ES2332178T5 - Análogos de ARN pequeños de interferencia (ARNpi) - Google Patents

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Abstract

Un compuesto bicatenario que comprende una hebra codificante y una hebra no codificante, en el que cada hebra comprende 12-35 nucleótidos y en el que dicho compuesto comprende al menos un monómero de ácido nucleico cerrado (LNA) que tiene la estructura **(Ver fórmula)** en las que X se selecciona a partir del grupo constituido por O, S y NR H , donde R H es H o alquilo C 1-4; Y es CH2; B es una nucleobase; Z y Z* están independientemente ausentes o se seleccionan a partir del grupo constituido por un grupo de enlace internucleosídico, un grupo terminal y un grupo protector; de forma que cuando el monómero de LNA está localizado en el extremo 3'', Z es un grupo terminal y Z* es un grupo de enlace internucleosídico; cuando el monómero de LNA está localizado en el extremo 5'', Z está ausente y Z* es un grupo terminal; y cuando el monómero de LNA está localizado dentro de la secuencia de nucleótidos, Z está ausente y Z* es un grupo de enlace internucleosídico, y en el que ningún monómero de LNA está localizado en el extremo 5'' de la hebra no codificante.

Description

Análogos de ARN pequeños de interferencia (ARNpi)
Campo de la invención
La presente invención se refiere a análogos pequeños de interferencia (ARNpi) bicatenarios novedosos que comprenden monómeros de ácidos nucleicos cerrados (LNA). Dichos compuestos inducen la silenciación génica postranscripcional específica de secuencia en muchos organismos mediante un procedimiento conocido comointerferencia de ARN (iARN). Los compuestos descritos en el presente documento tienen propiedades mejoradas con respecto a los ARNpi no modificados y pueden, en consecuencia, resultar útiles como agentes terapéuticos, por ejemplo, en el tratamiento de diversas formas de cáncer.
Antecedentes de la invención
Fire y cols. descubrieron la interferencia de ARN (iARN) en C. elegans (Nature, 1998, 391, 806-811). Se encontró que largos tramos de ARN bicatenario (ARNds) poseían un potente poder inactivador en la expresión génica que podía mantenerse durante generaciones en el gusano. La interferencia de ARN (iARN) rápidamente se convirtió en una herramienta genómica funcional en C. elegans (los inicios de la interferencia de ARN se revisan por Fire (TIG, 1999, 15, 358-363) y Bosher y Labouesse (Nature Cell Biology, 2000, 2, E31-E36)). Los primeros estudios en los que se demostró que la interferencia de ARN funcionaba en los vertebrados se realizaron en embriones de Danio rerio y en oocitos de ratón (Wargelius y cols., Biochem. Biophys. Res. Com. 1999, 263, 156-161, Wianny y Zernicka-Goetz, Nature Cell Biology, 2000, 2, 70-75). Dado que el ARNds induce efectos no específicos en las células demamífero, se ha planteado la hipótesis de que estos mecanismos no estaban completamente desarrollados en elsistema embrionario murino (Alexopoulou y cols., Nature, 2001, 413, 732-738, Reviews: Stark y cols., Annu. Rev. Biochem., 1998, 67, 227-264 y Samuel, Clin. Micro. Rev., 2001, 14, 778-809).
En lo que respecta a C. elegans y Drosophila, se ha demostrado que las hebras largas de iARN se degradan ahebras bicatenarias cortas (21-23 nucleótidos) y que estas formas degradadas actúan de mediadoras de la interferencia (Zamore y cols., Cell, 2000, 101, 25-33 y Elbashir y cols., Gen. Dev., 2001, 15, 188-200). Elbashir ycols. (Gen. Dev., 2001, 15, 188-200) demostraron que la escisión es igual en una diana codificante o no codificante y que ambas hebras del ARNpi pueden guiar la escisión contra el ARN no codificante o codificante, respectivamente. Elbashir y cols. mostraron de forma concluyente (Nature, 2001, 411, 494-498) que los ARNpi actúan de mediadores de una inactivación potente en una diversidad de líneas celulares de mamífero y probablemente eludían los efectos no específicos adversos de los ARNds largos en las células de mamífero. Este descubrimiento supuso un hito en la biología moderna y la aplicación de los ARNpi como agentes terapéuticos se convirtió rápidamente en un campo atractivo de investigación (revisado por McManus y Sharp, Nature Reviews Genetics, 2002, 3, 737-747 y Thompson, DDT, 2002, 7, 912-917).
Los ARNds son bastante estables en medios biológicos. Sin embargo, en el momento en el que el dúplex se disocia formando las hebras individuales, estas, al ser de ARN, se degradan inmediatamente. Una de las estrategias para conferir mayor estabilidad al ARNpi ha sido introducir restos de ARN químicamente modificados en las hebras individuales del ARNpi. Es bien sabido que los análogos de ARN sintéticos son mucho más estables en medios biológicos y que también se induce una estabilidad incrementada en los residuos de ARN naturales próximos. Por mayor estabilidad lo que se quiere decir principalmente es una mayor resistencia a las nucleasas pero también condichas modificaciones se puede conferir una mejor captación celular y distribución tisular. Se han descrito diversos análogos de ARNsi:
Pre-ARNsi (Parrish y cols. Mol. Cell, 2000, 6, 1077-1087) muestran tolerancia a ciertas modificaciones en laestructura para la iARN en C. elegans. Mediante la transcripción in vitro de las dos hebras diferentes en presencia de nucleótidos modificados, fue posible demostrar que los fosforotioatos se toleran tanto en la hebra codificante como no codificante al igual que 2’-fluorouracilo en lugar de uracilo. 2’-Aminouracilo y 2’-aminocitidina reducen laactividad de iARN cuando se incorporan a la hebra codificante y la actividad se pierde completamente cuando se incorporan a la hebra no codificante. Al cambiar uracilo a 2’-desoxitimidina en la hebra codificante, también sereduce el efecto, e incluso más cuando el cambio es en la hebra no codificante. Si una o ambas hebras están formadas completamente por monómeros de ADN, la actividad de iARN se pierde totalmente. En el estudio mencionado anteriormente, también se investigaron modificaciones en las bases; se encontró que 4-tiouracilo y 5bromouracilo se toleran en ambas hebras, mientras que 5-yodouracilo y 5-(3-aminoalil)uracilo reducen el efecto en la hebra codificante e incluso más en la hebra no codificante. Al sustituir la guanosina por inosina, se reduce mucho laactividad, independientemente de si la modificación se realiza en la hebra codificante o en la no codificante.
Sin embargo, las protuberancias de UU en 3’ pueden intercambiarse por protuberancias de 2’desoxitimidina en 3' yse toleran bien (Elbashir y cols., Nature, 2001, 411, 494-498 y Boutla y cols., Curr. Biol., 2001, 11, 1776-1780).
También se ha demostrado que pueden incorporarse monómeros de ADN en la hebra codificante sin poner en peligro la actividad.
Elbashir y cols., (EMBO, 2001, 20, 6877-6888) demostraron que los ARNpi modificados que contenían cuatro desoxinucleótidos en cada extremo 3' del ARNpi mantenían toda la actividad. Además, se encontró que la actividad se eliminaba si el ARNpi contenía solo un emparejamiento de bases incorrecto en "mitad" de la molécula.
Sin embargo, también se reseñó que pueden tolerarse 1-2 emparejamientos incorrectos siempre que los emparejamientos incorrectos se introduzcan en la hebra codificante (Holen y cols., NAR, 2002, 30, 1757-1766; Hohjoh, FEBS Lett., 2002, 26179, 1-5; Hamada y cols., Antisense and Nucl. Acid Drug Dev., 2002, 12, 301-309; yBoutla y cols., Curr. Biol., 2001, 11, 1776-1780)).
Nyk5nen y cols. (Cell, 2001, 107, 309-321) demostraron la necesidad de ATP para producir ARNpi de iARN, pero también en las posteriores etapas para desarrollar la actividad de los ARNpi. El ATP es necesario para desenrollar y mantener un 5’-fosfato para el reconocimiento por RISC. El 5’-fosfato es necesario para la actividad de ARNpi.Martínez y cols. (Cell, 2002, 110, 563-574) demostraron que una única hebra puede reconstituir el complejo silenciador inducido por ARN (RISC, Hammond y cols., Nature, 2000, 404, 293-296) y que una única hebra no
5 codificante tiene actividad especialmente cuando está 5’-fosforilada. La modificación en 5’ de la hebra no codificante, inhibe la actividad aunque puede modificarse tanto el extremo 3’ como el extremo 5’ de la hebra codificante.
Amarzguioui y cols. (NAR, 2003, 31, 589-595) confirmaron los hallazgos mencionados anteriormente y se concluyó que se toleraba un emparejamiento incorrecto siempre que no estuviera demasiado cerca del extremo 5’ de la hebra no codificante. Un emparejamiento incorrecto a 3-5 nucleótidos del extremo 5' de la hebra no codificante disminuye
10 la actividad de forma notable. Sin embargo, se demostró que se toleran dos emparejamientos incorrectos si están en "medio" o hacia el extremo 3' de la hebra no codificante, aunque con una actividad ligeramente menor.
Se han introducido modificaciones, como por ejemplo fosforotioatos y 2’-O-metil ARN, en los extremos de ARNpi(Amarzguioui y cols., NAR, 2003, 31, 589-595) y se toleraban bien. La 2’-O-alilación reduce el efecto cuando está presente en el extremo 5' de la hebra no codificante
15 El análogo nucleosídico bicíclico ENA (2’-0,4’-C-etilentimidina (ENA timidina, eT) también ha sido incorporado al ARNpi (Hamada y cols., Antisense and Nucl. Acid Drug Dev., 2002, 12, 301-309). Se demostró que dos ENA timidinas en el extremo 5' de la hebra codificante deterioraban el efecto. Hamada y cols. (2002) concluyeron que: "al usar 2’-O,4’-C -etilen timidina, que es un componente de los ácidos nucleicos con puentes de etileno (ENA), seelimina completamente la iARN".
20 Más recientemente, un número de ARNpi que contenían monómeros de LNA incorporados se describieron por Braasch y cols. (Biochemistry 2003, 42, 7967-7975).
En conclusión, se ha demostrado que la hebra no codificante es más sensible a las modificaciones que la hebra codificante. Sin limitarse a ninguna teoría específica, se cree que estos fenómenos, al menos en parte, se basan enel hecho de que la estructura del dúplex hebra no codificante/diana tiene que ser ARN natural de forma A. La hebra 25 codificante de ARNpi puede considerarse un "vehículo" para la administración de la hebra no codificante a la diana y la hebra codificante no participa en la degradación del ARN catalizada por enzimas. Así, al contrario que con la hebra no codificante, las modificaciones en la hebra codificante se toleran dentro de un cierto margen, aunque las modificaciones inducen cambios en la estructura de forma A del ARNpi. Si se introducen cambios en la hebra nocodificante tienen que equilibrarse estructuralmente dentro del marco de reconocimiento del complejo silenciador
30 inducido por ARN (RISC) natural.
Evidentemente, existe una necesidad en el campo de análogos de ARNpi novedosos y mejorados que posean potentes propiedades in vivo, una mayor bioestabilidad (que corresponda a un Tf incrementado), una resistencia anucleasas incrementada, captación celular mejorada y/o distribución tisular mejorada con respecto a los compuestos de ARNpi que están disponibles actualmente.
35 Así, el objeto de la presente invención es proporcionar análogos de ARNpi mejorados que tengan una o más de las propiedades mejoradas mencionadas anteriormente. La presente invención proporciona así análogos de ARNpimejorados que, entre otras cosas, muestren un elevado grado de bioestabilidad y/o estabilidad frente a las nucleasas y que de forma eficaz se dirijan a ARN, como por ejemplo ARNm o pre-ARNm, o a una variedad de ARNestructural como por ejemplo ARNt, ARNsn, ARNsc, ARNr o incluso ARN reguladores como microARN.
40 Breve descripción de la invención
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto bicatenario que comprendeuna hebra codificante y una hebra no codificante, en el que cada hebra comprende 17-25 nucleótidos y en el que dicho compuesto comprende al menos un monómero de ácido nucleico cerrado (LNA), que tiene la estructura
45 en las que
X se selecciona del grupo que consiste en O, S y NRH, en el que RH es H o alquilo C1-4;
Y es CH2;
B es una nucleobase;
Z y Za están independientemente ausentes o se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un
50 grupo de enlace internucleosídico, un grupo terminal y un grupo protector; de forma que cuando el monómero de
LNA está localizado en el extremo 3', Z es un grupo terminal y Z* es un grupo de enlace internucleosídico; cuando elmonómero de LNA está localizado en el extremo 5', Z está ausente y Z* es un grupo terminal; y cuando el monómero de LNA está localizado dentro de la secuencia de nucleótidos, Z está ausente y Z* es un grupo de enlace internucleosídico y
5 en la que ningún monómero de LNA está localizado en el extremo 5' de la hebra no codificante.
En otro aspecto la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto deacuerdo con la invención y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional la presente invención se refiere a un compuesto de acuerdo con la invención para usar como medicamento.
10 En otro aspecto más, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer o de síndrome respiratorio agudo grave (SARS).
Otros aspectos de la presente invención serán obvios de la descripción siguiente y de las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra las dos conformaciones de la furanosa (tipo S y tipo N).
15 La FIG. 2 muestra la estabilidad mejorada de LNApi comparada con ARNpi en fluidos biológicos. GL3+/-se degrada rápidamente mientras que LNApi ligeramente modificado (n.º 2185/2186) y LNApi con mayores modificaciones (n.º 2703-01/2186) muestran una estabilidad notablemente mejorada. El estudio de estabilidad se realizó en suero bovino fetal al 10% en solución salina fisiológica a 37 ºC.
La FIG. 3 muestra la regulación por disminución del gen NPY endógeno en células PC12 por los LNApi. Los
20 compuestos analizados eran (de izquierda a derecha): 2ª barra: ARNpi sin relación; 3ª barra: NPY+/1, 4ª barra: 2796/NPY-; 5ª barra: 2795/NPY+; 6ª barra: NPY+/2797; 7ª barra: 2796/2797.
La FIG. 4 muestra el efecto de LNApi dirigido contra luciferasa de luciérnaga y la modulación de la expresión. Las líneas de la izquierda representan la hebra codificante y las líneas de la derecha representan la hebra no codificante del LNApi. Las marcas de las líneas individuales representan la posición de los monómeros de LNA. Las dos últimas
25 líneas de la derecha representan el ARNpi de control. La primera barra (de la izquierda) representa la expresión del testigo de luciferasa, sin modular y completo con la que se normalizan todas las muestras. Los compuestos analizados eran (de izquierda a derecha): 2ª barra: GL3+/-; 3ª barra: GL3+/2186; 4ª barra: GL3+/2187; 5ª barra: 2184/GL3-; 6ª barra: 2184/2186; 7ª barra: 2184/2187; 8ª barra: 2185/GL3-; 9ª barra: 2185/2186; 10ª barra: 2185/2187; 11ª barra: 2703-1/GL3-; 12ª barra: 2703-1/2186; 13ª barra: GL3+/2189; 14ª barra: ARNpi sin relación.
30 La FIG. 5 muestra el efecto de LNApi dirigido contra luciferasa de Renilla y la modulación de la expresión. Las líneasde la izquierda representan la hebra codificante y las líneas de la derecha representan la hebra no codificante del LNApi. Las marcas de las líneas individuales representan la posición de los monómeros de LNA. La primera barra representa la expresión del testigo de luciferasa, sin modular y completo con el que se normalizan todas las muestras. Los compuestos analizados eran (de izquierda a derecha): 2ª barra: RL+/-; 3ª barra: RL+/2699-1; 4ª barra:
35 2700-1/2699-1; 5ª barra: 2702-1/2699-1; 6ª barra: RL+/2701-1; 7ª barra: 2700-1/2701-1; 8ª barra: 2702-1/2701-1.
La FIG. 6 muestra la estabilidad en suero de rata de oligos monocatenarios que contienen monómeros de LNA yARN, ARN bicatenario (ds) y ARN monocatenario (ss). Los ARNds y ARNss se degradaron inmediatamente, mientras que los oligos monocatenarios intactos que contenían monómeros de LNA y ARN podían detectarse después de 20-40 minutos. Los oligos analizados fueron 2189 y los ARNss (GL3-) y ARNds (GL3+/1)
40 correspondientes.
La FIG. 7 muestra compuestos de LNApi y ARNpi para dirigirse a SARS. Mayúsculas: monómero de beta-D-oxi-LNA. Minúsculas: monómero de ARN.
La FIG. 8 muestra el efecto citopático (CPE) en células vero infectadas con SARS y el CPE reducido después del tratamiento con ARNpi. Se muestra el ARNpi SARS 1. El simulado se trata con el agente de transfección
45 Lipofectamina 2000 solo. También se muestran células no infectadas.
La FIG. 9 muestra la inhibición de la citotoxicidad inducida por SARS mediante ARNpi y LNApi. Los compuestos analizados eran: SARS 1: 2842-1/2843-1; SARS 2: 2872-1/2845-1; SARS 3: 2846-1/2847-1; SARS 4: 2848-1/2849-1así como los ARNpi no modificados correspondientes. No pudieron detectarse diferencias en el tratamiento con LNApi y ARNpi para el sitio más eficaz, SARS 1. El sitio de eficacia media, SARS 3, fue mejorado mediante LNApi50 para que fuera tan eficaz como el sitio SARS 1. Los dos sitios que no mostraron ninguna eficacia de ARNpi, SARS 2 y SARS 4, tampoco mostraron ningún efecto mediante el tratamiento con LNApi. El efecto inhibidor se reduce con dosis víricas elevadas (60.000 DICT50). Los controles fueron ARNpi y LNApi contra luciferasa (Luc) y neuropéptido Y (NPY). No se observaron efectos adversos con los controles de LNApi. La citotoxicidad se midió en términos deliberación de lactato deshidrogenasa (LDH) a las 50 horas de la infección. Las diferentes gráficas representan
55 diferentes dosis víricas (dosis infecciosa de cultivo tisular 50, DICT50).
La FIG. 10 muestra el mecanismo propuesto de RISC que se carga donde la helicasa está desenrollando el dúplexde ARNpi en el extremo con una unión más débil.
La FIG. 11 muestra el efecto de emparejamientos incorrectos de un único par de bases incorporados en la otra punta del extremo 5' de la hebra no codificante. Las líneas son ARN, los círculos indican monómeros de LNA y las 60 cruces ilustran las incorporaciones de emparejamientos incorrectos. Los compuestos analizados eran (de izquierda a
derecha): luciferasa de Renilla: 2ª barra: RL+/-; 3ª barra: RL+/2701-1; 4ª barra: RL+(pos. 19A→C)/2701-1; 5ª barra: RL+(pos. 19A→C)/-; luciferasa de luciérnaga: 2ª barra: GL3+/-; 3ª barra: GL3+/2187; 4ª barra: GL3+(pos. 19A→C)/2187; 5ª barra: GL3+(pos. 19A→C)/-.
La FIG. 12 muestra el efecto de la posición del monómero de LNA en la hebra no codificante. Las líneas son ARN,
5 los círculos indican monómeros de LNA. Los compuestos analizados eran (de izquierda a derecha): 2ª barra: GL3+/-; 3ª barra: GL3+/2187; 4ª barra: GL3+/2789; 5ª barra: GL3+/2790; 6ª barra: GL3+/2792: 7ª barra: GL3+/2793; 8ª barra:GL3+/2794; 9ª barra: GL3+/2864; 10ª barra: GL3+/2865; 11ª barra: GL3+/2866; 12ª barra: GL3+/2867.
La FIG. 13 muestra la mejora por LNApi de los sitios diana de eficacia media. El simulado representa sin oligo. Ren1 es el sitio diana óptimo para ARNpi; y Ren2 y Ren3 son sitios menos potentes. Las líneas son ARN y los círculos
10 indican monómeros de LNA. Los compuestos analizados eran: Ren1: RL+/-; Ren2: 2863/hebra no codificante no modificada correspondiente; Ren3: 2826/hebra no codificante no modificada correspondiente, así como los ARNpino modificados correspondientes.
La FIG. 14 muestra el efecto de silenciación génica dependiente de la concentración de LNApi y ARNpi.
La FIG. 15 muestra diseños mejorados de ARNpi modificados mediante incorporación de monómeros de ADN y15 LNA.
La FIG. 16 muestra la menor eficacia de LNApi usando un monómero de LNA con una nucleobase voluminosa (T enlugar de U) en la posición de escisión 10 en la hebra no codificante. Los compuestos analizados eran: ARNpi: GL3+/-; LNApi10T: GL3+/2865; LNApi10U: GL3+/2865-U.
La FIG. 17 muestra la inhibición de la diana codificante/no codificante de SARS en 3’-UTR de luciferasa de 20 luciérnaga
La FIG. 18 muestra el efecto antitumoral in vivo de dos LNApi contra EGFP (3029/3031 y 3030/3031) sobre elxenoinjerto de 15PC3-EGFP en ratones NMRI.
La FIG. 19 muestra el volumen del tumor de ratones con xenoinjerto de 15PC3-EGFP tratados con LNApi y solución salina usando minibombas Alzet 1007D. Los tumores se implantaron en día 0. El tratamiento se inició el día 7 y
25 finalizó el día 12. Como puede observarse, los ratones tratados con LNApi presentaban un tamaño tumoral correspondiente al de los ratones de control.
La FIG. 20 muestra que los dúplex de LNApi están intactos después de 7 días en las minibombas Alzet 1007D.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
30 En el presente contexto, el término "nucleótido" quiere significar una unidad de 2-desoxirribosa (ADN) o una unidad de ribosa (ARN) que está unida a través de su carbono número uno a una base nitrogenada, como por ejemplo adenina (A), citosina (C), timina (T), guanina (G) o uracilo (U) y que está unida a través de su átomo de carbono número cinco a un grupo de enlace internucleosídico (según se define a continuación) o a grupos terminales (segúnse define a continuación). Por consiguiente, cuando se usa en el presente documento, el término "nucleótido"
35 engloba unidades de ARN (o monómeros) que comprenden una unidad de ribosa que está unida a través de su carbono número uno a una base nitrogenada, como por ejemplo A, C, T, G o U y que está unida a través de suátomo de carbono número cinco a un grupo fosfato o a un grupo terminal. De forma análoga, el término "nucleótido" también engloba unidades de ADN (o monómeros) que comprenden una unidad de 2-desoxirribosa que está unida a través de su carbono número uno a una base nitrogenada, como por ejemplo A, C, T, G o U y que está unida a
40 través de su átomo de carbono número cinco a un grupo fosfato o a un grupo terminal. El término "nucleótido" también cubre variantes o análogos de dichos monómeros de ARN y ADN. Más adelante se ofrece una descripción detallada de dichas variantes o análogos de monómeros de ARN y ADN.
En el presente contexto, el término "nucleósido" quiere significar una unidad de 2-desoxirribosa (ADN) o una unidad de ribosa (ARN) que está unida a través de su carbono número uno a una base nitrogenada, como por ejemplo 45 adenina (A), citosina (C), timina (T), guanina (G) o uracilo (U). Por consiguiente, cuando se usa en el presente documento, el término "nucleósido" engloba unidades de ARN (o monómeros) que comprenden una unidad deribosa que está unida a través de su carbono número uno a una base nitrogenada, como por ejemplo A, C, T, G o U. De forma análoga, el término "nucleósido" también engloba unidades de ADN (o monómeros) que comprenden una unidad de 2-desoxirribosa que está unida a través de su carbono número uno a una base nitrogenada, como por
50 ejemplo A, C, T, G o U. El término "nucleósido" también cubre variantes o análogos de dichos monómeros de ARN y ADN. Se entenderá que los nucleósidos individuales está unidos mediante un grupo de enlace internucleosídico.
Cuando se usa en el presente contexto, los términos "monómero de ácido nucleico cerrado", "resto de ácido nucleicocerrado", "monómero de LNA" o "resto de LNA" se refieren a un análogo nucleotídico bicíclico. Los monómeros deLNA se describen, entre otros, en los documentos WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO
55 02/28875, WO 03/006475 y WO 03/095467. El monómero de LNA también puede definirse con respecto a su fórmula química. Así, un "monómero de LNA" tal como se usa en el presente documento tiene la estructura química que se muestra en el Esquema 2 siguiente:
Esquema 2
o
en las que
X se selecciona del grupo que consiste en O, S y NRH, en el que RH es H o alquilo, como por ejemplo alquilo C1-4;
Y es (-CH2)r,
Z y Z* están independientemente ausentes o se seleccionan independientemente del grupo que consiste en ungrupo de enlace internucleosídico, un grupo terminal y un grupo protector; y
B es una nucleobase; Más adelante se ofrece una descripción detallada de los monómeros de LNA preferidos.
La expresión "grupo de enlace internucleosídico" pretende significar un grupo capaz de acoplar covalentemente dos nucleósidos, dos monómeros de LNA, un nucleósido y un monómero de LNA, etc. Los ejemplos específicos y preferidos incluyen grupos fosfato y grupos fosforotioato.
El término "ácido nucleico" se define como una molécula formada mediante el enlace covalente de dos o más nucleótidos. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan de forma intercambiable en el presente documento. Cuando se usan en el presente documento, un "ácido nucleico" o un "polinucleótido" habitualmente contiene más de 35 nucleótidos.
El término "oligonucleótido" se refiere, en el contexto de la presente invención, a un oligómero (también denominadooligo) de monómeros de ARN, de ADN y/o de LNA así como sus variantes y análogos. Cuando se usa en elpresente documento, un "oligonucleótido" habitualmente contiene 2-35 nucleótidos, en particular 12-35 nucleótidos.
Con el término "propiedades mejoradas" se entiende una o más propiedades por las que el compuesto de LNApi de la invención muestra un mejor resultado que sus homólogos naturales. Los ejemplos de dichos parámetros son facilidad de producción, coste de producción, mayor vida útil en depósito, mayor afinidad de unión a la diana (complemento provisional en la diana de LNApi o ARNm), mayor capacidad para penetrar una membrana celular, mejor resistencia a nucleasas extracelulares e intracelulares, mayor facilidad para la formulación farmacéutica, mayor potencia en su modo de acción, mejor distribución tisular, mejor respuesta fenotípica, mayor duración de los efectos, etc.
Con los términos "unidad" o "residuo" se entiende un monómero.
El término "al menos uno" engloba un número entero mayor o igual a 1, como por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y así sucesivamente.
Los términos "un" y "uno/a" tal como se usan con respecto a un nucleótido, un nucleósido, un agente activo, un monómero de LNA, etc. se pretende que signifiquen uno o más. En particular, la expresión "un componente (como por ejemplo un nucleótido, un nucleósido, un agente activo, un monómero de LNA o similares) que se selecciona del grupo que consiste en..." se pretende que signifique que pueden seleccionarse uno o más de los citados componentes. Así, las expresiones como "un componente seleccionado del grupo que consiste en A, B y C" se pretende que incluya todas las combinaciones de A, B y C, es decir A, B, C, A+B, A+C, B+C y A+B+C.
El término "tio-LNA" se refiere a un nucleótido cerrado en el que la X en el Esquema 2 es S. tio-LNA puede estar tanto en la forma beta-D como en la forma alfa-L. Generalmente, se prefiere la forma beta-D de tio-LNA. La forma beta-D de tio-LNA se muestra en el Esquema 3 como el compuesto 3C.
El término "tio-LNA" se refiere a un nucleótido cerrado en el que la X en el Esquema 2 es NH o NRH, en el que RH es hidrógeno o alquilo C1-4. Amino-LNA puede estar tanto en la forma beta-D como en la forma alfa-L. Generalmente, se prefiere la forma beta-D de amino-LNA. La forma beta-D de amino-LNA se muestra en el Esquema 3 como el compuesto 3D.
El término "oxi-LNA" se refiere a un nucleótido cerrado en el que la X en el Esquema 2 es O. Oxi-LNA puede estar tanto en la forma beta-D como en la forma alfa-L. Se prefiere la forma beta-D de oxi-LNA. La forma beta-D y la forma alfa-L se muestran en el Esquema 3 como los compuestos 3A y 3B, respectivamente.
El término "LNApi" se usa ampliamente con respecto a los compuestos bicatenarios de la invención. Así, un "LNApi", tal como se usa en el presente documento, siempre comprende al menos un monómero de LNA.
Tal como se usa en el presente documento, el término "ARNpi" se refiere a un tramo bicatenario de ARN o demonómeros de ARN modificados. En un compuesto de ARNpi típico, las dos hebras habitualmente tienen 19nucleótidos complementarios entre sí, creando así una doble hebra que tiene 19 nucleótidos de longitud y cada hebra tiene un extremo 3’ de dos nucleótidos protuberantes. Esta no es una definición estricta de ARNpi, que puede ser ligeramente más larga o más corta y tener o no protuberancias. En el ARNpi una hebra es la guía y escomplementaria al ARN diana (hebra no codificante) y la otra hebra (hebra codificante) tiene la misma secuencia que el ARN diana y por lo tanto es complementario a la hebra guía o no codificante. En el presente documento, los ARNreguladores como por ejemplo "micro ARN" ("miARN") y "ARN corto" ("ARNsh") y una diversidad de ARN estructurales como por ejemplo ARNt, ARNsn, ARNsc, ARNr se usan de forma intercambiable con el término "ARNpi".
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "ARNm" quiere significar el/los transcrito(s) de ARNm de ungen diana conocidos actualmente y cualesquiera transcritos adicionales, que puedan identificarse.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico diana" engloba cualquier ARN que podría someterse a modulación, escisión dirigida, bloqueo estérico (disminución de la abundancia del ARN diana y/o inhibición de la traducción) guiado por la hebra no codificante. El ARN diana podría, por ejemplo, ser ARN genómico, ARN vírico genómico, ARNm o un pre-ARNm
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "modificación de ácidos nucleicos específicos de diana "quiere significar cualquier modificación en un ácido nucleico diana.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "gen" quiere significar el gen que incluye exones, intrones, regiones 5' y 3' no codificantes y elementos reguladores y todas sus variantes actualmente conocidas y cualesquieravariantes adicionales, que puedan dilucidarse.
Tal como se usa en el presente documento, el término "modulación" quiere significar bien un aumento (estimulación)
o bien un descenso (inhibición) en la expresión de un gen. En la presente invención, la inhibición es la forma preferida de modulación de la expresión génica y el ARNm es una diana preferida.
Tal como se usa en el presente documento, el término "dirigir" un compuesto de LNApi o ARNpi a un ácido nucleico diana particular quiere significar proporcionar el oligonucleótido de ARNpi o LNApi a la célula, animal o ser humano de tal forma que los compuestos de LNApi o ARNpi sean capaces de unirse y modular la función de la diana.
Tal como se usa en el presente documento, "hibridación" quiere significar enlaces de hidrógeno, que pueden ser de Watson-Crick, Hoogsteen, enlaces de hidrógeno de Hoogsteen inverso, etc. entre bases nucleosídicas o nucleotídicas complementarias. Las cuatro nucleobases, que se encuentran habitualmente en el ADN son G, A, T y C, de las que G se empareja con C y A se empareja con T. En el ARN la T está sustituida por uracilo (U), que después se empareja con A. Los grupos químicos de las nucleobases que participan en la formación de dúplex estándar constituyen la cara Watson-Crick. Hoogsteen demostró un par de años después que las nucleobases de purina (G y A) además de su cara Watson-Crick tienen una cara Hoogsteen que puede reconocerse desde elexterior de un dúplex y se usa para unir los oligonucleótidos de pirimidina mediante enlaces de hidrógeno, formando así una estructura de triple hélice.
En el contexto de la presente invención, "complementaria" se refiere a la capacidad de emparejamiento preciso entre dos secuencias de nucleótidos entre sí. Por ejemplo, si un nucleótido en una cierta posición de un oligonucleótido puede formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido situado en la posición correspondiente de una molécula de ADN o ARN, entonces se considera que el oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí en esa posición. Las hebras de ADN o ARN se consideran complementarias entre sí cuando un número suficiente denucleótidos del oligonucleótido pueden formar enlaces de hidrógeno con los nucleótidos correspondientes del ADN o ARN diana para permitir la formación de un complejo estable. Para ser estable in vitro o in vivo, la secuencia de un compuesto de LNApi o ARNpi no tiene que ser complementaria al 100% a su ácido nucleico diana. Los términos "complementario" y "específicamente hibridable" por lo tanto implican que el compuesto de LNApi o ARNpi se une de una forma lo suficientemente fuerte y específica a la molécula diana para proporcionar la interferencia deseada con la función normal de la diana dejando mientras sin afectar la función de los ARNm no diana.
En el presente contexto, el término "conjugado" se pretende que indique una molécula heterogénea formada por la unión covalente de un compuesto tal como se describe en el presente documento a uno o más restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos. Los ejemplos de restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos incluyen agentesmacromoleculares tales como proteínas, cadenas de ácidos grasos, restos de azúcares, glucoproteínas, polímeros,
o sus combinaciones. Habitualmente las proteínas pueden ser anticuerpos contra una proteína diana. Los polímeros habituales pueden ser polietilenglicol.
En el presente contexto, el término "alquilo C1-6" se pretende que signifique una cadena de hidrocarburo saturado lineal o ramificada en la que las cadenas más largas tienen de uno a seis átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo y hexilo. Una cadena de hidrocarburo ramificada se pretende que signifique un alquilo C1-6 sustituido en cualquier carbono con unacadena de hidrocarburo.
En el presente contexto, el término "alquilo C1-4" se pretende que signifique una cadena de hidrocarburo saturado lineal o ramificada en la que la cadena más larga tiene de uno a cuatro átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo y terc-butilo. Una cadena de hidrocarburo ramificada se pretende que signifique un alquilo C1-4 sustituido en cualquier carbono con una cadena de hidrocarburo.
Cuando se usa en el presente documento, el término "alcoxi C1-6" se pretende que signifique alquil-oxi C1-6, tal comometoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, pentoxi, isopentoxi, neopentoxi yhexoxi.
En el presente contexto, el término "alquenilo C2-6" se pretende que signifique un grupo hidrocarburo lineal o ramificado que tiene de dos a seis átomos de carbono y que contiene uno o más enlaces dobles. Los ejemplos ilustrativos de grupos alquenilo C2-6 incluyen alilo, homoalilo, vinilo, crotilo, butenilo, butadienilo, pentenilo, pentadienilo, hexenilo y hexadienilo. La posición de la insaturación (el enlace doble) puede estar en cualquier posición a lo largo de la cadena de carbono.
En el presente contexto el término "alquinilo C2-6" se pretende que signifique grupos hidrocarburo lineales o ramificados que contienen de dos a seis átomos de carbono y que contiene uno o más enlaces triples. Los ejemplos ilustrativos de grupos alquinilo C2-6 incluyen acetileno, propinilo, butinilo, pentinilo y hexinilo. La posición de lainsaturación (el enlace triple) puede estar en cualquier posición a lo largo de la cadena de carbono. Puede haber más de un enlace insaturado de tal forma que el "alquinilo C2-6" sea un diino o un enediino como conoce el experto en la técnica.
El término "carcinoma", se pretende que indique un tumor maligno de origen epitelial. El tejido epitelial cubre o tapiza las superficies interiores y exteriores del cuerpo. Los ejemplos de tejido epitelial son la piel y la mucosa y serosa que tapizan las cavidades corporales y los órganos internos, tales como los intestinos, la vejiga urinaria, el útero, etc. El tejido epitelial también puede extenderse a capas de tejido más profundas de las glándulas, como por ejemplo las glándulas que segregan moco.
El término "sarcoma" se pretende que indique un tumor maligno que crece a partir de tejido conectivo, tal como cartílago, grasa, músculos, tendones y huesos.
El término "glioma", cuando se usa en el presente documento, se pretende que cubra un tumor maligno que seorigina en células gliales.
Compuestos de la invención
La presente invención se base, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que el LNA puede usarse para mejorar la interferencia de ARN incorporando monómeros de LNA en la hebra codificante y/o no codificante de los polinucleótidos bicatenarios, como por ejemplo ARNpi. Esto es particularmente sorprendente dado que los monómeros de ENA de estructura muy similar perjudican mucho la interferencia de ARN, incluso con ARNpimínimamente modificados (Hamada y cols., Antisense and Nucl. Acid Drug Dev., 2002, 12, 301-309).
El LNA muestra una propiedades de unión sin precedentes por secuencias de ADN y ARN diana. Además de estas notables propiedades de hibridación, los monómeros de LNA pueden mezclarse y actuar de forma cooperativa con monómeros de ADN y ARN así como con análogos de nucleótidos, como por ejemplo monómeros de ARN con modificación 2'-O-alquilo. La afinidad de unión sin precedentes de LNA por las secuencias de ADN o ARN diana y la capacidad de mezclar libremente monómeros de LNA con monómeros de ADN y ARN y un abanico de análogos de nucleótidos tiene algunas consecuencias importantes de acuerdo con la invención para el desarrollo de compuestos de tipo ARNpi eficaces y seguros.
El ADNds natural existe a pH fisiológico en forma de una hélice de forma B, mientras que el ARNds existe en forma de una hélice de forma A. Esta diferencia morfológica se debe a la diferencia en las conformaciones preferidas de los azúcares de las desoxirribosas y las ribosas. A temperatura ambiente el anillo de furanosa de la desoxirribosa existe en equilibrio entre la conformación C2’-endo (tipo S) y C3’-endo (tipo N) con una barrera de energía de ~2 kcal/mol (Fig. 1). La conformación C2’-endo (tipo S) da lugar a la hélice de forma B, mientras que la conformación C3’-endo (tipo N) da lugar a la hélice de forma A. Para la desoxirribosa la conformación de tipo S es de una energía menor que la de tipo N y eso explica porqué el ADN se encuentra en la conformación de tipo S. Para la ribosa se prefiere la conformación de tipo S y por lo tanto, el ARN adopta la hélice de forma A. Se sabe que la hélice de forma A está asociada con una mayor estabilidad de hibridación.
Los monómeros de LNA están cerrando la conformación del anillo de furanosa en una conformación quecorresponde a una conformación C3’-endo terminal. Estos monómeros por lo tanto imitan la conformación del ARN yse ha demostrado que la estructura de los oligonucleótidos y los dúplex de los monómeros son de tipo ARN(Petersen y cols., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 5974-82). Esto quiere decir que la estructura de oligonucleótidos de ARN y los dúplex de ARN/ARN a los que se incorporan los monómeros de LNA no cambian significativamente con respecto a los oligonucleótidos de ARN y los dúplex de ARN/ARN naturales. Se demostró además que los monómeros de LNA indujeron una conformación de tipo ARN cuando se introducían en ADN. Así, los monómeros de LNA imponen, en particular en el extremo 3', un alto grado de conformación C3’-endo (de tipo ARN). Si, por ejemplo, uno de cada dos o uno de cada tres restos en un oligómero de ADN está sustituido por monómeros de LNA, laestructura global del oligonucleótido se parecerá mucho al ARN. Así, el dúplex formado por dichos oligonucleótidos conseguirá una estructura que se parezca a los dúplex de forma A naturales (ARN/ARN). Es parte de esta invención usar esta propiedad de los monómeros de LNA para dirigir la conformación de ADN hacia una estructura de ARN.
Se apreciará que la afinidad sin precedentes del LNA puede usarse para acortar la longitud habitual de unoligonucleótido de ARNpi (de 21-35 meros a, por ejemplo, 12-20 meros) sin poner en peligro la afinidad necesaria para la actividad farmacológica. Dado que la especificidad intrínseca de un oligonucleótido es inversamente proporcional a su longitud, un acortamiento así aumentaría significativamente la especificidad del compuesto LNApipor su ARN diana. Un objetivo de la invención, debido por lo tanto al hecho de que la secuencia del genoma humano está disponible y la anotación de sus genes está progresando rápidamente, es identificar las secuencias únicas, lo más cortas posible, en el ARNm diana. Además, al reducir el tamaño de los oligonucleótidos y así facilitar elprocedimiento de fabricación y reducir los costes de fabricación, se cree que los compuestos de LNApi, como los
que se describen en el presente documento, tienen potencial para convertirse en base del tratamiento con iARN y deser un tratamiento comercialmente competitivo que puede ofrecerse para una variedad de enfermedades.
Por consiguiente, en su aspecto más amplio la presente invención se refiere a un compuesto bicatenario que comprende una hebra codificante y una hebra no codificante, en el que cada hebra comprende 12-35 nucleótidos y en el que dicho compuesto comprende al menos un monómero de ácido nucleico cerrado (LNA), que tiene la estructura
o
en las que
X se selecciona del grupo que consiste en O, S y NRH, en el que RH es H o alquilo C1-4;
Y es CH2;
B es una nucleobase;
Z y Z* están independientemente ausentes o se seleccionan independientemente del grupo que consiste en ungrupo de enlace internucleosídico, un grupo terminal y un grupo protector; de forma que cuando el monómero de LNA está localizado en el extremo 3', Z es un grupo terminal y Z* es un grupo de enlace internucleosídico; cuando elmonómero de LNA está localizado en el extremo 5', Z está ausente y Z* es un grupo terminal; y cuando el monómero de LNA está localizado dentro de la secuencia de nucleótidos, Z está ausente y Z* es un grupo de enlace internucleosídico y
en la que ningún monómero de LNA está localizado en el extremo 5' de la hebra no codificante.
Salvo en el extremo 5’ de la hebra no codificante, los compuestos bicatenarios de la invención pueden estar compuestos enteramente de monómeros de LNA o pueden estar compuestos por monómeros de LNA en cualquier combinación con monómeros de ADN, monómeros de ARN o análogos nucleotídicos.
Como se ha indicado anteriormente, el término "nucleótido" quiere significar una unidad de 2–desoxirribosa (ADN) ouna unidad de ribosa (ARN) que está unida a través de su carbono número uno a una base nitrogenada, como por ejemplo adenina (A), citosina (C), timina (T), guanina (G) o uracilo(U) y que está unida a través de su átomo de carbono número cinco a un grupo de enlace internucleosídico (según se define anteriormente) o a un grupo terminal (como se describe más adelante). Así, el término "nucleótido" engloba unidades (o monómeros) de ARN que comprenden una unidad de ribosa que está unida a través de su carbono número uno a una base nitrogenada, comopor ejemplo A, C, T, G o U y que está unida a través de su átomo de carbono número cinco a un grupo fosfato o aun grupo terminal. Como se explica anteriormente, el término "nucleótido" también engloba unidades (o monómeros)de ADN que comprenden una unidad de 2–desoxirribosa que está unida a través de su carbono número uno a una base nitrogenada, como por ejemplo A, C, T, G o U y que está unida a través de su átomo de carbono número cinco a un grupo fosfato o a un grupo terminal. El término "nucleótido" también cubre variantes o análogos de dichos monómeros de ARN y ADN. Por ejemplo, el grupo 2’–OH (ARN) o 2’–H (ADN) puede estar sustituido con –O–CH3, –O– CH2–CH2–OCH3, –O–CH2–CH2–CH2–NH2, –O–CH2–CH2–CH2–OH o F. Otros ejemplos de análogos nucleotídicos son los monómeros de LNA. Además, el grupo de enlace internucleosídico no está limitado a fosfato (–O–P (O)2–O–), sino que puede incluir –O–P(O,S)–O–, –O–P(S)2–O–, –S–P(O)2–O–, –S–P(O,S)–O–, –S–P(S)2–O–, –O–P(O)2–S–, –O–P(O, S)–S–, –S–P(O)2– S–, –O–PO(RH)–O–, O–PO(OCH3)–O–, –O–PO(NRH)–O–, O–PO(OCH2CH2S–R)–O–, –O–PO(BH3)–O–, –OPO(NHRH)–O–, –O– P(O)2–NRH–, –NRH–P(O)2–O–, –NRH–CO–O–, –NRH–CO–NRH–, –O–CO–O–, –O–CO–NRH–, –NRH–CO–CH2–, –O–CH2–CO–NRH–, – O–CH2–CH2–NRH–, –CO–NRH–CH2–, –CH2–NRH–CO–, –O–CH2–CH2–S–, –S–CH2–CH2–O–, –SCH2–CH2–S–, –CH2–SO2–CH2–, – CH2–CO–NRH–, –O–CH2–CH2–NRH–CO–, –CH2–NCH3–O–CH2–, donde RH es hidrógeno o alquilo C1–4. Además, la base nitrogenada no está restringida a A, C, T, G o U, sino que puede incluir otras purinas y pirimidinas, como por ejemplo5–metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5–bromouracilo, 5–propiniluracilo, 5–propini–6–fluoroluracilo, 5– metiltiazoluracilo, 6–aminopurina, 2–aminopurina, inosina, 2,6–diaminopurina, 7–propin–7–desazaadenina, 7–propin–7– desazaguanina y 2–cloro–6–aminopurina. Otros ejemplos de variantes y análogos de nucleótidos que entran dentro dela presente definición de "nucleótido" se describen en Freier & Altmann (Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429–4443) yUhlmann (Curr. Opinion en Drug & Development (2000, 3 (2): 293–213). El Esquema 1 siguiente ilustra ejemplos seleccionados de dichas variantes y análogos de nucleótidos. En conclusión, los compuestos de la invención pueden contener cualquiera de los nucleótidos mencionados anteriormente siempre que el compuesto contenga al menos unmonómero de LNA en al menos una de las hebras pero no en el extremo 5’ de la hebra no codificante.
Esquema 1
Tal como se indica anteriormente, el término "monómero de ácido nucleico cerrado" o "monómero de LNA" se refiere a un análogo nucleotídico bicíclico y tiene la estructura química que se muestra en el Esquema 2 siguiente:
Esquema 2
o
en las que X se selecciona del grupo que consiste en O, S y NRH, en el que RH es H o alquilo, como por ejemplo alquilo C1-4;
Y es (-CH2)r;
Z y Z* están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un grupo de enlace internucleosídico, un grupo terminal y un grupo protector; y B es una nucleobase; Un monómero de LNA preferido tiene la estructura química que se muestra en el Esquema 3 siguiente:
Esquema 3
en las que Z, Z*, RH y B se han definido anteriormente.
10 En una realización de la invención incluso más preferida, X es O y r es 1, es decir un monómero de LNA incluso máspreferido tiene la estructura química mostrada en el Esquema 4 siguiente:
Esquema 4
en las que Z, Z* y B se han definido anteriormente.
Las estructuras que se muestran en 3A y 3B anteriormente también pueden denominarse "forma beta-D" y "forma alfa-L", respectivamente. En una realización de la invención muy preferida, el monómero de LNA es la forma beta-D,es decir el monómero de LNA tiene la estructura química que se indica en 3A anteriormente.
Tal como se indica anteriormente, Z y Z*, que sirven para un enlace internucleosídico, están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un grupo de enlace internucleosídico, un grupo terminal y un grupo protector dependiendo de la posición real del monómero de LNA dentro del compuesto. Se entenderá que enlas realizaciones donde el monómero de LNA está localizado en el extremo 3', Z es un grupo terminal y Z* es un enlace internucleosídico. En las realizaciones donde el monómero de LNA está localizado en el extremo 5', Z está ausente y Z* es un grupo terminal. En las realizaciones donde el monómero de LNA está localizado dentro de la secuencia de nucleótidos, Z está ausente y Z* es un grupo de enlace internucleosídico.
Los ejemplos específicos de grupos de enlace internucleosídicos incluyen –O–P(O)2–O–, –O–P(O,S)–O–, –O–P(S)2–O–, –S– P(O)2–O–, –S–P(O,S)–O–, –S–P(S)2–O–, –O–P(O)2–S–, –O–P(O,S)–S–, –S–P(O)2–S–, –O–PO(RH)–O–, O–PO(OCH3)–O–, –O– PO(NRH)–O–, –O–PO(OCH2CH2S–R)–O–, –O–PO(BH3)–O–, –O–PO(NHRH)–O–, –O–P(O)2–NRH–, –NRH–P(O)2–O–, –NRH–CO–O–, –NRH–CO–NRH–, –O–COO–, –O–CO–NRH–, –NRH–CO–CH2–, –O–CH2–CO–NRH–, –O–CH2–CH2–NRH–, –CO–NRH–CH2–, –CH2– NRH–CO–, –O–CH2–CH2–S–, –S–CH2–CH2–O–, –S–CH2–CH2–S–, –CH2–SO2–CH2–, –CH2–CO–NRH–, –OCH2–CH2–NRH–CO–, –CH2– NCH3–O–CH2–, donde RH es hidrógeno o alquilo C1–4.
En una realización preferida de la invención, el grupo de enlace internucleosídico es un grupo fosfato (-O-P(O)2-O-), un grupo fosforotioato (-O-P(O,S)-O-) o el compuesto puede contener tanto grupos fosfato como gruposfosforotioato.
Los ejemplos específicos de grupos terminales incluyen grupos terminales que se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, Prot-O-, Act-O-, mercapto, Prot-S-, Act-S-, alquiltio C1-6,amino, Prot-N(RH)-, Act-N(RH)-, mono-o di(alquil C1-6)amino, alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alqueniloxi C2-6 opcionalmente sustituido, alquiniloC2-6 opcionalmente sustituido, alquiniloxi C2-6 opcionalmente sustituido, monofosfato que incluye monofosfato protegido, monotiofosfato que incluye monotiofosfato protegido, difosfato que incluye difosfato protegido, ditiofosfato que incluye ditiofosfato protegido, trifosfato que incluye trifosfato protegido, tritiofosfato que incluye tritiofosfato protegido, donde Prot es un grupo protector para -OH, -SH y -NH(RH) y Act es un grupo de activación para -OH, -SH y -NH(RH)y RH es hidrógeno o alquilo C1-6.
Los ejemplos de grupos protectores de fosfato incluyen S-acetiltioetilo (SATE) y S-pivaloiltioetilo (t-butil-SATE).
Otros ejemplos mas de grupos terminales incluyen intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos testigo, ligandos, carboxi, sulfono, hidroximetilo, Prot-O-CH2-,Act-O-CH2-, aminometilo, Prot-N(RH)-CH2-, Act-N(RH)-CH2-, carboximetilo, sulfonometilo, donde Prot es un grupo protector para -OH, -SH y -NH(RH) y Act es un grupo de activación para -OH, -SH y -NH(RH)y RH es hidrógeno o alquilo C1-6.
Los ejemplos de grupos protectores para los grupos -OH y -SH incluyen tritilo sustituido, tales como 4,4’dimetoxitritiloxi (DMT), 4-monometoxitritiloxi (MMT); tritiloxi, 9-(9-fenil)xanteniloxi(pixilo) opcionalmente sustituido, metoxitetrahidropiraniloxi (mthp) opcionalmente sustituido; sililoxi, tal como trimetilsililoxi (TMS), triisopropilsililoxi (TIPS), terc-butildimetilsililoxi (TBDMS), trietilsililoxi, fenildimetilsililoxi; terc-butiléteres; acetales (que incluyen dos grupos hidroxi); aciloxi, como por ejemplo acetilo o acetilos sustituidos con halógeno, por ejemplo cloroacetiloxi o fluoroacetiloxi, isobutiriloxi, pivaloiloxi, benzoiloxi y benzoílos sustituidos, metoximetiloxi (MOM), éteres de bencilo oéteres de bencilo sustituidos tales como 2,6-diclorobenciloxi (2,6-Cl2Bzl). Además, cuando Z o Z* es hidroxilo, pueden protegerse mediante la unión a un soporte sólido, opcionalmente a través de un enlazador.
Los ejemplos de grupos protectores de amina incluyen fluorenilmetoxicarbonilamino (Fmoc), terc-butiloxicarbonilamino (BOC), trifluoroacetilamino, aliloxicarbonilamino (alloc, AOC), Z-benciloxicarbonilamino (Cbz),benciloxicarbonilamino sustituido, tal como 2-clorobenciloxicarbonilamino (2-CIZ), monometoxitritilamino (MMT), dimetoxitritilamino (DMT), ftaloilamino y 9-(9-fenil)xantenilamino (pixilo).
El grupo de activación preferentemente actúa de mediador en el acoplamiento a otros restos y/o monómeros denucleótidos y después de que se haya completado el acoplamiento, el grupo de activación habitualmente seconvierte en un enlace internucleosídico. Los ejemplos de dichos grupos de activación incluyen O-fosforamidita opcionalmente sustituida, O-fosfotriéster opcionalmente sustituido, O-fosfodiéster opcionalmente sustituido, Hfosfonato opcionalmente sustituido y O-fosfonato opcionalmente sustituido. En el presente contexto, el término "fosforamidita" quiere decir un grupo de la fórmula -P(ORx)-N(Ry)2, en el que Rx designa un grupo alquilo opcionalmente sustituido, por ejemplo metilo, 2-cianoetilo, o bencilo y cada uno de Ry designa grupos alquilo opcionalmente sustituidos, por ejemplo etilo o isopropilo, o el grupo -N(Ry)2 forma un grupo morfolino (-N(CH2CH2)2O). Rx preferentemente designa 2-cianoetilo y los dos Ry son preferentemente idénticos y designan isopropilo. Por consiguiente, una fosforamidita particularmente preferente es N,N-diisopropil-O-(2cianoetil)fosforamidita.
Tal como se indica anteriormente, B es una nucleobase que puede ser de origen natural o no natural. Los ejemplos específicos de nucleobases incluyen adenina (A), citosina (C), 5-metilcitosina (MeC), isocitosina, pseudoisocitosina,guanina (G), timina (T), uracilo (U), 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 5-propini-6-fluoroluracilo, 5-metiltiazoluracilo, 6aminopurina, 2-aminopurina, inosina, 2,6-diaminopurina, 7-propin-7-desazaadenina, 7-propin-7-desazaguanina y 2cloro-6-aminopurina. Las nucleobases preferidas incluyen A, C, MeC, G, T y U, en particular A, C, MeC, G y U.
En una realización de la invención, la hebra codificante comprende al menos un monómero de LNA, como por ejemplo 1-10 monómeros de LNA, por ejemplo 1-5 monómeros de LNA. En otra realización de la invención, la hebra no codificante comprende al menos un monómero de LNA, tal como 1-10 monómeros de LNA, por ejemplo 1-5
monómeros de LNA. En una realización adicional de la invención, la hebra codificante comprende al menos un monómero de LNA y la hebra no codificante comprende al menos un monómero de LNA. Por ejemplo, la hebra codificante habitualmente comprende 1-10 monómeros de LNA, tal como 1-5 monómeros de LNA y la hebra no codificante habitualmente comprende 1-10 monómeros de LNA, tal como 1-5 monómeros de LNA.
Una ventaja particular sobre los compuestos de la invención es su estabilidad mejorada en fluidos biológicos, tales como suero. Así, una realización de la invención incluye la incorporación de monómeros de LNA a un oligonucleótidode ADN o ARN estándar para aumentar la estabilidad del compuesto de LNApi resultante en los fluidos biológicos por ejemplo aumentando la resistencia contra las nucleasas (endonucleasas y exonucleasas). Por consiguiente, loscompuestos de la invención, debido a la incorporación de monómeros de LNA, mostrarán una mayor semivida de circulación como resultado de su mayor temperatura de fusión y/o de su mayor resistencia a nucleasas. La magnitudde la estabilidad dependerá del número de monómeros de LNA que se use, de su posición en los oligonucleótidos y del tipo de monómero de LNA que se use. Comparando con ADN y fosforotioatos puede establecerse el siguiente orden de capacidad de estabilizar un oligonucleótido contra la degradación nucleolítica: ADN << fosforotioatos, LNAfosfodiéster < LNA-fosforotioatos.
Por lo tanto, los compuestos de acuerdo con la invención que se prefieren particularmente son los compuestos que, cuando se incuban en suero (por ejemplo suero humano, bovino o murino), tal como en suero bovino fetal al 10% en una solución salina fisiológica a 37 ºC durante 5 horas, se degradan menos que el compuesto de ARNds correspondiente. Preferentemente, se degrada menos del 25% de la cantidad inicial del compuesto de la invención después de 5 horas, más preferentemente se degrada menos de 50% de la cantidad inicial del compuesto de lainvención después de 5 horas, incluso más preferentemente se degrada menos de 75% de la cantidad inicial del compuesto de la invención después de 5 horas. En otra realización, se prefiere que se degrade menos de 25% de la cantidad inicial del compuesto de la invención después de 10 horas, e incluso es más preferente que se degrade menos de 50% de la cantidad inicial del compuesto de la invención después de 10 horas.
Considerando el hecho de que la síntesis de LNA es compatible con la síntesis de ARN/ADN estándar y que los monómeros de LNA se mezclan libremente con muchos análogos de ácidos nucleicos contemporáneos, laresistencia a las nucleasas de los compuestos de LNApi puede mejorarse además de acuerdo con la invención o bien incorporando otros análogos que presenten una mayor estabilidad contra las nucleasas o explotando los enlaces internucleosídicos resistentes a nucleasas por ejemplo los enlaces de fosforomonotioato, fosforoditioato ymetilfosfonato, etc.
Los monómeros de LNA pueden usarse libremente en el diseño de LNApi en ambas protuberancias en 3’ y el extremo 5' de la hebra codificante con activación total del efecto de LNApi y regulación por disminución de laproducción de proteínas (>90% de reducción). Los monómeros de LNA pueden distribuirse bastante libremente sobre la hebra codificante en el LNApi manteniendo una elevada capacidad de regulación por disminución (80% de reducción). El uso de una hebra no codificante con muchas sustituciones con monómero de LNA no pareceproporcionar un efecto de regulación por disminución, aunque no puede descartarse que un diseño especial de esa combinación pueda provocar un efecto de iARN. Las sustituciones con monómero de LNA de las protuberancias en3’ junto con el extremo 5' de la hebra codificante del LNApi dan la mayor reducción de los niveles de proteínas. Elextremo 5' de la hebra no codificante es el más sensible a la modificación con monómeros de LNA aunque otros muchos sitios de modificación se toleran mejor.
En una realización el compuesto de LNApi se diseña de forma que los monómeros de LNA se incorporen al compuesto de tal forma que refuercen los pares de bases del dúplex en el extremo 5' de la hebra codificante. Por lotanto, la helicasa puede dirigirse para desenrollar el otro extremo 5' (extremo 5' de la hebra no codificante). De este modo, puede controlarse la incorporación de la hebra no codificante/guía en el RISC. La helicasa comienza adesenrollar el dúplex de ARNpi en el extremo con la cohesión más débil. El extremo 3' liberado probablemente esobjeto de degradación mientras que la hebra que queda se incorpora al RISC. Los ARNpi eficaces muestran acumulación de la hebra no codificante/guía y un emparejamiento más débil en el extremo 5' de la hebra no codificante/guía. Posiblemente puedan evitarse efectos secundarios indeseados incorporando únicamente la hebra correcta (la hebra no codificante/guía) al RISC y no la hebra codificante no deseada (no complementaria al ARNdiana deseado).
El efecto de incorporar los monómeros de LNA al extremo 5' de la hebra no codificante puede observarse en la Fig.
11. El efecto de impedir el iARN de un resto de LNA en el extremo 5’ puede eliminarse parcialmente incorporando un emparejamiento incorrecto opuesto. En la Fig. 11 se ha demostrado esto para las dianas de Renilla y luciérnaga.
El efecto de impedir el iARN de un monómero de LNA incorporado en el extremo 5' de la hebra no codificante puede eliminarse casi totalmente eliminando el monómero de LNA una posición de base hacia el extremo 3' (Fig. 12). Eldesplazamiento del monómero de LNA más hacia el extremo 3' de la hebra no codificante no afecta a la expresión génica, pero cuando el monómero de LNA toma la posición 10 o 12, se observa un descenso significativo en elefecto de iARN. El complejo RISC escindirá el ARNm en una posición opuesta a la posición entre 10 y 11 de lahebra no codificante del ARNpi y aparentemente, la incorporación del monómero de LNA sintético a ese sitio impide la escisión por el complejo RISC. Cuando el monómero de LNA se desplaza más lejos en la hebra no codificante, este efecto de impedimento disminuye.
Como se describe anteriormente, la helicasa muestra sesgo de hebra y preferentemente incorpora el ARNpi del extremo con la menor cohesión del ARNpi. Por lo tanto, en principio, pueden incorporarse ambas hebras al dúplex de ARNpi. Esto entre otras propiedades del sistema de RISC+ARNpi dará lugar a efectos fuera del objetivo. Una forma de reducir esto es incorporar los monómeros de LNA de afinidad elevada. Para el sitio Ren1 la nucleobase 5’ de la hebra no codificante es U que constituye un resto con cohesividad "baja". El complejo RISC por lo tanto leerá de ese lado e incorporará la hebra no codificante (la hebra correcta). Para los sitios Ren2 y Ren3 la nucleobase en 5’ es C que constituyen sitios de cohesividad "alta". Para estos sitios, el extremo 5' de la hebra codificante está posicionada mediante una nucleobase A y una U que ambas constituyen sitos de cohesividad "baja". El RISC por lo
tanto puede mostrar sesgo de hebra en este caso y leer parcialmente de la hebra codificante (la hebra incorrecta). Alsustituir los restos 5’-adenosina y uridina por los restos de LNA A y U correspondientes, el sesgo de hebra se elimina y la hebra no codificante se incorpora al complejo RISC (Fig. 13). Por consiguiente, los restos de LNA pueden disminuir el sesgo de hebra y aumentar la potencia del dúplex. El LNApi de acuerdo con la presente invención preferentemente tiene una secuencia no codificante, que tiene como mínimo un 70%, más preferentemente 90-100% de identidad de secuencia con la molécula diana.
Tal como se indica anteriormente diversos diseños particulares aumentan la aplicabilidad de la potencia global del ARNpi natural:
(a)
una "caperuza en el extremo" diana en el ARNpi mejora la estabilidad contra las nucleasas (Figs. 2 y 15).
(b)
colocar un monómero de LNA hacia el extremo 5’ de la hebra codificante mejora la potencia del LNApi relativa a la del ARNpi natural ("cierre"). Esto se ilustra por el aumento en la potencia para las dianas de eficacia media (Figs. 13 y 15).
(c)
En la "posición del LNA" (Fig. 12) se muestra que situar un monómero de LNA en el sitio de escisión del complejoRISC, por ejemplo en la posición 10, calculada desde el extremo 5' en la hebra no codificante, disminuye la actividad del ARNpi ("bloqueo").
Estas observaciones básicas son importantes para mejorar la potencia global del ARNpi. En los diseños optimizados los extremos 3' deberían tener "caperuza" de monómeros de LNA asegurando así la resistencia a nucleasas (Figs. 12 y 15). El extremo 5' de la hebra codificante también debería modificarse con LNA para aumentar la unión a la hebra no codificante y así dirigir la helicasa para incorporarse el "lado correcto" del dúplex. Dicho "cierre" delextremo 5' de la hebra codificante y del extremo 3’ de las hebras codificante/no codificante del dúplex puede realizarse incorporando al menos un monómero de LNA a cualquier lado del dúplex. Dichos dúplex modificadostambién puede contener bases con enlaces de hidrógeno LNA-LNA. La observación de que la silenciación génica se reduce cuando el LNA se incorpora en la posición 10 o 12 de la hebra no codificante puede usarse en el supuesto contrario. Si el complejo RISC incorporara parte de la hebra codificante y por ello produjera efectos indeseados fuera del objetivo, la potencia de la incorporación indeseada podría reducirse incorporando LNA en la posición 10 y 12 de la hebra codificante ("bloqueando") como se muestra en la Fig. 12.
Por consiguiente, en una realización interesante de la invención, la hebra codificante comprende al menos un monómero de LNA localizado en al menos una (tal como en una) de las posiciones 9-13, contadas a partir del extremo 5'. Preferentemente, la hebra codificante comprende al menos un monómero de LNA localizado en al menos una (tal como en una) de las posiciones 10-12, contadas a partir del extremo 5'. En una realización de la invención particularmente interesante la hebra codificante comprende un monómero de LNA en la posición 10, en la posición 12 o en ambas posiciones 10 y 12, contadas a partir del extremo 5'. Además, es particularmente preferente que el monómero de LNA, si se incorpora en la posición 10, contenga una base nitrogenada que sea diferente de las bases de ARN naturales, es decir diferentes de A, C, G y U. En una realización particularmente preferida, el monómero de LNA localizado en la posición 10 (contada a partir del extremo 5') contiene la base nitrogenada T.
Es sabido que los monómeros de LNA incorporados en los oligos inducen una estructura de tipo ARN en el oligo yen el híbrido que pudiera formar. También se ha demostrado que los restos de LNA modifican la estructura de los restos de ADN, en particular cuando los restos de LNA se incorporan cerca del extremo 3'. La incorporación demonómeros de LNA cerca del extremo 5' parece tener un efecto menor. Esto quiere decir que es posible modificar las hebras de ARN que contienen monómeros de ADN y si uno o más restos de LNA flanquean los monómeros de ADN ellos también tendrán una estructura de tipo ARN. Por lo tanto, el ADN y el monómero de LNA pueden sustituir a los monómeros de ARN y aún así, el oligo logrará una estructura global de tipo ARN. Dado que los monómeros de ADN son considerablemente más baratos que los monómeros de ARN, más fáciles de sintetizar y más estables contra la degradación nucleófila, dichas modificaciones por lo tanto mejorarán el uso y aplicabilidad globales de los ARNpi (véase, por ejemplo, la Fig. 15).
Por consiguiente, se prefiere que al menos un (tal como un) monómero de LNA esté localizado en el extremo 5' de la hebra codificante. Más preferentemente, al menos dos (tales como dos) monómeros de LNA están localizados en el extremo 5' de la hebra codificante.
En otra realización preferente de la invención, la hebra codificante comprende al menos un (tal como un) monómerode LNA localizado en el extremo ’3 de la hebra codificante. Más preferentemente, al menos dos (tal como dos) monómeros de LNA están localizados en el extremo 3' de la hebra codificante.
En una realización particular de la invención, la hebra codificante comprende al menos un (tal como un) monómero de LNA localizado en el extremo ’5 de la hebra codificante y al menos un (tal como un) monómero de LNA localizado en el extremo 3' de la hebra codificante.. Incluso más preferentemente, la hebra codificante comprende al menos dos(tal como dos) monómeros de LNA localizados en el extremo 5' de la hebra codificante y al menos dos (tal como dos) monómeros de LNA localizados en el extremo 3’ de la hebra codificante.
Se prefiere que al menos un (tal como un) monómero de LNA esté localizado en el extremo 3' de la hebra nocodificante. Más preferentemente, al menos dos (tal como dos) monómeros de LNA están localizados en el extremo 3' de la hebra no codificante. Incluso más preferentemente, al menos tres (tal como tres) monómeros de LNA están localizados en el extremo 3' de la hebra no codificante. En una realización preferente particular de la invención, ningún monómero de LNA está localizado en o cerca (es decir a 1, 2 o 3 nucleótidos) del extremo 5' de la hebra no codificante.
Así, en la invención, el monómero de LNA puede estar localizado en cualquier posición de las hebras codificante yno codificante, salvo en el extremo ’5 de la hebra no codificante.
En una realización muy preferida de la invención, la hebra codificante comprende al menos un monómero de LNA enel extremo 5' y al menos un monómero de LNA en el extremo 3' y la hebra no codificante comprende al menos un monómero de LNA en el extremo 3'. Más preferentemente, la hebra codificante comprende al menos un monómero de LNA en el extremo 5' y al menos un monómero de LNA en el extremo 3' y la hebra no codificante comprende al menos dos monómeros de LNA en el extremo 3'. Incluso más preferentemente, la hebra codificante comprende al menos dos monómeros de LNA en el extremo 5' y al menos dos monómeros de LNA en el extremo 3' y la hebra no codificante comprende al menos dos monómeros de LNA en el extremo 3'. Todavía más preferentemente, la hebra codificante comprende al menos dos monómeros de LNA en el extremo 5' y al menos dos monómeros de LNA en el extremo 3' y la hebra no codificante comprende al menos tres monómeros de LNA en el extremo 3'. Se entenderá que en la realización más preferente, ninguno de los compuestos mencionados anteriormente contiene un monómero de LNA que esté localizado en el extremo 5' de la hebra no codificante.
En una realización interesante adicional de la invención, el monómero de LNA está localizado cerca del extremo 3', es decir en la posición 2, 3 o 4, preferentemente en la posición 2 o 3, en particular en la posición 2, calculada desde el extremo 3'.
Por consiguiente, en una realización muy interesante adicional de la invención, la hebra codificante comprende un monómero de LNA localizado en la posición 2, calculada desde el extremo 3'. En otra realización, la hebra codificante comprende monómeros de LNA localizados en la posición 2 y 3, calculada desde el extremo 3'.
En una realización preferente particular de la invención, la hebra codificante comprende al menos un (tal como un) monómero de LNA localizado en el extremo 5' y un monómero de LNA localizado en la posición 2 (calculada desde el extremo 3'). En una realización adicional, la hebra codificante comprende al menos dos (tal como dos) monómeros de LNA localizados en el extremo 5' de la hebra codificante, un monómero de LNA localizado en la posición 2(calculada desde el extremo 3').
Además, se prefiere que la hebra no codificante comprenda un monómero de LNA en la posición 2, calculada desde el extremo 3'. Más preferentemente, la hebra no codificante comprende monómeros de LNA en la posición 2 y 3, calculadas desde el extremo 3'. Incluso más preferentemente, la hebra no codificante comprende monómeros de LNA localizados en la posición 2, 3 y 4, calculadas desde el extremo 3'. En una realización preferente particular de lainvención, ningún monómero de LNA está localizado en o cerca (es decir a 1, 2 o 3 nucleótidos) del extremo 5' de la hebra no codificante.
En una realización muy preferida de la invención, la hebra codificante comprende al menos un monómero de LNA enel extremo 5' y un monómero de LNA en la posición 2 (calculada desde el extremo 3') y la hebra no codificante comprende un monómero de LNA localizado en la posición 2 (calculada desde el extremo 3'). Más preferentemente, la hebra codificante comprende al menos un monómero de LNA en el extremo 5' y un monómero de LNA en laposición 2 (calculada desde el extremo 3') y la hebra no codificante comprende monómeros de LNA en la posición 2 y 3 (calculadas desde el extremo 3'). Incluso más preferentemente, la hebra codificante comprende al menos dos monómeros de LNA en el extremo 5' y monómeros de LNA en la posición 2 y 3 (calculadas desde el extremo 3') y la hebra no codificante comprende monómeros de LNA en la posición 2 y 3 (calculadas desde el extremo 3'). Todavíamás preferentemente, la hebra codificante comprende al menos dos monómeros de LNA en el extremo 5' ymonómeros de LNA en la posición 2 y 3 (calculadas desde el extremo 3') y la hebra no codificante comprende monómeros de LNA en la posición 2, 3 y 4 (calculadas desde el extremo 3'). Se entenderá que ninguno de los compuestos mencionados anteriormente contiene un monómero de LNA que esté localizado en el extremo 5' de lahebra no codificante.
Tal como se indica anteriormente, cada hebra comprende 17-25 nucleótidos. Se entenderá que estos números serefieren al número total de nucleótidos naturales, variantes y análogos de nucleótidos, monómeros de LNA, etc., de la hebra. Así, el número total de dichos nucleótidos naturales, variantes y análogos de nucleótidos, monómeros deLNA, etc., no será inferior a 17 y no superará los 25. En la invención, cada hebra comprende 17-25 nucleótidos, tal como 20-22 o 20-21 nucleótidos.
Los compuestos de acuerdo con la invención pueden presentar extremos romos y en una realización particular el compuesto de LNApi de la invención es un 19-mero con extremos romos. Más preferentemente, sin embargo, al menos una de las hebras tiene una protuberancia en 3’. Habitualmente, la protuberancia en 3’ tendrá 1-7 nucleótidos (o variantes o análogos de nucleótidos o monómeros de LNA), preferentemente de 1-3 nucleótidos. Así, se entenderá que la hebra codificante puede contener una protuberancia en 3’, la hebra no codificante puede contener una protuberancia en 3’, o tanto la hebra codificante como la no codificante pueden contener protuberancias en 3’.
De forma similar, al menos una de las hebras puede tener una protuberancia en 5’. Habitualmente, la protuberancia en 5’ tendrá 1-4 nucleótidos (o variantes o análogos de nucleótidos o monómeros de LNA), preferentemente de 1-3nucleótidos. Así, se entenderá que la hebra codificante puede contener una protuberancia en 5’, la hebra no codificante puede contener una protuberancia en 5’, o tanto la hebra codificante como la no codificante pueden contener protuberancias en 5’. Evidentemente, la hebra codificante puede contener una protuberancia en 3' y en 5'. De forma alternativa, la hebra no codificante puede contener una protuberancia en 3' y en 5'.
Habitualmente, los compuestos de la invención contendrán otros restos además de monómeros de LNA. Dichos otros restos pueden ser cualesquiera de los restos que se describen con respecto a la definición de "nucleótido" anteriormente, e incluyen, por ejemplo, monómeros de ARN naturales, monómeros de ADN naturales así como variantes y análogos de nucleótidos como por ejemplo los que se mencionan con respecto a la definición de"nucleótido" anteriormente. Los ejemplos específicos de dichas variantes y análogos de nucleótidos incluyen, 2’-F,2’-O-Me, 2’-O-metoxietilo (MOE), 2’-O-(3-aminopropilo) (AP), ácido hexitol nucleico (HNA), ácido 2’-F-arabino nucleico (2’-F-ANA) y D-ciclohexenil nucleósido (CeNA). Además, el enlace internucleosídico puede ser un enlace internucleosídico fosforodiéster, fosforotioato o N3’-P5’ fosforoamidato como se describen anteriormente.
En general, las hebras individuales de los compuestos de la invención contendrán monómeros de LNA al menos aproximadamente al 5%, al menos aproximadamente al 10%, al menos aproximadamente al 15% o al menos aproximadamente al 20%, con respecto al número total de nucleótidos de la hebra. En ciertas realizaciones, los compuestos de la invención contendrán monómeros de LNA al menos aproximadamente al 25%, al menos aproximadamente al 30%, al menos aproximadamente al 40%, al menos aproximadamente al 50%, al menos aproximadamente al 60%, al menos aproximadamente al 70%, al menos aproximadamente al 80% o al menos aproximadamente al 90%, con respecto al número total de nucleótidos de la hebra.
Por lo que respecta a los monómeros de LNA, se entenderá que cualquiera de los monómeros de LNA que semuestran en el Esquema 2 y 3 son útiles para los fines de la presente invención. Sin embargo, actualmente se prefiere que el monómero de LNA esté en la forma beta-D, correspondiente a los monómeros de LNA que se muestran como compuestos 3A, 3C y 3D. El monómero de LNA actualmente más preferido es el monómero que se muestra como compuesto 3A en el Esquema 3 y 4 anteriormente, es decir el monómero de LNA actualmente más preferente es la forma beta-D de oxi-LNA.
En una realización adicional de la invención, el compuesto de la invención está ligado a uno o más ligandos formando un conjugado. El/los ligando(s) desempeña(n) el papel de aumentar la captación celular del conjugado conrespecto al compuesto no conjugado. Esta conjugación puede darse en las posiciones 5’-OH y/o 3’-OH terminales, pero la conjugación también puede darse en las azúcares y/o las nucleobases. De forma particular, el factor decrecimiento con el que puede conjugarse el oligonucleótido no codificante, puede comprender transferrina o folato. Pueden prepararse complejos de transferrina-polilisina-oligonucleótido o complejos de folato-polilisinaoligonucleótido para la captación por las células que expresan niveles elevados de receptor de transferrina o folato.Otros ejemplos de conjugados/ligandos son restos de colesterol, intercaladores bicatenarios como por ejemplo acridina, poli-L-lisina, "caperuza terminal" con uno o más grupos de enlaces resistentes a nucleasas como por ejemplo fosforomonotioato y similares.
La preparación de complejos de transferrina como vehículos de la captación de los oligonucleótidos en las células sedescribe por Wagner y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). La administración celular de conjugados de folato y macromoléculas mediante endocitosis de los receptores de folato, que incluye laadministración de un oligonucleótido no codificante, se describe por Low y cols., documento US 5.108.921 y por Leamon y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5572 (1991).
Los compuestos o conjugados de la invención también pueden conjugarse o conjugarse además con sustancias farmacológicas activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, una sulfamida, un antidiabético, un agente antibacteriano, un agente quimioterapéutico o un antibiótico.
Las nucleobases de ARN naturales son A, C, G y U. El uso de estas en los monómeros de LNA constituirá una modificación mínima. Sin embargo, las bases MeC (5’ metil citosina) y T (timina) se usan convenientemente como monómeros de LNA y también pueden usarse en forma de dúplex de ARN como se muestra en el presente documento (véase la Fig. 16). Se prevé que la naturaleza de las bases que se usan en los extremos del LNApi no afectará significativamente a la función de la molécula de ARNpi en tanto en cuanto mantengan su capacidad de hibridarse con bases complementarias si ocupan una posición con bases pareadas en la molécula. Sin embargo, cuando las modificaciones en el LNA se sitúan en posiciones internas del dúplex, por ejemplo en la posición 10 (calculada desde el extremo 5’), debe preverse que la naturaleza de la nucleobase es importante. Así, las bases naturales, C y U, perturbarán el dúplex en menor grado que las modificaciones de las bases T y MeC. Esto proporciona sutiles posibilidades de diseño. Por ejemplo si se quiere "bloquear" la hebra codificante en el sitio de escisión por ejemplo en la posición 10ª, debería usarse T o MeC (si fueran complementarias), pero si se quiere modificar la hebra no codificante en el sitio de escisión por ejemplo en la posición 10 debería usarse U o C (si fuerancomplementarias). Una realización de la invención por lo tanto debe incluir una nucleobase modificada. Podría conseguirse impedir la nucleobase usando grupos más voluminosos que el metilo, por ejemplo etilo, propilo, fenilo o grupos testigo como biotina. Así, el reconocimiento diferenciado de las nucleobases por el complejo RISC, u otras enzimas proporciona un nivel adicional de oportunidades de diseño para los ARNpi modificados con LNA. Por consiguiente, en una realización interesante de la invención, la posición 10 (calculada desde el extremo 5') comprende T o MeC.
Para permitir una rápida respuesta a los cambios ambientales y a otros, los sistemas biológicos habitualmente seconstruyen como sistemas dinámicos, es decir como sistemas en los que el estado de equilibrio se mantiene mediante la acción de activadores y desactivadores. Con respecto al complejo RISC por lo tanto puede preverse que el complejo activado (es decir el complejo proteínico que contiene el oligonucleótido intacto que cataliza la destrucción de la diana) se somete a una actividad de desactivación, como por ejemplo una actividad de nucleasa que elimina todo o parte del oligonucleótido inactivando así la función del complejo RISC activado. De forma alternativa, la desactivación del complejo RISC simplemente puede determinarse por la velocidad de disociación del oligonucleótido del complejo RISC que, después de la disociación, puede no ser capaz de volver a asociarse.
Por consiguiente, en un aspecto interesante la presente invención se refiere al uso de los compuestos que sedescriben en el presente documento para potenciar la vida útil del complejo RISC activo potenciando así la duraciónde su acción. En una realización de la invención esto se logra aumentando la resistencia del componente de ARNdel complejo RISC a la degradación mediante la(s) actividad(es) teórica(s) de ARNsa incorporando el LNA y/u otros análogos de ácidos nucleicos y/o mediante modificaciones químicas. En otra realización de la invención, la deseadamejora de la vida del complejo RISC activo se logra disminuyendo la velocidad de disociación del oligonucleótido de ARN del complejo RISC introduciendo LNA y/u otros análogos de ácidos nucleicos y/o mediante modificaciones químicas que aumentan la afinidad del oligonucleótido por las parejas a las que se une en el complejo RISC.
Cuando se diseñan en forma de inhibidor, los LNApi de la invención se unen al ácido nucleico diana y modulan la expresión de su proteína cognada. Preferentemente, dicha modulación produce una inhibición en la expresión de almenos el 10% o al menos el 20% en comparación con el nivel de expresión normal, más preferentemente al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, o al menos el 90% de inhibición en comparación con el nivel de expresión normal.
Fabricación
Los compuestos de la invención pueden producirse usando las técnicas de polimerización de la química de los
5 ácidos nucleicos, que se conocen bien por una persona de habilidad ordinaria en la técnica de la química orgánica. Generalmente, pueden usarse ciclos de oligomerización de la estrategia de fosforamidita (S. L. Beaucage y R. P.Iyer, Tetrahedron, 1993,49, 6123; y S. L. Beaucage y R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48,2223), pero también pueden usarse otras reacciones químicas, como por ejemplo la química de H-fosfonato o la química de fosfotriéster.
Para algunos monómeros puede ser necesario un tiempo de acoplamiento mayor y/o acoplamientos repetidos con
10 reactivos recién preparados y/o reactivos de acoplamiento más concentrados. Sin embargo, en las manos de los autores de la presente invención, las fosforamiditas empleadas se acoplaron con un rendimiento de acoplamiento por etapas satisfactorio >97%. La tiolación del fosfato puede realizarse intercambiando la oxidación normal, es decir la oxidación de yodo/piridina/H2O por un procedimiento de oxidación usando el reactivo de Beaucage (disponible comercialmente). Como será evidente para el experto en la técnica, pueden emplearse otros reactivos de
15 sulfurización.
La purificación de las hebras individuales puede realizarse usando cartuchos de purificación de fase inversa desechables y/o HPLC de fase inversa y/o precipitación con etanol o butanol. Puede usarse electroforesis en gel, HPLC de fase inversa, EM por MALDI y EM por IES para verificar la pureza de los oligonucleótidos que contienen LNA sintetizados. Además, los materiales de soporte sólido que tienen inmovilizados sobre ellos un LNA con 20 nucleobases protegidas y con 5'-OH protegido son especialmente interesantes para la síntesis de oligonucleótidos que contienen LNA donde un monómero de LNA está incluido en el extremo 3'. Para este fin, el material de soporte sólido es preferentemente CPG o poliestireno sobre el que se enlaza un monómero de LNA opcionalmente con una nucleobase protegida y opcionalmente con 5’-OH protegido funcionalizado en 3’. El monómero de LNA puede unirse al soporte sólido usando las condiciones descritas por el suministrador para ese material de soporte sólido particular.
25 Un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento novedoso para la síntesis de los compuestos de la invención, que se caracteriza porque los monómeros individuales, por ejemplo los monómeros de LNA y los monómeros de ARN, se acoplan usando 1H-tetrazol o 5-etiltio-1H-tetrazol. Una realización adicional de este aspecto es que el procedimiento conlleva un tiempo de acoplamiento que está en el intervalo de 200-1200 segundos, como por ejemplo en el intervalo de 400-1200 segundos, preferentemente en el intervalo de 600-900 segundos.
30 Las dianas a modificar de acuerdo con la presente invención pueden ser dianas implicadas en un número de mecanismos biológicos básicos que incluyen proliferación de glóbulos rojos, proliferación celular, metabolismo iónico, metabolismo de glucosa y energía, regulación del pH y metabolismo de matriz. La invención que se describeen el presente documento engloba un procedimiento de prevención o de tratamiento de cáncer que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de ARNpi que modula una diana a un ser humano que necesite
35 dicha terapia.
Tratamiento y composiciones farmacéuticas
Como se ha explicado inicialmente, los compuestos de la invención constituirán fármacos adecuados con propiedades mejoradas. El diseño de un fármaco iARN potente y seguro requiere el ajuste de precisión de diversos parámetros como por ejemplo la afinidad/especificidad, estabilidad en fluidos biológicos, captación celular, modo de
40 acción, propiedades farmacocinéticas y toxicidad.
Por consiguiente, en un aspecto adicional la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la invención y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un compuesto de acuerdo con la invención para usar 45 como medicamento.
Como se comprenderá, la dosis depende de la gravedad y de la respuesta del estado de enfermedad a tratar y el ciclo de tratamiento dura de varios días a varios meses, o hasta que se consigue la curación o una disminución delestado de enfermedad. Las pautas de administración óptimas pueden calcularse midiendo la acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los 50 LNApi individuales. Generalmente pueden estimarse basándose en las CE50 que se encuentre que son eficaces in vitro y en los modelos animales in vivo. En general, la dosis es de 0,01 μg a 1 g por kg de peso corporal y puede administrarse una o más veces diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 10 años o mediante infusión continua durante de horas hasta varios meses. Las tasas de repetición para la administración pueden estimarse basándose en los tiempos de permanencia y en concentraciones del fármaco
55 medidas en fluidos o tejidos corporales. Tras el tratamiento con éxito, puede ser deseable hacer que el paciente se someta a una terapia de mantenimiento para evitar la reaparición del estado de enfermedad.
Composición farmacéutica
Debería entenderse que la invención también se refiere a una composición farmacéutica, que comprende al menos un compuesto de la invención como principio activo. Debería entenderse que la composición farmacéutica de
60 acuerdo con la invención opcionalmente comprende un vehículo farmacéutico y que la composición farmacéutica opcionalmente comprende otros compuestos, como por ejemplo compuestos quimioterapéuticos, compuestos antiinflamatorios, compuestos antivirales y/o compuestos inmunomoduladores.
El compuesto oligomérico comprendido en esta invención puede emplearse en una diversidad de sales
farmacéuticamente aceptables. Tal como se usa en el presente documento, el término se refiere a sales que mantienen la actividad biológica deseada de los compuestos identificados en el presente documento y exhiben efectos toxicológicos indeseados mínimos. Ejemplos no limitantes de dichas sales pueden formarse con sales deadición de aminoácidos orgánicos y sales de adición de bases formadas con cationes metálicos como por ejemplo cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio y similares, o con un catión formado por amoniaco, N,N-dibenciletilen-diamina, D-glucosamina, tetraetilamonio, o etilendiamina.
En una realización de la invención el compuesto oligomérico puede estar en forma de un profármaco. Los oligonucleótidos son por su propia naturaleza iones con carga negativa. Debido a la naturaleza lipófila de las membranas celulares la captación celular de oligonucleótidos es reducida comparada con los equivalentes neutros o lipófilos. Este "impedimento" de la polaridad puede evitarse usando la estrategia de los profármacos (véase por ejemplo Crooke, R. M. (1998) en Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlín, Alemania, vol. 131, páginas 103-140). En este enfoque, los oligonucleótidos se preparan de forma protegida deforma que el oligo sea neutro cuando se administra. Estos grupos de protección se diseñan de tal forma que puedaneliminarse cuando el oligo es captado por las células. Los ejemplos de dichos grupos de protección son Sacetiltioetilo (SATE) o S-pivaloiltioetilo (t-butil-SATE). Estos grupos de protección son resistentes a nucleasas y se eliminan de forma selectiva intracelularmente.
Los agentes de enlace y adyuvantes farmacéuticamente aceptables pueden formar parte del fármaco formulado. Lascápsulas, comprimidos y píldoras, etc. pueden contener por ejemplo los siguientes compuestos: celulosa microcristalina, goma o gelatina como aglutinantes; almidón o lactosa como excipientes; estearatos como lubricantes; diversos agentes edulcorantes o aromatizantes. Para las cápsulas la monodosis puede contener un vehículo líquido como aceites grasos. Del mismo modo los recubrimientos de azúcar o agentes entéricos pueden serparte de la monodosis. Las formulaciones de oligonucleótidos también pueden ser emulsiones de los principios farmacéuticos activos y un lípido que forme una emulsión de micelas. Un compuesto de la invención puede mezclarse con cualquier material que no impida la acción deseada, o con material que suplemente la acción deseada. Estos podrían incluir otros fármacos que incluyen otros compuestos nucleotídicos. Para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica o tópica, la formulación puede incluir un diluyente estéril, tampones reguladores de la tonicidad y antibacterianos. El compuesto activo puede prepararse con vehículos que protejan contra ladegradación o la eliminación inmediata del cuerpo, que incluyen implantes o microcápsulas con propiedades de liberación controladas. Para la administración intravenosa los vehículos preferidos son solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato.
Preferiblemente, un compuesto oligomérico está incluido en una formulación unitaria como por ejemplo en unvehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz sin provocar efectos secundarios graves al paciente tratado.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de numerosas formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser (a) oral
(b) pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, (c) tópica que incluye epidérmica, transdérmica, oftálmica y a las membranas mucosas que incluyen administración vaginal y rectal; o (d) parenteral que incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intraventricular. En una realización la composición farmacéutica se administra por vía IV, IP, oral, tópica o en forma de inyección en embolada o se administra directamente al órgano diana. Las composiciones farmacéuticas y formulaciones para laadministración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas,pulverizadores, supositorios, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables los vehículos farmacéuticos convencionales, las bases acuosas, en polvo u oleosas, los espesantes y similares. También pueden ser útiles condones y guantes recubiertos y similares. Las formulaciones tópicas preferidas incluyen aquellas en las que los compuestos de la invención están mezclados con un agente de administración tópica tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Las composiciones yformulaciones para la administración oral incluyen, pero sin restricción, polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o en medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobrecitos,comprimidos o minicomprimidos. Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitación, potenciadores de la penetración, compuestos vehículo yotros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, soluciones, emulsiones yformulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero sin limitación, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. La administración de un fármaco al tejido tumoral puede potenciarse mediante la administración mediada por vehículos que incluyen, pero sin limitación, liposomas catiónicos, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadena ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas y microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54 (1):3-27). Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que pueden presentarse convenientemente en forma monodosis, pueden prepararse de acuerdo con técnicas convencionales notorias en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con el/los vehículo(s) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima losprincipios activos con los vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente fraccionados o ambos; y después, si fuera necesario, dando forma al producto. Las composiciones de la presente invención pueden formularse en cualquiera de muchas formas farmacéuticas posibles tales como, pero sin limitación, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos y supositorios. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse en forma de suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes. Los compuestos de la invención también pueden conjugarse con sustancias farmacológicas activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, una sulfamida, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.
En otra realización, las composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos de LNApi, dirigidos contra un primer ácido nucleico y uno o más compuestos de LNApi adicionales dirigidos contra un segundo ácido nucleico diana. Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o de forma secuencial.
5 Los compuestos que se describen en el presente documento son útiles para un número de aplicaciones terapéuticas como se indica anteriormente. En general, los procedimientos terapéuticos de la invención incluyen la administraciónde una cantidad terapéuticamente eficaz de un LNApi a un mamífero, particularmente un ser humano. En una cierta realización, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos de la invención y (b) otro u otros agentes quimioterapéuticos. Cuando se usan con los compuestos de la
10 invención, dichos agentes quimioterapéuticos pueden usarse de forma individual, secuencial, o en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos tales distintos o en combinación con radioterapia. Todos los agentes quimioterapéuticos conocidos por una persona experta en la técnica se incorporan aquí como tratamientos combinados con compuestos de acuerdo con la invención. Otros agentes activos, tales como fármacos antiinflamatorios, que incluyen pero sin limitación fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides,
15 fármacos antivirales y fármacos inmunomoduladores también pueden combinarse en composiciones de la invención.Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o de forma secuencial.
Cáncer
En otro aspecto más la presente invención se refiere al uso de un compuesto de acuerdo con la invención para lafabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer. En otro aspecto la presente invención se refiere a un
20 procedimiento para el tratamiento, o la profilaxis del cáncer, comprendiendo dicho procedimiento administrar un compuesto de la invención o una composición farmacéutica de la invención a un paciente que lo necesite.
Dichos cánceres pueden incluir neoplasia linforreticular, leucemia linfoblástica, tumores cerebrales, tumores gástricos, plasmacitomas, mieloma múltiple, leucemia, tumores del tejido conectivo, linfomas y tumores sólidos.
En el uso de un compuesto de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer,
25 dicho cáncer de forma adecuada puede estar en forma de un tumor sólido. De forma análoga, en el procedimiento para tratar cáncer dado a conocer en el presente documento dicho cáncer puede de forma adecuada estar en forma de un tumor sólido.
Además, dicho cáncer también es de forma adecuada un carcinoma. El carcinoma habitualmente se selecciona del grupo que consiste en melanoma maligno, carcinoma de células basales, carcinoma de ovarios, carcinoma de30 mama, cáncer de pulmón amicrocítico, carcinoma de células renales, carcinoma de vejiga, carcinoma de vejiga superficial recurrente, carcinoma de estómago, carcinoma de próstata, carcinoma pancreático, carcinoma de pulmón, carcinoma de cuello de útero, displasia de cuello de útero, papilomatosis laringea, carcinoma de colon,carcinoma colorrectal y tumores carcinoides. Más habitualmente, dicho carcinoma se selecciona del grupo queconsiste en melanoma maligno, cáncer de pulmón amicrocítico, carcinoma de mama, carcinoma de colon y
35 carcinoma de células renales. El melanoma maligno habitualmente se selecciona del grupo que consiste en melanoma de extensión superficial, melanoma nodular, melanoma lentiginoso maligno, melagnoma acral, melanoma amelanótico y melanoma desmoplástico.
De forma alternativa, el cáncer de forma adecuada puede ser un sarcoma. El sarcoma habitualmente está en laforma seleccionada del grupo que consiste en osteosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma, histiocitoma
40 fibroso maligno, fibrosarcoma y sarcoma de Kaposi.
De forma alternativa, el cáncer de forma adecuada puede ser un glioma.
Una realización adicional se refiere al uso de un compuesto de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, en el que dicho medicamento además comprende un agente quimioterapéutico que se selecciona del grupo que consiste en adrenocorticosteroides, como por ejemplo 45 prednisona, dexametasona o decadron; altretamina (hexalen, hexametilmelamina (HMM)); amifostina (etiol); aminoglutetimida (cytadren); amsacrina (M-AMSA); anastrozol (arimidax); andrógenos, tales como testosterona; asparraginasa (eispar); calmete-gurina de bacilo; bicalutamida (casodex); bleomicina (blenoxano); busulfán (mileran); carboplatina (paraplatina); carmustina (BCNU, BICNU); clorambucilo (leukeran); clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina); cisplatina (platinol); citosina arabinosida (citarabina); dacarbazina (DTIC); dactinomicina50 (actinomicina-D, cosmegen); daunorrubicina (cerubidina); docetaxel (taxotere); doxorrubicina (adriomicina);epirrubicina; estramustina (emcyt); estrógenos, como por ejemplo dietilstilbestrol (DES); etopósido (VP-16, VePesid, etopofós); fludarabina (fludara); flutamida (eulexin); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracilo (5-FU); gemcitabina (gemzar); goserelina (zodalex); herceptina (trastuzumab); hidroxiurea (hidrea); idarrubicina (idamicina); ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleucina); interferón alfa (intrón A, roferón A); irinotecán (camptosar); leuprolida (lupron); 55 levamisol (ergamisol); lomustina (CCNU); mecloratamina (mustargen, mostaza nitrogenada); melfalán (alkeran); mercaptopurina (purinetol, 6-MP); metotrexato (mexato); mitomicina-C (mutamucina); mitoxantrona (novantrona); octreótida (sandostatina); pentostatina (2-desoxicoformicina, nipent); plicamicina (mitramicina, mitracina);prorocarbazina (matulano); estreptozocina; tamoxifina (nolvadex); taxol (paclitaxel); tenipósido (vumon, VM-26); tiotepa; topotecán (hicamtina); tretinoína (vesanoid, ácido holo-trans retinoico); vinblastina (valban); vincristina
60 (Oncovina) y vinorelbina (navelbina). De forma adecuada, el agente quimioterapéutico adicional se selecciona a partir de taxanos como por ejemplo Taxol, Paclitaxel o Docetaxel.
De forma similar, la invención se refiere además al uso de un compuesto de acuerdo con la invención para lafabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, en el que dicho tratamiento comprende además laadministración de otro agente quimioterapéutico que se selecciona del grupo que consiste en 65 adrenocorticosteroides, tales como prednisona, dexametasona o decadron; altretamina (hexalen, hexametilmelamina (HMM)); amifostina (etiol); aminoglutetimida (cytadren); amsacrina (M-AMSA); anastrozol (arimidax); andrógenos, como por ejemplo testosterona; asparraginasa (elspar); calmete-gurina de bacilo; bicalutamida (casodex); bleomicina (blenoxano); busulfán (mileran); carboplatina (paraplatina); carmustina (BCNU, BICNU); clorambucilo (leukeran); clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina); cisplatina (platinol); citosina arabinosida (citarabina);5 dacarbazina (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D, cosmegen); daunorrubicina (cerubidina); docetaxel (taxotere); doxorrubicina (adriomicina); epirrubicina; estramustina (emcyt); estrógenos, como por ejemplo dietilstilbestrol (DES); etopósido (VP-16, VePesid, etopofós); fludarabina (fludara); flutamida (eulexin); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracilo (5-FU); gemcitabina (gemzar); goserelina (zodalex); herceptina (trastuzumab); hidroxiurea (hidrea); idarrubicina (idamicina); ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleucina); interferón alfa (intrón A, roferón A); irinotecán (camptosar); leuprolida (lupron); levamisol (ergamisol); lomustina (CCNU); mecloratamina (mustargen, mostaza nitrogenada); melfalán (alkeran); mercaptopurina (purinetol, 6-MP); metotrexato (mexato); mitomicina-C (mutamucina);mitoxantrona (novantrona); octreótida (sandostatina); pentostatina (2-desoxicoformicina, nipent); plicamicina (mitramicina, mitracina); prorocarbazina (matulano); estreptozocina; tamoxifina (nolvadex); taxol (paclitaxel);tenipósido (vumon, VM-26); tiotepa; topotecán (hicamtina); tretinoina (vesanoid, ácido holo-trans retinoico);
15 vinblastina (valban); vincristina (Oncovina) y vinorelbina (navelbina). De forma adecuada, dicho tratamientocomprende además la administración de un agente quimioterapéutico adicional que se selecciona de taxanos, como por ejemplo Taxol, Paclitaxel o Docetaxel.
Explicado de forma alternativa, el compuesto de la invención o la composición farmacéutica de la invención puedenusarse en un procedimiento para tratar cáncer, comprendiendo dicho procedimiento administrar un compuesto de la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención a un paciente que lo necesite y que ademáscomprende la administración de un agente quimioterapéutico adicional. Dicha administración adicional puede ser tal que el agente quimioterapéutico adicional esté conjugado con el compuesto de la invención, esté presente en lacomposición farmacéutica, o se administre en una formulación separada.
Enfermedades infecciosas
25 En una realización interesante particular de la invención, los compuestos de LNApi de acuerdo con la invención se usan para dirigirlos contra el síndrome respiratorio agudo grave (SARS), que apareció primero en China en noviembre de 2002. De acuerdo con la OMS, más de 8.000 personas han sido infectadas en todo el mundo, dando como resultado más de 900 muertes. Un coronavirus anteriormente desconocido se ha identificado como agente causal de la epidemia de SARS (Drosten C y cols. N Engl J Med 2003, 348, 1967-76; y Fouchier RA y cols. Nature 2003, 423, 240). La identificación del SARS-CoV vino seguida de una rápida secuenciación del genoma vírico demúltiples cepas aisladas (Ruan y cols. Lancet 2003, 361, 1779-85; Rota PA y cols. Science 2003, 300, 1394-9; yMarra MA y cols. Science 2003, 300, 399-404). Esta información de la secuencia inmediatamente posibilitó eldesarrollo de antivirales contra SARS mediante técnicas de inactivación basadas en ácidos nucleicos tales como ARNpi. La secuencia de nucleótidos que codifica la ARN polimerasa (Pol) dependiente de ARN del SARS-CoV está
35 muy conservada en toda la familia de coronavirus. El producto génico de Pol se traduce desde el ARN genómico como parte de una poliproteína y usa el ARN genómico como plantilla para sintetizar ARN de hebra no codificante y posteriormente ARNm subgenómico.
La proteína Pol por lo tanto se expresa temprano en el ciclo vital vírico y es crucial para la replicación vírica (véase laFig. 10).
Por consiguiente, en otro aspecto adicional la presente invención se refiere al uso de un compuesto de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de síndrome respiratorio agudo grave (SARS), así como a un procedimiento para tratar síndrome respiratorio agudo grave (SARS), comprendiendo dicho procedimiento administrar un compuesto de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención a un paciente que lo necesite.
45 Se contempla que los compuestos de la invención pueden tener una amplia aplicación en un amplio abanico de enfermedades infecciosas, como por ejemplo difteria, tétanos, tos ferina, polio, hepatitis B, Haemophilus influenza, sarampión, paperas y rubéola.
Por consiguiente, en otro aspecto mas, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad infecciosa, así como a unprocedimiento para tratar una enfermedad infecciosa, comprendiendo dicho procedimiento administrar un compuesto de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención a un paciente que lonecesite.
Enfermedades inflamatorias
La respuesta inflamatoria es un mecanismo esencial de defensa del organismo contra el ataque de agentes
55 infecciosos y también está implicada en la patogénesis de muchas enfermedades agudas y crónicas, que incluyen trastornos autoinmunitarios. A pesar de ser necesaria para luchar contra los patógenos, los efectos de un brote inflamatorio pueden ser devastadores. Por lo tanto, a menudo es necesario restringir la sintomatología de la inflamación usando fármacos antiinflamatorios. La inflamación es un procedimiento complejo normalmentedesencadenado por lesiones tisulares que incluye la activación de una gran variedad de enzimas, el aumento de la permeabilidad vascular y la extravasación de fluidos corporales, migración celular y liberación de mediadores químicos, todos con la finalidad de destruir y reparar el tejido lesionado.
En otro aspecto mas, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, así como a un procedimiento para tratar una enfermedad inflamatoria, comprendiendo dicho procedimiento administrar un compuesto de acuerdo
65 con la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención a un paciente que lo necesite.
En una realización preferente de la invención, la enfermedad inflamatoria es una enfermedad reumática y/o una enfermedad de los tejidos conectivos, como por ejemplo artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE) o lupus, esclerodermia, polimiositis, enfermedad inflamatoria del intestino, dermatomiositis, colitis ulcerosa,enfermedad de Crohn, vasculitis, artritis soriásica, dermatitis soriásica exfoliante, pénfigo vulgar y síndrome deSjorgren, en particular enfermedad inflamatoria del intestino y enfermedad de Crohn.
De forma alternativa, la enfermedad inflamatoria puede ser una inflamación no reumática, como bursitis, sinovitis, capsulitis, tendinitis y/u otras lesiones inflamatorias de origen traumático o deportivo.
Otros usos
Los compuestos de ARNpi de la presente invención pueden utilizarse como reactivos de investigación para el diagnóstico, terapia y profilaxis. En la investigación, los ARNpi pueden usarse para inhibir específicamente lasíntesis de los genes diana en las células y en los animales experimentales facilitando así el análisis funcional de ladiana o la valoración de su utilidad como diana para la intervención terapéutica. En el diagnóstico los ARNpi pueden usarse para detectar y cuantificar la expresión de la diana en las células y tejidos mediante prueba de bandas deNorthern, hibridación in situ o técnicas similares. Para la terapia, un animal o un ser humano, sospechoso de tener una enfermedad o trastorno, que puede tratarse modulando la expresión de diana se trata mediante la administración de compuestos de ARNpi de acuerdo con esta invención.
Además se proporcionan procedimientos de tratamiento de un animal en particular ratón y rata y de tratamiento deun ser humano, que se sospecha que tiene o que es propenso a una enfermedad o afección, asociada a la expresión de la diana mediante la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los compuestos o composiciones de ARNpi de la invención.
La invención se ilustra adicionalmente de forma no limitante mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplos Abreviaturas
DMT: dimetoxitritilo DCI: 4,5-dicianoimidazol DMAP: 4-dimetilaminopiridina DCM: diclorometano DMF: dimetilformamida THF: tetrahidrofurano DIEA: N,N-diisopropiletilamina PyBOP: hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio Bz: benzoílo Ibu: isobutirilo Beaucage: 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona GL3+: 5’-cuuacgcugaguacuucgadtdt-3’, GL3-: 5’-ucgaaguacucagcguaagdtdt-3’ NPY+: 5’-ugagagaaagcacagaaaadtdt-3’ NPY-: 5’-uuuucugugcuuucucucadtdt-3’ RL+: 5’-aucugaagaaggagaaaaadtdt-3’ RL-: 5’-uuuuucuccuucuucagaudtdt-3’ Minúsculas sin prefijo: monómero de ARN Minúsculas con prefijo "d": monómero de ADN
Ejemplo 1: síntesis de monómeros
La preparación de monómeros de LNA se describe con gran detalle en las referencias Koshkin y cols., J. Org. Chem., 2001, 66, 8504-8512 y Pedersen y cols., Synthesis, 2002, 6, 802-809 así como en las referencias que secitan en ellos. Cuando los grupos protectores Z y Z* eran oxi-N,N-diisopropil-O-(2-cianoetil)fosforamidita ydimetoxitritiloxi, dichos compuestos se sintetizaron tal como se describe en el documento WO 03/095467; Pedersen y cols., Synthesis 6, 802-808, 2002; Sørensen y cols., J. Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176, 2002; Singh y cols., J. Org. Chem. 63, 6078-6079, 1998; y Rosenbohm y cols., Org. Biomol. Chem. 1, 655-663, 2003. Todos los monómeros que contienen citosina estaban sustituidos por monómeros de 5-metil-citosina para todos los
acoplamientos. Todos los monómeros de LNA que se usaron fueron beta-D-oxi LNA (compuesto 3A).
Ejemplo 2: síntesis de oligonucleótidos
Todas las síntesis se realizaron a escala de 1 μmol en una plataforma MOSS Expedite instrument. Los procedimientos de síntesis se realizaron esencialmente como se describe en el manual del aparato.
Preparación del hemiéster succinílico de LNA
Se disolvieron monómero de 5’-O-DMT-3'-hidroxi-LNA (500 mg), anhídrido succínico (1,2 eq.) y DMAP (1,2 eq.) en DCM (35 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. Después de la extracción con NaH2PO4, 0,1 M, pH 5,5 (2x) y salmuera (1x), la fase orgánica se secó además con Na2SO4 anhidro, se filtró y se evaporó. Se obtuvo el derivado hemiéster con un rendimiento del 95% y se usó sin purificación adicional.
Preparación de LNA-CPG (vidrio poroso controlado)
El derivado hemiéster preparado anteriormente (90 μmol) se disolvió en una cantidad mínima de DMF. Se añadieron DIEA y piBOP (90 μmol) y se mezclaron conjuntamente durante 1 min. Esta mezcla preactivada se combinó con LCAA-CPG (500 Å, tamaño de malla de 80-120, 300 mg) en un sintetizador manual y se agitó. Después de 1,5 h agitando a temperatura ambiente, el soporte se eliminó por filtración y se lavó con DMF, DCM y MeOH. Después de secar, se determinó que la carga era de 57 μmol/g (véase Tom Brown, Dorcas J.S.Brown, Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis. En: F. Eckstein, editor. Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14).
Ciclos de fosforotioato
5’-O-DMT (A(bz), C(bz), G(ibu) o T) ligados a CPG se desprotegieron usando una solución de ácido tricloroacético al 3% (v/v) en diclorometano. El CPG se lavó con acetonitrilo. Se realizó el acoplamiento de fosforamiditas (A(bz), G(ibu), 5-metil-C(bz)) o T-β-cianoetil-fosforamidita) usando una solución 0,08 M de la amidita protegida con 5’-O-DMT en acetonitrilo y la activación se realizó usando DCI (4,5-dicianoimidazol) en acetonitrilo (0,25 M). La reacción de acoplamiento se realizó durante 2 min. La tiolación se realizó usando reactivo de Beaucage (0,05 M enacetonitrilo) y se dejó reaccionar durante 3 min. El soporte se lavó cuidadosamente con acetonitrilo y la posterior adición de la caperuza se realizó usando soluciones estándar (CAP A) y (CAP B) añadiendo la caperuza a los grupos hidroxilo sin reaccionar en 5’. La etapa de adición de la caperuza se repitió después y el ciclo se terminó lavando con acetonitrilo.
Ciclos de unidades de LNA
5’-O-DMT (A(bz), C(bz), G(ibu) o T) ligado a CPG se desprotegió usando el mismo procedimiento como se describe anteriormente. El acoplamiento se realizó usando 5’-O-DMT-A(bz), C(bz), G(ibu) o T-β-cianoetilfosforamidita (0,1 M en acetonitrilo) y la activación se logró mediante DCI (0,25 M en acetonitrilo). La reacción de acoplamiento se realizó durante 7 min. La adición de la caperuza se realizó usando soluciones estándar (CAP A) y (CAP B) durante 30 s. Eltriéster de fosfito se oxidó al triéster de fosfato más estable usando una solución estándar de I2 y piridina en THF durante 30 s. El soporte se lavó con acetonitrilo y se repitió la etapa de adición de la caperuza. El ciclo concluyó conun lavado cuidadoso con acetonitrilo.
Escisión y desprotección
Los oligonucleótidos se escindieron del soporte y el grupo protector de β-cianoetilo se eliminó tratando el soporte con NH4OH al 35% durante 1 h a temperatura ambiente. El soporte se eliminó mediante filtración y los grupos protectores básicos se eliminaron elevando la temperatura a 65 ºC durante 4 horas. Después el amoníaco se eliminó por evaporación.
Purificación
Los oligos se purificaron bien mediante HPLC de fase inversa (RP-HPLC) o bien mediante cromatografía deintercambio aniónico (AIE):
RP-HPLC:
Columna: VYDAC™, n.º de cat. 218TP1010 (vydac)
Caudal: 3 ml/min
Tampón: A (acetato de amonio 0,1 M, a pH 7,6)
B (acetonitrilo)
Gradiente:
Tiempo 0
10 18 22 23 28
B%
0 5 30 100 100 0
A/E:
Columna: Resource™ 15Q (Amersham Pharmacia Biotech) 5
Caudal: 1,2 ml/min Tampón: A (NaOH 0,1 M) B (NaOH 0,1 M, NaCl 2,0 NaCl)
Gradiente:
Tiempo 0
1 27 28 32 33
B%
0 25 55 100 100 0
Medición de Tf
Las curvas de fusión se registraron en un espectrofotómetro Perkin Elmer UV/VIS lambda 40 en línea con unsistema PTP-6 Peltier. Los oligonucleótidos se disolvieron en tampón salino (tampón fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, a pH 7,0) a una concentración de 1,5 μM y usando cubetas de 1 cm de longitud de recorrido. Las muestras se desnaturalizaron a 95 ºC durante 3 min y lentamente se enfriaron 20 ºC antes de las mediciones. Las curvas de fusión se registraron a 260 nm usando una velocidad de calentamiento de 1 ºC/min, una ventana de 2 nm y una respuesta de 0,2 s. Los valores de Tf se obtuvieron del máximo del primer derivado de las curvas de fusión.
Ejemplo 3: síntesis de oligonucleótidos de LNA/ARN
Síntesis
Los oligonucleótidos de LNA/ARN se sintetizaron sin DMT a una escala de 1,0 μmol usando un sintetizador deácidos nucleicos automatizados (MOSS Expedite 8909) y usando reactivos estándar. Se usaron 1H-tetrazol o 5etiltio-1H-tetrazol como activadores. La concentración de LNA ABz, GIBu y T fosforamidita era de 0,1 M en acetonitriloanhidro. El MeCBz se disolvió en THF al 15% en acetonitrilo. El tiempo de acoplamiento para todos los acoplamientos de monómeros fue de 600 s. Las ARN fosforamiditas (Glen Research, Sterling, Virginia) estaban protegidas con Nacetilo y 2’-O-triisopropilsililoximetilo (TOM). La concentración de monómero era de 0,1 M (acetonitrilo anhidro) y el tiempo de acoplamiento era de 900 s. El tiempo de oxidación se fijó en 50 s. El soporte sólido era DMT-LNA-CPG (1000Å, 30-40 μmol/g).
Tratamiento y purificación
La escisión de la resina y la desprotección de la nucleobase/fosfato se realizó en un tubo estéril mediante tratamiento con 1,5 ml de una solución de metilamina (1:1, metilamina al 55% en etanol: metilamina al 40% en agua) a 35 ºC durante 6 h o se dejó hasta la mañana siguiente. El tubo se centrifugó y la solución de metilamina setransfirió a un segundo tubo estéril. La solución de metilamina se evaporó en una centrifugadora al vacío. Eliminandolos grupos protectores de 2’-O, el resto se disolvió en 1,0 ml de TBAF 1,0 M en THF y se calentó a 55 ºC durante 15min. y se dejó a 35 ºC toda la noche. El THF se evaporó en una centrifugadora al vacío dejando una goma amarillo claro, que se neutralizó con aprox. 600 μl (volumen total de la muestra: 1,0 ml) de Tris-tampón 1,0 M sin RNasas (pH 7). La mezcla se homogeneizó agitando y calentando a 65 ºC durante 3 min. La desalación de los oligonucleótidos se realizó en columnas NAP-10 (Amersham Biosciences, véase más adelante). El filtrado de la etapa 4 (véase más adelante) se recogió y se analizó mediante MALDI-TOF y electroforesis en gel (gel de secuenciación de acrilamida al 16% (1 mm), tampón de TBE [Tris: 89 mM, ácido bórico: 89 mM, EDTA: 2 mM, pH 8,3] al 0,9%, durante 2 h a 20 W como el parámetro limitante. El gel se tiñó con CyberGold (Molecular Probes, 1:10000 en TBE 0,9x) durante 30 min seguido de escaneado en un Bio-Rad FX Imager). La concentración del oligonucleótido se midió mediante espectrometría UV a 260 nm.
Esquema A, desalación en columnas NAP-10:
Etapa
Reactivo Operación Volumen Comentarios
1
- Tampón de almacenamiento vacío - Desechar
2
H2O (sin RNasas) Lavar 2 x volumen completo Desechar
3
Oligo en tampón (sinRNasas) Cargar 1,0 ml Desechar
4
H2O (sin RNasas) Elución 1,5 ml Recoger -contiene oligo
5
H2O (sin RNasas) "Elución" 0,5 ml Recoger -contiene sal + pequeñacantidad de oligo
Como se apreciará por el experto en la materia, los temas más importantes en la síntesis de los oligos de LNA/ARN con respecto a los procedimientos estándar son que i) son necesarios tiempos de acoplamiento mayores para lograr una buena eficacia de acoplamiento y ii) el tiempo de oxidación tiene que ser mayor para minimizar la formación de fragmentos con deleciones. Además, el acoplamiento de fosforamiditas protegidas a 2’-O-TOM fue superior que a 2’-O-TBDMS. Tomando esto en cuenta, los oligonucleótidos en bruto fueron de una calidad tal que pudo evitarse la purificación adicional. Debería realizarse un análisis de EM después de eliminar los grupos TOM.
Ejemplo 4: estabilidad mejorada de LNApi con respecto a ARNpi
La estabilidad mejorada de LNApi con respecto a ARNpi se muestra en la Fig. 2. Tanto los ARNpi ligeramente modificados como los ARNpi más modificados mostraron estabilidad mejorada. La estabilidad se evaluó en suero 5 bovino fetal al 10% diluido en una solución salina fisiológica. Los ARNpi y LNApi se incubaron en el suero a 37 ºC. Se extrajeron muestras a diferentes tiempos y se analizaron en geles de TBE de poliacrilamida al 15% y se tiñeron con SYBR-oro (Molecular probes). Las bandas se cuantificaron y se representaron en una gráfica. Para elcompuesto de ARNpi no modificado puede observarse una acumulación de una banda intermedia (entre ARNds yARNss) que ha sido identificada como un 19-mero bicatenario, es decir ARNpi con protuberancias en 3’ degradadas.
10 Esto no se observó para los LNApi correspondientes.
Ejemplo 5: prueba de diseño de LNApi en un sistema indicador de mamífero
Primero se valoró la eficacia de diferentes diseños y combinaciones de LNApi en un sistema con testigo de luciferasa en un cultivo celular de mamífero. Los oligonucleótidos que se usaron se muestran en la Tabla 1. Los oligonucleótidos codificantes y los no codificantes correspondientes se hibridaron generando hebras bicatenarias, es
15 decir ARNpi o LNApi.
Las células que se usaron eran las líneas celulares de riñón embrionario humanas (HEK) 293. Las células HEK 293se mantuvieron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina, estreptomicina y glutamina (Invitrogen, Paisely, Reino Unido). Los plásmidos que se usaron fueron pGL3-Control que codificaba la luciferasa de luciérnaga controlada por el promotor y el potenciador de SV40 y pRL-TK que codificaba la luciferasa de Renilla
20 controlada por el promotor de HSV-TK (Promega, Madison, WI, Estados Unidos).
Transfección
Un día antes de la transfección las células se sembraron en 500 μl de medio en placas de 24 pocillos para que seadhirieran y alcanzaran una confluencia del 70 al 90% en el momento de la transfección. Las células se sembraron en el medio sin antibióticos y se cambiaron a 500 μl de Opti-MEM I justo antes de añadir la mezcla de transfección a 25 las células. Se preparó una mezcla de cotransfección estándar para pocillos triplicados añadiendo por separado 510 ng de pGL3-Control, 51 ng de pRL-TK y 340 ng de ARNpi a 150 μl de Opti-MEM I (Invitrogen) y 3 μl deLipofectamina 2000 (Invitrogen) a otros 150 μl de Opti-MEM I. Las dos soluciones se mezclaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 20-30 minutos antes de añadirse a las células. Se añadieron 100 μl de la mezcla de transfección a cada uno de los tres pocillos. El volumen final del medio más la mezcla de transfección fue de 600 μl.
30 La concentración de LNApi o ARNpi correspondió a aproximadamente 13 nM. Las células se incubaron con la mezcla de transfección durante 4 horas y después el medio se sustituyó por DMEM totalmente suplementado.
Ensayo indicador de luciferasa dual (Promega)
Las células se recogieron en tampón de lisis pasiva y se ensayaron de acuerdo con el protocolo (Promega) usandoun luminómetro con formato de 96 pocillos de NovoSTAR con dispensador de sustrato (BMG Labtechnologies,
35 Offenburg, Alemania). Se aplicaron 10 μl de muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y el luminómetro añadió 50 μl de reactivo de ensayo de la luciferasa II (sustrato para la luciferasa de luciérnaga) a un pocillo y midió.Después, se añadieron 50 μl de Stop and Glow (solución de terminación para la luciferasa de luciérnaga y sustrato para la luciferasa de Renilla) y se midió. Se usó la media de las actividades de luciferasa medidas durante 10 segundos calculando las proporciones entre la luciferasa de luciérnaga y la de Renilla o al revés.
40 Ejemplo 6: modelo in vitro; valoración de la eficacia en una diana endógena
Las células que se usaron eran feocromocitomas suprarrenales de rata, líneas celulares PC12. Las PC12 se mantuvieron en DMEM suplementado con suero de caballo al 10%, suero bovino fetal al 5%, penicilina, estreptomicina y glutamina. El protocolo de transfección con SiLNA o ARNpi contra genes endógenos (como NPY en las células PC12) sigue el mismo procedimiento como se describe anteriormente pero sin los plásmidos de
45 luciferasa y solo añadiendo ARNpi contra NPY (dado que el gen NPY se expresa de forma endógena en las células PC12). Las concentraciones finales de LNApi o ARNpi variaban de 1 a 100 nM. Las células habitualmente serecogían de 24 a 48 horas después de la transfección y se extraía el ARNm. Los niveles de ARNm se cuantificaban con PCR en tiempo real. La regulación por disminución del NPY diana en PC12 se muestra en la Fig. 3.
Ejemplo 7: modelo in vitro: análisis de la inhibición de la diana
50 Expresión mediante PCR en tiempo real
La silenciación génica de una diana mediante SiLNA o ARNpi puede ensayarse de una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden cuantificarse los niveles de ARNm de la diana, por ejemplo, por análisis mediante prueba de bandas de Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR), o PCR en tiempo real. Actualmente se prefiere la PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis por ARN puede realizarse sobre
55 el ARN o ARNm celular total. Los procedimientos de aislamiento del ARN y de análisis del ARN, como por ejemplo análisis por prueba de bandas de Northern, son rutinarios en la técnica y se enseñan, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.
Las células se recolectaron y se extrajo el ARNm. Se usaron protocolos de PCR en tiempo real amplificando los genes diana de ARNm con cebadores génicos específicos junto con un par cebador de un gen doméstico como
60 control interno (como por ejemplo ciclofilina). La regulación por disminución se expresó como una proporción de la cantidad de ARNm diana frente a la cantidad de ARNm de control.
La PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente usando el sistema iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System disponible comercialmente, disponible de BioRAD .
Ejemplo 8: análisis in vitro: inhibición mediante ARNpi de la expresión de la diana indicadora mediante oligonucleótidos de LNApi
Los monómeros de LNA podrían usarse modificando ambos extremos de la hebra codificante de ARNpi con un efecto mantenido con respecto a ARNpi (>90% de inhibición de la expresión de la luciferasa de luciérnaga con respecto a las muestras sin tratar). La hebra no codificante también podría modificarse en el extremo 3' sin pérdidade eficacia mientras que una modificación en el extremo 5' de la hebra no codificante reducía el efecto a una inhibición del 25-50%. Al sustituir todos los residuos que contienen uracilo por timinas en LNA en la hebra codificante se reduciría el efecto a una inhibición del 80%. Una modificación similar en la hebra no codificante anulaba el efecto (Fig. 4). La fosforilación del extremo 5' de la hebra no codificante del LNApi no mejoró la reducción (20-30% de reducción, no se muestran datos). Experimentos similares dirigidos contra la luciferasa de Renilla mostraron que podían modificarse ambos extremos de la hebra codificante con monómeros de LNA, mientras que la hebra nocodificante tolera la modificación con monómeros de LNA en el extremo 3' (inhibición al 95% en todos los casos), pero mostró menos inhibición con una modificación con LNA en ambos extremos 3’ y 5'. Aún así, se observó una inhibición del 75% (Fig. 5). Se midió la estabilidad de LNA/ARN en todos los oligos con uracilo en ARN a timidina en LNA (2189) en suero de rata al 100%, donde la estabilidad fue similar a los oligos de ADN desnudos. En tiempo cero ya se habían degradado una hebra monocatenaria de ARN no modificada (GL3-) y una hebra bicatenaria no modificada (GL3+/-) (Fig. 6).
Ejemplo 9: análisis in vitro: inhibición mediante ARNpi de una diana endógena mediante LNApi
Inhibición de la citotoxicidad
Las células se transfectaron con 85 nM del ARNpi o LNApi respectivo (SARS 1-4, véase la Fig. 7) o con ARNpi decontrol dirigido contra el gen de la luciferasa de luciérnaga (Luc) o el gen del neuropéptido Y (NPY) de rata. Las células con transfección simulada se trataron con Lipofectamina 2000 solo y se usaron como control positivo. Las células no infectadas se incluyeron como control negativo. Las células transfectadas se infectaron con 60.000, 6.000
o 600 DICT50 de SARS-CoV. Después de 50 horas desde la infección, se midió el CPE y la citotoxicidad. Se encontró una diferencia notable en CPE entre las células tratadas con el ARNpi más eficaz, SARS 1 comparadas con las células con transfección simulada (Fig. 8). La citotoxicidad se determinó en términos de porcentaje de liberación de LDH de las células tratadas comparadas con las células de control con transfección simulada. La inhibición porcentual de la citotoxicidad se calculó como una citotoxicidad del 100% en la muestra tratada con ARNpi. Los cuatro ARNpi y LNApi específicos de Pol tuvieron diversos efectos sobre la citotoxicidad (Fig. 9). Los ARNpi y LNApi más eficaces fueron los dirigidos contra el sitio SARS 1, que redujeron la citotoxicidad y con hasta el65% a una DICT50 de 600. El sitio SARS 3 fue medio eficaz usando ARNpi en todas las tres dosis de virus. Sin embargo SARS 3 se convirtió en un sitio igualmente eficaz que SARS 1 usando LNApi, también en las tres dosis de virus. Los sitios SARS 2 y SARS 4 no mostraron ningún efecto por ARNpi o LNApi a ninguna dosis de virus. Los datos representan la media y la desviación típica determinadas mediante tres experimentos independientes porcuadruplicado.
Virus y células
Se usaron células Vero para todos los experimentos en células. Las células se cultivaron en MEM de Eagle sin rojo fenol que contenía FCS al 5% y PEST al 1% a 37 ºC y 5% de CO2. La cepa aislada Frankfurt 1 (número de accesode GenBank AY291315, amablemente donada por el Dr. H. W. Doerr) se cultivó con titulaciones elevadas en células Vero. Se juntaron los sobrenadantes de dos matraces de cultivo de células T225 y se congelaron a -80 ºC en viales de 1 ml y constituyeron la solución madre de virus. La solución madre de virus se identificó como SARS-CoV mediante PCR con transcriptasa inversa de diagnóstico usando los cebadores BNIoutS2 y BNIoutAs11 y loscebadores Cor-p-F2 y Cor-p-R12. La solución madre de virus se usó en diluciones de factor diez o a una dilución fija infectando células Vero en placas de cultivo celular de 96 pocillos. La solución madre de virus se diluyó 600.000 veces (determinado mediante el procedimiento de Reed-Muench) alcanzando la DICT50 en placas de cultivo celular de 96 pocillos.
Los oligonucleótidos de LNApi se produjeron como se describe anteriormente. La secuencia se muestra en la Fig. 7.
Transfecciones
Se usó Lipofectamina2000 (Invitrogen) transfectando las células con ARNpi y LNApi. La eficacia de la transfección fue elevada y se transfectaron la mayoría de las células. El medio de transfección se cambió por MEM de Eagle sinrojo fenol después de cuatro horas y las células se cultivaron hasta la mañana siguiente formando una monocapa confluente.
Citopatogenia y citotoxicidad
Se detectó el efecto citopatogénico (CPE) en células infectadas según se redondearon las células y por separación de la placa de cultivo celular. El CPE se puntuó con un microscopio óptico. La citotoxicidad se midió usando un kit de detección de la citotoxicidad (LDH) (Roche, Alemania). Las células con transfección simulada tratadas solo con Lipofectamina 2000 se establecieron como el 100% de citotoxicidad provocada por la infección vírica a cada dilución de virus. Las células no infectadas se usaron determinando la citotoxicidad de fondo. La citotoxicidad porcentual se determinó mediante [((Abs490 muestra -fondo)/(Abs490 controles con transfección simulada -fondo)) x100]. La inhibición de la citotoxicidad se calculó mediante [(1-(Abs490 muestra -fondo)/(Abs490 controles con transfección simulada -fondo)) x100].
Ejemplo 10: reducción de los efectos a distancia
La inhibición de la diana codificante/no codificante de SARS en 3’UTR de la luciferasa de luciérnaga se realizó a ARNpi 1,6 nM/LNApi con los plásmidos: pS3Xs (pGL3 con diana codificante de SARS), pS3Xas (pGL3 con diana no codificante de SARS) y pGL3 (sin diana de SARS)
La secuencia diana SARS 3 se clonó en dirección codificante (secuencia correspondiente al ARNm de SARS) y nocodificante (secuencia complementaria al ARNm de SARS) en 3’ UTR de luciferasa de luciérnaga, entre la región codificante de la luciferasa y poli A en pGL3. pGL3 se cortó con Xba I (entre el codón de terminación de luc y poli A) y un oligo bicatenario de ADN de la secuencia diana SARS S3 con protuberancias Xba I.
(Oligo bicatenario de ADN de la diana SARS 3 (posición genómica 14593 de SARS) con protuberancias Xba I)
5’-ctagcaaactgtcaaacccggtaattttt-3’ (codificante, igual que el ARNm)
3’-atttgacagtttgggccattaaaaagatc-5’ (no codificante, complementario al ARNm)
El ligado del oligo bicatenario produjo dos productos plasmídicos bien con diana codificante o bien con diana nocodificante (pS3Xs: diana en dirección codificante, pS3Xas: diana en dirección no codificante). Los dos plásmidos diferentes se transfectaron en cultivos de células HEK293 aparte junto con plásmido de control pRL-TK y ARNpidirigido contra SARS3 o LNApi dirigido contra SARS3 (concentración final de 1,6 nM), de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 5. Las células se incubaron durante 24 horas, las células se recogieron y se midió la actividad de la luciferasa como se describe en el Ejemplo 5.
El LNApi puede inactivar la hebra codificante no deseada manteniendo mientras el efecto total en la hebra no codificante. El ARNpi muestra el efecto de ambas hebras. La secuencia diana de SARS 3 se clonó tanto en dirección codificante como en dirección no codificante donde después se ensayaron LNApi y ARNpi para efectos inhibidores en los dos plásmidos diferentes.
El ARNpi muestra la regulación por disminución tanto de la diana codificante (parte de la secuencia de ARNm deSARS, ~90% de reducción de la actividad de la luciferasa) como de la diana no codificante (secuenciacomplementaria al ARNm de SARS) (~50% de reducción). Así tanto la hebra codificante y como la no codificante enel ARNpi tienen un efecto de regulación por disminución. Sin embargo, el LNApi SARS 3 muestra un efecto igual de bueno en la regulación por disminución de la diana codificante (~90% de reducción) pero no tiene actividad sobre la diana no codificante (0% de reducción). Por lo tanto, la hebra no codificante de LNApi mantiene el efecto total mientras que se anula el efecto de la hebra codificante no deseado. Esto quiere decir que LNApi puede minimizar las dianas no objetivo de la hebra codificante al inactivarlas con respecto a la maquinaria de interferencia de ARN (Fig. 17).
Ejemplo 11: eficacia in vivo de LNApi
El fin de este estudio era poner a prueba la eficacia in vivo de dos ARNpi contra eGFP que se habían modificado incorporando monómeros de LNA. Los compuestos empleados fueron 3029/3031 y 3030/3031.
Resumiendo, se inyectaron a ratones atímicos hembra (NMRI nu/nu, Charles River Netherlands, Maastricht, Holanda) xenoinjertos de 15PC3 y Miapaca. Las células 15PC3 y las células Miapaca expresan eGFP como sedescribe por Fluiter y cols. (2002) Cancer Research 62, 2024-2028.
Después de dos semanas de crecimiento tumoral se implantaron a los ratones minibombas osmóticas por vía subcutánea (Alzet 1007D, n.º de lote 10052-02 (bombas de 7 días) (Durect Corporation, Cupertino, CA)). Estas bombas se cargaron con 3029/3031 o 3030/3031 dando una dosis de 0,5 mg/kg/día. Los ratones se trataron durante5 días. Al 5º día los ratones se sacrificaron y se obtuvieron imágenes de la fluorescencia en el tumor y se midió usando un analizador de imágenes luminiscente LAS3000 (Fujifilm). La fluorescencia se cuantificó usando el programa AIDA (Raytest GmbH, Straubenhardt, Alemania). Después de obtenerse imágenes los tumores seextrajeron y se almacenaron para el análisis proteínico (prueba de bandas de Western). Los resultados obtenidos para 15PC3 se muestran en la Fig. 18. Como puede verse los compuestos de LNApi tuvieron un efecto significativo sobre el crecimiento tumoral. Con el modelo de xenoinjerto con Miapaca se obtuvieron resultados similares.
El LNApi se comprobó antes del implante y después del experimento (los restos presentes en la bomba) usando el análisis por MALDI-TOF. El LNApi se purificó mediante intercambio iónico en las placas de purificación del kit degenotipado Nucleave (Waters, Milford, MA, Estados Unidos) y se analizó usando espectrometría de masas dedispersión con ionización de desorción por láser asistida por matriz (MALDI-TOF) en un MALDI Biflex III (Brucker instruments, Leipzig, Alemania). Los datos se muestran en la Fig. 20.
Tabla 1.
N.º
Secuencia (5’→3’) Conc. (μM) Pureza
2184
cuuacgcugaguacuucgaTT 440 ~80%
2185
MeCuuacgcugaguacuucga-T7 320 ~70%
2186
ucgaaguacucagcguaagTT 380 ~65%
2187
TcgaaguacucagcguaagTT 340 ~60%
2187-phos
Phos-TcgaaguacucagcguaagTT 350 ~80%
2188
MeCTcgcTagTacTTcgaTT 410 ~50%
2189
TcgaagTacTcagcgTaagTT 390 ~55%
2189-phos
Phos-TcgaagTacTcagcgTaagTT 330 ~80%
2699-1
uuuuucuccuucuucagauTT 400 ~80%
2700-1
aucugaagaaggagaaaaaTT 400 ~80%
2701-1
TuuuucuccuucuucagauTT 360 ~80%
2702-1
AucugaagaaggagaaaaaTT 430 ~80%
2703-1
MeCTTacgcTgagTacTrcgaTT 500 ~80%
Mayúsculas: Beta-D-oxi monómero de LNA Minúsculas: monómero de ARN Phos: 5’-fosfato MeC: 5-metilcitosina
N.º
Secuencia (5’→3’)
2780
MeCTTAMeCGMeCTGAGTAMeCTTMeCGATT
2781
dCTdtAdCGdCTdgAdgTdaMeCdtTdCGdaTT
2782
dCTdtdaMeCdgdCTdgdaGdtdaMeCdtdtMeCdgdaTT
2783
MeCuuAcGcuGaGuaMeCuuMeCgaTT
2784
MeCdUdUAdcGdCduGdaGdUdaMeCdUdUMeCdgdaTT
2785
uMeCGAAGTAMeCTMeCAGMeCGTAAGTT
2786
uMeCdgAdaGdtAdcTdcAdgMeCdgTdaAdgTT
2787
uMeCdgdaAdgdtAdCdtMeCdadgMeCdgdtAdadgTT
2788
ucGaaGuaMeCucAgcGuAagTT
2789
uMeCgaaguacucagcguaagTT
2790
ucGaaguacucagcguaagTT
2792
ucgaAguacucagcguaagTT
2793
ucgaaGuacucagcguaagTT
2794
ucgaaguAcucagcguaagTT
2795
TgAgAgaaAgcAcAgaAaaTT
2796
TgagagaaagcacagaaaaTT
2797
TuuucugugcuuucucucaTT
Tabla 2
27 (continuación)
Mayúsculas: Beta-D-oxi monómero de LNA Minúsculas sin prefijo: monómero de ARN Minúsculas con prefijo "d": monómero de ADN MeC: 5-metilcitosina
Tabla 3
N.º
Secuencia (5’→3’)
2842-1
GgaugaggaaggcaauuuaTT
2843-1
uaaauugccuuccucauccTT
2872-1
CugguacgauuucggugauTT
2845-1
aucaccgaaaucguaccagTT
2846-1
AcugucaaacccgguaauuTT
2847-1
aauuaccggguuugacaguTT
2848-1
GacaacuccuauucguaguTT
2849-1
acuacgaauaggaguugucTT
2862-1
UccagaacaaaccaaacggTT
2863-1
AaacaugcagaaaaugcugTT
2864-1
ucgaaguaMeCucagcguaagTT
2865-1
ucgaaguacTcagcguaagTT
2866-1
ucgaaguacuMeCagcguaagTT
2867-1
ucgaaguacucAgcguaagTT
2865-U
ucgaaguacAcagcguaagTT
3029
GcugacccugaaguucaucTT
3030
GMeCTgacMeCcuGaagTTcaucTT
3031
gaugaacuucagggucagcTT
Mayúsculas: Beta-D-oxi monómero de LNA Minúsculas sin prefijo: monómero de ARN MeC: 5-metilcitosina

Claims (26)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto bicatenario que comprende una hebra codificante y una hebra no codificante, en el que cada hebra comprende 17-25 nucleótidos y en el que dicho compuesto comprende al menos un monómero de ácido nucleico cerrado (LNA) que tiene la estructura
    en las que
    X es seleccionado del grupo que consiste en O, S y NRH, en el que RH es H o alquilo C1-4;
    Y es CH2;
    B es una nucleobase;
    10 Z y Z* están independientemente ausentes o son seleccionados independientemente del grupo que consiste en un grupo de enlace internucleosídico, un grupo terminal y un grupo protector; de forma que cuando el monómero de LNA está localizado en el extremo 3', Z es un grupo terminal y Z* es un grupo de enlace internucleosídico; cuando elmonómero de LNA está localizado en el extremo 5', Z está ausente y Z* es un grupo terminal; y cuando el monómero de LNA está localizado dentro de la secuencia de nucleótidos, Z está ausente y Z* es un grupo de enlace
    15 internucleosídico y
    en el que ningún monómero de LNA está localizado en el extremo 5' de la hebra no codificante.
  2. 2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la hebra codificante comprende 1-10 monómeros de LNA.
  3. 3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que al menos un monómero de LNA está 20 localizado en el extremo 5' de la hebra codificante.
  4. 4.
    El compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en el que al menos dos monómeros de LNA están localizados en el extremo 5' de la hebra codificante.
  5. 5.
    El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos un monómero de LNA está localizado en el extremo 3' de la hebra codificante.
    25 6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, en el que al menos dos monómeros de LNA están localizados en el extremo 3' de la hebra codificante.
  6. 7. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la hebra no codificante comprende al menos un monómero de LNA.
  7. 8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la hebra no codificante comprende 1-1030 monómeros de LNA.
  8. 9.
    El compuesto de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que al menos un monómero de LNA está localizado en el extremo 3' de la hebra no codificante.
  9. 10.
    El compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, en el que al menos dos monómeros de LNA están localizados en el extremo 3' de la hebra no codificante.
    35 11. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 10, en el que al menos tres monómeros de LNA están localizados en el extremo 3' de la hebra no codificante.
  10. 12. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la hebra codificante comprende al menos un LNA y la hebra no codificante comprende al menos un monómero de LNA.
  11. 13. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la hebra codificante comprende 1-1040 monómeros de LNA y la hebra no codificante comprende 1-10 monómeros de LNA.
  12. 14.
    El compuesto de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en el que la hebra codificante comprende al menos un monómero de LNA en el extremo 5' y al menos un monómero de LNA en el extremo 3' y en el que la hebra no
    codificante comprende al menos un monómero de LNA en el extremo 3'.
  13. 15.
    El compuesto de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la hebra codificante comprende al menos unmonómero de LNA en el extremo 5' y al menos un monómero de LNA en el extremo 3' y en el que la hebra nocodificante comprende al menos dos monómeros de LNA en el extremo 3'.
    5 16. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la hebra codificante comprende al menos dosmonómeros de LNA en el extremo 5' y al menos dos monómeros de LNA en el extremo 3' y en el que la hebra nocodificante comprende al menos dos monómeros de LNA en el extremo 3'.
  14. 17. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la hebra codificante comprende al menos dos
    monómeros de LNA en el extremo 5' y al menos dos monómeros de LNA en el extremo 3' y en el que la hebra no10 codificante comprende al menos tres monómeros de LNA en el extremo 3'.
  15. 18.
    El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la hebra codificantecomprende al menos un monómero de LNA en al menos una de las posiciones 9-13 contadas a partir del extremo 5'.
  16. 19.
    El compuesto de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la hebra codificante comprende un monómerode LNA en la posición 10.
    15 20. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 18 o 19, en el que la hebra codificante comprende un monómero de LNA en la posición 11.
  17. 21. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en el que la hebra codificante comprende un monómero de LNA en la posición 12.
  18. 22. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que cada hebra 20 comprende 20-22 nucleótidos.
  19. 23.
    El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos una de las hebras tiene una protuberancia en 3'.
  20. 24.
    El compuesto de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la hebra codificante tiene una protuberancia en 3’.
    25 25. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 23 o 24, en el que la hebra no codificante tiene una protuberancia en 3’.
  21. 26.
    El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23-25, en el que las protuberancias en 3’ son de 1-3 nucleótidos.
  22. 27.
    El compuesto de acuerdo con la reivindicación 26, en el que tanto la hebra codificante como la no
    30 codificante comprenden dichas protuberancias en 3’, en el que cada hebra comprende 17-25 nucleótidos; en el que la hebra codificante tiene uno o dos monómeros de LNA en el extremo 5' y uno o dos monómeros de LNA en elextremo 3'; y en el que la hebra no codificante tiene uno o dos monómeros de LNA en el extremo 3'.
  23. 28. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-27, en el que ningún monómero de LNA está localizado a 1, 2 o 3 nucleótidos del extremo 5' de la hebra no codificante.
    35 29. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que X es seleccionado del grupo que consiste en O, S y NH.
  24. 30.
    El compuesto de acuerdo con la reivindicación 29, en el que X es O.
  25. 31.
    El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho monómero de LNA está en la forma beta-D.
    40 32. Un conjugado que comprende el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-31 enlazado a uno o más ligandos.
  26. 33. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-31 o el conjugado de acuerdo con la reivindicación 32 y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
    45 34. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-31 o el conjugado de acuerdo con la reivindicación 32, para su uso como medicamento.
    (tipo N)
    (tipo S)
    Proporción normalizadaNPY/Ciclina (control interno) Proporción normalizadaLuciérnaga/Renilla
    Proporción normalizadaLuciérnaga/Renilla
    Infectado No infectado
    Tratamiento:
    Simulado
    Después de la bomba
    Antes de la bomba
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