ES2330239T3 - Usos de carbamoilfosfato sintetasa 1 (cps 1) como biomarcador humoral para la diagnosis de afecciones tumorales. - Google Patents

Usos de carbamoilfosfato sintetasa 1 (cps 1) como biomarcador humoral para la diagnosis de afecciones tumorales. Download PDF

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Abstract

Uso de la carbamoilfosfato sintetasa (CPS 1) y/o de sus fragmentos con inmunorreactividad de CPS 1 como biomarcador humoral para la diagnosis in vitro y el control evolutivo y terapéutico de afecciones tumorales.

Description

Usos de la carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1) como biomarcador humoral para la diagnosis de afecciones tumorales.
La presente invención se refiere a nuevos usos de la enzima carbamoilfosfato sintetasa 1 (E.C. 6.3.4.16, llamada siempre abreviadamente de aquí en adelante CPS 1) y/o de fragmentos de CPS 1 que se dan fisiológicamente y presentan inmunorreactividad de CPS 1 como biomarcador humoral para la diagnosis médica para la detección de afecciones tumorales (como marcador tumoral humoral), es decir para la diagnosis de afecciones tumorales mediante la detección de CPS 1 o de inmunorreactividad de CPS 1 en la circulación, y en particular en el suero o plasma de pacientes a los que se les efectúa un examen rutinario para detectar una posible presencia de tumores, con respecto a los cuales hay una sospecha fundada de tumores, o en los cuales ya fue detectado un tumor y que se tienen en observación o sometidos a una terapia.
Dentro del marco de la presente solicitud, el concepto de "tumor" se usa como concepto general o sinónimo para las neoplasias, y en particular para las neoplasias malignas como las que son típicas de las afecciones cancerosas (carcinomas). En un país como Alemania enferman cada año de neoformaciones malignas (tumores malignos), es decir de cáncer, más de 300.000 hombres y mujeres, siendo considerables tanto el número de nuevos casos de cáncer que se diagnostican anualmente como la mortalidad. Los tumores malignos pueden producirse en casi cada tejido u órgano, y según el órgano afectado se distingue entre numerosas afecciones cancerosas, que pueden diferenciarse considerablemente entre sí tanto con respecto a su frecuencia estadística como con respecto a su prognosis y su tratabilidad.
En los últimos años se ha desarrollado una pluralidad de terapias que han traído consigo considerables avances con respecto a la curabilidad de numerosas formas de afecciones cancerosas. En todos los casos se cumple sin embargo la regla de que las probabilidades de curación de las afecciones cancerosas son siempre tanto mayores cuanto mayor sea la antelación con la que se identifique la afección cancerosa. Es a este respecto muy particularmente importante una identificación anticipada del cáncer en un punto en el tiempo en el que no hayan surgido aún síntomas clínicos o síntomas clínicos significativos.
Para la identificación lo más anticipada posible de tumores en la diagnosis clínica se determinan en muestras biológicas, y en particular en muestras de sangre y secreciones corporales de los pacientes examinados, los llamados "marcadores tumorales". Los marcadores tumorales son sustancias que son formadas directamente por las células tumorales malignas, o bien se producen debido a que las células tumorales inducen la síntesis del respectivo marcador en células no tumorales. Al detectarse marcadores tumorales en elevada concentración en muestras biológicas líquidas (marcadores tumorales humorales) o localizados en el tejido (marcadores tumorales celulares), permiten según las circunstancias específicas del caso individual en cuestión una identificación anticipada de tumores malignos en grupos de riesgo, sirven para la diagnosis tumoral primaria y permiten la enunciación de pronósticos y/o una supervisión de una terapia tumoral y dado el caso una identificación anticipada de una recidiva tumoral. En la presente solicitud se usa como concepto general para todas las posibilidades de aplicación más específicas que se mencionan (indicaciones) el concepto de "diagnosis". Se da una visión de conjunto sobre los marcadores tumorales actualmente usados en la diagnosis clínica en Lothar Thomas (redactor), Labor und Diagnose, 5ª edición ampliada, capítulo 34, véase en particular el resumen 34.1 "Afecciones Malignas" en las páginas 956-961, así como las contribuciones a los distintos marcadores tumorales utilizados clínicamente en 34.2-34.17 en las páginas 916-1019.
Es común a todos los marcadores tumorales que se determinan actualmente el hecho de que la sensibilidad de su determinación es relativamente limitada, y de que los mismos presentan una relativamente alta especificidad orgánica. La relativamente alta especificidad orgánica de los marcadores tumorales que se determinan actualmente tiene por un lado la ventaja de que al producirse su detección se obtiene al mismo tiempo una información sobre el órgano en el que con una alta probabilidad ha surgido la afección cancerosa causal. Una alta especificidad constituye sin embargo una desventaja en la medida en que con la determinación de marcadores tumorales organoespecíficos no son detectables las afecciones cancerosas de otros órganos, o en que para una identificación anticipada completa es necesaria una simultánea determinación de numerosos marcadores tumorales distintos. La relativamente baja sensibilidad de la determinación de los marcadores tumorales conocidos (con una alta sensibilidad de una determinación se identifican correctamente la mayoría de los enfermos o todos los enfermos), que según la afección cancerosa y el marcador tumoral está situada entre un 20 y un 80%, tiene como consecuencia el hecho de que, a pesar de la determinación de los marcadores tumorales en sí adecuados para ello, sigue siendo bastante considerable el peligro de una no identificación de afecciones cancerosas.
Sigue habiendo por consiguiente necesidad de nuevos biomarcadores humorales, y en particular de marcadores tumorales humorales que debido a una propia organoespecificidad o sensibilidad característica y ya al proceder a su determinación en solitario o bien en combinación con la determinación de otro biomarcador/marcador tumoral o de otros varios biomarcadores/marcadores tumorales permitan una diagnosis mejorada, y en particular una diagnosis de cáncer mejorada.
La presente invención se refiere a la identificación de un biomarcador humoral que puede servir de nuevo marcador tumoral humoral, y a todos los posibles usos derivados de esta identificación en el ámbito de la diagnosis tumoral.
Las reivindicaciones están destinadas a proteger al amparo de la legislación en materia de patentes a estos usos o procedimientos de diagnosis in vitro haciendo uso de la determinación del nuevo marcador tumoral humoral.
La presente invención se basa en la sorprendente constatación de que en la circulación, es decir en particular en los plasmas o sueros de pacientes en los que fueron identificados tumores clínicamente distintos, en particular de partes blandas u órganos internos, eran detectables con en parte excelente sensibilidad concentraciones claramente elevadas de la enzima carbamoilfosfato sintetasa (CPS 1), o sea una fuerte inmunorreactividad de CPS 1, y ello se daba concretamente en claro contraste con los sujetos sanos de control, lo cual hace de la CPS 1 y de la inmunorreactividad de CPS 1 un nuevo marcador tumoral humoral.
Usando un inmunoensayo que había sido desarrollado en conexión con el diagnóstico de sepsis y permite selectivamente la detección o la medición de CPS 1 o de la inmunorreactividad de CPS 1 en un suero o plasma de un paciente humano, se constató en casa de la solicitante que también en la circulación de pacientes con distintos tumores diagnosticados clínicamente pueden encontrarse en concentraciones marcadamente elevadas CPS 1 y/o una fuerte inmunorreactividad de CPS 1.
Dentro del marco de la misma investigación se constató además que el mismo biomarcador se encuentra claramente incrementado también en la circulación de pacientes con afecciones intestinales inflamatorias crónicas (M.C.; C.U.) (M.C. = enfermedad de Crohn; C.U. = colitis ulcerosa), en particular en los accesos morbosos agudos que son típicos de estas enfermedades.
Para la diagnosis médica la CPS 1 y los fragmentos de CPS 1 con inmunorreactividad de CPS 1 no han desempeñado tradicionalmente papel práctico alguno. En el más concreto ámbito especializado de la diagnosis tumoral aún nunca se ha tratado sobre la CPS 1 como posible marcador tumoral humoral.
Sin embargo, la propia enzima CPS 1 (E.C. 6.3.4.16) es perfectamente conocida desde hace mucho tiempo. Dicha enzima cataliza la conversión de amoníaco, bicarbonato y 2 ATP con formación de fosfato de carbamoilo en el primer paso del ciclo de la urea. Dicha enzima también desempeña además un papel en la biosíntesis de arginina, que es por su parte un sustrato para la biosíntesis de NO, p. ej. en un shock por endotoxinas (véase Shoko Tabuchi et al., Regulation of Genes for Inducible Nitric Oxide Synthase and Urea Cycle Enzymes in Rat Liver in Endotoxin Shock, Biochemical and Biophysical Research Communications 268, 221-224 (2000)). La CPS 1 debe distinguirse de la enzima citosólica CPS 2 (E.C. 6.3.5.5), que desempeña asimismo un papel en el ciclo de la urea, pero procesa el sustrato glutamina. Es sabido que la CPS 1 está localizada en las mitocondrias y se da en esta forma en el tejido hepático en grandes cantidades (representa un 2-6% de la proteína total del hígado). Su secuencia de aminoácidos y su localización genética son conocidas desde hace mucho tiempo (véase Haraguchi Y. et al., Cloning and sequence of a cDNA encoding human carbamyl phosphate synthetase I: molecular analysis of hyperammonemia, Gene 1991, nov. 1; 107 (2):335-340; véase también la publicación WO 03/089933 A1 de la solicitante). Con respecto a su papel fisiológico puede hacerse referencia a artículos de revistas especializadas tales como p. ej. el de H.M. Holder et al., Carbamoyl phosphate synthetase: an amazing biochemical odyssey from substrate to product, CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 56 (1999) 507-522 y a la literatura a la que ahí se hace referencia, así como a la introducción de la publicación de Mikiko Ozaki et al., Enzyme-Linked Immunosorbent Assay of Carbamoylphosphate Synthetase I: Plasma Enzyme in Rat Experimental Hepatitis and Its Clearance, Enzyme Protein 1994, 95:48:213-221.
Según Shoko Tabuchi et al., loc. cit., en hígados de rata en un shock por endotoxinas artificial (LPS) no se observa incremento alguno de la enzima (proteína). Según Li Yin et al., Participation of different cell types in the restitutive response of the rat liver to periportal injury induced by allyl alcohol, Journal of Hepatology 1999, 31:497-507, en una lesión hepática por alcohol alílico se observa en los exámenes histológicos a los tres días en todos los hepatocitos un incremento de la expresión de CPS 1.
Se constató además que en el modelo de la rata y en una hepatitis aguda producida experimentalmente mediante administración de galactosamina se encuentra en el plasma de la rata una actividad inmunológica de CPS 1 marcadamente incrementada (determinada con un ELISA con IgG de conejo anti-CPS 1 de rata), concretamente a las 24-48 h del tratamiento con la galactosamina desencadenadora de la hepatitis. En el plasma de rata fueron también crecientemente identificables durante la hepatitis aguda fragmentos de CPS 1 con masas molares de aproximadamente 140 y 125 kDa sin otra caracterización más precisa (correspondencia secuencial), mientras que en un análisis inmunoblot acompañante en muestras de autopsia humanas no pudieron observarse fragmentos de CPS 1 con inmunorreactividad de CPS 1 (Mikiko Ozaki et al., loc. cit.).
En un trabajo de Liu Tong-hua et al., Carbamoyl Phosphate Synthetase 1, A Novel Marker for Gastric Carcinoma, Chinese Medical Journal, 102(8):630-638, 1989, se dan resultados de exámenes inmunocitométricos de muestras tisulares de distintos tumores eliminados por vía operatoria para la detección de una posible presencia de CPS 1. Los autores hallaron indicios de inmunorreactividad de CPS 1 solamente en tejido de carcinoma del estómago, pero por el contrario no los hallaron en otros tejidos tumorales (del esófago, del colon, del páncreas, del pulmón, de mama, de ovario, de riñón, de próstata y de vejiga urinaria). Dichos autores deducen de ello una posible aptitud de la CPS 1 como marcador tisular selectivo, es decir como marcador tumoral celular para el cáncer de estómago. No se trata sobre una posible aparición de CPS 1 en la circulación, y de las investigaciones que se describen no pueden sacarse conclusiones de tipo alguno con respecto a una eventual aptitud de la CPS 1 como marcador tumoral humoral.
En la WO 03/042661 se establece una relación entre la elevada expresión de CPS 1 en el tejido del colon y el cáncer de colon. No se menciona la aptitud de la CPS 1 como marcador humoral.
Las mediciones que se describen en la presente solicitud representan el primer informe de una aparición de CPS 1 en la circulación de pacientes tumorales. La CPS 1 fue hasta la fecha determinada, y ello tan sólo en investigaciones de la solicitante, únicamente en el suero o en el plasma de pacientes de sepsis (véase la WO 03/089933 A1). Los pacientes de sepsis, cuya afección altamente aguda y potencialmente amenazadora para la vida se supervisa y se trata típicamente en estaciones de tratamiento intensivo, representan una población de pacientes que es claramente distinta de los pacientes tumorales, los pacientes de riesgo tumoral o los pacientes con afecciones intestinales inflamatorias crónicas, es decir los pacientes que padecen de una afección crónica o que se desarrolla a lo largo de largos periodos de tiempo.
Para la determinación de la CPS 1 o de la inmunorreactividad de CPS 1 como marcador tumoral/biomarcador humoral en sueros de pacientes según la presente invención puede procederse fundamentalmente como se ha descrito en la publicación WO 03/089933 A1 de la solicitante en relación con la determinación de CPS 1 como marcador de sepsis. El procedimiento de determinación que se describe en la parte experimental de la presente solicitud, que fue aplicado para el análisis de sueros o plasmas de pacientes tumorales para la detección de la presencia de CPS 1 o de inmunorreactividad de CPS 1, es el mismo procedimiento que ya ha sido descrito en la susodicha solicitud WO 03/089933 A1 de la solicitante.
En el sentido de la presente solicitud debe entenderse como "uso" no tan sólo la determinación inmunológica directa de CPS 1 en muestras in vitro dentro del marco de la diagnosis tumoral, sino también un uso de CPS 1 o de fragmentos de CPS 1 o de anticuerpos para su determinación selectiva para la fabricación de kits (kits = conjuntos de materiales y utensilios) de ensayo, o un uso para la producción de componentes de ensayo, o sea p. ej. de anticuerpos poli- o monoclonales que se prevén p. ej. en forma inmovilizada y/o marcada por regla general asimismo en kits de ensayo para las afecciones indicadas, o de sustancias patrón y de referencia.
Hay que señalar además explícitamente que en la determinación según la invención de CPS 1 o de inmunorreactividad de CPS 1 y según el diseño del ensayo puede tener lugar una simultánea determinación de CPS 1 tanto en forma de la molécula en esencia completa como en forma de otros fragmentos más cortos (péptidos parciales que se dan fisiológicamente) de la CPS 1 completa posiblemente presentes en el fluido biológico. Cuando en la presente solicitud se habla de una determinación de "inmunorreactividad de CPS 1", debe entenderse que ello tiene en cuenta esta circunstancia relativa a la técnica de medición, para evitar una incorrecta interpretación limitativa de la doctrina de la presente invención.
En lugar de la determinación de CPS 1 o de inmunorreactividad de CPS 1, a efectos diagnósticos la determinación de CPS 1 se efectúa dado el caso también indirectamente como determinación de una actividad enzimática que corresponde a la actividad de CPS 1 o a la actividad residual de los fragmentos de CPS 1 en la sangre. Puesto que la CPS 1 no surge en la circulación en los sujetos sanos, una actividad enzimática mensurable de CPS 1 en la sangre de un paciente puede constituir desde el punto de vista diagnóstico un significativo indicio de una seria perturbación del buen estado de salud del paciente. Hay que señalar también en este punto que la actividad en la circulación de una enzima que normalmente está localizada en el interior de las células y tan sólo ahí desempeña su acción funcionalmente correcta debe valorarse en sí negativamente, y por consiguiente puede contribuir también como tal a una exacerbación del estado morboso.
Sobre la base de los resultantes que se presentan a continuación, la CPS 1 y la inmunorreactividad de CPS 1 detectable en el plasma o en el suero son adecuadas como péptidos marcadores específicos (marcadores tumorales) para la detección diagnóstica de tumores (neoplasias).
Se prevé además realizar la determinación de CPS 1 y/o fragmentos de CPS 1 como marcadores de prognosis y marcadores para la supervisión de la evolución morbosa de las afecciones tumorales dentro del marco de una medición en combinación con otros marcadores.
La determinación de CPS 1 propiamente dicha puede efectuarse de cualquier manera adecuada en sí conocida, siendo preferidos los inmunoensayos con un adecuado diseño de ensayo.
Los procedimientos de determinación de inmunorreactividad de CPS 1 en una muestra biológica pueden ser cualesquiera procedimientos conocidos de la inmunodiagnosis de los que se usan para la detección y la medición de antígenos. La CPS 1 se determina preferiblemente con ayuda de un ensayo de fijación de ligando en el que para la fijación y marcación se usan adecuados anticuerpos específicos en forma inmovilizada o bien en forma marcada o marcable.
También formatos de ensayo competitivo pueden ofrecer particulares ventajas. Preferiblemente no se trabaja ahí con una marcación enzimática, sino que se elige otra marcación, como p. ej. una marcación para una reacción de detección por quimioluminiscencia, como p. ej. un éster de acridinio. Naturalmente, para la determinación de CPS 1 se usa con preferencia un ensayo de este tipo, que garantiza la alta sensibilidad necesaria dentro de la gama de las concentraciones de CPS 1 que se dan y permite una separación de las señales de medición del fondo del ensayo.
El procedimiento de determinación puede estar adaptado a la tecnología de los chips, o bien puede estar configurado como ensayo rápido (ensayo de Point-of-Care).
En una forma de realización preferida la determinación inmunodiagnóstica se efectúa como inmunoensayo en sándwich heterogéneo, en el cual uno de los anticuerpos está inmovilizado en una fase estacionaria cualquiera, como por ejemplo las paredes de tubitos de ensayo recubiertos (p. ej. de poliestireno; "Coated Tubes"; CT), o en placas de microtitulación, por ejemplo de poliestireno, o en partículas, como por ejemplo partículas magnéticas, mientras que el otro anticuerpo lleva un residuo que representa una etiqueta directamente detectable o permite un enlace selectivo con una etiqueta y sirve para la detección de las estructuras en sándwich formadas. Es también posible una inmovilización posterior o retardada en el tiempo usando adecuadas fases estacionarias.
Fundamentalmente pueden aplicarse todas las técnicas de marcación que son susceptibles de ser usadas en los ensayos de la clase que se describe, a las cuales pertenecen las marcaciones con radioisotopos, enzimas y etiquetas de fluorescencia, quimioluminiscencia o bioluminiscencia y las marcaciones de color ópticamente detectables, como por ejemplo las que se hacen con átomos de oro y partículas de colorante como los que se usan en particular para los llamados ensayos de Point-of-Care (POC) o ensayos rápidos. En el caso de un inmunoensayo en sándwich heterogéneo, ambos anticuerpos pueden también presentar partes de un sistema de detección de la clase que se describe a continuación en conexión con ensayos homogéneos.
El procedimiento según la invención puede ser además configurado como procedimiento homogéneo en el que permanecen en suspensión en la fase fluida los complejos en sándwich formados a base de ambos anticuerpos y de la CPS 1 a detectar. En un caso de este tipo se prefiere marcar ambos anticuerpos con partes de un sistema de detección que al ser ambos anticuerpos integrados en un único sándwich permite una generación de señales o emisión de señales. Tales técnicas son en particular susceptibles de ser configuradas como procedimientos de detección mediante amplificación de fluorescencia o extinción de fluorescencia. Un procedimiento de este tipo particularmente preferido implica el uso de reactivos de detección que se usan por parejas, como son por complejo los que se describen en los documentos US-A-4 822 733, EP-B1-180 492 o EP-B1-539 477 y en el estado de la técnica que ahí se cita. Dichos reactivos permiten efectuar directamente en la mezcla de reacción una medición que incluye selectivamente tan sólo productos de reacción que contienen ambos componentes de marcación en un único inmunocomplejo. Como ejemplo de ello hay que hacer referencia a la tecnología que se oferta con las marcas TRACE® (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) o KRYPTOR®, que lleva a la práctica las doctrinas de las solicitudes anteriormente mencionadas.
Habiéndose hecho explícitamente referencia a estas solicitudes, debe considerarse como parte de la exposición de la presente solicitud el contenido de la susodicha solicitud anterior (WO 03/089933 A1) de la solicitante.
A continuación se aclaran más detalladamente la determinación de CPS 1 y los resultados obtenidos en su determinación en plasmas de pacientes tumorales y pacientes con M.C. o C.U., haciéndose al respecto referencia a dos figuras.
Las figuras muestran lo siguiente:
La figura 1, los resultados de la medición de la inmunorreactividad de CPS 1 en plasmas de personas normales sanas y de pacientes con distintas afecciones tumorales clínicamente diagnosticadas que se indican en la figura con el inmunoensayo que se describe más detalladamente en la parte experimental, indicando la línea de trazos el límite de detección inferior del ensayo (0,5 ng/ml).
La figura 2, correspondientes resultados en plasmas de pacientes que padecen de un acceso agudo de su afección intestinal inflamatoria crónica (M.C. o C.U.).
Parte experimental Determinaciones de la inmunorreactividad de CPS 1 en plasmas humanos de personas normales sanas y pacientes tumorales 1. Material y métodos 1.1. Síntesis de péptidos
Se seleccionaron dos zonas sacadas de la secuencia de aminoácidos conocida de la CPS 1 humana (Pos. 184-199: zona peptídica 1; ID SEC Nº: 1; Pos. 245-257: zona peptídica 2; ID SEC Nº: 2). Respectivamente completadas con un residuo de cisteína N-terminal, ambas zonas fueron según procedimientos estándar sintetizadas como péptidos solubles, purificadas, sometidas a control de calidad mediante espectrometría de masas y HPLC (HPLC = cromatografía de líquidos de alta resolución) de fase inversa y liofilizadas en partes alícuotas (firma JERINI AG, Berlín, Alemania). Las secuencias de aminoácidos de los péptidos son las siguientes:
Péptido PCEN17: CEFEGQPVDFVDPNKQN ID SEC Nº:1
Péptido PCVD14: CVPWNHDFTKMEYD ID SEC Nº:2
El material patrón recombinante fue adquirido a la firma InVivo GmbH (de Hennigsdorf, Alemania). Se trataba de un extracto celular crudo de una cepa de E. coli que expresaba la zona N-terminal recombinante de la CPS 1 humana, completada con una cola de afinidad Strep-tag N-terminal. Se le atribuyó al extracto una concentración arbitraria de CPS 1.
1.2. Conjugación e inmunización
Mediante MBS (éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) se conjugaron con la proteína portadora KLH (Keyhole limpet hemocyanin = hemocianina de lapa californiana) (véanse las instrucciones de trabajo "NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers" de la firma PIERCE, de Rockford, IL, EE.UU.) los péptidos PCEN17 y PCVD14 anteriormente mencionados. Con estos conjugados se inmunizaron ovejas según el esquema siguiente: Cada oveja recibió inicialmente 100 \mug de conjugado (estando el dato de la masa referido a la parte peptídica del conjugado) y a continuación cada 4 semanas 50 \mug de conjugado (estando el dato de la masa referido a la parte peptídica del conjugado). Comenzando al cuarto mes tras el comienzo de la inmunización se tomaron cada 4 semanas por cada oveja 700 ml de sangre, y de la misma se obtuvo antisuero por centrifugación. Las conjugaciones, las inmunizaciones y la obtención de antisueros fueron efectuadas por la firma MicroPharm, de Carmartheshire, R.U.
1.3. Purificación de los anticuerpos
En un procedimiento de 1 paso se prepararon a partir de los antisueros que habían sido obtenidos comenzando en el cuarto mes tras la inmunización los anticuerpos peptido-específicos.
Para ello, los péptidos PCEN17 y PCVD14 fueron primeramente acoplados a gel SulfoLink (véanse las instrucciones de trabajo "Sulfolink Kit" de la firma PIERCE, de Rockford, IL, EE.UU.). Se presentaron para el acoplamiento 5 mg de péptido por cada 5 ml de gel.
La purificación por afinidad de anticuerpos peptido-específicos de antisueros de oveja contra ambos péptidos fue efectuada de la manera siguiente:
Las columnas para péptidos fueron en primer lugar lavadas alternativamente tres veces con respectivamente 10 ml de tampón de elución (ácido cítrico 50 mM, pH 2,2) y tampón de fijación (fosfato sódico 10 mM, 0,1% de Tween, pH 6,8). 100 ml de los antisueros fueron filtrados a través de un tamaño de poro de 0,2 \mum y mezclados con el material de columna existente. Para ello, el gel fue barrido cuantitativamente de la columna con 10 ml de tampón de fijación. La incubación se efectuó durante la noche a temperatura ambiente con agitación. Las preparaciones se pasaron cuantitativamente a columnas vacías (NAP 25, Pharmacia, vaciadas). Se desecharon los filtrados. A continuación se efectuó lavado con 250 ml de tampón de fijación exento de proteína (contenido de proteína del eluido de lavado < 0,02 A280 nm). Se aportó tampón de elución a las columnas lavadas, y se recogieron fracciones de 1 ml. Se determinó el contenido de proteína de cada fracción mediante el método BCA (véanse las instrucciones de trabajo de la firma PIERCE, de Rockford, IL, EE.UU.). Fueron reunidas las fracciones con concentraciones de proteína < 0,8 mg/ml. Tras determinación de la proteína del pool mediante el método BCA, fueron obtenidas unas producciones de 27 mg para el anticuerpo anti-PCEN17 y de 33 mg para el anticuerpo anti-PCVD14.
1.4. Marcación
Por medio de una columna de filtración en gel NAP-5 (Pharmacia), 500 \mul del anticuerpo anti-PCEN17 purificado (véase lo indicado anteriormente) se pasaron a 1 ml de tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 8,0) según las instrucciones de trabajo. La determinación de la concentración de proteína de la solución de anticuerpo arrojó un valor de 1,5 mg/ml.
Para la marcación por quimioluminiscencia del anticuerpo 67 \mul de la solución de anticuerpo fueron mezclados con 10 \mul de MA70-acridinio-NHS-éster (1 mg/ml; firma HOECHST Behring) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Entonces fueron añadidos 423 \mul de glicina 1M y se prosiguió la incubación por espacio de otros 10 minutos. Por medio de una columna de filtración en gel NAP-5 (Pharmacia), la preparación de marcación se pasó a continuación a 1 ml de eluyente A (fosfato de potasio 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) según las instrucciones de trabajo, y fue además liberada de componentes de bajo peso molecular. Para la separación de los últimos residuos de etiquetas no fijadas a anticuerpos fue efectuada una HPLC de filtración en gel (columna: Waters Protein Pak SW300). La muestra fue aplicada y cromatografiada con eluyente A con un caudal de 1 ml/min. Con un fotómetro de flujo fueron medidas las longitudes de onda de 280 nm y 368 nm. La relación de absorción a 368 nm/280 nm como medida del grado de marcación del anticuerpo fue en el pico de 0,10. Las fracciones con contenido de anticuerpos monómeros (tiempo de reacción 8-10 min.) fueron recogidas y reunidas en 3 ml de fosfato sódico 100 mM, NaCl 150 mM, albúmina de suero bovino al 5%, azida sódica al 0,1%, pH 7,4.
1.5. Acoplamiento
Tubitos de poliestireno de 5 ml irradiados (firma Greiner) fueron recubiertos con anticuerpo anti-PCVD14 purificado de la manera siguiente: El anticuerpo fue diluido en Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,8, hasta una concentración de 6,6 \mug/ml. Se pipetaron al interior de cada tubito 300 \mul de esta solución. Los tubitos fueron incubados durante 20 horas a 22ºC. Se aspiró la solución. Entonces se llenó cada tubito con 4,2 ml de fosfato sódico 10 mM, Karion FP al 2%, albúmina de suero bovino al 0,3%, pH 7,5. Tras 20 horas se aspiró la solución. Los tubitos fueron finalmente secados en un secador al vacío.
2. Realización y evaluación del inmunoensayo 2.1. Configuración del ensayo
Se fabricó un tampón de ensayo que tenía la composición siguiente:
Fosfato sódico 100 mM, NaCl 150 mM, albúmina de suero bovino al 5%, IgG de oveja inespecífica al 0,1%, azida sódica al 0,1%, pH 7,4.
Sirvió de material patrón CPS 1 humana recombinante expresada en E. coli en forma de un extracto de E. coli crudo que contenía toda la proteína intracelular soluble. Este extracto fue diluido serialmente en suero normal de caballo (firma SIGMA). A los patrones así fabricados les fueron atribuidas concentraciones arbitrarias según su dilución.
2.2. Medición de plasmas EDTA de sujetos aparentemente sanos y de pacientes con distintas neoplasias (tumores) Sueros de ensayo:
a. Sirvieron de sueros de ensayo para las determinaciones de CPS 1 por un lado 557 plasmas de distintos pacientes con tumores clínicamente diagnosticados de distintos órganos/tejidos. Para cada plasma de ensayo existía una precisa documentación clínica que permitió un desglose de los plasmas usados en la medición según la clase de tumor constatada en los pacientes.
Más concretamente fueron medidos: 94 plasmas de pacientes con cáncer de colon (en la figura 1: Ca Colon), 97 plasmas de pacientes con cáncer de hígado (Ca Hígado), 26 plasmas de pacientes con cáncer de riñón (Ca Riñón), 152 plasmas de pacientes con cáncer de páncreas (Ca Páncreas), 48 plasmas de pacientes con cáncer de pulmón (Ca Pulmón) y 140 plasmas de pacientes con cáncer de mama (Ca Mama).
Sirvieron de sueros de control 128 sueros de sujetos aparentemente sanos.
b. Paralelamente a ello fueron también medidos sueros de en total 78 pacientes a los cuales les había sido efectuado un tratamiento de un acceso agudo de la enfermedad de Crohn (M.C.) o de colitis ulcerosa (C.U.) (figura 2).
Se pipetaron al interior de los tubitos de ensayo anteriormente mencionados respectivamente 50 \mul de patrón o muestra y 200 \mul de tampón de ensayo. Se efectuó incubación por espacio de 18 horas a 22ºC con sacudimiento. Entonces se efectuaron 4 lavados con 1 ml de solución de lavado (Tween 20 al 0,1%) en cada uno de ellos por tubito. Entonces se pipetaron al interior de cada tubito 200 \mul de tampón de ensayo que contenía 0,5 millones de RLU (RLU = unidades relativas de luz) del anticuerpo trazador marcado con MA70. Se efectuó incubación por espacio de dos horas a 22ºC con sacudimiento. Entonces se hicieron 4 lavados con 1 ml de solución de lavado (Tween 20 al 0,1%) para cada uno por cada tubito, se dejaron escurrir los tubitos, y se midió la quimioluminiscencia fijada al tubito en un luminómetro (firma BERTHOLD, LB952T; reactivos básicos de la BRAHMS AG).
Usando el software MultiCalc (Spline Fit) se efectuó la lectura de la concentración de inmunorreactividad de CPS 1. Los resultados para pacientes tumorales se muestran en la figura 1, y los resultados para pacientes con afecciones intestinales inflamatorias crónicas (M.C.; C.U.) se muestran en la figura 2. Se aprecia en cada caso una clara diferenciación entre los sujetos sanos, en los cuales no se hallaron concentraciones de CPS 1 situadas por encima del límite de detección (0,5 ng/ml), y los pacientes, siendo bastante distinta la sensibilidad de la detección de CPS 1 para las distintas clases de tumor.
Concretamente se determinaron para las distintas clases de cáncer las sensibilidades siguientes (véase la Fig. 1):
Cáncer de colon
72%
Cáncer de hígado
38%
Cáncer de riñón
85%
Cáncer de páncreas
48%
Cáncer de pulmón
42%
Cáncer de mama
24%
La sensibilidad en las afecciones intestinales inflamatorias (enfermedad de Crohn/colitis ulcerosa) era de un 71% para la M.C. y de un 50% para la C.U.
Mediante el inmunoensayo en sándwich descrito se ha demostrado con ello que los plasmas de pacientes tumorales y de pacientes en una fase aguda de una afección intestinal inflamatoria crónica pueden presentar concentraciones marcadamente elevadas de inmunorreactividad de CPS 1, mientras que en los plasmas de sujetos sanos no se detectaba CPS 1. Se puso de manifiesto para distintos pacientes tumorales un masivo incremento de la inmunorreactividad de CPS 1 en el plasma. Dicho incremento no hay que ponerlo en clara relación lógica con la ya anteriormente conocida aparición de CPS 1 en la sepsis. Es sabido que en la sepsis se produce una lesión de las mitocondrias (Crouser ED et al., Endotoxin-induced mitochondrial damage correlates with impaired respiratory activity; Crit Care Med. 2002 feb.; 30(2):276-84). Una lesión de este tipo en combinación con necrosis o apoptosis podría ser causa del paso de CPS 1 de la matriz mitocondrial a la circulación sanguínea en la sepsis. Esta suposición para la aclaración de la aparición de CPS 1 en la sepsis no proporciona sin embargo una sencilla aclaración plausible para la aparición en los sueros o plasmas de pacientes tumorales, que no era previsible sobre la base de los conocimientos del estado de la técnica.
Los conocimientos en los que se basa la presente invención sobre la aparición de considerables concentraciones de CPS 1 en la circulación de pacientes de cáncer y pacientes de M.C. y de C.U. hacen que parezca posible que la CPS 1 incluso en forma disuelta ha conservado al menos partes de su reactividad enzimática y contribuye a la exacerbación de la afección y/o a determinadas consecuencias morbosas indeseadas. Se sigue de ello que sustancias en sí conocidas que inhiben la expresión o la acción enzimática de la CPS 1 pueden ser adecuadas para influenciar positivamente la morbilidad global. Tales sustancias están p. ej. descritas en J Steroid Biochem Mol Bio 1991 mayo; 38(5):599-609; J Biol Chem 1977 mayo 25; 252(10):3558-60; J Biol Chem 1984 ene. 10; 259(1):323-31 y J Biol Chem 1981 nov. 10; 256(21):11160-5; J Biol Chem 1981 abr. 10; 256(7):3443-6. Pertenecen a las mismas en particular los iones de Ca y otros iones metálicos y sustancias de tipo esteroide. Se cuentan además entre las mismas también anticuerpos u otros fijadores específicos que como bloqueadores o inhibidores de la CPS 1 y mediante fijación a la CPS 1 pueden anular o debilitar la acción de CPS 1 en la circulación.
Según ello, la administración de tales inhibidores de CPS 1 a pacientes en los que es detectable CPS 1 en la sangre constituye un medio para influenciar terapéuticamente la morbilidad y mejorar significativamente el estado y/o el bienestar de un paciente de cáncer.
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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias que cita el solicitante se aporta solamente en calidad de información para el lector y no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha procedido con gran esmero al compilar las referencias, no puede excluirse la posibilidad de que se hayan producido errores u omisiones, y la OEP se exime de toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción
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<110> B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft
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<120> Uso de la carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1) como biomarcador humoral para la diagnosis de afecciones tumorales y afecciones intestinales inflamatorias crónicas
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<130> 4467 PCT
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<150> DE 102004045705.0
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<151> 2004-09-21
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<160> 2
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<170> PatentIn versión 3.2
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<210> 1
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Secuencia Sintética
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<400> 1
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1 
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<210> 2
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia Sintética
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<400> 2
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2

Claims (6)

1. Uso de la carbamoilfosfato sintetasa (CPS 1) y/o de sus fragmentos con inmunorreactividad de CPS 1 como biomarcador humoral para la diagnosis in vitro y el control evolutivo y terapéutico de afecciones tumorales.
2. Procedimiento in vitro para la identificación anticipada y la identificación, para la prognosis evolutiva y el enjuiciamiento del grado de gravedad, así como para el enjuiciamiento evolutivo de acompañamiento a la terapia de afecciones tumorales; caracterizado por el hecho de que se determina en una muestra de suero o plasma de un paciente la presencia y/o cantidad de CPS 1 y/o de sus fragmentos que se dan fisiológicamente con inmunorreactividad de CPS 1, y de la detección y/o de la cantidad de CPS 1 o de inmunorreactividad de CPS 1 se sacan conclusiones con respecto a la presencia, a la previsible evolución, al grado de gravedad o al éxito de una terapia de una afección tumoral.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que las secuencias de CPS 1 usadas para la determinación son secuencias de una parte N-terminal de la CPS 1 que comprende los aminoácidos 1 a aprox. 630 de la secuencia completa de la CPS 1.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 o 3, caracterizado por el hecho de que es un procedimiento de determinación inmunodiagnóstica.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 o 3, caracterizado por el hecho de que es un procedimiento de determinación de la actividad enzimática de CPS 1 o de una actividad enzimática residual de CPS 1 en una muestra de sangre total, suero o plasma de un paciente de cáncer.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por el hecho de que se ejecuta para la detección de un tumor seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de carcinoma de colon, carcinoma de hígado, carcinoma de riñón, carcinoma de páncreas, carcinoma de pulmón y carcinoma de mama y combinaciones de los mismos.
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