KR890002068B1

KR890002068B1 - 겔여과 컬럼에 의한 엔도톡신의 제거방법

Info

Publication number: KR890002068B1
Application number: KR1019870000212A
Authority: KR
Inventors: 정미영; 박희섭; 현형환; 유무영
Original assignee: 제일제당 주식회사; 손영희
Priority date: 1987-01-13
Filing date: 1987-01-13
Publication date: 1989-06-16
Also published as: KR880008814A

Abstract

내용 없음.

Description

겔여과 컬럼에 의한 엔도톡신의 제거방법

첨부된 도면은 계면활성제인 트라이톤(Triton X-100)에 평형된 세파크릴(Sephacryl s-200) 겔여과 컬럼에 의해 인터페론으로부터 엔도톡신이 분리된 일예를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 생의학 분야에서 사용되는 물질인 저분자 화합물, 고분자화합물, 단백질등(이하 생의학 물질이라 약칭한다)으로부터 엔도톡신을 제거하는 방법에 관한 것이다.

엔도톡신은 그람-음성미생물의 세포벽면에 존재하는 당지질(리포폴리사카라이드)로 체내에 주입될 경우에는 체온을 상승시키기 때문에 체내에 주입되는 모든 생의학 물질은 엔도톡신이 반드시 제거되어야 하며, 유전공학적 방법을 이용한 의약품의 개발에 있어서도 그람-음성 미생물을 그 숙주세포를 사용하는 경우에는 엔도톡신을 제거하는 과정을 반드시 거쳐야 하는 것이다.

엔도톡신을 제거하기 위한 종래의 방법으로는 열이나 산, 알칼리 처리, 여과방법, 흡착방법, 이온교환수지 방법등이 있으나, 이러한 방법은 고온, 강산, 강알칼리등의 사용으로 인한 격렬한 조건으로 인하여 생의학 물질의 변성을 초래하거나 방법이 번거롭고 경비가 많이 소요되는 단점이 있을 뿐만 아니라, 계면활성제에 의해 엔도톡신을 제거하는 트라이톤액으로 생의학 물질을 액상추출하는 방법(미국특허 제4,412,985호)은 수회에 걸쳐 추출작업을 행하여야 하기 때문에 작업이 번거롭고 생의학 물질의 완전 회수가 곤란함은 물론, 생의학 물질이 유기용매와 접촉되므로 해서 생의학 물질의 생물학적 활성도가 상실될 수도 있는 문제점이 있다.

따라서 본 발명자등은 종래 방법에 의한 문제점을 해소하고자 연구 검토한 결과, 계면활성제에 평형된 컬럼에서 생의학 물질을 겔여과하므로서 종래방법보다 개선된 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 계면활성제를 포함한 완충용액으로 미리 겔여과 컬럼을 1컬럼 부피 이상으로 세척하여 컬럼을 계면활성제 완충용액으로 평형시킨 다음, 생의학 물질을 이 컬럼에 통과시킴으로써 생의학 물질로부터 엔도톡신이 제거됨과 동시에 제거되어 나온 엔도톡신 스스로가 거대구체를 형성하여 겔여과 컬럼상에서 용출이 될때 생의학 물질과 분리된 피크를 이루며 먼저 용출이 되므로써 생의학 물질과 엔도톡신을 완전히 분리시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의한 방법은 생의학 물질을 수회에 걸쳐 트라이톤액으로 액상 추출하는 작업을 없애주고 액상 추출작업을 겔여과로 대체 시킴으로서 추출작업중에 발생되는 생의학 물질의 손실을 제거함과 동시에 겔여과상에서 엔도톡신과 생의학 물질을 완전히 분리시킬 수 있을 뿐만 아니라 유기용매를 사용하지 않으므로 생의학 물질의 생물학적 활성도를 상실할 우려가 없는 특징이 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 계면활성제로서는 트라이톤류(Triton Series, RC₆H₄(OC₂H₄)nOH, R은 옥틸이나 노닐, n은 3 이상의 정수이다) 또는 트윈류(Tween Series, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레이트)로 농도는 0.1-10%(W/V) 정도가 바람직하다.

계면활성제는 대상 생의학 물질이 용해되어 있는 용액에 용해하여 사용하며 일반적으로 pH3-pH9 사이의 5mM 농도 이상의 완충용액에 용해하여 사용한다.

겔여과 컬럼에 사용하는 겔로는 계면활성제에 영향을 받지 않는 폴리아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란중 하나 또는 둘 이상의 중합체로서 겔의 선택은 그 분자량별 분획 범위가 대상 생의학 물질의 분자량을 포함하는 것으로 선택하므로써 제거되어 나온 엔도톡신의 거대구체가 베제제한(exclusion limit) 이상이 되어 생의학 물질보다 먼저 용출되도록 한다.

에도톡신이 제거되는데 소요되는 시간은 겔여과 컬럼의 1컬럼 부피의 용액이 용출되는 시간 정도로 보통 30분 이상이 소요된다.

컬럼을 작동시키기에 적합한 온도는 겔여과가 가능한 온도이면 모두 사용할 수 있으나 일반적으로는 3℃ 이상에서 상온까지의 온도이다.

일반 엔도톡신이 제거되면 생의학 물질로부터의 계면활성제의 제거는 이온교환수지, 겔여과, 삼투압 같은 통상의 방법으로 행할 수 있다(Anna J.Furth, Anal. Biochem. (109), 207-215(1980)).

다음의 실시예에서 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다.

[실시예]

본 실시예에 사용한 생의학 물질은 대장균 세포벽에서 유래하는 엔도톡신이 혼합되어 있는 분자량 약 20,000의 단백질인 유전자 조작된 대장균으로부터 얻어진 인터페론이다.

세파크릴 S-200 약 200ml를 유리관(1.4×120cm)에 충진시켜 겔여과 컬럼을 준비한 다음, 여기에 0.5% 트라이톤이 포함되어 있는 완충용액(150mM NaCl용액, pH 7.0)을 1컬럼부피 이상(이 경우 220ml 이상)으로 사용하여 세척하고 컬럼이 완충용액에 평형이 되도록 한다.

평형의 확인은 쿠마시부릴런트블루(Coomassie Beilliant Blue)가 트라이톤과 반응하여 푸른색을 나타내는 반응을 이용하였다.

평형이 확인된 후 이 컬럼에 2ml의 인터페론 용액을 주입하고 겔여과를 행한다. 이때의 유속은 약 4ml/hr로 하였다(4ml/hr 이상 10ml/hr까지도 가능).

컬럼으로부터 용출되는 액은 약 2ml씩 분획, 수집하고 각각의 에도톡신 농도와 단백질 농도를 결정하였다. 엔도톡신 농도는 LAL 테스트(Limulus Amebocyte Lysate, Whittaker M.A.Bioproducts사 제품)에 의해 결정하였고 단백질 농도는 라우리 방법(Lowry method, Lowry, O.H.et al, J.Biol.Chem.(193) 265-275(1951))에 의해 결정하였다.

첨부된 도면에서의 결과와 같이 엔도톡신의 피크는 분획번호 40근처에서, 인터페론은 분획번호 60-80사이에서 용출되므로써 엔도톡신이 인터페론으로부터 완전히 분리 제거되었음을 확인할 수 있었다.

Claims

계면활성제에 평형된 겔여과 컬럼을 이용하여 저분자화합물, 고분자화합물, 단백질 및 효소를 포함하는 생의학 물질로부터 엔도톡신을 제거함을 특징으로 하는 겔여과 컬럼에 의한 엔도톡신의 제거방법.
제1항에 있어서, 계면활성제는 트라이톤류(RC₆H₄(OC₂H₄)nOH, R은 옥틸 또는 노닐, n은 3 이상의 정수이다)임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 계면활성제는 트윈류(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레이트)임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 계면활성제의 농도는 0.1%-10%(W/V)임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 겔은 폴리아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란중 하나 또는 그 이상의 중합체임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 계면활성제는 pH 3-9 사이의 5mM 농도 이상의 완충용액에 용해된 것임을 특징으로 하는 방법.