41,
51-53 o cualquier homólogo, análogo o fragmento de
las mismas. Preferiblemente, tales fragmentos de ARNt sintetasa no
incluyen una marca His.
El segundo fragmento de ARNt sintetasa pueden
tener o puede no tener una metionina en su extremo N. Los ejemplos
de fragmentos de ARNt sintetasa que no tienen una metionina en su
extremo N incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de
aminoácidos que comprende, que está constituida esencialmente por o
está constituida por la SEC ID Nº: 12-14,
24-26, 36-38, 48-50
o cualquier homólogo o análogo o fragmento de las mismas.
Preferiblemente, tales fragmentos de ARNt sintetasa no incluyen una
marca His.
En algunos casos, el primer y segundo fragmentos
de ARNt sintetasa son aproximadamente el 50% en peso de la
composición. También se pueden utilizar otras proporciones de un
primer y segundo fragmentos de ARNt sintetasa.
Un fragmento de ARNt sintetasa puede ser un
fragmento de triptofanil ARNt sintetasa, una triptofanil ARNt
sintetasa humana y/o cualquier fragmento angiostático de un
fragmento de ARNt sintetasa. Tales fragmentos pueden formar
adicionalmente complejos multi-unidad que pueden
estar unidos covalente o no covalentemente.
La composición en el primer recipiente puede
envasarse para administración sistémica o administración local.
Preferiblemente, las composiciones se envasan en dosificaciones
unitarias únicas. Cuando se envasan en dosificaciones unitarias
únicas, una dosis puede variar entre 50-1000
\mug/dosis.
El kit de este documento también puede incluir
un segundo agente terapéutico. Tal segundo agente terapéutico puede
estar contenido en un segundo recipiente. Los ejemplos de un segundo
agente terapéutico incluyen, aunque sin limitación, un agente
anti-neoplásico, un agente
anti-inflamatorio, un agente antibacteriano, un
agente antiviral, una agente angiogénico y un agente
anti-angiogénico. En casos preferidos, un segundo
agente terapéutico es un agente
anti-angiogénico.
En cualquiera de los kits de este documento, una
composición que comprende un fragmento de ARNt sintetasa puede
tener un pI experimental mayor de 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 ó 7,5.
Un kit puede incluir un recipiente que comprende
un anticuerpo que se une específicamente a un epítope de un
fragmento de ARNt sintetasa e instrucciones por escrito para el uso
del mismo. En tales ejemplos, el fragmento de ARNt sintetasa puede
ser un fragmento de triptofanil ARNt sintetasa, un fragmento de ARNt
sintetasa humana y/o cualquier fragmento angiostático de una ARNt
sintetasa. En algunas realizaciones, un fragmento angiostático de
ARNt sintetasa es uno seleccionado entre el grupo constituido por
las SEC ID Nº: 12-17, 24-29,
36-41, 48-53 y cualquier homólogo y
análogo de las mismas.
Los kits de este documento también pueden
incluir una o más jeringas u otros dispositivos de administración
(por ejemplo, endoprótesis vasculares, depósitos implantables,
etc.). Los kits pueden incluir también un conjunto de instrucciones
por escrito para el uso de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se prepararon TrpRS humanas recombinantes libres
de endotoxinas (variantes GD y SY) de la siguiente manera: Se
prepararon plásmidos que codifican TrpRS de longitud completa
(restos de aminoácido 1-471 de la SEC ID Nº: 1 y la
variante SY de los mismos) o TrpRS truncadas, denominados en lo
sucesivo T2 (SEC ID Nº: 12 (variante GD) o SEC ID Nº: 24 (variante
SY)), constituido esencialmente por los restos
94-471 de la TrpRS de longitud completa y un
segundo fragmento de TrpRS truncada, denominado en lo sucesivo T1
(SEC ID Nº: 13 (variante GD) o SEC ID Nº: 25 (variante SY)),
constituido esencialmente por los restos 71-471 de
TrpRS de longitud completa.
Cada plásmido también codificaba una marca
C-terminal constituida por seis restos de histidina
(por ejemplo, restos de aminoácido de 472-484 de la
SEC ID Nº: 1) y un resto inicial de metionina. El T1 marcado con
His_{6} (SEC ID Nº: 13 y 25) tenía la secuencia de aminoácidos de
la SEC ID Nº: 5 (o variante SY de la misma), mientras que el T2
marcado con His_{6} tenía la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 7 (o variante SY de la misma).
Los plásmidos anteriores que contenían las
variantes SY y GD de T2 se introdujeron en la cepa BL 21 de E.
Coli (DE 3) (Novagen, Madison, Wis.). De forma similar, se
preparó EMAPII madura humana, que codificaba también una marca
C-terminal de 6 restos de histidina, para su uso. La
sobreexpresión de la TrpRS recombinante se indujo tratando las
células con isopropil
\beta-D-tiogalactopiranósido
durante 4 horas. Las células se lisaron después y las proteínas del
sobrenadante se purificaron en columnas de afinidad a níquel
HIS-BIND® (Novagen^{TM}) de acuerdo con el
protocolo sugerido por el fabricante. Después de la purificación,
las proteínas de TrpRS se incubaron con solución salina tamponada
con fosfato (PBS) que contenía ZnSO_{4} 1 \muM y después se
retiró el Zn^{2+} libre (Kisselev y col., Eur. J. Biochem.
120: 511-17 (1981)).
La endotoxina se retiró de las muestras de
proteína mediante separación de fases usando Triton
X-114 (Liu y col. Clin. Biochem. 30:
455-63 (1997)). Se determinó que las muestras de
proteína contenían menos de 0,01 unidades de endotoxina por ml
usando un ensayo de gel-clot
E-TOXATE® (Sigma, St. Louis, Mo.). La concentración
de proteínas se determinó mediante el ensayo de Bradford
(Bio-Rad, Hercules, Calif.) usando albúmina de suero
bovino (BSA) como un patrón.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Ejemplo
2
Se examinó la escisión de TrpRS humana de
longitud completa mediante PMN elastasa. La TrpRS se trató con PMN
elastasa en PBS (pH 7,4) a una proporción de proteasa:proteína de
1:3000 durante 0, 15, 30 ó 60 minutos. Después de la escisión, las
muestras se analizaron en geles de
SDS-poliacrilamida al 12,5%. La escisión con PMN
elastasa de una TrpRS de longitud completa de aproximadamente 53
kDa generó un fragmento principal de aproximadamente de 46 kDa (SEC
ID Nº: 5, T1, que tenía la marca de histidina
C-terminal o una variante SY de la misma) y un
fragmento secundario de aproximadamente 43,5 KDa (SEC ID Nº: 7, T2
que tenía la marca de histidina C-terminal o la
variante SY de la misma). En particular, la escisión de TrpRS de
longitud completa (variante SY) mediante PMN elastasa generó un
fragmento principal de aproximadamente 46 KDa (SEC ID Nº: 25) y un
fragmento secundario de aproximadamente 43,5 KDa (SEC ID Nº:
24).
Los análisis de transferencia de Western con
anticuerpos dirigidos contra la marca His_{6}
carboxilo-terminal de las proteínas TrpRS
recombinantes mostró que ambos fragmentos, que eran evidentes a
aproximadamente 46 KDa y 43,5 KDa para las variantes GD o SY,
poseían la marca His_{6} en sus extremos carboxilo. De este modo,
solamente el extremo amino de dos fragmentos de TrpRS se vio
truncado. Las secuencias amino-terminales de los
fragmentos de TrpRS se determinaron mediante degradación de Edman
usando un secuenciador ABI Modelo 494. La secuenciación de estos
fragmentos mostró que las secuencias del extremo N eran
S-N-H-G-P
para T1 y
S-A-K-G-l
para T2, indicando que los restos amino terminales de los
fragmentos principal y secundario de TrpRS se situaban en las
posiciones 71 y 94, respectivamente, de la TrpRS de longitud
completa. Estas construcciones de TrpRS humana para la variante GD
se resumen en la Figura 1.
La actividad angiostática de los fragmentos
principal y secundario de TrpRS se analizó en ensayos de
angiogénesis. Se usaron formas recombinantes de los fragmentos
principal y secundario de TrpRS SEC ID Nº: 5 y 7 (y variantes SY de
las mismas), teniendo cada uno una marca de histidina
C-terminal (restos de aminoácidos
472-484 de la SEC ID Nº: 1) en estos ensayos. Las
variantes tanto GD como SY de los fragmentos
T2-TrpRS fueron capaces de inhibir la
angiogénesis.
Ejemplo
3
La actividad angiostática de formas truncadas
obtenidas de triptofanil ARNt sintetasa de longitud completa se
examinó en un modelo de angiogénesis de la retina en ratones después
del nacimiento. Friedlander y col. (Abstracts
709-B84 y 714-B89, IOVS
41(4): 138-139 (15 de marzo de 2000))
informaron que la angiogénesis de la retina después del nacimiento
en el ratón evoluciona por etapas. La presente invención proporciona
un procedimiento para ensayar la inhibición de la angiogénesis
explotando esta vascularización de la retina por etapas.
Se prepararon mini-TrpRS y T2
recombinantes libres de endotoxinas (por ejemplo, SEC ID Nº: 12 y
24) como proteínas recombinantes. Estas proteínas se inyectaron por
vía intravítrea en ratones Balb/C neonatos en los días 7 u 8
después del nacimiento (P) y las retinas se recogieron en P12 o P13.
Se usaron anticuerpos contra colágeno IV y anticuerpo secundario
conjugado con fluoresceína para visualizar los vasos en las
preparaciones completas de retina. La actividad
anti-angiogénica se evaluó mediante un examen con
microscopio confocal basándose en el efecto de las proteínas
inyectadas sobre la formación del plexo vascular profundo y
superficial. La inyección intravítrea y el aislamiento de la retina
se realizaron con un microscopio de disección (SMZ 645, Nikon,
Japón). Se creó una fisura del párpado en ratones en el día 7
después del nacimiento (P7) con una cuchilla fina para exponer el
globo para la inyección de T2 (5 pmol) o TrpRS (5 pmol). Las
muestras (0,5 \mul) se inyectaron con una jeringa equipada con
una aguja del calibre 32 (Hamilton Company, Reno, Nev.). La
inyección se realizó entre el ecuador y el limbo de la córnea;
durante la inyección la situación de la punta de la aguja se
controló mediante visualización directa para determinar que estaba
en la cavidad vítrea. Los ojos con daño en el cristalino o la
retina inducido por la aguja se excluyeron del estudio. Después de
la inyección, los párpados se volvieron a colocar en su sitio para
cerrar la fisura.
En el día 12 después del nacimiento, (P12), los
animales se sacrificaron y se extirparon los ojos. Después de 10
minutos en paraformaldehído al 4% (PFA) la córnea, el cristalino, la
esclerótica y el humor vítreo se extirparon a través de una
incisión en el limbo. La retina aislada se preparó para tinción
empapándola en metanol durante 10 minutos en hielo, seguida de
bloqueo en suero fetal bovino al 50% (Gibco, Grand Island, N.Y.)
con suero normal de cabra al 20% (The Jackson Laboratory, Bar
Harbor, Me.) en PBS durante 1 hora en hielo. Los vasos sanguíneos
se visualizaron específicamente tiñendo la retina con un anticuerpo
de conejo anti-colágeno IV de ratón (Chemicon,
Temecula, Calif) diluido 1:200 en tampón de bloqueo durante 18 horas
a 4ºC. Se incubó un anticuerpo de cabra anti-IgG de
conejo conjugado con ALEXA FLUOR® 594 (Molecular Probes, Eugene,
Oregon - dilución 1:200 en tampón de bloqueo) con la retina durante
2 horas a 4ºC. Las retinas se colocaron en portaobjetos con medio M
de montaje de disipación lenta (Molecular Probes, Eugene,
Oregon).
La actividad angiostática se evaluó en base al
grado de angiogénesis en la capa vascular de la retina profunda y
exterior (capa secundaria) que se forma entre P8 y P12. La aparición
de la red interna de vasos sanguíneos (capa principal) se evaluó
para determinar el desarrollo normal y signos de toxicidad. Ninguna
de las construcciones de proteínas usadas en este ejemplo produjo
ningún efecto adverso sobre la capa principal.
La Figura 2 proporciona una representación
fotomicrográfica de la capacidad de T2 para inhibir la
vascularización de la red profunda secundaria de la retina de
ratón. En la Figura 2, la fila A muestra la red vascular de una
retina expuesta a TrpRS, la fila B muestra la red vascular de una
retina expuesta a mini-TrpRS y la fila C muestra la
red vascular de una retina expuesta al polipéptido T2 de la presente
invención. La primera columna (izquierda) muestra la red
superficial principal y la segunda columna muestra la red profunda
secundaria. Como es evidente a partir de la Figura 2, ninguno de
los polipéptidos influyó en la red superficial principal, mientras
que solamente T2 inhibió de forma significativa la vascularización
de la red profunda secundaria.
La mayoría de los ojos tratados con PBS
mostraban un desarrollo vascular de la retina normal, pero se
observó la inhibición completa de la capa vascular exterior en
aproximadamente el 8,2% (n=73) de los ojos tratados. La inhibición
completa de la red exterior se observó en el 28% de los ojos
tratados con mini-TrpRS (0,5 mg/ml) (n=75). La
forma truncada más pequeña (T2) fue un inhibidor mucho más potente
de la angiogénesis de manera dependiente de la dosis; el 14,3% se
inhibieron completamente después del tratamiento con 0,1 mg/ml de T2
(n=14), el 40% después de tratamiento con 0,25 mg/ml (n=20) y el
69,8% se inhibieron completamente después de 0,5 mg/ml (n=53). Los
datos para los tratamientos de 0,5 mg/ml se presentan gráficamente
en la Figura 3. Las formas truncadas de TrpRS humana, especialmente
T2 (por ejemplo, SEC ID Nº: 12, 24, 36 y 48), tiene un efecto
angiostático potente sobre el desarrollo vascular de la retina.
Ejemplo
4
Se usó un ensayo de angiogénesis matrigel en
ratón para examinar la actividad angiostática de T2 (SEC ID Nº: 7 o
variante SY del mismo) de acuerdo con los procedimientos descritos
por Brooks y col. Methods Mol. Biol., 129: 257-269
(1999) y Eliceiri y col. Mol. Cell, 4: 915-924
(1999). Se realizó como se describe con las siguientes
modificaciones. A ratones atímicos WEHI se les implantaron por vía
subcutánea 400 \mul de matrigel agotado en factor de crecimiento
(Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.) que contenía VEGF 20 nM. La
actividad angiostática de T2 se ensayó inicialmente incluyendo T2
2,5 \muM en el tapón de Matrigel. La potencia se determinó
incluyendo diversas concentraciones de T2 en el tapón. En el día 5,
se inyectó por vía intravenosa a los ratones la lectina de unión
endotelial marcada con fluoresceína, Griffonia (Bandeiraea)
Simplicifolia I, isolectina B4 (Vector Laboratories,
Burlingame, Calif.) y los tapones de matrigel se resecaron. El
contenido de fluoresceína de cada tapón se cuantificó mediante
análisis espectrofotométrico después de moler el tapón en tampón
RIPA (fosfato sódico 10 mM, pH 7,4, cloruro sódico 150 mM, Nonidet
P-40 al 1%, desoxicolato sódico al 0,5% y
dodecilsulfato sódico al 0,1%). Los datos en el Ejemplo cuatro se
ilustran en la Figura 4.
Ejemplo
5
Para evaluar la captación y localización de T2
inyectado en la retina, se inyectó T2-TrpRS marcado
con ALEXA® 488 (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon) en el humor
vítreo del ojo el día 7 después del nacimiento (P7). Se recogieron
los globos en P8 y P12 y se fijaron en PFA al 4% durante 15 minutos.
Las retinas se disecaron adicionalmente libres de tejido no
retiniano adherente y se colocaron en PFA al 4% durante una noche a
4ºC y después se embebieron en medio (TISSUE-TEK®
O.C.T., Sakura Fine Technical Co., Japón) en hielo seco. Las
secciones de criostato (10 micrómetros) se rehidrataron con PBS y se
bloquearon con BSA al 5% y suero normal de cabra al 2% en PBS. Los
vasos sanguíneos se visualizaron con anticuerpo
anti-colágeno IV de ratón como se ha descrito
anteriormente. Se usó tinción nuclear DAPI que contiene VECTASHIELD®
(Vector Laboratories, Burlingame, Calif.) para colocar los tejidos
en un portaobjetos con un cubreobjetos.
Como alternativa, se incubaron secciones de
retina sin teñir con TrpRS de longitud completa marcada con ALEXA®
488 200 nM o T2 marcado con ALEXA® 488 en tampón de bloqueo durante
una noche a 4ºC. Las secciones se lavaron seis veces durante 5
minutos cada vez en PBS, seguido de la incubación con 1 \mug/ml de
DAPI durante 5 minutos para la visualización de los núcleos. Se
realizó un prebloqueo con T2 sin marcar incubando T2 sin marcar 1
\muM durante 8 horas a 4ºC antes de la incubación con T2 marcado
con ALEXA® 488. Las retinas se examinaron con un microscopio
confocal multifotón BioRad MRC1024. Se produjeron imágenes
vasculares tridimensionales a partir de un conjunto de imágenes de
serie Z usando el software Confocal Assistant (BioRad, Hercules,
Calif.).
Se examinaron fragmentos de T2 (SEC ID Nº: 7 y
su variante SY) para determinar si tenían actividad angiostática,
incluso aunque habían perdido actividad de aminoacilación. El ensayo
de matrigel en ratón se usó para examinar la actividad angiostática
de T2 in vivo. VEGF_{165} induce el desarrollo de vasos
sanguíneos en el tapón de matrigel de ratón. Cuando se añadió T2 al
matrigel junto con VEGF_{165}, la angiogénesis se bloqueó de
manera dependiente de la dosis con una CI_{50} de 1,7 nM como se
muestra en la Figura 4.
El T2 marcado con ALEXA® 488 se sitúa en los
vasos sanguíneos de la retina. Para visualizar la localización
intraocular de T2, se examinó la distribución de T2 marcado con
ALEXA® 488 después de la inyección intravítrea en el día 7 después
del nacimiento. Las retinas se aislaron al día siguiente, se
seccionaron y se examinaron usando microscopía confocal. La
distribución de la proteína inyectada estaba restringida a los vasos
sanguíneos. Esta situación se confirmó mediante
co-tinción de ojos tratados con T2 marcado con un
anticuerpo de conejo anti-colágeno IV de ratón
(datos no mostrados) y secundariamente con un anticuerpo de cabra
anti-IgG de conejo marcado con ALEXA FLUOR® 594.
Cinco días después de la inyección de T2 marcado con ALEXA FLUOR®
488 (en el P12), la fluorescencia verde del T2 marcado todavía era
visible (Figura 5A). En estas retinas, no se observó capa vascular
secundaria en el P12, indicando que el T2 marcado con ALEXA FLUOR®
488 retenía la actividad angiostática en comparación con el T2 sin
marcar. Las retinas inyectadas en P7 con TrpRS de longitud completa
marcada con ALEXA FLUOR® 488 desarrollaron una capa vascular
secundaria en el P12 pero no se observó tinción vascular (Figura
5B). En la Figura 5 las proteínas marcadas con ALEXA FLUOR® 488 son
verdes, los vasos que contienen colágeno marcado con ALEXA FLUOR®
594 son rojos y los núcleos son azules.
Para evaluar adicionalmente las propiedades de
unión del T2 marcado, se tiñeron cortes de sección transversal de
retinas de neonatos normales con T2 marcado con ALEXA FLUOR® 488. En
estas condiciones, el T2 marcado con ALEXA FLUOR® 488 sólo se unió
a los vasos sanguíneos (Figura 5C). La unión fue específica puesto
que se bloqueaba mediante preincubación con T2 sin marcar (datos no
mostrados). No se observó tinción de vasos de la retina cuando se
aplicó TrpRS de longitud completa marcada con ALEXA FLUOR® 488 a las
retinas (Figura 5D), coherente con la ausencia de actividad
angiostática de la enzima de longitud completa.
Como se muestra en la Figura 5, T2 marcado con
ALEXA FLUOR® 488 es angiostático y se localiza en los vasos
sanguíneos de la retina. T2 marcado con ALEXA FLUOR® 488 (Figura 5A)
o TrpRS de longitud completa (Figura 5B) se inyectaron (0,5 \mul,
por vía intravítrea) en el día 7 después del nacimiento (P7). Las
retinas se recogieron en P8 y se tiñeron con un anticuerpo
anti-colágeno IV y tinción nuclear DAPI. El T2
marcado (flecha superior señalando los vasos en la Figura 5A) se
localizaba en los vasos sanguíneos en la red superficial principal
(1º). Obsérvese que la red profunda secundaria está completamente
ausente (2º). Aunque las capas vasculares principal (1º) y
secundaria (2º) están presentes en los ojos inyectados con TrpRS de
longitud completa marcada con ALEXA FLUOR® 488 (flechas en la
Figura 5B), no se observa marcado.
En un estudio diferente, se tiñeron secciones
congeladas de retinas de P15 con T2 marcado con ALEXA FLUOR® 488
(Figura 5C) o TrpRS de longitud completa marcada con ALEXA FLUOR®
488 (Figura 5D) y se formaron imágenes en el microscopio de
exploración láser confocal. El T2 marcado se situaba de forma
selectiva en los vasos sanguíneos y aparece como un vaso verde
brillante que penetra en las capas vasculares de la retina principal
y secundaria, justamente por debajo de la marca "2º" en la
Figura 5C. No se observó tinción con TrpRS de longitud completa
marcada fluorescentemente (Figura 5D).
La TrpRS de longitud completa contiene un
dominio NH_{2} terminal único y carece de actividad angiostática.
La retirada de parte de este dominio completo muestra una proteína
con actividad angiostática. El dominio NH_{2} terminal que puede
eliminarse mediante corte y empalme alternativo o mediante
proteolisis, puede regular la actividad angiostática de TrpRS,
posiblemente mostrando un sitio de unión necesario para angiostasis
que es inaccesible en la TrpRS de longitud completa.
La angiogénesis inducida por VEGF en el modelo
de matrigel de ratón se inhibió completamente mediante T2 como
también la angiogénesis fisiológica en la retina de neonatos.
Curiosamente, el efecto anti-angiogénico más
potente de los fragmento de TrpRS in vitro y en CAM y en
modelos de matrigel se observa en angiogénesis estimulada por VEGF.
Los resultados de angiogénesis de la retina de ratón neonato son
coherentes con un enlace entre angiogénesis estimulada por VEGF y
los efectos angiostáticos de los fragmentos de TrpRS; la
angiogénesis de la retina en este sistema puede estar dirigida por
VEGF. Además, la inhibición observada en el modelo de la retina era
específica para vasos de desarrollo reciente; los vasos de la capa
vascular principal pre-existentes (en el momento de
la inyección) no se alteraron mediante el tratamiento. Aunque no se
conoce el mecanismo para la actividad angiostática de T2, la
localización específica de T2 en la vasculatura endotelial de la
retina y el efecto selectivo de T2 en vasos sanguíneos de desarrollo
reciente sugiere que T2 puede funcionar a través de un receptor de
células endoteliales expresado en células que proliferan o que
migran. Una comprensión adicional del mecanismo de la actividad
angiostática de T2 requiere identificación más detallada del
mecanismo de acción.
Diversos tipos celulares que producen, después
de estimulación con interferón-\gamma, la
mini-TrpRS angiostática producen también factores
angiostáticos tales como IP-10 y MIG. De este modo,
estos resultados plantean la posibilidad de un papel para TrpRS en
las rutas normales fisiológicamente pertinentes de la angiogénesis.
Otra proteína celular ubicua, pro-EMAPII (p43),
tiene dos papeles aparentemente no relacionados similares a los
presentados en este documento para TrpRS. Pro-EMAPII
ayuda a la traducción de proteínas asociándose con el complejo
multi-sintetasa de las aminoacil ARNt sintetasas de
mamífero. La misma se procesa y se secreta como EMAPII y se ha
sugerido un papel para EMAPII como un mediador angiostático durante
el desarrollo pulmonar.
De este modo, T2 se puede utilizar en remodelado
angiogénico fisiológicamente pertinente observado en condiciones
normales o patológicas. En la angiogénesis normal, T2 puede ayudar a
establecer zonas sin vasos fisiológicamente importantes presentes
en algunos órganos tales como la zona no vascular de la fóvea de la
retina central. La angiogénesis patológica se puede producir si se
inhibe la escisión de TrpRS de longitud completa, conduciendo a un
sobrecrecimiento de los vasos.
En las enfermedades oculares, la
neovascularización puede conducir a una pérdida catastrófica de
visión. Estos pacientes pueden recibir potencialmente un gran
beneficio de la inhibición terapéutica de la angiogénesis. El
factor de crecimiento endotelial vascular se ha asociado con
neovascularización y edema macular en la retina aunque se cree que
otros estímulos angiogénicos tienen también papeles en la
angiogénesis de la retina. Se ha observado una asociación entre
angiogénesis estimulada por VEGF y la potente actividad angiostática
de los fragmentos de TrpRS, haciendo a estas moléculas útiles en el
tratamiento de retinopatía hipóxica y otras retinopatías
proliferativas. No hay informes en la bibliografía de un agente
anti-angiogénico que inhiba completamente la
angiogénesis el 70% del tiempo, como hace el T2 de la presente
invención (Figura 5). Otra ventaja de los fragmentos de TrpRS es
que estos representan agentes anti-angiogénicos de
origen natural y por lo tanto, potencialmente no inmunogénicos. Por
tanto, estas moléculas se pueden administrar mediante terapia basada
en células o vectores virales dirigidos. Puesto que muchos
pacientes con enfermedades oculares neovasculares tienen enfermedad
isquémica sistémica asociada, es deseable el tratamiento
anti-angiogénico local con células manipuladas
genéticamente o vectores virales colocados directamente en el
ojo.
Además del tratamiento de retinopatías
angiogénicas, los fragmentos de TrpRS de la presente invención,
particularmente T2-TrpRS y fragmentos que inhiben
la angiogénesis del mismo, podrían inhibir también potencialmente el
crecimiento de tumores sólidos previniendo la vascularización del
tumor. Los fragmentos de TrpRS de la presente invención bloquean la
proliferación y quimiotaxis inducida por VEGF de las células
endoteliales in vitro y, por lo tanto, son útiles en el
tratamiento de cualquier patología que implica proliferación y
vascularización de células endoteliales no deseada.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
La Tabla 6 a continuación resume diversas
construcciones de vectores de fragmentos de ARNt sintetasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores identificados en la Tabla 6 se
prepararon mediante los siguientes procedimientos:
Plásmido pAS-001. El
fragmento T2-TrpRS se amplificó mediante PCR usando
un clon de longitud completa de TrpRS (Invitrogen, clon 3542671)
como un molde. Los oligonucleótidos para PCR se basaron en la
secuencia de T2-TrpRS y contenían un sitio
5'-NdeI y un sitio 3'-HindIII (en
cursiva y en negrita) (5'GGA GAT ATA CAT ATG AGT GCA
AAA GGC ATA GAC TAC 3' (SEC ID Nº: 77) y 5' TGC GGC CGC
AAG CTT TCA CTG AAA GTC GAA GGA CAG CTT CC 3' (SEC ID
Nº: 78)). Después de la amplificación, el fragmento de PCR
purificado se escindió con NdeI y HindIII y después se clonó en
estos mismos sitios digeridos por restricción de plásmido pET24b+
(Novagen). El plásmido resultante contenía una secuencia de
T2-TrpRS, seguida inmediatamente por un codón de
terminación. Por lo tanto, la secuencia de marca His no estaba
fusionada a la secuencia génica de T2-TrpRS.
Plásmidos pAS-002. El
fragmento de T2-TrpRS se amplificó mediante PCR
usando el clon de TrpRS de longitud completa (Invitrogen, clon
3542671) como un molde. Los oligonucleótidos para PCR contenían un
sitio 5'-NdeI y un sitio 3'-HindIII
(en cursiva y en negrita) (5' TGG ACA GTA CAG CAT ATG
AGT GCA AAA GGC ATA GAC TAC 3' (SEC ID Nº: 79) y 5' TGC GGC CGC
AAG CTT CTG AAA GTC GAA GGA CAG CTT CCG 3' (SEC ID Nº:
80)). Después de la amplificación, el fragmento de PCR purificado
se escindió con NdeI y HindIII y después se clonó en estos mismos
sitios digeridos por restricción del plásmido pET20b+ (Novagen). El
plásmido resultante contenía una fusión génica en fase entre la
secuencia de la marca de His carboxi-terminal
presente en el vector pET20b+ y el T2-TrpRS.
Plásmido pAS-004. Se usó
la introducción mediada por oligonucleótidos basada en PCR de un
sitio de escisión de trombina para modificar la secuencia del
vector de pAS-002. Los oligonucleótidos de PCR se
basaron en la secuencia de T2-TrpRS y contenían un
sitio de escisión de trombina (en negrita y en cursiva)
(5'-GCT GTC CTT CGA CTT TCA GTC TTC TGG TCT
GGT GCC ACG CGG TTC TAA GCT TGC GGC GGC ACT CGA GCA CCA CC
3' (SEC ID Nº: 81) y 5' GGT GGT GCT CGA GTG CGG CCG CAA GCT
T AG AAC CGC GTG GCA CCA GAC CAG AAG A CT GAA AGT CGA
AGG ACA GC 3' (SEC ID Nº: 82)). Durante la reacción de PCR, los
cebadores se hibridan a la misma secuencia en hebras opuestas del
plásmido y después se extienden con ADN polimerasa Pfu turbo
(Stratagene), generando plásmidos con la inserción de trombina
inmediatamente cadena arriba de la marca 6-His. El
sitio de escisión de trombina permite la retirada de la marca
6-His después de la purificación de la proteína.
Plásmido pAS-006. El
fragmento mini TyrRS se amplificó mediante PCR usando el clon TyrRS
de longitud completa (Invitrogen, 4386850) como un molde. Los
oligonucleótidos para PCR contenían un sitio 5'-NdeI
y un sitio 3'-XhoI (en cursiva y en negrita) (5'
CCT GCT CAA CAT ATG GGG GAC GCT CCC AGC CCT GAA GAG 3'
(SEC ID Nº: 83) y 5' CCA GCC GCT CGA GGA TGA CCT CCT
CTG GTT CTG AAT TC 3' (SEC ID Nº: 84)). Después de la amplificación,
el fragmento de PCR purificado se escindió con NdeI y XhoI y
después se clonó en estos mismos sitios digeridos por restricción
del plásmido pET24b+ (Novagen). El plásmido resultante contenía una
fusión génica en fase entre la secuencia de la marca His
carboxi-terminal presente en el vector pET24b+ y el
mini TyrRS.
Plásmido pAS-007. El
fragmento mini-TrpRS se amplificó mediante PCR
usando el clon de TrpRS de longitud completa (Invitrogen, 3542671)
como un molde. Los oligonucleótidos para PCR contenían un sitio
5'-NdeI y un sitio 3'-HindIII (en
negrita y en cursiva) (GTG TCA TTA CAT ATG AGC TAC AAA
GCT GCC GCG GGG 3' (SEC ID Nº: 85) y 5' CGA TGG G AA GCT
T CT GAA AGT CGA AGG ACA GCT TCC G 3' (SEC ID Nº: 86)).
Después de la amplificación, el fragmento de PCR purificado se
escindió con NdeI y HindIII y después se clonó en estos mismos
sitios digeridos por restricción del plásmido pET24b+ (Novagen). El
plásmido resultante contenía una fusión génica en fase entre la
secuencia de la marca His carboxi-terminal presente
en el vector pET24b+ y el mini TyrRS.
Plásmido pAS-009. El
fragmento mini-TrpRS se amplificó mediante PCR
usando el clon de longitud completa de TyrRS (Invitrogen, clon
4386850) como un molde. Los oligonucleótidos para PCR se basaban en
la secuencia de mini TyrRS y contenían un sitio
5'-NdeI y un sitio 3'-XhoI (en
negrita y en cursiva) (5' CCT GCT CAA CAT ATG GGG GAC
GCT CCC AGC CCT GAA GAG 3' (SEC ID Nº: 87) y 5' CCA GCC G CT
CGA GTC AGA TGA CCT CCT CTG GTT CTG AAT TC 3' (SEC ID Nº:
88)). Después de la amplificación, el fragmento de PCR purificado se
escindió con NdeI y XhoI y después se clonó en estos mismos sitios
digeridos por restricción del plásmido pET24b+ (Novagen). El
plásmido resultante contenía una secuencia de
T2-TrpRS, seguida inmediatamente por un codón de
terminación. Por lo tanto, la secuencia de la marca His no estaba
fusionada con la secuencia génica de T2-TrpRS.
En el caso de pAS-002 y
pAS-007, el gen para mini TyrRS o
T2-TrpRS se fusionó a una marca
6-His para ayudar en la purificación a partir del
sistema de huésped para materiales de calidad de investigación. Sin
embargo, la marca 6-His no se usó en el sistema
final elegido para la expresión y purificación de material para el
desarrollo pre-clínico.
Transformaciones. Se añadieron plásmidos
a células químicamente competentes de E. coli BL21 (DE3)
(Novagen) y se dejó que incubaran en hielo durante 30 minutos.
Después de la incubación, la mezcla de células/ADN se sometió a
choque térmico durante 45 segundos a 42ºC. Se permitió que las
células se recuperaran a 37ºC en un agitador durante 30 minutos y
después se sembraron en placas LB con el antibiótico apropiado.
Purificación de Proteínas. La expresión
de la calidad de investigación (proteínas marcadas con His) de la
proteína en BL21 (DE3) se indujo a A_{600} = 0,6 mediante la
adición de
\beta-D-tiogalactopiranósido de
isopropilo 1 mM (Novagen) durante 4 horas. Las células se recogieron
mediante centrifugación, se alisaron en hielo mediante sonicación
en el tampón de columna (Tris-HCl 20 mM (pH 7,9),
NaCl, 500 mM, imidazol 30 mM y
\beta-mercaptoetanol 5 mM) y el lisado se aclaró
mediante centrifugación a 35.000 g durante 30 minutos. El
sobrenadante se cargó en una columna de afinidad
Ni-NTA (Qiagen) pre-equilibrada con
tampón de columna. La columna se lavó con tampón de columna que
contenía Triton-X 114 al 0,1% (Sigma) para disociar
el lipopolisacárido (LPS) de la proteína, seguido de un tampón de
columna adicional para retirar el detergente residual. La proteína
se eluyó con un gradiente de imidazol 30-250 mM en
tampón de columna y se almacenó en PBS (pH 7,5)/Glicerol al 50% y
DTT 2 mM. Las proteínas purificadas se ensayaron para determinar
endotoxina mediante el ensayo de Lisado de Amebocitos de Limulus
(LAL) (BioWhittaker). Todas las proteínas purificadas tenían una
pureza mayor del 95% a juzgar por la electroforesis en gel de
poliacrilamida (Geles Bis-Tris NuPAGE al
4-12%, Invitrogen). La concentración de proteínas
se determinó mediante el ensayo de Bradford usando el reactivo de
Ensayo de Proteínas Bio-Rad
(Bio-Rad).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se transfectaron células de E. coli con
un vector de la SEC ID Nº: 70 identificado en el Ejemplo 6
anteriormente. El producto de proteína T2 producido se purificó
hasta aproximadamente el 95% de pureza mediante los siguientes
procedimientos:
En el siguiente procedimiento de alteración
celular y aclarado de lisado, todas las etapas se realizaron a 4ºC
y el pH de todos los tampones se ajustó a 4.
La masa total de la pasta celular recogida del
tanque de fermentación se dividió en siete lotes, conteniendo cada
lote aproximadamente 90 g de pasta celular. La pasta celular para
cada lote se mezcló durante aproximadamente 3 minutos con 950 ml de
Tampón de Lisis frío (Tris 25 mM, pH 8,0, Glicerol al 10%, EDTA 1
mM) usando un homogeneizador.
La suspensión de cada lote se pasó después dos
veces a través de un homogeneizador de alta presión Avestin
EmulsiFlex C-50 a 68,93 a 137,86 MPa (10.000 a
20.000 psi) y se recogió en hielo, teniendo cuidado de que la
temperatura del lisado no superara los 10ºC. El homogeneizador se
lavó después abundantemente con tampón de lisis para retirar el
lisado residual.
El lisado (\sim1150 ml) de cada lote se
centrifugó después a 38.250 g durante 55 minutos. El sobrenadante
(\sim1100 ml) se conservó y los sedimentos se descartaron. Para
cada lote, el sobrenadante se cargó en la columna HP de Q Sepharose
lo más rápido posible (véase cromatografía de Q Sepharose). Se
realizaron todas las etapas anteriores para la alteración celular y
el aclarado de cualquier lote adicional de células, seguido de la
carga inmediata en la columna de Q Sepharose después del
aclarado.
El sobrenadante del procedimiento de
centrifugación se cargó en una columna de Alto Rendimiento de Q
Sepharose de 2,2 l (13 cm de diámetro y 16,6 cm de altura). La
carga de la proteína en la columna no debe superar 5 ml de lisado
por ml de resina. La columna se equilibró previamente con 2,5 l de
Tampón B (Tris 25 mM, pH 8,0, glicerol al 10%, NaCl 1 M) seguido de
11 l de Tampón A (Tris 25 mM, pH 8,0, glicerol al 10%). El caudal de
carga (para el material soluble) era de 20-50
ml/min (aproximadamente 10-25 cm/h) y el flujo a
través de la columna se recogió.
La columna se lavó con 30 volúmenes de columna
(66 l) de Tampón A a 60 ml/min (\sim30 cm/h). La columna se eluyó
después con un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna (44 l),
de Tampón A a Tampón B al 20% a 100 ml/min (\sim50 cm/h) y se
recogieron fracciones de 500 ml durante el pico de elución
("fracciones Q"). Las fracciones Q se analizaron mediante
SDS-PAGE (para tanto la cantidad de
T2-TrpRS en la fracción como la pureza relativa del
material) y las fracciones que contenían las cantidades mayores de
T2-TrpRS purificado se combinaron. La HPLC de fase
inversa representa una alternativa posible al uso de
SDS-PAGE para análisis de las fracciones.
La combinación total de fracciones Q se filtró a
4ºC a través de dos cartuchos de filtración para la reducción de
endotoxinas Pall con una membrana Mustang E a 10 ml/min, recogiendo
el flujo que pasaba a través. La muestra se dividió entre los dos
cartuchos de filtro y se expuso a la membrana de filtro solamente
una vez. Aproximadamente el 93% de la proteína total se recuperó
después de la filtración para la reducción de endotoxinas.
La combinación filtrada de reducción de
endotoxinas (8500 ml) se concentró hasta <1 l usando un filtro
de Flujo Cruzado (Ultrafiltración) (límite de peso molecular de
10.000) a presiones de 0,03-0,05 MPa
(5-7 psi). El filtrado se recogió y se comprobó
mediante ensayo de Bradford para fuga de polipéptidos. La
combinación concentrada (<1 l) se diluyó cinco veces con tampón
A de CM (HEPES 25 mM pH 8,0, glicerol 10%) para aumentar el volumen
de la muestra hasta 5 l. La conductividad de la combinación de
dilución final fue de 1,02 mS, mientras que la conductividad del
Tampón A de CM fue de 0,74 mS.
La muestra del procedimiento de intercambio de
tampón se cargó en una columna de Flujo Rápido de CM Sepharose de
1300 ml (13 cm de diámetro, 9,8 cm de altura), equilibrada
previamente con 6,5 l de Tampón A (HEPES 25 mM pH 8,0, glicerol al
10%). El caudal de carga fue de 90 ml/min (\sim40 cm/h). La
columna se lavó con 15 volúmenes de columna (19,5 l) de Tampón A a
70 ml/min (\sim30 cm/h). La columna se eluyó después con un
gradiente lineal de 20 volúmenes de columna (26 l), desde Tampón A
a Tampón B al 50% (HEPES 25 mM pH 8,0, glicerol al 10%, NaCl 1 M) a
100 ml/min (\sim50 cm/h) y se recogieron fracciones de 500 ml
durante el pico de elución. Las fracciones de CM se analizaron
mediante SDS-PAGE (para tanto la cantidad de
T2-TrpRS en la fracción como la pureza relativa del
material) y las fracciones que contenían las cantidades más grandes
de T2-TrpRS purificada se combinaron. La HPLC de
fase inversa representa una alternativa posible al uso de
SDS-PAGE para el análisis de las fracciones.
Las fracciones de CM combinadas (5500 ml) se
concentraron a aproximadamente 150 ml usando un filtro de Flujo
Cruzado (Ultrafiltración) (límite de peso molecular de 10.000
Dalton) a presiones de 0,01-0,05 MPa
(2-7 psi). Las fracciones de filtrado se recogieron
y se comprobaron mediante ensayo de Bradford para la filtración de
polipéptidos. La combinación concentrada (145 ml) se dializó frente
a 15 l de tampón de almacenamiento final (fosfato sódico 5 mM pH
7,4, NaCl 150 mM, glicerol al 50%) usando tuberías de diálisis que
tienen un límite de peso molecular de 6000-8000
Dalton a 4ºC (\sim16 horas).
La combinación dializada (\sim50 ml) se retiró
de la diálisis y los ensayos se completaron sobre la muestra. El
volumen final de la muestra concentrada fue de 52 ml y la
concentración final de la muestra fue de 26,3 mg/ml en base al
ensayo de Bradford convencional. El análisis en
SDS-PAGE desnaturalizante final de la muestra se
completó para una determinación de la pureza y se ilustra en la
Figura 9. Los carriles 1 y 10 ilustran los Marcadores de Proteína
BenchMark MW de Invitrogen. Los dos marcadores de peso molecular
pesados y los tres marcadores de peso molecular más ligeros entre
ellos se identifican en la parte izquierda del gel. Sus pesos
moleculares varían de 20 kDa a 50 kDa. Los carriles 2 y 9 son
blancos. Los carriles 3 - 8 ilustran diversas cantidades de
producto de T2-TrpRS final. Como puede visualizarse,
el producto de T2-TrpRS producido mediante
transfección de E. coli de la SEC ID Nº: 70 tiene un peso
molecular de aproximadamente 43 kDa. El nivel de endotoxinas de
esta muestra, medido usando un ensayo de endotoxinas PyroGene^{TM}
de Invitrogen Corporation, se determinó que era 6,25 U.E./mg de
proteína.
La Tabla 2 a continuación ilustra el análisis de
producto de T2-TrpRS de diversas etapas del
protocolo de purificación descrito anteriormente.
Ejemplo
8
Se produjo T2-TrpRS bajo en
endotoxinas mediante la expresión en un huésped de E. coli
(BL21-DE3) usando un plásmido dirigido por T7 que
tiene la secuencia SEC ID Nº: 70. Las células se cultivaron en
condiciones de cGMP para producir tanto el Banco Celular Maestro
(MCB) como el Banco Celular de Trabajo (WCB).
El medio de cultivo (extracto de levadura 46,4
g/l, glicerol 4 g/l y glucosa 4 g/l) se preparó y se esterilizó por
filtración. Se añadió kanamicina a la solución a una concentración
final de 50 \mug/ml de medio. Se transfirieron alícuotas de medio
de cultivo de 250 ml a siete matraces estériles de 1 l y se usaron
para la inoculación.
Para el procedimiento se usó un inóculo de etapa
única. Se descongeló un vial de WCB antes de la inoculación. Se
seleccionaron cuatro matraces de agitación para procedimientos de
proceso adicionales. Se retiraron (50) ml de medios de 3 matraces
de agitación no usados para el procesamiento posterior del ensayo de
bioacumulación. Se añadió una alícuota de WCB de 0,2 ml a cada uno
de cuatro matraces de agitación de 1 l que contenían 0,25 l de
medio de cultivo. Se usó una punta de pipeta estéril entre cada
matraz. Los matraces se incubaron a 37ºC, 200 rpm en un agitador de
ambiente controlado durante 8-10 horas. Un matraz de
los cuatro se usó para controlar el crecimiento y los otros tres se
usaron para inocular el fermentador. Durante la incubación del
matraz de agitación, el fermentador se llenó con medio de
fermentación, se esterilizó por calor y se dejó enfriar. La
composición del medio de fermentación fue la siguiente: 37,1 g/l de
extracto de levadura, 6,67 g/l de KH_{2}PO_{4}, 9,67 g/l de
K_{2}HPO_{4},18,6 g/l de Na_{2}HPO_{4}, 1,47 g/l de
NH_{4}Cl y 0,736 g/l de NaCl.
Se añadieron materiales adicionales tales como
la solución de alimentación (7,3 g/l de MgSO_{4} anhidro, 160 g/l
de glicerol, 0,22 g/l de CaCl_{2} y 32,0 g/l de glucosa) y
solución de elementos traza (27,0 g/l de
FeCl_{3}\cdot6H_{2}O, 1,3 g/l de ZnCl_{2}, 1,0 g/l de
CuCl_{2}\cdot2H_{2}O, 2,0 g/l de CoCl_{2}, 2,0 g/l de
(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}\cdot4H_{2}O, 0,5 g/l de
ácido bórico, 100 ml/l de HCl concentrado) a la mezcla de reacción
en las proporciones correctas (0,147 l/l y 0,0022 ml/l,
respectivamente). Se añadió solución antiespumante Pluronic
L-61 (25%, v/v) al fermentador a una proporción de
0,02 ml/l de solución de fermentación. Se añadió kanamicina
adicional al fermentador para mantener la selección de células
transfectadas. El pH de la solución se llevó a 7,0, usando
hidróxido de amonio o ácido fosfórico y la temperatura se mantuvo
a
37ºC.
37ºC.
Después de que el cultivo de los matraces de
muestra alcanza una DO_{600} de 3, los contenidos de los otros
tres matraces de agitación se combinaron y se usan para inocular el
medio de fermentación en el fermentador. Los contenidos de la
combinación de inóculo, menos el volumen de las muestras, se
añadieron al fermentador. La DO_{600} se midió inmediatamente
después de la inoculación a intervalos de 1 hora. La agitación se
aumentó y el oxígeno se complementó según fue necesario para
mantener el oxígeno disuelto (OD) por encima del 30% usando
controles automáticos. Cuando el fermentador alcanzó una DO_{600}
de 10, las muestras de pre-inducción se tomaron y
se procesaron.
La inducción se realizó mediante la adición de
IPTG hasta una concentración final de 0,1 mM. El crecimiento se
controló cada hora hasta que el glicerol se agotó. El consumo del
glicerol dio como resultado un pico en el OD a las
6-8 horas después de la inducción. En este punto, se
tomaron y se procesaron las muestras. La suspensión restante se
preparó para la recogida de células.
El procedimiento de recogida comenzó
disminuyendo el ajuste de temperatura a 10ºC. Los controles de pH y
OD se detuvieron y el agitador se ralentizó a 100 rpm. Cuando la
temperatura de la suspensión alcanzó 25ºC, los contenidos del
fermentador se distribuyeron a frascos de centrífuga. La suspensión
se centrifugó a 4000 (3300 x g nominales) rpm durante 15 minutos a
2-8ºC. Se recogieron los sedimentos celulares, se
pesaron y se resuspendieron en Tampón de Lisis Celular (3,02 g/l de
base tris, 0,29 g/l de EDTA y 100 g/l de glicerol, pH 8,0) de modo
que para cada 1 g de pasta celular, se usaron 10 ml de tampón y se
almacenaron a 2-8ºC hasta la lisis. Las células
suspendidas se homogenizaron después con 3 pases a través de un
Avestin Emulsiflux 50 a >62,04 MPa (9000 psi) a
2-8ºC. La suspensión homogeneizada se dispensó en
frascos de centrífuga y se centrifugó a 4000 rpm durante 45 minutos
a 2-8ºC. El sobrenadante se recogió y se almacenó a
2-8ºC a la espera de procesamiento adicional.
Los procedimientos de procesamiento general
corriente abajo se muestran en la Figura 8. El procedimiento de
purificación siguió el esquema general de las siguientes etapas:
aclarado del sobrenadante; cromatografía en columna de alto
rendimiento de Q Sepharose; filtración en Mustang E;
concentración/intercambio de tampón; cromatografía en columna de
flujo rápido de CM Sepharose; concentración/intercambio de tampón; y
filtración estéril y carga.
\vskip1.000000\baselineskip
Se descargó tampón de Lisis a través de un
filtro de cápsula estéril de 0,45/0,2 micrómetros (membrana
Sartobran P, de 2 pies cuadrados (0,186 m^{2})) mientras se
mantenía una presión de < 0,14 MPa (20 psig). Se retira todo el
aire del sistema. El sobrenadante se pasó a través del sistema a una
velocidad de 130-150 ml/min. La velocidad de la
bomba se ajustó para conseguir < 0,17 MPa (25 psi) de
contrapresión. La solución resultante se denominó el
"Sobrenadante Aclarado".
El primer sistema de cromatografía en columna se
diseñó para aumentar la pureza de la proteína seleccionando sus
características de unión y elución. Durante esta etapa, la pureza de
la proteína aumentaba aproximadamente hasta el 90% y las
endotoxinas se reducían hasta aproximadamente el 5% del contenido
inicial (UE/mg proteína).
Se cargó resina de HP Q Sepharose en una columna
Amersham BPG 200/500 y se desinfectó con hidróxido sódico 0,5 N. El
volumen aproximado del lecho de resina era de 5 l. La columna se
conectó a un sistema de Cromatografía Bioprocess Amersham de 6 mm.
Todas las soluciones se cebaron y el sistema se lavó abundantemente
con un mínimo de cinco (5) volúmenes de columna del tampón de carga
(Tris 25 mM + glicerol al 10% (p/p), pH 8,0). El Sobrenadante
Aclarado se cargó en la columna a un caudal de 9,4 l/hora. La
columna se lavó con tampón de lavado (Tris 25 mM + glicerol al 10%
(p/p) + NaCl 30 mM, pH 8,0) a una velocidad de 9,4 l/hora hasta que
12 volúmenes de columna de la solución pasaron a través de la
columna y la absorbancia (A_{280nm}) cayó hasta <0,05 UA. El
producto se eluyó de la columna pasando el tampón de elución (Tris
25 mM + glicerol al 10% (p/p) + NaCl 80 mM, pH 8,0) a través de la
columna a una velocidad de 15 l/hora. El producto se eluyó en un
volumen de nueve (9) volúmenes de columna, que se recogió como seis
(6) fracciones de 1000 ml (F1 - F6), seguido de veinte (20)
fracciones de 2000 ml (F7 - F26). El pico se recogió hasta que la
absorbancia (A_{280nm}) volvió a 0,04 UA por encima de la medida
inicial. Se tomaron muestras de cada fracción y se analizaron para
determinar el contenido de T2-TrpRS. Las fracciones
se almacenaron a 2-8ºC hasta que se completaron los
análisis. Cuando las fracciones que contenían \geq20% de pureza
de T2-TrpRS se identificaron, se combinaron en un
recipiente y se les dio el nombre nuevo "Combinación de Q
Sepharose HP". La columna se limpió pasando tampón de
regeneración (tris 25 mM + glicerol al 10% (p/p) + NaCl 1 M, pH
8,0) a través de la columna durante un mínimo de cinco (5) volúmenes
de columna a un caudal de 9,1 l/hora. En lo sucesivo, la columna se
desinfectó pasando hidróxido sódico 0,5 N a través de la columna a
una velocidad de 17 l/hora durante cinco (5) volúmenes de columna.
La columna se almacenó en hidróxido sódico 0,1 N.
El sistema de filtración Mustang E era un
sistema de filtración en fase sólida diseñado específicamente para
retirar endotoxinas de la solución. Esta etapa no dio como resultado
ningún aumento apreciable en la cantidad de
T2-TrpRS en comparación con la cantidad total de
proteína, es decir, la pureza de T2-TrpRS en
relación con otros polipéptidos en la solución.
Una cápsula Pall Mustang E (NP6MSTGEP1) se
conectó a una bomba peristáltica y se lavó abundantemente con Agua
para Inyección (WFI). La presión se mantuvo a < 0,14 MPa (20
psig) y el aire se liberó abriendo la válvula de purgado en el lado
no estéril (entrada) del filtro. Se pasaron aproximadamente tres (3)
l de WFI a través del filtro. La Combinación de Q Sepharose HP se
pasó a través del filtro hasta una bombona despirogenada a una
velocidad que produce una presión de entrada de < 0,14 MPa (20
psig). Cuando quedaban menos de 500 ml de la Combinación de Q
Sepharose HP, se añadieron dos (2) l de tampón de lavado Q Sepharose
(Tris 25 mM + glicerol al 10% (p/p) + NaCl 30 mM, pH 8,0) a la
combinación. El ajuste de la bomba se redujo y el material restante
se filtró. El filtrado resultante se denominó el "Filtrado Mustang
E".
Este sistema de ultrafiltración/diafiltración se
diseñó para reducir el volumen y cambiar el sistema de tampón al
del próximo sistema de cromatografía (Cromatografía en Columna de
Flujo Rápido de CM Sepharose).
Un sistema de Ultrafiltración Diafiltración
Pellicon 2 (UFDF) se equipó con cinco (5) filtros de flujo cruzado
de 10 kDa 0,1 m^{2}. El sistema se lavó abundantemente con un
mínimo de 20 l de WFI y el caudal de agua limpia (CWF) se calculó a
una presión transmembrana (TMP) de 0,07 MPa (10 psig). El sistema se
desinfectó con un mínimo de 10 l de hidróxido sódico 0,5 N a una
TMP de 0,03 MPa (5 psig). El hidróxido sódico se purgó del sistema
con WFI. El sistema se lavó abundantemente con un mínimo de 10 l de
tampón de carga de flujo rápido (FF) de CM Sepharose (HEPES 25 mM +
glicerol al 10% (p/p), pH 8,0). El sistema se cargó con una solución
recién preparada de tampón de carga FF de CM Sepharose y el
filtrado Mustang E se conectó a la tubería de entrada. El filtrado
Mustang E se concentró hasta un volumen final de 15 l a una TMP de
0,07-0,08 MPa (10-12 psig). Cuando
la concentración estaba completa, la diafiltración en el tampón de
carga FF CM Sepharose comenzó usando seis veces el volumen del
filtrado Mustang E concentrado. Cuando la conductividad de la
solución alcanzó 1,3 mS/cm, la diafiltración estaba completa. La
solución final se denominó "Material Retenido UFDF Nº 1". El
sistema se lavó con cloruro sódico 0,5 N y WFI entre usos y se
almacenó en hidróxido sódico 0,1 N.
El segundo sistema de cromatografía en columna
se diseñó para aumentar la pureza de la proteína seleccionando sus
características de unión y elución. Durante esta etapa, la pureza de
la proteína aumentó hasta \geq 98% y las endotoxinas se redujeron
hasta < 10 UE/mg proteína.
Se cargó resina FF de CM Sepharose en una
columna Amersham BPG 200/500 y se desinfectó con hidróxido sódico
0,5 N. El volumen aproximado del lecho de resina era de 3,2 l. La
columna se conectó a un sistema de Cromatografía Bioprocess de
Amersham de 6 mm. Todas las soluciones se cebaron y el sistema se
lavó abundantemente con un mínimo de cinco (5) volúmenes de columna
del tampón de carga (HEPES 25 mM + glicerol al 10% (p/p), pH 8,0).
El Material Retenido UFDF Nº1 se pasó a través de un filtro de
cápsula Opticap de 4 pulgadas (10,16 cm) (0,2 \mum de tamaño de
poro) a < 0,14 MPa (20 psig) y la solución se reetiquetó
"Filtrado del Material Retenido UFDF Nº1". Esta última
solución se cargó inmediatamente en la columna de CM Sepharose a
31,4 l/hora. En lo sucesivo, la columna se lavó con 15 volúmenes de
columna del tampón de carga al mismo caudal hasta que la
absorbancia (A_{280nm}) cayó hasta < 0,01 UA y se usó el
volumen total del tampón de lavado. El producto se eluyó de la
columna pasando tampón de elución (HEPES 25 mM + NaCl 1,0 M +
glicerol al 10%, pH 8,0) a una velocidad de 31,4 l/hora durante
seis (6) volúmenes de columna. El volumen de elución se recogió como
fracciones (F1, F2, etc.) en aumentos de 1 l hasta que la
absorbancia (A_{280nm}) cayó hasta 0,01 UA por encima de la
medida inicial. Se tomaron muestras de cada fracción y se analizaron
para el contenido de T2-TrpRS. Las fracciones se
almacenaron a 2-8ºC hasta que todos los análisis se
completaron (no superar las 24 horas). La columna se lavó pasando
un tampón de regeneración (HEPES 25 mM + glicerol al 10% (p/p) +
NaCl 1 M, pH 8,0) a través de la columna durante un mínimo de cinco
(5) volúmenes de columna a una velocidad de 31,4 l/hora. A partir
de entonces, la columna se desinfectó pasando hidróxido sódico 0,5 N
a través de la columna a una velocidad de 31,4 l/hora durante cinco
(5) volúmenes de columna. La columna se almacenó en hidróxido sódico
0,1 N.
\vskip1.000000\baselineskip
Este sistema de ultrafiltración/diafiltración se
diseñó para reducir el volumen y cambiar el sistema de tampón al de
la formulación de sustancia de fármaco final (fosfato sódico 5 mM +
cloruro sódico 150 mM, pH 7,4).
Un sistema de Ultrafiltración Diafiltración
Pellicon 2 (UFDF) se equipó con un (1) filtro de flujo cruzado de
10 kDa 0,1 m^{2}. El sistema se lavó abundantemente con un mínimo
de 10 l de WFI y se calculó el CWF a una TMP de 0,03 MPa (5 psig).
El sistema se desinfectó con un mínimo de 5 l de hidróxido sódico
0,5 N a una TMP de 0,03 MPa (5 psig). El hidróxido sódico se purgó
del sistema con WFI. El sistema se lavó abundantemente con un
mínimo de 2 l de tampón de formulación de sustancia de fármaco
final. El sistema se cargó con una solución recién preparada de
tampón de formulación de sustancia de fármaco final y las fracciones
de elución CM que se identificó que tenían >95% de pureza de
contenido de T2-TrpRS se recombinaron y se mezclaron
suavemente y se denominaron la "Combinación de Elución de CM
Sepharose". En el modo de Ultrafiltración, la Combinación de
Elución de CM Sepharose se concentró hasta una diana de 15,0 g/l a
una TMP de 0,07-0,08 MPa (10-12
psig). Cuando la concentración estaba completa, comenzó la
diafiltración en el tampón de formulación de sustancia de fármaco
final usando ocho veces el volumen de la Combinación de Elución de
CM Sepharose concentrada. Cuando se completó la diafiltración, el
sistema se drenó y se envió una muestra a Control de Calidad para
una medida estadística de concentración y pureza de proteínas. Si
la concentración estaba en el intervalo de 10 - 15 mg/ml, la etapa
de UFDF estaba completa. Si la concentración estaba fuera de este
intervalo, el sistema se reiniciaba y se tomaban medidas de
corrección para ajustar la concentración dentro del intervalo
especificado. El sistema se limpió con cloruro sódico 0,5 N y WFI
entre usos y se almacenó en hidróxido sódico 0,1 N.
\vskip1.000000\baselineskip
La solución final se pasó a través de un filtro
Millipak 20 (0,22 \mum) en frascos PETG estériles de 1 l. Las
unidades de endotoxinas se midieron a 0,003 U.E. por mg de
proteína.
La Figura 6 ilustra las medidas del pI
experimental (la carga eficaz) de un producto producido de forma
recombinante por E. coli después de transfectarlo con un
vector de la SEC ID Nº: 70 producido mediante los procedimientos de
los Ejemplos 7 y 8. La Muestra 1 se produjo mediante los
procedimientos del Ejemplo 7 y la Muestra 2 se produjo mediante los
procedimientos del Ejemplo 8. La pureza de la Muestra 1 es de
aproximadamente el 95% y la pureza de la Muestra 2 es mayor del
99%. Las muestras se diluyeron 1:1 con tampón de muestra Novex pH
3-10. El marcador usado es un marcador IEF de
invitrogen^{TM}.
La siguiente Tabla 1 es un resumen de cada
carril.
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Aunque el pI teórico para el monómero T2 que
tiene la SEC ID Nº: 24 ó 27 es 7,1, el pI experimental para el
producto producido de forma recombinante se midió a aproximadamente
7,6, como se ilustra en la Figura 6. Esto sugiere que algunas de
las cargas negativas de la secuencia principal están "ocultas"
o son inaccesibles al entorno local.
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Ejemplo
10
La Figura 10 ilustra un gel SDS page de
T2-TrpRS producido expresando de forma recombinante
un vector de la SEC ID Nº: 70 en E. coli. El material de
T2-TrpRS producido mediante este procedimiento era
aproximadamente el 99% puro y contenía aproximadamente 0,003
U.E./mg de proteína.
El carril 1 es un Mark 12 Ladder. El carril 2
ilustra una muestra del material de Carga en la etapa de
procesamiento antes de la etapa de purificación final usando una
columna de CM Sepharose que no se calentó antes de comenzar la
separación en gel. El carril 3 es el mismo material después de que
se ha aplicado calor a la muestra a o cerca de 100ºC durante al
menos 5 minutos. Los carriles 4, 6 y 8 son fracciones de la columna
de CM Sepharose sin calentar la muestra antes de comenzar la
separación en gel. Las fracciones de elución que contienen
T2-TrpRS que se están ensayando se representan como
elución temprana, media y tardía de la columna de CM Sepharose
después de la aplicación del tampón de elución. Había cinco
fracciones de elución en este estudio. Los carriles 5, 7 y 9 son
las fracciones de los carriles 4, 6 y 8, respectivamente, pero con
desnaturalización por calor de la proteína antes de comenzar la
separación en gel. El carril 10 es un Patrón de Referencia (producto
aproximadamente el 95% puro) preparado también mediante la
expresión recombinante de un polinucleótido que codifica la SEC ID
Nº: 27 en E. coli.
Como se visualiza mediante el gel, los carriles
2, 4, 6, 8 y 10, incluyen todos una banda superior a aproximadamente
86 kDa. Esta banda desaparece cuando las muestras se calentaron en
los carriles 3, 5, 7 y 9. Todos los carriles incluyen una banda a
aproximadamente 43 kD, que se cree que es la forma monomérica del
producto. Esto es más probable que se produzca porque el producto
producido mediante la expresión recombinante de la SEC ID Nº: 27 en
E. coli es un complejo multi-unidad, tal como
un dímero que está asociado de forma no covalente. El calentamiento
da como resultado la disociación del dímero y la visualización de
los componentes monoméricos de la proteína.
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Ejemplo
11
La Figura 11 ilustra un gel nativo de
T2-TrpRS producido mediante la expresión
recombinante de un vector de la SEC ID Nº: 70 en E. coli,
que se purificó adicionalmente hasta aproximadamente el 99% de
pureza y aproximadamente 0,003 U.E./mg de proteína.
El gel era un gel Novex NuPage
Tris-Acetato, que no incluía SDS o detergente que
pudieran alterar los enlaces no covalentes. Los carriles
1-3 ilustran el producto a concentraciones más bajas
que los carriles 5-7 (3 \mug y 5 \mug/carril,
respectivamente). Como puede visualizarse, todas las muestras se
desarrollan como una banda única. Esto sugiere que el producto
purificado es una forma única de la molécula (es decir, monómero y
dímero no existen de forma simultánea usando este modo de
detección).
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Ejemplo
12
Se usó una columna de HPLC de selección por
tamaño para detectar el peso molecular y complejidad de un producto
de T2-TrpRS producido expresando de forma
recombinante un vector de la SEC ID Nº: 70. El producto de
T2-TrpRS se purificó hasta aproximadamente el 99% y
0,003 U.E./mg de proteína.
La columna de HPLC usada fue Amersham Superdex
200 10/300 GL^{TM}, que es una columna de agarosa y dextrano
reticulada. La fase móvil fue Fosfato Potásico 0,2 M y Cloruro
Potásico 0,15 M (pH 6,5). El caudal (ml/min) fue de 0,5. La
detección se realizó a tres longitudes de onda diferentes: 215, 254
y 280 nm.
El calibrado se realizó usando dextrano azul,
\beta-amilasa, alcohol deshidrogenasa, albúmina,
anhidrasa carbónica, citocromo c y azida sódica.
La Tabla 3 a continuación ilustra el peso
molecular (PM), el logaritmo del PM, el tiempo de retención (TR) y
el volumen de elución para cada uno de los elementos de calibrado.
El volumen de vacío (V_{0}) se midió como el volumen de elución
de dextrano azul a 8,667; el volumen interno (V_{i}) se midió como
el volumen de elución de azida sódica a 26,977 y el volumen total
(W_{m}) fue de 35,654.
La Tabla 4 a continuación ilustra el coeficiente
de distribución para cada uno de los elementos de calibrado.
La Figura 12 ilustra una curva de calibrado en
la que el eje x es el tiempo de retención de los elementos de
calibrado por minuto y el eje y es el log PM.
Una muestra del producto de proteína purificado
de la expresión de la SEC ID Nº: 70 se cargó en la columna para
identificar su peso molecular. Los productos con pesos moleculares
mayores desprendieron de la columna antes que los productos que
tenían pesos moleculares más pequeños. Como se ilustra en las
Figuras 13-15, el producto producido de forma
recombinante tenía un tiempo de retención de aproximadamente 27,3
minutos. La Figura 13 ilustra el producto detectado a una
absorbancia UV de 215 nm. La Figura 14 ilustra el producto detectado
a una absorbancia UV de 254 nm. La Figura 15 ilustra el producto
detectado a una absorbancia UV de 280 nm.
La Tabla 5 a continuación ilustra los cálculos
del peso molecular del producto producido de forma recombinante. Se
calculó que el producto tenía un peso molecular de 87,283 kD. Esto
confirmó que el producto está constituido por dos unidades de
monómero, cada una de aproximadamente 43 kDa.
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Ejemplo
13
Se realizó una HPLC de fase inversa para
analizar la pureza y establecer la identidad de un producto
producido expresando de forma recombinante un polinucleótido que
codifica un fragmento de T2 (por ejemplo, SEC ID Nº: 27) de este
documento. El sistema de HPLC usado incluía una columna Vydac
Protein C4, 2,1 x 150 mm, 5 \mum, Parte Nº 214TP5215 y un
detector de UV capaz de una detección a 210 nm. La fase móvil A
(diluyente), incluía TFA al 0,1% en agua, que se preparó mezclando
1 ml de TFA con 1 l de agua. La fase móvil B, incluía TFA al 0,1%
en acetonitrilo, que se preparó mezclando 1 ml de TFA con 1 l de
acetonitrilo. El acetonitrilo es menos hidrófobo que el agua y por
lo tanto interfiere con las interacciones lipídicas de las proteínas
y la superficie de resina de la columna. Después de que se instala
la columna Vydac, se inyecta un diluyente como una muestra de
blanco. Pueden inyectarse después diversas cantidades de material de
referencia (por ejemplo, T2 purificado hasta aproximadamente el 99%
de pureza) para crear una curva normal. Después, se inyecta una
muestra de un producto de T2 parcialmente purificado (por ejemplo,
un producto obtenido expresando de forma recombinante un
polinucleótido que codifica la SEC ID Nº: 27) que se ha dejado a
temperatura ambiente durante tres días a un volumen de 25 \mul.
Se establece un conjunto de gradientes de las dos fases móviles (A y
B) de la siguiente manera.
El caudal de columna de las columnas se mantiene
a 0,50 ml/minuto y la temperatura de columna se mantiene a 40ºC. El
principal pico de tiempo de retención del producto puede
identificarse comparando el tiempo de retención de la muestra con
el tiempo de retención del material de referencia. Los resultados de
la columna de HPLC de fase inversa se ilustran en la Figura 20. El
eje x ilustra la tasa de retención en minutos. El eje y ilustra las
unidades de absorbancia.
Un único pico a aproximadamente 18,825 ilustra
que el producto es una especie (aproximadamente el 99,56% del área
bajo la curva estaba en un tiempo de retención de 18,825 min \pm1
min). También demuestra que el producto, que es un dímero, no se
escinde o se separa cuando se deja a temperatura ambiente durante
tres días.
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Ejemplo
14
Se realizó degradación de Edman en dos productos
de T2-TrpRS producidos mediante expresión en E.
coli del vector de la SEC ID Nº: 70. El primer producto se
purificó hasta aproximadamente el 95% de pureza y el segundo
producto se purificó hasta aproximadamente el 99,5% de pureza. Los
dos productos tenían una secuencia N terminal que comenzaba con
SAK.
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Ejemplo
15
Aproximadamente 0,5 \mul de productos
producidos mediante E. Coli transfectado con un vector de la
SEC ID Nº: 70 y purificados hasta aproximadamente el 95% \pm 4%
de pureza (Producto A) y hasta aproximadamente el 99,5% \pm 0,5%
de pureza (Producto B) se sometieron a análisis de espectro de masas
de MALDI-TOF (Voyager DE-STR).
Se observaron dos masas principales en los
espectros MALDI-TOF para el Producto A (43210/43400
Da \pm 30 Da) y el Producto B (43194/43380 Da \pm 30 Da). Los
iones potencialmente cargados doblemente pueden indicar la
presencia de más de una masa de proteínas por muestra. La Figura 21
ilustra el espectro de MALDI-TOF del Producto A. La
Figura 22 ilustra el espectro de MALDI-TOF del
Producto B. Los dos picos pueden ser el resultado de tener algún
producto que contiene una N-formil-metionina
no escindida después de la traducción de proteínas; un efecto de
matriz del dispositivo MALDI-TOF; u otra
modificación química o post-traduccional del
producto.
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Ejemplo
16
Se analizó el producto de
T2-TrpRS producido mediante transfección de E.
coli con un vector de la SEC ID Nº: 70 usando espectros de masa
de electronebulización (ESI) (QSTARpulsar, Applied Biosystems) y
espectros de masa MALDI-TOFF (Voyager De STR,
Applied Biosystems) para caracterizar adicionalmente el producto de
T2-TrpRS resultante, para determinar si los
extremos estaban modificados y para determinar si el extremo N tenía
metionina, no tenía metionina o tenía una metionina modificada.
La Figura 23 ilustra el espectro de masas del
producto de T2-TrpRS producido mediante transfección
de E. coli con un vector de la SEC ID Nº: 70 y la
purificación adicional del producto hasta aproximadamente el 99,5%
de pureza y 0,003 U.E./mg de proteína, digerido con GluC.
La Figura 24 ilustra el espectro de masas del
producto de T2-TrpRS producido mediante transfección
de E. coli con un vector de la SEC ID Nº: 70 y la
purificación adicional del producto hasta aproximadamente el 99,5%
de pureza y 0,003 U.E./mg de proteína, digerido con tripsina.
La Figura 25 ilustra el espectro de masas del
producto de T2-TrpRS producido mediante la
transfección de E. coli con un vector de la SEC ID Nº: 70 y
la purificación adicional del producto hasta aproximadamente el
99,5% de pureza y 0,003 U.E./mg de proteína, digerido con GluC que
muestra el péptido N terminal sin una metionina a 494 m/z
(Mr=2468). No se observó una masa correspondiente al extremo N con
metionina o una formil metionina o metionina oxidada, metilada o
acetilada. Se observa que el estado de carga de este péptido es 5.
Las masas isotópicas en esta serie difieren en 1/5 ó 0,2 Da. En
conjunto, la intensidad de señal del extremo N sin una metionina
estaba por debajo de 10 recuentos incluso cuando la concentración de
proteína era tan alta como 0,4 \mug/\mul.
La Figura 26 ilustra el espectro de masas del
producto de T2-TrpRS producido mediante la
transfección de E. coli con un vector de la SEC ID Nº: 70 y
la purificación adicional del producto hasta aproximadamente el
99,5% de pureza y 0,003 U.E./mg de proteína, digerida con GluC que
muestra el péptido N terminal sin una metionina a 618 m/z
(Mr=2468). Se observó que el estado de carga de este producto de
T2-TrpRS era 4. Las masas isotópicas en esta serie
diferían en ¼ o 0,25 Da. En conjunto, los espectros para el producto
de T2-TrpRS producido mostraron que el producto
estaba parcialmente digerido.
La Figura 27 ilustra el espectro de masas de un
producto de T2-TrpRS digerido con GluC producido
mediante la transfección de E. coli con un vector de la SEC
ID Nº: 70 y la purificación adicional del producto hasta
aproximadamente el 99,5% de pureza y 0,003 U.E./mg de proteína, que
mostraba un péptido C-terminal sin una metionina N
terminal. Este péptido estaba a m/z = 759. Como este péptido está
cargado doblemente su masa era también el doble o Mr = 1516.
La Figura 28 ilustra una fragmentación de la
masa doblemente cargada a m/z = 759 de la Figura 28. Solamente se
marcaron los fragmentos de carga única. El análisis de este espectro
confirma que el extremo C del producto de T2-TrpRS
producido mediante la expresión recombinante del vector de la SEC ID
Nº: 70 tenía una secuencia de la SEC ID Nº: 69. La búsqueda en la
base de datos no redundante con estos datos de fragmentación produjo
una coincidencia significativa para la proteína humana IFP53. La
secuencia del péptido coincidía en el 100% con el péptido
C-terminal del producto de T2-TrpRS
producido mediante la transfección de E. Coli con un vector
de la SEC ID Nº: 70. Estos resultados indicaron que el producto de
T2-TrpRS producido mediante la transfección de
E. coli con un vector de la SEC ID Nº: 70 no tenía extremos
mellados y que el extremo C del producto recombinante era la SEC ID
Nº: 69, sin una marca His.
La Figura 29 ilustra un espectro de masas de
MALDI-TOF del producto de T2-TrpRS
producido de forma recombinante en E. coli con un vector de
la SEC ID Nº: 70, en el que el producto se purificó hasta
aproximadamente el 99,5% de pureza y las endotoxinas se retiraron
dejando 0,003 U.E./mg de proteína. El producto se digirió después
con GluC.
La Figura 30 ilustra el espectro de masas de
MALDI-TOF del producto de T2-TrpRS
producido de forma recombinante en E. coli con un vector de
la SEC ID Nº: 70, en el que el producto se purificó hasta
aproximadamente el 99,5% de pureza y las endotoxinas se retiraron
dejando 0,003 U.E./mg de proteína. El producto se digirió después
con tripsina.
Estos espectros de MALDI-TOF no
muestran masas que podrían corresponder a un extremo N con o sin
Met.
La Figura 31 ilustra un espectro de ionización
de electronebulización de un producto de T2-TrpRS
producido tras la transfección de E. coli con un vector de
la SEC ID Nº: 70, purificación hasta aproximadamente el 99,5% de
pureza y retirada de endotoxinas hasta aproximadamente 0,003 U.E./mg
de proteína. El producto se desaló con un Zip Tip C_{4}
(Millipore). Este espectro ilustra varias series de posibles iones
cargados de forma múltiple. Cuando se enrollan como se ilustra en
la Figura 32, estos datos muestran un componente principal con una
masa molecular de 43.329 Da y es coherente con la masa teórica de
43.329 Da para la proteína esperada menos el resto Met del extremo
N. Además, también se asignan a dos especies adicionales importantes
masas de 43.507 Da y 43.588 Da. La diferencia de masas entre estos
componentes es cercana a la esperada para la fosforilación aunque
la diferencia entre el componente principal (43329 Da) y el
componente con la masa (43507 Da) no puede asignarse fácil-
mente.
mente.
La Figura 33 ilustra un espectro de masas de
MALDI-TOF de un producto de T2-TrpRS
producido mediante la transfección de E. coli con un vector
de la SEC ID Nº: 70, purificación hasta aproximadamente el 99,5% de
pureza y retirada de endotoxinas hasta aproximadamente el 0,003
U.E./mg de proteína. El producto se desaló con un Zip Tip C_{4}
(de Millipore). Este espectro tenía unos grupos iónicos
pseudomoleculares cargados de manera única principales que tienen
centros a m/z 43215 y 43415, con los iones cargados doblemente
asociados a m/z 21621 y 21715. Las expansiones de la región cargada
de manera única sugiere que el grupo de 43415 Da está compuesto por
más de una especie y puede corresponder a las dos especies de masa
molecular más alta observadas en el espectro de electronebulización
de la Figura 31.
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Ejemplo
17
La Figura 13 ilustra un ensayo de intercambio de
PPi. La TrpRS une covalentemente el triptófano a su ARNt afín en un
mecanismo de dos etapas que está dirigido de forma energética por el
consumo de ATP. El ensayo de intercambio de PPi mide la catálisis
enzimática de la incorporación de pirofosfato inorgánico (PPi) en
Triptofanil-AMP.
Los productos de esta reacción están libres de
triptófano y libres de ATP. (Esta es la reacción inversa a la usada
para activar aminoácidos para unión a ARNt). Se usa como una medida
de la actividad enzimática en la primera mitad de la reacción
catalizada por aminoacil ARNt sintetasas. De este modo, se usa
habitualmente para evaluar la actividad de las enzimas. La otra (o
segunda mitad de la reacción) es la unión posterior del aminoácido
al ARNt. La reacción enzimática de dos etapas completa que mide la
incorporación global de Trp en ARNt se denomina un "ensayo de
aminoacilación" y puede resumirse de la siguiente manera:
- Primera reacción:
- Trp + ATP produce de forma reversible Trp-AMP + PPi
- Segunda reacción:
- Trp-AMP + ARNt produce Trp-ARNt + AMP
- Global:
- Trp + ATP + ARNt produce Trp-ARNt + AMP + PPi
En la primera etapa (denominada activación de
aminoácidos), la TrpRS activa el aminoácido a través de una
reacción de condensación con ATP para generar
Trp-AMP con la liberación de pirofosfato (PPi). En
la segunda etapa, el aminoácido activado se une al extremo 3' del
ARNt afín para producir el ARNt aminoacilado
(Trp-ARNt) y la liberación de AMP.
Por lo tanto, la actividad catalítica de TrpRS
puede caracterizarse en un intercambio de ATP-PPi
dependiente de triptófano (Ec. 1) y ensayos de aminoacilación (suma
de las ecuaciones 1 y 2).
Las reacciones de intercambio de PPi evalúan la
inversión de la activación de aminoácidos midiendo la incorporación
de [^{32}P]-PPi en ATP (Ec. 1). Por el contrario,
los ensayos de aminoacilación (la suma de Ec. 1 y 2) mide la
cantidad de [^{3}H]-Triptófano ligado a su ARNt
afín.
Reacción de intercambio de PPi - las
reacciones de intercambio de PPi se realizaron en Tris HCl 100 mM,
pH 7,8, fluoruro potásico 10 mM, cloruro de magnesio 2 mM, ATP 1 mM,
PPi sódico 2 mM, [^{32}P]-PPi sódico, triptófano
1 mM y \beta-mercaptoetanol 5 mM. Las reacciones
se iniciaron mediante la adición de enzima 0,2 \muM y se
realizaron a temperatura ambiente. En cada punto temporal, las
muestras se inactivaron en carbón al 4%, ácido perclórico al 11% y
PPi sódico 200 mM. El carbón se recogió y se lavó dos veces con
ácido perclórico al 1% y PPi sódico 200 mM antes del recuento de
escintilación.
Los recuentos por minuto ("CPM") que miden
la incorporación de [^{32}P]-PPi en ATP se
detectaron para TrpRS de longitud completa y T2 producido. La
Figura 17 (izquierda) ilustra CPM para TrpRS de longitud completa
("FLWRS"; SEC ID Nº: 63 ó 64); una variante de la longitud
completa en la que Pro-287 se convierte a una Asp
("FLWRS/P287D") y de T2-TrpRS obtenido
expresando de forma recombinante el vector de la SEC ID Nº: 70 en
E. coli de acuerdo con los procedimientos de este documento)
("T2-WRS"). La Figura 17 (centro) ilustra CPM
menos el fondo que son datos donde las unidades de CPM en tiempo
cero se han restado. La Figura 17 (derecha) ilustra el CPM final de
[^{32}P]-PPi.
Como se ilustra en la Figura 16, la TrpRS de
longitud completa incorporaba sustancialmente más
[^{32}P]-PPi en ATP que el
T2-TrpRS. Este resultado sugiere que el T2 es en
gran medida "inactivo" en comparación con la TrpRS de longitud
completa en su actividad de ARNt sintetasa.
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Ejemplo
18
Inmediatamente después del nacimiento (P0), la
vasculatura de la retina está prácticamente ausente en el ratón.
Aproximadamente tres semanas después del nacimiento (P21) la retina
ha obtenido un patrón adulto de vasos de la retina a través de un
patrón de desarrollo estereotípico, bifásico de angiogénesis.
Inicialmente, los vasos similares a radios alrededor de la papila
crecen de forma radial a partir de la arteria y la vena centrales
de la retina, conectándose entre sí de forma progresiva mediante un
plexo capilar que se forma entre ellos. La segunda fase de la
formación de vasos de la retina comienza aproximadamente en el día 8
después del nacimiento (P8) cuando surgen ramas colaterales de los
capilares del plexo superficial y penetran en la retina. Las ramas
vasculares se anastomosan después de forma lateral para formar un
"plexo vascular profundo" plano en el borde exterior de la
capa nuclear interna, que está en su lugar aproximadamente en el
P12. También se forma un plexo vascular intermedio en el borde
interno de la capa nuclear interna entre P14 y P20. El desarrollo de
estas redes vasculares en el ratón neonato es sorprendentemente
similar a los acontecimientos que ocurren en el feto humano en el
tercer trimestre.
La reproducibilidad de este procedimiento y su
accesibilidad fácil en animales después del nacimiento proporcionan
una oportunidad para ensayar la eficacia de compuestos
anti-angiogénicos en un modelo fisiológicamente
pertinente de angiogénesis. La actividad angiostática de
T2-TrpRS u otras moléculas angiostáticas se ensayó
mediante inyecciones intravítreas en P8, inmediatamente antes de la
formación de los brotes vasculares profundos y se evaluó en base al
grado de formación vascular en el plexo vascular profundo de la
retina en el P12. La aparición del plexo vascular superficial (capa
principal) se evaluó para determinar signos de toxicidad y
cualquier efecto secundario del fármaco sobre la vasculatura
establecida previamente. Para cada retina, los niveles de
inhibición se graduaron en base a los niveles relativos de
inhibición por toda la retina. La Figura 18 ilustra diversos
porcentajes de inhibición mediante compuestos inyectados en el P8
antes del desarrollo del plexo vascular profundo y los efectos de
la neovasculación ensayados 4 días después.
La Figura 19 ilustra una comparación del
porcentaje de inhibición de angiogénesis mediante tres lotes
diferentes de fabricación de T2 en diversas dosificaciones. En el
extremo izquierdo de cada comparación de dosificación está la
inhibición por "T2-TrpRS SY", un producto
producido expresando un polinucleótido que codifica la SEC ID Nº:
27 con la adición de una marca His6 C-terminal en
E. coli seguido de purificación usando técnicas de
laboratorio (columna de afinidad a níquel y Triton
X-114). En el centro de cada comparación de dosis
está "T2-TrpRS 40448," un producto producido
expresando un polinucleótido que codifica la SEC ID Nº: 27 (sin una
marca His6 C-terminal) en E. coli seguido de
purificación usando un sistema de cromatografía en columna de
gradiente lineal y un filtro de endotoxinas de modo que la muestra
es aproximadamente el 95% pura. En el extremo derecho de cada nivel
de comparación de dosis está la inhibición mediante
"T2-TrpRS PD195", un producto producido
expresando un vector de la SEC ID Nº: 70 (sin una marca His6
C-terminal) en E. Coli, seguido de
purificación usando un procedimiento de fabricación con cambio de
escala, incluyendo cromatografía en columnas de elución de lote y
un área aumentada de un filtro de endotoxina, de modo que la muestra
es aproximadamente el 99% pura y se reducen adicionalmente los
niveles de endotoxina.
Es evidente una pequeña de eficacia en forma
ligera de campana, con eficacias máximas que se producen a partir
de las inyecciones de 0,25 ó 0,50 \mug/ojo, (5,22 ó 10,44
picomoles respectivamente). Se han realizado mejoras significativas
en la eficacia con cada nuevo protocolo de fabricación hasta la
fecha (1º = T_{2}-TrpRS SY, 2º =
T_{2}-TrpRS 40448 y 3º = T2-TrpRS
PD195-DG30L (PD195)). Además, con cada nuevo lote
fabricado, la curva de eficacia se volvió significativamente más
amplia (Figura 19). Es probable que estas mejoras sean el resultado
de procedimientos de purificación mejorados que han producido
niveles cercanos al 100% de pureza para el lote
T2-TrpRSPD195.
El eje y de la Figura 19 ilustra el porcentaje
de retinas con una inhibición >75%. Este porcentaje de inhibición
también se puede expresar en este documento en unidades de
actividad. Por ejemplo, si el 50% de las retinas experimentó una
inhibición >75%, se considera la actividad de proteína a 50
unidades de actividad, si el 70% de retinas experimentan una
inhibición >75%, la actividad de proteína se considera a 70
unidades de actividad.
- SEC ID Nº: 1. -
- Met-TrpRS-marca-His (aminoácido más el vector ácido nucleico) (la variante GD)
- SEC ID Nº: 2. -
- Met-mini-Trp-marca-His (aminoácido más el ácido nucleico) (la variante GD).
- SEC ID Nº: 3. -
- Met-mini-TrpRS-marca-His (aminoácido) (la variante GD)
- SEC ID Nº: 4. -
- Met-T1-marca-His (aminoácido más el vector ácido nucleico) (la variante GD)
- SEC ID Nº: 5. -
- Met-T1-marca-His (aminoácido) (la variante GD)
- SEC ID Nº: 6. -
- Met-T2-marca-His (aminoácido más el vector ácido nucleico) (la variante GD)
- SEC ID Nº: 7. -
- Met-T2-marca-His (aminoácido) (la variante GD).
- SEC ID Nº: 8. -
- SNHGP (la secuencia de inicio de T1) (la variante GD)
- SEC ID Nº: 9. -
- SAKGI (la secuencia de inicio de T2) (la variante GD)
- SEC ID Nº: 10. -
- HVGH (secuencia interna)
- SEC ID Nº: 11. -
- KMSAS (secuencia interna)
- SEC ID Nº: 12. -
- T2 (la variante GD)
- SEC ID Nº: 13. -
- T1 (la variante GD)
- SEC ID Nº: 14. -
- mini-TrpRS (la variante GD)
- SEC ID Nº: 15. -
- Met-T2 (la variante GD).
- SEC ID Nº: 16. -
- Met-T1 (la variante GD)
- SEC ID Nº: 17. -
- Met-mini-TrpRS (la variante GD).
- SEC ID Nº: 18. -
- ácido nucleico que codifica T2 (la variante GD)
- SEC ID Nº: 19. -
- ácido nucleico que codifica Met-T2 (la variante GD)
- SEC ID Nº: 20. -
- ácido nucleico que codifica T1 (la variante GD)
- SEC ID Nº: 21. -
- ácido nucleico que codifica Met-T1 (la variante GD)
- SEC ID Nº: 22. -
- ácido nucleico que codifica mini-TrpRS (la variante GD)
- SEC ID Nº: 23. -
- ácido nucleico que codifica Met-mini-TrpRS (la variante GD)
- SEC ID Nº: 24. -
- T2 (la variante SY)
- SEC ID Nº: 25. -
- T1 (la variante SY)
- SEC ID Nº: 26. -
- mini-TrpRS (la variante SY)
- SEC ID Nº: 27. -
- Met-T2 (la variante SY)
- SEC ID Nº: 28. -
- Met-T1 (la variante SY)
- SEC ID Nº: 29. -
- Met-mini-TrpRS (la variante SY)
- SEC ID Nº: 30. -
- ácido nucleico que codifica T2 (la variante SY)
- SEC ID Nº: 31. -
- ácido nucleico que codifica Met-T2 (la variante SY)
- SEC ID Nº: 32. -
- ácido nucleico que codifica T1 (la variante SY)
- SEC ID Nº: 33. -
- ácido nucleico que codifica Met-T1 (la variante SY)
- SEC ID Nº: 34. -
- ácido nucleico que codifica mini-TrpRS (la variante SY)
- SEC ID Nº: 35. -
- ácido nucleico que codifica Met-mini-TrpRS (la variante SY)
- SEC ID Nº: 36. -
- T2 (la variante GY)
- SEC ID Nº: 37. -
- T1 (la variante GY)
- SEC ID Nº: 38. -
- mini-TrpRS (la variante GY)
- SEC ID Nº: 39. -
- Met-T2 (la variante GY)
- SEC ID Nº: 40. -
- Met-T1 (la variante GY)
- SEC ID Nº: 41. -
- Met-mini-TrpRS (la variante GY)
- SEC ID Nº: 42. -
- ácido nucleico que codifica T2 (la variante GY)
- SEC ID Nº: 43. -
- ácido nucleico que codifica Met-T2 (la variante GY)
- SEC ID Nº: 44. -
- ácido nucleico que codifica T1 (la variante GY)
- SEC ID Nº: 45. -
- ácido nucleico que codifica Met-T1 (la variante GY)
- SEC ID Nº: 46. -
- ácido nucleico que codifica mini-TrpRS (la variante GY)
- SEC ID Nº: 47. -
- ácido nucleico que codifica Met-mini-TrpRS (la variante GY)
- SEC ID Nº: 48. -
- T2 (la variante SD)
- SEC ID Nº: 49. -
- T1 (la variante SD)
- SEC ID Nº: 50. -
- mini-TrpRS (la variante SD)
- SEC ID Nº: 51. -
- Met-T2 (la variante SD)
- SEC ID Nº: 52. -
- Met-T1 (la variante SD)
- SEC ID Nº: 53. -
- Met-mini-TrpRS (la variante SD)
- SEC ID Nº: 54. -
- ácido nucleico que codifica T2 (la variante SD)
- SEC ID Nº: 55. -
- ácido nucleico que codifica Met-T2 (la variante SD)
- SEC ID Nº: 56. -
- ácido nucleico que codifica T1 (la variante SD)
- SEC ID Nº: 57. -
- ácido nucleico que codifica Met-T1 (la variante SD)
- SEC ID Nº: 58. -
- ácido nucleico que codifica mini-TrpRS (la variante SD)
- SEC ID Nº: 59. -
- ácido nucleico que codifica Met-mini-TrpRS (la variante SD)
- SEC ID Nº: 60. -
- Dominio de dimerización (de T2 144-199)
- SEC ID Nº: 61. -
- Variante GD de longitud completa, con Met N terminal y sin marca His.
- SEC ID Nº: 62. -
- Variante GD de longitud completa, sin Met N terminal y sin marca His
- SEC ID Nº: 63. -
- Variante SY de longitud completa, con Met N terminal y sin marca His.
- SEC ID Nº: 64. -
- Variante SY de longitud completa, sin Met N terminal y sin marca His.
- SEC ID Nº: 65. -
- Variante GY de longitud completa, con Met N terminal y sin marca His.
- SEC ID Nº: 66. -
- Variante GY de longitud completa, sin Met N terminal y sin marca His.
- SEC ID Nº: 67. -
- Variante SD de longitud completa, con Met N terminal y sin marca His.
- SEC ID Nº: 68. -
- Variante SD de longitud completa, sin Met N terminal y sin marca His.
- SEC ID Nº: 69. -
- Extremo C: FMTPRKLSFDFQ.
- SEC ID Nº: 70. -
- Plásmido 01 - pET24b+ con un inserto NdeI/HindIII de T2-TrpRS Humana (variante SY) sin marca 6-His.
- SEC ID Nº: 71. -
- Plásmido 02: pET20b+ con un inserto NdeI/HindIII de T2-TrpRS Humana (variante SY) con marca 6-His
- SEC ID Nº: 72. -
- Plásmido 04 pET20b+ con un inserto NdeI/HindIII de T2-TrpRS (variante SY), marca 6-His con Sitio de Escisión de Trombina.
- SEC ID Nº: 73. -
- Plásmido 06 pET24b+ con un inserto NdeI/XhoI de mini-TyrRS Humana, marca 6-His.
- SEC ID Nº: 74. -
- Plásmido 07 pET24b+ con un inserto NdeI/HindIII de mini-TrpRS Humana, (variante SY) marca 6-His
- SEC ID Nº: 75. -
- Plásmido 09: pET24b+ con un inserto NdeI/XhoI de mini-TyrRS Humana, sin marca His.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> GLIDDEN, PAUL F.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA
MODULACIÓN DE ANGIOGENESIS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PC22120A
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 484
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> trpRS humana recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4877
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de nucleótido
mini-TrpRS humana recombinante
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3428)..(4738)
\newpage
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<400> 2
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 437
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de proteína
mini-TrpRS humana recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 4811
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de nucleótido
Met-T1-marca His humana
recombinante
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3428)(4672)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de proteína
Met-T1-marca His humana
recombinante
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<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 4742
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de nucleótido
Met-T2-marca His humana
recombinante
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3428)..(4603)
\newpage
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<400> 6
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 392
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de proteína
Met-T2-marca His humana
recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 423
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de
mini-TrpRS humana recombinante (variante GD)
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<400> 14
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de
Met-T2 humana recombinante (variante GD)
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<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 402
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de
Met-T1 humana recombinante (variante GD)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 424
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de
Met-mini-TrpRS humana recombinante
(variante GD)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1134
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de T2 humana
recombinante (variante GD)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1134)
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<400> 18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1137
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de
Met-T2 humana recombinante (variante GD)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1137)
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<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
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<211> 1203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de T1 humana
recombinante (variante GD)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1203)
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<400> 20
\newpage
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Construcción de
Met-T1 humana recombinante (variante GD)
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1206)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de
mini-TrpRS humana recombinante (variante GD)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1269)
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<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Construcción de
Met-mini-TrpRS humana recombinante
(variante GD)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1272)
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<400> 23
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<210> 24
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<211> 378
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de T2 humana
recombinante (variante SY)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de T1 humana
recombinante (variante SY)
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<223> Construcción de
mini-TrpRS humana recombinante (variante SY)
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Construcción de
Met-T2 humana recombinante (variante SY)
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Met-T1 humana recombinante (variante SY)
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<223> Construcción de
Met-mini-TrpRS humana recombinante
(variante SY)
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Met-T2 humana recombinante (variante SY)
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<223> Construcción de
Met-T1 humana recombinante (variante SY)
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<223> Construcción de
mini-TrpRS humana recombinante (variante SY)
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<223> Construcción de
Met-mini-TrpRS humana recombinante
(variante SY)
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Construcción de T1 humana
recombinante (variante GY)
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<211> 423
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Construcción de
mini-TrpRS humana recombinante (variante GY)
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Construcción de
Met-T2 humana recombinante (variante GY)
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Construcción de
Met-T1 humana recombinante (variante GY)
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<211> 424
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Construcción de
Met-mini-TrpRS humana recombinante
(variante GY)
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Met-T2 humana recombinante (variante GY)
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recombinante (variante GY)
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<223> a, t, c o g
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<212> ADN
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Met-T1 humana recombinante (variante GY)
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<222> (432)
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<223> a, t, c o g
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Construcción de
mini-TrpRS humana recombinante (variante GY)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1269)
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<211> 1272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Construcción de
Met-mini-TrpRS humana recombinante
(variante GY)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1272)
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (498)
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<223> a, t, c o g
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
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<210> 48
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<211> 378
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Construcción de T2 humana
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<400> 48
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<210> 49
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<211> 401
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Construcción de T1 humana
recombinante (variante SD)
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<400> 49
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<211> 423
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Construcción de
mini-TrpRS humana recombinante (variante SD)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
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<211> 379
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Construcción de
Met-T2 humana recombinante (variante SD)
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<400> 51
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<211> 402
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Construcción de
Met-T1 humana recombinante (variante SD)
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<400> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
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<211> 424
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Construcción de
Met-mini-TrpRS humana recombinante
(variante SD)
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<210> 54
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<211> 1134
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de T2 humana
recombinante (variante SD)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1134)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (358)..(360)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nnn es agy, tcy o tcr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1137
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de
Met-T2 humana recombinante (variante SD)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1137)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (361)..(363)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nnn es agy, tcy o tcr
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de T1 humana
recombinante (variante SD)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1203)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (427)..(429)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nnn es agy, tcy o tcr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de
Met-T1 humana recombinante (variante SD)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1206)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (430)..(432)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nnn es agy, tcy o tcr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de
mini-TrpRS humana recombinante (variante SD)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1269)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (493)..(495)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nnn es agy, tcy o tcr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de
Met-mini-TrpRS humana recombinante
(variante SD)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1272)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (496)..(498)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nnn es agy, tcy o tcr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: proteína de variante GD humana recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 470
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: proteína de variante GD humana recombinante
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: proteína de variante SY humana recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 470
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: proteína de variante SY humana recombinante
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: proteína de variante GY humana recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 470
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: proteína de variante GY humana recombinante
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: proteína de variante SD humana recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 470
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: proteína SD humana recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: péptido C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Plásmido 01 - pET24b+ con un NdeI/HindIII en lugar de Hu
T2-WRS (variante SY) sin marca
6-H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4742
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Plásmido 02: pET20b+ con un NdeI/HindIII en lugar de Hu
T2-WRS (variante SY), con marca
6-H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4769
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Plásmido 04pET20b+con un NdeI/HindIII en lugar de
T2-WRS (variante SY), marca 6-H con
sitio de escisión de Tombina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6326
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Plásmido 06 pET24b+ con un NdeI/XhoI en lugar de Hu
mini-YRS, marca 6-H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6563
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Plásmido 07 pET24b+ con un NdeI/HindIII en lugar de Hu
mini-WRS, (variante SY) marca
6-H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Plásmido 09: pET24b+ con un NdeI/XhoI en lugar de Hu
mini-YRS,
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipsin marca H
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
Claims (4)
1. Un procedimiento para purificar un fragmento
de ARNt sintetasa, que comprende realizar una etapa de filtración
para la reducción de endotoxinas después de realizar una etapa de
aclarado y antes de realizar al menos una de las etapas
seleccionadas entre: una etapa de intercambio de tampón; una etapa
de concentración; y una etapa de cromatografía de intercambio
catiónico, en el que dicha etapa de cromatografía de intercambio
catiónico comprende el uso de una resina de intercambio catiónico,
en el que dicha resina se selecciona entre: CM Sepharose, SP
Sepharose y DEAE Sepharose.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que dicho procedimiento no incluye el uso de un
desnaturalizante.
3. Un procedimiento para purificar un fragmento
de ARNt sintetasa que comprende realizar una etapa de filtración
para la reducción de endotoxinas después de realizar una etapa de
cromatografía de intercambio aniónico en el que dicha etapa de
cromatografía de intercambio aniónico comprende el uso de una resina
de intercambio aniónico, en el que dicha resina se selecciona entre
Q Sepharose, DEAE Sepharose y ANX Sepharose.
4. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que dicho fragmento de ARNt sintetasa
se selecciona entre el grupo constituido por SEC ID Nº: 12, 13, 14,
15, 16, 17, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 48, 49,
50, 51, 52 y 53.
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| JP5771142B2 (ja) | 2008-06-11 | 2015-08-26 | エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド | チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドの血小板新生活性 |
| WO2009158649A1 (en) | 2008-06-26 | 2009-12-30 | Atyr Pharma, Inc. | Compositions and methods comprising glycyl-trna synthetases having non-canonical biological activities |
| WO2010099477A2 (en) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Atyr Pharma, Inc. | Polypeptide structural motifs associated with cell signaling activity |
| DK3255146T3 (da) | 2009-03-16 | 2019-08-19 | Pangu Biopharma Ltd | Præparater og fremgangsmåder omfattende histidyl-tRNA-synthetasesplejsningsvarianter med ikke-kanoniske biologiske aktiviteter |
| US20100310576A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-12-09 | Adams Ryan A | COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING ASPARTYL-tRNA SYNTHETASES HAVING NON-CANONICAL BIOLOGICAL ACTIVITIES |
| US20120252718A1 (en) * | 2009-10-06 | 2012-10-04 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and Methods for Regulating Cytochrome c-Mediated Apoptosis by tRNA |
| CA2783731C (en) | 2009-12-11 | 2018-03-27 | Atyr Pharma, Inc. | Aminoacyl trna synthetases for modulating inflammation |
| US8828395B2 (en) | 2009-12-11 | 2014-09-09 | Atyr Pharma, Inc. | Antibodies that bind tyrosyl-tRNA synthetases |
| US8980253B2 (en) | 2010-04-26 | 2015-03-17 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of cysteinyl-tRNA synthetase |
| CN103096911B (zh) | 2010-04-27 | 2018-05-29 | Atyr 医药公司 | 与异亮氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现 |
| US8986681B2 (en) | 2010-04-27 | 2015-03-24 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of threonyl-tRNA synthetases |
| AU2011248489B2 (en) | 2010-04-28 | 2016-10-06 | Pangu Biopharma Limited | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of alanyl tRNA synthetases |
| WO2011150279A2 (en) | 2010-05-27 | 2011-12-01 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutaminyl-trna synthetases |
| EP2563383B1 (en) | 2010-04-29 | 2017-03-01 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of valyl trna synthetases |
| CN103097523B (zh) | 2010-04-29 | 2016-09-28 | Atyr医药公司 | 与天冬酰胺酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现 |
| US9034321B2 (en) | 2010-05-03 | 2015-05-19 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-alpha-tRNA synthetases |
| CN103108655B (zh) | 2010-05-03 | 2017-04-05 | Atyr 医药公司 | 与丝氨酰‑tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现 |
| EP2566496B1 (en) | 2010-05-03 | 2018-02-28 | aTyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of methionyl-trna synthetases |
| CA2797277C (en) | 2010-05-03 | 2021-02-23 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of arginyl-trna synthetases |
| CA2798139C (en) | 2010-05-04 | 2019-09-24 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of p38 multi-trna synthetase complex |
| CA2798301C (en) | 2010-05-04 | 2020-09-15 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glutamyl-prolyl-trna synthetases |
| CN103200953B (zh) | 2010-05-14 | 2017-02-15 | Atyr 医药公司 | 与苯丙氨酰‑β‑tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现 |
| CN103096914B (zh) | 2010-05-17 | 2015-08-12 | Atyr医药公司 | 与亮氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相关的治疗、诊断和抗体组合物的创新发现 |
| AU2011261486B2 (en) | 2010-06-01 | 2017-02-23 | Pangu Biopharma Limited | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of lysyl-tRNA synthetases |
| EP2593125B1 (en) | 2010-07-12 | 2017-11-01 | aTyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-trna synthetases |
| KR20130102534A (ko) | 2010-07-12 | 2013-09-17 | 에이티와이알 파마, 인코포레이티드 | 히스티딜trna 합성효소의 단백질 단편에 관련된 치료적, 진단적, 및 항체 조성물의 혁신적 발견 |
| NZ603811A (en) | 2010-07-12 | 2015-03-27 | Atyr Pharma Inc | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of aspartyl-trna synthetases |
| US8999321B2 (en) | 2010-07-12 | 2015-04-07 | Atyr Pharma, Inc. | Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-tRNA synthetases |
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| US9714419B2 (en) | 2011-08-09 | 2017-07-25 | Atyr Pharma, Inc. | PEGylated tyrosyl-tRNA synthetase polypeptides |
| US9822353B2 (en) | 2011-12-06 | 2017-11-21 | Atyr Pharma, Inc. | PEGylated aspartyl-tRNA synthetase polypeptides |
| US9816084B2 (en) | 2011-12-06 | 2017-11-14 | Atyr Pharma, Inc. | Aspartyl-tRNA synthetases |
| CA2858613A1 (en) | 2011-12-29 | 2013-08-08 | Atyr Pharma, Inc. | Aspartyl-trna synthetase-fc conjugates |
| KR20140123571A (ko) | 2012-02-16 | 2014-10-22 | 에이티와이알 파마, 인코포레이티드 | 자가면역 및 염증성 질환의 치료를 위한 히스티딜ｔｒｎａ 신테타제 |
| AU2014233436B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-05 | Atyr Pharma, Inc. | Histidyl-tRNA synthetase-Fc conjugates |
| JP2020517638A (ja) | 2017-04-20 | 2020-06-18 | エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド | 肺の炎症を治療するための組成物および方法 |
| JP7302093B2 (ja) * | 2019-07-18 | 2023-07-03 | ジェイダブリュ バイオサイエンス | Ｗｒｓタンパク質に特異的に結合する抗体及びその用途 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR890002068B1 (ko) * | 1987-01-13 | 1989-06-16 | 제일제당 주식회사 | 겔여과 컬럼에 의한 엔도톡신의 제거방법 |
| JPH01196294A (ja) * | 1988-01-30 | 1989-08-08 | Tosoh Corp | スーパーオキサイド・ジムスターゼから発熱性物質を除去する方法 |
| JPH01196295A (ja) * | 1988-01-30 | 1989-08-08 | Tosoh Corp | プロウロキナーゼからの発熱性物質除去方法 |
| JPH01242105A (ja) * | 1988-03-18 | 1989-09-27 | Toray Ind Inc | エンドトキシン除去材 |
| JPH04197436A (ja) * | 1990-11-29 | 1992-07-17 | Terumo Corp | エンドトキシン吸着フィルター |
| GB9601068D0 (en) * | 1996-01-19 | 1996-03-20 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
| GB2327945A (en) * | 1997-07-31 | 1999-02-10 | Medeva Europ Ltd | Removal of endotoxin from vaccines |
| AU4589901A (en) * | 2000-03-31 | 2001-10-15 | Scripps Research Inst | Human aminoacyl-trna synthetase polypeptides useful for the regulation of angiogenesis |
| RU2297425C2 (ru) * | 2001-02-23 | 2007-04-20 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Полипептиды, происходящие из триптофанил-трнк-синтетазы, и их применение для регуляции развития кровеносных сосудов |
| US6903189B2 (en) * | 2001-03-21 | 2005-06-07 | The Scripps Research Institute | Human aminoacyl-tRNA synthetase polypeptides useful for the regulation of angiogenesis |
| WO2003009813A2 (en) * | 2001-07-26 | 2003-02-06 | Novartis Ag | Methods of treating neuropilin-mediated diseases |
-
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